WO2014140329A2 - Elektrisches verfahren zum nachweis von änderungen in molekülinteraktionen - Google Patents

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protein
binding unit
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Andreas Menzel
Raphael GÜBELI
Wilfried Weber
Margit Zacharias
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Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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    • G01N27/4146—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS involving nanosized elements, e.g. nanotubes, nanowires

Definitions

  • the invention relates to the detection of changes in molecule interactions in general and the detection of molecules in a sample in particular.
  • the invention relates to a method for detecting changes in molecule interactions by means of an analyte in a sample based on detection of a change in electrical conductivity of a sensor. Furthermore, the invention relates to a sensor for detecting changes in molecule interactions, a method for producing such a sensor and the use of such a sensor.
  • Labeling molecules labels
  • a limited sensitivity with it In particular, the detection of most low molecular weight substances, in particular antibiotics, in liquid samples is currently only optically possible.
  • Detection of changes in molecule interactions according to the features of the independent claims.
  • the described embodiments equally relate to the method for detecting changes in molecule interactions, the sensor, the method of manufacturing a sensor and the use of the sensor.
  • features set forth below with respect to the method for detecting changes in molecule interactions may also be used in the sensor, the use of the sensor, and optionally the method of manufacturing the sensor, and vice versa.
  • a method of detecting changes in molecular interactions by an analyte in a sample based on detection of a change in electrical conductivity of a sensor.
  • the method includes the step of providing a sensor, a binding moiety, a sensor molecule, and a sample with the analyte.
  • the binding unit and / or the sensor molecule is at the
  • the method comprises combining the sensor, the sensor molecule and the analyte, wherein the bonding changes a binding state between the sensor molecule and the binding unit from a first state to a second state or from the second state to the first state. This changes the
  • Binding state between the sensor molecule and the binding unit due to the presence of the analyte In the first state, the sensor molecule is bound to the binding unit and in the alternative second state
  • the inventive method further comprises the step of detecting a change in an electrical conductivity of the sensor, wherein the change in the electrical conductivity of the sensor on the change of the bonding state between the
  • this method of the present invention may be embodied as a method of detecting an analyte in a sample based on detection of a change in electrical conductivity of a sensor. Therefore, in the following, the method of the present invention will also be referred to as a detection method.
  • Detection method can therefore be in the case of a given, unknown
  • the method of the present invention may also be practiced as a method of detecting changes in molecular interaction between the binding moiety and the sensor molecule through the presence of a drug.
  • the method of the present invention is referred to as a detection method.
  • This embodiment can provide an efficient and sensitive so-called drug screening method for cases in which the user knows the contents of the sample, namely the drug to be tested, but its effects on the drug
  • targeted searches can be made for active substances, in particular medical active substances, which are suitable for producing a desired change in the molecule interaction.
  • active substances in particular medical active substances, which are suitable for producing a desired change in the molecule interaction.
  • the user can supply a potentially suitable active substance to the sensor.
  • a change in the molecule interaction, in particular a binding or detachment, between the sensor molecule and the binding unit is caused by the potential drug, created by the sensor
  • This embodiment of the present invention is applicable to protein-protein combinations, for example. This could be z. For example, in drug development, it may also be used to screen small molecule libraries to identify those candidates that specifically affect a given protein-protein interaction. Overall, with the detection method of the present invention, the influence of the presence of the drug on the molecule interaction between the binding unit and the sensor molecule can be examined and detected.
  • the term “analyte” may describe both the substance, in particular the molecule, which is detected in the sample by the detection method of the present invention.
  • the term “analyte” may likewise describe the substance, in particular the molecule, which thereupon acts as an active ingredient It is examined whether this is a change in the molecule interaction between an interaction pair consisting of sensor molecule and binding unit is caused.
  • the sensor can be provided with the analyte in pure form.
  • the sample consists of the analyte.
  • the present invention also encompasses applications in which the analyte is supplied to the sensor in the form of a mixture, for example a solution. Further details and examples will be further described below.
  • the method according to the invention makes use of the fact that the change in the electrical conductivity of the sensor is caused by the presence of the analyte.
  • conformational changes of the used Sensor molecules are used, which are specifically dependent on the
  • the method can also advantageously make use of two specific bindings.
  • This single or double specificity can be used to increase the sensitivity in the detection of the analyte or to detect a change in a molecule interaction.
  • This method after the step of combining based on the used first specific binding and the specific second binding used, can determine the presence of the analyte in the sample based on the change in the evoked electrical conductivity of the sensor.
  • the method of the present invention may also use the competition between bonds between the sensor molecule, the binding moiety, and the analyte. This is further explained, for example, in detail with reference to the embodiments of FIGS. 8 to 14.
  • the method presented herein it is possible to provide a label-free (i.e., label-free) method. It can therefore be designed as a label-free method for detecting the analyte or as a label-free method for the search and / or analysis of active ingredients.
  • the electrical detection method is capable of real-time measurement.
  • the electrical detection method described here both a first embodiment under protection, in which due to the presence of the analyte in the sensor environment bound to the binding unit
  • Sensor molecule performs a conformational change and thereby detached from the binding unit and thereby also from the sensor. This will be explained further below and can be taken, for example, from FIG. 4 and the associated description. Furthermore, the electrical
  • Detection method a second embodiment under protection, according to which the sensor molecule is not initially bound to the binding unit and therefore is in a state detached from the binding unit.
  • the analyte is added to the sample, so the analyte in the
  • the sensor molecule undergoes a conformational change and thereby binds to the binding unit.
  • This change in state causes a change in the electrical conductivity of the sensor, which is detectable by the sensor.
  • the method makes use of this conductivity change and thereby detects the analyte in the sample or a change in the molecule interaction.
  • the method uses a change in the surface charge on the sensor, for example on the gate of the sensor, for electrical detection.
  • the sensor molecule may be an electrically charged molecule.
  • the binding unit is to be regarded as a biological, biochemical or chemical entity to which the sensor molecule can bind as a function of the presence / absence of the analyte.
  • the binding unit is embodied for example as a double-stranded oligonucleotide, a first protein, or an immobilized analyte.
  • the term "oligonucleotide" can be understood as nucleic acid sequence or nucleic acid.
  • the binding unit may be immobilized on the sensor, but alternatively, the sensor molecule may also be immobilized on the sensor, or both may be immobilized on the sensor.
  • conventional immobilization techniques known to those skilled in the art can be used.
  • the step of merging the sensor, the sensor molecule and the analyte can be carried out sequentially, that is stepwise. In particular, first the sensor with the binding unit can be brought into contact with the sensor molecule and only then the analyte is added. But also a different order is possible.
  • the method of the invention utilizes the causality between the presence of the analyte in the vicinity of the sensor molecule and the binding behavior of the analyte
  • the method can be used to detect biomolecular interactions on ultralong nanowalls with a high molecular weight
  • Aspect ratio can be used. For example, this is an electrical
  • the change in the electrical conductivity allows an inference to a change in the bond between the sensor molecule and the binding unit and / or the analyte to be detected in the sample.
  • the binding unit and / or the sensor molecule can be immobilized on a wall, in particular on a nanowire, that is to say on a nanoscale wall, of the sensor.
  • a wall in particular on a nanowire, that is to say on a nanoscale wall, of the sensor.
  • Advantageous geometries of the wall will be described in more detail later. It should be noted here that in one embodiment of the sensor of the present invention with the wall and a thin-film structure may be meant. In particular, a
  • continuous thin film can be used as a gate between the two metallic contacts of the sensor.
  • a continuous thin film can be used as a gate between the two metallic contacts of the sensor.
  • a 100 nm thick zinc oxide film with a thin alumina layer on it was produced. Details will be explained further below.
  • nanosensors make it possible to perform the detection method reliably, quickly and repeatably.
  • a wafer can be microstructured, ultrathin layers being produced by atomic layer deposition.
  • centimeter-long nanostructures or nanowalls can be produced with high precision and in the desired arrangement.
  • thin nanowalls can be produced so that one can speak of nanolines.
  • contact by means of lithography is possible. This makes it possible to produce sensors which have walls or nanostructures with a length in the centimeter range, which has a strong responsiveness, ie a strong one
  • the detection method according to the invention can be carried out particularly well.
  • bio-molecules can generally be charged depending on the pH of the environment. Depending on the pH, protonate or
  • a method of synchronously detecting different analytes according to a method described herein. This method further comprises the step of performing the method on a plurality of sensors, wherein the plurality of sensors is arranged on a chip or a wafer.
  • this enables the multiplexed detection of various substances in liquid samples.
  • This embodiment enables rapid and simultaneous detection of various analytes on a chip or wafer.
  • the sample which is brought into contact with the sensor, contain one or more active ingredients.
  • different binding units and simultaneously different sensor molecules in this embodiment can be used simultaneously in one sensor.
  • Binding units or sensor molecules on different walls of the sensor can be used for this purpose. This allows a separate readout of the signal on each wall, which allows a binding units / sensor molecule specific reading per wall.
  • the method uses a sensor with a wall of length L, thickness D and height H, wherein the relation D ⁇ H ⁇ L or the relation D> H ⁇ L holds for the sensor.
  • the relation D ⁇ H ⁇ L walls having a high aspect ratio are provided.
  • the binding unit is immobilized on the sensor and the sensor molecule is bound in the first state to the binding unit and thus / to the sensor.
  • the sensor molecule is in the second state detached from the binding unit and from the sensor.
  • the binding unit makes the bond between the
  • the change in the binding state between the sensor molecule and the binding unit is dependent on the dose of the analyte in the sample.
  • the detection method is dependent on the dose of the analyte in the sample.
  • the cause of the detection method is dependent on the dose of the analyte in the sample.
  • the method of the present invention is a highly specific detection method. It can clearly detect the presence of the analyte in the sample. This is further demonstrated by Figures 4-7 and the underlying data.
  • the senor has a first metallic contact as inflow, a second metallic contact as outflow and an electrical gate, hereinafter referred to as gate.
  • the binding unit is arranged on the gate of the sensor. Detecting the
  • this measures the electrical conductivity change between the inflow and the outflow after the analyte has been added to the sample. Due to the resulting altered bonding relationships between the sensor molecule and the binding moiety, dislodging or binding, can be determined by the presence of the analyte in the sample by detecting a corresponding change in the electrical conductance.
  • a time interval which is less than 10 min, 5 min, 2 min, 1 min, 30 sec, 10 sec, 4 sec, 2 sec, or 1 sec is between the step of merging and detecting.
  • the detection method of the present invention offers the possibility of a
  • Detection method can be provided. The same advantages apply to the embodiment of the drug screening method described above. According to a further embodiment of the invention, a
  • Quantification of the amount of analyte in the sample based on the detected change in the electrical conductivity of the sensor.
  • the senor can be calibrated. This happens, for example, by an additional gate contact.
  • the gate voltage can modulate the conductivity of the sensor.
  • By applying a certain gate voltage series it is possible to conclude the surface charge in a certain range.
  • the net surface charge is known to be at a certain pH value and then, by the calibrated conductivity change, can deduce the number of proteins dissolved and thus the number of molecules in the analyte imply. Further possibilities for quantification open up to the
  • the method comprises the step of establishing a first specific binding between the sensor molecule and the analyte.
  • the change in the binding state between the sensor molecule and the binding unit occurs due to the first specific binding produced between the sensor molecule and the analyte.
  • Figures 3 to 14 show various aspects of an electrical detection method using such a first specific binding. Various combinations of sensor molecules and analytes will be given later.
  • the method further comprises the step of establishing a second specific binding between the sensor molecule and the binding unit, and the step of solving the second specific binding between the sensor molecule and the binding unit due to the presence of the analyte.
  • the production of the first specific binding between the sensor molecule and the analyte causes a conformational change of the sensor molecule, whereby the change of the binding state between the sensor molecule and the binding unit is caused.
  • a conformational change can be seen by way of example from FIG. 4, in which the sensor molecule 305 after binding to the
  • the analyte may also compete with binding to the binding unit.
  • the binding unit is immobilized on the sensor, and the binding unit is by a
  • the double-stranded oligonucleotide may have a region or an oligonucleotide sequence to which the sensor molecule used specifically binds. Detailed examples will be described below.
  • the analyte is a
  • Molecule and the sensor molecule a corresponding repressor protein.
  • the analyte is a
  • Antibiotic and the sensor molecule a corresponding antibiotic repressor or a corresponding repressor protein.
  • this method provides for the electrical detection of antibiotics by detecting a change in electrical conductivity of the sensor.
  • the antibiotic may be embodied as tetracycline, but other antibiotics may also be detected therewith, as further set forth below.
  • a combination of the sensor molecule and the analyte is selected from the list of combinations consisting of
  • Escherichia coli a member of the Lad family, in its complexes with inducer trehalose-6-phosphate and noninducer trehalose. Protein Sci 7, 2511-2521 (1998).
  • Pseudomonas aeruginosa is mediated by a transcriptional regulator, OruR. J Bacteriol 179, 7834-7842 (1997).
  • the transcriptional regulator SsuR activates expression of the Corynebacterium glutamicum sulphonate genes in the absence of sulphate. Mol Microbiol 58, 480-494 (2005).
  • Methanococcus maripaludis roles of the euryarchaeal repressor NrpR, 2-oxoglutarate, and 2 operators. J Biol Chem 280, 5236-5241 (2005).
  • Lysines 72, 80 and 213 and aspartic acid 210 of the Lactococcus lactis LacR repressor are involved in the response to the inducer tagatose-6-phosphate leading to the induction of lac operon expression. Protein Eng 6, 201-206 (1993).
  • HpdA degradation gene hppd is transcriptionally activated by HpdA and repressed by HpdR in Streptomyces coelicolor, while hpdA is negatively autoregulated and repressed by HpdR. Mol Microbiol 65, 1064-1077 (2007).
  • the binding unit is a first protein immobilized on the sensor, and the sensor molecule is a second protein.
  • FIGS. 8, 9, 10, 12, 13 and 14 Various examples of such detection methods and corresponding sensors, in which combinations of first and second proteins are used, can be taken from FIGS. 8, 9, 10, 12, 13 and 14 as well as the respectively associated description.
  • a combination of the first protein, the second protein and the analyte is selected from the list of combinations consisting of
  • GyrB (Gyrase GyrB coumarin antibiotic subunit B)
  • FKBP FK-binding FRB rapamycin, FK506 and
  • Protein domain of derivatives thereof (e.g.
  • FM F36M mutant FM rapamycin, FK506 and FKBP derivatives thereof (e.g.
  • Derivatives e.g., rapalogs, mTOR inhibitors
  • cyclosporins e.g., rapalogs, mTOR inhibitors
  • ToxT (from V. ToxT Virstatin
  • DHFR dihydrofolate DHFR methotrexate
  • the binding unit is a first protein and the sensor molecule is a second protein which is immobilized on the sensor.
  • the binding unit is an immobilized analyte, wherein the sensor molecule is a protein.
  • Detection method for this embodiment and the associated sensor can also be taken from the figure 11.
  • an immobilized analyte is disposed on the gate of the sensor and provides the binding unit 304.
  • another free analyte 300 may compete with the first protein for binding to the immobilized analyte and displace the protein 1.
  • this changes the binding state of the sensor molecule 305 which can be determined as a change in the electrical conductivity of the sensor between inflow and outflow because of the concomitant change in the surface charge at the sensor / gate.
  • a combination of the immobilized analyte and the protein is selected from the list of
  • the binding unit is a first nucleic acid
  • the sensor molecule is a second nucleic acid
  • the second nucleic acid is designed such that it binds to the first nucleic acid via base pairing.
  • the analyte is a third nucleic acid, the third
  • Nucleic acid is designed such that it binds by base pairing either to the first nucleic acid or the second nucleic acid.
  • first, second and third nucleic acids DNA and RNA and modified derivatives thereof, e.g. Thioester bonds, functionalization of the bases, phosphate residues, and / or sugar groups with other charged molecules, can also be used in combination.
  • analyte ie the third nucleic acid
  • a competitive interaction occurs between the second and third nucleic acids with respect to the
  • the competition can lead to the second
  • nucleic acid Deleting nucleic acid from the first nucleic acid and correspondingly the third nucleic acid via corresponding base pairing to the second or first
  • Nucleic acid binds. By detachment of the second nucleic acid from the first nucleic acid, a charge change on the surface is caused. This process can be electrically detected according to the present invention.
  • the first nucleic acid is covalently bound to the sensor.
  • the binding unit is a first nucleic acid
  • the sensor molecule is a second nucleic acid
  • the second nucleic acid is designed such that it binds by base pairing to the first nucleic acid.
  • the analyte is designed as a molecule, as a low molecular weight compound, or as a protein. The analyte is designed to bind to the first nucleic acid or to the second nucleic acid.
  • the analyte is a molecule such as e.g. a low molecular weight compound such as a drug or as a protein.
  • a molecule such as e.g. a low molecular weight compound such as a drug or as a protein.
  • Embodiment binds the second nucleic acid to the first nucleic acid.
  • Either the first nucleic acid or the second nucleic acid or both nucleic acids may be an aptamer.
  • a detachment of the second from the first nucleic acid takes place. This leads to a charge change on the surface. This process can be done according to the
  • aptamer is understood to mean a short single-stranded DNA or RNA oligonucleotide having 25 to 70 bases, which can bind a specific molecule via its 3D structure.
  • the sensor molecule is a linker which is bound to the sensor. Furthermore, a protein or another molecule is bound to the linker. The binding moiety is designed as the linker with the protein bound thereto.
  • the analyte is a hydrolytic enzyme which, when combined with the sensor and the linker attached thereto, specifically cleaves the linker such that a portion of the linker with the protein or other molecule is released from the sensor.
  • the hydrolytic enzyme may be, by way of example and not limitation, a protease, peptidase, esterase or deoxyribonuclease (DNase). But also other hydrolytic enzymes can be used. In these configurations, the linker is designed to be specifically cleaved by the hydrolytic enzyme.
  • DNase deoxyribonuclease
  • the enzymatic cleavage of the linker causes the protein bound to the linker or the other molecule with a part of the linker is detached from the surface. This causes a change in the electrical charge on the surface, which can be electrically detected according to the present invention.
  • a sensor for detecting changes in molecular interactions by means of an analyte in a sample based on detection of a change in electrical conductivity of the sensor, the sensor being constructed in accordance with one described herein
  • This sensor can be used in all embodiments of the detection method described herein, unless otherwise specified.
  • a sensor for detecting changes in molecular interactions by means of an analyte in a sample based on detection of a change in electrical conductivity has a transistor structure with a first metallic contact as an inflow, a second metallic contact as a drain and a gate.
  • a binding unit or a sensor molecule is immobilized on the gate.
  • the gate is designed as a wall or as a nanostructure between the first metallic contact and the second metallic contact.
  • the wall has a rectangular, square, trapezoidal or triangular cross section.
  • a sensor for detecting an analyte in a sample based on a detection of a change in electrical conductivity of the sensor is specified. Therefore, the sensor described herein does not use so-called nanowires, which may be known in the art, and which are made by methods using, for example, the Vapor-Solid (VS) or the Vapor Liquid Solid (VLS) mechanism. Such nanowires of the prior art have a round cross-section and a wire-like structure. Because such a
  • nanowires are referred to in the art as "one-dimensional" objects, whereas the present invention employs sensors that gate a wall having a rectangular, square, trapezoidal or triangular shape
  • Thin-film structure has.
  • a continuous thin film can be used as a gate between the two metallic contacts of the sensor.
  • the thin film is made of a semiconductor material, such as zinc oxide, and may have an additional overlying protective layer of, for example, aluminum oxide.
  • Both layers can be deposited by atomic layer deposition. This is further illustrated by the corresponding manufacturing method of the present invention, for example, in FIG. 17.
  • the sensor can be efficiently and accurately provided to the user using the manufacturing methods set forth herein.
  • the wall of the gate can be designed as a nanowire, which can have different lengths, heights and thicknesses and can fulfill various associated relations. This will be specified further below.
  • the senor in this and in any other embodiment may be designed as a field effect transistor or diode and have a PN junction.
  • the gate as metallic back contact, as a so-called back gate executed.
  • a so-called liquid gate in which the molecule or molecules on the surface provide the gate potential is also possible.
  • Embodiment of the present invention which can be used in the detection method.
  • the sensor material has a certain surface charge.
  • molecules are neutrally charged at the isoelectric point (pl). If the pH is below the pl, the molecules are positively charged, the pH is above the pl, the molecules are negatively charged.
  • Exemplary sensor materials are ZnO and / or A1203.
  • ZnO has a pI in the range 9-10 and is relatively positively charged for neutral pH values.
  • the surface charge of the semiconductor can increase the affinity of surface functionalization. Proteins often have low pI values, so that they are usually negatively charged.
  • the senor is arranged on a chip or a wafer.
  • the sensor has a CMOS structure and the sensor is designed as an integrated circuit.
  • the sensor has a multiplicity of field-effect transistor structures arranged in parallel with one metallic contact each as a feed, in each case one metallic contact as drain, and one in each case between them
  • the binding unit is immobilized on the gate of the sensor.
  • the binding unit is selected from the group consisting of double-stranded oligonucleotide strand, protein, and immobilized analyte.
  • This protein is further selected from the group consisting of GyrB (gyrase subunit B), FKBP (FK binding protein), FM (F36M mutant of FKBP), Cyp, ToxT (from V. cholerae), DHFR (Dihydrofolate reductase).
  • the immobilized analyte is selected from the group consisting of coumarin antibiotics, rapamycin, FK506, FK506 derivatives, rapalogs, mTOR inhibitors, cyclosporins, closporin, closporin derivatives, ascomycins, antifolate, biotin, steroid hormones and analogues, virstatin,
  • Methotrexate and methotrexate derivatives are methotrexate and methotrexate derivatives.
  • Nucleotide / O ligonucleotide with a protein or with an immobilized analyte on the sensor possible.
  • the binding unit is embodied as a protein, again a number of embodiments are possible.
  • a method for producing a sensor includes the step of providing a patterned substrate and includes the step of providing a wall of a semiconductor on the patterned substrate such that the wall is rectangular, square, triangular, or rectangular
  • the method includes the steps of applying a first metallic contact and a second metallic contact to the wall, thereby providing a transistor structure with the sensor. It should be noted that the individual process steps this
  • Manufacturing process again may have a plurality of sub-steps, as they are further explained for example in the context of Figure 17.
  • the method can be seen as a combination of microsystems technology and nanotechnology, which allows the production of nanoscale sensors on a wafer scale.
  • atomic layer deposition also atomic layer deposition, ALD
  • ALD atomic layer deposition
  • a thin-film structure can thus be produced.
  • a continuous thin film may be provided as a gate between the two metallic contacts.
  • a 100 nm thick ZnO film with a thin A1 2 0 3 layer is formed thereon.
  • this layer structure may correspond to the aforementioned criterion that D> H ⁇ L.
  • Such a thin-film structure is also referred to as a wall in the context of the present invention, as it also extends between the first metallic contact and the second metallic contact, that is the inflow and outflow, as in the other embodiments of the wall of the sensor.
  • centimeter-long nanostructures or nanowalls can be provided as walls for a sensor (s) on the wafer. This can be considered as an exemplary line structure. Such nanowalls can then be used as gate of the sensor described here and enable a particularly sensitive detection method for a wide variety of analytes or a particularly sensitive method of drug-screening. This manufacturing method therefore allows the production of sensors for multiplex detection of
  • the substrate may be made of silicon. But it can also be a non-conductive substrate, which can also be flexible. For example, it could be a foil or the material used is paper or paper. This embodiment of the sensor can then be produced as a cost-effective disposable disposable product.
  • the method comprises the step of depositing the wall by means of atomic layer deposition of the semiconductor on the structured substrate.
  • the method comprises the further steps of providing a
  • the binding unit may be a double-stranded oligonucleotide, a first protein and an immobilized analyte.
  • the first protein and the immobilized analyte may be made according to the embodiments set forth herein.
  • the method may include the additional step of depositing an additional layer via atomic layer deposition over the provided wall to provide the sensor with a protective layer.
  • the manufacturing method comprises the step of partially removing the deposited semiconductor by etching.
  • the substrate is designed as a silicon wafer.
  • the method further comprises the step of
  • Depositing a silicon oxide layer on the silicon wafer and also has the step of using photoresist and ultraviolet light to produce parallel, rectangular strips of photoresist on.
  • a homogeneous layer of the semiconductor in particular zinc oxide, is deposited over the strips by means of atomic layer deposition, or by means of low-temperature deposition, for depositing the wall.
  • Atomic layer deposition or deposited by means of low-temperature atomic layer deposition are atomic layer deposition or deposited by means of low-temperature atomic layer deposition.
  • a step of reactive ion etching is performed so that anisotropically on an upper side of the strips and on a bottom of the substrate the semiconductor is etched away so that only the semiconductor remains on the side walls of the photoresist.
  • RIE reactive ion etching
  • Oxygen plasma process performed, whereby the strips of photoresist removed and resulting in freestanding semiconductor walls, especially zinc oxide walls.
  • the wall is designed as a continuous thin-film structure.
  • Thin-film structure made of zinc oxide and above the zinc oxide is arranged as an additional layer of aluminum oxide. According to a further embodiment of the invention, the
  • Manufacturing process the following steps. Providing a patterned substrate by depositing a silicon oxide layer on the silicon wafer and using photoresist and ultraviolet light to form parallel, rectangular strips of photoresist.
  • the substrate is designed as a silicon wafer.
  • the walls of the semiconductor are also provided by performing an oxygen plasma process, thereby removing the strips of photoresist, thereby obtaining free-standing semiconductor walls such that the walls have a rectangular, square, triangular, or trapezoidal cross-section.
  • the walls have a length L, a thickness D and a height H and it applies to the walls
  • the fabrication method further comprises the steps of depositing an additive layer over the provided walls of the semiconductor and depositing a first metallic contact and a second metallic contact on the wall, thereby forming a transistor Structure is provided.
  • the thin film has a thickness of less than 10 ⁇ m, less than 5 ⁇ m, less than 2 ⁇ m, less than 1 ⁇ m, less than 500 nm, less than 200 nm, less than 100 nm, less than 50 nm, less than 20 nm or less than 10 nm ,
  • This thicknesses of the functional semiconductor material may be combined with a protective layer as described in the context of the present invention. This protective layer may, for example, be between 1 nm and 200 nm thick.
  • the thickness of this protective layer may be less than 10 nm, less than 5 nm or less than 2 nm.
  • the use of a sensor described herein for detecting changes in molecule interactions by means of an analyte is provided.
  • a sensor as described herein for detecting an analyte in a sample is provided.
  • the analyte may be selected from the embodiments set forth herein.
  • the use of the sensor according to the invention allows a fast and reliable detection of a wide variety of analytes, depending on which binding unit and / or which sensor molecule are used. Since the sensor is also relatively easy and relatively inexpensive to manufacture, it is interesting for industrial applications. The same benefits apply to the
  • the present invention can be used in principle for various ways of detecting an analyte in a sample and is not limited to the specified combination of the features of claim 1 and the dependent
  • FIG. 1 shows a flowchart of a detection method according to FIG.
  • Figures 2a and 2b show a sensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows a sensor and a corresponding method for detecting changes in molecule interactions according to an embodiment of the invention
  • FIG. 4a shows a sensor and a method for the detection of tetracycline antibiotics according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 4b shows the development over time of the electrical conductivity of the sensor from FIG. 4a during the performance of the method.
  • FIG. 5a shows a time-resolved measurement of the electrical conductance of the sensor from FIG. 4a with addition of various concentrations of the analyte.
  • FIG. 5b shows a dose-dependence of a measurement of the electrical conductance of the sensor from FIG. 4a.
  • FIG. 6 shows a reversibility test of the sensor from FIG. 4a.
  • FIG. 7 a shows the time-resolved development of the electrical conductivity of a sensor when measured with milk containing various concentrations of.
  • FIG. 7b shows the corresponding dose dependence of the electrical conductance of the sensor of FIG. 7a.
  • FIGS. 8 to 14 show various methods and sensors for detecting an analyte in a sample according to different embodiments of the present invention.
  • Fig. 15 shows particular geometric dimensions of the wall of a sensor according to another embodiment of the invention.
  • Fig. 16 shows geometric dimensions of the wall of further embodiments of a sensor.
  • 17 is a schematic diagram of a manufacturing method of a sensor according to an embodiment of the invention.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a method for the detection of
  • the flowchart of FIG. 1 comprises, as step S1, the provision of a sensor, a binding unit, a sensor molecule and a sample with the analyte.
  • the binding unit and / or the sensor molecule are immobilized on the sensor.
  • step S2 the sensor, the sensor molecule and the analyte are brought together, whereby a bonding state between the sensor molecule and the
  • Binding unit changed from a first state to a second state or from the second state to the first state. This change of
  • Binding state between the sensor molecule and the binding unit due to, thus causally dependent on, the presence of the analyte.
  • the sensor molecule In the first state, the sensor molecule is bound to the binding unit and in the second state, the sensor molecule is detached from the binding unit.
  • This method may also be referred to as an electrical method because step S4, detecting a change in electrical conductivity of the sensor, is included. there Based on the change in the electrical conductivity of the sensor on the
  • Bond unit This method of FIG. 1 makes it possible to use and advantageously exploit highly specific interaction both between the binding unit and the sensor molecule and between the sensor molecule and the analyte.
  • the electrical detection method shown in FIG. 1 can be used for the detection of an analyte in an unknown sample.
  • the method can use and exploit dynamic and reversible bonding relationships between these components.
  • the detection of the analyte is therefore based on the specific and selective modification of the binding of the sensor molecule as a function of the presence of the analyte. This is a so-called label-free detection method, so what else without
  • Marking molecules manages.
  • the method of Figure 1 may also be practiced as a method of detecting changes in the molecule interaction between the binding moiety and the sensor molecule by the presence of a potential drug.
  • This embodiment of the method can thus provide an efficient and sensitive so-called drug screening method for cases in which the user knows the content of the sample, namely the active substance to be tested, and its effects on the
  • FIGS 2a and 2b respectively show a photograph of a scanning electron microscope of a wall 303 used as a gate in a sensor according to the present invention.
  • the cross section of the wall 303 is clear in both figures to see.
  • This wall was fabricated by atomic layer deposition (ALD) based spacer lithography (ASL).
  • ALD atomic layer deposition
  • ASL spacer lithography
  • such a sensor has a wall of length L which is greater than a length selected from the group consisting of 1 mm, 10 mm, 5 mm, 1 cm, and 5 cm.
  • micrometer-sized wall lengths are also possible because the manufacturing process described herein allows for such a length.
  • the detection method may, if desired, use a sensor with these geometries and / or geometries given below.
  • such a sensor has a wall with thickness D which is selected from the group consisting of 10 to 500 nm, 10 to 250 nm, 10 to 50 nm, 10 to 20 nm, 20 to 100 nm, and 40 to 100 nm.
  • such a sensor has a wall with a height H, which is selected from the group consisting of 100 nm to 5 ⁇ , 250 nm to 5 ⁇ , 500 nm to 5 ⁇ , 500 nm to 1 ⁇ , 1 ⁇ to 2 ⁇ , and 1 ⁇ to 4 ⁇ .
  • Such a sensor 200 or such a production method for the sensor 200 can advantageously exploit the large ratio between the surface and the volume of the sensor or the wall of the sensor.
  • semiconducting materials are zinc oxide (ZnO) based materials
  • the present invention allows the user to use, for example, thin atomic layer deposition (ALD) zinc oxide film layers to fabricate the sensor platform.
  • ALD thin atomic layer deposition
  • the atomic layer deposition has the advantage that arbitrary and high aspect ratio nanostructures over a large area, such as a wafer surface, are very controlled and homogeneous to produce and allow mass production.
  • ASL spacer lithography
  • Zinc oxide as an n-type semiconductor, has specific advantages for the sensor described here and for the measuring method described here. Make the biofunctionalization of zinc oxide itself and the longevity of the sensor in buffer solutions
  • One way to realize photocorrosive stability in aqueous solutions of zinc oxide is to coat the surface with a stable material through another atomic layer deposition. If desired, homogeneous growth of atomic layers by means of ALD layers can take place over the 3D nanostructures at low temperatures.
  • a thin layer of alumina can be used which improves the longevity in aqueous solutions and at the same time acts as a dielectric for the field effect transistor.
  • Metal oxide surfaces such as alumina can be modified by organic ligands having high K dielectric properties.
  • carboxylic acids as linkers form stable so-called self-assembled monolayers (SAM) on the sensor surface.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a sensor 200 for detecting changes in molecule interactions according to an exemplary embodiment of the invention.
  • the senor may be used to detect an analyte 300 in the sample based on detection of a change in electrical conductivity of the sensor.
  • a previously described drug screening can be carried out with it.
  • the sensor has a transistor structure with a first metallic contact 301 as a feed, a second metallic contact 302 as a drain and a gate 303.
  • the so-called liquid gate is used, in which the molecule / molecules on the surface of the gate 303 provides the gate potential. It is at the gate a
  • Bonding unit 304 immobilized.
  • the gate is implemented as a nanoscale wall 306 between the first metallic contact and the second metallic contact.
  • the wall has a rectangular cross-section. In this case, a time sequence of the detection method in Fig. 3 is shown from left to right. On the first wall 303 on the left side of Fig. 3 is a
  • Binding unit 304 immobilized on the wall 306.
  • Sensor molecule 305 in the sensor environment is a specific binding between the binding unit 304 and the sensor molecule 305.
  • analyte 300 as illustrated in the right part of Fig. 3, a
  • the binding unit 304 for example, as
  • double-stranded oligonucleotide be designed as a protein or immobilized analyte.
  • the sensor molecule 305 there are many different embodiments for the sensor molecule 305. Different analytes 300 may be detected using the measurement method described herein. This will be in the context of the others Figures illustrated and further explained. Likewise, a
  • TetR Tet repressor sensor protein
  • the sensor 200 in FIG. 4 has high aspect ratio nanostructures made by atomic layer deposition and spacer lithography.
  • the walls 303 are used as gate of the transistor structure shown in Fig. 4a.
  • the surfaces of the gates 303 were functionalized with the binding moiety 401, which consists of oligonucleotides having the sequence of the operator tetO.
  • the Tet repressor binds protein (TetR) 400 in a specific manner.
  • This sensor protein 400 referred to as
  • Sensor molecule is released by the binding unit 401, here performed as operator DNA, in a dose-dependent manner when the sensor molecule 400 with the analyte 402, the tetracycline antibiotic, in combination.
  • the electrical conductance is modulated accordingly, as the total surface charge changes.
  • FIG. 4 the switching mechanism of the sensor proteins 400, which are first bound to the functionalized surfaces 303 of the sensor 200 and subsequently released again, is illustrated in FIG. 4 on the basis of the sensor 200.
  • the detection method and sensor shown here can be used to detect antibiotic residues in cows' milk, which are well below the maximum residue level allowed by the European Union.
  • the detection method and sensor shown here can be used to detect antibiotic residues in cows' milk, which are well below the maximum residue level allowed by the European Union.
  • the detection method and sensor shown here can be used to detect antibiotic residues in cows' milk, which are well below the maximum residue level allowed by the European Union.
  • the detection method and sensor shown here can be used to detect antibiotic residues in cows' milk, which
  • the nanostructured sensor for monitoring the binding of the tetracycline repressor (TetR) to its operator DNA and the corresponding inducible release of TetR can be reliably detected by the addition of tetracycline.
  • TetR tetracycline repressor
  • Nanostructured sensor and the associated detection method is subsequently demonstrated by the accurate quantification of tetracycline in biologically complex samples such as milk.
  • Ref. 1 Christen, E., Karlsson, M., Kämpf, M., Weber, C., Fussenegger, M., Weber, W. Protein Expr Purif. 2009, 66, 158-164.
  • the cells were centrifuged (6000xg, 7 min, 4 ° C) and resuspended in lysis buffer (40 ml per 1000 ml original culture volume, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) Using a Frech-Press digested (1000 bar, 3 passes, APV, DK, Albertslund, APV-2000) and the cell residue was removed by centrifugation at 30,000 xg for 30 minutes at 4 ° C.
  • lysis buffer 40 ml per 1000 ml original culture volume, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0
  • the lysate was assayed for Ni 2+ -NTA agarose Superfiow gravity column (10 ml lysate per ml volume of Ni 2+ -NTA agarose beads, Qiagen, Hilden, Germany, cat # 30210), followed by 10 column volumes of lysis buffer, 10 column volumes of wash buffer (50 mM
  • TetR protein was concentrated to 0.6 mg / ml, freeze-dried and stored at -80 ° C.
  • H 2 O Protein concentration was determined by the Bradford method (Bio-Rad, Hercules, California, cat # 500-0006) with bovine serum albumin (BSA) as the standard.
  • the oligonucleotides oRG128 (5'-actccctatcagtgatagagaa-3 ') and oRG229 (5'-tctctctacactgatagggagt-3', 5'-COOH were functionalized by IBA GmbH (Göttingen, Germany No. 5-0210-23X) in equimolar amounts (50 ⁇ per oligonucleotide) in 1 ⁇ SSC buffer (15 mM sodium citrate, 150 mM NaCl, pH 7), incubated at 95 ° C for 5 minutes, and then cooled slowly (2 ° C per min) to room temperature.
  • tetO functionalized double-stranded tetO oligonucleotides
  • Tetracycline was obtained from Applichem (AppliChem, Darmstadt, Germany, cat # A1685,0025) and dissolved in ethanol as a 2 mg / ml stock solution.
  • Erythromycin was obtained from Sigma-Aldrich (cat # E-5389) and dissolved in ethanol as a 10 mg / ml stock solution.
  • Ampicillin was obtained from Roth (Carl Roth, Düsseldorf, Germany, Cat # K029.2) and dissolved in H 2 O as a 100 mg / ml stock solution.
  • Gentamycin was obtained from Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Lausen, Switzerland, cat # 380-003-G005) and dissolved in H 2 O as a 20 mg / ml stock solution. The stock solutions were diluted in binding buffer or milk to the final experimental concentration.
  • Fig. 4a shows first the basic principle of the sensor 200.
  • the wall of the sensor had a length of about 500 ⁇ .
  • a double-stranded oligonucleotide bound to the operator tetO is attached to the sensor 200 of FIG.
  • the tetracycline repressor can bind in a sequence-specific manner.
  • the tetO oligonucleotides used herein have a carboxylic acid end at the 5 'end of a strand.
  • the electrical properties, such as the electrical conductance between inflow and outflow (G D s) is shown in Fig. 4b and is according to the
  • Fig. 5a describes the entire time-resolved experimental procedure of Fig. 4 to obtain the dose-dependent profile of TetR-modified gates 303 for tetracycline.
  • the time 0 sec in step 1 describes the exposure of the nanowand sensor with the already bound TetR to a binding buffer until a stable baseline is achieved. Subsequently, 1 pM tetracycline in
  • Binding buffer is added to the system, as shown in step 2 of Fig. 5a, resulting in a rapid increase in conductance (here the absolute change in conductance is shown with respect to the baseline).
  • the tetracycline molecules bind the Tet repressor protein, resulting in a conformational change of the TetR protein and release of the tetracycline TetR complex from its binding moiety, the tetO.
  • Washing step 1 leads to a further increase in the conductance, since the dissociated tetracycline TetR complexes are no longer present in the nanostructure surface area (the conductance measurement after washing lasts again 2 min). From from there, the tetracycline dose in the binding buffer is increased in increments of ten to as low as 1 ⁇ , which is represented by steps 3, 4, 5, 6, 7 and 8. Between these steps, the sensor 200 is rinsed each time with binding buffer and is measured in the binding buffer for 2 minutes in terms of its conductance. The system is extremely sensitive, with a detection limit below 1 pM. The data is summarized in Fig. 5b on a linear and a logarithmic scale. Through data analysis, in which this plot is fitted and in which one
  • the senor 200 is capable of electronically detecting residues of tetracycline less than 1 pM, which is still below the maximum residue level of the European Union of 100 ⁇ g per kg. From a professional point of view, this sensitivity is not limited to the application shown here by way of example. This makes the measurement method described here in detail, based on the sensor described here, much more sensitive than previously known methods, such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Overall, therefore, it should be noted that the sensor 200 and the method performed therewith provide a great improvement in sensitivity compared to conventional methods for detecting drug-target interactions.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • Binding buffer measured which is indicated by the step 1.
  • the sensor was subsequently put to another practical application to demonstrate the detection and quantification of antibiotic from veterinary products, for example, milk.
  • veterinary products for example, milk.
  • the detection of tetracycline in milk and the cross-sensitivity to other antibiotic classes will be explained.
  • raw milk was used without any antibiotic contamination.
  • This milk was then distributed into several sample tubes and with different exemplary classes of antibiotics (tetracycline, erythromycin, ampicillin and gentamicin) in concentrations according to the maximum
  • Residue level is 100 ⁇ g per liter, 40 ⁇ g per liter, 4 ⁇ g per liter, and 100 ⁇ g per liter for tetracycline, erythomycin, ampicillin and gentamicin.
  • the milk was diluted by 3 orders of magnitude.
  • cross-sensitivity was first tested by exposing the sensor to various milk solutions containing antibiotic components. Step 1 always corresponds to the washing buffer binding step and the measurements in the binding buffer. In step 2, pure, uncontaminated, liquefied, organic milk was added
  • ultralong nanowalls with a high aspect ratio of zinc oxide / alumina were prepared to successfully functionalize them with double-stranded operator DNA and load them with Tet repressor proteins.
  • the contact of the sensor with various concentrations of tetracycline antibiotics that bind to the TetR protein, followed by a conformational change in the protein lead to the release and a change in the electrical properties due to a
  • Residue level of the EU has been tested. Concentrations as low as 100 fM were successfully detected by the sensor.
  • the senor and the detection method are suitable for enabling the quantification of antibiotics or, in general, the detection of the interaction of small molecules on the surface.
  • the binding and peeling of such conformance modifying molecules can be detected by the sensor and method recited herein.
  • Corresponding measuring methods represent the concept for the electrical quantification of drug-target interactions in real time
  • Embodiment is the detection of tetracycline antibiotics listed in milk and other examples are given. The impact of this
  • TetR stands for a whole family of DNA-binding regulatory proteins, the TetR family, their specific binding to respective DNA operator sequences changes in response to many different small molecules such as drugs, metabolites, vitamins or metals. Therefore, the embodiments set forth above with reference to FIGS. 4 to 7 can also be applied from a professional point of view to other protein-DNA combinations in which the TetR-IEiO complexes are replaced accordingly. Therefore, the technique described herein can be used to rapidly and sensitively quantify many different types of small molecules. In addition, protein-protein combinations are also applicable. This could be z. For example, in drug development, in the simplest case, also be used to screen small molecule libraries to identify those candidates that specifically affect given protein-protein interactions.
  • Figures 8 to 14 show different sensors
  • FIG. 8 shows a sensor with a gate 303, on which a first protein 800 is immobilized as a binding unit 304.
  • the free analyte 300 is added to this sensor 200 so that the analyte and protein 1 combine to form a new epitope 801.
  • the second protein 802 which acts as a sensor molecule, the complex 803 is formed on or at the gate 303.
  • the second protein therefore binds to the new epitope 801.
  • FKBP may be the protein PI, rapamycin the analyte and FRB the protein 2 be.
  • the first protein 900 is embodied as a binding unit 304 and the bivalent analyte 300 is added. This results in a new complex 901, which, however, does not represent a new epitope in comparison to FIG.
  • the second protein 902 is added as sensor molecule 305 and the complex 903 on the gate 303 is created.
  • the first protein 900 can for example, GyrB, the analyte may be coumermycin and the second protein may be GyrB.
  • FIG. 10 shows an immobilized first protein 1000 which functions as a binding unit 304.
  • the second protein 1001 which takes over the function of the sensor molecule 305, binds to the first protein.
  • the free analyte 300 Upon addition of the free analyte 300, it competes with the already bound protein P2 to bind to the immobilized protein PI.
  • the analyte 300 binds to the first protein 1000 and forms a new complex 1002, thereby abrogating the binding between the first protein and the second protein.
  • FM may be mentioned as the first protein
  • FM as the second protein
  • FK506 as the analyte.
  • FIG. 11 shows that immobilized on the gate 303 is analyte 1100, which in this exemplary embodiment is referred to as
  • Binding unit 304 functions. After addition of the sensor molecule 305, which is embodied here as a first protein, this binds to the immobilized analyte 304. After addition of a free unbound analyte 300, this binds to the protein 1 and this complex is dissociated from the immobilized analyte.
  • an immobilized antigen A can be named as analyte 1100, as protein PI an antibody and as free analyte again the immobilized antigen.
  • FIG. 12 is the continuation of FIG. Based on the complex 903, the second protein P2 and the analyte can be seen as sensor molecule 305.
  • Analyte A 2 300 competes with sensor molecule 305 for binding to protein PI, which is immobilized on the gate.
  • GyrB can be mentioned as PI, coumermycin as analyte A, GyrB as P2 and novobiocin as monovalent analyte A 2 300.
  • FIG. 13 shows how a first protein is implemented as a gate-immobilized binding unit 304. Subsequently, a protein-2-analyte complex as a sensor molecule 305 is supplied to the sensor, so that a corresponding complex 1300 is formed.
  • a free analyte 300 Upon addition of a free analyte 300, it competes with the sensor molecule for binding to the immobilized protein PI, resulting in replacement of the sensor molecule 305 by the free analyte 300 in the protein PI.
  • anti-fluorescein scFv may be mentioned as PI, BSA-FITC as complex P2-A and free fluorescein as free analyte.
  • Fig. 14 shows a further embodiment of the invention, in which a
  • Analyte 1401 is immobilized on a first protein 1400, wherein the first protein in turn is immobilized on the gate 303.
  • This complex serves as
  • Binding unit 304 A second protein 1402 can be added which binds to the analyte.
  • the complex consisting of the second protein and the analyte is used as sensor molecule 305.
  • a complex 1404 similar to the initial state is formed, consisting of the first protein and the free analyte.
  • BSA-FITC can serve as complex Pl-A, anti-fluorescein scFv as P2 and free fluorescein as free analyte.
  • FIGS. 15 and 16 each show different geometric dimensions of a gate of a sensor for detecting an analyte according to various embodiments of the invention.
  • the gate 303 is shown on the substrate 1500, wherein further elements of the sensor 200 are not shown here for the sake of clarity.
  • the parameters thickness D, height H and length L of the wall are shown.
  • the sensor is D ⁇ H ⁇ L or D> H ⁇ L.
  • the gate 303 which is made as a wall, has a rectangular cross-section in FIG. However, a square cross section is possible. Likewise, the production of a triangular cross section is possible, as shown in FIG. 16.
  • a particularly good responsiveness in the detection of changed surface charges is achieved.
  • a sensor allows for a precise and reliable method for detecting an analyte in a sample based on the detection of the change in the electrical conductivity of the sensor.
  • Fig. 17 shows the fabrication of a sensor according to another
  • FIG. 17 shows a method for producing a sensor, which comprises the following steps: providing a structured substrate, providing a wall of a sensor
  • Transistor structure is provided.
  • a 1 ⁇ m thick silicon oxide layer is used on a silicon (100) wafer.
  • High resolution TSMR photoresist is used and standard ultraviolet light photolithography is used for development in MIF726 (developer solution, metal ion free) to produce parallel rectangular strips 1700 with extreme vertical sidewalls of 400 ⁇ m height over the entire wafer
  • RIE reactive ion etching
  • Oxygen plasma process at 220 ° C removes the resist strips 1700, resulting in freestanding zinc oxide nano walls.
  • the height and thickness (the Aspect ratio) of the nanowalls can be determined by the height of the resist and the deposited thickness of the atomic layer deposition.

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Abstract

Es sind ein Verfahren und ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen im Allgemeinen und zur Detektion eines Analyten in einer Probe im Besonderen auf Basis einer Detektion einer elektrischen Leitfähigkeitsänderung angegeben. Eine spezifische erste Bindung zwischen einem Sensormolekül und einer Bindungseinheit auf dem Sensor wird aufgrund der Anwesenheit des Analyten verändert, was die Oberflächenladung auf dem Sensor messbar verändert. Die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit an dem Sensor lässt sich erfassen und mit Änderungen in Molekülinteraktionen in Verbindung setzen.

Description

Elektrisches Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft den Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen im Allgemeinen und die Detektion von Molekülen in einer Probe im Besonderen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors sowie die Verwendung eines solchen Sensors.
TECHNOLOGISCHER HINTERGRUND
Es sind derzeit etablierte Techniken zur Moleküldetektion verfügbar, die auf optischen Ausleseprozessen basieren, wie zum Beispiel die Systeme ELISA
(Enzyme-linked Immunosorbent Assays) und Systeme, die sich der
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (Surface plasmon resonance, SPR) bedienen oder andere chemometrische Technologien verwenden. Jedoch bringen diese Systeme Nachteile wie einen hohen Zeitaufwand der Messung auf Grund langer Reaktionszeiten, hohe Gerätekosten, die zwingende Verwendung von
Markermolekülen (labels) und eine begrenzte Sensitivität mit sich. Insbesondere ist die Detektion der meisten niedermolekularen Stoffe, insbesondere von Antibiotika, in flüssigen Proben derzeit nur optisch möglich.
Weiterhin ist nach bisher bekannten Methoden die Herstellung entsprechender Sensoren mit nanoskaligen Strukturen nicht auf der Wafer-Skala möglich. Der Stand der Technik lehrt, Sensoren durch technisch aufwändige Prozesse bereitzustellen, die oft epitaktisches Wachstum und aufwendige Elektronenstrahllithographie verwenden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es kann daher als eine Aufgabe der Erfindung angesehen werden, einen verbesserten Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen bereitzustellen. Im Speziellen kann es als eine Aufgabe der Erfindung angesehen werden, eine verbesserte
Detektion eines Analyten in einer Probe bereitzustellen.
Die Aufgabe der Erfindung wird mittels der Gegenstände der unabhängigen
Ansprüche gelöst. Weitere Vorteile und Weiterbildungen sind in den
Unteransprüchen angegeben.
Es sind ein Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors, ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors, und die Verwendung eines Sensors zum
Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen gemäß den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche angegeben. Die beschriebenen Ausführungsbeispiele betreffen gleichermaßen das Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen, den Sensor, das Verfahren zur Herstellung eines Sensors sowie die Verwendung des Sensors. Mit anderen Worten können Merkmale, die im Folgenden in Bezug auf das Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen angegeben werden, ebenso in dem Sensor, der Verwendung des Sensors und gegebenenfalls dem Verfahren zur Herstellung des Sensors verwendet werden, und umgekehrt. Gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors angegeben. Das Verfahren weist den Schritt des Bereitstellens eines Sensors, einer Bindungseinheit, eines Sensormoleküls und einer Probe mit dem Analyten auf. Dabei ist die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an dem
Sensor immobilisiert. Als weiteren Schritt weist das Verfahren das Zusammenführen des Sensors, des Sensormoleküls und des Analyten auf, wobei sich durch das Zusammenführen ein Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand oder von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand verändert. Dabei verändert sich der
Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund der Anwesenheit des Analyten. In dem ersten Zustand ist das Sensormolekül an die Bindungseinheit gebunden und in dem alternativen zweiten Zustand ist das
Sensormolekül von der Bindungseinheit losgelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren weist weiterhin den Schritt des Detektierens einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf, wobei die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf der Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem
Sensormolekül und der Bindungseinheit beruht. Wie im Folgenden detailliert beschrieben wird, kann dieses Verfahren der vorliegenden Erfindung als Verfahren zur Detektion eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors ausgeführt sein. Daher wird im Folgenden das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch als Detektionsverfahren bezeichnet. Mittels dieses
Detektionsverfahrens kann daher im Fall einer gegebenen, unbekannten
Zusammensatzung der Probe beantwortet werden, ob darin ein gewisser Analyt enthalten ist. Falls gewünscht kann zusätzlich eine entsprechende Quantifizierung durchgeführt werden. Weitergehende Details hierzu werden im Folgenden
angegeben. Ein exemplarisches Beispiel eines solchen Verfahrens zur Detektion eines Analyten in einer Probe ist in den Figuren 4 bis 7 ausführlich beschrieben.
Darüber hinaus und alternativ dazu kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch als Verfahren zur Detektion von Änderungen in der Molekülinteraktion zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül durch die Anwesenheit eines potentiellen Wirkstoffs (drug) ausgeführt werden. Auch aus diesem Grund wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung als Detektionsverfahren bezeichnet. Dieses Ausführungsbeispiel kann ein effizientes und sensitives sogenanntes drug Screening Verfahren für Fälle bereitstellen, in welchen der Benutzer den Inhalt der Probe kennt, nämlich den zu untersuchenden Wirkstoff, aber seine Auswirkungen auf die
Molekülinteraktion eines gegebenen Paars aus Sensormolekül und Bindungseinheit untersuchen möchte. Insbesondere kann damit für ein gegebenes Interaktionspaar bestehend aus Sensormolekül und Bindungseinheit gezielt nach Wirkstoffen, insbesondere medizinischen Wirkstoffen, gesucht werden, die geeignet sind, eine gewünschte Veränderung in der Molekülinteraktion hervorzurufen. Der Nutzer kann in diesem Kontext einen potentiell geeigneten Wirkstoff dem Sensor zuführen. Für den Fall, dass eine Veränderung der Molekülinteraktion, insbesondere ein Binden oder Loslösen, zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit durch den potentiellen Wirkstoff hervorgerufen wird, entsteht durch den Sensor ein
entsprechendes elektrisches Signal. Diese Signalgenerierung wird für viele verschiedene Fälle im Folgenden weiter erklärt werden. Dieses Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel auf Protein-Protein Kombinationen anwendbar. Dies könnte z. B. bei der Medikamentenentwicklung auch zum Screenen von Bibliotheken kleiner Moleküle (small molecules) genutzt werden, um diejenigen Kandidaten zu identifizieren, die eine gegebene Protein-Protein- Wechselwirkung spezifisch beeinflussen. Insgesamt kann mit dem Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung der Einfluss der Anwesenheit des Wirkstoffs auf die Molekülinteraktion zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül untersucht und detektiert werden.
Die folgenden Ausführungen und Details der vorliegenden Erfindung betreffen sowohl das Ausführungsbeispiel zur Detektion eines Analyten in einer Probe als auch das Ausführungsbeispiel des oben beschriebenen drug-screening Verfahrens insofern nicht explizit Anderes angegeben ist.
Dabei kann der Begriff„Analyt" sowohl den Stoff, insbesondere das Molekül, beschreiben, welches mit dem Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung in der Probe detektiert wird. Ebenso kann der Begriff„Analyt" den Stoff, insbesondere das Molekül, beschreiben, welches als Wirkstoff daraufhin untersucht wird, ob damit eine Veränderung der Molekülinterkation zwischen einem Interaktionspaar bestehend aus Sensormolekül und Bindungseinheit verursachbar ist. In beiden Fällen kann der Sensor mit dem Analyt in Reinform versehen werden. In diesem Fall besteht die Probe aus dem Analyten. Jedoch umfasst die vorliegende Erfindung natürlich auch Anwendungen, bei welchen der Analyt dem Sensor in Form eines Gemischs, zum Beispiel einer Lösung, zugeführt wird. Weitere Details und Beispiele werden im Folgenden weiter beschrieben werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt aus, dass die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors durch die Anwesenheit des Analyten hervorgerufen wird. Dabei können insbesondere Konformationsänderungen des verwendeten Sensormoleküls genutzt werden, die in spezifischer Abhängigkeit von der
Anwesenheit des Analyten auftreten. Wie im Folgenden erklärt werden wird, kann das Verfahren auch vorteilhafterweise von zwei spezifischen Bindungen Gebrauch machen. Dabei besteht die erste spezifische Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit und/oder die zweite spezifische Bindung besteht zwischen dem Analyten und dem Sensormolekül. Diese einfache oder doppelte Spezifizität kann zur Steigerung der Sensitivität bei der Detektion des Analyten oder zur Detektion einer Änderung einer Molekülinterkation genutzt werden. Dieses Verfahren kann nach dem Schritt des Zusammenführens aufgrund der verwendeten ersten spezifischen Bindung und der verwendeten spezifischen zweiten Bindung basierend auf der Veränderung der hervorgerufenen elektrischen Leitfähigkeit des Sensors die Anwesenheit des Analyten in der Probe feststellen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann aber auch die Kompetition zwischen Bindungen zwischen dem Sensormolekül, der Bindungseinheit und dem Analyten nutzen. Dies wird beispielsweise im Detail mit Bezug auf die Ausführungsformen der Figuren 8 bis 14 weiter erläutert.
Vorteilhafterweise ist es mit dem hier präsentierten Verfahren möglich, ein markierungsfreies (d. h. label-free) Verfahren bereitzustellen. Es kann daher als markierungsfreies Verfahren zur Detektion des Analyten oder als markierungsfreies Verfahren zur Suche und/oder Analyse von Wirkstoffen ausgeführt sein. Darüber hinaus ist das elektrische Detektionsverfahren in der Lage, eine Echtzeitmessung zu ermöglichen. Dabei stellt das hier beschriebene elektrische Detektionsverfahren sowohl eine erste Ausführungsform unter Schutz, bei der aufgrund der Anwesenheit des Analyten in der Sensorumgebung das an die Bindungseinheit gebundene
Sensormolekül eine Konformationsänderung durchführt und sich dadurch von der Bindungseinheit und dadurch auch von dem Sensor loslöst. Dies wird im Folgenden weiter erklärt werden und kann beispielsweise der Figur 4 und der zugehörigen Beschreibung entnommen werden. Weiterhin stellt das elektrische
Detektionsverfahren auch eine zweite Ausführungsform unter Schutz, gemäß welcher das Sensormolekül zunächst nicht an die Bindungseinheit gebunden ist und sich daher in einem von der Bindungseinheit losgelösten Zustand befindet. Für den Fall, dass der Analyt in die Probe gegeben wird, also der Analyt in die
Sensorumgebung gelangt, führt das Sensormolekül eine Konformationsänderung durch und bindet dadurch an die Bindungseinheit. Diese Bmdungszustandsänderung verursacht ebenso wie das Loslösen in der ersten Ausführungsform eine Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, welche durch den Sensor detektierbar ist. Das Verfahren macht sich diese Leitwertänderung zunutze und detektiert dadurch den Analyten in der Probe bzw. eine Änderung der Molekülinterkation. Wie im Folgenden weiter erläutert werden wird, nutzt das Verfahren eine Veränderung der Oberflächenladung auf dem Sensor, zum Beispiel auf dem Gatter des Sensors, zur elektrischen Detektion. Dabei kann in jedem Ausführungsbeispiel das Sensormolekül ein elektrisch geladenes Molekül sein. Dabei ist in diesem und in jedem anderen Ausführungsbeispiel die Bindungseinheit als eine biologische, biochemische oder chemische Einheit zu sehen, an welche das Sensormolekül in Abhängigkeit von der Anwesenheit/ Abwesenheit des Analyten binden kann. Mit Bezug auf die folgenden Figuren 3, 4 und 8 bis 14 werden verschiedene Ausführungsbeispiele des Verfahrens und des zugehörigen Sensors beschrieben, bei denen die Bindungseinheit beispielsweise als ein doppelsträngiges Oligonukleotid, ein erstes Protein, oder ein immobilisierter Analyt ausgeführt ist. Jedoch sind auch andere Ausführungsformen der Bindungseinheit möglich, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Dabei kann im gesamten Kontext der Erfindung der Begriff„Oligonukleotid" als Nukleinsäuresequenz oder Nukleinsäure verstanden werden.
Auch für das Sensormolekül und den entsprechenden Analyten können
verschiedenste vielfältige Kombinationen durch den Fachmann gewählt werden. Besondere Ausführungsformen werden im Folgenden detailliert beschrieben. Wie bereits zuvor angegeben, kann die Bindungseinheit an dem Sensor immobilisiert sein, alternativ kann aber auch das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert sein, oder beide können an dem Sensor immobilisiert sein. Dazu können herkömmliche Immobilisierungstechniken, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Weiterhin kann der Schritt des Zusammenführens des Sensors, des Sensormoleküls und des Analyten sequentiell, das heißt schrittweise, erfolgen. Insbesondere kann zunächst der Sensor mit der Bindungseinheit mit dem Sensormolekül in Verbindung gebracht werden und erst anschließend wird der Analyt hinzugefügt. Aber auch eine davon abweichende Reihenfolge ist möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die Kausalität zwischen der Anwesenheit des Analyten in der Nähe des Sensormoleküls und dem Bindungsverhalten des
Sensormoleküls vorteilhafterweise aus. Das Verfahren kann zur Detektion von biomolekularen Interaktionen auf ultralangen Nanowänden mit einem hohen
Aspektverhältnis verwendet werden. Beispielsweise ist damit eine elektrische
Detektion von niedermolekularen Stoffen mit wünschenswerter Sensitivität möglich, wie anhand von Daten und Beispielen im Nachfolgenden belegt wird. Eine Vielzahl verschiedener Beispiele solcher niedermolekularer Stoffe wird im Folgenden angegeben. Weiterhin lässt die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit einen Rückschluss auf eine Bindungsveränderung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit und/oder den zu detektierenden Analyten in der Probe zu.
Weiterhin können beispielsweise die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an einer Wand, insbesondere an einer Nanowand, also an einer nanoskaligen Wand, des Sensors immobilisiert sein. Vorteilhafte Geometrien der Wand werden später detaillierter beschrieben werden. Dabei sei bereits hier darauf hingewiesen, dass in einem Ausführungsbeispiel des Sensors der vorliegenden Erfindung mit der Wand auch eine Dünnfilmstruktur gemeint sein kann. Insbesondere kann ein
kontinuierlicher Dünnfilm als Gatter zwischen den beiden metallischen Kontakten des Sensors verwendet werden. In einem beispielhaften Ausführungsbeispiel wird ein 100 nm dicker Zinkoxid Film mit einer dünnen Aluminiumoxid Lage darauf erzeugt. Details hierzu werden im Folgenden weiter erläutert werden.
Durch die Kombination von Mikrosystemtechnik und Nanotechnologie wird die Herstellung von Nanosensoren auf Wafer-Skala ermöglicht. Solch Nanosensoren erlauben es, das Detektionsverfahren verlässlich, schnell und wiederholbar durchführen zu können. Dabei kann ein Wafer mikrostrukturiert werden, wobei mittels Atomlagenabscheidung ultradünne Schichten erzeugt werden. Damit können zentimeterlange Nanostrukturen oder Nanowände hochpräzise und in gewünschter Anordnung erzeugt werden. Dabei können so dünne Nanowände erzeugt werden, dass man bildlich von Nanolinien sprechen kann. Darüber hinaus ist auch ein Kontaktieren mittels Lithographie möglich. Damit lassen sich Sensoren herstellen, welche Wände oder Nanostrukturen mit einer Länge im Zentimeterbereich aufweisen, die eine starke Responsivität, das heißt eine starke
Ansprechempfindlichkeit, bezüglich der Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors bereitstellen. Damit kann das erfindungsgemäße Detektionsverfahren besonders gut ausgeführt werden.
Weiterhin können geladene, also elektrisch nicht neutrale Sensormoleküle, geladene Analyten und/oder geladene Bindungseinheiten verwendet werden. Verschiedene
Kombinationen davon sind möglich, ohne damit den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Es ist auch zu berücksichtigen, dass Bio-Moleküle generell je nach pH- Wert der Umgebung geladen sein können. Je nach pH- Wert protonieren bzw.
deprotonieren die entsprechenden Gruppen am Molekül und ergeben dann eine Nettoladung. Die Ladung hängt somit vom isoelektrischen Punkt (pl) ab. Weitere Details hierzu werden im Folgenden noch weitergehend erläutert. Es ist auch zu berücksichtigen, dass Desoxyribonukleinsäure (DNS, Deoxyribonucleic acid, DNA) meistens bei neutralem pH negativ geladen ist. Das gilt ebenso für die meisten Proteine. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur synchronen Detektion von verschiedenen Analyten gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren angegeben. Dieses Verfahren weist weiterhin den Schritt Durchführen des Verfahrens an einer Vielzahl von Sensoren auf, wobei die Vielzahl von Sensoren auf einem Chip oder einem Wafer angeordnet ist.
Insbesondere wird dadurch die multiplexe Detektion verschiedener Substanzen in flüssigen Proben ermöglicht. Dieses Ausführungsbeispiel ermöglicht eine schnelle und gleichzeitige Detektion verschiedener Analyten auf einem Chip oder Wafer.
Darüber hinaus kann ein solcher Chip oder Wafer auch für das oben beschriebene drug-screening Verfahren genutzt werden. Angesichts der Wichtigkeit von schaltbaren Protein-DNS-Wechselwirkungen und auch von zu beinflussenden Protein-Protein- Wechselwirkungen, beides auch im Rahmen von
Medikamentenentwicklungen, ist das Detektionsverfahren und der Sensor als
Weiterentwicklung zu sehen, welche die multiparallele Möglichkeit bereitstellt, neue Wirkstoffe und/oder Medikamente zu entdecken. Dabei kann die Probe, welche mit dem Sensor in Kontakt gebracht wird, einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten. Dabei können in einem Sensor gleichzeitig unterschiedliche Bindungseinheiten und gleichzeitig unterschiedliche Sensormoleküle in diesem Ausführungsbeispiel eingesetzt werden. Insbesondere die Immobilisierung unterschiedlicher
Bindungseinheiten oder Sensormoleküle an unterschiedlichen Wänden des Sensors kann dazu genutzt werden. Dies ermöglicht eine getrennte Auslesung des Signals an je einer Wand, was eine Bindungseinheiten/Sensormolekül spezifische Auslesung pro Wand ermöglicht.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendet das Verfahren einen Sensor mit einer Wand der Länge L, der Dicke D und der Höhe H, wobei für den Sensor die Relation D < H < L oder die Relation D > H < L gilt. Im Falle der Relation D < H < L werden Wände mit einem hohen Aspektverhältnis bereitgestellt. Es besteht hierbei die Möglichkeit, das Verhältnis zwischen
Oberflächen und Volumen zu erhöhen und somit eine erhöhte Sensitivität des Sensors/des Verfahrens zu erzielen. Die Relation D > H < L zeichnet sich durch ausgedehnte und breite Strukturen mit niedriger Höhe aus. Das kann aber auch als Film oder dünne Schicht betrachtet werden. Im Falle eines Halbleiters ist in beiden Fällen die Sensitivität erhöht, da bei Nanostrukturen die Änderung der
Verarmungszone der elektrischen Ladungsträger, induziert durch die
Oberflächenladung, stärker erfasst werden kann. Durch die Änderung der
Oberflächenladung auf dem Halbleiter werden also die elektronischen Bänder im Halbleiter verbogen, die im Vergleich zu ihren "Bulk" Gegenstücken mit kleinen Strukturgrößen sensitiv erfasst werden können. Dabei sind im Kontext der vorliegenden Erfindung verschiedene
Halbleitermaterialien verwendbar. Insbesondere sind auch organische, halbleitende Polymere davon mit umfasst. Als Ausführungsbeispiel werden im Folgenden Details zu Zinkoxid angegeben, die jedoch ohne Weiteres auf andere Halbleiter übertragbar sind und daher auch Teil der Erfindung darstellen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit an dem Sensor immobilisiert und das Sensormolekül ist in dem ersten Zustand an die Bindungseinheit und damit/dadurch an den Sensor gebunden. Das Sensormolekül ist in dem zweiten Zustand von der Bindungseinheit und von dem Sensor losgelöst.
Mit anderen Worten, stellt die Bindungseinheit die Bindung zwischen dem
Sensormolekül und dem Sensor im gebundenen Zustand des Sensormoleküls her. Die Merkmale dieses Ausführungsbeispiels können beispielhaft den Figuren 3 und 4 entnommen werden. In diesen Figuren sind jedoch weitere Merkmale enthalten, die nicht zwingend für das hier beschriebene Ausführungsbeispiel enthalten sein müssen. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit abhängig von der Dosis des Analyten in der Probe.
Mit anderen Worten ist in diesem Ausführungsbeispiel das Detektionsverfahren abhängig von der Dosis des Analyten in der Probe. Die Verursachung der
detektierbaren Änderung des Bindungszustandes ist also in diesem
Ausführungseispiel abhängig von der Dosis des Analyten. Hingegen werden im Stand der Technik Verfahren gelehrt, in denen unspezifische Maßnahmen, wie beispielsweise die Erhöhung einer Salzkonzentration, zur Veränderung einer
Bindung zwischen zwei Molekülen führen. Für den Fall, dass bei der vorliegenden Erfindung spezifische Bindungen verwendet werden, stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung hingegen ein hoch spezifisches Detektionsverfahren dar. Es kann damit eindeutig die Anwesenheit des Analyten in der Probe nachgewiesen werden. Dies wird weiter durch die Figuren 4-7 und den zugrundeliegenden Daten belegt.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Sensor einen ersten metallischen Kontakt als Zufluss, einen zweiten metallischen Kontakt als Abfluss und ein elektrisches Gatter, nachfolgend Gate genannt, auf. Dabei ist die Bindungseinheit an dem Gatter des Sensors angeordnet. Das Detektieren der
Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors detektiert dabei die
Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit zwischen dem Zufluss und dem Abfluss des Sensors.
Mit anderen Worten wird dadurch die elektrische Leitwertänderung zwischen dem Zufluss und dem Abfluss gemessen nachdem der Analyt in die Probe gegeben wurde. Aufgrund der sich dadurch ergebenden, veränderten Bindungsverhältnisse zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit, ein Loslösen oder ein Binden, kann durch den Nachweis einer entsprechenden Veränderung des elektrischen Leitwerts auf die Anwesenheit des Analyten in der Probe geschlossen werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung liegt zwischen dem Schritt des Zusammenführens und des Detektierens ein Zeitraum, der geringer ist als 10 min, 5 min, 2 min, 1 min, 30 sec, 10 sec, 4 sec, 2 sec, oder 1 sec.
Dabei können unterschiedliche Zeiten zum einen durch unterschiedliche
Wechselwirkungen der Reaktionspartner zu Stande kommen. Zum anderen kann auch der Transport der Moleküle zu der Oberfläche ausschlaggebend dafür sein.
Im Gegensatz zu zeitaufwändigen Verfahren nach dem Stand der Technik bietet das Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit, eine
Echtzeitmessung bereitzustellen und damit in Echtzeit dem Benutzer die Information zu übermitteln, ob der Analyt in der untersuchten Probe vorhanden ist. Dadurch kann ein industriell anwendbares und für industrielle Zwecke bevorzugtes
Detektionsverfahren bereitgestellt werden. Die gleichen Vorteile gelten für die Ausführungsform des oben beschriebenen drug Screening Verfahrens. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt eine
Quantifizierung der Menge des Analyten in der Probe, basierend auf der detektierten Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors.
Beispielsweise kann der Sensor kalibriert werden. Dies geschieht beispielsweise durch einen zusätzlichen Gatterkontakt. Die Gatespannung kann die Leitfähigkeit des Sensors modulieren. Durch das Anlegen einer gewissen Gatespannungsreihe kann auf die Oberflächenladung in einem bestimmten Bereich geschlossen werden. Im Falle von Proteinen kennt man die Nettooberflächenladung in einem gewissen pH Wert und kann dann durch die kalibrierte Leitfähigkeitsänderung auf die Anzahl der gelösten Proteine schließen und somit auf die Anzahl der Moleküle im Analyten implizieren. Weiter Möglichkeiten zur Quantifizierung erschließen sich dem
Fachmann aus den hierin erfolgten Erläuterungen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren den Schritt Herstellen einer ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten auf. Dabei erfolgt die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund der hergestellten ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten. Beispielsweise zeigen die Figuren 3 bis 14 verschiedene Aspekte eines elektrischen Detektionsverfahrens, bei dem eine solche erste spezifische Bindung verwendet wird. Verschiedene Kombinationen von Sensormolekülen und Analyten werden später angegeben. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren weiterhin den Schritt des Herstellens einer zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit, und den Schritt des Lösens der zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund der Anwesenheit des Analyten auf.
Die entsprechende Kausalität und Dynamik dieser Ausführungsform der Erfindung kann beispielsweise ebenfalls der Figur 4 entnommen werden und wird in der zugehörigen Figurenbeschreibung erläutert. Verschiedene Kombinationen von Sensormolekülen und Bindungseinheit werden später angegeben.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung bewirkt die Herstellung der ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten eine Konformationsänderung des Sensormoleküls, wodurch die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit verursacht wird. Eine derartige Konformationsänderung kann beispielhaft der Figur 4 entnommen werden, in welcher das Sensormolekül 305 nach der Bindung an die
Bindungseinheit 304 und nach der Zugabe des Analyten 300 eine
Konformationsänderung durchführt, so dass eine Loslösung des Sensormoleküls von dem Sensor und damit eine detektierbare Veränderung der Oberflächenladung an der Wand 303 erreicht wird, wobei die Wand als Gatter eines Sensors ausgeführt ist. In anderen, alternativen Ausführungsbeispielen kann der Analyt auch mit der Bindung an die Bindungseinheit konkurrieren.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit auf dem Sensor immobilisiert, und die Bindungseinheit ist durch ein
doppelsträngiges Oligonukleotid ausgeführt. Das doppelsträngige Oligonukleotid kann dabei einen Bereich oder eine Oligonukleotidsequenz aufweisen, an welche das verwendete Sensormolekül spezifisch bindet. Detaillierte Beispiele werden diesbezüglich im Folgenden beschrieben.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der Analyt ein
Molekül und das Sensormolekül ein entsprechendes Repressorprotein.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der Analyt ein
Antibiotikum und das Sensormolekül ein entsprechender Antibiotikum-Repressor beziehungsweise ein entsprechendes Repressorprotein. Mit anderen Worten stellt dieses Verfahren die elektrische Detektion von Antibiotika mittels einer Detektion einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors bereit. Beispielsweise kann das Antibiotikum als Tetracyclin ausgeführt sein, aber auch andere Antibiotika können damit nachgewiesen werden, wie im Folgenden weiter dargelegt wird. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist eine Kombination aus dem Sensormolekül und dem Analyten ausgewählt aus der Liste von Kombination bestehend aus
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Die hier angegebenen Ausführungsbeispiele des Sensormoleküls ändern ihre Affinität zu einer spezifischen DNA Sequenz als Funktion der Konzentration des jeweils angegebenen Analyten. Dabei erfolgt in der zuvor angegebenen Liste ein Bezug auf folgende Dokumente als Referenzen (Ref):
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Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit ein erstes Protein, welches auf dem Sensor immobilisiert ist, und das Sensormolekül ist ein zweites Protein.
Verschiedene Beispiele solcher Detektionsverfahren und entsprechender Sensoren, bei welchen Kombinationen erster und zweiter Proteine verwendet werden, können den Figuren 8, 9, 10, 12,13 und 14 sowie der jeweils zugehörigen Beschreibung entnommen werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel ist eine Kombination aus dem ersten Protein, dem zweiten Protein und dem Analyten ausgewählt aus der Liste von Kombinationen bestehend aus
Erstes Protein Zweites Protein Analyt
GyrB (Gyrase GyrB Coumarin- Antibiotika Untereinheit B)
FKBP (FK-bindendes FRB Rapamycin, FK506 und
Protein) (Domäne von Derivate davon (z.B.
FRAP) Rapaloga, mTOR- Inhibitoren)
FM (F36M Mutante FM Rapamycin, FK506 und von FKBP) Derivate davon (z.B.
Rapaloga, mTOR- Inhibitoren)
FKBP FKBP Rapamycin, FK506 und
Derivate davon (z.B.
Rapaloga, mTOR- Inhibitoren)
FKBP Cyp (Cyclophilin) Rapamycin, FK506 und
Derivate (z.B. Rapaloga, mTOR-Inhibitoren), Cyclosporine
Cyp Cyp Cyclosporine und
Derivate davon
ToxT (aus V. ToxT Virstatin
cholerae)
DHFR (Dihydrofolat- DHFR Methotrexat und
reductase) Derivate davon
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit ein erstes Protein und das Sensormolekül ist ein zweites Protein, welches auf dem Sensor immobilisiert ist.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit ein immobilisierter Analyt, wobei das Sensormolekül ein Protein ist.
Die entsprechenden Bindungsverhältnisse und die Dynamik während des
Detektionsverfahrens für dieses Ausführungsbeispiel und der zugehörige Sensor kann auch der Figur 11 entnommen werden. Hier ist also ein immobilisierter Analyt auf dem Gatter des Sensors angeordnet und stellt die Bindungseinheit 304 bereit. Nach der Herstellung einer Bindung mit dem Protein PI kann ein weiterer freier Analyt 300 mit dem ersten Protein um die Bindung an den immobilisierten Analyten konkurrieren und das Protein 1 verdrängen. Insgesamt ändert sich damit der Bindungszustand des Sensormoleküls 305, was wegen der damit einhergehenden Änderung der Oberflächenladung am Sensor/am Gatter als Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors zwischen Zufluss und Abfluss festgestellt werden kann.
Gemäße einem weiteren Ausführungsbeispiel ist eine Kombination aus dem immobilisierten Analyten und dem Protein ausgewählt aus der Liste von
Kombinationen, bestehend aus
Protein Analyt
GyrB Coumarin- Antibiotika
FKBP mTOR-Inhibitoren
FRP mTOR-Inhibitoren
FM mTOR-Inhibitoren
Cyp Cyclosporine
Cyp Ascomycine
DHFR Antifolat
Strepatvidin Biotin
Avidin Biotin
Neutravidin Biotin
Steroidhormon- Steroidhormone und
rezeptoren Analoga
ToxT Virstatin Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit eine erste Nukleinsäure, das Sensormolekül ist eine zweite Nukleinsäure und die zweite Nukleinsäure ist derart ausgeführt, dass sie über Basenpaarung an die erste Nukleinsäure bindet. Der Analyt ist eine dritte Nukleinsäure, wobei die dritte
Nukleinsäure derart ausgeführt ist, dass sie über Basenpaarung entweder an die erste Nukleinsäure oder die zweite Nukleinsäure bindet.
Dabei können als erste, zweite und dritte Nukleinsäure DNA und RNA sowie modifizierte Derivate davon, z.B. Thioester-Bindungen, eine Funktionalisierung der Basen, Phosphatreste, und/oder Zuckergruppen mit weiteren geladenen Molekülen, auch in Kombination verwendet werden. Bei Hinzugabe des Analyten, also der dritten Nukleinsäure, zu dem Sensor, auf dem die erste Nukleinsäure gebunden ist und an die wiederum die zweite Nukleinsäure gebunden ist, tritt eine kompetitive Wechselwirkung zwischen der zweiten und dritten Nukleinsäure bezüglich der
Bindung an die erste Nukleinsäure auf oder es tritt eine kompetitive Wechselwirkung zwischen der ersten und dritten Nukleinsäure bezüglich der Bindung an die zweite Nukleinsäure auf. Die Kompetition kann dazu führen, dass sich die zweite
Nukleinsäure von der ersten Nukleinsäure ablöst und entsprechend die dritte Nukleinsäure über entsprechende Basenpaarung an die zweite oder erste
Nukleinsäure bindet. Durch Ablösung der zweiten Nukleinsäure von der ersten Nukleinsäure wird eine Ladungsveränderung an der Oberfläche hervorgerufen. Dieser Vorgang kann gemäß der vorliegenden Erfindung elektrisch detektiert werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die erste Nukleinsäure kovalent an den Sensor gebunden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit eine erste Nukleinsäure, das Sensormolekül ist eine zweite Nukleinsäure, wobei die zweite Nukleinsäure derart ausgeführt ist, dass sie über Basenpaarung an die erste Nukleinsäure bindet. Der Analyt ist als Molekül, als niedermolekulare Verbindung, oder als Protein ausgeführt. Der Analyt ist derart ausgeführt, dass er an die erste Nukleinsäure oder an die zweite Nukleinsäure bindet.
In dieser Ausführungsform ist der Analyt als Molekül wie z.B. eine niedermolekulare Verbindung wie ein Medikament oder auch als Protein ausgeführt. In diesem
Ausführungsbeispiel bindet die zweite Nukleinsäure an die erste Nukleinsäure. Dabei kann entweder die erste Nukleinsäure oder die zweite Nukleinsäure oder beide Nukleinsäuren ein Aptamer sein. Durch Bindung des Analyten an das Aptamer findet eine Ablösung der zweiten von der ersten Nukleinsäure ab. Dies führt zu einer Ladungsveränderung an der Oberfläche. Dieser Vorgang kann gemäß der
vorliegenden Erfindung elektrisch detektiert werden. Dabei soll im Kontext der Erfindung unter dem Begriff„Aptamer" ein kurzes einzelsträngiges DNA- oder RNA-Oligonukleotid mit 25 bis 70 Basen verstanden werden, das ein spezifisches Molekül über seine 3D Struktur binden kann.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Sensormolekül ein Linker, der an den Sensor gebunden ist. Weiterhin ist an den Linker ein Protein oder ein anderes Molekül gebunden. Die Bindungseinheit ist als der Linker mit dem daran gebundenen Protein ausgeführt. Der Analyt ist ein hydrolytisches Enzym, welches bei Zusammenführung mit dem Sensor und mit dem daran gebundenen Linker den Linker spezifisch spaltet, so dass ein Teil des Linkers mit dem Protein oder dem anderen Molekül von dem Sensor losgelöst wird.
Dabei sind unterschiedlichste Ausführungsformen des hydrolytischen Enzyms möglich. Bei dem hydrolytischen Enzym kann es sich in beispielhaften, nicht beschränkenden Ausführungsformen um eine Protease, Peptidase, Esterase oder Desoxyribonuklease (DNase) handeln. Aber auch andere hydrolytische Enzyme können verwendet werden. In diesen Konfigurationen ist der Linker so ausgeführt, dass er spezifisch von dem hydrolytischen Enzym gespalten wird.
Die enzymatische Spaltung des Linkers führt dazu, dass das an den Linker gebundene Protein oder das andere Molekül mit einem Teil des Linkers von der Oberfläche losgelöst wird. Dadurch wird eine Veränderung der elektrischen Ladung an der Oberfläche hervorgerufen, die gemäß der vorliegenden Erfindung elektrisch detektiert werden kann.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors angegeben, wobei der Sensor gemäß einem hierin beschriebenen
Herstellungsverfahren hergestellt oder herstellbar ist. Dieser Sensor kann in allen hierin beschriebenen Ausführungsbeispielen des Detektionsverfahrens eingesetzt werden, insofern nichts Gegenteiliges angegeben ist.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Sensor zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit angegeben. Der Sensor weist eine Transistorstruktur mit einem ersten metallischen Kontakt als Zufluss, einem zweiten metallischen Kontakt als Abfluss und einem Gatter auf. Dabei ist an dem Gatter eine Bindungseinheit oder ein Sensormolekül immobilisiert angeordnet. Das Gatter ist dabei als Wand beziehungsweise als Nanostruktur zwischen dem ersten metallischen Kontakt und dem zweiten metallischen Kontakt ausgeführt. Darüber hinaus weist die Wand einen rechteckigen, quadratischen, trapezförmigen oder dreieckigen Querschnitt auf.
Gemäße einem weiteren Ausführungsbeispiel ist ein Sensor zur Detektion eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors angegeben. Daher verwendet der hier beschriebene Sensor keine sogenannten Nanodrähte, die aus dem Stand der Technik bekannt sein mögen und die mit Verfahren hergestellt werden, welche zum Beispiel den Vapor-Solid (VS) oder dem Vapor Liquid Solid (VLS) Mechanismus nutzen. Solche Nanodrähte des Standes der Technik weisen einen runden Querschnitt und eine drahtartige Struktur auf. Da ein solcher
Herstellungsprozess ein eindimensionales Wachstum verursacht, werden solche Nanodrähte in der Fachwelt daher als„eindimensionale" Gegenstände bezeichnet. Im Gegensatz dazu verwendet die vorliegende Erfindung Sensoren, die als Gatter eine Wand mit einem rechteckigen, quadratischen, trapezförmigen oder dreieckigen
Querschnitt aufweisen. Bezüglich des Begriffs„Wand" sei angemerkt, dass in einem Ausführungsbeispiel des Sensors der vorliegenden Erfindung als Wand eine
Dünnfilmstruktur aufweist. Insbesondere kann ein kontinuierlicher Dünnfilm als Gatter zwischen den beiden metallischen Kontakten des Sensors verwendet werden. Der Dünnfilm ist aus einem Halbleitermaterial hergestellt, beispielsweise Zinkoxid, und kann eine zusätzliche darüber liegende Schutzschicht aus beispielsweise Aluminiumoxid aufweisen. Natürlich sind auch andere Materialkombinationen möglich. Beide Lagen können mit Atomlagenabscheidung abgeschieden werden. Dies wird weiter durch das entsprechende Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel in Figur 17, verdeutlicht. Der Sensor kann mit den hierin angegebenen Herstellungsmethoden effizient und präzise für den Benutzer bereitgestellt werden. Verschiedenste Materialien eignen sich zur Herstellung eines solchen Sensors, was im Nachfolgenden weiter erläutert wird. Dabei kann die Wand des Gatters als eine Nanowand ausgeführt sein, die verschiedene Längen, Höhen und Dicken haben kann und verschiedene zugehörige Relationen erfüllen kann. Dies wird im Folgenden noch weiter spezifiziert werden.
Auch kann der Sensor in diesem und in jedem anderen Ausführungsbeispiel als Feldeffekttransistor oder Diode ausgeführt sein und einen P-N-Übergang aufweisen. Ebenso kann in diesem und in jedem anderen Ausführungsbeispiel das Gatter als metallischer Rückkontakt, als so genanntes Back Gate, ausgeführt sein. Jedoch ist auch ein sogenanntes Liquid Gate, in dem das Molekül oder die Moleküle auf der Oberfläche das Gatterpotential zur Verfügung stellen, eine mögliche
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche in dem Detektionsverfahren genutzt werden kann.
Ähnlich wie Biomoleküle hat das Sensormaterial eine gewisse Oberfiächenladung. Generell gilt, dass am isoelektrischen Punkt (pl) Moleküle neutral geladen sind. Liegt der pH unter dem pl sind die Moleküle positiv geladen, liegt der pH über dem pl sind die Moleküle negativ geladen. Beispielhafte Sensormaterialien sind ZnO und/oder A1203. Zum Beispiel hat ZnO einen pl im Bereich 9-10 und ist für neutrale pH Werte relative positiv geladen. Durch die Oberfiächenladung des Halbleiters kann die Affinität der Oberfiächenfunktionalisierung erhöht werden. Proteine haben oftmals niedrige pl- Werte, so dass diese dann meist negativ geladen sind.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der Sensor auf einem Chip oder einem Wafer angeordnet. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Sensor eine CMOS-Struktur auf und der Sensor ist als integrierter Schaltkreis ausgeführt. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Sensor eine Vielzahl von Feldeffekttransistorstrukturen in paralleler Anordnung mit jeweils einem metallischen Kontakt als Zufiuss, jeweils einem metallischen Kontakt als Abfluss, und jeweils einem dazwischen
angeordneten Gatter in Form einer Wand auf. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Bindungseinheit an dem Gatter des Sensors immobilisiert. Dabei ist die Bindungseinheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus doppelsträngigem Oligonukleotidstrang, Protein, und immobilisiertem Analyt. Dieses Protein ist weiterhin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GyrB (Gyrase Untereinheit B), FKBP (FK-bindendes Protein), FM (F36M Mutante von FKBP), Cyp, ToxT (aus V. cholerae), DHFR (Dihydrofolatreduktase). Weiterhin ist der immobilisierte Analyt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Coumarin-Antibiotika, Rapamycin, FK506, FK506-Derivate, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporinen, Closporin, Closporin-Derivaten, Ascomycinen, Antifolat, Biotin, Steroidhormonen und Analoga, Virstatin,
Methotrexat und Methotrexat-Derivaten.
Mit anderen Worten sind zumindest hinsichtlich der Bindungseinheit drei verschiedene Arten von Sensoren, mit einem doppelsträngigen
Nukleotid/O ligonukleotid, mit einem Protein oder mit einem immobilisierten Analyten an dem Sensor möglich. Ebenso sind für den Fall, dass die Bindungseinheit als Protein ausgeführt ist, wieder eine Reihe von Ausführungsformen möglich.
Ebenso im Falle eines immobilisierten Analyten, wie beispielsweise in der Figur 11 dargestellt, bieten sich mehrere Möglichkeiten, diesen immobilisierten Analyten auszuführen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Sensors angegeben. Dieses Herstellungsverfahren weist den Schritt des Bereitstellens eines strukturierten Substrates auf und weist den Schritt des Bereitstellens einer Wand eines Halbleiters auf dem strukturierten Substrat derart auf, dass die Wand einen rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder
trapezförmigen Querschnitt hat. Ebenso weist das Verfahren die Schritte Aufbringen eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand auf, wodurch eine Transistorstruktur mit dem Sensor bereitgestellt wird. Dabei sei darauf hingewiesen, dass die einzelnen Verfahrensschritte dieses
Herstellungsverfahrens wiederum mehrere Unterschritte aufweisen können, wie sie beispielsweise im Kontext der Figur 17 weiter erläutert werden. Insbesondere kann das Verfahren als eine Kombination von Mikrosystemtechnik und Nanotechnologie gesehen werden, welche die Herstellung von Nanosensoren auf Wafer-Skala erlaubt. Beispielsweise kann mittels Atomlagenabscheidung (auch atomic layer deposition, ALD) eine ultradünne Schicht erzeugt werden. In einem Ausführungsbeispiel kann damit eine Dünnfilmstruktur erzeugt werden. Insbesondere kann ein kontinuierlicher Dünnfilm als Gatter zwischen den beiden metallischen Kontakten bereitgestellt werden. In einer beispielhaften Ausführungsform wird ein 100 nm dicker ZnO Film mit einer dünnen A1203 Lage darauf erzeugt. Dieser Schichtaufbau kann in manchen Ausführungsformen dem zuvor genannten Kriterium entsprechen, dass D > H < L gilt. Eine solche Dünnfilmstruktur wird im Kontext der vorliegenden Erfindung ebenso als Wand bezeichnet, da sie sich ebenso zwischen dem ersten metallischen Kontakt und dem zweiten metallischen Kontakt, also dem Zufluß und dem Abfluß, erstreckt wie in den anderen Ausführungsbeispielen der Wand des Sensors.
Insgesamt können zentimeterlange Nanostrukturen oder Nanowände als Wände für einen Sensor/mehrere Sensoren auf dem Wafer bereitgestellt werden. Dies kann als beispielhafte Linienstruktur angesehen werden. Solche Nanowände können dann als Gatter des hier beschriebenen Sensors verwendet werden und ermöglichen ein besonders sensitives Detektionsverfahren für verschiedenste Analyten oder ein besonders sensitives Verfahren des drug-screenings. Dieses Herstellungsverfahren erlaubt daher die Herstellung von Sensoren zur Multiplex-Detektion von
verschiedenen Substanzen in flüssiger Umgebung. Beispielswiese kann das Substrat aus Silizium sein. Es kann aber auch ein nichtleitendes Substrat sein, welches auch flexibel sein kann. Beispielsweise könnte es eine Folie sein oder das verwendete Material ist aus Papier oder weist Papier auf. Dieses Ausführungsbeispiel des Sensors lässt sich dann als kostengünstiges Einmal- Wegwerfprodukt herstellen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Verfahren den Schritt Abscheiden der Wand mittels Atomlagenabscheidung des Halbleiters auf dem strukturierten Substrat auf. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der
Erfindung weist das Verfahren die weiteren Schritte Bereitstellen einer
Bindungseinheit und/oder eines Sensormoleküls, und Immobilisieren der Bindungseinheit und/oder des Sensormoleküls an der Wand des Sensors auf. Dabei kann die Bindungseinheit ein doppelsträngiges Oligonukleotid, ein erstes Protein und ein immobilisierter Analyt sein. Das erste Protein und der immobilisierte Analyt können gemäß den hierin angegeben Ausführungsbeispielen ausgeführt sein.
Falls gewünscht, kann das Verfahren den zusätzlichen Schritt des Abscheidens einer Zusatzschicht mittels Atomlagenabscheidung über die bereitgestellte Wand enthalten, um den Sensor mit einer Schutzschicht zu versehen. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das Herstellungsverfahren den Schritt des partiellen Entfernens des abgeschiedenen Halbleiters mittels Ätzen auf.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Substrat als Silizium Wafer ausgeführt. Das Verfahren weist weiterhin den Schritt des
Aufbringens einer Siliziumoxidschicht auf dem Silizium Wafer auf, und weist ebenso den Schritt des Verwendens von Photolack und ultraviolettem Licht zur Herstellung von parallelen, rechtwinkligen Streifen aus Photolack auf.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird zum Abscheiden der Wand eine homogene Schicht des Halbleiters, insbesondere Zinkoxid, über die Streifen mittels Atomlagenabscheidung, oder mittels Niedrigtemperatur-
Atomlagenabscheidung oder mittels Tieftemperatur-Atomlagenabscheidung abgeschieden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein Schritt des reaktiven Ionen-Ätzens (RIE) durchgeführt, so dass anisotrop auf einer Oberseite der Streifen und auf einem Boden des Substrates der Halbleiter weggeätzt wird, so dass nur der Halbleiter an den Seitenwänden des Photolacks stehenbleibt.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein
Sauerstoffplasmaprozess durchgeführt, wodurch die Streifen aus Photolack entfernt werden und wodurch freistehende Halbleiter- Wände, insbesondere Zinkoxid- Wände, entstehen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Wand als kontinuierliche Dünnfilmstruktur ausgeführt ist. Gemäß einem weiteren
Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Wand als kontinuierliche
Dünnfilmstruktur aus Zinkoxid ausgeführt und oberhalb des Zinkoxids ist als Zusatzschicht Aluminiumoxid angeordnet. Gemäße einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das
Herstellungsverfahren die folgenden Schritte auf. Bereitstellen eines strukturierten Substrates durch Aufbringen einer Siliziumoxidschicht auf den Silizium Wafer und durch Verwenden von Photolack und ultraviolettem Licht zur Herstellung von parallelen, rechtwinkligen Streifen aus Photolack. Dabei ist das Substrat als Silizium Wafer ausgeführt. Das Bereitstellen von Wänden eines Halbleiters ist ebenso Teil des Verfahrens, wobei dieses Bereitstellen durch Abscheiden des Halbleiters auf dem strukturierten Substrat erfolgt und durch das Ausführen eines reaktiven Ionen-Ätzens (RIE) erfolgt, so dass anisotrop auf einer Oberseite der Streifen und auf einem Boden des Substrates der Halbleiter weggeätzt wird, so dass nur der Halbleiter an
Seitenwänden des Photolacks stehenbleibt. Die Wände des Halbleiters werden auch dadurch bereitgestellt, dass ein Sauerstoffplasmaprozess durchgeführt wird, wodurch die Streifen aus Photolack entfernt werden und wodurch freistehende Halbleiter- Wände derart erhalten werden, dass die Wände einen rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt aufweisen. Dabei weisen die Wände eine Länge L, eine Dicke D und eine Höhe H auf und es gilt für die Wände die
Relation D < H < L oder die Relation D > H < L. Das Herstellungsverfahren weist weiterhin die Schritte des Abscheidens einer Zusatzschicht über die bereitgestellten Wände des Halbleiters und des Aufbringens eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand auf wodurch eine Transistor Struktur bereitgestellt wird. In einer beispielhaften Ausführungsform weist der Dünnfilm eine Dicke von kleiner 10 μιη, kleiner 5 μιη, kleiner 2 μιη, kleiner 1 μιη, kleiner 500 nm, kleiner 200 nm, kleiner 100 nm, kleiner 50 nm, kleiner 20 nm oder kleiner 10 nm auf. Diese Dicken des funktionalen Halbleitermaterials können mit einer Schutzschicht kombiniert werden, wie sie im Kontext der vorliegenden Erfindung beschrieben ist. Diese Schutzschicht kann beispielsweise zwischen 1 nm und 200 nm dick sein.
Beispielsweise kann die Dicke dieser Schutzschicht kleiner 10 nm, kleiner 5 nm oder kleiner 2 nm sein. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung eines hierin beschriebenen Sensors zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten angegeben. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung eines hierin beschriebenen Sensors zur Detektion eines Analyten in einer Probe angegeben. Falls gewünscht, kann der Analyt aus den hierin angegeben Ausführungsbeispielen ausgewählt ist. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Sensors erlaubt ein schnelles und zuverlässiges Detektieren verschiedenster Analyten, je nachdem welche Bindungseinheit und/oder welches Sensormolekül verwendet werden. Da der Sensor auch relativ leicht und relativ kostengünstig herzustellen ist, ist er für die industrielle Anwendung interessant. Die gleichen Vorteile gelten für die
Ausführungsform des oben beschriebenen drug Screening Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung lässt sich grundsätzlich für verschiedene Arten zur Detektion eines Analyten in einer Probe nutzen und ist nicht auf die angegebenen Kombination der Merkmale des Patentanspruchs 1 und der abhängigen
Patentansprüche beschränkt. Es ergeben sich darüber hinaus weitere Möglichkeiten, einzelne Merkmale, wenn sie sich aus den Patentansprüchen, der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele oder unmittelbar aus der Zeichnung ergeben, miteinander zu kombinieren. Die Erfindung wird im Folgenden unter Verweis auf die beigefügten Figuren und anhand schematischer Darstellung bevorzugter Ausführungsbeispiele noch einmal näher erläutert. Hieraus ergeben sich auch weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Fig. 1 zeigt ein Flussdiagramm eines Detektionsverfahrens gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Die Figuren 2a und 2b zeigen einen Sensor gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 zeigt einen Sensor und ein korrespondierendes Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen gemäß einem Ausführungsbeispiel der
Erfindung.
Fig. 4a zeigt einen Sensor und ein Verfahren zur Detektion von Tetracyclin- Antibiotikum gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 4b zeigt die zeitliche Entwicklung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors aus Fig.4a während der Durchführung des Verfahrens.
Fig. 5a zeigt eine zeitaufgelöste Messung des elektrischen Leitwertes des Sensors aus Fig.4a bei Zugabe verschiedener Konzentrationen des Analyten.
Fig. 5b zeigt eine Dosisabhängigkeit einer Messung des elektrischen Leitwerts des Sensors aus Fig.4a.
Fig. 6 zeigt einen Reversibilitätstest des Sensors aus Fig.4a.
Fig. 7a zeigt die zeitaufgelöste Entwicklung des elektrischen Leitwertes eines Sensors bei einer Messung mit Milch, die verschiedene Konzentrationen von
Antibiotika enthält.
Fig. 7b zeigt die entsprechende Dosisabhängigkeit des elektrischen Leitwertes des Sensors von Fig. 7a. Fig. 8 bis 14 zeigen verschiedene Verfahren und Sensoren zur Detektion eines Analyten in einer Probe gemäß unterschiedlicher Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung.
Fig. 15 zeigt besondere geometrische Abmessungen der Wand eines Sensors gemäß weiterer Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 16 zeigt geometrische Abmessungen der Wand weiterer Ausführungsbeispiele eines Sensors.
Fig. 17 ist eine schematische Darstellung eines Herstellungsverfahrens eines Sensors gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
In den Figurenbeschreibungen werden für die gleichen oder ähnlichen Elemente die gleichen Bezugsziffern verwendet.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Nachweis von
Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors. Das Flussdiagramm der Fig. 1 weist als Schritt Sl das Bereitstellen eines Sensors, einer Bindungseinheit, eines Sensormoleküls und einer Probe mit dem Analyten auf. Dabei sind die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert. Im Schritt S2 wird der Sensor, das Sensormolekül und der Analyt zusammengeführt, wodurch sich ein Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der
Bindungseinheit von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand oder von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand verändert. Diese Veränderung des
Bindungszustandes ist mit dem Schritt S3 dargestellt. Dabei ändert sich der
Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit aufgrund, also kausal abhängig von, der Anwesenheit des Analyten. In dem ersten Zustand ist das Sensormolekül an die Bindungseinheit gebunden und in dem zweiten Zustand ist das Sensormolekül von der Bindungseinheit losgelöst. Dieses Verfahren kann auch als elektrisches Verfahren bezeichnet werden, da der Schritt S4, das Detektieren einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, enthalten ist. Dabei basiert die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf der
Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormolekül und der
Bindungseinheit. Dieses Verfahren der Fig. 1 ermöglicht es, hochspezifische Interaktion sowohl zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül als auch zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten zu verwenden und vorteilhaft auszunutzen. Mit anderen Worten kann das in der Fig. 1 gezeigt elektrische Detektionsverfahren für die Detektion eines Analyten in einer unbekannten Probe genutzt werden. Das Verfahren kann dynamische und reversible Bindungsverhältnisse zwischen diesen Komponenten verwenden und ausnutzen. Die Detektion des Analyten basiert daher auf der spezifischen und selektiven Veränderung der Bindung des Sensormoleküls in Abhängigkeit von der Anwesenheit des Analyten. Dabei handelt es sich um ein sogenanntes label-freies Detektionsverfahren, was also ohne weitere
Markierungsmoleküle auskommt. Alternativ dazu kann das Verfahren der Fig. 1 auch als Verfahren zur Detektion von Änderungen in der Molekülinteraktion zwischen der Bindungseinheit und dem Sensormolekül durch die Anwesenheit eines potentiellen Wirkstoffs (drug) ausgeführt werden. Dieses Ausführungsbeispiel des Verfahrens kann also ein effizientes und sensitives sogenanntes drug Screening Verfahren für Fälle bereitstellen, in welchen der Benutzer den Inhalt der Probe kennt, nämlich den zu untersuchenden Wirkstoff, und seine Auswirkungen auf die
Molekülinteraktion eines gegebenen Paars aus Sensormolekül und Bindungseinheit untersuchen möchte. Weiter Details und zusätzliche Aspekte des Verfahrens können den folgenden Figurenbeschreibungen zu den Figuren 2 bis 17 entnommen werden.
Fig. 2a und 2b zeigen jeweils eine Aufnahme eines Rasterelektronenmikroskops einer Wand 303, die in einem Sensor gemäß der vorliegenden Erfindung als Gatter verwendet wird. Dabei ist der Querschnitt der Wand 303 in beiden Figuren deutlich zu sehen. Diese Wand wurde mittels Atomlagenabscheidung (atomic layer deposition, ALD) basierter Spacer-Lithographie (ASL) hergestellt. Gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung weist ein solcher Sensor eine Wand der Länge L auf, die größer ist als eine Länge ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1 mm, 10 mm, 5 mm, 1 cm, und 5 cm. Jedoch sind auch Wandlängen im Mikrometer- Bereich möglich, da das hierin beschriebene Herstellungsverfahren eine solche Länge ermöglicht. Das Detektionsverfahren kann, falls gewünscht, einen Sensor mit diesen Geometrien und/oder Geometrien, die im Folgenden angegeben sind, verwenden. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weist ein solcher Sensor eine Wand mit Dicke D auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 10 bis 500 nm, 10 bis 250 nm, 10 bis 50 nm, 10 bis 20 nm, 20 bis 100 nm, und 40 bis 100 nm. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel weist ein solcher Sensor eine Wand mit einer Höhe H auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 100 nm bis 5 μιη, 250 nm bis 5 μιη, 500 nm bis 5 μιη, 500 nm bis 1 μιη, 1 μιη bis 2 μιη, und 1 μιη bis 4 μιη.
Ein solcher Sensor 200 bzw. ein solches Herstellungsverfahren für den Sensor 200 kann vorteilhafterweise das große Verhältnis zwischen der Oberfläche und dem Volumen des Sensors, bzw. der Wand des Sensors, ausnutzen. Unter der Vielzahl von halbleitenden Materialien haben Zinkoxid(ZnO)-basierte Materialien
vielversprechende Eigenschaften für Feldeffekttransistoren und optische chemische, Gas- und biologische Sensoren. Aber auch andere Halbleitermaterialien
einschließlich organischen, halbleitenden Polymeren können natürlich für die Wand 300 verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es dem Nutzer, beispielsweise dünne Zinkoxidfilmschichten mit Atomlagenabscheidung (ALD) zu verwenden, um die Sensorplattform herzustellen. Die Atomlagenabscheidung hat den Vorteil, dass beliebige und hohe Aspektverhältnis aufweisende Nanostrukturen über eine große Fläche, beispielsweise eine Wafer-Fläche, sehr kontrolliert und homogen herstellbar sind und eine Massenproduktion erlauben. Der Vorteil der hier beschriebenen ALD-basierten Spacer-Lithographie (ASL) ist ihre Variabilität hinsichtlich des verwendeten Materials und der möglichen Steuerung der
Dimensionen der Wand 300. Die Dimension der Dicke kann bis in den Ängström- Bereich (1 Ängström = 10"10 m) hinein gesteuert werden, wobei die Höhe der Struktur mit dem darunter liegenden Resistfilm kontrolliert werden kann, was für enorm hohe Aspektverhältnisse von Wänden 303 als Nanostrukturen auf Wafer- Skala ausgenutzt werden kann.
Zinkoxid bringt als n-typ Halbleiter für den hier beschriebenen Sensor und das hier beschriebene Messverfahren spezifische Vorteile mit sich. Die Biofunktionalisierung von Zinkoxid selbst und die Langlebigkeit des Sensors in Pufferlösungen stellen
Herausforderungen dar. Eine Möglichkeit, um photokorrosive Stabilität in wässrigen Lösungen von Zinkoxid zu realisieren, ist die Beschichtung der Oberfläche mittels eines stabilen Materials durch eine weitere Atomlagenabscheidung. Falls gewünscht kann ein homogenes Wachstum von Atomlagen mittels ALD-Schichten über die 3D- Nanostrukturen bei tiefen Temperaturen erfolgen. Beispielsweise kann eine dünne Schicht Aluminiumoxid verwendet werden, welche die Langlebigkeit in wässrigen Lösungen verbessert und gleichzeitig als Dielektrikum für den Feldeffekttransistor fungiert. Metalloxidoberflächen wie Aluminiumoxid können durch organische Liganden mit hohen K-dielektrischen Eigenschaften modifiziert werden. Ebenso bilden Carbonsäuren als Linker stabile sogenannte self-assembled monolayers (SAM) auf der Sensoroberfläche. Die Adsorption oder Desorption von negativ geladenen Molekülen auf den Aluminiumoxid-Gate erhöht oder erniedrigt die Oberflächenladung, was als Modulation des Liquid Gate Potentials angesehen werden kann. Die Erhöhung der gesamten Oberflächenladung führt zu Aufbiegung des Valenzbandes (Ev) und des Leitungsbandes (Ec) des Zinkoxids, was den Effekt eines erniedrigten elektrischen Leitwertes hat. Die Gesamtladung wird erniedrigt, wenn negativ geladenen Moleküle von der Oberfläche entfernt werden, was die Bandaufbiegung reduziert. Daher ist der elektrische Leitwert im Resultat vergrößert. Das Detektionsverfahren und der Sensor der vorliegenden Erfindung können diese Effekte nutzen. Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines Sensors 200 zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Falls gewünscht kann der Sensor zur Detektion eines Analyten 300 in der Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors eingesetzt werden. Auch ein zuvor beschriebenes drug-screening kann damit durchgeführt werden. Der Sensor weist eine Transistorstruktur mit einem ersten metallischen Kontakt 301 als Zufiuss, einem zweiten metallischen Kontakt 302 als Abfluss und einem Gatter 303 auf. Dabei wird das sogenannte Liquid Gate verwendet, in dem das Molekül/die Moleküle auf der Oberfläche des Gatters 303 das Gatterpotential zur Verfügung stellt/stellen. Dabei ist an dem Gatter eine
Bindungseinheit 304 immobilisiert. Darüber hinaus ist das Gatter als nanoskalige Wand 306 zwischen dem ersten metallischen Kontakt und dem zweiten metallischen Kontakt ausgeführt. Ebenso hat die Wand einen rechteckigen Querschnitt. Dabei ist ein zeitlicher Ablauf des Detektionsverfahrens in Fig. 3 von links nach rechts gezeigt. An der ersten Wand 303 auf der linken Seite der Fig. 3 ist eine
Bindungseinheit 304 an der Wand 306 immobilisiert. Durch Zugabe des
Sensormoleküls 305 in die Sensorumgebung erfolgt eine spezifische Bindung zwischen der Bindungseinheit 304 und dem Sensormolekül 305. Bei Zugabe des Analyten 300, wie im rechten Teil der Fig. 3 illustriert, wird eine
Konformationsänderung des Sensormoleküls 305 verursacht, so dass sich das Sensormolekül von dem gebundenen Zustand an der Bindungseinheit 304 in den gelösten Zustand begibt. Da nach Zugabe des Analyten 300 bei elektrischer
Auslesung dies als Änderung der Oberfiächenladungen auf dem Gatter 303 gemessen werden kann, ist ein eindeutiger Nachweis des Analyten 300 in der untersuchten Probe möglich. Dabei kann die Bindungseinheit 304 beispielsweise als
doppelsträngiger Oligonukleotid, als Protein oder als immobilisierter Analyt ausgeführt sein. Ebenso gibt es viele verschiedene Ausführungsformen für das Sensormolekül 305. Unterschiedlichste Analyten 300 können mit dem hier beschriebenen Messverfahren detektiert werden. Dies wird im Kontext der weiteren Figuren veranschaulicht und weiter erklärt werden. Ebenso kann eine
Quantifizierung der Menge des Analyten in der Probe erfolgen.
Fig. 4 zeigt ein weiter konkretisiertes Ausführungsbeispiel. Die Detektion von Medikament-Target-Interaktionen in Echtzeit ist für die Medikamentenentwicklung oder für kontaminierte Lebensmittel/Flüssigkeiten ein wertvolles Mittel. Durch die vorliegende Erfindung war es zum ersten Mal möglich, die Oberflächen von
Nanowänden für die elektrische Echtzeitdetektion und Quantifizierung von
Antibiotika mit einem Tet-Repressor-Sensorprotein (TetR) 400 durchzuführen. Der Sensor 200 in Fig. 4 weist Nanostrukturen mit einem hohen Aspektverhältnis auf, welche durch Atomlagenab Scheidung und Spacer-Lithographie hergestellt wurden. Die Wände 303 werden dabei als Gatter der gezeigten Transistorstruktur in Fig. 4a verwendet. Die Oberflächen der Gatter 303 wurden mit der Bindungseinheit 401 funktionalisiert, welche aus Oligonukleotiden, die die Sequenz des Operators tetO aufweisen, besteht. An diese Bindungseinheit bindet das Tet-Repressor Protein (TetR) 400 in einer spezifischen Weise. Dieses Sensorprotein 400, das als
Sensormolekül fungiert, wird von der Bindungseinheit 401, hier ausgeführt als Operator-DNS, in einer dosisabhängigen Weise wieder freigegeben, wenn das Sensormolekül 400 mit dem Analyten 402, dem Tetracyclin- Antibiotikum, in Verbindung kommt. Als Resultat ist der elektrische Leitwert entsprechend moduliert, da sich die gesamte Oberflächenladung verändert. Dies wird weiter mit Bezug auf die Figuren 5-7 erklärt werden. Mit anderen Worten wird in Fig. 4 anhand des Sensors 200 der Schaltmechanismus der Sensorproteine 400 dargestellt, die zunächst an die funktionalisierten Oberflächen 303 des Sensors 200 gebunden sind und anschließend wieder freigegeben werden. Wie im Folgenden erklärt wird, kann das dabei beschriebene Detektionsverfahren und der hier gezeigte Sensor beispielsweise verwendet werden, um Antibiotika-Rückstände in Milch von Kühen nachzuweisen, die weit unter dem maximalen Rückstandswert liegen, den die Europäische Union erlaubt. Selbstverständlich sind vielzählige andere Anwendungen mit der
vorliegenden Erfindung möglich. Es wurde zum ersten Mal die Echtzeitmessung dynamischer molekularer
Wechselwirkungen auf Basis von elektrischen Messungen ermittelt. Im
nachfolgenden Beispiel wird exemplarisch dargelegt, dass der nanostrukturierte Sensor für das Überwachen der Bindung des Tetracyclin-Repressors (TetR) an seine Operator-DNS und die entsprechende induzierbare Freigabe des TetR durch die Hinzufügung von Tetracyclin zuverlässig detektiert werden kann. Die vorliegende Erfindung erlaubt es daher, ultrasensitive Messungen von Tetracyclin- Konzentrationen durchzuführen. Die vorteilhafte Eignung dieses neuen
nanostrukturierten Sensors und des zugehörigen Detektionsverfahrens wird im Folgenden durch die exakte Quantifizierung von Tetracyclin in biologisch komplexen Proben wie Milch nachgewiesen.
Zunächst werden detaillierte Angaben über die vorbereitenden Maßnahmen zur Durchführung der Experimente erläutert:
Herstellung des TetR-Proteins:
Das DNS-bindende Protein TetR wurde gemäß Ref. 1 hergestellt (Ref. : 1 : Christen, E.; Karlsson, M.; Kämpf, M.; Weber, C; Fussenegger, M.; Weber, W. Protein Expr Purif. 2009, 66, 158-164). Kurz zusammengefasst wurden zur Expression eines TetR-Proteins mit C-terminalem Hexahistidin-Tag E. coli BL21 * (DE3) pLysS- Zellen mit dem Plasmid pWW307 transformiert und die Proteinexpression wurde in LB-Medium bei OD6oo = 1 mit 1 mM Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) für 4 h bei 37 °C induziert. Die Zellen wurden zentrifugiert (6000 x g, 7 min, 4 °C) und in Lysepuffer resuspendiert (40 ml pro 1000 ml ursprünglichen Kulturvolumen, 50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0), unter Verwendung einer Frech-Press aufgeschlossen (1000 bar, 3 Durchgänge, APV, DK, Albertslund, APV-2000) und der Zellrückstand wurde durch Zentrifugation bei 30000 x g für 30 Minuten bei 4 °C entfernt. Das Lysat wurde auf eine Ni2+-NTA-Agarose- Superfiow-Schwerkraftssäule (10 ml Lysat pro ml Volumen an Ni2+-NTA-Agarose- Kügelchen, Qiagen, Hilden, Deutschland, Kat.-Nr. 30210) aufgetragen, anschließend mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer, 10 Säulenvolumina Waschpuffer (50 mM
NaH2P04, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) gewaschen und die Elution erfolgte mit 2 Säulenvolumina Elutionspuffer (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0). Nach Zugabe von 10 % Saccharose wurde das TetR- Protein bis 0,6 mg/ml aufkonzentriert, gefriergetrocknet und bei -80 °C gelagert. Für die Experimente wurde das lyophilisierte TetR-Protein durch Zugabe von H20 aufgelöst. Die Proteinkonzentration wurde durch die Bradford-Methode (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, Kat.-Nr. 500-0006) mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt.
Hvbridisierung der Carbonsäure-terminierten doppelsträngigen Oligonukleotide (tetO):
Für die Erzeugung von doppelsträngiger Operator-DNS zur Bindung des TetR- Proteins wurden die Oligonukleotide oRG128 (5'-actccctatcagtgatagagaaa-3') und oRG229 (5'-tttctctatcactgatagggagt-3', 5'-COOH funktionalisiert von IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), Kat.-Nr. 5-0210-23X) in äquimolaren Mengen (50 μΜ je Oligonukleotid) in lx SSC-Puffer (15 mM Natriumeitrat, 150 mM NaCl, pH 7) gemischt, bei 95 °C für 5 Minuten inkubiert und anschließend langsam (2 °C pro min) auf Raumtemperatur abgekühlt.
Funktionalisierungs verfahren :
Jede Vorrichtung wurde für 2 Stunden mit Carbonsäure-terminierten
doppelsträngigen tetO Oligonukleotiden (tetO) funktionalisiert. Um nicht gebundene Moleküle zu entfernen, wurde die Vorrichtung dann in deionisiertem Wasser gespült. Um Oberflächenbereiche mit unspezifischer Proteinbindung zu blockieren, wurde für 30 Minuten 1% (v/v) Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Aldrich, Kat.-Nr. 05479) in Bindungspuffer (0,01 mM Tris, 0,01 mM MgCl2 und 0,06 mM NaCl) zugegeben.
Probenvorbereitung der Antibiotika:
Tetracyclin wurde von Applichem (AppliChem, Darmstadt, Deutschland, Kat.-Nr. A1685,0025) erhalten und in Ethanol als eine 2 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Erythromycin wurde von Sigma-Aldrich (Kat.-Nr. E-5389) erhalten und in Ethanol als eine 10 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Ampicillin wurde von Roth (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland, Kat.-Nr. K029.2) erhalten und in H20 als eine 100 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Gentamycin wurde von Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Lausen, Schweiz, Kat.-Nr. 380-003-G005) erhalten und in H20 als eine 20 mg/ml Stammlösung aufgelöst. Die Stammlösungen wurden in Bindungspuffer oder Milch auf die endgültige experimentelle Konzentration verdünnt.
Experimente:
Fig. 4a zeigt zunächst das Grundprinzip des Sensors 200. In diesem Experiment hatte die Wand des Sensors eine Länge von etwa 500μιη. An dem Sensor 200 der Fig. 4 wird zunächst ein doppelsträngiges Oligonukleotid, der Operator tetO gebunden. An den doppelsträngigen Operator Oligonukleotid kann der Tetracyclin-Repressor in einer Sequenz-spezifischen Weise binden. Die hier verwendeten tetO- Oligonukleotide weisen eine Carboxylsäureende an dem 5 '-Ende eines Stranges auf. Die elektrischen Eigenschaften, wie zum Beispiel der elektrische Leitwert zwischen Zufluss und Abfluss (GDs) ist in Fig. 4b dargestellt und wird nach der
Funktionalisierung gemessen (Schritt 1). Während des Annäherns des TetR Proteins zu der DNS, wird es einen Ladungstransfer von adsorbierenden Proteinen geben und der Leitwert sinkt aufgrund der n-Typ-Charakteristik von Zinkoxid (Schritt 2). Die Gesamtladung von TetR (isoelektrischer Punkt pl = 6,2) ist negativ im Falle einer umgebenden Pufferlösung (pH 7,8). Ein Waschschritt beseitigt die nicht gebundenen Proteine und das Signal des Leitwertes wird erneut gemessen, wobei ein leichter Anstieg des Leitwerts festgestellt wird. Wenn zu diesem funktionalisierten Sensor 200 dann Antibiotika der Tetracyclin-Familie zugegeben werden (Schritt 3), lösen sie durch Binden an das TetR Protein eine Konformationsänderung der Proteinstruktur aus. Dadurch wird der TetR-TetC-Komplex von der ieiO-modifizierten
Sensoroberfläche 303 freigegeben was zu einer Reduktion der Ladung an der Sensoroberfläche führt. Ein anschließender Waschschritt 4 erfolgt, um letztlich die nicht gebundenen TetR-TetC-Komplexe zu entfernen, so dass die erhöhte elektrische Leitfähigkeit erneut gemessen werden kann. In unseren Experimenten haben wir den Sensor 200 einer 0,1 mM (1 millimolar = 1 mol/m3) Pufferlösung ausgesetzt. Das
Sensormolekül liegt in einer Lösung vor, wobei die Lösung 3 μg pro ml TetR enthält, und wobei der Sensor für 30 Minuten in der Lösung verbleibt. Anschließend wird der Nano wand- Sensor Tetracyclin ausgesetzt, wobei Lösungen von 1 pM (1 picomolar = 10 9 mol/m3) zu 1 μΜ (1 micromolar = 10 3 mol/m3) in Bindungspufferlösungen verwendet wurden.
Fig. 5a beschreibt das gesamte zeitaufgelöste experimentelle Verfahren der Fig. 4, um das dosisabhängige Profil der TetR-modifzierten Gatter 303 für Tetracyclin zu erhalten. Die Zeit 0 sec beim Schritt 1 beschreibt die Exposition des Nanowand- Sensors mit dem schon gebundenen TetR gegenüber einem Bindungspuffer, bis eine stabile Basislinie erreicht wird. Anschließend wird 1 pM Tetracyclin in
Bindungspuffer zu dem System zugegeben, was in Schritt 2 der Fig. 5a gezeigt ist, und was zu einem schnellen Anstieg des elektrischen Leitwertes führt (hier ist die absolute Veränderung des Leitwertes in Bezug auf die Basislinie gezeigt). Zu diesem Zeitpunkt binden die Tetracyclin-Moleküle das Tet-Repressor-Protein, was zu einer Konformationsänderung des TetR-Proteins und zur Freigabe des Tetracyclin-TetR- Komplexes von seiner Bindungseinheit, dem tetO, führt. Ein zusätzlicher
Waschschritt 1 führt zu einer weiteren Erhöhung des Leitwertes, da die dissoziierten Tetracyclin-TetR-Komplexe nicht mehr in der Nanostruktur-Oberflächengegend vorhanden sind (die Leitwertmessung nach dem Waschen dauert wieder 2 min). Von da ab wird die Tetracyclin-Dosis im Bindungspuffer in Zehnerschritten auf bis zu 1 μΜ erhöht, was durch die Schritte 3, 4, 5, 6, 7 und 8 dargestellt ist. Zwischen diesen Schritten wird der Sensor 200 jeweils mit Bindungspuffer gespült und wird in dem Bindungspuffer für 2 Minuten hinsichtlich seines Leitwertes vermessen. Das System ist äußerst sensitiv, mit einer Detektionsgrenze unter 1 pM. Die Daten sind in der Fig. 5b auf einer linearen und einer logarithmischen Skala zusammengefasst. Durch Datenanalyse, bei dem dieser Plot gefittet wird und bei dem eine
Dosisantwortfunktion verwendet wird, kann eine Assoziationskonstante kass in dem Bereich von 109 M"1 gefunden werden, was in Übereinstimmung ist mit den Daten, die in der Literatur für solche TetR-Tetracyclin-Interaktionssysteme angegeben werden.
Wichtiger erscheint uns der Punkt, dass der Sensor 200 in der Lage ist, elektronisch Rückstände von Tetracyclin geringer als 1 pM zu detektieren, was weiter unter dem maximalen Rückstandslevel der Europäischen Union von 100 μg pro kg liegt. Diese Sensitivität ist aus fachmännischer Sicht nicht auf die hier exemplarisch gezeigte Anwendung beschränkt. Das macht das hier im Detail beschriebene Messverfahren, basierend auf dem hier beschriebenen Sensor, sehr viel sensitiver als bisher bekannte Methoden, wie beispielsweise Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA). Insgesamt ist daher festzuhalten, dass der Sensor 200 und das damit durchgeführte Verfahren eine starke Verbesserung der Sensitivität im Vergleich zu konventionellen Methoden zur Detektion von Medikament-Target- Wechselwirkungen bietet.
Für industrielle Zwecke und auch für die Zukunft ist es wichtig, Sensoren bereitzustellen, die zuverlässig und wiederholbar Messungen durchführen. Im folgenden Experiment der Fig. 6 wird eine ieiO-modifizierte Wand eines Sensors mehrfach TetR und Tetracyclin ausgesetzt. Im Schritt 1 wird die elektrische
Leitfähigkeit des funktionalisierten Sensors in einem Bindungspuffer gemessen, bis eine stabile Basislinie erreicht wird. Anschließend werden 3 μg pro ml TetR Proteine (3 μg/ml in Bindungspuffer) zu dem Sensor hinzugegeben, wobei der elektrische Leitwert während der Inkubationszeit von ca. 6 Minuten fällt. Ein Waschschritt und eine Messung der elektrischen Leitfähigkeit direkt nach der Inkubation wurde durchgeführt. Anschließend wurde 50 nM (1 nanomolar = 10 6 mol/m3) Tetracyclin in Bindungspuffer hinzugefügt (Schritt 3) und der dissoziierte Tetracyclin-TetR- Komplex wurde weggewaschen und der Leitwert des Systems wurde in
Bindungspuffer gemessen, was durch den Schritt 1 indiziert wird. Eine
anschließende TetR-Inkubation und Tetracyclin-indizierte Beseitigung wurde zwei weitere Male durchgeführt, um den entsprechenden Schalteffekt und die
Wiederholbarkeit an dem Sensor zu demonstrieren. Der finale Schritt 4 wurde durchgeführt, um 10 nM Tetracyclin zu detektieren und es wurde immer noch eine Veränderung im Leitwert erkannt, was beweist, dass der Sensor immer noch voll funktionstüchtig ist.
Nachdem erfolgreich die Quantifizierung von Tetracyclin-Konzentrationen mit dem Nano wand- Sensor mit hoher Sensitivität demonstriert wurde, wurde der Sensor anschließend einer weiteren, praktischen Anwendung zugeführt, um die Detektion und Quantifizierung von Antibiotikum von Veterinären Produkten, zum Beispiel Milch, zu belegen. Dabei wird im Folgenden die Detektion von Tetracyclin in Milch und die Kreuzsensitivität zu anderen antibiotischen Klassen erläutert. Für dieses Experiment wurde rohe Milch ohne jegliche antibiotische Kontamination verwendet. Diese Milch wurde dann in verschiedene Probenröhrchen verteilt und mit verschiedenen exemplarischen Antibiotikumsklassen (Tetracyclin, Erythromycin, Ampicillin und Gentamicin) in Konzentrationen gemäß dem maximalen
Rückstandslevel der Europäischen Union versehen. Dieses maximale
Rückstandslevel (MRL) ist 100 μg pro Liter, 40 μg pro Liter, 4 μg pro Liter, und 100 μg pro Liter für Tetracyclin, Erythomycin, Ampicillin und Gentamicin. Für die Messungen wurde die Milch um 3 Größenordnungen verdünnt. In Fig. 7a wurde zunächst die Kreuzsensitivität durch Exponierung des Sensors in verschiedenen Milchlösungen mit Antibiotika-Bestandteilen getestet. Der Schritt 1 entspricht immer dem Waschschritt mit Bindungspuffer und den Messungen in dem Bindungspuffer. Im Schritt 2 wurde reine, unkontaminierte, verflüssigte, organische Milch in
Bindungspuffer in die Messzelle eingeführt, wobei kein Effekt während dieses Waschschrittes bemerkt wurde. Anschließend wurde die verflüssigte Milch, welche Erythomycin, Ampicillin, Gentamicin enthält, in den Schritten 3, 4 und 5 dem Sensor zugeführt. Wie der Fig. 7a zu entnehmen ist, wurde keine signifikante Veränderung des elektrischen Leitwertes beobachtet, was zeigt, dass das TetR-Protein nicht auf andere Antibiotika-Klassen als Tetracyclin reagiert. Dies belegt die Spezifität und Selektivität der vorliegenden Erfindung. Anschließend wurde die mit Tetracyclin kontaminierte Milch dem Sensor zugeführt, was einer Konzentration zwischen 10 fM (1 femtomolar = 10 12 mol/m3) und 100 pM nach einer 2000-fachen Verdünnung entspricht und den verdünnten MRL darstellt. Das Experiment in Fig. 7a wurde um das genannte Dosisantwortprofil erweitert, was die Schritte 6 bis 9 für entsprechend angewendete Konzentrationen umfasst. Die durchschnittlichen Dosisantwortdaten der getesteten Milchproben sind in der Fig. 7b auf linearer und logarithmischer Skala zusammengefasst und stimmen mit dem Dosisantwortprofil der Fig. 5b überein, bei welchen nur Puffer verwendet wurde. Wie durch die hier dargestellten Experimente gezeigt wurde, erfolgt zum ersten Mal eine einfache Fabrikation eines Sensors , welcher in der Lage ist, schnell ultrageringe Konzentrationen von Antibiotikarückständen wie Tetracyclin in realen biologischen Systemen wie Milch nachzuweisen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in diesem Beispiel ultralange Nanowände mit einem hohen Aspektverhältnis aus Zinkoxid/ Aluminiumoxid hergestellt wurden, um diese erfolgreich mit doppelsträngiger Operator-DNS zu funktionalisieren und mit Tet-Repressor-Proteinen zu beladen. Der Kontakt des Sensors mit verschiedenen Konzentrationen von Tetracyclin- Antibiotika, die an das TetR-Protein binden, gefolgt von einer Konformationsänderung in dem Protein führen zu der Freigabe und einer Veränderung in den elektrischen Eigenschaften aufgrund einer
Ladungsmodulation auf der Nanowand-Oberfläche und einer korrespondierenden Biegung der Bänder, die hier durch den elektrischen Leitwert gemessen werden kann. Die elektrische Leitfähigkeit zwischen dem Zufluss und dem Abfluss des Sensors wurde kontinuierlich gemessen und Konzentrationen im Bereich von 1 pM und 1 μΜ wurden detektiert, wobei eine typische Assoziationskonstante von ca. 109 M"1 bestimmt wurde. Der Schaltmechanismus des Bindens, der Freigabe des Proteins sowie die Wiederholbarkeit und Verlässlichkeit wurden gezeigt, indem der Sensor mehrere Male TetR-Proteinen und Tetracyclin zugeführt wurde. Wir wiederholten den Test mit anderen Ausführungsbeispielen und Proben des Sensors, wobei entsprechend ähnliche Sensorcharakteristiken festgestellt wurden.
Experimente mit verdünnter reiner Milch, und mit Milch, die in kontrollierter Weise mit TetR-spezifischen Tetracyclinen sowie mit Antibiotika von anderen Klassen verunreinigt wurde, wurden durchgeführt. Reine Milch und Antibiotika anderer Klassen zeigen eine vernachlässigbare Reaktion auf TetR und bewirken keine Änderung in der Leitfähigkeit des Sensors, was eine sehr gute Selektivität des Sensors demonstriert. Milch, die mit Tetracyclin gemäß dem maximalen
Rückstandslevel der EU versetzt wurde, wurde getestet. Konzentrationen bis hinab zu 100 fM wurden erfolgreich durch den Sensor detektiert.
Es wurde also erneut gezeigt, dass der Sensor und das Detektionsverfahren geeignet ist, um eine Quantifizierung von Antibiotika oder im Allgemeinen die Detektion der Wechselwirkung von kleinen Molekülen (small molecules) auf der Oberfläche zu ermöglichen. Die Bindung und das Ablösen von solchen konformitätsändernden Molekülen kann mittels des hier angegebenen Sensors und Verfahrens detektiert werden. Mit anderen Worten stellt der hier präsentierte Sensor und das
korrespondierende Messverfahren das Konzept zur elektrischen Quantifizierung von Medikament-Target-Interaktionen in Echtzeit dar. Als exemplarisches
Ausführungsbeispiel ist die Detektion von Tetracyclin- Antibiotika in Milch aufgeführt und andere Beispiele sind angegeben. Die Auswirkung dieses
grundlegenden Konzepts geht über die spezifische Anwendung hinaus, da TetR für eine ganze Familie von DNS-bindenden Regulator-Proteinen steht, der TetR-Familie, deren spezifische Bindung an jeweilige DNS Operatorsequenzen sich in Antwort auf viele verschiedene small molecules wie Medikamente, Metabolite, Vitamine oder Metalle verändert. Daher lassen sich die zuvor bezüglich der Figuren 4 bis 7 dargelegten Ausführungen aus fachmännischer Sicht ebenso auf andere Protein-DNS Kombinationen anwenden, bei denen die TetR-ieiO-Komplexe entsprechend ersetzt werden. Daher kann die hierein beschriebene Technik verwendet werden, um viele verschiedene Arten von small molecules schnell und sensitiv zu quantifizieren. Darüber hinaus sind auch Protein-Protein Kombinationen anwendbar. Dies könnte z. B. bei der Medikamentenentwicklung im einfachsten Fall auch zum Screenen von small molecule Bibliotheken genutzt werden, um diejenigen Kandidaten zu identifizieren, die eine gegebene Protein-Protein- Wechselwirkungen spezifisch beeinflussen.
Diesbezüglich zeigen die Figuren 8 bis 14 unterschiedliche Sensoren und
Detektionsverfahren gemäß weiteren Ausführungsbeispielen. Dabei sind
unterschiedliche Ausführungsformen des Sensormoleküls 305 und unterschiedliche Ausführungsformen der Bindungseinheit 304 gezeigt. Insbesondere zeigt Fig. 8 einen Sensor mit einem Gatter 303, auf dem als Bindungseinheit 304 ein erstes Protein 800 immobilisiert ist. Es wird der freie Analyt 300 zu diesem Sensor 200 hinzugefügt, so dass sich der Analyt und das Protein 1 zu einem neuen Epitop 801 verbinden. Bei Zugabe des zweiten Proteins 802, welches als Sensormolekül fungiert, entsteht der Komplex 803 auf oder an dem Gatter 303. Das zweite Protein bindet daher an das neue Epitop 801. Dabei kann beispielsweise FKBP das Protein PI, Rapamycin der Analyt und FRB das Protein 2 sein.
Fig. 9 beschreibt ein anderes Ausführungsbeispiel, bei dem das erste Protein 900 als Bindungseinheit 304 ausgeführt ist und der bivalente Analyt 300 hinzugefügt wird. Dabei entsteht ein neuer Komplex 901, der jedoch im Vergleich zu Fig. 8 kein neues Epitop darstellt. Das zweite Protein 902 wird als Sensormolekül 305 hinzugefügt und es entsteht der Komplex 903 auf dem Gatter 303. Das erste Protein 900 kann beispielsweise GyrB, der Analyt kann Coumermycin und das zweite Protein kann GyrB sein.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt Fig. 10 ein immobilisiertes erstes Protein 1000, das als Bindungseinheit 304 fungiert. Das zweite Protein 1001, das die Funktion des Sensormoleküls 305 übernimmt, bindet an das erste Protein. Nach der Hinzugabe des freien Analyten 300 konkurriert dieser mit dem bereits gebundenen Protein P2, um die Bindung zu dem immobilisierten Protein PI . Schließlich bindet der Analyt 300 an das erste Protein 1000 und bildet einen neuen Komplex 1002, wodurch die Bindung zwischen dem ersten Protein und dem zweiten Protein aufgehoben bzw. durchbrochen wird. Als Beispiel kann FM als erstes Protein, FM als zweites Protein und FK506 als Analyt genannt werden.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel zeigt Fig. 11, dass auf dem Gatter 303 an Analyt 1100 immobilisiert ist, der in diesem Ausführungsbeispiel als
Bindungseinheit 304 fungiert. Nach Zugabe des Sensormoleküls 305, das hier als erstes Protein ausgeführt ist, bindet dieses an den immobilisierten Analyten 304. Nach Zugabe eines freien ungebundenen Analyten 300 bindet dieser an das Protein 1 und dieser Komplex dissoziiert von dem immobilisierten Analyten. Als Beispiel kann ein immobilisiertes Antigen A als Analyt 1100, als Protein PI ein Antikörper und als freier Analyt wieder das immobilisierte Antigen genannt werden.
Ein weiteres Beispiel ist in Fig. 12 gezeigt, welches die Fortsetzung der Fig. 9 darstellt. Aufbauend auf dem Komplex 903, können das zweite Protein P2 und der Analyt als Sensormolekül 305 gesehen werden. Nach Zugabe des monovalenten
Analyten A2300 konkurriert dieser mit dem Sensormolekül 305 um die Bindung an das Protein PI, welches auf dem Gatter immobilisiert ist. Als Beispiel kann GyrB als PI, Coumermycin als Analyt A, GyrB als P2 und Novobiocin als monovalenten Analyten A2300 genannt werden. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt Fig. 13, wie ein erstes Protein als am Gatter immobilisierte Bindungseinheit 304 ausgeführt ist. Anschließend wird ein Protein-2-Analyt-Komplex als Sensormolekül 305 dem Sensor zugeführt, so dass ein entsprechender Komplex 1300 entsteht. Nach Zugabe eines freien Analyten 300 konkurriert dieser mit dem Sensormolekül um die Bindung an das immobilisierte Protein PI, was zur Ersetzung des Sensormoleküls 305 durch den freien Analyten 300 im Protein PI führt. Als Beispiel kann Anti-Fluorescein scFv als PI, BSA-FITC als Komplex P2-A und freies Fluorescein als freier Analyt genannt werden.
Fig. 14 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, in dem ein
Analyt 1401 auf einem ersten Protein 1400 immobilisiert ist, wobei das erste Protein seinerseits an dem Gatter 303 immobilisiert ist. Dieser Komplex dient als
Bindungseinheit 304. Ein zweites Protein 1402 kann hinzugefügt werden, welches an den Analyten bindet. Der Komplex bestehend aus dem zweiten Protein und dem Analyten wird als Sensormolekül 305 verwendet. Nach Hinzufügung des freien Analyten 300 entsteht ein dem Anfangszustand ähnlicher Komplex 1404, der aus dem ersten Protein und dem freien Analyten besteht. Als Beispiel kann BSA-FITC als Komplex Pl-A, Anti-fluorescein scFv als P2 und freies Fluorescein als freier Analyten dienen.
Die Figuren 15 und 16 zeigen jeweils unterschiedliche geometrische Abmessungen eines Gatters eines Sensors zur Detektion eines Analyten gemäß verschiedener Ausführungsbeispiele der Erfindung. Es ist das Gatter 303 auf dem Substrat 1500 gezeigt, wobei weitere Elemente des Sensors 200 der Übersichtlichkeit halber hier nicht dargestellt sind. In Fig. 15 sind die Parameter Dicke D, Höhe H und Länge L der Wand gezeigt. Insbesondere sind gemäß spezifischen Ausführungsbeispielen zwei Relationen angegeben, in welchen für den Sensor gilt, dass D < H < L oder D > H < L. Das Gatter 303, das als Wand ausgeführt ist, hat in Fig. 15 einen rechteckigen Querschnitt. Jedoch ist auch ein quadratischer Querschnitt möglich. Ebenso ist die Herstellung eines dreieckigen Querschnitts möglich, wie in der Fig. 16 gezeigt.
Mit einem Sensor dieser geometrischen Abmessungen wird eine besonders gute Responsivität bei dem Nachweis geänderter Oberflächenladungen erreicht. Mit anderen Worten erlaubt ein solcher Sensor ein präzises und verlässliches Verfahren zur Detektion eines Analyten in einer Probe auf Basis der Detektion der Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors. Fig. 17 zeigt die Fabrikation eines Sensors gemäß einem weiteren
Ausführungsbeispiel der Erfindung. Mit anderen Worten ist in Fig. 17 ein Verfahren zur Herstellung eines Sensors angegeben, welches die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen eines strukturierten Substrates, Bereitstellen einer Wand eines
Halbleiters auf dem strukturierten Substrat, und Aufbringen eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand, wodurch eine
Transistorstruktur bereitgestellt wird. Im Detail wird im Verfahren der Fig. 17 eine 1 μιη dicke Siliziumoxid-Schicht auf einem Silicum (lOO)-Wafer verwendet. Hoch auflösender TSMR Photoresist wird verwendet und Standard-Photolithographie mit ultraviolettem Licht wird zur Entwicklung in MIF726 (Entwicklerlösung, Metall- Ionen Frei) verwendet, um parallele rechtwinklige Streifen 1700 mit extremen vertikalen Seitenwänden von 400 μιη Höhe über den gesamten Wafer im
Zentimeterbereich zu erzeugen. Anschließend werden 50 μιη polykristallines Zinkoxid in dreidimensionaler Art und Weise über die Streifen 1700 abgeschieden, wobei dies mittels Tieftemperatur-Atomlagenabscheidung (115 °C, DEZ Precursor) erfolgt, um eine homogene Schicht 1701 zu erreichen. Anschließend wird reaktives Ionen-Ätzen (RIE) ausgeführt, um anisotrop auf der Oberseite der Streifen 1700 und auf dem Boden des Substrates 50 nm Zinkoxid wegzuätzen, so dass nur das Zinkoxid an den Seitewänden des Photoresists stehenbleibt. Ein zusätzlicher
Sauerstoffplasmaprozess bei 220 °C entfernt die Resist- Streifen 1700, wodurch freistehende Zinkoxid-Nano wände erhalten werden. Die Höhe und die Dicke (das Aspektverhältnis) der Nanowände kann durch die Höhe des Resist und der abgeschiedenen Dicke der Atomlagenabscheidung bestimmt werden. Eine
Metallverdampfung von 400 μιη Aluminium/Goldschicht erfolgt anschließend, um die elektrischen Zufluss- und Abflusskontakte bereitzustellen. Anschließend wird das Gatter-Dielektrikum, bestehend aus einer 5 μιη dicken Aluminiumoxid, durch einen zusätzlichen ALD-Prozess (200 °C, TMA Precursor) aufgebracht. Der dadurch entstehende Sensor 200 wird dann elektronisch mittels Bonding von
Aluminiumdrähten verbunden und die elektrischen Kontakte mittels PDMS elektrisch passiviert.
Ergänzend sei darauf hingewiesen, dass "umfassend" keine anderen Elemente oder Schritte ausschließt und "eine" oder "ein" keine Vielzahl ausschließt. Ferner sei darauf hingewiesen, dass Merkmale oder Schritte, die mit Verweis auf eines der obigen Ausführungsbeispiele beschrieben worden sind, auch in Kombination mit anderen Merkmalen oder Schritten anderer oben beschriebener Ausführungsbeispiele verwendet werden können.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit eines Sensors, das Verfahren aufweisend die Schritte:
Bereitstellen eines Sensors, einer Bindungseinheit, eines Sensormoleküls und einer Probe mit dem Analyten (Sl),
wobei die Bindungseinheit und/oder das Sensormolekül an dem Sensor immobilisiert sind/ist,
Zusammenführen des Sensors, des Sensormoleküls und des Analyten (S2) wodurch sich ein Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der
Bindungseinheit von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand oder von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand verändert (S3),
wobei sich der Bindungszustand zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit auf Grund der Anwesenheit des Analyten verändert,
wobei das Sensormolekül in dem ersten Zustand an die Bindungseinheit gebunden ist und wobei das Sensormolekül in dem zweiten Zustand von der Bindungseinheit losgelöst ist,
das Verfahren weiterhin aufweisend den Schritt
Detektieren einer Veränderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors
(S4), und
wobei die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors auf der Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem Sensormoleküls und der Bindungseinheit basiert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
wobei die Bindungseinheit an dem Sensor immobilisiert ist, und
wobei das Sensormolekül in dem ersten Zustand an die Bindungseinheit und darüber an den Sensor gebunden ist und wobei das Sensormolekül in dem zweiten Zustand von der Bindungseinheit und von dem Sensor losgelöst ist.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2,
wobei die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem
Sensormolekül und der Bindungseinheit dosisabhängig von einer Dosis des Analyten in der Probe erfolgt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei der Sensor einen ersten metallischen Kontakt als Zufluss, einen zweiten metallischen Kontakt als Abfluss und ein Gatter aufweist,
wobei die Bindungseinheit an dem Gatter des Sensors angeordnet ist, und wobei das Detektieren der Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit des Sensors die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit zwischen dem Zufluss und dem Abfluss detektiert.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4 ,
wobei der Sensor als Gatter eine Wand mit einem rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt zwischen dem Zufluss und dem Abfluss aufweist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin aufweisend den Schritt:
Herstellen einer ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten (S5), und
wobei die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem
Sensormolekül und der Bindungseinheit auf Grund der hergestellten ersten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und dem Analyten erfolgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6,
Herstellen einer zweiten spezifischen Bindung zwischen dem
Sensormolekül und der Bindungseinheit (S6), und Lösen der zweiten spezifischen Bindung zwischen dem Sensormolekül und der Bindungseinheit auf Grund der Anwesenheit des Analyten (S7).
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7,
wobei die Herstellung der ersten spezifischen Bindung zwischen dem
Sensormolekül und dem Analyten eine Konformationsänderung des Sensormoleküls bewirkt wodurch die Veränderung des Bindungszustandes zwischen dem
Sensormolekül und der Bindungseinheit verursacht wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Bindungseinheit auf dem Sensor immobilisiert ist, und wobei die Bindungseinheit ein doppelsträngiges Oligonukleotid ist.
10. Verfahren zur Detektion eines Antibiotikums gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9,
wobei der Analyt ein Antibiotikum ist, und
wobei das Sensormolekül ein entsprechender Antibiotikum-Repressor ist.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9,
wobei eine Kombination aus dem Sensormolekül und dem Analyten ausgewählt ist aus der Liste von Kombinationen bestehend aus
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Bindungseinheit ein erstes Protein ist,
wobei das erste Protein auf dem Sensor immobilisiert ist,
wobei das Sensormolekül ein zweites Protein ist, und
wobei eine Kombination aus dem ersten Protein, dem zweiten Protein und dem Analyten ausgewählt ist aus der Liste von Kombinationen bestehend aus
Erstes Protein Zweites Protein Analyt
GyrB (Gyrase GyrB Coumarin -Antibiotika Untereinheit B)
FKBP (FK-bindendes FRB Rapamycin, FK506 und
Protein) (Domäne von Derivate davon (z.B.
FRAP) Rapaloga, mTOR- Inhibitoren)
FM (F36M mutant of FM Rapamycin, FK506 und
FKBP) Derivate davon (z.B.
Rapaloga, mTOR- Inhibitoren)
FKBP FKBP Rapamycin, FK506 und
Derivate davon (z.B.
Rapalogs, mTOR- Inhibitoren)
FKBP Cyp (Cyclophilin) Rapamycin, FK506 und
Derivate davon (z.B.
Rapalogs, mTOR- Inhibitoren),
Cyclosporine
Cyp Cyp Cyclosporine und
Derivate davon
ToxT (aus V. ToxT Virstatin
cholerae)
DHFR (Dihydrofolat- DHFR Methotrexat und
reduktase) Derivate davon
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Bindungseinheit ein immobilisierter Analyt ist, wobei das Sensormolekül ein Protein ist, und
wobei eine Kombination aus dem immobilisierten Analyten und dem Protein ausgewählt ist aus der Liste von Kombinationen bestehend aus
Figure imgf000062_0001
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Bindungseinheit eine erste Nukleinsäure ist,
wobei das Sensormolekül eine zweite Nukleinsäure ist,
wobei die zweite Nukleinsäure derart ausgeführt ist, dass sie über
Basenpaarung an die erste Nukleinsäure bindet,
wobei der Analyt eine dritte Nukleinsäure ist, und
wobei die dritte Nukleinsäure derart ausgeführt ist, dass sie über
Basenpaarung an die erste oder an die zweite Nukleinsäure bindet.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Bindungseinheit eine erste Nukleinsäure ist,
wobei das Sensormolekül eine zweite Nukleinsäure ist,
wobei die zweite Nukleinsäure derart ausgeführt ist, dass sie über Basenpaarung an die erste Nukleinsäure bindet, wobei der Analyt als Molekül, als niedermolekulare Verbindung, oder als Protein ausgeführt, und
wobei der Analyt derart ausgeführt ist, dass er an die erste Nukleinsäure oder an die zweite Nukleinsäure bindet.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei das Sensormolekül ein enzymatisch spaltbarer Linker ist, der an den Sensor gebunden ist,
wobei an den Linker ein Protein oder ein anderes Molekül gebunden ist, wobei die Bindungseinheit als der Linker mit dem daran gebundenen Protein oder dem daran gebundenen Molekül ausgeführt ist,
wobei der Analyt ein hydrolytisches Enzym ist, und
wobei das hydrolytische Enzym bei Zusammenführung mit dem Sensor und mit dem daran gebundenen Linker den Linker spezifisch spaltet, so dass ein Teil des Linkers mit dem Protein von dem Sensor losgelöst wird.
17. Verfahren zur Herstellung eines Sensors zum Nachweis von
Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, das Herstellungsverfahren aufweisend die Schritte:
Bereitstellen eines strukturierten Substrates (MSI), das als Silizium Wafer ausgeführt ist, durch Aufbringen einer Siliziumoxidschicht auf den Silizium Wafer und durch Verwenden von Photolack und ultraviolettem Licht zur Herstellung von parallelen, rechtwinkligen Streifen (1700) aus Photolack,
Bereitstellen von Wänden eines Halbleiters durch Abscheiden des
Halbleiters auf dem strukturierten Substrat (MS2), Ausführen eines reaktiven Ionen- Ätzens (RIE), so dass anisotrop auf einer Oberseite der Streifen (1700) und auf einem Boden des Substrates der Halbleiter weggeätzt wird, so dass nur der Halbleiter an Seitenwänden des Photolacks stehenbleibt, und durch Durchführen eines Sauerstoffplasmaprozesses, wodurch die Streifen (1700) aus Photolack entfernt werden und wodurch freistehende Halbleiter- Wände erhalten werden,
derart, dass die Wände einen rechteckigen, quadratischen, dreieckigen oder trapezförmigen Querschnitt aufweisen,
wobei die Wände eine Länge L, eine Dicke D und eine Höhe H aufweisen, wobei für die Wände die Relation D < H < L oder die Relation D > H < L gilt,
das Herstellungsverfahren weiterhin aufweisend die Schritte
Abscheiden einer Zusatzschicht über die bereitgestellten Wände des Halbleiters, und
Aufbringen eines ersten metallischen Kontakts und eines zweiten metallischen Kontakts an der Wand wodurch eine Transistor Struktur bereitgestellt wird (MS3).
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, weiterhin aufweisend die Schritte:
Bereitstellen einer Bindungseinheit und/oder eines Sensormoleküls, und Immobilisieren der Bindungseinheit und/oder des Sensormoleküls an der
Wand,
wobei die Bindungseinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus doppelsträngigem Oligonukleotid, einem ersten Protein, und einem immobilisierten Analyt,
wobei das erste Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GyrB (Gyrase Untereinheit B), FKBP (FK-bindendes Protein), FM (F36M Mutante von FKBP), FKBP, Cyp, ToxT (aus V. cholerae), DHFR
(Dihydrofolatreduktase), und
wobei der immobilisierter Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Coumarin-Antibiotika, Rapamycin, FK506, FK506- Derivaten, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclosporinen, Closporin, Closporin-Derivaten, Ascomycinen, Antifolat, Biotin, Steroidhormonen und Analoga, Virstatin, Methotrexat und Methotrexatderivaten.
19. Sensor (200) zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten (300) in einer Probe auf Basis einer Detektion einer Änderung einer elektrischen Leitfähigkeit des Sensors, wobei der Sensor gemäß einem
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18 herstellbar ist.
20. Verwendung eines Sensors gemäß Anspruch 19 zum Nachweis von Änderungen in Molekülinteraktionen mittels eines Analyten, wobei der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ein Antibiotikum, einer
niedermolekularen Verbindung in der Probe, Coumarin-Antibiotika, mTOR- Inhibitoren, Cyclospormen, Ascomycinen, Antifolat, Biotin, Steroidhormonen und Analoga, Virstatin, Coumarin-Antibiotika, Rapamcin, FK506 und Derivate davon, Rapaloga, mTOR-Inhibitoren, Cyclospormen, Cyclosporin-Derivaten, Methotrexat, und Methotrexatderivaten.
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