JPH10508466A - Ｃｄｒを移植された▲ｉｉｉ▼型抗ｃｅａヒト化マウスモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 異種抗体のフレームワーク領域に移植された親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の相補性決定領域を有するヒト化モノクローナル抗体であって、このヒト化抗体が親マウスモノクローナル抗体の結合特異性は保持するものの、異種宿主においてそれよりも免疫原性が小さいヒト化モノクローナル抗体。好ましいマウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体はＭＮ１４抗体であり、好ましい異種抗体はヒトに由来するものである。このヒト化モノクローナル抗体を産生するＤＮＡ構築物及びベクター、並びにそれを用いる診断用及び治療用複合体も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤＲを移植されたIII型抗ＣＥＡヒト化マウスモノクローナル抗体 発明の背景 本発明は、結腸及び他のガンの診断及び治療用の免疫学的試薬に関する。特に 、本発明は、対応するマウス抗ガン胎児性抗原（「ＣＥＡ」）モノクローナル抗 体（「ｍＡｂ」）（ＭＮ１４）の結合親和特性並びにヒト抗体の抗原性及びエフ ェクター特性を有するヒト化抗ＣＥＡモノクローナル抗体に関する。さらに、本 発明は、抗ＣＥＡマウスｍＡｂの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）がヒト抗体のフ レームワーク領域に移植されているヒト化ｍＡｂ、そのようなＣＤＲを移植され た抗体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを増殖させ、発現させるためのベクター 及び形質転換宿主、並びに診断及び治療用途に有用な抗体の複合体に関する。 ガンの診断及び治療への有望なアプローチは、診断及び治療作用物質を悪性腫 瘍に直接搬送するターゲッティング抗体の使用を包含する。過去１０年にわたっ て、様々な腫瘍特異的抗体及び抗体断片が、これらの抗体を薬物、毒素、放射性 核種もしくは他の作用物質に複合する方法、及びこれらの複合体を患者に投与す る方法と同様に、開発されている。これらの努力は多大な進歩をもたらしている が、様々のほとんど予期し得ない問題が、ある程度まで開発されている試薬の幾 つかの診断上及び治療上の実用性を制限している。 その中で、最も扱いにくい問題は、ターゲッティング複合体に外来抗原として 応答し得る、ヒト免疫系自体によって引き起こされるものである。すなわち、（ ヒトに最も普通に用いられているターゲッティング抗体である）マウスモノクロ ーナル抗体と複合体を形成している薬物又は放射性核種で処置された患者は、体 内を循環しているヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びその複合体の抗体部分に 対する一般化された即時型III型過敏性反応を発現する。さらに、副作用が最小 である場合（例えば、単一の投与における場合）でさえ、循環ＨＡＭＡは患者に おけるターゲッティング作用物質の有効濃度を低下させ、したがって、診断又は 治療作用物質が標的部位に到達するのを制限する。 この問題を克服又は回避するため、幾つかのアプローチが開発されているが、 限られた成功しか収めていない。戦略の１つは、ターゲッティング抗体を化学的 に修飾してその抗原性を抑制することである。例えば、ターゲッティング抗体へ のポリエチレングリコールの複合（ＰＥＧ化）が、抗体の抗原性を低下させるこ とが報告されている。別のアプローチは、抗体における抗原性の部位を特徴付け た後、それを除去することである。この手法においては、ＩｇＧ全体の代わりに 、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂及び他の抗体断片が用いられている。加えて、血液か らＨＡＭＡを血漿交換で除去することによりＨＡＭＡの副作用を低下させる試み がなされている。また、外来抗体の副作用を十分に低下させてターゲッティング 作用物質での複数の治療を可能にするのに、免疫抑制技術も用いられている。 これらのアプローチで完全に満足に改善するものはない。ターゲッティング抗 体及び抗体複合体に対する不利な免疫応答を減少または取り除く手段が、これら の診断及び治療作用物質の完全な利益を得るために、依然として要求されている 。 この目標は、以下に説明されるＣＤＲを移植されたヒト化マウス抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂで達成される。 発明の要約 本発明の目的は、マウスクラスIII抗ＣＥＡ ｍＡｂ（ＭＮ１４）のＣＤＲが ヒト抗体又は抗体断片のアミノ酸配列に機能的に移植されたヒト化クラスIII抗 ＣＥＡ ｍＡｂを提供し、マウスクラスIII、抗ＣＥＡ ｍＡｂの抗ＣＥＡ結合 特性及びヒト患者におけるヒトｍＡｂの免疫原性を有する免疫学的試薬を提供す ることにある。 本発明の別の目的は、このような抗体をコードするＤＮＡ構築体を提供するこ とにある。これに関する具体的な目的は、細胞培養及び抗体産生における有利な 特性を有する、改良された抗体及びその抗体をコードするＤＮＡを生成する遺伝 子操作を容易にする基質ＤＮＡである。 本発明のさらに別の目的は、このＤＮＡを増殖させ、かつこの抗体を発現させ るためのベクターを提供することにある。これに関連する本発明の目的は、保存 、増殖、抗体産生及び治療用途のための、ベクターを有する細胞を提供すること にある。 本発明のさらに別の目的は、診断及び治療において用いられる、抗体を含有す る組成物を提供することにある。これに関しては、とりわけ、ex vivo及びin vi voにおける造影、診断、予後及び治療のための、造影剤及び治療剤と複合体を形 成する抗体を含む複合体を提供することが目的である。 前述の目的の達成において、本発明の一側面に従い、異種（ヒト）抗体のフレ ームワーク領域に移植されたマウスクラスIII、抗ＣＥＡ ｍＡｂ（ＭＮ１４） のＣＤＲを含むヒト化マウスｍＡｂであって、このようにヒト化されたｍＡｂ抗 体がクラスIII、抗ＣＥＡ結合特異性は保持するものの、患者において親ＭＮ１ ４マウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さいヒト化マウスｍＡｂが提供 される。 特に好ましい態様においては、このヒト化抗体の軽鎖可変領域は下記式で特徴 付けられる。 ＦＲ_L1−ＣＤＲ_L1−ＦＲ_L2−ＣＤＲ_L2−ＦＲ_L3−ＣＤＲ_L3−ＦＲ_L4 ここで、ＦＲの各々は個別にヒト抗体のフレームワーク領域であり、かつＣＤＲ の各々は個別にＭＮ１４の軽鎖の相補性決定領域にあり、及び下付文字は軽（「 Ｌ」）鎖領域を指す。 重鎖可変領域は下記式で特徴付けられる。 ＦＲ_H1−ＣＤＲ_H1−ＦＲ_H2−ＣＤＲ_H2−ＦＲ_H3−ＣＤＲ_H3−ＦＲ_H4 ここで、ＦＲ及びＣＤＲは上と同じ意味を有し、かつ下付文字「Ｈ」は重鎖領域 を指す。） 態様の１つにおいて、ＣＤＲ_L1はアミノ酸配列 ＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶＡ（ 配列番号２０）を有し、ＣＤＲ_L2はアミノ酸配列 ＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号 ２１）を有し、ＣＤＲ_L3はアミノ酸配列 ＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２） を有し、ＣＤＲ_H1はアミノ酸配列 ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を有し、ＣＤＲ_H2 はアミノ酸配列 ＥＩＨＰ ＤＳＳＴＩ ＮＹＡＰＳ ＬＫＤ（配列番号２４ ）を有し、ＣＤＲ_H3はアミノ酸配列 ＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５） を有する。 他の態様において、ＦＲ_L1はアミノ酸配列 ＤＩＱＬＴ ＱＳＰＳＳ ＬＳＡ ＳＶ ＧＤＲＶＴ ＩＴＣ（配列番号２６）を有し、ＦＲ_L2はアミノ酸配列 Ｗ ＹＱＱＫ ＰＧＫＡＰ ＫＬＬＩＹ（配列番号２７）を有し、ＦＲ_L3はアミノ酸 配列 ＧＶＰ（Ｓ又はＤ）Ｆ ＳＧＳ（Ｇ又はＶ）Ｓ ＧＴＤＦＴ ＦＴＩＳＳ ＬＱＰＥＤ ＩＡＴＹＹ Ｖ（配列番号２８）を有し、ＦＲ_L4はアミノ酸配列 ＦＧＱＧＴ ＫＶＩＥＫ（配列番号２９）を有し、ＦＲ_H1はアミノ酸配列 Ｅ ＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＳＳ ＧＦＤＦＴ（配 列番号３０）、ＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＡＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３１）又はＱＶＱＬＱ ＥＳＧＰＧ ＬＶＲＰＳ ＱＴ ＬＳＬ ＴＣＴＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３２）を有し、ＦＲ_H2はアミノ酸配 列 ＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＶＡ（配列番号３３）、ＷＶＲＱＡ ＰＧＫ ＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３４）、又はＷＶＲＱＰ ＰＧＲＧＬ ＥＷＩＡ（配 列番号３５）を有し、ＦＲ_H3はアミノ酸配列 ＲＦＴＩＳ ＲＤＮＳＫ ＮＴＬ ＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３６）、ＲＦＴＩ Ｓ ＲＤＮＡＫ ＮＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配 列番号３７）、又はＲＶＴＭＬ ＲＤＴＳＫ ＮＧＳＦＬ ＲＬＳＳＶ ＴＡＡ ＤＴ ＡＶＹＹＣ ＡＳ（配列番号３８）を有し、ＦＲ_H4はアミノ酸配列 ＷＧ ＱＧＴ ＰＶＴＶＳ Ｓ（配列番号３９）、又はＷＧＱＧＴ ＴＶＴＶＳ Ｓ（ 配列番号４０）を有し、以上において、Ｃはスルフィドリル又はジスルフィドの 形であってもよい。 別の好ましい態様は、クラスIII、抗ＣＥＡヒト化ｍＡｂと複合体を形成する 診断又は治療剤を包含する。ここで、このクラスIII、抗ＣＥＡヒト化ｍＡｂに おいて、この抗体のＣＤＲはＭＮ１４マウスｍＡｂのＣＤＲに由来し、ＦＲは異 種（ヒト）抗体のＦＲに由来し、この複合体はＭＮ１４のクラスIII、抗ＣＥＡ 結合特異性を保持するものの、ヒトにおいてマウスＭＮ１４よりも免疫原性が小 さい。そのような態様の１つにおいては、その軽鎖及び重鎖可変領域は上に示さ れる通りに特徴付けられ、かつ同様に上に説明されるアミノ酸配列を有する。 さらに別の好ましい態様において、患者の診断又は治療方法が、前述の好まし い態様の複合体を適当な投与計画の下に投与するステップを含む。 別の好ましい態様は、上述のヒト化抗体の軽鎖、重鎖またはその両鎖をコード する単離精製ＤＮＡを含む。 別の好ましい態様は、上述のＣＤＲ及びＦＲのＤＮＡ配列を含む。 本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の請求の範囲 から明らかとなる。 用語の説明 本出願においては、以下の用語又は略語が用いられる。この用語集に記される 意味は、説明のためのみである。これらの用語の完全な意味は、当該技術分野の 熟練者には明らかである。 「ＣＤＲ」は、相補性決定領域に対する略語として用いられる。これらは、主 として、しかしながら他の可能性を除くわけではないが、抗原抗体結合の原因で ある、抗体の可変領域内の領域である。 「ＦＲ」は、フレームワーク領域に対する略語である。広く言えば、これらは 、抗体の可変領域の、ＣＤＲに隣接し、もしくは並列する部分である。一般には 、これらの領域は、その可変領域の立体配座に影響を与え、そのフレームワーク 領域が抗体と抗原との相互作用に影響を及ぼし得るにもかかわらず、抗体への抗 原の特異的結合の直接の原因とはほとんどならない多くの構造上の機能を有する 。 「キメラ」は、その可変領域がマウス抗体に由来し、その定常領域が異種（別 ）の種の抗体に由来する抗体を指す。 「ヒト化」は、上に定義されるキメラ抗体ではあるが、ＦＲ可変領域がヒト抗 体に由来するものを指す。 「ＨＡＨＡ」は、ヒト化マウス抗体に対するヒト抗体を指す。 「ＣＥＡ」は、内胚葉起源の消化器系上皮のほとんどのアデノカルシノーマ並 びに乳ガン及び非小細胞肺ガンのような他のガンにおいて発現する１８０ｋＤａ 糖タンパク質であるガン胎児性抗原を指す。 接頭辞としての「ｈ」という文字は、「ヒト化」を意味する。 他の略語は、Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3rd ed. Mosby Year Book Europe L td. (1993)に従って用いられる。この文献は、引用することにより本明細書にそ のまま組込まれる。 本明細書の開示において用いられるこれらの用語及び他の用語は、本発明が属 する技術分野において通常用いられるものと同じ意味で用いられる。 図面の簡単な説明 図１（配列番号１及び配列番号２）は、マウスＮＥＷＭ ＭＮ１４可変領域重 鎖（「ＶＨ」）のコンセンサスＤＮＡ配列及びそのタンパク質翻訳産物を示す。 ＣＤＲはボックスで囲まれている。 図２（配列番号３及び配列番号４）は、マウスＭＮ１４可変領域軽鎖（「ＶＫ 」） のコンセンサスＤＮＡ配列及びそのタンパク質翻訳産物を示す。ＣＤＲはボック スで囲まれている。 図３は、キメラもしくはヒト化ＭＮ１４の重鎖遺伝子の発現のためのベクター を示す。この模式図は、キメラ及び再構成重鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の 両者並びにｐＳＶｇｐｔ発現ベクターを示す。「キメラ」と表示されている最初 の図は、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡに連結したＭＮ１４マウスＶ Ｈ領域をコードするＤＮＡを示すマップである。このＭＮ１４ ＶＨ領域におい て、３つの黒い領域により３つのＣＤＲが示されている。ＦＲは、４つの点で埋 めた領域で示されている。「再構成」と表示されている真中の図は、マウスＦＲ が、「ヒト」ＶＨ領域で４つの白抜き領域によって示されるヒトＦＲで置換され ているＭＮ１４ ＶＨ領域のヒト化を示す。下方に示される発現ベクターｐＳＶ ｇｐｔの円形マップは、Ｉｇｈエンハンサー要素のすぐ下流の、再構成ＭＮ１４ 抗体遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位を示す。また、このマップは 、増殖のための大腸菌における複製起点（ｃｏｌＥｌ ｏｒｉ）及び哺乳動物細 胞における複製起点（ＳＶ４０プロモーター領域）、並びにこのベクターで形質 転換されている細菌を培養するための選択マーカー（Ａｐ^r）及び哺乳動物細胞 を培養するための選択マーカー（ｇｐｔ）をコードする遺伝子を含むこのベクタ ー内の重要な機能的ドメインの幾つかも示す。この場合の抗体遺伝子の発現は、 この抗体遺伝子のマップでＨｉｎｄＩＩＩ部位の近傍に黒塗りの丸で示されるＩ ｇプロモーターを介在する。 図４は、キメラもしくはヒト化ＭＮ１４κ鎖遺伝子の発現のためのベクターを 示す。この図は、キメラ及び再構成ＭＮ１４κ軽鎖遺伝子及びｐＳＶｈｙｇ発現 ベクターを示す。「キメラ」と表示される最初の図は、ヒトκ定常（「ＣＫ」） 領域をコードするＤＮＡに結合するＭＮ１４マウスκ軽鎖可変領域領域（「ＶＫ 」）をコードするＤＮＡを示すマップである。このマウスＶＫ領域において、３ つの ＣＤＲが３つの黒い領域で示され、ＦＲが４つの点で埋められている領域で示さ れている。「再構成」と表示される真中の図は、マウスＦＲが、「ヒト」ＶＫ領 域において４つの白抜きの領域で示されるヒトＦＲで置換されているＭＮ１４ ＶＫ領域のヒト化を示す。最後の発現ベクターｐＳＶｈｙｇの円形マップは、Ｉ ｇｈエンハンサー要素のすぐ下流の再構成ＭＮ１４抗体遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ ／ＢａｍＨＩ挿入部位を示す。このマップは、大腸菌増殖のための複製起点（ｃ ｏｌ Ｅｌ ｏｒｉ）及び哺乳動物細胞の増殖のための複製起点（ＳＶ４０プロ モーター領域）、並びにこのベクターで形質転換されている細菌を培養するため の選択マーカー（Ａｐ^r）及び哺乳動物細胞を培養するための選択マーカー（ｇ ｐｔ）をコードする遺伝子を含むこのベクター内の重要な機能的ドメインの幾つ かも示す。この場合の抗体遺伝子の発現には、この抗体遺伝子のマップのＨｉｎ ｄＩＩＩ部位の近傍で黒塗りの丸で図示されるＩｇプロモーターが介在する。 図５は、マウスＭＮ１４可変領域（配列番号２及び配列番号４）の配列を、ヒ ト可変領域ＮＥＷＭ ＶＨ（配列番号５）及びＲＥＩ ＶＫ（配列番号６）と共 に（図５Ａ）、並びにヒトＫＯＬ ＶＨ領域（配列番号７）と共に（図５Ｂ）示 す。ＣＤＲはボックスで囲まれ、このヒト化ＶＨに組込まれているマウスＶＨ ＦＲは、Kabat、et al.SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,U.S. Government Printing Office,Washington,D.C.,1987のナンバリング・システム に従ってそれらの位置が印付けられている。ＫＬＨｕＶＨに含まれていたＣＤＲ 外のマウスの残基は、黒丸で示されている。 図６は、マウスＭＮ１４ ＶＨフレームワーク領域（ＦＲ）（配列番号２）と ヒト化ＭＮ１４ ＶＨフレームワーク領域（配列番号５、８〜１１、７及び１２ 〜１５）との間のアミノ酸配列の比較を示す。マウスと異なるヒトＦＲ残基のみ が示されている。また、ＮＥＷＭ及びＫＯＬのＣＤＡも示されていない。それぞ れのＦＲにおけるアミノ酸置換の領域が太字で強調され、その置換の位置がＫａ ｂａｔらのナンバリング・システムに従って示されている。３番目のＣＤＲが、 ボックスで囲まれている。 図７は、ＭＮ１４ ＨｕＶＨ領域のＤＮＡ配列とそれに対応するアミノ酸配列 （配列番号１６及び配列番号１７）を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。 図８は、ＭＮ１４ ＨｕＶＫ領域のＤＮＡ配列とそれに対応するアミノ酸配列 （配列番号１８及び配列番号１９）を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。 図９は、（−○−）ＫＬＨｕＶＨ／ＨｕＶＫ、（−■−）ＫＬＨｕＶＨＡＩＧ ／ＨｕＶＫ、（−●−）ＫＬＨｕＶＫＡＩＧＡＹ／ＨｕＶＫ、（−□−）ＫＬＨ ｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫ、（−▲−）キメラ対照、及び（−△−）マウス対照 を含むＫＬＨｕＶＨ変異体の相対結合親和性を比較する、ＭＮ１４の遮断（すな わち、競合）検定のグラフである。 図１０は、ｈＭＮ１４を（ＦＲ１領域でグリコシル化されている）ＨＭＮ１４ −ＮＶＴと比較する、ＭＮ１４遮断検定を示す。 図１１は、結腸ガン患者に¹³¹Ｉ標識ｈＭＮ１４ＩｇＧ（左パネル）又はｍＭ Ｎ１４ＩｇＧ（右パネル）を投与した後の、その患者の腹部のラジオオートグラ ムである。 発明の詳細な説明 過去に、ＭＮ１４のＣＥＡ結合特性を有する有効な非ＨＡＭＡ誘発性の抗ＣＥ Ａ抗体を開発することには失敗しているが、ＭＮ１４ ｍＡｂのＣＤＲをヒト抗 体のＦＲに移植して、ＨＡＭＡの誘発が低下され、かつエフェクター活性が増大 されていながら、ＭＮ１４の抗ＣＥＡ ｍＡｂの抗原結合特性を有する抗体及び 抗体誘導試薬を得ることが可能であることが見出されている。 マウス抗ＣＥＡのＩｇＧ１モノクローナル抗体ＭＮ１４、及びその生成は、以 前に説明されている。Hansen et al., Cancer, 71:3478 (1993)、Primus et al. , 米国特許第4,818,709号を参照。ＭＮ１４はクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナ ル抗 体の基準の全てを満たし、ＥＩＡで胎便と非反応性であり、かつ通常の組織とは 反応しない。 遮断解析は、Hansen et al.，1993 上記、Losman et al., Int. Cancer，56:5 80(1994)、Hansen et al.，Clin. Chem.，35:146(1989)に従って行う。ＣＥＡの 定量にこれらの参考文献に記述されるものと同じ条件を用いて、標識ＭＮ１４プ ローブに対するヒト化ＭＮ１４の結合を評価することができる。典型的なプロー ブは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に複合しているＭＮ１４ である。標識及び非標識ＭＮ１４の両者を、マイクロタイタープレートのウェル のような固体支持体に固定されているＣＥＡ試料に加える。ＣＥＡに対する標識 ＭＮ１４の結合の「遮断」の程度は、非標識ＭＮ１４の活性の直接の反映である 。標準ＭＮ１４を用いて、ヒト化ＭＮ１４又はそれらの誘導体の未知試料の相対 活性を決定することができる。典型的には、この反応はマイクロタイタープレー トのウェルにおいて行われる。例えば２５μｇ／ウェルのレベルでこのウェルを ＣＥＡで直接満たされ、又は間接的に満たされる。間接的に満たされる場合には 、ＣＥＡと反応はするがＭＮ１４が相互作用するものとは異なるエピトープに反 応する抗体が予め満たされている。このような抗体は、ＭＮ１５ ｍＡｂであっ てもよい。その後、ＣＥＡを間接的にそのウェルに固定することができる。次に 、そのような満たされたプレートを用いて、競合結合ＥＩＡ検定を行うことがで きる。 前述のＨＲＰ標識ｍＡｂの代わりに、抗体を、通常、例えば¹³¹Ｉを用いて、 クロラミンＴ法により、約１０ｍＣｉ／μｇの比活性まで放射ヨウ素化すること が可能であり、遊離した放射性同位体はアクリルアミドゲルカラムでのクロマト グラフィーにより除去する（上記Hansen et al.，1993を参照）。 本明細書に説明される発明の実施に適切な分子生物学上の技術も、当該技術分 野における熟練者には公知である。適切な技術は、とりわけ、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Labo ratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), PROTOCOLS IN MOLECULAR BI OLOGY, Ausubel et al.，Eds.，Green Publishing Associates and Wiley-Inter science, John Wiley and Sons, New York(1987, 1988, 1989)（これらは、引用 することにより、本明細書に補遺を含むそれら全体を組込むものとする）を含む 多くのマニュアルや主要な刊行物に記述されている。 本明細書に開示されるＭＮ１４軽鎖及び重鎖ＣＤＲ及び修飾したＭＮ１４のＣ ＤＲは、上記参考文献に記述されているもののような公知の組換え技術を用いて 、他の抗体に組込むことができる。 この目的に適切な具体的な方法は、下記例に示されている。本明細書に説明さ れるアミノ酸配列に基づいて、ＭＮ１４のＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチ ドを合成することができる。本明細書に説明されるアミノ酸配列を正確にコード するものに加えて、修飾ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを作製すること もできる。また、このオリゴヌクレオチドは、ＭＮ１４のＣＤＲのものに加えて 、例えばクローニングを容易にするヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌ クレオチドの合成技術は公知であり、多くの製造者から入手可能な自動装置で行 うことができる。さらに、あらゆる特定の配列のオリゴヌクレオチドを購入する ことができる。 ＭＮ１４のＣＤＲ及び／又は特定のＦＲ残基をコードするオリゴヌクレオチド 又はそれらの相補鎖に相当するオリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド の末端、一般的には１２ヌクレオチドがテンプレートＤＮＡに完全にアニーリン グするように設計されているという条件の下で、部位指向性突然変異誘発による ＶＨ又はＶＫ ＤＮＡへのこれらの残基のコドンの導入に用いることができる。 このテンプレートＤＮＡは、典型的には、必須ＦＲをコードする可変領域ＤＮＡ を坦持するＭ１３ベクターに表される一本鎖ＤＮＡである。方法の１つにおいて 、 変異誘発性オリゴヌクレオチドをそれらの５’末端でリン酸化し、５’から可変 領域ＤＮＡへの伸長を誘発するオリゴヌクレオチドと一緒に、このｓｓＤＮＡテ ンプレートにアニーリングする。このオリゴヌクレオチドを、Ｔ７ポリメラーゼ 及びＴ４ＤＮＡリガーゼによって一緒に連結する断片を用いて伸長させ、可変領 域全体を包含する完全な変異鎖を得る。この変異鎖をテンプレートとして用い、 熱サイクル反応においてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて適切なプライマー からその相補鎖の複数のコピーを合成することができる。変異鎖がこのように選 択的に増幅されると、通常のＰＣＲにより、クローニング、配列決定及び発現の ためにＤＮＡを増幅することが可能である。 抗体をコードしている適切なＤＮＡが開示により本明細書に示されるが、事実 上、そのようなＤＮＡのあらゆるものが含まれる。様々なヒト抗体遺伝子が、公 的に利用可能な寄託の形態で利用することができる。抗体及び抗体をコードして いる遺伝子の多くの配列が公開されており、上述のように適切な抗体遺伝子をこ れらの配列から合成することができる。 本発明の範囲には、本明細書に説明されるＤＮＡ配列の対立遺伝子、変種及び 変異が含まれる。 本開示によるＣＤＲ移植は、確立されている技術を用いて行うことができる。 抗体産生細胞系は、熟練技術者に公知の技術を用いて選択し、かつ培養すること ができる。そのような技術は、様々な実験マニュアル及び主要な刊行物に記述さ れている。例えば、以下に記述されるような本発明での使用に適する技術は、CU RRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Coligan et al.，Eds., Green Publishing As sociates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991)に記 述されておる。この文献は引用することにより補遺を含むその全体が本明細書に 組込まれる。 ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞から、グアニジニウムイソチオシアネート 抽出及び沈殿と、それに続く遠心もしくはクロマトグラフィーのような標準技術 により、単離することができる。所望であれば、オリゴｄＴセルロースでのクロ マトグラフィーのような標準技術により、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離すること ができる。これらの目的に適する技術は、前述の参考文献に記述されるように、 当該技術分野において公知である。 抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、公知の方法に従って逆転写酵素 及びＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時に又は別々に作製することができる。こ れは、コンセンサス定常領域プライマーで、あるいは公開されている重鎖及び軽 鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーで開始することがで きる。 抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンの単離にＰＣＲを用いること もできる。この場合、コンセンサスプライマー、又はマウスコンセンサス領域プ ローブのようなより大きな同種プローブでライブラリーをスクリーニングするこ とが可能である。必要な技術は当該技術分野における熟練者に公知であり、前述 のSambrook及びAusubelの参考文献に説明されており、かつ以下に述べられる例 により説明される。 抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、ＣＤＲを単離する前に、あらゆ る適切な宿主のあらゆる適切なベクターにおいて増殖させることができる。以下 の例に説明されるように、このクローンは、しばしば、この目的のために、大腸 菌内で最も都合よく増殖される。しかしながら、熟練者に公知の他の様々なベク ター及び宿主細胞を本発明のこの側面において有利に用いることができる。その ようなベクターの様々なものが前述の参考文献に説明されている。 ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを、組換えＤＮＡ技術に関連する前述の 参考文献に詳細に説明されている標準の公知技術に従い、細胞から単離し、制限 地図を作製し、かつ配列決定することができる。 ベクターにより抗体重鎖及び軽鎖並びにそれらの断片をコードするＤＮＡを、 キメラ及びＣＤＲを移植したヒト化ＭＮ１４抗体の構築に用いることができる。 ＭＮ１４の抗ＣＥＡ ｍＡｂのＣＤＲが本明細書で同定され、説明され、かつ 図１及び図２（それぞれ、配列番号２及び配列番号４）に示されている。これら の配列を用いて、ＭＮ１４重鎖及び軽鎖のＣＤＲを本発明で用いるために合成す ることができる。天然資源からＭＮ１４のＣＤＲを再クローニングする必要はな い。そのＤＮＡ及びアミノ酸配列は本明細書に示されている。本発明のこの側面 に適するオリゴヌクレオチド合成技術は熟練技術者に公知であり、幾つかの市販 されている自動合成器のあらゆるものを用いて行うことができる。加えて、本明 細書に説明されるＣＤＲをコードするＤＮＡは、商業ＤＮＡ合成販売者のサービ スにより得ることができる。 本発明のこの側面によって合成されるポリヌクレオチドには、ＭＮ１４のＣＤ Ｒを構成するものに加えて、このＣＤＲに由来するものではないものも含まれ得 る。異種からのＦＲへのこのＣＤＲの結合を容易にするさらなる塩基を含んでい てもよい。この目的のために、制限部位又はオーバーラップした相補的な領域を 含むこともできる。短い重複一本鎖ＤＮＡからの長い二本鎖ＤＮＡの合成は当該 技術分野における熟練者に公知である。同様に、平滑末端ＤＮＡ及び少なくとも 部分的に重複する相補的な末端を有するものを含むＤＮＡの末端間結合は公知で ある。これらの技術は、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に説 明されている。 また、ＭＮ１４重鎖及び軽鎖のＣＤＲも、特にはキメラもしくはヒト化抗体に 組込んだ後に、クローニングしたＤＮＡ又はＲＮＡ、もしくは合成ＤＮＡ又はＲ ＮＡにおける塩基の削除、挿入及び変更を行うための公知の組換えＤＮＡ技術を 用いて、修飾することが可能である。この目的に適切な部位特異的突然変異誘発 技術は当該技術分野における熟練者に公知であり、組換えＤＮＡ技術に関する前 述の参考文献に説明されている。また、削除及び挿入技術も説明されている。こ れらの方法は、例えば、ＭＮ１４のＣＤＲをコードするポリヌクレオチド又はク ローニングした重鎖もしくは軽鎖遺伝子の他の領域への所望の変更の導入に用い ることができる。 本発明に従い、ＭＮ１４のＣＤＲ及び修飾ＭＮ１４のＣＤＲをＦＲのあらゆる セットに実用的に導入することができる。これに関して、ポリヌクレオチドをク ローニングし、操作する様々な公知の技術を効果的に使用できることを当該技術 分野における熟練者は予期するであろう。このような技術は、前述の組換えＤＮ Ａに関連する参考文献に説明される方法によって示されている。 本発明の特に好ましい態様において、ＭＮ１４のＣＤＲがヒト抗体に移植され る。この文脈において、ヒト抗体は、ヒト体内に生じるあらゆる抗体又は、幾つ かの点において、ヒト免疫系と適合し得るように設計されている加工抗体を指す ことは理解されるであろう。この目的のためには、広くは、患者において不利な 免疫応答を引き起こすことがない抗体が特に好ましい。より具体的には、「ヒト 抗体」という表現は、ヒト体内において実際に生じる遺伝子、又はそれらの対立 遺伝子、変種もしくは変異体によってコードされる抗体を意味することが意図さ れている。 いったんＭＮ１４に由来するＣＤＲを移植された抗体をコードするＤＮＡが、 ＭＮ１４のＶＨ及びＶＫ領域ＤＮＡ及び、それらにより形成されるヒト定常ドメ インの軽鎖及び重鎖の各々と結合する可変領域から構築されると、通常の技術に より、それを増殖及び発現のためのベクターに挿入することが可能である。この 方法で、所望の量の抗体を得ることができる。 このＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体は、造影化合物又は同位体と結合 するこのヒト化抗体又はそれらのＦａｂ’を被検体に投与することにより、造影 用途に用いることができる。 造影のためには、通常の方法を用いて、この抗体を標識に複合する。このよう な通常の方法には、１）抗体タンパク質又はそれらの断片の直接放射性ヨウ素化 又は２）抗体又はそれらの断片への金属性核種の直接付着（例えば、Hansen et al., Cancer, 73: 761(1994)を参照）が含まれるが、これらに限定されるもので はない。様々な診断用及び治療用金属の抗体又はそれらの断片への結合に用いる ことができる二官能性キレートの使用も本発明の範囲内にある(Antibodies in R adiodiagnosis and Therapy, ed. M. R. Zalutsky, 1989, CRC Press, Boca Rat on, FL、及びCancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, ed. D. M. Golde nberg, 1994, CRC Press, Boca Raton, FLを参照）。複合手順及び生成物の特徴 付けに続いて、ヒト患者において使用するための診断用組成物の生成に適する優 良製造規範(Good Manufacturing procedures、「ＧＭＰ」)に合致する条件下に おいて、十分に標識された複合体を均質に精製する。 ＭＮ１４のＣＤＲを移植された抗体及びこの複合体の造影剤部分との血清抗体 の反応は、複合体の投与の前に得られた対照血清の反応を含めて、その診断手順 の過程の全てにわたって決定することができる。同様の決定は、ＭＮ１４それ自 体の類似の複合体で処置されている他の患者においても行われる。これらの試験 によって検出される、ＣＤＲを移植されたＭＮ１４ヒト抗体と反応する血清抗体 は、マウスＭＮ１４含有複合体で処置されている患者において複合体の抗体部分 と反応する抗体ではほとんどあり得ない。 アミノデキストランに、及びホウ素に複合するヒト化ＭＮ１４抗体は、診断用 途に用いることができる。アミノデキストラン−ホウ素付加物に複合するための ＭＮ１４及びＣＤＲを移植されたＭＮ１４抗体は、上に説明されるように調製す ることができる。アミノデキストラン−ホウ素付加物は、適切なホウ素ケージ化 合物（例えば、アミノデキストラン官能基で適切に誘導形成されている１２−ホ ウ素炭酸塩）の反応により調製することができる。好ましい態様においては、ア ミノデキストランを過剰のハロアセチル酸エステル又は（無水ヨード酢酸のよう な）無水物と反応させ、それにより、通常、反応条件及びアミノデキストランの サイズに応じて１０〜１０００基の範囲をとる、所望の数のハロアセチル基を有 するアミノデキストランを生成させる。メルカプトカルボランＢ１２のような適 切なホウ素誘導体を、所望のモル過剰で、アルキル化反応により、ハロアセチル −アミノデキストランと反応させる。好ましい態様においては、ホウ素化ハロア セチルアミノデキストラン上の多数のハロアセチル基が未反応のまま残り、この 付加物をタンパク質のチオール基に付着させるための「ハンドル」として用いる ことが可能である。 ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体及びそれらの誘導体は、それらの免 疫原性の低下により、治療において、血清疾患もしくはアナフィラキーショック のような望まれない免疫反応を伴うことのない受動免疫、上述のような腫瘍の位 置測定及びin vivo造影、活性作用物質の局部濃度が重要な因子である疾患細胞 の特定の処置、例えば、細胞毒、免疫調節剤もしくは他の薬学的に活性な分子の 部位指向性送達等に有用であり、それらにより、これらのヒト化抗体の実用上の 用途が確立される。上述のように、in vivo造影のためには、ヒト化したＣＤＲ 移植ＭＮ１４モノクローナル抗体を放射性標識し、又は放射性核種、例えばヨウ 素、イットリウム、テクネチウム等と複合体を形成する金属キレート剤と複合さ せ、一次及び転移性ＣＥＡ腫瘍の検出に放射性走査技術を用いることができる。 この目的のため、この放射性抗体を、例えば静脈内に、注射し、ガンマ造影機を 用いて規則的な間隔で患者を走査する。ＣＥＡを発現する腫瘍は他の組織よりも 多くの放射性抗体を取り込み、造影カメラにより容易に認識される。¹³¹Ｉで標 識されているモノクローナル抗体が、優先的に、体重ｋｇ当り１５〜３０μＣｉ に相当する３〜１０μｇの量で用いられる。細胞障害作用物質を用いる治療のた めには、この抗体を、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、リシン Ａ、放射 性原子、毒性作用物質のような様々な既知の治療剤に複合させ、そのような複合 体を薬学的に許容し得る無菌担体中に処方し、その製剤を通常の手段により投与 する。治療上の投与量は、これらの技術分野における平均的な技量を有する利用 者により、通常通りに、容易に決定することができる。哺乳動物の治療用量は、 患者の状態及び投与様式に応じて、モノクローナル抗体自体については体重ｋｇ 当り約１ｍｇ〜５ｍｇ、細胞障害薬剤との複合体については体重ｋｇ当り０．１ ｍｇ〜５ｍｇである。あるいは、ＣＥＡが存在するガン細胞を被験者から除去す るために、このヒト化抗体を、宿主の免疫系の要素、例えば補体系もしくは細胞 介在応答と組み合わせて用いることができる。患者の免疫応答は、先行する方法 により監視することができる。放射性造影及び治療のためのさらなる手順につい ては、EP 0 323,806号、Hansen et al., Cancer 71: 3478-85(1993)、及び米国 特許第4,818,709号並びにそれらに含まれるを参考文献を参照のこと。これらの 全ては引用することにより本明細書に組込まれる。 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA， 1989に記述されるもののような非経口投与のための医薬調製品が好ましい。最終 調製品は、０．０１％〜５０％の活性成分を含有する。このような複合体の製造 方法及び診断及び治療におけるそれらの使用は、例えば、Shih et al., 米国特 許第5,057,313号、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832(1988)、同時継続中の 同一出願人による米国特許出願第08/162,912号、及びMcKearn et al., 米国特許 第5,156,840号に示されており、それらの内容は引用することにより本明細書に 組込まれる。 上述のように、治療のためには、ヒト化抗体複合体及び薬学的に許容し得る担 体を治療上有効な量で患者に投与する。投与される量が生理学的に意味のあるも のである場合、複合体と薬学的に許容し得る担体との組み合わせは、「治療上有 効な量」で投与されると言われる。ある作用物質が存在することで、投与される 患者の生理状態に検出可能な変化を生じる場合、その作用物質は「生理学的に意 味がある」。標的とされる治療剤は、等価の非標的作用物質を全身投与したとき に、それが投与された用量のより高い割合を目的の標的に送達し、その標的に付 着する場合、「治療上有効」である。 治療上有効であるためには、複合体及び担体は、他の治療剤と組み合わせるか 、又はより広範な治療投薬計画の一部として投与することが必要となることがあ る。現在、組み合わせ治療アプローチで用いられる場合に標的治療剤の効果がし ばしば大きく増大し得るという意見が医師らの間にはある。例えば、単独で用い られた場合重度の血液毒性を引き起こすＢ細胞リンパ腫の高用量の放射免疫治療 は、自己骨髄再注入と組み合わせて用いた場合、非常に効果的であることが示さ れている。Press et al., “Treatment of Relapsed B Cell Lymphomas with Hi gh Dose Radioimmunotherapy and Bone Marrow Transplantation”in CANCER TH ERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, ed. (CRC Press, Boca Rat on, 1994)ch. 17参照。別の例においては、腫瘍が予備照射されている場合、腫 瘍による放射標識抗体の取り込みの５倍の増強が観察される。Leichner et al. ，Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14: 1033(1987)参照。放射免疫治療の 臨床上の効力を改善する潜在力を有することが示されている機構が、DeNardo et al., “Overview of Obstacles and Opportunities for Radioimmunotherapy o f Cancer”in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Ed . (CRC Press, Boca Raton, 1994)ch. 11にも論じられている。用量制限副作用 の研究並びに標的の狙い付け、取り込み及び有益な副作用の増強及び増幅に加え て、そのような組み合わせプロトコルを開発する方法はこの分野における熟練臨 床技術者に公知であり、開発に過度の実験を必要としない。 診断及び治療剤とのヒト化ＭＮ１４の複合体を用いるin vivoでの実験は、動 物モデル及びヒト患者で実施されている（以下の例１１を参照）。ＣＤＲを移植 さ れたヒト化抗体複合体は、良好な治療上のプロフィールを示し、親であるＭＮ１ ４抗体複合体よりも長い治療投与計画で用いることが可能であった。ＣＤＲを移 植された抗体複合体は、対照マウス抗体複合体よりも治療効果が良好であり、有 害な副作用が少なかった。 例えば、誘導体形成の目的で、上記Shih et al.によって記述される方法を用 い、炭水化物ヒドロキシル基を用いて、この抗体をアミノデキストラン結合メト トレキセートと共有結合により複合体を形成させた。免疫活性に対する抗体炭水 化物基の寄与を決定するため、哺乳動物細胞において遮断遺伝子が発現する前に グリコシル化部位、ＮＶＴを導入するように、ｈＭＮ１４（接頭辞「ｈ」は「ヒ ト化」を意味することが意図されている）のＶＫ ＦＲ１領域の１８〜２０位に 変異を導入することができる。遮断細胞結合検定におけるｈＭＮ１４抗体と変異 ｈＭＮ１４−ＮＴＶとの比較（図８）は、１８位の炭水化物部分にはこのヒト化 抗体の免疫反応性に対する影響がないことを示している。 平均分子量４０ｋＤａのアミノデキストランをＮａＩＯ₄で酸化して（ヒドロ キシル基の酸化により）アルデヒドを形成する。反応条件及びタイミングを注意 深く制御することにより、アミノデキストランのモル当たり約５０〜１５０モル のアルデヒド基が導入される。次に、このアルデヒドを過剰の１，３−ジアミノ −２−ヒドロキシプロパンと反応させ、実質的に全てのアルデヒドとシッフ塩基 を形成させる。次いで、このシッフ塩基を過剰のＮａＢＨ₄で処理することによ り還元する。その後、このアミン誘導デキストランをゲル排除クロマトグラフィ ーにより精製する。 細胞障害性薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）は、ジメチルホルムアミド中で、 ジシクロカルボジアミドで処理し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応 させることにより活性化する。活性化されたＭＴＸを、水溶液中において、５０ ：１の比でアミノ誘導デキストランと混合する。この生成物から、精製後に、モ ル当たり約３５ＭＴＸモルを有するＭＴＸ誘導デキストランが得られる。このよ うに得られたＭＴＸ付加物を、前出のShih et al.に記述される方法を用いて、 ＭＮ１４のＣＤＲを移植された抗体に結合させる。例えば、抗体の炭水化物を酸 化し、得られたアルデヒドを付加物中のデキストランの残留アミンと反応させる 。それにより得られたシッフ塩基産物を、抗体の１０倍モル過剰のシアノホウ水 素化ナトリウムで処理することにより還元する。この還元抗体−デキストラン− ＭＴＸ産物を検定の前に完全に精製し、患者に投与するために処方する。 対照として、同じ方法で、親ＭＮ１４抗体をデキストラン−ＭＴＸに結合させ る。 このＣＤＲを移植された精製した抗体複合体は、ＣＥＡ産生ガンを有する患者 に投与することができる（上を参照）。この治療に対する副作用、特に患者の免 疫系が介在するものを含む応答を監視する。このＣＤＲを移植された抗体複合体 で治療した患者は、治療結果の改善、その作用物質に対する免疫応答の減少及び 治療の免疫介在有害作用の顕著な減少を示す。このＣＤＲを移植された抗体複合 体を用いる治療は、親マウスＭＮ１４抗体を用いるものより高い投与量で、かつ より長い期間行うことが可能であり、より積極的な治療と応答の改善を可能にす る。 本発明を、以下の説明のための例を参照することによりさらに説明する。ＭＮ −１４軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするＤＮＡクローンの単離に関する技術が、 産生細胞からのあらゆる抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子の単離に有用なクローニング 技術によって説明されることは、予期されるであろう。配列が開示されているの で、本発明を実施するためにＭＮ１４重鎖及び軽鎖遺伝子を再単離する必要はな い。 この詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい態様を示すものではある が、説明のためだけに示されるものであることは理解されるべきである。これは 、 本発明の精神及び範囲内にある様々な変更および変形が、以下の説明のための記 述から、当該技術分野における熟練者に明らかとなるためである。 例１ 抗体産生細胞の培養 上記Hansen et al. (1993)及び上記Primus et al. (1983)に従い、クラスIII 、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を産性するマウス／マウスハイブリドーマ細胞系 を確立した。 標準イソタイプ決定技術を用いて調整培地(conditioned medium)を試験するこ とにより、κＩｇＧ１の分泌について細胞を選択した。このための様々なキット が市販されている。これらの細胞を、上述の標準遮断検定を用いて調整培地を試 験することにより、抗体の産生についてスクリーニングした。この検定において 確認された産生細胞のストックを増殖させ、液体窒素中で凍結した。 例２ 産生細胞系からのＲＮＡの単離 ＭＮ１４産生細胞を培養で増殖させ、遠心によって集めて洗浄した。全ＲＮＡ を、このペレットの細胞から、Favaloro et al., Methods in Enzymology 65: 7 18(1980)及びOrlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 3833(1989)に 従って単離した。これらは、参照することにより組込まれる。 例３ ｃＤＮＡ合成及び重鎖可変領域の増幅 ＭＮ１４産生細胞からのｍＲＮＡを、以下に記述されるように、ｃＤＮＡ合成 の標準技術を用いるｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによるＤＮＡ増幅に用いた。一般に は、ＰＣＲに用いられるプライマーは、増幅産物のクローニングを容易にするた め、それらの５’末端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有していた。マウス ＩｇＧ₁重鎖の第１の定常領域ドメイン（「ＣＨ１」）をコードするＤＮＡのセ ン ス鎖の末端に相補的なオリゴヌクレオチドを、逆転写酵素による第１鎖ｃＤＮＡ 合成の誘発に用いた。このプライマーの配列、ＣＧ１ＦＯＲ、を表１に示す。下 記表１には、本明細書で用いられる他のオリゴヌクレオチド配列も示される。 クローニングを容易にするためにプライマーに組込まれている制限部位には下 線が付されている。 次に、重鎖（「ＶＨ」）ｃＤＮＡの可変領域を、上に引用されるOrlandi et a l. (1989)に記述されるように、ＰＣＲにより、同じプライマー、ＣＧ１ＦＯＲ 、及びＶＨ遺伝子の５’末端のコンセンサス配列に基づくプライマー（ＶＨ１Ｂ ＡＣＫ）を用いて増幅した。この反応のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に より分析した。これにより、エチジウムブロマイド染色及び蛍光照明で、期待通 り約４００ｂｐの１つの主要バンドが明らかになった。 第２のｃＤＮＡ調製品からの配列を確かめるため、ＰＣＲにおいてシグナル配 列プライマーを用いてＮ末端の真正アミノ酸の決定を可能にした。重鎖シグナル 配列コード領域に基づく分解オリゴヌクレオチドであるＳＨ１ＢＡＣＫ及びＳＨ ２ＢＡＣＫを、ＣＧ１ＦＯＲに関連する別々の反応に用いた。ＣＧ１ＦＯＲ、Ｓ Ｈ１ＢＡＣＫ増幅から拡散産物バンドが得られた。 この産物のＶＨ含量を増大させるため、これを低融点アガロースから切り出し 、ＳＨ１ＢＡＣＫ及び第４のフレームワーク領域コンセンサス配列に相補的なオ リゴヌクレオチド、ＶＨ１ＦＯＲ、を用いて増幅した。この反応の産物は、アガ ロースゲル電気泳動で分析した場合、別のバンドであった。 例４ ＰＣＲにより得られた、ＭＮ１４重鎖可変領域をコードする ＤＮＡのクローニング及び配列決定 ＣＧ１ＦＯＲ、ＶＨ１ＢＡＣＫプライマー対を用いて得られた増幅産物をＨｉ ｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで別々に消化した。これらの酵素の開裂部位はこれらの ＰＣＲプライマーに含まれる。このＶＨ内部にも部位があるのかどうかを決定す ることが好ましかった。この制限断片のアガロースゲル分析は、このＤＮＡの一 端に近接する内部ＰｓｔＩ部位の存在を示した。このＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩ Ｉ及びＰｓｔＩで消化し、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９にクローニングし て、それぞれのクローンの挿入断片（インサート）のＤＮＡ配列を決定した。大 部分のクローンが同じＶＨのＤＮＡの挿入断片を有していた。 この配列決定により、このさらなる予期せざるＰｓｔＩ部位の存在が確認され た。この部位は、ＶＨの最後の２つのアミノ酸を部分的にコードするＣＧ１ＦＯ Ｒプライマーの配列の３’末端に近接していた。この方法により幾つかの完全長 ＶＨクローンが得られたが、さらなるＰＣＲ産物ＤＮＡをＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断 片としてクローニングした。このため、これらのクローンは完全ＶＨ配列は有す るが、ＣＧ１ＦＯＲによって与えられる定常領域は有していなかった。ＶＫ１Ｂ ＡＣＫ、ＣＧ１ＦＯＲ産物から、合計１６の完全長クローンが得られた。これら の実験において、分析されたクローンの約２５％がＶＨ領域と無関係の挿入断片 を有していた。 第２のｃＤＮＡ調製品からのＶＨ配列を確認し、同時に、このＶＨのＮ末端に 対応する、プライマーが指定するものではない本当のＤＮＡ配列を得るため、Ｖ Ｈ１ＦＯＲ及びＳＨ１ＢＡＣＫプライマーからのＰＣＲ産物をクローニングした 。これらのプライマーは、上述のＣＧ１ＦＯＲ及びＶＨ１ＢＡＣＫのＰｓｔＩ及 びＨｉｎｄＩＩＩ部位ではなく、ＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を有する 。この反応のＰＣＲ産物を、ＢｓｔＥＩＩで消化し、このＢｓｔＥＩＩ末端を埋 め、ＥｃｏＲＩで消化し、このＥｃｏＲＩ及び平滑末端をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ ｄＩＩで消化されているベクターに連結することによりクローニングした。この クローニング断片の配列を決定した。このＶＨ断片の収量は比較的少なかった。 これは、おそらく、ＳＨ１ＢＡＣＫの縮重によって引き起こされるＰＣＲにおけ る特異性の欠如を反映している。しかしながら、配列決定された１８のクローン のうちの４つは、以前に配列決定されている通りのＭＮ１４のＶＨ領域をコード するＤＮＡを有していた。他の挿入断片はＶＨをコードしているＤＮＡ由来では なか った。 全部で、２０の完全長ＭＮ１４のＶＨクローンが得られた。これらのＭＮ１４ のＶＨ領域クローンにおける配列の中で、５つの一過性変異が観察された。これ らの変異は、増幅の間に、Ｔａｑポリメラーゼによる誤った取り込みの結果とし て導入されたもののようである。 例５ ＭＮ１４の重鎖可変領域のアミノ酸配列の分析 ＶＨのＤＮＡ配列から翻訳されたマウスＭＮ１４重鎖可変領域のアミノ酸配列 を図１に示す（配列番号１及び配列番号２）。この配列とマウスＶＨサブグルー プを表す配列との比較は、ＭＮ１４の重鎖可変領域がサブグループIIIＢ（Kabat et al. SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U. S. Governmen t Printing Office, 1987を参照）に属することを示した。 ＭＮ１４のＣＤＲの配列は、前出のKabat et al.(1987)によって報告されてい るいかなるものとも異なる。さらに、ＭＮ１４重鎖ＶＨフレームワーク領域の４ つの位置のアミノ酸が、他のサブグループIIIＢのＶＨ配列のフレームワーク領 域のものとは異なる。これらの４つの置換（Ｓｅｒ１４、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ９ ４及びＰｒｏ１０８）は、IIIＢ ＶＨサブグループ以外の他のマウスＶＨ領域 において観察されているが、Kabatの１０８位のプロリンが最も異例である。 ＶＨ又はＶＫにおけるあらゆる異例の残基は、マウスＭＮ１４の結合に有利で あることが立証されている体細胞変異を表すことがある。 例６ ｃＤＮＡ合成及びＭＮ１４ ＶＫをコードするＤＮＡの増幅 ＭＮ１４のκ軽鎖をコードするｃＤＮＡを、上述の重鎖の可変領域をコードす るｃＤＮＡと同様の方法でクローニングした。κ鎖ｃＤＮＡの第１鎖を合成する ための逆転写酵素を誘発するのに、幾つかのプライマーを用いた。プライマーの １つであるＣＫ２ＦＯＲの配列は、κ軽鎖遺伝子の定常領域（「ＣＫ」）の５’ 末端の配列から誘導した。他の２つのプライマー、ＶＫ１ＦＯＲ及びＶＫ３ＦＯ Ｒ、の配列は、κ軽鎖遺伝子の可変領域（「ＶＫ」）の３’末端の配列をベース とした。 第１鎖ＤＮＡ産物を、ＰＣＲにより、多くのプライマー対を用いて増幅した。 一方向への合成を第１鎖の作製に用いたプライマーにより誘発した。もう一方の 、「逆」方向への重合は、ＶＫ領域の５’末端の配列であるＶＫ１ＢＡＣＫ、Ｖ Ｋ２ＢＡＣＫ、ＶＫ３ＢＡＣＫ、ＶＫ４ＢＡＣＫ及びＶＫ８ＢＡＣＫ、又はシグ ナルペプチドの最後の４つのアミノ酸及び可変領域の最初の４つのアミノ酸をコ ードする配列であるＶＫ５ＢＡＣＫ、ＶＫ６ＢＡＣＫ及びＶＫ７ＢＡＣＫのいず れかに基づく配列を有する一連のκ軽鎖特異的プライマーで開始した。加えて、 ＣＫ２ＦＯＲで誘発したｃＤＮＡも、ＶＫ１ＦＯＲ及びＶＫ８ＢＡＣＫを用いて 増幅した。 これらの増幅産物を、上記の例に記述されている方法で、ゲル電気泳動により 分析した。ＶＫ１ＢＡＣＫ、ＶＫ３ＢＡＣＫ、ＶＫ５ＢＡＣＫ、ＶＫ７ＢＡＣＫ 及びＶＫ８ＢＡＣＫで誘発する反応からの生成物が、期待通りの３５０ｂｐのバ ンドを生じた。 例７ ＰＣＲによって得られたＭＮ１４κ軽鎖可変領域のクローニング及び配列決定 選択されたＰＣＲ産物を、上記例４においてＶＨについて説明されているのと 同様の様式で増幅プライマーに含まれる制限部位を用いて、Ｍ１３ｍｐ１８及び Ｍ１３ｍｐ１９にクローニングした。ヌクレオチド配列決定により、大部分の挿 入断片がＶＫ関連ではなかったことが明らかとなった。これは、ＶＫのｃＤＮＡ のクローニングを試みる場合、異例のことではなく、ＶＨ特異的プライマーより もＶＫ特異的プライマーを設計することが困難であるように思われる。 ＶＫ１ＦＯＲ／ＶＫ８ＢＡＣＫの組み合わせからＶＫのｃＤＮＡ挿入断片が得 られたが、ＣＤＲ_L3をコードするｃＤＮＡ内でのフレームシフト及び２３位に不 変Ｃｙｓが存在しないことにより、これは機能的なＶＫを生じなかった。このＶ ＫのｃＤＮＡは他のハイブリドーマから単離されており、これはＳｐ２／０融合 パートナーに由来する。ＣＫ２／ＶＫ１ＢＡＣＫ産物は、この場合フレームワー ク４の保存残基を欠く、さらなる４つの異なる異常ＶＫ ｃＤＮＡ挿入断片を生 じた。このプライマー対を用いて得られた５０のＶＫ挿入断片は、明らかにこの プライマーのミスマッチが誘発するずれによる現象であるＶＫ１ＢＡＣＫの３’ 末端でのフレーム移動を除いて、機能的ＶＫのものであった。この問題は、ＶＫ 遺伝子までは伸長しないＶＫ８ＢＡＣＫを用いることにより、回避することがで きる。しかしながら、ＶＫ１ＦＯＲ／ＶＫ８ＢＡＣＫ産物からのさらなるクロー ンの分析は所望の挿入断片を生じなかった。 推定ＶＫを優先的に増幅するため、その真正第４フレームワーク配列からＶＫ ３ＦＯＲを設計し、ＶＫ１ＦＯＲの代替物として合成した。ＶＫ３ＦＯＲ及びＶ Ｋ８ＢＡＣＫを用いるＶＫ３ＦＯＲ誘発ｃＤＮＡの増幅により所望のＶＫを含む ４つのクローンが生じ、この戦略は成功した。 マウスＭＮ１４κ軽鎖可変領域のＤＮＡ及びアミノ酸配列が図２に示されてい る（配列番号３及び配列番号４）。このＭＮ１４のＶＫは、KabatのＶＫサブグ ループＶに位置し得る。このＭＮ１４ ＶＫフレームワーク領域の僅か３つの残 基（Ｍｅｔ１０、Ｖａｌ６６及びＴｈｒ７６）だけがこのサブグループの他のメ ンバーに現れない。Ｍｅｔ１０及びＶａｌ６６がこの３つのうちで最も異例であ る。これらは、Kabatに列挙されているマウスＶＫのいかなるものにも見出され ない。これらのＭＮ１４のＶＫのＣＤＲには、Kabatにおいて以前報告されてい る配列はない。 例８ ヒト抗体の可変領域へのＭＮ１４のＶＨ及びＶＫのＣＤＲの移植 ８．１ キメラ抗体発現ベクターの構築 マウス可変領域及びヒト定常領域からなるキメラ抗体の生成において、親マウ ス抗体と一緒に試験することは、正しい可変領域ｃＤＮＡが単離されていること をチェックするのに役立った。また、成功したキメラ抗体は、ヒト化されたもの の結合を評価する際、有用な対照としても機能する。発現のための可変領域のク ローニングにおいて用いられた配列は前出のOrlandi et al. (1989)に記述され ており、図３及び４に示されている。 ＶＨのＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＶＨ１ＢＡＣＫ及びＶＨ１ＦＯＲを使用 するＰＣＲを用いて、Ｍ１３クローンＭＮＶＨ４１から増幅した。これらのプラ イマー中のＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限部位は、発現のための正しい背景の下 で、Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１にＶＨが挿入されることを可能にする。この時点で、Ｖ Ｈの内部ＢａｍＨＩ制限部位を部位指向性突然変異により除去した。Ｍ１３ＶＨ ＰＣＲ１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片全体を包含するこの反応生成物をｐ ＳＶｇｐｔにクローニングし、ＶＨ配列を確認した。 その後、上記Takahashi et al., Cell, 29: 671-679(1962)によって公開され ているヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子をこの構築物にＢａｍＨＩ断片として加え、 これにより、ｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇＧ１と呼ばれるベクターを 得た。 同様に、プライマーＶＫ８ＢＡＣＫ及びＶＫ３ＦＯＲ並びにＭ１３ＶＫＰＣＲ １にクローニングされているＰｖｕＩＩ、ＢｇＩＩＩ消化産物を用いるＰＣＲ増 幅より、Ｍ１３クローンＭＮＶＫ１５４からＶＫ ＤＮＡを得、それにより可変 領域の配列をチェックした。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＲＦのＤＮＡか ら切り出し、プラスミドｐＳＶｈｙｇに移した。この構築物は、Hieter et al., Cell, 22: 197-207 (1980)に記述されるように、既にヒトκ定常領域遺伝子を 有 する。このようにして得られた最終ベクターはｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨ ｕＣＫと名付けられた。 ８．２ ハイブリッド抗体の発現及び試験 Ｍ１３ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミド ｐＳＶｇｐｔに挿入し、発現ベクターｐＳＶｇｐｔＫＬＨｕＡＩＧＡＨｕＩｇＧ １を得た。同様に、Ｍ１３ＨｕＶＫのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラス ミドｐＳＶｈｙｇに挿入し、発現ベクターｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＲＥＩＨｕＶＫ ＨｕＣＫを得た。約５μｇのｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇＧ１及び１ ０μｇのｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨｕＣＫ ＤＮＡをＰｖｕｌで直鎖状に して、１７０Ｖ、９６０μＦのシングルパルスのＢｉｏＲａｄモデル１６５ＢＲ １１６０ジーン・パルサー・エレクトロポレーター(Gene Pulser Electroporato r)を通常通り用いるエレクトロポレーションにより、約１０⁷個の半集密ＳＰ２ ／０ミエローマ細胞に移した。２４ウェルプレートにおいて、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳ成長培地にマイコフェノール酸及びキサンチンを添加することにより、ｇ ｐｔ遺伝子の発現について細胞を選択した。 生存細胞のコロニーを含むウェルを同定した。その培地上清をこれらのウェル から取り除き、ヒト抗体について検定した。抗体を分泌するコロニーを増殖させ 、より多量の抗体を単離するため０．５Ｌの調整培地を得た。 通常通り、最初に、プロテインＡアガロースアフィニティクロマトグラフィー により、この培地から抗体を精製した。精製した抗体を、未変性ＭＮ１４抗体、 ヒト抗体及び他の対照を参照して、さらに特徴付けた。 また、この抗体を、ＭＮ１４遮断検定におけるその反応プロフィールによって も特徴付けた。これにより、このハイブリッド抗体のＣＥＡ結合親和性と、ポジ ティブコントロールとして役に立つＭＮ１４マウス抗体によるＣＥＡ結合とによ って、情報を提示する比較が得られた。 ８．３ ＭＮ１４抗体のヒト化 ヒトＮＥＷＭ ＶＨ、ＫＯＬ ＶＨ及びＲＥＩ ＶＫフレームワークがヒト体 内で寛容性であるように思われるため、それらを抗体の再構成のための基礎とし て選択した。ＭＮ１４のＶＨ（配列番号２）及びＶＫ（配列番号４）とこれらの ヒト可変領域とを並べたものを図５に示す（配列番号５〜７）。 Ａ．ＮＥＷＭベースのヒト化 ＭＮ１４のＣＤＲを導入するための開始点は、必須ＦＲ及び無関係のＣＤＲを コードするＤＮＡである。これらのテンプレートの可変領域は、用いられる発現 ベクターに適合する形態、すなわち、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片中にあり 、本明細書にはプロモーター領域、シグナルペプチド及びイントロンＤＮＡも含 まれる（図３及び図４）。ＮＥＷＭ ＶＨでのものについては、このテンプレー トはＭ１３ＶＨＰＣＲ１（上記Orlandi et al.、及び下記８．３項）である。Ｋ ＯＬ ＦＲ及び無関係のＣＤＲを含む、このテンプレートの誘導体を、ＫＯＬコ ード領域の生成に用いた。Ｍ１３ＶＫＰＣＲ１（上記Orlandi et al.）の誘導体 をＨｕＶＫベクターの作製において用いた。得られたベクターを、Ｍ１３ＮＭＨ ｕＶＨ、Ｍ１３ＫＬＨｕＶＨ及びＭ１３ＨｕＶＫと名付けた。ヒト化ＭＮ１４可 変領域ＤＮＡを有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、本質的に例８．１に おいてキメラＭＮ１４発現ベクターの構築について記述される通りに、これらの Ｍ１３ベクターから発現ベクターに移した。 ＮＥＷＭ ＦＲは、Poljak et al. Biochemistry 16: 3412-20(1977)に説明さ れている。そのマウス等価物のものに匹敵する、ＣＥＡに対する親和性を有する ｈＭＮ１４の構築を、段階的なアプローチで達成した。キメラ抗体の生成は、ヒ ト化されたものの結合を評価する場合に、有用な対照を提供する。ヒトＮＥＷＭ ＶＨ及びＲＥＩ ＶＫフレームワークを抗体を再構成するための基礎として最 初に選択した。これは、これらがヒト体内において寛容性であることが知られて いるためである。ＭＮ１４の残基Ｐｈｅ２７、Ａｓｐ２８及びＴｈｒ３０は保持 した。これは、Ｋａｂａｔの超可変領域であるＣＤＲ１残基３１〜３５の一部で はないものの、それらのアミノ酸がＣＤＲ１構造ループ(Chothia et al., J. Mo l. Biol. 176: 901-917(1987))の一部であるためである。加えて、以下の理由に より、ヒト化ＶＨへの組込みのために次の残基も選択した。すなわち、Ａｌａ２ ４、この残基はＣＤＲ１に接触する。Ａｒｇ７１、この残基の側鎖はこのドメイ ンの中心を通して突き出し、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２と相互作用する。ほんの少し のＶａｌの置換はこれらのＣＤＲループの立体配座を変更し得る。ならびに、Ｓ ｅｒ９４、大部分の抗体はこの位置にＡｒｇを有しており、そこではＣＤＲ３の Ａｓｐ残基と相互作用するものと考えられ、ＮＥＷＭがＡｒｇを含むとマウスＣ ＤＲとの望ましくない相互作用を形成することがあり得るという理由である。他 の再構成分子において重要であることが立証されている領域に相当する３つの領 域において、このバージョン（ＮＭＨｕＶＨ）に対する他の変更がなされた。こ れらの変更は以下のものであった。 （ｉ） Ｇｌｎ７７Ｐｈｅ７８Ｓｅｒ７９からＴｈｒＬｅｕＴｙｒ（ＮＭＨ ｕＶｈＨＴＬＹ、配列番号９） （ｉｉ） Ｓｅｒ８２Ｔｈｒ８３Ａｌａ８４Ａｌａ８５からＬｙｓＡｒｇＳｅ ｒＧｌｕ（ＮＭＨｕＶｈＨＫＲＳＥ、配列番号１０） （ｉｉｉ） Ａｒｇ６６Ｖａｌ６７Ｔｈｒ６８Ｍｅｔ６９Ｌｅｕ７０からＬｙｓ ＰｈｅＩｌｅＶａｌＳｅｒ（ＮＭＨｕＶｈＫＦＩＶＳ、配列番号１１） このＮＥＷＭ ＶＨフレームワークの異なるバージョン（配列番号５及び８〜 １１）とＭＮ１４ ＶＨ（配列番号２）とのアラインメントを図６に示す。これ らのバージョンの各々は、同じＨｕＶＫと対を形成している。ＴＬＹ又はＫＦＩ ＶＳモチーフのいずれかを含むことにより、約２倍の改善が得られた。 上記Kabat et al.(1987)に示されているＮＥＷＮフレームワーク配列とは２つ の相違がある。すなわち、Ｓ１０７からＴ及びＬ１０８からＴ。Kabatは、残基 １をＰＣＡとして、かつ残基５及び６をＥ又はＱとして列挙している。 Ｂ．ＫＯＬベースのヒト化 ＮＥＷＭ ＶＨの使用と平行して、我々はヒトＫＯＬ ＶＨも再構成している 。ＫＯＬ ＶＨは、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｚ．ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ，３６４：７１３−７４７（１９８７）に説明されている。抗体のヒト化に 用いられたＦＲはＫａｂａｔに示されるものと同様である。このＫＯＬベースの ＶＨの本来のバージョンは、残基の可変性の観点で定義される（上記Kabat et a l.）、ＭＮ１４のＣＤＲ及び３つのさらなるマウス残基を有していた。ＮＥＷＭ ＶＨを用いた場合と同様に、これらの置換のうちの２つが生じた。これは、β シートフレームワークから伸びる実際のペプチドＣＤＲ１構造ループが残基２５ 〜３２からなる（上記Chothia et al. 1987）ためである。２８位及び３０位で の変更は、このループが全体としてマウス抗体から移植されるのを可能にする。 ＫＯＬ ＶＨのＡｒｇ残基がＡｓｐ１１０との塩架橋に関与し、ＮＥＷＭ ＶＨ を用いた場合と同様に、Ａｒｇ９４の保持がＭＮ１４のＣＤＲ３構造を攪乱する ことがあるように思われたため、ＭＮ１４残基９４が含められた。残基９４の側 鎖はＣＤＲ１の残基とも相互作用し得る。この基本ＭＮ１４ ＫＯＬＨｕＶＨ（ 配列番号１２）に対してなされた他の変更は以下の通りである。 （ｉ） Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４及びＶａｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧ ｌｙ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧ、配列番号１３）。 （ｉｉ） Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４、Ｖａｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧｌ ｙ、及びＳｅｒ７４からＡｌａ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧＡ、配列番号１４）。 （ｉｉｉ） Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４、Ｖａｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧｌ ｙ、Ｓｅｒ７４からＡｌａ及びＰｈｅ７９からＴｙｒ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧＡＹ 、配列番号１５）。変異の論理的説明 Ａｌａ２４ − ＣＤＲ１のループは、残基２９の側鎖のフレームワークへの 浸透によって固定されている。残基２４は、それが相互作用するものの１つであ る(Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817(1992))。 Ｉｌｅ４８Ｇｌｙ４９ − これらの残基の両者はＣＤＲ２超可変領域に隣接 するものの、実際の構造ループからはかけ離れている。両残基は完全に埋もれて おり(Padlan, Mol. Immunolog. 28: 489-498, 1991)、これらがそれらのパッ キング相互作用により結合を行うことが可能であるように思われた。 Ａｌａ７４ − この残基はＶＨ抗原結合表面に見出される第４ループの一部 であり、その側鎖は溶媒にほとんど完全に露出している（上記Padlan、1991）。 この残基と抗原との直接相互作用を予想することができた。 Ｔｙｒ７９ − 残基７４と同様に、この残基は抗原結合部位に近接し、結合 を行うことが可能である。 ＫＯＬ ＶＨフレームワークの異なるバージョン（配列番号７及び１２〜１５ ）とＮＥＷＭベースのバージョン（配列番号５及び８〜１１）及びマウスＭＮ１ ４（配列番号２）のアラインメントを図６に示す。 ＭＮ１４ＨｕＶＨ及びＭＮ１４ＨｕＶＬのＤＮＡ配列及び翻訳産物をそれぞれ 図７及び８に示す（それぞれ、配列番号１６〜１９）。 抗体ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫのようなヒト化ＫＬＨｕＶＨの変種を精 製し、以下のように遮断検定において試験を行った。抗体を、指定された濃度で 、ＨＲＰ標識ＭＮ１４と共に添加し、最終容積０．１ｍｌとした。３７℃で３０ 分間インキュベートし、洗浄して未結合の抗体を除去した後、残留結合ペルオキ シダーゼ活性から抗体の相対親和力を決定した。図９の検定データによって示さ れるように、「再構成」（すなわち、ＦＲにＣＤＲが移植されている）ヒト化抗 体の活性は、キメラ及びマウス陽性対照のものと同等であった。 ＫＬＨｕＶＨＡＩＧ／ＨｕＶＫ及びＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡＹ／ＨｕＶＫ抗体を 分泌する細胞からの上清液を用いて得られた結果は、これらが、ＫＬＨｕＶＨＡ ＩＧＡ／ＨｕＶＫ抗体のものと同等の遮断活性を有することを示唆する。 Ｃ．ＲＥＩベースのヒト化 ＲＥＩ ＶＬは、Epp et al., Eur. J. Biochem.，45: 513-24(1974)に説明さ れている。ＲＥＩフレームワークにおいては、結合を改善するための変更は行わ なかった。Kabat et al．(1987)に示される配列からの変更は、Ｍ４からＬ、Ｔ ３９からＫ、Ｙ７１からＦ、Ｌ１０４からＶ、Ｑ１０５からＥ、及びＴ１０７か らＫである。これらの変更は、ＭＮ１４ ＣＤＲを移植するときに用いられるテ ンプレートに予め存在し、結合を改善するために特異的に作製されはしなかった 。Ｍ４のＬへの変更は制限部位を組込むが、残りの相違がＲＥＩフレームワーク の異例の残基を取り除く。類似のフレームワークが、Foote et al., J. Mol. Bi ol. 224: 487-9(1992)により、ヒトκサブグループＩのコンセンサスと呼ばれて いる。 例９ ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体の発現 ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体の発現について安定に形質転換された 細胞を上述の方法で選択し、クローニングして個々の産生細胞系を確立した。こ れらの系の各々を検定し、正しい抗体の産生を決定して、産生の効力を評価した 。抗体のクラスを決定し、抗ＣＥＡ結合親和性を評価した。 最良の産生細胞を産生される抗体の全量についてさらに特徴付け、これらのう ちの最良のものについて、トランスフェクション、組込み、増殖又は選別の間に 抗体遺伝子に変異が生じていないことを保証するためそのｍＲＮＡから配列を得 た。 例１０ 細胞培養物中で発現したＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体の精製 ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体の最良産生細胞系を培養し、その成長 培地を集めて、０．２ミクロン膜を通して濾過した。その後、抗体を、プロテイ ンＡクロマトグラフィー、次いでイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー のような他の通常の精製ステップにより精製した。通常の遠心により、細胞をペ レット化した。その上清液から、上述のように抗体を精製した。 例１１ 診断におけるヒト化ＭＮ１４モノクローナル抗体の使用 Ａ．動物研究 ヒト結腸ガンを有するヌードマウスにおいて、標識ヒト化ＭＮ１４ ＩｇＧの 生体内の分配を測定した。放射性位置測定研究に対しては、４〜５週齢雌胸腺欠 損マウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、 胸腺欠損マウスにおいて順次増殖させた異種移植片から調製したＬＳ１７４Ｔヒ ト結腸アデノカルシノーマ(Sharkey et al., Cancer Res.，50: 828-34(1990)) の１０％懸濁液０．２ｍｌを皮下に移植した。腫瘍の発達を２週間待った後、こ れらのマウスに、２０μＣｉ（約２μｇ）の¹³¹Ｉ標識ヒト化ＭＮ１４モノクロ ーナル抗体を静脈内注射した。その後、時々、４〜５匹のマウスの群を屠殺し、 上記Sharkey et al.に従い、組織中で放射活性の位置を測定した。表２のデータ は注射された用量／組織ｇの％及び腫瘍：非腫瘍比を示す。 これらの結果は、この抗体の優れた腫瘍結合性を示し、その最大結合活性は２ 日以内に生じる。ｈＭＮ１４抗体の血液クリアランスは、親ｍＭＮ１４抗体より も迅速であった。加えて、脾臓によるｈＭＮ１４の取り込みはｍＭＮ１４よりも 高く、これはｈＭＮ１４抗体がマウスにとって「外来性」であるという事実を反 映している。腫瘍：非腫瘍比は優れたものであった。これらの結果は、本発明の ｈＭＮ１４ ｍＡｂがＣＥＡ産生腫瘍を標的とすることが可能であることを示す 。 Ｂ．¹³¹Ｉ標識ヒト化ＭＮ１４のＩｇＧを用いた臨床研究 ヒト化ＭＮ１４ ＩｇＧのターゲッティング及び薬物速度論的挙動の先行調査 のため、患者を、米国分子薬剤及び免疫学センター(Center for Molecular Medi cine and Immunology)、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪで、インスティチューショナル・レ ビュー・ボード(Institutional Review Board)認可プロトコルに処した。図１２ に示されている結果の場合、その男性患者は、肝臓に転移している結腸直腸ガン を有していた。彼に¹³¹Ｉ−ｈＭＮ１４ ＩｇＧ（８ｍＣｉ、０．６ｍｇ抗体） を静脈注射し、６日間にわたって撮像した。続いて、この患者に等用量のｍＭＮ １４ ＩｇＧを注射した。図１２に示される像は、各注射の約１４０時間後の腹 部前面の像を示す。これらの像は、直接比較することができるように、正確に同 じ濃度に調整されている。これらの結果は、親マウス抗体のみならずこのヒト化 抗体がＣＥＡ産生腫瘍によって取り込まれることを示す。これらの実験は、本発 明のヒト化ＭＮ１４ ｍＡｂを用いるヒトＣＥＡ産生結腸ガンの診断が実用上有 用なものであることを立証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異種抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植された親マウスクラスIII 、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するヒト化モノ クローナル抗体であって、該異種がヒトを含むあらゆる種を包含し、該ヒト化抗 体が該親マウスモノクローナル抗体のクラスIII、抗ＣＥＡ結合特異性は保持す るものの、ヒト患者において該親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗 体よりも免疫原性が小さいヒト化モノクローナル抗体。 ２．前記マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体がＭＮ１４モノクロ ーナル抗体である請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。 ３．前記異種抗体がヒト抗体である請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗 体。 ４．（ａ）軽鎖可変領域が式 ＦＲ_L1−ＣＤＲ_L1−ＦＲ_L2−ＣＤＲ_L2−ＦＲ_L3−ＣＤＲ_L3−ＦＲ_L4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体の異なるフレームワーク領域であり、かつＣＤ Ｒの各々はＭＮ１４の軽鎖の異なる相補性決定領域である）によって特徴付けら れ、かつ、 （ｂ）重鎖可変領域が式 ＦＲ_H1−ＣＤＲ_H1−ＦＲ_H2−ＣＤＲ_H2−ＦＲ_H3−ＣＤＲ_H3−ＦＲ_H4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体の異なるフレームワーク領域であり、かつＣＤ Ｒの各々はＭＮ１４の前記重鎖の異なる相補性決定領域である）によって特徴付 けられる 請求項２に記載のヒト化モノクローナル抗体。 ５．ＣＤＲ_L1のアミノ酸配列がＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０） であり、 ＣＤＲ_L2のアミノ酸配列がＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）であり、 ＣＤＲ_L3のアミノ酸配列がＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）であり、 ＣＤＲ_H1のアミノ酸配列がＴＹＷＭＳ（配列番号２３）であり、 ＣＤＲ_H2のアミノ酸配列がＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列 番号２４）であり、 ＣＤＲ_H3のアミノ酸配列がＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）である 請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体。 ６．ＦＲ_L1がヒト抗体のＦＲ_L1に自然に生じる約２３アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L2がヒト抗体のＦＲＬ₂₂に自然に生じる約１５アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L3がヒト抗体のＦＲＬ₃₃に自然に生じる約３２アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L4がヒト抗体のＦＲ_L4に自然に生じる約１０アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H1がヒト抗体のＦＲ_H1に自然に生じる２８〜３２アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H2がヒト抗体のＦＲ_H2に自然に生じる１２〜１６アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H3がヒト抗体のＦＲ_H3に自然に生じる３０〜３４アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H4がヒト抗体のＦＲ_H4に自然に生じる９〜１３アミノ酸の領域を含む 請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体。 ７．ＦＲ_L1のアミノ酸配列がＤＩＱＬＴ ＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶ ＧＤＲＶ Ｔ ＩＴＣ（配列番号２６）であり、 ＦＲ_L2のアミノ酸配列がＷＹＱＱＫ ＰＧＫＡＰ ＫＬＬＩＹ（配列番号２７ ）であり、 ＦＲ_L3のアミノ酸配列がＧＶＰ（Ｓ又はＤ）Ｒ ＦＳＧＳ（Ｇ又はＶ） ＳＧ ＴＤＦ ＴＦＴＩＳ ＳＬＱＰＥ ＤＩＡＴＹ ＹＣ（配列番号２８）であり、 ＦＲ_L4のアミノ酸配列がＦＧＱＧＴ ＫＶＩＥＫ（配列番号２９）であり、 ＦＲ_H1のアミノ酸配列がＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３０）、ＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰ Ｇ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＡＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３１）、又はＱＶＱＬＱ ＥＳＧＰＧ ＬＶＲＰＳ ＱＴＬＳＬ ＴＣＴＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３２ ）であり、 ＦＲ_H2のアミノ酸配列がＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＶＡ（配列番号３３） 、ＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３４）、又はＷＶＲＱＰ ＰＧ ＲＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３５）であり、 ＦＲ_H3のアミノ酸配列がＲＦＴＩＳ ＲＤＮＳＫ ＮＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３６）、ＲＦＴＩＳ ＲＤＮＡＫ Ｎ ＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３７）、又は ＲＶＴＭＬ ＲＤＴＳＫ ＮＧＳＦＬ ＲＬＳＳＶ ＴＡＡＤＴ ＡＶＹＹＣ ＡＳ（配列番号３８）であり、 ＦＲ_H4のアミノ酸配列がＷＧＱＧＴ ＰＶＴＶＳ Ｓ（配列番号３９）、又は ＷＧＱＧＴ ＴＶＴＶＳ Ｓ（配列番号４０）である （以上において、Ｃはスルフィドリル又はジスルフィドの形であってもよい）請 求項６に記載のヒト化モノクローナル抗体。 ８．ＣＤＲ_L1のアミノ酸配列がＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０） であり、 ＣＤＲ_L2のアミノ酸配列がＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）であり、 ＣＤＲ_L3のアミノ酸配列がＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）であり、 ＣＤＲ_H1のアミノ酸配列がＴＹＷＭＳ（配列番号２３）であり、 ＣＤＲ_H2のアミノ酸配列がＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列 番号２４）であり、 ＣＤＲ_H3のアミノ酸配列がＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）である 請求項７に記載のヒト化モノクローナル抗体。 ９．ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡと名付けられている請求項１に記載のヒト化モノク ローナル抗体。 １０．マウスクラスIII、抗ＣＥＡヒト化モノクローナル抗体に結合する診断 又は治療剤を包含する複合体であって、該抗体のＣＤＲが親マウスクラスIII、 抗ＣＥＡモノクローナル抗体に由来し、かつＦＲが異種抗体に由来し、ここで、 該異種はヒトを含むあらゆる種を指し、該ヒト化モノクローナル抗体が該親マウ スクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体のクラスIII、抗ＣＥＡ結合特異性を 保持するものの、該異種において親クラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体よ りも免疫原性が小さい複合体。 １１．前記親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体がＭＮ１４モノ クローナル抗体である請求項９に記載の複合体。 １２．前記異種がヒトを指す請求項１０に記載の複合体。 １３．前記モノクローナル抗体において、 （ａ）軽鎖可変領域が式 ＦＲ_L1−ＣＤＲ_L1−ＦＲ_L2−ＣＤＲ_L2−ＦＲ_L3−ＣＤＲ_L3−ＦＲ_L4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体の異なるフレームワーク領域であり、かつＣＤ Ｒの各々はＭＮ１４の軽鎖の異なる相補性決定領域である）によって特徴付けら れ、かつ （ｂ）重鎖可変領域が式 ＦＲ_H1−ＣＤＲ_H1−ＦＲ_H2−ＣＤＲ_H2−ＦＲ_H3−ＣＤＲ_H3−ＦＲ_H4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体の異なるフレームワーク領域であり、かつＣＤ Ｒの各々はＭＮ１４の重鎖の異なる相補性決定領域である）によって特徴付けら れる 請求項１２に記載の複合体。 １４．ＣＤＲ_L1のアミノ酸配列がＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０ ）であり、 ＣＤＲ_L2のアミノ酸配列がＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）であり、 ＣＤＲ_L3のアミノ酸配列がＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）であり、 ＣＤＲ_H1のアミノ酸配列がＴＹＷＭＳ（配列番号２３）であり、 ＣＤＲ_H2のアミノ酸配列がＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列 番号２４）であり、 ＣＤＲ_H3のアミノ酸配列がＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）である 請求項１３に記載の複合体。 １５．ＦＲ_L1がヒト抗体のＦＲ_L1に自然に生じる約２３アミノ酸の領域を含み 、 ＦＲ_L2がヒト抗体のＦＲＬ₂₂に自然に生じる約１５アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L3がヒト抗体のＦＲＬ₃₃に自然に生じる約３２アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L4がヒト抗体のＦＲ_L4に自然に生じる約１０アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H1がヒト抗体のＦＲ_H1に自然に生じる２８〜３２アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H2がヒト抗体のＦＲ_H2に自然に生じる１２〜１６アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H3がヒト抗体のＦＲ_H3に自然に生じる３０〜３４アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H4がヒト抗体のＦＲ_H4に自然に生じる９〜１３アミノ酸の領域を含む 請求項１３に記載の複合体。 １６．ＦＲ_L1のアミノ酸配列がＤＩＱＬＴ ＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶ ＧＤＲ ＶＴ ＩＴＣ（配列番号２６）であり、 ＦＲ_L2のアミノ酸配列がＷＹＱＱＫ ＰＧＫＡＰ ＫＬＬＩＹ（配列番号２７ ）であり、 ＦＲ_L3のアミノ酸配列がＧＶＰ（Ｓ又はＤ）Ｒ ＦＳＧＳ（Ｇ又はＶ） ＳＧ ＴＤＦ ＴＦＴＩＳ ＳＬＱＰＥ ＤＩＡＴＹ ＹＣ（配列番号２８）であり、 ＦＲ_L4のアミノ酸配列がＦＧＱＧＴ ＫＶＩＥＫ（配列番号２９）であり、 ＦＲ_H1のアミノ酸配列がＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３０）、ＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰ Ｇ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＡＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３１）、又はＱＶＱＬＱ ＥＳＧＰＧ ＬＶＲＰＳ ＱＴＬＳＬ ＴＣＴＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３２ ）であり、 ＦＲ_H2のアミノ酸配列がＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＶＡ（配列番号３３） 、ＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３４）、又はＷＶＲＱＰ ＰＧ ＲＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３５）であり、 ＦＲ_H3のアミノ酸配列がＲＦＴＩＳ ＲＤＮＳＫ ＮＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３６）、ＲＦＴＩＳ ＲＤＮＡＫ Ｎ ＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３７）、又は ＲＶＴＭＬ ＲＤＴＳＫ ＮＧＳＦＬ ＲＬＳＳＶ ＴＡＡＤＴ ＡＶＹＹＣ ＡＳ（配列番号３８）であり、 ＦＲ_H4のアミノ酸配列がＷＧＱＧＴ ＰＶＴＶＳ Ｓ（配列番号３９）、又は ＷＧＱＧＴ ＴＶＴＶＳ Ｓ（配列番号４０）である （以上において、Ｃはスルフィドリル又はジスルフィドの形であってもよい）請 求項１５に記載の複合体。 １７．ＣＤＲ_L1のアミノ酸配列がＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０ ）であり、 ＣＤＲ_L2のアミノ酸配列がＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）であり、 ＣＤＲ_L3のアミノ酸配列がＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）であり、 ＣＤＲ_H1のアミノ酸配列がＴＹＷＭＳ（配列番号２３）であり、 ＣＤＲ_H2のアミノ酸配列がＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列 番号２４）であり、 ＣＤＲ_H3のアミノ酸配列がＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）である 請求項１６に記載の複合体。 １８．前記治療剤が細胞障害性物質を含む請求項１０に記載の複合体。 １９．前記診断試薬が造影剤を含む請求項１０に記載の複合体。 ２０．患者に、診断又は治療に有効な量の、請求項１０から請求項１９のいず れか１項に記載の診断又は治療剤を含有する複合体を投与するステップを含む患 者の診断又は治療方法。 ２１．親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のＣ ＤＲ及び異種抗体のＦＲをコードする単離精製キメラＤＮＡであって、該異種抗 体がヒトを含むあらゆる種に由来することが可能であり、該キメラＤＮＡによっ て発現される抗体が該親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体のクラ スIII、抗ＣＥＡ結合特異性を保持するものの、異種被検体において該親モノク ローナル抗体よりも免疫原性が小さい単離精製キメラＤＮＡ。 ２２．図１に示されるＭＮ１４モノクローナル抗体のＶＨアミノ酸鎖をコード するＤＮＡ配列、並びにそれらの対立遺伝子、変種及び変異を包含する単離ポリ ヌクレオチド。 ２３．請求項２２に記載のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質。 ２４．図２に示されるＭＮ１４モノクローナル抗体のＶＫアミノ酸鎖をコード するＤＮＡ配列、並びにそれらの対立遺伝子、変種及び変異を包含する単離ポリ ヌクレオチド。 ２５．請求項２４に記載のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質。 ２６．ｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇＧ１と名付けられ、図３に示さ れる、ヒト化キメラＭＮ１４重鎖の発現のためのベクター。 ２７．ｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨｕＣＫと名付けられ、図４に示される 、ヒト化キメラＭＮ１４κ軽鎖の発現のためのベクター。 ２８．ヒト化キメラＭＮ１４モノクローナル抗体を発現させるための方法であ って、 （ａ）ベクターｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇＧ１及びｐＳＶｈｙｇＭ Ｎ１４ＭｕＶＫＨｕＣＫを直鎖状にするステップと、 （ｂ）哺乳動物リンパ細胞を該直鎖状ベクターでトランスフェクションするステ ップと、 （ｃ）該トランスフェクションされた細胞をｇｐｔ遺伝子を発現するものについ て選択するステップと、 （ｄ）該ｇｐｔ遺伝子を発現する該細胞から、該ヒト化キメラモノクローナル抗 体を分泌する細胞を選択するステップと を含む方法。 ２９．ｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＮＥＷＭＨｕＩｇＧ１と名付けられ、図３に示さ れる、再構成ヒト化ＭＮ１４可変重鎖を発現させるためのベクターであって、２ ４、２７、２８、３０、７１及び９４位のＭＮ１４アミノ酸残基が、該ＭＮ１４ 可変重鎖のＣＤＲと共に該可変重鎖に変異しているベクター。 ３０．ｐＳＶｈｇｒＭＮ１４ＲＥＩＨｕＣＫと名付けられ、図４に示される、 再構成ヒト化ＭＮ１４可変κ軽鎖を発現させるためのベクターであって、２４、 ２７、２８、３０、７１及び９４位のＭＮ１４アミノ酸残基が、該ＭＮ１４可変 κ軽鎖のＣＤＲと共に該可変κ軽鎖に変異しているベクター。 ３１．（ａ）前記軽鎖が式 ＦＲ_L1−ＣＤＲ_L1−ＦＲ_L2−ＣＤＲ_L2−ＦＲ_L3−ＣＤＲ_L3−ＦＲ_L4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体の異なるフレームワーク領域であり、かつＣＤ Ｒの各々はＭＮ１４の軽鎖の異なる相補性決定領域である）によって特徴付けら れ、かつ、 （ｂ）前記重鎖可変領域が式 ＦＲ_H1−ＣＤＲ_H1−ＦＲ_H2−ＣＤＲ_H2−ＦＲ_H3−ＣＤＲ_H3−ＦＲ_H4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体の異なるフレームワーク領域であり、かつＣＤ Ｒの各々はＭＮ１４の重鎖の異なる相補性決定領域である）によって特徴付けら れる 請求項２１に記載の単離精製ＤＮＡ。 ３２．ＣＤＲ_L1のアミノ酸配列がＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０ ）であり、 ＣＤＲ_L2のアミノ酸配列がＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）であり、 ＣＤＲ_L3のアミノ酸配列がＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）であり、 ＣＤＲ_H1のアミノ酸配列がＴＹＷＭＳ（配列番号２３）であり、 ＣＤＲ_H2のアミノ酸配列がＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列 番号２４）であり、 ＣＤＲ_H3のアミノ酸配列がＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）である 請求項３１に記載の単離精製ＤＮＡ。 ３３．ＦＲ_L1がヒト抗体のＦＲ_L1に自然に生じる約２３アミノ酸の領域を含み 、 ＦＲ_L2がヒト抗体のＦＲＬ₂₂に自然に生じる約１５アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L3がヒト抗体のＦＲＬ₃₃に自然に生じる約３２アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_L4がヒト抗体のＦＲ_L4に自然に生じる約１０アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H1がヒト抗体のＦＲ_H1に自然に生じる２８〜３２アミノ酸の領域を含み、 ＦＲH₂がヒト抗体のＦＲ_H2に自然に生じる１２〜１６アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H3がヒト抗体のＦＲ_H3に自然に生じる３０〜３４アミノ酸の領域を含み、 ＦＲ_H4がヒト抗体のＦＲ_H4に自然に生じる９〜１３アミノ酸の領域を含む 請求項３１に記載の単離精製ＤＮＡ。 ３４．ＦＲ_L1のアミノ酸配列がＤＩＱＬＴ ＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶ ＧＤＲ ＶＴ ＩＴＣ（配列番号２６）であり、 ＦＲ_L2のアミノ酸配列がＷＹＱＱＫ ＰＧＫＡＰ ＫＬＬＩＹ（配列番号２７ ）であり、 ＦＲ_L3のアミノ酸配列がＧＶＰ（Ｓ又はＤ）Ｒ ＦＳＧＳ（Ｇ又はＶ） ＳＧ ＴＤＦ ＴＦＴＩＳ ＳＬＱＰＥ ＤＩＡＴＹ ＹＣ６（配列番号２８）であり 、 ＦＲ_L4のアミノ酸配列がＦＧＱＧＴ ＫＶＩＥＫ（配列番号２９）であり、 ＦＲ_H1のアミノ酸配列がＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３０）、ＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰ Ｇ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＡＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３１）、又はＱＶＱＬＱ ＥＳＧＰＧ ＬＶＲＰＳ ＱＴＬＳＬ ＴＣＴＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号３２ ）であり、 ＦＲ_H2のアミノ酸配列がＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＶＡ（配列番号３３） 、ＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３４）、又はＷＶＲＱＰ ＰＧ ＲＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３５）であり、 ＦＲ_H3のアミノ酸配列がＲＦＴＩＳ ＲＤＮＳＫ ＮＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３６）、ＲＦＴＩＳ ＲＤＮＡＫ Ｎ ＴＬＦＬ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３７）、又は ＲＶＴＭＬ ＲＤＴＳＫ ＮＧＳＦＬ ＲＬＳＳＶ ＴＡＡＤＴ ＡＶＹＹＣ ＡＳ（配列番号３８）であり、 ＦＲ_H4のアミノ酸配列がＷＧＱＧＴ ＰＶＴＶＳ Ｓ（配列番号３９）、又は ＷＧＱＧＴ ＴＶＴＶＳ Ｓ（配列番号４０）である （以上において、Ｃはスルフィドリル又はジスルフィドの形であってもよい）請 求項３３に記載の単離精製ＤＮＡ。 ３５．ＣＤＲ_L1のアミノ酸配列がＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０ ）であり、 ＣＤＲ_L2のアミノ酸配列がＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）であり、 ＣＤＲ_L3のアミノ酸配列がＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）であり、 ＣＤＲ_H1のアミノ酸配列がＴＹＷＭＳ（配列番号２３）であり、 ＣＤＲ_H2のアミノ酸配列がＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列 番号２４）であり、 ＣＤＲ_H3のアミノ酸配列がＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）である 請求項３４に記載の単離精製ＤＮＡ。 ３６．キメラ再構成遺伝子を含む図３のプラスミドｐＳＶｇｐｔ。 ３７．キメラ遺伝子を含む図４のプラスミドｐＳＶｈｙｇ。 ３８．図３に示されるキメラ遺伝子を発現する形質転換細胞。 ３９．図４に示されるキメラ遺伝子を発現する形質転換細胞。