DE102013004805A1

DE102013004805A1 - Elektrisches Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen

Info

Publication number: DE102013004805A1
Application number: DE102013004805.2A
Authority: DE
Inventors: Raphael Gübeli; Andreas Menzel; Wilfried Weber; Margit Zacharias
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2014-09-18
Also published as: WO2014140329A2; WO2014140329A3

Abstract

Es sind ein Verfahren und ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen im Allgemeinen und zur Detektion eines Analyten in einer Probe im Besonderen auf Basis einer Detektion einer elektrischen Leitfähigkeitsänderung angegeben. Eine spezifische erste Bindung zwischen einem Sensormolekül und einer Bindungseinheit auf dem Sensor wird aufgrund der Anwesenheit des Analyten verändert, was die Oberflächenladung auf dem Sensor messbar verändert. Die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit an dem Sensor lässt sich erfassen und mit Änderungen in Molekülinteraktionen in Verbindung setzen.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft den Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen im Allgemeinen und die Detektion von Molekülen in einer Probe im Besonderen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors sowie die Verwendung eines solchen Sensors.
TECHNOLOGISCHER HINTERGRUND
Es sind derzeit etablierte Techniken zur Moleküldetektion verfügbar, die auf optischen Ausleseprozessen basieren, wie zum Beispiel die Systeme ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) und Systeme, die sich der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (Surface plasmon resonance, SPR) bedienen oder andere chemometrische Technologien verwenden. Jedoch bringen diese Systeme Nachteile wie einen hohen Zeitaufwand der Messung auf Grund langer Reaktionszeiten, hohe Gerätekosten, die zwingende Verwendung von Markermolekülen (labels) und eine begrenzte Sensitivität mit sich. Insbesondere ist die Detektion der meisten niedermolekularen Stoffe, insbesondere von Antibiotika, in flüssigen Proben derzeit nur optisch möglich.
Weiterhin ist nach bisher bekannten Methoden die Herstellung entsprechender Sensoren mit nanoskaligen Strukturen nicht auf der Wafer-Skala möglich. Der Stand der Technik lehrt, Sensoren durch technisch aufwändige Prozesse bereitzustellen, die oft epitaktisches Wachstum und aufwendige Elektronenstrahllithographie verwenden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es kann daher als eine Aufgabe der Erfindung angesehen werden, einen verbesserten Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen bereitzustellen. Im Speziellen kann es als eine Aufgabe der Erfindung angesehen werden, eine verbesserte Detektion eines Analyten in einer Probe bereitzustellen.
Die Aufgabe der Erfindung wird mittels der Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere Vorteile und Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Es sind ein Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors, ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors, und die Verwendung eines Sensors zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen gemäß den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche angegeben.
Die beschriebenen Ausführungsbeispiele betreffen gleichermaßen das Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen, den Sensor, das Verfahren zur Herstellung eines Sensors sowie die Verwendung des Sensors. Mit anderen Worten können Merkmale, die im Folgenden in Bezug auf das Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen angegeben werden, ebenso in dem Sensor, der Verwendung des Sensors und gegebenenfalls dem Verfahren zur Herstellung des Sensors verwendet werden, und umgekehrt.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors angegeben. Das Verfahren weist den Schritt des Bereitstellens eines Sensors, einer Bindungseinheit, eines Sensormoleküls und einer Probe mit dem Analyten auf. Dabei ist die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert. Als weiteren Schritt weist das Verfahren das Zusammenführen des Sensors, des Sensormoleküls und des Analyten auf, wobei sich durch das Zusammenführen ein Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand oder von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand verändert. Dabei verändert sich der Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund der Anwesenheit des Analyten. In dem ersten Zustand ist das Sensormolekül an die Bindungseinheit gebunden und in dem alternativen zweiten Zustand ist das Sensormolekül von der Bindungseinheit losgelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren weist weiterhin den Schritt des Detektierens einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf, wobei die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf der Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit beruht.
Wie im Folgenden detailliert beschrieben wird, kann dieses Verfahren der vorliegenden Erfindung als Verfahren zur Detektion eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors ausgeführt sein. Daher wird im Folgenden das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch als Detektionsverfahren bezeichnet. Mittels dieses Detektionsverfahrens kann daher im Fall einer gegebenen, unbekannten Zusammensatzung der Probe beantwortet werden, ob darin ein gewisser Analyt enthalten ist. Falls gewünscht kann zusätzlich eine entsprechende Quantifizierung durchgeführt werden. Weitergehende Details hierzu werden im Folgenden angegeben. Ein exemplarisches Beispiel eines solchen Verfahrens zur Detektion eines Analyten in einer Probe ist in den 4 bis 7 ausführlich beschrieben.
Darüber hinaus und alternativ dazu kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch als Verfahren zur Detektion von Änderungen in der Molekülinteraktion zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül durch die Anwesenheit eines potentiellen Wirkstoffs (drug) ausgeführt werden. Auch aus diesem Grund wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung als Detektionsverfahren bezeichnet. Dieses Ausführungsbeispiel kann ein effizientes und sensitives sogenanntes drug screening Verfahren für Fälle bereitstellen, in welchen der Benutzer den Inhalt der Probe kennt, nämlich den zu untersuchenden Wirkstoff, aber seine Auswirkungen auf die Molekülinteraktion eines gegebenen Paars aus Sensormolekül und Bindungseinheit untersuchen möchte. Insbesondere kann damit für ein gegebenes Interaktionspaar bestehend aus Sensormolekül und Bindungseinheit gezielt nach Wirkstoffen, insbesondere medizinischen Wirkstoffen, gesucht werden, die geeignet sind, eine gewünschte Veränderung in der Molekülinteraktion hervorzurufen. Der Nutzer kann in diesem Kontext einen potentiell geeigneten Wirkstoff dem Sensor zuführen. Für den Fall, dass eine Veränderung der Molekülinteraktion, insbesondere ein Binden oder Loslösen, zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit durch den potentiellen Wirkstoff hervorgerufen wird, entsteht durch den Sensor ein entsprechendes elektrisches Signal. Diese Signalgenerierung wird für viele verschiedene Fälle im Folgenden weiter erklärt werden. Dieses Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel auf Protein-Protein Kombinationen anwendbar. Dies könnte z. B. bei der Medikamentenentwicklung auch zum Screenen von Bibliotheken kleiner Moleküle (small molecules) genutzt werden, um diejenigen Kandidaten zu identifizieren, die eine gegebene Protein-Protein-Wechselwirkung spezifisch beeinflussen. Insgesamt kann mit dem Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung der Einfluss der Anwesenheit des Wirkstoffs auf die Molekülinteraktion zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül untersucht und detektiert werden.
Die folgenden Ausführungen und Details der vorliegenden Erfindung betreffen sowohl das Ausführungsbeispiel zur Detektion eines Analyten in einer Probe als auch das Ausführungsbeispiel des oben beschriebenen drug-screening Verfahrens insofern nicht explizit Anderes angegeben ist.
Dabei kann der Begriff „Analyt” sowohl den Stoff, insbesondere das Molekül, beschreiben, welches mit dem Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung in der Probe detektiert wird. Ebenso kann der Begriff „Analyt” den Stoff, insbesondere das Molekül, beschreiben, welches als Wirkstoff daraufhin untersucht wird, ob damit eine Veränderung der Molekülinterkation zwischen einem Interaktionspaar bestehend aus Sensormolekül und Bindungseinheit verursachbar ist. In beiden Fällen kann der Sensor mit dem Analyt in Reinform versehen werden. In diesem Fall besteht die Probe aus dem Analyten. Jedoch umfasst die vorliegende Erfindung natürlich auch Anwendungen, bei welchen der Analyt dem Sensor in Form eines Gemischs, zum Beispiel einer Lösung, zugeführt wird. Weitere Details und Beispiele werden im Folgenden weiter beschrieben werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt aus, dass die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors durch die Anwesenheit des Analyten hervorgerufen wird. Dabei können insbesondere Konformationsänderungen des verwendeten Sensormoleküls genutzt werden, die in spezifischer Abhängigkeit von der Anwesenheit des Analyten auftreten. Wie im Folgenden erklärt werden wird, kann das Verfahren auch vorteilhafterweise von zwei spezifischen Bindungen Gebrauch machen. Dabei besteht die erste spezifische Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit und/oder die zweite spezifische Bindung besteht zwischen dem Analyten und dem Sensormolekül. Diese einfache oder doppelte Spezifizität kann zur Steigerung der Sensitivität bei der Detektion des Analyten oder zur Detektion einer Änderung einer Molekülinterkation genutzt werden. Dieses Verfahren kann nach dem Schritt des Zusammenführens aufgrund der verwendeten ersten spezifischen Bindung und der verwendeten spezifischen zweiten Bindung basierend auf der Veränderung der hervorgerufenen elektrischen Leitfähigkeit des Sensors die Anwesenheit des Analyten in der Probe feststellen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann aber auch die Kompetition zwischen Bindungen zwischen dem Sensormolekül, der Bindungseinheit und dem Analyten nutzen. Dies wird beispielsweise im Detail mit Bezug auf die Ausführungsformen der 8 bis 14 weiter erläutert.
Vorteilhafterweise ist es mit dem hier präsentierten Verfahren möglich, ein markierungsfreies (d. h. label-free) Verfahren bereitzustellen. Es kann daher als markierungsfreies Verfahren zur Detektion des Analyten oder als markierungsfreies Verfahren zur Suche und/oder Analyse von Wirkstoffen ausgeführt sein. Darüber hinaus ist das elektrische Detektionsverfahren in der Lage, eine Echtzeitmessung zu ermöglichen. Dabei stellt das hier beschriebene elektrische Detektionsverfahren sowohl eine erste Ausführungsform unter Schutz, bei der aufgrund der Anwesenheit des Analyten in der Sensorumgebung das an die Bindungseinheit gebundene Sensormolekül eine Konformationsänderung durchführt und sich dadurch von der Bindungseinheit und dadurch auch von dem Sensor loslöst. Dies wird im Folgenden weiter erklärt werden und kann beispielsweise der 4 und der zugehörigen Beschreibung entnommen werden. Weiterhin stellt das elektrische Detektionsverfahren auch eine zweite Ausführungsform unter Schutz, gemäß welcher das Sensormolekül zunächst nicht an die Bindungseinheit gebunden ist und sich daher in einem von der Bindungseinheit losgelösten Zustand befindet. Für den Fall, dass der Analyt in die Probe gegeben wird, also der Analyt in die Sensorumgebung gelangt, führt das Sensormolekül eine Konformationsänderung durch und bindet dadurch an die Bindungseinheit. Diese Bindungszustandsänderung verursacht ebenso wie das Loslösen in der ersten Ausführungsform eine Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, welche durch den Sensor detektierbar ist. Das Verfahren macht sich diese Leitwertänderung zunutze und detektiert dadurch den Analyten in der Probe bzw. eine Änderung der Molekülinterkation. Wie im Folgenden weiter erläutert werden wird, nutzt das Verfahren eine Veränderung der Oberflächenladung auf dem Sensor, zum Beispiel auf dem Gatter des Sensors, zur elektrischen Detektion.
Dabei ist in diesem und in jedem anderen Ausführungsbeispiel die Bindungseinheit als eine biologische, biochemische oder chemische Einheit zu sehen, an welche das Sensormolekül in Abhängigkeit von der Anwesenheit/Abwesenheit des Analyten binden kann. Mit Bezug auf die folgenden 3, 4 und 8 bis 14 werden verschiedene Ausführungsbeispiele des Verfahrens und des zugehörigen Sensors beschrieben, bei denen die Bindungseinheit beispielsweise als ein doppelsträngiges Oligonukleotid, ein erstes Protein, oder ein immobilisierter Analyt ausgeführt ist. Jedoch sind auch andere Ausführungsformen der Bindungseinheit möglich, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Dabei kann im gesamten Kontext der Erfindung der Begriff „Oligonukleotid” als Nukleinsäuresequenz verstanden werden.
Auch für das Sensormolekül und den entsprechenden Analyten können verschiedenste vielfältige Kombinationen durch den Fachmann gewählt werden. Besondere Ausführungsformen werden im Folgenden detailliert beschrieben.
Wie bereits zuvor angegeben, kann die Bindungseinheit an dem Sensor immobilisiert sein, alternativ kann aber auch das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert sein, oder beide können an dem Sensor immobilisiert sein. Dazu können herkömmliche Immobilisierungstechniken, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Weiterhin kann der Schritt des Zusammenführens des Sensors, des Sensormoleküls und des Analyten sequentiell, das heißt schrittweise, erfolgen. Insbesondere kann zunächst der Sensor mit der Bindungseinheit mit dem Sensormolekül in Verbindung gebracht werden und erst anschließend wird der Analyt hinzugefügt. Aber auch eine davon abweichende Reihenfolge ist möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die Kausalität zwischen der Anwesenheit des Analyten in der Nähe des Sensormoleküls und dem Bindungsverhalten des Sensormoleküls vorteilhafterweise aus. Das Verfahren kann zur Detektion von biomolekularen Interaktionen auf ultralangen Nanowänden mit einem hohen Aspektverhältnis verwendet werden. Beispielsweise ist damit eine elektrische Detektion von niedermolekularen Stoffen mit wünschenswerter Sensitivität möglich, wie anhand von Daten und Beispielen im Nachfolgenden belegt wird. Eine Vielzahl verschiedener Beispiele solcher niedermolekularer Stoffe wird im Folgenden angegeben. Weiterhin lässt die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit einen Rückschluss auf eine Bindungsveränderung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit und/oder den zu detektierenden Analyten in der Probe zu.
Weiterhin können beispielsweise die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an einer Wand, insbesondere an einer Nanowand, also an einer nanoskaligen Wand, des Sensors immobilisiert sein. Vorteilhafte Geometrien der Wand werden später detaillierter beschrieben werden
Durch die Kombination von Mikrosystemtechnik und Nanotechnologie wird die Herstellung von Nanosensoren auf Wafer-Skala ermöglicht. Solch Nanosensoren erlauben es, das Detektionsverfahren verlässlich, schnell und wiederholbar durchführen zu können. Dabei kann ein Wafer mikrostrukturiert werden, wobei mittels Atomlagenabscheidung ultradünne Schichten erzeugt werden. Damit können zentimeterlange Nanostrukturen oder Nanowände hochpräzise und in gewünschter Anordnung erzeugt werden. Dabei können so dünne Nanowände erzeugt werden, dass man bildlich von Nanolinien sprechen kann. Darüber hinaus ist auch ein Kontaktieren mittels Lithographie möglich. Damit lassen sich Sensoren herstellen, welche Wände oder Nanostrukturen mit einer Länge im Zentimeterbereich aufweisen, die eine starke Responsivität bezüglich der Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors bereitstellen. Damit kann das erfindungsgemäße besonders gut ausgeführt werden.
Weiterhin können geladene, also elektrisch nicht neutrale Sensormoleküle, geladene Analyten und/oder geladene Bindungseinheiten verwendet werden. Verschiedene Kombinationen davon sind möglich, ohne damit den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Es ist auch zu berücksichtigen, dass Bio-Moleküle generell je nach pH-Wert der Umgebung geladen sein können. Je nach pH-Wert protonieren bzw. deprotonieren die entsprechenden Gruppen am Molekül und ergeben dann eine Nettoladung. Die Ladung hängt somit vom isoelektrischen Punkt (pI) ab. Weitere Details hierzu werden im Folgenden noch weitergehend erläutert. Es ist auch zu berücksichtigen, dass Desoxyribonukleinsäure (DNS, Deoxyribonucleic acid, DNA) meistens bei neutralem pH negativ geladen ist. Das gilt ebenso für die meisten Proteine.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur synchronen Detektion von verschiedenen Analyten gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren angegeben. Dieses Verfahren weist weiterhin den Schritt Durchführen des Verfahrens an einer Vielzahl von Sensoren auf, wobei die Vielzahl von Sensoren auf einem Chip oder einem Wafer angeordnet ist.
Insbesondere wird dadurch die multiplexe Detektion verschiedener Substanzen in flüssigen Proben ermöglicht. Dieses Ausführungsbeispiel ermöglicht eine schnelle und gleichzeitige Detektion verschiedener Analyten auf einem Chip oder Wafer.
Darüber hinaus kann ein solcher Chip oder Wafer auch für das oben beschriebene drug-screening Verfahren genutzt werden. Angesichts der Wichtigkeit von schaltbaren Protein-DNS-Wechselwirkungen und auch von zu beinflussenden Protein-Protein-Wechselwirkungen, beides auch im Rahmen von Medikamentenentwicklungen, ist das Detektionsverfahren und der Sensor als Weiterentwicklung zu sehen, welche die multiparallele Möglichkeit bereitstellt, neue Wirkstoffe und/oder Medikamente zu entdecken. Dabei kann die Probe, welche mit dem Sensor in Kontakt gebracht wird, einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten.
Dabei können in einem Sensor gleichzeitig unterschiedliche Bindungseinheiten und gleichzeitig unterschiedliche Sensormoleküle in diesem Ausführungsbeispiel eingesetzt werden. Insbesondere die Immobilisierung unterschiedlicher Bindungseinheiten oder Sensormoleküle an unterschiedlichen Wänden des Sensors kann dazu genutzt werden. Dies ermöglicht eine getrennte Auslesung des Signals an je einer Wand, was eine Bindungseinheiten/Sensormolekül spezifische Auslesung pro Wand ermöglicht.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendet das Verfahren einen Sensor mit einer Wand der Länge L, der Dicke D und der Höhe H, wobei für den Sensor die Relation D ≤ H ≤ L oder die Relation D ≥ H ≤ L gilt.
Im Falle der Relation D ≤ H ≤ L werden Wände mit einem hohen Aspektverhältnis bereitgestellt. Es besteht hierbei die Möglichkeit, das Verhältnis zwischen Oberflächen und Volumen zu erhöhen und somit eine erhöhte Sensitivität des Sensors/des Verfahrens zu erzielen. Die Relation D ≥ H ≤ L zeichnet sich durch ausgedehnte und breite Strukturen mit niedriger Höhe aus. Das kann aber auch als Film oder dünne Schicht betrachtet werden. Im Falle eines Halbleiters ist in beiden Fällen die Sensitivität erhöht, da bei Nanostrukturen die Änderung der Verarmungszone der elektrischen Ladungsträger, induziert durch die Oberflächenladung, stärker erfasst werden kann. Durch die Änderung der Oberflächenladung auf dem Halbleiter werden also die elektronischen Bänder im Halbleiter verbogen, die im Vergleich zu ihren ”Bulk” Gegenstücken mit kleinen Strukturgrößen sensitiv erfasst werden können.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit an dem Sensor immobilisiert und das Sensormolekül ist in dem ersten Zustand an die Bindungseinheit und damit/dadurch an den Sensor gebunden. Das Sensormolekül ist in dem zweiten Zustand von der Bindungseinheit und von dem Sensor losgelöst.
Mit anderen Worten, stellt die Bindungseinheit die Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Sensor im gebundenen Zustand des Sensormoleküls her. Die Merkmale dieses Ausführungsbeispiels können beispielhaft den 3 und 4 entnommen werden. In diesen Figuren sind jedoch weitere Merkmale enthalten, die nicht zwingend für das hier beschriebene Ausführungsbeispiel enthalten sein müssen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit abhängig von der Dosis des Analyten in der Probe.
Mit anderen Worten ist in diesem Ausführungsbeispiel das Detektionsverfahren abhängig von der Dosis des Analyten in der Probe. Die Verursachung der detektierbaren Änderung des Bindungszustandes ist also in diesem Ausführungseispiel abhängig von der Dosis des Analyten. Hingegen werden im Stand der Technik Verfahren gelehrt, in denen unspezifische Maßnahmen, wie beispielsweise die Erhöhung einer Salzkonzentration, zur Veränderung einer Bindung zwischen zwei Molekülen führen. Für den Fall, dass bei der vorliegenden Erfindung spezifische Bindungen verwendet werden, stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung hingegen ein hoch spezifisches Detektionsverfahren dar. Es kann damit eindeutig die Anwesenheit des Analyten in der Probe nachgewiesen werden. Dies wird weiter durch die 4–7 und den zugrundeliegenden Daten belegt.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Sensor einen ersten metallischen Kontakt als Zufluss, einen zweiten metallischen Kontakt als Abfluss und ein elektrisches Gatter, nachfolgend Gate genannt, auf. Dabei ist die Bindungseinheit an dem Gatter des Sensors angeordnet. Das Detektieren der Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors detektiert dabei die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit zwischen dem Zufluss und dem Abfluss des Sensors.
Mit anderen Worten wird dadurch die elektrische Leitwertänderung zwischen dem Zufluss und dem Abfluss gemessen nachdem der Analyt in die Probe gegeben wurde. Aufgrund der sich dadurch ergebenden, veränderten Bindungsverhältnisse zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit, ein Loslösen oder ein Binden, kann durch den Nachweis einer entsprechenden Veränderung des elektrischen Leitwerts auf die Anwesenheit des Analyten in der Probe geschlossen werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung liegt zwischen dem Schritt des Zusammenführens und des Detektierens ein Zeitraum, der geringer ist als 10 min, 5 min, 2 min, 1 min, 30 sec, 10 sec, 4 sec, 2 sec, oder 1 sec.
Dabei können unterschiedliche Zeiten zum einen durch unterschiedliche Wechselwirkungen der Reaktionspartner zu Stande kommen. Zum anderen kann auch der Transport der Moleküle zu der Oberfläche ausschlaggebend dafür sein.
Im Gegensatz zu zeitaufwändigen Verfahren nach dem Stand der Technik bietet das Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit, eine Echtzeitmessung bereitzustellen und damit in Echtzeit dem Benutzer die Information zu übermitteln, ob der Analyt in der untersuchten Probe vorhanden ist. Dadurch kann ein industriell anwendbares und für industrielle Zwecke bevorzugtes Detektionsverfahren bereitgestellt werden. Die gleichen Vorteile gelten für die Ausführungsform des oben beschriebenen drug screening Verfahrens.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt eine Quantifizierung der Menge des Analyten in der Probe, basierend auf der detektierten Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors.
Beispielsweise kann der Sensor kalibriert werden. Dies geschieht beispielsweise durch einen zusätzlichen Gatterkontakt. Die Gatespannung kann die Leitfähigkeit des Sensors modulieren. Durch das Anlegen einer gewissen Gatespannungsreihe kann auf die Oberflächenladung in einem bestimmten Bereich geschlossen werden. Im Falle von Proteinen kennt man die Nettooberflächenladung in einem gewissen pH Wert und kann dann durch die kalibrierte Leitfähigkeitsänderung auf die Anzahl der gelösten Proteine schließen und somit auf die Anzahl der Moleküle im Analyten implizieren. Weiter Möglichkeiten zur Quantifizierung erschließen sich dem Fachmann aus den hierin erfolgten Erläuterungen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren den Schritt Herstellen einer ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten auf. Dabei erfolgt die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund der hergestellten ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten.
Beispielsweise zeigen die 3 bis 14 verschiedene Aspekte eines elektrischen Detektionsverfahrens, bei dem eine solche erste spezifische Bindung verwendet wird. Verschiedene Kombinationen von Sensormolekülen und Analyten werden später angegeben.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren weiterhin den Schritt des Herstellens einer zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit, und den Schritt des Lösens der zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund der Anwesenheit des Analyten auf.
Die entsprechende Kausalität und Dynamik dieser Ausführungsform der Erfindung kann beispielsweise ebenfalls der 4 entnommen werden und wird in der zugehörigen Figurenbeschreibung erläutert. Verschiedene Kombinationen von Sensormolekülen und Bindungseinheit werden später angegeben.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung bewirkt die Herstellung der ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten eine Konformationsänderung des Sensormoleküls, wodurch die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit verursacht wird.
Eine derartige Konformationsänderung kann beispielhaft der 4 entnommen werden, in welcher das Sensormolekül 305 nach der Bindung an die Bindungseinheit 304 und nach der Zugabe des Analyten 300 eine Konformationsänderung durchführt, so dass eine Loslösung des Sensormoleküls von dem Sensor und damit eine detektierbare Veränderung der Oberflächenladung an der Wand 303 erreicht wird, wobei die Wand als Gatter eines Sensors ausgeführt ist. In anderen, alternativen Ausführungsbeispielen kann der Analyt auch mit der Bindung an die Bindungseinheit konkurrieren.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit auf dem Sensor immobilisiert, und die Bindungseinheit ist durch ein doppelsträngiges Oligonukleotid ausgeführt. Das doppelsträngige Oligonukleotid kann dabei einen Bereich oder eine Oligonukleotidsequenz aufweisen, an welche das verwendete Sensormolekül spezifisch bindet. Detaillierte Beispiele werden diesbezüglich im Folgenden beschrieben.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der Analyt ein Molekül und das Sensormolekül ein entsprechendes Repressorprotein.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der Analyt ein Antibiotikum und das Sensormolekül ein entsprechender Antibiotikum-Repressor beziehungsweise ein entsprechendes Repressorprotein.
Mit anderen Worten stellt dieses Verfahren die elektrische Detektion von Antibiotika mittels einer Detektion einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors bereit. Beispielsweise kann das Antibiotikum als Tetracyclin ausgeführt sein, aber auch andere Antibiotika können damit nachgewiesen werden, wie im Folgenden weiter dargelegt wird.

Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist eine Kombination aus dem Sensormolekül und dem Analyten ausgewählt aus der Liste von Kombination bestehend aus

Klasse	Analyt/Metabolit	Sensormolekül/Regulator	Ref
A	Trp	TrpR
A	Arg	ArgR	24
A	Phe	TyrR	38
A	Val, Ile, Leu	CodY	31
A	O-acetyl-serin	CymR	7
A	4-Hydroxyphenylpyruvat	HpdR	37
A	Ornithin	OruR	10
A	Leu	Lrp	20
A	SAM	McbR	24
E	Citrat	CcpC	14
E	Pyruvat	PdhR	22
E	Lactat	LldR	8
E	2-Oxoglutarat	NrpR	18
E	2-Oxoglutarat	GltC	23
E	NADH	Rex	2
E	Fructose-6-P	SugR	6
E	L-Arabinose	AraR	21
E	Maltotriose	Tgr	13
E	Xylose	XylR	32
E	Tagatose-6-P	LacR	35

E	Trehalose-6-P	TreR	9
E	Fructose-1,6-bis-P	CggR	25
E	Fructose-1-P	ScrR	11
E	Maltose	TrmB	16
E	Saccharose	MsmR	28
E	Glyoxylat	Ic1R	19
F	Langkettiges Acyl-CoA	FadR	34
F	Palmitoyl-CoA	DesT	40
M	Biotin-AMP	BirA	33
M	cAMP	GlxR	17
M	Sulphat	SsuR	15
M	Formyl-THF	QscR	12
M	Cholin	BetI	26
M	Harnsäure	HucR	36
M	Propandiol	PocR	5
M	17-beta-Östradiol	Bm3R1	27
N	UTP	PyrR	1
N	Cytidin	CytR	4
N	Uracil, Thymin	RutR	30
N	Deoxyribose-5-P	DeoR	39

Die hier angegebenen Ausführungsbeispiele des Sensormoleküls ändern ihre Affinität zu einer spezifischen DNA Sequenz als Funktion der Konzentration des jeweils angegebenen Analyten. Dabei erfolgt in der zuvor angegebenen Liste ein Bezug auf folgende Dokumente als Referenzen (Ref):

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Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit ein erstes Protein, welches auf dem Sensor immobilisiert ist, und das Sensormolekül ist ein zweites Protein.
Verschiedene Beispiele solcher Detektionsverfahren und entsprechender Sensoren, bei welchen Kombinationen erster und zweiter Proteine verwendet werden, können den 8, 9, 10, 12, 13 und 14 sowie der jeweils zugehörigen Beschreibung entnommen werden.

Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel ist eine Kombination aus dem ersten Protein, dem zweiten Protein und dem Analyten ausgewählt aus der Liste von Kombinationen bestehend aus

Erstes Protein	Zweites Protein	Analyt
GyrB (Gyrase Untereinheit B)	GyrB	Coumarin-Antibiotika
FKBP (FK-bindendes Protein)	FRB (Domäne von FRAP)	Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren)
FM (F36M Mutante von FKBP)	FM	Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren)
FKBP	FKBP	Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren)
FKBP	Cyp (Cyclophilin)	Rapamycin, FK506 und Derivate (z. B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren), Cyclosporine
Cyp	Cyp	Cyclosporine und Derivate davon
ToxT (aus V. cholerae)	ToxT	Virstatin
DHFR (Dihydrofolatreductase)	DHFR	Methotrexat und Derivate davon

Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit ein erstes Protein und das Sensormolekül ist ein zweites Protein, welches auf dem Sensor immobilisiert ist.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit ein immobilisierter Analyt, wobei das Sensormolekül ein Protein ist.
Die entsprechenden Bindungsverhältnisse und die Dynamik während des Detektionsverfahrens für dieses Ausführungsbeispiel und der zugehörige Sensor kann auch der 11 entnommen werden. Hier ist also ein immobilisierter Analyt auf dem Gatter des Sensors angeordnet und stellt die Bindungseinheit 304 bereit.
Nach der Herstellung einer Bindung mit dem Protein P1 kann ein weiterer freier Analyt 300 mit dem ersten Protein um die Bindung an den immobilisierten Analyten konkurrieren und das Protein 1 verdrängen. Insgesamt ändert sich damit der Bindungszustand des Sensormoleküls 305, was wegen der damit einhergehenden Änderung der Oberflächenladung am Sensor/am Gatter als Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors zwischen Zufluss und Abfluss festgestellt werden kann.

Gemäße einem weiteren Ausführungsbeispiel ist eine Kombination aus dem immobilisierten Analyten und dem Protein ausgewählt aus der Liste von Kombinationen, bestehend aus

Protein	Analyt
GyrB	Coumarin-Antibiotika
FKBP	mTOR-Inhibitoren
FRP	mTOR-Inhibitoren
FM	mTOR-Inhibitoren
Cyp	Cyclosporine
Cyp	Ascomycine
DHFR	Antifolat
Strepatvidin	Biotin
Avidin	Biotin
Neutravidin	Biotin
Steroidhormonrezeptoren	Steroidhormone und Analoga
ToxT	Virstatin

Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit angegeben. Der Sensor weist eine Transistorstruktur mit einem ersten metallischen Kontakt als Zufluss, einem zweiten metallischen Kontakt als Abfluss und einem Gatter auf. Dabei ist an dem Gatter eine Bindungseinheit oder ein Sensormolekül immobilisiert angeordnet. Das Gatter ist dabei als Wand beziehungsweise als Nanostruktur zwischen dem ersten metallischen Kontakt und dem zweiten metallischen Kontakt ausgeführt. Darüber hinaus weist die Wand einen rechteckigen, quadratischen, trapezförmigen oder dreieckigen Querschnitt auf.
Gemäße einem weiteren Ausführungsbeispiel ein Sensor zur Detektion eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors angegeben.
Daher verwendet der hier beschriebene Sensor keine sogenannten Nanodrähte, die aus dem Stand der Technik bekannt sein mögen und die mit Verfahren hergestellt werden, welche zum Beispiel den Vapor-Solid (VS) oder dem Vapor Liquid Solid (VLS) Mechanismus nutzen. Solche Nanodrähte des Standes der Technik weisen einen runden Querschnitt und eine drahtartige Struktur auf. Da ein solcher Herstellungsprozess ein eindimensionales Wachstum verursacht, werden solche Nanodrähte in der Fachwelt daher als „eindimensionale” Gegenstände bezeichnet. Im Gegensatz dazu verwendet die vorliegende Erfindung Sensoren, die als Gatter eine Wand mit einem rechteckigen, quadratischen, trapezförmigen oder dreieckigen Querschnitt aufweisen. Dies wird weiter durch das entsprechende Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel in 17, verdeutlicht. Der Sensor kann mit den hierin angegebenen Herstellungsmethoden effizient und präzise für den Benutzer bereitgestellt werden. Verschiedenste Materialien eignen sich zur Herstellung eines solchen Sensors, was im Nachfolgenden weiter erläutert wird. Dabei kann die Wand des Gatters als eine Nanowand ausgeführt sein, die verschiedene Längen, Höhen und Dicken haben kann und verschiedene zugehörige Relationen erfüllen kann. Dies wird im Folgenden noch weiter spezifiziert werden.
Auch kann der Sensor in diesem und in jedem anderen Ausführungsbeispiel als Feldeffekttransistor oder Diode ausgeführt sein und einen P-N-Übergang aufweisen. Ebenso kann in diesem und in jedem anderen Ausführungsbeispiel das Gatter als metallischer Rückkontakt, als sogenanntes Back Gate, ausgeführt sein. Jedoch ist auch ein sogenanntes Liquid Gate, in dem das Molekül oder die Moleküle auf der Oberfläche das Gatterpotential zur Verfügung stellen, eine mögliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche in dem Detektionsverfahren genutzt werden kann.
Ähnlich wie Biomoleküle hat das Sensormaterial eine gewisse Oberflächenladung. Generell gilt, dass am isoelektrischen Punkt (pI) Moleküle neutral geladen sind. Liegt der pH unter dem pI sind die Moleküle positiv geladen, liegt der pH über dem pI sind die Moleküle negativ geladen. Beispielhafte Sensormaterialien sind ZnO und/oder Al2O3. Zum Beispiel hat ZnO einen pI im Bereich 9–10 und ist für neutrale pH Werte relative positiv geladen. Durch die Oberflächenladung des Halbleiters kann die Affinität der Oberflächenfunktionalisierung erhöht werden. Proteine haben oftmals niedrige pI-Werte, so dass diese dann meist negativ geladen sind.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der Sensor auf einem Chip oder einem Wafer angeordnet. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Sensor eine CMOS-Struktur auf und der Sensor ist als integrierter Schaltkreis ausgeführt. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Sensor eine Vielzahl von Feldeffekttransistorstrukturen in paralleler Anordnung mit jeweils einem metallischen Kontakt als Zufluss, jeweils einem metallischen Kontakt als Abfluss, und jeweils einem dazwischen angeordneten Gatter in Form einer Wand auf.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit an dem Gatter des Sensors immobilisiert. Dabei ist die Bindungseinheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus doppelsträngigem Oligonukleotidstrang, Protein, und immobilisiertem Analyt. Dieses Protein ist weiterhin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GyrB (Gyrase Untereinheit B), FKBP (FK-bindendes Protein), FM (F36M Mutante von FKBP), Cyp, ToxT (aus V. cholerae), DHFR (Dihydrofolatreduktase). Weiterhin ist der immobilisierte Analyt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Coumarin-Antibiotika, Rapamycin, FK506, FK506-Derivate, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporinen, Closporin, Closporin-Derivaten, Ascomycinen, Antifolat, Biotin, Steroidhormonen und Analoga, Virstatin, Methotrexat und Methotrexat-Derivaten.
Mit anderen Worten sind zumindest hinsichtlich der Bindungseinheit drei verschiedene Arten von Sensoren, mit einem doppelsträngigen Nukleotid/Oligonukleotid, mit einem Protein oder mit einem immobilisierten Analyten an dem Sensor möglich. Ebenso sind für den Fall, dass die Bindungseinheit als Protein ausgeführt ist, wieder eine Reihe von Ausführungsformen möglich. Ebenso im Falle eines immobilisierten Analyten, wie beispielsweise in der 11 dargestellt, bieten sich mehrere Möglichkeiten, diesen immobilisierten Analyten auszuführen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Sensors. Dieses Herstellungsverfahren weist den Schritt des Bereitstellens eines strukturierten Substrates auf und weist den Schritt des Bereitstellens einer Wand eines Halbleiters auf dem strukturierten Substrat derart auf, dass die Wand einen rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt hat. Ebenso weist das Verfahren die Schritte Aufbringen eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand auf, wodurch eine Transistorstruktur mit dem Sensor bereitgestellt wird.
Dabei sei darauf hingewiesen, dass die einzelnen Verfahrensschritte dieses Herstellungsverfahrens wiederum mehrere Unterschritte aufweisen können, wie sie beispielsweise im Kontext der 17 weiter erläutert werden. Insbesondere kann das Verfahren als eine Kombination von Mikrosystemtechnik und Nanotechnologie gesehen werden, welche die Herstellung von Nanosensoren auf Wafer-Skala erlaubt. Beispielsweise kann mittels Atomlagenabscheidung (auch atomic layer deposition ALD) eine ultradünne Schicht erzeugt werden und insgesamt können zentimeterlange Nanostrukturen oder Nanowände als Wände für einen Sensor/mehrere Sensoren auf dem Wafer bereitgestellt werden. Dies kann als beispielhafte Linienstruktur angesehen werden. Solche Nanowände können dann als Gatter des hier beschriebenen Sensors verwendet werden und ermöglichen ein besonders sensitives Detektionsverfahren für verschiedenste Analyten oder ein besonders sensitives Verfahren des drug-screenings. Dieses Herstellungsverfahren erlaubt daher die Herstellung von Sensoren zur Multiplex-Detektion von verschiedenen Substanzen in flüssiger Umgebung.
Beispielswiese kann das Substrat aus Silizium sein. Es kann aber auch ein nichtleitendes Substrat sein, welches auch flexibel sein kann. Beispielsweise könnte es eine Folie sein oder das verwendete Material ist aus Papier oder weist Papier auf. Dieses Ausführungsbeispiel lässt sich dann als kostengünstiges Einmal-Wegwerfprodukt herstellen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren den Schritt Abscheiden der Wand mittels Atomlagenabscheidung des Halbleiters auf dem strukturierten Substrat auf. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren die weiteren Schritte Bereitstellen einer Bindungseinheit und/oder eines Sensormoleküls, und Immobilisieren der Bindungseinheit und/oder des Sensormoleküls an der Wand des Sensors auf. Dabei kann die Bindungseinheit ein doppelsträngiges Oligonukleotid, ein erstes Protein und ein immobilisierter Analyt sein. Das erste Protein und der immobilisierte Analyt können gemäß den hierin angegeben Ausführungsbeispielen ausgeführt sein.
Falls gewünscht, kann das Verfahren den zusätzlichen Schritt des Abscheidens einer Zusatzschicht mittels Atomlagenabscheidung über die bereitgestellte Wand enthalten, um den Sensor mit einer Schutzschicht zu versehen. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Herstellungsverfahren den Schritt des partiellen Entfernens des abgeschiedenen Halbleiters mittels Ätzen auf.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung eines hierin beschriebenen Sensors zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten angegeben. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung eines hierin beschriebenen Sensors zur Detektion eines Analyten in einer Probe angegeben.
Falls gewünscht, kann der Analyt aus den hierin angegeben Ausführungsbeispielen ausgewählt ist. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Sensors erlaubt ein schnelles und zuverlässiges Detektieren verschiedenster Analyten, je nachdem welche Bindungseinheit und/oder welches Sensormolekül verwendet werden. Da der Sensor auch relativ leicht und relativ kostengünstig herzustellen ist, ist er für die industrielle Anwendung interessant. Die gleichen Vorteile gelten für die Ausführungsform des oben beschriebenen drug screening Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung lässt sich grundsätzlich für verschiedene Arten zur Detektion eines Analyten in einer Probe nutzen und ist nicht auf die angegebenen Kombination der Merkmale des Patentanspruchs 1 und der abhängigen Patentansprüche beschränkt. Es ergeben sich darüber hinaus weitere Möglichkeiten, einzelne Merkmale, wenn sie sich aus den Patentansprüchen, der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele oder unmittelbar aus der Zeichnung ergeben, miteinander zu kombinieren.
Die Erfindung wird im Folgenden unter Verweis auf die beigefügten Figuren und anhand schematischer Darstellung bevorzugter Ausführungsbeispiele noch einmal näher erläutert. Hieraus ergeben sich auch weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt ein Flussdiagramm eines Detektionsverfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Die 2a und 2b zeigen einen Sensor gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt einen Sensor und ein korrespondierendes Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
4a zeigt einen Sensor und ein Verfahren zur Detektion von Tetracyclin-Antibiotikum gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
4b zeigt die zeitliche Entwicklung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors aus 4a während der Durchführung des Verfahrens.
5a zeigt eine zeitaufgelöste Messung des elektrischen Leitwertes des Sensors aus 4a bei Zugabe verschiedener Konzentrationen des Analyten.
5b zeigt eine Dosisabhängigkeit einer Messung des elektrischen Leitwerts des Sensors aus 4a.
6 zeigt einen Reversibilitätstest des Sensors aus 4a.
7a zeigt die zeitaufgelöste Entwicklung des elektrischen Leitwertes eines Sensors bei einer Messung mit Milch, die verschiedene Konzentrationen von Antibiotika enthält.
7b zeigt die entsprechende Dosisabhängigkeit des elektrischen Leitwertes des Sensors von 7a.
8 bis 14 zeigen verschiedene Verfahren und Sensoren zur Detektion eines Analyten in einer Probe gemäß unterschiedlicher Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung.
15 zeigt besondere geometrische Abmessungen der Wand eines Sensors gemäß weiterer Ausführungsbeispiel der Erfindung.
16 zeigt geometrische Abmessungen der Wand weiterer Ausführungsbeispiele eines Sensors.
17 ist eine schematische Darstellung eines Herstellungsverfahrens eines Sensors gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
In den Figurenbeschreibungen werden für die gleichen oder ähnlichen Elemente die gleichen Bezugsziffern verwendet.
1 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors. Das Flussdiagramm der 1 weist als Schritt S1 das Bereitstellen eines Sensors, einer Bindungseinheit, eines Sensormoleküls und einer Probe mit dem Analyten auf. Dabei sind die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert. Im Schritt S2 wird der Sensor, das Sensormolekül und der Analyt zusammengeführt, wodurch sich ein Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand oder von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand verändert. Diese Veränderung des Bindungszustandes ist mit dem Schritt S3 dargestellt. Dabei ändert sich der Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund, also kausal abhängig von, der Anwesenheit des Analyten. In dem ersten Zustand ist das Sensormolekül an die Bindungseinheit gebunden und in dem zweiten Zustand ist das Sensormolekül von der Bindungseinheit losgelöst. Dieses Verfahren kann auch als elektrisches Verfahren bezeichnet werden, da der Schritt S4, das Detektieren einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, enthalten ist. Dabei basiert die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf der Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit.
Dieses Verfahren der 1 ermöglicht es, hochspezifische Interaktion sowohl zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül als auch zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten zu verwenden und vorteilhaft auszunutzen. Mit anderen Worten kann das in der 1 gezeigt elektrische Detektionsverfahren für die Detektion eines Analyten in einer unbekannten Probe genutzt werden. Das Verfahren kann dynamische und reversible Bindungsverhältnisse zwischen diesen Komponenten verwenden und ausnutzen. Die Detektion des Analyten basiert daher auf der spezifischen und selektiven Veränderung der Bindung des Sensormoleküls in Abhängigkeit von der Anwesenheit des Analyten. Dabei handelt es sich um ein sogenanntes label-freies Detektionsverfahren, was also ohne weitere Markierungsmoleküle auskommt. Alternativ dazu kann das Verfahren der 1 auch als Verfahren zur Detektion von Änderungen in der Molekülinteraktion zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül durch die Anwesenheit eines potentiellen Wirkstoffs (drug) ausgeführt werden. Dieses Ausführungsbeispiel des Verfahrens kann also ein effizientes und sensitives sogenanntes drug screening Verfahren für Fälle bereitstellen, in welchen der Benutzer den Inhalt der Probe kennt, nämlich den zu untersuchenden Wirkstoff, und seine Auswirkungen auf die Molekülinteraktion eines gegebenen Paars aus Sensormolekül und Bindungseinheit untersuchen möchte.
Weiter Details und zusätzliche Aspekte des Verfahrens können den folgenden Figurenbeschreibungen zu den 2 bis 17 entnommen werden.
2a und 2b zeigen jeweils eine Aufnahme eines Rasterelektronenmikroskops einer Wand 303, die in einem Sensor gemäß der vorliegenden Erfindung als Gatter verwendet wird. Dabei ist der Querschnitt der Wand 303 in beiden Figuren deutlich zu sehen. Diese Wand wurde mittels Atomlagenabscheidung (atomic layer deposition, ALD) basierter Spacer-Lithographie (ASL) hergestellt. Gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung weist ein solcher Sensor eine Wand der Länge L auf, die größer ist als eine Länge ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1 mm, 10 mm, 5 mm, 1 cm, und 5 cm. Jedoch sind auch Wandlängen im Mikrometer-Bereich möglich, da das hierin beschriebene Herstellungsverfahren eine solche Länge ermöglicht. Das Detektionsverfahren kann, falls gewünscht, einen Sensor mit diesen Geometrien und/oder Geometrien, die im Folgenden angegeben sind, verwenden. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist ein solcher Sensor eine Wand mit Dicke D auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 10 bis 500 nm, 10 bis 250 nm, 10 bis 50 nm, 10 bis 20 nm, 20 bis 100 nm, und 40 bis 100 nm. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel weist ein solcher Sensor eine Wand mit einer Höhe H auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 100 nm bis 5 um, 250 nm bis 5 µm, 500 nm bis 5 µm, 500 nm bis 1 µm, 1 µm bis 2 µm, und 1 µm bis 4 µm.
Ein solcher Sensor 200 bzw. ein solches Herstellungsverfahren für den Sensor 200 kann vorteilhafterweise das große Verhältnis zwischen der Oberfläche und dem Volumen des Sensors, bzw. der Wand des Sensors, ausnutzen. Unter der Vielzahl von halbleitenden Materialien haben Zinkoxid(ZnO)-basierte Materialien vielversprechende Eigenschaften für Feldeffekttransistoren und optische chemische, Gas- und biologische Sensoren. Aber auch andere Halbleitermaterialien können natürlich für die Wand 300 verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es dem Nutzer, beispielsweise dünne Zinkoxidfilmschichten mit Atomlagenabscheidung (ALD) zu verwenden, um die Sensorplattform herzustellen. Die Atomlagenabscheidung hat den Vorteil, dass beliebige und hohe Aspektverhältnis aufweisende Nanostrukturen über eine große Fläche, beispielsweise eine Wafer-Fläche, sehr kontrolliert und homogen herstellbar sind und eine Massenproduktion erlauben. Der Vorteil der hier beschriebenen ALD-basierten Spacer-Lithographie (ASL) ist ihre Variabilität hinsichtlich des verwendeten Materials und der möglichen Steuerung der Dimensionen der Wand 300. Die Dimension der Dicke kann bis in den Ångström-Bereich (1 Ångström = 10^–10 m) hinein gesteuert werden, wobei die Höhe der Struktur mit dem darunter liegenden Resistfilm kontrolliert werden kann, was für enorm hohe Aspektverhältnisse von Wänden 303 als Nanostrukturen auf Wafer-Skala ausgenutzt werden kann.
Zinkoxid bringt als n-typ Halbleiter für den hier beschriebenen Sensor und das hier beschriebene Messverfahren spezifische Vorteile mit sich. Die Biofunktionalisierung von Zinkoxid selbst und die Langlebigkeit des Sensors in Pufferlösungen stellen Herausforderungen dar. Eine Möglichkeit, um photokorrosive Stabilität in wässrigen Lösungen von Zinkoxid zu realisieren, ist die Beschichtung der Oberfläche mittels eines stabilen Materials durch eine weitere Atomlagenabscheidung. Falls gewünscht kann ein homogenes Wachstum von Atomlagen mittels ALD-Schichten über die 3D-Nanostrukturen bei tiefen Temperaturen erfolgen. Beispielsweise kann eine dünne Schicht Aluminiumoxid verwendet werden, welche die Langlebigkeit in wässrigen Lösungen verbessert und gleichzeitig als Dielektrikum für den Feldeffekttransistor fungiert. Metalloxidoberflächen wie Aluminiumoxid können durch organische Liganden mit hohen K-dielektrischen Eigenschaften modifiziert werden. Ebenso bilden Carbonsäuren als Linker stabile sogenannte self-assembled monolayers (SAM) auf der Sensoroberfläche. Die Adsorption oder Desorption von negativ geladenen Molekülen auf den Aluminiumoxid-Gate erhöht oder erniedrigt die Oberflächenladung, was als Modulation des Liquid Gate Potentials angesehen werden kann. Die Erhöhung der gesamten Oberflächenladung führt zu Aufbiegung des Valenzbandes (E_V) und des Leitungsbandes (E_C) des Zinkoxids, was den Effekt eines erniedrigten elektrischen Leitwertes hat. Die Gesamtladung wird erniedrigt, wenn negativ geladenen Moleküle von der Oberfläche entfernt werden, was die Bandaufbiegung reduziert. Daher ist der elektrische Leitwert im Resultat vergrößert. Das Detektionsverfahren und der Sensor der vorliegenden Erfindung können diese Effekte nutzen.
3 zeigt eine schematische Darstellung eines Sensors 200 zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Falls gewünscht kann der Sensor zur Detektion eines Analyten 300 in der Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors eingesetzt werden. Auch ein zuvor beschriebenes drug-screening kann damit durchgeführt werden. Der Sensor weist eine Transistorstruktur mit einem ersten metallischen Kontakt 301 als Zufluss, einem zweiten metallischen Kontakt 302 als Abfluss und einem Gatter 303 auf. Dabei wird das sogenannte Liquid Gate verwendet, in dem das Molekül/die Moleküle auf der Oberfläche des Gatters 303 das Gatterpotential zur Verfügung stellt/stellen. Dabei ist an dem Gatter eine Bindungseinheit 304 immobilisiert. Darüber hinaus ist das Gatter als nanoskalige Wand 306 zwischen dem ersten metallischen Kontakt und dem zweiten metallischen Kontakt ausgeführt. Ebenso hat die Wand einen rechteckigen Querschnitt. Dabei ist ein zeitlicher Ablauf des Detektionsverfahrens in 3 von links nach rechts gezeigt. An der ersten Wand 303 auf der linken Seite der 3 ist eine Bindungseinheit 304 an der Wand 306 immobilisiert. Durch Zugabe des Sensormoleküls 305 in die Sensorumgebung erfolgt eine spezifische Bindung zwischen der Bindungseinheit 304 und dem Sensormolekül 305. Bei Zugabe des Analyten 300, wie im rechten Teil der 3 illustriert, wird eine Konformationsänderung des Sensormoleküls 305 verursacht, so dass sich das Sensormolekül von dem gebundenen Zustand an der Bindungseinheit 304 in den gelösten Zustand begibt. Da nach Zugabe des Analyten 300 bei elektrischer Auslesung dies als Änderung der Oberflächenladungen auf dem Gatter 303 gemessen werden kann, ist ein eindeutiger Nachweis des Analyten 300 in der untersuchten Probe möglich. Dabei kann die Bindungseinheit 304 beispielsweise als doppelsträngiger Oligonukleotid, als Protein oder als immobilisierter Analyt ausgeführt sein. Ebenso gibt es viele verschiedene Ausführungsformen für das Sensormolekül 305. Unterschiedlichste Analyten 300 können mit dem hier beschriebenen Messverfahren detektiert werden. Dies wird im Kontext der weiteren Figuren veranschaulicht und weiter erklärt werden. Ebenso kann eine Quantifizierung der Menge des Analyten in der Probe erfolgen.
4 zeigt ein weiter konkretisiertes Ausführungsbeispiel. Die Detektion von Medikament-Target-Interaktionen in Echtzeit ist für die Medikamentenentwicklung oder für kontaminierte Lebensmittel/Flüssigkeiten ein wertvolles Mittel. Durch die vorliegende Erfindung war es zum ersten Mal möglich, die Oberflächen von Nanowänden für die elektrische Echtzeitdetektion und Quantifizierung von Antibiotika mit einem Tet-Repressor-Sensorprotein (TetR) 400 durchzuführen. Der Sensor 200 in 4 weist Nanostrukturen mit einem hohen Aspektverhältnis auf, welche durch Atomlagenabscheidung und Spacer-Lithographie hergestellt wurden. Die Wände 303 werden dabei als Gatter der gezeigten Transistorstruktur in 4a verwendet. Die Oberflächen der Gatter 303 wurden mit der Bindungseinheit 401 funktionalisiert, welche aus Oligonukleotiden, die die Sequenz des Operators tetO aufweisen, besteht. An diese Bindungseinheit bindet das Tet-Repressor Protein (TetR) 400 in einer spezifischen Weise. Dieses Sensorprotein 400, das als Sensormolekül fungiert, wird von der Bindungseinheit 401, hier ausgeführt als Operator-DNS, in einer dosisabhängigen Weise wieder freigegeben, wenn das Sensormolekül 400 mit dem Analyten 402, dem Tetracyclin-Antibiotikum, in Verbindung kommt. Als Resultat ist der elektrische Leitwert entsprechend moduliert, da sich die gesamte Oberflächenladung verändert. Dies wird weiter mit Bezug auf die 5–7 erklärt werden. Mit anderen Worten wird in 4 anhand des Sensors 200 der Schaltmechanismus der Sensorproteine 400 dargestellt, die zunächst an die funktionalisierten Oberflächen 303 des Sensors 200 gebunden sind und anschließend wieder freigegeben werden. Wie im Folgenden erklärt wird, kann das dabei beschriebene Detektionsverfahren und der hier gezeigte Sensor beispielsweise verwendet werden, um Antibiotika-Rückstände in Milch von Kühen nachzuweisen, die weit unter dem maximalen Rückstandswert liegen, den die Europäische Union erlaubt. Selbstverständlich sind vielzählige andere Anwendungen mit der vorliegenden Erfindung möglich.
Es wurde zum ersten Mal die Echtzeitmessung dynamischer molekularer Wechselwirkungen auf Basis von elektrischen Messungen ermittelt. Im nachfolgenden Beispiel wird exemplarisch dargelegt, dass der nanostrukturierte Sensor für das Überwachen der Bindung des Tetracyclin-Repressors (TetR) an seine Operator-DNS und die entsprechende induzierbare Freigabe des TetR durch die Hinzufügung von Tetracyclin zuverlässig detektiert werden kann. Die vorliegende Erfindung erlaubt es daher, ultrasensitive Messungen von Tetracyclin-Konzentrationen durchzuführen. Die vorteilhafte Eignung dieses neuen nanostrukturierten Sensors und des zugehörigen Detektionsverfahrens wird im Folgenden durch die exakte Quantifizierung von Tetracyclin in biologisch komplexen Proben wie Milch nachgewiesen.
Zunächst werden detaillierte Angaben über die vorbereitenden Maßnahmen zur Durchführung der Experimente erläutert:
Herstellung des TetR-Proteins:
Das DNS-bindende Protein TetR wurde gemäß Ref. 1 hergestellt (Ref.: 1: Christen, E.; Karlsson, M.; Kampf, M.; Weber, C.; Fussenegger, M.; Weber, W. Protein Expr Purif. 2009, 66, 158–164). Kurz zusammengefasst wurden zur Expression eines TetR-Proteins mit C-terminalem Hexahistidin-Tag E. coli BL21* (DE3) pLysS-Zellen mit dem Plasmid pWW307 transformiert und die Proteinexpression wurde in LB-Medium bei OD₆₀₀ = 1 mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) für 4 h bei 37°C induziert. Die Zellen wurden zentrifugiert (6000 × g, 7 min, 4°C) und in Lysepuffer resuspendiert (40 ml pro 1000 ml ursprünglichen Kulturvolumen, 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0), unter Verwendung einer Frech-Press aufgeschlossen (1000 bar, 3 Durchgänge, APV, DK, Albertslund, APV-2000) und der Zellrückstand wurde durch Zentrifugation bei 30000 × g für 30 Minuten bei 4°C entfernt. Das Lysat wurde auf eine Ni²⁺-NTA-Agarose-Superflow-Schwerkraftssäule (10 ml Lysat pro ml Volumen an Ni²⁺-NTA-Agarose-Kügelchen, Qiagen, Hilden, Deutschland, Kat.-Nr. 30210) aufgetragen, anschließend mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer, 10 Säulenvolumina Waschpuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) gewaschen und die Elution erfolgte mit 2 Säulenvolumina Elutionspuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0). Nach Zugabe von 10% Saccharose wurde das TetR-Protein bis 0,6 mg/ml aufkonzentriert, gefriergetrocknet und bei –80°C gelagert. Für die Experimente wurde das lyophilisierte TetR-Protein durch Zugabe von H₂O aufgelöst. Die Proteinkonzentration wurde durch die Bradford-Methode (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, Kat.-Nr. 500-0006) mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt.
Hybridisierung der Carbonsäure-terminierten doppelsträngigen Oligonukleotide (tetO):
Für die Erzeugung von doppelsträngiger Operator-DNS zur Bindung des TetR-Proteins wurden die Oligonukleotide oRG128 (5'-actccctatcagtgatagagaaa-3') und oRG229 (5'-tttctctatcactgatagggagt-3',5'-COOH funktionalisiert von IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), Kat.-Nr. 5-0210-23X) in äquimolaren Mengen (50 μM je Oligonukleotid) in 1x SSC-Puffer (15 mM Natriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 7) gemischt, bei 95°C für 5 Minuten inkubiert und anschließend langsam (2°C pro min) auf Raumtemperatur abgekühlt.
Funktionalisierungsverfahren:
Jede Vorrichtung wurde für 2 Stunden mit Carbonsäure-terminierten doppelsträngigen tetO Oligonukleotiden (tetO) funktionalisiert. Um nicht gebundene Moleküle zu entfernen, wurde die Vorrichtung dann in deionisiertem Wasser gespült. Um Oberflächenbereiche mit unspezifischer Proteinbindung zu blockieren, wurde für 30 Minuten 1% (v/v) Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Aldrich, Kat.-Nr. 05479) in Bindungspuffer (0,01 mM Tris, 0,01 mM MgCl₂ und 0,06 mM NaCl) zugegeben.
Probenvorbereitung der Antibiotika:
Tetracyclin wurde von Applichem (AppliChem, Darmstadt, Deutschland, Kat.-Nr. A1685,0025) erhalten und in Ethanol als eine 2 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Erythromycin wurde von Sigma-Aldrich (Kat.-Nr. E-5389) erhalten und in Ethanol als eine 10 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Ampicillin wurde von Roth (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland, Kat.-Nr. K029.2) erhalten und in H₂O als eine 100 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Gentamycin wurde von Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Lausen, Schweiz, Kat.-Nr. 380-003-G005) erhalten und in H₂O als eine 20 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Die Stammlösungen wurden in Bindungspuffer oder Milch auf die endgültige experimentelle Konzentration verdünnt.
Experimente:
4a zeigt zunächst das Grundprinzip des Sensors 200. In diesem Experiment hatte die Wand des Sensors eine Länge von etwa 500 μm. An dem Sensor 200 der 4 wird zunächst ein doppelsträngiges Oligonukleotid, der Operator tetO gebunden. An den doppelsträngigen Operator Oligonukleotid kann der Tetracyclin-Repressor in einer Sequenz-spezifischen Weise binden. Die hier verwendeten tetO-Oligonukleotide weisen eine Carboxylsäureende an dem 5'-Ende eines Stranges auf. Die elektrischen Eigenschaften, wie zum Beispiel der elektrische Leitwert zwischen Zufluss und Abfluss (G_DS) ist in 4b dargestellt und wird nach der Funktionalisierung gemessen (Schritt 1). Während des Annäherns des TetR Proteins zu der DNS, wird es einen Ladungstransfer von adsorbierenden Proteinen geben und der Leitwert sinkt aufgrund der n-Typ-Charakteristik von Zinkoxid (Schritt 2). Die Gesamtladung von TetR (isoelektrischer Punkt pI = 6,2) ist negativ im Falle einer umgebenden Pufferlösung (pH 7,8). Ein Waschschritt beseitigt die nicht gebundenen Proteine und das Signal des Leitwertes wird erneut gemessen, wobei ein leichter Anstieg des Leitwerts festgestellt wird. Wenn zu diesem funktionalisierten Sensor 200 dann Antibiotika der Tetracyclin-Familie zugegeben werden (Schritt 3), lösen sie durch Binden an das TetR Protein eine Konformationsänderung der Proteinstruktur aus. Dadurch wird der TetR-TetC-Komplex von der tetO-modifizierten Sensoroberfläche 303 freigegeben was zu einer Reduktion der Ladung an der Sensoroberfläche führt. Ein anschließender Waschschritt 4 erfolgt, um letztlich die nicht gebundenen TetR-TetC-Komplexe zu entfernen, so dass die erhöhte elektrische Leitfähigkeit erneut gemessen werden kann. In unseren Experimenten haben wir den Sensor 200 einer 0,1 mM (1 millimolar = 1 mol/m³) Pufferlösung ausgesetzt. Das Sensormolekül liegt in einer Lösung vor, wobei die Lösung 3 μg pro ml TetR enthält, und wobei der Sensor für 30 Minuten in der Lösung verbleibt. Anschließend wird der Nanowand-Sensor Tetracyclin ausgesetzt, wobei Lösungen von 1 pM (1 picomolar = 10^–9 mol/m³) zu 1 μM (1 micromolar = 10^–3 mol/m³) in Bindungspufferlösungen verwendet wurden.
5a beschreibt das gesamte zeitaufgelöste experimentelle Verfahren der 4, um das dosisabhängige Profil der TetR-modifzierten Gatter 303 für Tetracyclin zu erhalten. Die Zeit 0 sec beim Schritt 1 beschreibt die Exposition des Nanowand-Sensors mit dem schon gebundenen TetR gegenüber einem Bindungspuffer, bis eine stabile Basislinie erreicht wird. Anschließend wird 1 pM Tetracyclin in Bindungspuffer zu dem System zugegeben, was in Schritt 2 der 5a gezeigt ist, und was zu einem schnellen Anstieg des elektrischen Leitwertes führt (hier ist die absolute Veränderung des Leitwertes in Bezug auf die Basislinie gezeigt). Zu diesem Zeitpunkt binden die Tetracyclin-Moleküle das Tet-Repressor-Protein, was zu einer Konformationsänderung des TetR-Proteins und zur Freigabe des Tetracyclin-TetR-Komplexes von seiner Bindungseinheit, dem tetO, führt. Ein zusätzlicher Waschschritt 1 führt zu einer weiteren Erhöhung des Leitwertes, da die dissoziierten Tetracyclin-TetR-Komplexe nicht mehr in der Nanostruktur-Oberflächengegend vorhanden sind (die Leitwertmessung nach dem Waschen dauert wieder 2 min). Von da ab wird die Tetracyclin-Dosis im Bindungspuffer in Zehnerschritten auf bis zu 1 μM erhöht, was durch die Schritte 3, 4, 5, 6, 7 und 8 dargestellt ist. Zwischen diesen Schritten wird der Sensor 200 jeweils mit Bindungspuffer gespült und wird in dem Bindungspuffer für 2 Minuten hinsichtlich seines Leitwertes vermessen. Das System ist äußerst sensitiv, mit einer Detektionsgrenze unter 1 pM. Die Daten sind in der 5b auf einer linearen und einer logarithmischen Skala zusammengefasst. Durch Datenanalyse, bei dem dieser Plot gefittet wird und bei dem eine Dosisantwortfunktion verwendet wird, kann eine Assoziationskonstante k_ass in dem Bereich von 10⁹ M^–1 gefunden werden, was in Übereinstimmung ist mit den Daten, die in der Literatur für solche TetR-Tetracyclin-Interaktionssysteme angegeben werden.
Wichtiger erscheint uns der Punkt, dass der Sensor 200 in der Lage ist, elektronisch Rückstände von Tetracyclin geringer als 1 pM zu detektieren, was weiter unter dem maximalen Rückstandslevel der Europäischen Union von 100 μg pro kg liegt. Diese Sensitivität ist aus fachmännischer Sicht nicht auf die hier exemplarisch gezeigte Anwendung beschränkt. Das macht das hier im Detail beschriebene Messverfahren, basierend auf dem hier beschriebenen Sensor, sehr viel sensitiver als bisher bekannte Methoden, wie beispielsweise Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA). Insgesamt ist daher festzuhalten, dass der Sensor 200 und das damit durchgeführte Verfahren eine starke Verbesserung der Sensitivität im Vergleich zu konventionellen Methoden zur Detektion von Medikament-Target-Wechselwirkungen bietet.
Für industrielle Zwecke und auch für die Zukunft ist es wichtig, Sensoren bereitzustellen, die zuverlässig und wiederholbar Messungen durchführen. Im folgenden Experiment der 6 wird eine tetO-modifizierte Wand eines Sensors mehrfach TetR und Tetracyclin ausgesetzt. Im Schritt 1 wird die elektrische Leitfähigkeit des funktionalisierten Sensors in einem Bindungspuffer gemessen, bis eine stabile Basislinie erreicht wird. Anschließend werden 3 μg pro ml TetR Proteine (3 μg/ml in Bindungspuffer) zu dem Sensor hinzugegeben, wobei der elektrische Leitwert während der Inkubationszeit von ca. 6 Minuten fällt. Ein Waschschritt und eine Messung der elektrischen Leitfähigkeit direkt nach der Inkubation wurde durchgeführt. Anschließend wurde 50 nM (1 nanomolar = 10^–6 mol/m³) Tetracyclin in Bindungspuffer hinzugefügt (Schritt 3) und der dissoziierte Tetracyclin-TetR-Komplex wurde weggewaschen und der Leitwert des Systems wurde in Bindungspuffer gemessen, was durch den Schritt 1 indiziert wird. Eine anschließende TetR-Inkubation und Tetracyclin-indizierte Beseitigung wurde zwei weitere Male durchgeführt, um den entsprechenden Schalteffekt und die Wiederholbarkeit an dem Sensor zu demonstrieren. Der finale Schritt 4 wurde durchgeführt, um 10 nM Tetracyclin zu detektieren und es wurde immer noch eine Veränderung im Leitwert erkannt, was beweist, dass der Sensor immer noch voll funktionstüchtig ist.
Nachdem erfolgreich die Quantifizierung von Tetracyclin-Konzentrationen mit dem Nanowand-Sensor mit hoher Sensitivität demonstriert wurde, wurde der Sensor anschließend einer weiteren, praktischen Anwendung zugeführt, um die Detektion und Quantifizierung von Antibiotikum von veterinären Produkten, zum Beispiel Milch, zu belegen. Dabei wird im Folgenden die Detektion von Tetracyclin in Milch und die Kreuzsensitivität zu anderen antibiotischen Klassen erläutert. Für dieses Experiment wurde rohe Milch ohne jegliche antibiotische Kontamination verwendet. Diese Milch wurde dann in verschiedene Probenröhrchen verteilt und mit verschiedenen exemplarischen Antibiotikumsklassen (Tetracyclin, Erythromycin, Ampicillin und Gentamicin) in Konzentrationen gemäß dem maximalen Rückstandslevel der Europäischen Union versehen. Dieses maximale Rückstandslevel (MRL) ist 100 μg pro Liter, 40 μg pro Liter, 4 μg pro Liter, und 100 μg pro Liter für Tetracyclin, Erythomycin, Ampicillin und Gentamicin. Für die Messungen wurde die Milch um 3 Größenordnungen verdünnt. In 7a wurde zunächst die Kreuzsensitivität durch Exponierung des Sensors in verschiedenen Milchlösungen mit Antibiotika-Bestandteilen getestet. Der Schritt 1 entspricht immer dem Waschschritt mit Bindungspuffer und den Messungen in dem Bindungspuffer.
Im Schritt 2 wurde reine, unkontaminierte, verflüssigte, organische Milch in Bindungspuffer in die Messzelle eingeführt, wobei kein Effekt während dieses Waschschrittes bemerkt wurde. Anschließend wurde die verflüssigte Milch, welche Erythomycin, Ampicillin, Gentamicin enthält, in den Schritten 3, 4 und 5 dem Sensor zugeführt. Wie der 7a zu entnehmen ist, wurde keine signifikante Veränderung des elektrischen Leitwertes beobachtet, was zeigt, dass das TetR-Protein nicht auf andere Antibiotika-Klassen als Tetracyclin reagiert. Dies belegt die Spezifität und Selektivität der vorliegenden Erfindung.
Anschließend wurde die mit Tetracyclin kontaminierte Milch dem Sensor zugeführt, was einer Konzentration zwischen 10 fM (1 femtomolar = 10^–12 mol/m³) und 100 pM nach einer 2000-fachen Verdünnung entspricht und den verdünnten MRL darstellt. Das Experiment in 7a wurde um das genannte Dosisantwortprofil erweitert, was die Schritte 6 bis 9 für entsprechend angewendete Konzentrationen umfasst. Die durchschnittlichen Dosisantwortdaten der getesteten Milchproben sind in der 7b auf linearer und logarithmischer Skala zusammengefasst und stimmen mit dem Dosisantwortprofil der 5b überein, bei welchen nur Puffer verwendet wurde. Wie durch die hier dargestellten Experimente gezeigt wurde, erfolgt zum ersten Mal eine einfache Fabrikation eines Sensors, welcher in der Lage ist, schnell ultrageringe Konzentrationen von Antibiotikarückständen wie Tetracyclin in realen biologischen Systemen wie Milch nachzuweisen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in diesem Beispiel ultralange Nanowände mit einem hohen Aspektverhältnis aus Zinkoxid/Aluminiumoxid hergestellt wurden, um diese erfolgreich mit doppelsträngiger Operator-DNS zu funktionalisieren und mit Tet-Repressor-Proteinen zu beladen. Der Kontakt des Sensors mit verschiedenen Konzentrationen von Tetracyclin-Antibiotika, die an das TetR-Protein binden, gefolgt von einer Konformationsänderung in dem Protein führen zu der Freigabe und einer Veränderung in den elektrischen Eigenschaften aufgrund einer Ladungsmodulation auf der Nanowand-Oberfläche und einer korrespondierenden Biegung der Bänder, die hier durch den elektrischen Leitwert gemessen werden kann. Die elektrische Leitfähigkeit zwischen dem Zufluss und dem Abfluss des Sensors wurde kontinuierlich gemessen und Konzentrationen im Bereich von 1 pM und 1 μM wurden detektiert, wobei eine typische Assoziationskonstante von ca. 10⁹ M^–1 bestimmt wurde. Der Schaltmechanismus des Bindens, der Freigabe des Proteins sowie die Wiederholbarkeit und Verlässlichkeit wurden gezeigt, indem der Sensor mehrere Male TetR-Proteinen und Tetracyclin zugeführt wurde. Wir wiederholten den Test mit anderen Ausführungsbeispielen und Proben des Sensors, wobei entsprechend ähnliche Sensorcharakteristiken festgestellt wurden. Experimente mit verdünnter reiner Milch, und mit Milch, die in kontrollierter Weise mit TetR-spezifischen Tetracyclinen sowie mit Antibiotika von anderen Klassen verunreinigt wurde, wurden durchgeführt. Reine Milch und Antibiotika anderer Klassen zeigen eine vernachlässigbare Reaktion auf TetR und bewirken keine Änderung in der Leitfähigkeit des Sensors, was eine sehr gute Selektivität des Sensors demonstriert. Milch, die mit Tetracyclin gemäß dem maximalen Rückstandslevel der EU versetzt wurde, wurde getestet. Konzentrationen bis hinab zu 100 fM wurden erfolgreich durch den Sensor detektiert.
Es wurde also erneut gezeigt, dass der Sensor und das Detektionsverfahren geeignet ist, um eine Quantifizierung von Antibiotika oder im Allgemeinen die Detektion der Wechselwirkung von kleinen Molekülen (small molecules) auf der Oberfläche zu ermöglichen. Die Bindung und das Ablösen von solchen konformitätsändernden Molekülen kann mittels des hier angegebenen Sensors und Verfahrens detektiert werden. Mit anderen Worten stellt der hier präsentierte Sensor und das korrespondierende Messverfahren das Konzept zur elektrischen Quantifizierung von Medikament-Target-Interaktionen in Echtzeit dar. Als exemplarisches Ausführungsbeispiel ist die Detektion von Tetracyclin-Antibiotika in Milch aufgeführt und andere Beispiele sind angegeben. Die Auswirkung dieses grundlegenden Konzepts geht über die spezifische Anwendung hinaus, da TetR für eine ganze Familie von DNS-bindenden Regulator-Proteinen steht, der TetR-Familie, deren spezifische Bindung an jeweilige DNS Operatorsequenzen sich in Antwort auf viele verschiedene small molecules wie Medikamente, Metabolite, Vitamine oder Metalle verändert. Daher lassen sich die zuvor bezüglich der 4 bis 7 dargelegten Ausführungen aus fachmännischer Sicht ebenso auf andere Protein-DNS Kombinationen anwenden, bei denen die TetR-tetO-Komplexe entsprechend ersetzt werden. Daher kann die hierein beschriebene Technik verwendet werden, um viele verschiedene Arten von small molecules schnell und sensitiv zu quantifizieren. Darüber hinaus sind auch Protein-Protein Kombinationen anwendbar. Dies könnte z. B. bei der Medikamentenentwicklung im einfachsten Fall auch zum Screenen von small molecule Bibliotheken genutzt werden, um diejenigen Kandidaten zu identifizieren, die eine gegebene Protein-Protein-Wechselwirkungen spezifisch beeinflussen.
Diesbezüglich zeigen die 8 bis 14 unterschiedliche Sensoren und Detektionsverfahren gemäß weiteren Ausführungsbeispielen. Dabei sind unterschiedliche Ausführungsformen des Sensormoleküls 305 und unterschiedliche Ausführungsformen der Bindungseinheit 304 gezeigt. Insbesondere zeigt 8 einen Sensor mit einem Gatter 303, auf dem als Bindungseinheit 304 ein erstes Protein 800 immobilisiert ist. Es wird der freie Analyt 300 zu diesem Sensor 200 hinzugefügt, so dass sich der Analyt und das Protein 1 zu einem neuen Epitop 801 verbinden. Bei Zugabe des zweiten Proteins 802, welches als Sensormolekül fungiert, entsteht der Komplex 803 auf oder an dem Gatter 303. Das zweite Protein bindet daher an das neue Epitop 801. Dabei kann beispielsweise FKBP das Protein P1, Rapamycin der Analyt und FRB das Protein 2 sein.
9 beschreibt ein anderes Ausführungsbeispiel, bei dem das erste Protein 900 als Bindungseinheit 304 ausgeführt ist und der bivalente Analyt 300 hinzugefügt wird. Dabei entsteht ein neuer Komplex 901, der jedoch im Vergleich zu 8 kein neues Epitop darstellt. Das zweite Protein 902 wird als Sensormolekül 305 hinzugefügt und es entsteht der Komplex 903 auf dem Gatter 303. Das erste Protein 900 kann beispielsweise GyrB, der Analyt kann Coumermycin und das zweite Protein kann GyrB sein.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt 10 ein immobilisiertes erstes Protein 1000, das als Bindungseinheit 304 fungiert. Das zweite Protein 1001, das die Funktion des Sensormoleküls 305 übernimmt, bindet an das erste Protein. Nach der Hinzugabe des freien Analyten 300 konkurriert dieser mit dem bereits gebundenen Protein P2, um die Bindung zu dem immobilisierten Protein P1. Schließlich bindet der Analyt 300 an das erste Protein 1000 und bildet einen neuen Komplex 1002, wodurch die Bindung zwischen dem ersten Protein und dem zweiten Protein aufgehoben bzw. durchbrochen wird. Als Beispiel kann FM als erstes Protein, FM als zweites Protein und FK506 als Analyt genannt werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel zeigt 11, dass auf dem Gatter 303 an Analyt 1100 immobilisiert ist, der in diesem Ausführungsbeispiel als Bindungseinheit 304 fungiert. Nach Zugabe des Sensormoleküls 305, das hier als erstes Protein ausgeführt ist, bindet dieses an den immobilisierten Analyten 304. Nach Zugabe eines freien ungebundenen Analyten 300 bindet dieser an das Protein 1 und dieser Komplex dissoziiert von dem immobilisierten Analyten. Als Beispiel kann ein immobilisiertes Antigen A als Analyt 1100, als Protein P1 ein Antikörper und als freier Analyt wieder das immobilisierte Antigen genannt werden.
Ein weiteres Beispiel ist in 12 gezeigt, welches die Fortsetzung der 9 darstellt. Aufbauend auf dem Komplex 903, können das zweite Protein P2 und der Analyt als Sensormolekül 305 gesehen werden. Nach Zugabe des monovalenten Analyten A₂ 300 konkurriert dieser mit dem Sensormolekül 305 um die Bindung an das Protein P1, welches auf dem Gatter immobilisiert ist. Als Beispiel kann GyrB als P1, Coumermycin als Analyt A, GyrB als P2 und Novobiocin als monovalenten Analyten A₂ 300 genannt werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt 13, wie ein erstes Protein als am Gatter immobilisierte Bindungseinheit 304 ausgeführt ist. Anschließend wird ein Protein-2-Analyt-Komplex als Sensormolekül 305 dem Sensor zugeführt, so dass ein entsprechender Komplex 1300 entsteht. Nach Zugabe eines freien Analyten 300 konkurriert dieser mit dem Sensormolekül um die Bindung an das immobilisierte Protein P1, was zur Ersetzung des Sensormoleküls 305 durch den freien Analyten 300 im Protein P1 führt. Als Beispiel kann Anti-Fluorescein scFv als P1, BSA-FITC als Komplex P2-A und freies Fluorescein als freier Analyt genannt werden.
14 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, in dem ein Analyt 1401 auf einem ersten Protein 1400 immobilisiert ist, wobei das erste Protein seinerseits an dem Gatter 303 immobilisiert ist. Dieser Komplex dient als Bindungseinheit 304. Ein zweites Protein 1402 kann hinzugefügt werden, welches an den Analyten bindet. Der Komplex bestehend aus dem zweiten Protein und dem Analyten wird als Sensormolekül 305 verwendet. Nach Hinzufügung des freien Analyten 300 entsteht ein dem Anfangszustand ähnlicher Komplex 1404, der aus dem ersten Protein und dem freien Analyten besteht. Als Beispiel kann BSA-FITC als Komplex P1-A, Anti-fluorescein scFv als P2 und freies Fluorescein als freier Analyten dienen.
Die 15 und 16 zeigen jeweils unterschiedliche geometrische Abmessungen eines Gatters eines Sensors zur Detektion eines Analyten gemäß verschiedener Ausführungsbeispiele der Erfindung. Es ist das Gatter 303 auf dem Substrat 1500 gezeigt, wobei weitere Elemente des Sensors 200 der Übersichtlichkeit halber hier nicht dargestellt sind. In 15 sind die Parameter Dicke D, Höhe H und Länge L der Wand gezeigt. Insbesondere sind gemäß spezifischen Ausführungsbeispielen zwei Relationen angegeben, in welchen für den Sensor gilt, dass D ≤ H ≤ L oder D ≥ H ≤ L. Das Gatter 303, das als Wand ausgeführt ist, hat in 15 einen rechteckigen Querschnitt. Jedoch ist auch ein quadratischer Querschnitt möglich. Ebenso ist die Herstellung eines dreieckigen Querschnitts möglich, wie in der 16 gezeigt. Mit einem Sensor dieser geometrischen Abmessungen wird eine besonders gute Responsivität bei dem Nachweis geänderter Oberflächenladungen erreicht. Mit anderen Worten erlaubt ein solcher Sensor ein präzises und verlässliches Verfahren zur Detektion eines Analyten in einer Probe auf Basis der Detektion der Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors.
17 zeigt die Fabrikation eines Sensors gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung. Mit anderen Worten ist in 17 ein Verfahren zur Herstellung eines Sensors angegeben, welches die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen eines strukturierten Substrates, Bereitstellen einer Wand eines Halbleiters auf dem strukturierten Substrat, und Aufbringen eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand, wodurch eine Transistorstruktur bereitgestellt wird. Im Detail wird im Verfahren der 17 eine 1 µm dicke Siliciumoxid-Schicht auf einem Silicum(100)-Wafer verwendet. Hoch auflösender TSMR Photoresist wird verwendet und Standard-Photolithographie mit ultraviolettem Licht wird zur Entwicklung in MIF726 (Entwicklerlösung, Metall-Ionen Frei) verwendet, um parallele rechtwinklige Streifen 1700 mit extremen vertikalen Seitenwänden von 400 µm Höhe über den gesamten Wafer im Zentimeterbereich zu erzeugen. Anschließend werden 50 µm polykristallines Zinkoxid in dreidimensionaler Art und Weise über die Streifen 1700 abgeschieden, wobei dies mittels Tieftemperatur-Atomlagenabscheidung (115°C, DEZ Precursor) erfolgt, um eine homogene Schicht 1701 zu erreichen. Anschließend wird reaktives Ionen-Ätzen (RIE) ausgeführt, um anisotrop auf der Oberseite der Streifen 1700 und auf dem Boden des Substrates 50 nm Zinkoxid wegzuätzen, so dass nur das Zinkoxid an den Seitewänden des Photoresists stehenbleibt. Ein zusätzlicher Sauerstoffplasmaprozess bei 220°C entfernt die Resist-Streifen 1700, wodurch freistehende Zinkoxid-Nanowände erhalten werden. Die Höhe und die Dicke (das Aspektverhältnis) der Nanowände kann durch die Höhe des Resist und der abgeschiedenen Dicke der Atomlagenabscheidung bestimmt werden. Eine Metallverdampfung von 400 µm Aluminium/Goldschicht erfolgt anschließend, um die elektrischen Zufluss- und Abflusskontakte bereitzustellen. Anschließend wird das Gatter-Dielektrikum, bestehend aus einer 5 µm dicken Aluminiumoxid, durch einen zusätzlichen ALD-Prozess (200°C, TMA Precursor) aufgebracht. Der dadurch entstehende Sensor 200 wird dann elektronisch mittels Bonding von Aluminiumdrähten verbunden und die elektrischen Kontakte mittels PDMS elektrisch passiviert.
Ergänzend sei darauf hingewiesen, dass ”umfassend” keine anderen Elemente oder Schritte ausschließt und ”eine” oder ”ein” keine Vielzahl ausschließt. Ferner sei darauf hingewiesen, dass Merkmale oder Schritte, die mit Verweis auf eines der obigen Ausführungsbeispiele beschrieben worden sind, auch in Kombination mit anderen Merkmalen oder Schritten anderer oben beschriebener Ausführungsbeispiele verwendet werden können.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors, das Verfahren aufweisend die Schritte: Bereitstellen eines Sensors, einer Bindungseinheit, eines Sensormoleküls und einer Probe mit dem Analyten (S1), wobei die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert sind/ist, Zusammenführen des Sensors, des Sensormoleküls und des Analyten (S2) wodurch sich ein Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand oder von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand verändert (S3), wobei sich der Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit auf Grund der Anwesenheit des Analyten verändert, wobei das Sensormolekül in dem ersten Zustand an die Bindungseinheit gebunden ist und wobei das Sensormolekül in dem zweiten Zustand von der Bindungseinheit losgelöst ist, das Verfahren weiterhin aufweisend den Schritt Detektieren einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors (S4), und wobei die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf der Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormoleküls und der Bindungseinheit basiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bindungseinheit an dem Sensor immobilisiert ist, und wobei das Sensormolekül in dem ersten Zustand an die Bindungseinheit und darüber an den Sensor gebunden ist und wobei das Sensormolekül in dem zweiten Zustand von der Bindungseinheit und von dem Sensor losgelöst ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit dosisabhängig von einer Dosis des Analyten in der Probe erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Sensor einen ersten metallischen Kontakt als Zufluss, einen zweiten metallischen Kontakt als Abfluss und ein Gatter aufweist, wobei die Bindungseinheit an dem Gatter des Sensors angeordnet ist, und wobei das Detektieren der Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit zwischen dem Zufluss und dem Abfluss detektiert.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Sensor als Gatter eine Wand mit einem rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt zwischen dem Zufluss und dem Abfluss aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin aufweisend den Schritt: Herstellen einer ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten (S5), und wobei die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit auf Grund der hergestellten ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, Herstellen einer zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit (S6), und Lösen der zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit auf Grund der Anwesenheit des Analyten (S7).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die Herstellung der ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten eine Konformationsänderung des Sensormoleküls bewirkt wodurch die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit verursacht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Bindungseinheit auf dem Sensor immobilisiert ist, und wobei die Bindungseinheit ein doppelsträngiges Oligonukleotid ist.
Verfahren zur Detektion eines Antibiotikums gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Analyt ein Antibiotikum ist, und wobei das Sensormolekül ein entsprechender Antibiotikum-Repressor ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine Kombination aus dem Sensormolekül und dem Analyten ausgewählt ist aus der Liste von Kombinationen bestehend aus Analyt Sensormolekül Trp TrpR Arg ArgR Phe TyrR Val, Ile, Leu CodY O-Acetyl-Serin CymR 4-Hydroxyphenylpyruvat HpdR Ornithin OruR Leu Lrp SAM McbR Citrat CcpC Pyruvat PdhR Lactat LldR 2-Oxoglutarat NrpR 2-Oxoglutarat GltC NADH Rex Fructose-6-P SugR L-Arabinose AraR Maltotriose Tgr Xylose XylR Tagatose-6-P LacR Trehalose-6-P TreR Fructose-1,6-bis-P CggR Fructose-1-P ScrR Maltose TrmB Saccharose MsmR Glyoxylat IclR Langkettiges Acyl-CoA FadR Palmitoyl-CoA DesT Biotin-AMP BirA cAMP GlxR Sulphat SsuR Formyl-THF QscR Cholin BetI Harnsäure HucR Propandiol PocR 17-beta-Östradiol Bm3R1 UTP PyrR Cytidin CytR Uracil, Thymin RutR Deoxyribose-5-P DeoR
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Bindungseinheit ein erstes Protein ist, wobei das erste Protein auf dem Sensor immobilisiert ist, wobei das Sensormolekül ein zweites Protein ist, und wobei eine Kombination aus dem ersten Protein, dem zweiten Protein und dem Analyten ausgewählt ist aus der Liste von Kombinationen bestehend aus Erstes Protein Zweites Protein Analyt GyrB (Gyrase Untereinheit B) GyrB Coumarin-Antibiotika FKBP (FK-bindendes Protein) FRB (Domäne von FRAP) Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren) FM (F36M mutant of FKBP) FM Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren) FKBP FKBP Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapalogs, mTOR-Inhibitoren) FKBP Cyp (Cyclophilin) Rapamycin, FK506 und Derivate davon (z. B. Rapalogs, mTOR-Inhibitoren), Cyclosporine Cyp Cyp Cyclosporine und Derivate davon ToxT (aus V. cholerae) ToxT Virstatin DHFR (Dihydrofolatreduktase) DHFR Methotrexat und Derivate davon
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Bindungseinheit ein immobilisierter Analyt ist, wobei das Sensormolekül ein Protein ist, und wobei eine Kombination aus dem immobilisierten Analyten und dem Protein ausgewählt ist aus der Liste von Kombinationen bestehend aus Protein Analyt GyrB Coumarin-Antibiotika FKBP mTOR-Inhibitoren FRP mTOR-Inhibitoren FM mTOR-Inhibitoren Cyp Cyclosporine Cyp Ascomycine DHFR Antifolat Strepatvidin Biotin Avidin Biotin Neutravidin Biotin Steroidhormonrezeptoren Steroidhormone und Analoga ToxT Virstatin
Sensor (200) zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten (300) in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, der Sensor aufweisend: eine Transistor Struktur mit einem ersten metallischen Kontakt (301) als Zufluss, einem zweiten metallischen Kontakt (302) als Abfluss und einem Gatter (303), wobei an dem Gatter eine Bindungseinheit (304) oder eine Sensormolekül (305) immobilisiert angeordnet ist, wobei das Gatter als Wand (306) zwischen dem ersten metallischen Kontakt und dem zweiten metallischen Kontakt ausgeführt ist, und wobei die Wand einen rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt aufweist.
Sensor gemäß Anspruch 14, wobei die Wand eine Länge L, eine Dicke D und eine Höhe H aufweist, und wobei für den Sensor die Relation D ≤ H ≤ L oder die Relation D ≥ H ≤ L gilt.
Sensor gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei die Bindungseinheit an dem Gatter immobilisiert ist, und wobei die Bindungseinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus doppelsträngigem Oligonukleotidstrang, Protein und immobilisiertem Analyt, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GyrB (Gyrase Untereinheit B), FKBP (FK-bindendes Protein), FM (F36M Mutante von FKBP), Cyp, ToxT (aus V. cholerae), DHFR (Dihydrofolatreductase), und wobei der immobilisierte Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Coumarinantibiotika, Rapamycin, FK506, FK506 Derivate, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporin, Closporin, Closporinderivate, Ascomycine, Antifolat, Biotin, Steroidhormone und Analoga, Virstatin, Methotrexat, und Methotrexatderivate.
Verfahren zur Herstellung eines Sensors zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, das Herstellungsverfahren aufweisend die Schritte: Bereitstellen eines strukturierten Substrates (MS 1), Bereitstellen einer Wand eines Halbleiters auf dem strukturierten Substrat (MS2) derart, dass die Wand einen rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt aufweist, und Aufbringen eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand wodurch eine Transistor Struktur bereitgestellt wird (MS3).
Verfahren gemäß Anspruch 17, weiterhin aufweisend den Schritt: Abscheiden der Wand mittels Atomlagenabscheidung des Halbleiters auf dem strukturierten Substrat.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, weiterhin aufweisend die Schritte: Bereitstellen einer Bindungseinheit und/oder eines Sensormoleküls, und Immobilisieren der Bindungseinheit und/oder des Sensormoleküls an der Wand, wobei die Bindungseinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus doppelsträngigem Oligonukleotid, einem ersten Protein, und einem immobilisierten Analyt, wobei das erste Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GyrB (Gyrase Untereinheit B), FKBP (FK-bindendes Protein), FM (F36M Mutante von FKBP), FKBP, Cyp, ToxT (aus V. cholerae), DHFR (Dihydrofolatreduktase), und wobei der immobilisierter Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Coumarin-Antibiotika, Rapamycin, FK506, FK506-Derivaten, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporinen, Closporin, Closporin-Derivaten, Ascomycinen, Antifolat, Biotin, Steroidhormonen und Analoga, Virstatin, Methotrexat und Methotrexatderivaten.
Verwendung eines Sensors gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten, wobei der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ein Antibiotikum, einer niedermolekularen Verbindung in der Probe, Coumarin-Antibiotika, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporinen, Ascomycinen, Antifolat, Biotin, Steroidhormonen und Analoga, Virstatin, Coumarin-Antibiotika, Rapamcin, FK506 und Derivate davon, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporinen, Cyclosporin-Derivaten, Methotrexat, und Methotrexatderivaten.