JP2002218990A - Ｃｄｒを移植されたｉｉｉ型抗ｃｅａヒト化マウスモノクローナル抗体 - Google Patents

Ｃｄｒを移植されたｉｉｉ型抗ｃｅａヒト化マウスモノクローナル抗体

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JP2002218990A
JP2002218990A JP2001357367A JP2001357367A JP2002218990A JP 2002218990 A JP2002218990 A JP 2002218990A JP 2001357367 A JP2001357367 A JP 2001357367A JP 2001357367 A JP2001357367 A JP 2001357367A JP 2002218990 A JP2002218990 A JP 2002218990A
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ハンス・ジェイ ハンセン，
Kathryn L Armour
アーマー，キャスリン・エル
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 マウスクラスIII、抗ＣＥＡ ｍＡｂの抗Ｃ
ＥＡ結合特性及びヒト患者におけるヒトｍＡｂの免疫原
性を有する免疫学的試薬を提供する。 【解決手段】 異種抗体のフレームワーク領域に移植さ
れた親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体
の相補性決定領域を有するヒト化モノクローナル抗体で
あって、このヒト化抗体が親マウスモノクローナル抗体
の結合特異性は保持するものの、異種宿主においてそれ
よりも免疫原性が小さいヒト化モノクローナル抗体が提
供される。好ましいマウスクラスIII、抗ＣＥＡモノク
ローナル抗体はＭＮ１４抗体であり、好ましい異種抗体
はヒトに由来するものである。このヒト化モノクローナ
ル抗体を産生するＤＮＡ構築物及びベクター、並びにそ
れを用いる診断用及び治療用複合体も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、結腸及び他のガン
の診断及び治療用の免疫学的試薬に関する。特に、本発
明は、対応するマウス抗ガン胎児性抗原（「ＣＥＡ」）
モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）（ＭＮ１４）の結合
親和特性並びにヒト抗体の抗原性及びエフェクター特性
を有するヒト化抗ＣＥＡモノクローナル抗体に関する。
さらに、本発明は、抗ＣＥＡマウスｍＡｂの相補性決定
領域（「ＣＤＲ」）がヒト抗体のフレームワーク領域に
移植されているヒト化ｍＡｂ、そのようなＣＤＲを移植
された抗体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを増殖さ
せ、発現させるためのベクター及び形質転換宿主、並び
に診断及び治療用途に有用な抗体の複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景 ガンの診断及び治療への有望なアプローチは、診断及び
治療作用物質を悪性腫瘍に直接搬送するターゲッティン
グ抗体の使用を包含する。過去１０年にわたって、様々
な腫瘍特異的抗体及び抗体断片が、これらの抗体を薬
物、毒素、放射性核種もしくは他の作用物質に複合する
方法、及びこれらの複合体を患者に投与する方法と同様
に、開発されている。これらの努力は多大な進歩をもた
らしているが、様々のほとんど予期し得ない問題が、あ
る程度まで開発されている試薬の幾つかの診断上及び治
療上の実用性を制限している。
【０００３】その中で、最も扱いにくい問題は、ターゲ
ッティング複合体に外来抗原として応答し得る、ヒト免
疫系自体によって引き起こされるものである。すなわ
ち、（ヒトに最も普通に用いられているターゲッティン
グ抗体である）マウスモノクローナル抗体と複合体を形
成している薬物又は放射性核種で処置された患者は、体
内を循環しているヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそ
の複合体の抗体部分に対する一般化された即時型III型
過敏性反応を発現する。さらに、副作用が最小である場
合（例えば、単一の投与における場合）でさえ、循環Ｈ
ＡＭＡは患者におけるターゲッティング作用物質の有効
濃度を低下させ、したがって、診断又は治療作用物質が
標的部位に到達するのを制限する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この問題を克服又は回
避するため、幾つかのアプローチが開発されているが、
限られた成功しか収めていない。戦略の１つは、ターゲ
ッティング抗体を化学的に修飾してその抗原性を抑制す
ることである。例えば、ターゲッティング抗体へのポリ
エチレングリコールの複合（ＰＥＧ化）が、抗体の抗原
性を低下させることが報告されている。別のアプローチ
は、抗体における抗原性の部位を特徴付けた後、それを
除去することである。この手法においては、ＩｇＧ全体
の代わりに、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及び他の抗体断片
が用いられている。加えて、血液からＨＡＭＡを血漿交
換で除去することによりＨＡＭＡの副作用を低下させる
試みがなされている。また、外来抗体の副作用を十分に
低下させてターゲッティング作用物質での複数の治療を
可能にするのに、免疫抑制技術も用いられている。
【０００５】これらのアプローチで完全に満足に改善す
るものはない。ターゲッティング抗体及び抗体複合体に
対する不利な免疫応答を減少または取り除く手段が、こ
れらの診断及び治療作用物質の完全な利益を得るため
に、依然として要求されている。
【０００６】この目標は、以下に説明されるＣＤＲを移
植されたヒト化マウス抗ヒトＣＥＡｍＡｂで達成され
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、マウス
クラスIII抗ＣＥＡ ｍＡｂ（ＭＮ１４）のＣＤＲがヒ
ト抗体又は抗体断片のアミノ酸配列に機能的に移植され
たヒト化クラスIII抗ＣＥＡ ｍＡｂを提供し、マウス
クラスIII、抗ＣＥＡ ｍＡｂの抗ＣＥＡ結合特性及び
ヒト患者におけるヒトｍＡｂの免疫原性を有する免疫学
的試薬を提供することにある。
【０００８】本発明の別の目的は、このような抗体をコ
ードするＤＮＡ構築体を提供することにある。これに関
する具体的な目的は、細胞培養及び抗体産生における有
利な特性を有する、改良された抗体及びその抗体をコー
ドするＤＮＡを生成する遺伝子操作を容易にする基質Ｄ
ＮＡである。
【０００９】本発明のさらに別の目的は、このＤＮＡを
増殖させ、かつこの抗体を発現させるためのベクターを
提供することにある。これに関連する本発明の目的は、
保存、増殖、抗体産生及び治療用途のための、ベクター
を有する細胞を提供することにある。
【００１０】本発明のさらに別の目的は、診断及び治療
において用いられる、抗体を含有する組成物を提供する
ことにある。これに関しては、とりわけ、ex vivo及びi
n vivoにおける造影、診断、予後及び治療のための、造
影剤及び治療剤と複合体を形成する抗体を含む複合体を
提供することが目的である。
【００１１】前述の目的の達成において、本発明の一側
面に従い、異種（ヒト）抗体のフレームワーク領域に移
植されたマウスクラスIII、抗ＣＥＡ ｍＡｂ（ＭＮ１
４）のＣＤＲを含むヒト化マウスｍＡｂであって、この
ようにヒト化されたｍＡｂ抗体がクラスIII、抗ＣＥＡ
結合特異性は保持するものの、患者において親ＭＮ１４
マウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さいヒト
化マウスｍＡｂが提供される。
【００１２】特に好ましい態様においては、このヒト化
抗体の軽鎖可変領域は下記式で特徴付けられる。 ＦＲL1−ＣＤＲL1−ＦＲL2−ＣＤＲL2−ＦＲL3−ＣＤＲ
L3−ＦＲL4ここで、ＦＲの各々は個別にヒト抗体のフレ
ームワーク領域であり、かつＣＤＲの各々は個別にＭＮ
１４の軽鎖の相補性決定領域にあり、及び下付文字は軽
（「Ｌ」）鎖領域を指す。
【００１３】重鎖可変領域は下記式で特徴付けられる。 ＦＲH1−ＣＤＲH1−ＦＲH2−ＣＤＲH2−ＦＲH3−ＣＤＲ
H3−ＦＲH4ここで、ＦＲ及びＣＤＲは上と同じ意味を有
し、かつ下付文字「Ｈ」は重鎖領域を指す。）
【００１４】態様の１つにおいて、ＣＤＲL1はアミノ酸
配列 ＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶＡ（配列番号２０）を有
し、ＣＤＲL2はアミノ酸配列 ＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列
番号２１）を有し、ＣＤＲL3はアミノ酸配列 ＱＱＹＳ
Ｌ ＹＲＳ（配列番号２２）を有し、ＣＤＲH1はアミノ
酸配列 ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を有し、ＣＤＲ H2
はアミノ酸配列 ＥＩＨＰ ＤＳＳＴＩ ＮＹＡＰＳ
ＬＫＤ（配列番号２４）を有し、ＣＤＲH3はアミノ酸配
列 ＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）を有す
る。
【００１５】他の態様において、ＦＲL1はアミノ酸配列
ＤＩＱＬＴ ＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶ ＧＤＲＶＴ
ＩＴＣ（配列番号２６）を有し、ＦＲL2はアミノ酸配列
ＷＹＱＱＫ ＰＧＫＡＰ ＫＬＬＩＹ（配列番号２
７）を有し、ＦＲL3はアミノ酸配列 ＧＶＰ（Ｓ又は
Ｄ）Ｆ ＳＧＳ（Ｇ又はＶ）Ｓ ＧＴＤＦＴ ＦＴＩＳ
ＳＬＱＰＥＤ ＩＡＴＹＹ Ｖ（配列番号２８）を有
し、ＦＲL4はアミノ酸配列ＦＧＱＧＴ ＫＶＩＥＫ（配
列番号２９）を有し、ＦＲH1はアミノ酸配列 ＥＶＱＬ
Ｖ ＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＳＳ
ＧＦＤＦＴ（配列番号３０）、ＥＶＱＬＶ ＥＳＧＧ
Ｇ ＶＶＱＰＧ ＲＳＬＲＬ ＳＣＳＡＳＧＦＤＦＴ
（配列番号３１）又はＱＶＱＬＱ ＥＳＧＰＧ ＬＶＲ
ＰＳ ＱＴＬＳＬ ＴＣＴＳＳ ＧＦＤＦＴ（配列番号
３２）を有し、ＦＲH2はアミノ酸配列 ＷＶＲＱＡ Ｐ
ＧＫＧＬ ＥＷＶＡ（配列番号３３）、ＷＶＲＱＡ Ｐ
ＧＫＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３４）、又はＷＶＲＱＰ
ＰＧＲＧＬ ＥＷＩＡ（配列番号３５）を有し、ＦＲ
H3はアミノ酸配列 ＲＦＴＩＳ ＲＤＮＳＫ ＮＴＬＦ
Ｌ ＱＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列
番号３６）、ＲＦＴＩＳ ＲＤＮＡＫ ＮＴＬＦＬ Ｑ
ＭＤＳＬ ＲＰＥＤＴ ＧＶＹＦＣ ＡＳ（配列番号３
７）、又はＲＶＴＭＬ ＲＤＴＳＫ ＮＧＳＦＬ ＲＬ
ＳＳＶ ＴＡＡＤＴ ＡＶＹＹＣ ＡＳ（配列番号３
８）を有し、ＦＲH4はアミノ酸配列 ＷＧＱＧＴ ＰＶ
ＴＶＳ Ｓ（配列番号３９）、又はＷＧＱＧＴ ＴＶＴ
ＶＳ Ｓ（配列番号４０）を有し、以上において、Ｃは
スルフィドリル又はジスルフィドの形であってもよい。
【００１６】別の好ましい態様は、クラスIII、抗ＣＥ
Ａヒト化ｍＡｂと複合体を形成する診断又は治療剤を包
含する。ここで、このクラスIII、抗ＣＥＡヒト化ｍＡ
ｂにおいて、この抗体のＣＤＲはＭＮ１４マウスｍＡｂ
のＣＤＲに由来し、ＦＲは異種（ヒト）抗体のＦＲに由
来し、この複合体はＭＮ１４のクラスIII、抗ＣＥＡ結
合特異性を保持するものの、ヒトにおいてマウスＭＮ１
４よりも免疫原性が小さい。そのような態様の１つにお
いては、その軽鎖及び重鎖可変領域は上に示される通り
に特徴付けられ、かつ同様に上に説明されるアミノ酸配
列を有する。
【００１７】さらに別の好ましい態様において、患者の
診断又は治療方法が、前述の好ましい態様の複合体を適
当な投与計画の下に投与するステップを含む。
【００１８】別の好ましい態様は、上述のヒト化抗体の
軽鎖、重鎖またはその両鎖をコードする単離精製ＤＮＡ
を含む。別の好ましい態様は、上述のＣＤＲ及びＦＲの
ＤＮＡ配列を含む。
【００１９】本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下
の詳細な説明及び添付の請求の範囲から明らかとなる。
【００２０】
【発明の実施の形態】用語の説明 本出願においては、以下の用語又は略語が用いられる。
この用語集に記される意味は、説明のためのみである。
これらの用語の完全な意味は、当該技術分野の熟練者に
は明らかである。
【００２１】「ＣＤＲ」は、相補性決定領域に対する略
語として用いられる。これらは、主として、しかしなが
ら他の可能性を除くわけではないが、抗原抗体結合の原
因である、抗体の可変領域内の領域である。
【００２２】「ＦＲ」は、フレームワーク領域に対する
略語である。広く言えば、これらは、抗体の可変領域
の、ＣＤＲに隣接し、もしくは並列する部分である。一
般には、これらの領域は、その可変領域の立体配座に影
響を与え、そのフレームワーク領域が抗体と抗原との相
互作用に影響を及ぼし得るにもかかわらず、抗体への抗
原の特異的結合の直接の原因とはほとんどならない多く
の構造上の機能を有する。
【００２３】「キメラ」は、その可変領域がマウス抗体
に由来し、その定常領域が異種（別）の種の抗体に由来
する抗体を指す。
【００２４】「ヒト化」は、上に定義されるキメラ抗体
ではあるが、ＦＲ可変領域がヒト抗体に由来するものを
指す。
【００２５】「ＨＡＨＡ」は、ヒト化マウス抗体に対す
るヒト抗体を指す。「ＣＥＡ」は、内胚葉起源の消化器
系上皮のほとんどのアデノカルシノーマ並びに乳ガン及
び非小細胞肺ガンのような他のガンにおいて発現する１
８０ｋＤａ糖タンパク質であるガン胎児性抗原を指す。
【００２６】接頭辞としての「ｈ」という文字は、「ヒ
ト化」を意味する。他の略語は、Roitt et al., IMMUNO
LOGY, 3rd ed. Mosby Year Book Europe Ltd. (1993)に
従って用いられる。この文献は、引用することにより本
明細書にそのまま組込まれる。
【００２７】本明細書の開示において用いられるこれら
の用語及び他の用語は、本発明が属する技術分野におい
て通常用いられるものと同じ意味で用いられる。
【００２８】過去に、ＭＮ１４のＣＥＡ結合特性を有す
る有効な非ＨＡＭＡ誘発性の抗ＣＥＡ抗体を開発するこ
とには失敗しているが、ＭＮ１４ ｍＡｂのＣＤＲをヒ
ト抗体のＦＲに移植して、ＨＡＭＡの誘発が低下され、
かつエフェクター活性が増大されていながら、ＭＮ１４
の抗ＣＥＡ ｍＡｂの抗原結合特性を有する抗体及び抗
体誘導試薬を得ることが可能であることが見出されてい
る。
【００２９】マウス抗ＣＥＡのＩｇＧ１モノクローナル
抗体ＭＮ１４、及びその生成は、以前に説明されてい
る。Hansen et al., Cancer, 71:3478 (1993)、Primus
et al.,米国特許第4,818,709号を参照。ＭＮ１４はクラ
スIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の基準の全てを満
たし、ＥＩＡで胎便と非反応性であり、かつ通常の組織
とは反応しない。
【００３０】遮断解析は、Hansen et al., 1993 上記、
Losman et al., Int. Cancer, 56:580 (1994)、Hansen
et al., Clin. Chem., 35:146 (1989)に従って行う。Ｃ
ＥＡの定量にこれらの参考文献に記述されるものと同じ
条件を用いて、標識ＭＮ１４プローブに対するヒト化Ｍ
Ｎ１４の結合を評価することができる。典型的なプロー
ブは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
に複合しているＭＮ１４である。標識及び非標識ＭＮ１
４の両者を、マイクロタイタープレートのウェルのよう
な固体支持体に固定されているＣＥＡ試料に加える。Ｃ
ＥＡに対する標識ＭＮ１４の結合の「遮断」の程度は、
非標識ＭＮ１４の活性の直接の反映である。標準ＭＮ１
４を用いて、ヒト化ＭＮ１４又はそれらの誘導体の未知
試料の相対活性を決定することができる。典型的には、
この反応はマイクロタイタープレートのウェルにおいて
行われる。例えば２５μｇ／ウェルのレベルでこのウェ
ルをＣＥＡで直接満たされ、又は間接的に満たされる。
間接的に満たされる場合には、ＣＥＡと反応はするがＭ
Ｎ１４が相互作用するものとは異なるエピトープに反応
する抗体が予め満たされている。このような抗体は、Ｍ
Ｎ１５ ｍＡｂであってもよい。その後、ＣＥＡを間接
的にそのウェルに固定することができる。次に、そのよ
うな満たされたプレートを用いて、競合結合ＥＩＡ検定
を行うことができる。
【００３１】前述のＨＲＰ標識ｍＡｂの代わりに、抗体
を、通常、例えば131Ｉを用いて、クロラミンＴ法によ
り、約１０ｍＣｉ／μｇの比活性まで放射ヨウ素化する
ことが可能であり、遊離した放射性同位体はアクリルア
ミドゲルカラムでのクロマトグラフィーにより除去する
（上記Hansen et al., 1993を参照）。
【００３２】本明細書に説明される発明の実施に適切な
分子生物学上の技術も、当該技術分野における熟練者に
は公知である。適切な技術は、とりわけ、Sambrook et
al.,MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd E
d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, N.Y. (1989), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIO
LOGY, Ausubel et al., Eds., Green Publishing Assoc
iates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons,
New York (1987, 1988, 1989)（これらは、引用するこ
とにより、本明細書に補遺を含むそれら全体を組込むも
のとする）を含む多くのマニュアルや主要な刊行物に記
述されている。
【００３３】本明細書に開示されるＭＮ１４軽鎖及び重
鎖ＣＤＲ及び修飾したＭＮ１４のＣＤＲは、上記参考文
献に記述されているもののような公知の組換え技術を用
いて、他の抗体に組込むことができる。
【００３４】この目的に適切な具体的な方法は、下記例
に示されている。本明細書に説明されるアミノ酸配列に
基づいて、ＭＮ１４のＣＤＲをコードするオリゴヌクレ
オチドを合成することができる。本明細書に説明される
アミノ酸配列を正確にコードするものに加えて、修飾Ｃ
ＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを作製することも
できる。また、このオリゴヌクレオチドは、ＭＮ１４の
ＣＤＲのものに加えて、例えばクローニングを容易にす
るヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌクレオチ
ドの合成技術は公知であり、多くの製造者から入手可能
な自動装置で行うことができる。さらに、あらゆる特定
の配列のオリゴヌクレオチドを購入することができる。
【００３５】ＭＮ１４のＣＤＲ及び／又は特定のＦＲ残
基をコードするオリゴヌクレオチド又はそれらの相補鎖
に相当するオリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオ
チドの末端、一般的には１２ヌクレオチドがテンプレー
トＤＮＡに完全にアニーリングするように設計されてい
るという条件の下で、部位指向性突然変異誘発によるＶ
Ｈ又はＶＫ ＤＮＡへのこれらの残基のコドンの導入に
用いることができる。このテンプレートＤＮＡは、典型
的には、必須ＦＲをコードする可変領域ＤＮＡを坦持す
るＭ１３ベクターに表される一本鎖ＤＮＡである。方法
の１つにおいて、変異誘発性オリゴヌクレオチドをそれ
らの５’末端でリン酸化し、５’から可変領域ＤＮＡへ
の伸長を誘発するオリゴヌクレオチドと一緒に、このｓ
ｓＤＮＡテンプレートにアニーリングする。このオリゴ
ヌクレオチドを、Ｔ７ポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼによって一緒に連結する断片を用いて伸長させ、可
変領域全体を包含する完全な変異鎖を得る。この変異鎖
をテンプレートとして用い、熱サイクル反応においてＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて適切なプライマーか
らその相補鎖の複数のコピーを合成することができる。
変異鎖がこのように選択的に増幅されると、通常のＰＣ
Ｒにより、クローニング、配列決定及び発現のためにＤ
ＮＡを増幅することが可能である。
【００３６】抗体をコードしている適切なＤＮＡが開示
により本明細書に示されるが、事実上、そのようなＤＮ
Ａのあらゆるものが含まれる。様々なヒト抗体遺伝子
が、公的に利用可能な寄託の形態で利用することができ
る。抗体及び抗体をコードしている遺伝子の多くの配列
が公開されており、上述のように適切な抗体遺伝子をこ
れらの配列から合成することができる。
【００３７】本発明の範囲には、本明細書に説明される
ＤＮＡ配列の対立遺伝子、変種及び変異が含まれる。
【００３８】本開示によるＣＤＲ移植は、確立されてい
る技術を用いて行うことができる。抗体産生細胞系は、
熟練技術者に公知の技術を用いて選択し、かつ培養する
ことができる。そのような技術は、様々な実験マニュア
ル及び主要な刊行物に記述されている。例えば、以下に
記述されるような本発明での使用に適する技術は、CURR
ENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Coligan et al., Eds.,
Green Publishing Associates and Wiley-Interscienc
e, John Wiley and Sons, New York (1991)に記述され
ておる。この文献は引用することにより補遺を含むその
全体が本明細書に組込まれる。
【００３９】ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞から、
グアニジニウムイソチオシアネート抽出及び沈殿と、そ
れに続く遠心もしくはクロマトグラフィーのような標準
技術により、単離することができる。所望であれば、オ
リゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーのような標
準技術により、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離することが
できる。これらの目的に適する技術は、前述の参考文献
に記述されるように、当該技術分野において公知であ
る。
【００４０】抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡ
は、公知の方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて、同時に又は別々に作製することができ
る。これは、コンセンサス定常領域プライマーで、ある
いは公開されている重鎖及び軽鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配
列に基づくより特異的なプライマーで開始することがで
きる。
【００４１】抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡク
ローンの単離にＰＣＲを用いることもできる。この場
合、コンセンサスプライマー、又はマウスコンセンサス
領域プローブのようなより大きな同種プローブでライブ
ラリーをスクリーニングすることが可能である。必要な
技術は当該技術分野における熟練者に公知であり、前述
のSambrook及びAusubelの参考文献に説明されており、
かつ以下に述べられる例により説明される。
【００４２】抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡ
は、ＣＤＲを単離する前に、あらゆる適切な宿主のあら
ゆる適切なベクターにおいて増殖させることができる。
以下の例に説明されるように、このクローンは、しばし
ば、この目的のために、大腸菌内で最も都合よく増殖さ
れる。しかしながら、熟練者に公知の他の様々なベクタ
ー及び宿主細胞を本発明のこの側面において有利に用い
ることができる。そのようなベクターの様々なものが前
述の参考文献に説明されている。
【００４３】ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを、
組換えＤＮＡ技術に関連する前述の参考文献に詳細に説
明されている標準の公知技術に従い、細胞から単離し、
制限地図を作製し、かつ配列決定することができる。
【００４４】ベクターにより抗体重鎖及び軽鎖並びにそ
れらの断片をコードするＤＮＡを、キメラ及びＣＤＲを
移植したヒト化ＭＮ１４抗体の構築に用いることができ
る。
【００４５】ＭＮ１４の抗ＣＥＡ ｍＡｂのＣＤＲが本
明細書で同定され、説明され、かつ図１及び図２（それ
ぞれ、配列番号２及び配列番号４）に示されている。こ
れらの配列を用いて、ＭＮ１４重鎖及び軽鎖のＣＤＲを
本発明で用いるために合成することができる。天然資源
からＭＮ１４のＣＤＲを再クローニングする必要はな
い。そのＤＮＡ及びアミノ酸配列は本明細書に示されて
いる。本発明のこの側面に適するオリゴヌクレオチド合
成技術は熟練技術者に公知であり、幾つかの市販されて
いる自動合成器のあらゆるものを用いて行うことができ
る。加えて、本明細書に説明されるＣＤＲをコードする
ＤＮＡは、商業ＤＮＡ合成販売者のサービスにより得る
ことができる。
【００４６】本発明のこの側面によって合成されるポリ
ヌクレオチドには、ＭＮ１４のＣＤＲを構成するものに
加えて、このＣＤＲに由来するものではないものも含ま
れ得る。異種からのＦＲへのこのＣＤＲの結合を容易に
するさらなる塩基を含んでいてもよい。この目的のため
に、制限部位又はオーバーラップした相補的な領域を含
むこともできる。短い重複一本鎖ＤＮＡからの長い二本
鎖ＤＮＡの合成は当該技術分野における熟練者に公知で
ある。同様に、平滑末端ＤＮＡ及び少なくとも部分的に
重複する相補的な末端を有するものを含むＤＮＡの末端
間結合は公知である。これらの技術は、例えば、組換え
ＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に説明されている。
【００４７】また、ＭＮ１４重鎖及び軽鎖のＣＤＲも、
特にはキメラもしくはヒト化抗体に組込んだ後に、クロ
ーニングしたＤＮＡ又はＲＮＡ、もしくは合成ＤＮＡ又
はＲＮＡにおける塩基の削除、挿入及び変更を行うため
の公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、修飾することが可
能である。この目的に適切な部位特異的突然変異誘発技
術は当該技術分野における熟練者に公知であり、組換え
ＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に説明されている。
また、削除及び挿入技術も説明されている。これらの方
法は、例えば、ＭＮ１４のＣＤＲをコードするポリヌク
レオチド又はクローニングした重鎖もしくは軽鎖遺伝子
の他の領域への所望の変更の導入に用いることができ
る。
【００４８】本発明に従い、ＭＮ１４のＣＤＲ及び修飾
ＭＮ１４のＣＤＲをＦＲのあらゆるセットに実用的に導
入することができる。これに関して、ポリヌクレオチド
をクローニングし、操作する様々な公知の技術を効果的
に使用できることを当該技術分野における熟練者は予期
するであろう。このような技術は、前述の組換えＤＮＡ
に関連する参考文献に説明される方法によって示されて
いる。
【００４９】本発明の特に好ましい態様において、ＭＮ
１４のＣＤＲがヒト抗体に移植される。この文脈におい
て、ヒト抗体は、ヒト体内に生じるあらゆる抗体又は、
幾つかの点において、ヒト免疫系と適合し得るように設
計されている加工抗体を指すことは理解されるであろ
う。この目的のためには、広くは、患者において不利な
免疫応答を引き起こすことがない抗体が特に好ましい。
より具体的には、「ヒト抗体」という表現は、ヒト体内
において実際に生じる遺伝子、又はそれらの対立遺伝
子、変種もしくは変異体によってコードされる抗体を意
味することが意図されている。
【００５０】いったんＭＮ１４に由来するＣＤＲを移植
された抗体をコードするＤＮＡが、ＭＮ１４のＶＨ及び
ＶＫ領域ＤＮＡ及び、それらにより形成されるヒト定常
ドメインの軽鎖及び重鎖の各々と結合する可変領域から
構築されると、通常の技術により、それを増殖及び発現
のためのベクターに挿入することが可能である。この方
法で、所望の量の抗体を得ることができる。
【００５１】このＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗
体は、造影化合物又は同位体と結合するこのヒト化抗体
又はそれらのＦａｂ’を被検体に投与することにより、
造影用途に用いることができる。
【００５２】造影のためには、通常の方法を用いて、こ
の抗体を標識に複合する。このような通常の方法には、
１）抗体タンパク質又はそれらの断片の直接放射性ヨウ
素化又は２）抗体又はそれらの断片への金属性核種の直
接付着（例えば、Hansen etal., Cancer, 73: 761 (199
4)を参照）が含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。様々な診断用及び治療用金属の抗体又はそれらの
断片への結合に用いることができる二官能性キレートの
使用も本発明の範囲内にある(Antibodies inRadiodiagn
osis and Therapy, ed. M. R. Zalutsky, 1989, CRC Pr
ess, Boca Raton, FL、及びCancer Therapy with Radio
labeled Antibodies, ed. D. M. Goldenberg, 1994, CR
C Press, Boca Raton, FLを参照）。複合手順及び生成
物の特徴付けに続いて、ヒト患者において使用するため
の診断用組成物の生成に適する優良製造規範(Good Manu
facturing procedures、「ＧＭＰ」）に合致する条件下
において、十分に標識された複合体を均質に精製する。
【００５３】ＭＮ１４のＣＤＲを移植された抗体及びこ
の複合体の造影剤部分との血清抗体の反応は、複合体の
投与の前に得られた対照血清の反応を含めて、その診断
手順の過程の全てにわたって決定することができる。同
様の決定は、ＭＮ１４それ自体の類似の複合体で処置さ
れている他の患者においても行われる。これらの試験に
よって検出される、ＣＤＲを移植されたＭＮ１４ヒト抗
体と反応する血清抗体は、マウスＭＮ１４含有複合体で
処置されている患者において複合体の抗体部分と反応す
る抗体ではほとんどあり得ない。
【００５４】アミノデキストランに、及びホウ素に複合
するヒト化ＭＮ１４抗体は、診断用途に用いることがで
きる。アミノデキストラン−ホウ素付加物に複合するた
めのＭＮ１４及びＣＤＲを移植されたＭＮ１４抗体は、
上に説明されるように調製することができる。アミノデ
キストラン−ホウ素付加物は、適切なホウ素ケージ化合
物（例えば、アミノデキストラン官能基で適切に誘導形
成されている１２−ホウ素炭酸塩）の反応により調製す
ることができる。好ましい態様においては、アミノデキ
ストランを過剰のハロアセチル酸エステル又は（無水ヨ
ード酢酸のような）無水物と反応させ、それにより、通
常、反応条件及びアミノデキストランのサイズに応じて
１０〜１０００基の範囲をとる、所望の数のハロアセチ
ル基を有するアミノデキストランを生成させる。メルカ
プトカルボランＢ１２のような適切なホウ素誘導体を、
所望のモル過剰で、アルキル化反応により、ハロアセチ
ル−アミノデキストランと反応させる。好ましい態様に
おいては、ホウ素化ハロアセチルアミノデキストラン上
の多数のハロアセチル基が未反応のまま残り、この付加
物をタンパク質のチオール基に付着させるための「ハン
ドル」として用いることが可能である。
【００５５】ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体
及びそれらの誘導体は、それらの免疫原性の低下によ
り、治療において、血清疾患もしくはアナフィラキーシ
ョックのような望まれない免疫反応を伴うことのない受
動免疫、上述のような腫瘍の位置測定及びin vivo造
影、活性作用物質の局部濃度が重要な因子である疾患細
胞の特定の処置、例えば、細胞毒、免疫調節剤もしくは
他の薬学的に活性な分子の部位指向性送達等に有用であ
り、それらにより、これらのヒト化抗体の実用上の用途
が確立される。上述のように、in vivo造影のために
は、ヒト化したＣＤＲ移植ＭＮ１４モノクローナル抗体
を放射性標識し、又は放射性核種、例えばヨウ素、イッ
トリウム、テクネチウム等と複合体を形成する金属キレ
ート剤と複合させ、一次及び転移性ＣＥＡ腫瘍の検出に
放射性走査技術を用いることができる。この目的のた
め、この放射性抗体を、例えば静脈内に、注射し、ガン
マ造影機を用いて規則的な間隔で患者を走査する。ＣＥ
Ａを発現する腫瘍は他の組織よりも多くの放射性抗体を
取り込み、造影カメラにより容易に認識される。131Ｉ
で標識されているモノクローナル抗体が、優先的に、体
重ｋｇ当り１５〜３０μＣｉに相当する３〜１０μｇの
量で用いられる。細胞障害作用物質を用いる治療のため
には、この抗体を、ドキソルビシン、メトトレキセー
ト、タキソール、リシンＡ、放射性原子、毒性作用物質
のような様々な既知の治療剤に複合させ、そのような複
合体を薬学的に許容し得る無菌担体中に処方し、その製
剤を通常の手段により投与する。治療上の投与量は、こ
れらの技術分野における平均的な技量を有する利用者に
より、通常通りに、容易に決定することができる。哺乳
動物の治療用量は、患者の状態及び投与様式に応じて、
モノクローナル抗体自体については体重ｋｇ当り約１ｍ
ｇ〜５ｍｇ、細胞障害薬剤との複合体については体重ｋ
ｇ当り０．１ｍｇ〜５ｍｇである。あるいは、ＣＥＡが
存在するガン細胞を被験者から除去するために、このヒ
ト化抗体を、宿主の免疫系の要素、例えば補体系もしく
は細胞介在応答と組み合わせて用いることができる。患
者の免疫応答は、先行する方法により監視することがで
きる。放射性造影及び治療のためのさらなる手順につい
ては、EP 0 323,806号、Hansen et al., Cancer 71: 34
78-85 (1993)、及び米国特許第4,818,709号並びにそれ
らに含まれるを参考文献を参照のこと。これらの全ては
引用することにより本明細書に組込まれる。
【００５６】Remington's Pharmaceutical Sciences, M
ack Publishing Co., Easton, PA,1989に記述されるも
ののような非経口投与のための医薬調製品が好ましい。
最終調製品は、０．０１％〜５０％の活性成分を含有す
る。このような複合体の製造方法及び診断及び治療にお
けるそれらの使用は、例えば、Shih et al., 米国特許
第5,057,313号、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832
(1988)、同時継続中の同一出願人による米国特許出願
第08/162,912号、及びMcKearn et al., 米国特許第5,15
6,840号に示されており、それらの内容は引用すること
により本明細書に組込まれる。
【００５７】上述のように、治療のためには、ヒト化抗
体複合体及び薬学的に許容し得る担体を治療上有効な量
で患者に投与する。投与される量が生理学的に意味のあ
るものである場合、複合体と薬学的に許容し得る担体と
の組み合わせは、「治療上有効な量」で投与されると言
われる。ある作用物質が存在することで、投与される患
者の生理状態に検出可能な変化を生じる場合、その作用
物質は「生理学的に意味がある」。標的とされる治療剤
は、等価の非標的作用物質を全身投与したときに、それ
が投与された用量のより高い割合を目的の標的に送達
し、その標的に付着する場合、「治療上有効」である。
【００５８】治療上有効であるためには、複合体及び担
体は、他の治療剤と組み合わせるか、又はより広範な治
療投薬計画の一部として投与することが必要となること
がある。現在、組み合わせ治療アプローチで用いられる
場合に標的治療剤の効果がしばしば大きく増大し得ると
いう意見が医師らの間にはある。例えば、単独で用いら
れた場合重度の血液毒性を引き起こすＢ細胞リンパ腫の
高用量の放射免疫治療は、自己骨髄再注入と組み合わせ
て用いた場合、非常に効果的であることが示されてい
る。Press et al., “Treatment of Relapsed B Cell L
ymphomas with High Dose Radioimmunotherapy and Bon
e Marrow Transplantation" in CANCER THERAPY WITH R
ADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, ed. (CRC Pres
s, Boca Raton, 1994) ch. 17参照。別の例において
は、腫瘍が予備照射されている場合、腫瘍による放射標
識抗体の取り込みの５倍の増強が観察される。Leichner
et al.,Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14: 103
3 (1987)参照。放射免疫治療の臨床上の効力を改善する
潜在力を有することが示されている機構が、DeNardo et
al., “Overview of Obstacles and Opportunities for
Radioimmunotherapy of Cancer" in CANCER THERAPY W
ITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Ed. (CRC
Press, Boca Raton, 1994) ch. 11にも論じられてい
る。用量制限副作用の研究並びに標的の狙い付け、取り
込み及び有益な副作用の増強及び増幅に加えて、そのよ
うな組み合わせプロトコルを開発する方法はこの分野に
おける熟練臨床技術者に公知であり、開発に過度の実験
を必要としない。
【００５９】診断及び治療剤とのヒト化ＭＮ１４の複合
体を用いるin vivoでの実験は、動物モデル及びヒト患
者で実施されている（以下の例１１を参照）。ＣＤＲを
移植されたヒト化抗体複合体は、良好な治療上のプロフ
ィールを示し、親であるＭＮ１４抗体複合体よりも長い
治療投与計画で用いることが可能であった。ＣＤＲを移
植された抗体複合体は、対照マウス抗体複合体よりも治
療効果が良好であり、有害な副作用が少なかった。
【００６０】例えば、誘導体形成の目的で、上記Shih e
t al.によって記述される方法を用い、炭水化物ヒドロ
キシル基を用いて、この抗体をアミノデキストラン結合
メトトレキセートと共有結合により複合体を形成させ
た。免疫活性に対する抗体炭水化物基の寄与を決定する
ため、哺乳動物細胞において遮断遺伝子が発現する前に
グリコシル化部位、ＮＶＴを導入するように、ｈＭＮ１
４（接頭辞「ｈ」は「ヒト化」を意味することが意図さ
れている）のＶＫ ＦＲ１領域の１８〜２０位に変異を
導入することができる。遮断細胞結合検定におけるｈＭ
Ｎ１４抗体と変異ｈＭＮ１４−ＮＴＶとの比較（図８）
は、１８位の炭水化物部分にはこのヒト化抗体の免疫反
応性に対する影響がないことを示している。
【００６１】平均分子量４０ｋＤａのアミノデキストラ
ンをＮａＩＯ４で酸化して（ヒドロキシル基の酸化によ
り）アルデヒドを形成する。反応条件及びタイミングを
注意深く制御することにより、アミノデキストランのモ
ル当たり約５０〜１５０モルのアルデヒド基が導入され
る。次に、このアルデヒドを過剰の１，３−ジアミノ−
２−ヒドロキシプロパンと反応させ、実質的に全てのア
ルデヒドとシッフ塩基を形成させる。次いで、このシッ
フ塩基を過剰のＮａＢＨ４で処理することにより還元す
る。その後、このアミン誘導デキストランをゲル排除ク
ロマトグラフィーにより精製する。
【００６２】細胞障害性薬剤メトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）は、ジメチルホルムアミド中で、ジシクロカルボジ
アミドで処理し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド
と反応させることにより活性化する。活性化されたＭＴ
Ｘを、水溶液中において、５０：１の比でアミノ誘導デ
キストランと混合する。この生成物から、精製後に、モ
ル当たり約３５ＭＴＸモルを有するＭＴＸ誘導デキスト
ランが得られる。このように得られたＭＴＸ付加物を、
前出のShih et al.に記述される方法を用いて、ＭＮ１
４のＣＤＲを移植された抗体に結合させる。例えば、抗
体の炭水化物を酸化し、得られたアルデヒドを付加物中
のデキストランの残留アミンと反応させる。それにより
得られたシッフ塩基産物を、抗体の１０倍モル過剰のシ
アノホウ水素化ナトリウムで処理することにより還元す
る。この還元抗体−デキストラン−ＭＴＸ産物を検定の
前に完全に精製し、患者に投与するために処方する。
【００６３】対照として、同じ方法で、親ＭＮ１４抗体
をデキストラン−ＭＴＸに結合させる。
【００６４】このＣＤＲを移植された精製した抗体複合
体は、ＣＥＡ産生ガンを有する患者に投与することがで
きる（上を参照）。この治療に対する副作用、特に患者
の免疫系が介在するものを含む応答を監視する。このＣ
ＤＲを移植された抗体複合体で治療した患者は、治療結
果の改善、その作用物質に対する免疫応答の減少及び治
療の免疫介在有害作用の顕著な減少を示す。このＣＤＲ
を移植された抗体複合体を用いる治療は、親マウスＭＮ
１４抗体を用いるものより高い投与量で、かつより長い
期間行うことが可能であり、より積極的な治療と応答の
改善を可能にする。
【００６５】本発明を、以下の説明のための例を参照す
ることによりさらに説明する。ＭＮ−１４軽鎖及び重鎖
遺伝子をコードするＤＮＡクローンの単離に関する技術
が、産生細胞からのあらゆる抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子
の単離に有用なクローニング技術によって説明されるこ
とは、予期されるであろう。配列が開示されているの
で、本発明を実施するためにＭＮ１４重鎖及び軽鎖遺伝
子を再単離する必要はない。
【００６６】この詳細な説明及び具体的な例は、本発明
の好ましい態様を示すものではあるが、説明のためだけ
に示されるものであることは理解されるべきである。こ
れは、本発明の精神及び範囲内にある様々な変更および
変形が、以下の説明のための記述から、当該技術分野に
おける熟練者に明らかとなるためである。
【００６７】実施態様例 以下は、本発明の実施態様例である。 １．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の
相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来の軽鎖の可
変領域及び重鎖の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）の
各々とを含むヒト化モノクローナル抗体またはその断片
であって、該ヒト化抗体は、該親マウスクラスIII抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持するものの、ヒ
ト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体よりも免疫原性が小さく、該親マウスクラス
III抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤ
Ｒが、ＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番号２０）を
含むＣＤＲL1と、ＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番号２１）を
含むＣＤＲL2と、ＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列番号２２）
を含むＣＤＲL3とを含んでなり、該親マウスクラスIII
抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ
が、ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を含むＣＤＲH1と、Ｅ
ＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配列番号２
４）を含むＣＤＲH2と、ＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡＹ（配列
番号２５）を含むＣＤＲH3とを含んでなることを特徴と
するヒト化モノクローナル抗体またはその断片。
【００６８】２．（ａ）軽鎖可変領域が、式 ＦＲL1−ＣＤＲL1−ＦＲL2−ＣＤＲL2−ＦＲL3−ＣＤＲ
L3−ＦＲL4 （ここで、ＦＲの各々はヒト抗体のフレームワーク領域
であり、ＣＤＲの各々は該親マウスクラスIII抗ＣＥＡ
モノクローナル抗体の軽鎖の相補性決定領域である。）
により特徴付けられ、（ｂ）重鎖可変領域が、式 ＦＲH1−ＣＤＲH1−ＦＲH2−ＣＤＲH2−ＦＲH3−ＣＤＲ
H3−ＦＲH4 （ここで、ＦＲの各々は、ヒト抗体のフレームワーク領
域であり、ＣＤＲの各々は親マウスクラスIII抗ＣＥＡ
モノクローナル抗体の重鎖の相補性決定領域である。）
により特徴付けられるパラグラフ１に記載のヒト化モノ
クローナル抗体。
【００６９】３．ＦＲL1が、ヒト抗体のＦＲL1に天然に
生じる約２３個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲL2が、ヒ
ト抗体のＦＲL2に天然に生じる約１５個のアミノ酸の領
域を含み、ＦＲL3が、ヒト抗体のＦＲL3に天然に生じる
約３２個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲL4が、ヒト抗体
のＦＲL4に天然に生じる約１０個のアミノ酸の領域を含
み、ＦＲH1が、ヒト抗体のＦＲH1に天然に生じる約２８
〜３２個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲH2が、ヒト抗体
のＦＲH2に天然に生じる約２８〜３２個のアミノ酸の領
域を含み、ＦＲH3が、ヒト抗体のＦＲH3に天然に生じる
約３０〜３４個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲH4が、ヒ
ト抗体のＦＲH4に天然に生じる約９〜１３個のアミノ酸
の領域を含むことを特徴とするパラグラフ２に記載のヒ
ト化モノクローナル抗体。
【００７０】４．ＦＲL1のアミノ酸配列が、DIQLT QSPS
S LSASV GDRVT ITC（配列番号２６）であり、ＦＲL2の
アミノ酸配列が、WYQQK PGKAP KLLIY（配列番号２７）
であり、ＦＲL3のアミノ酸配列が、GVP(S又はD)R FSGS
(G又はV) SGTDF TFTIS SLQPE DIATY YC（配列番号２
８）であり、ＦＲL4のアミノ酸配列が、FGQGT KVIEK
（配列番号２９）であり、ＦＲH1のアミノ酸配列が、EV
QLV ESGGG VVQPG RSLRL SCSSS GFDFT（配列番号３
０）、EVQLV ESGGG VVQPG RSLRL SCSAS GFDFT（配列番
号３１）又はQVQLQ ESGPG LVRPS QTLSL TCTSS GFDFT
（配列番号３２）であり、ＦＲH2のアミノ酸配列が、WV
RQA PGKGL EWVA（配列番号３３）、WVRQA PGKGLEWIA
（配列番号３４）又はWVRQP PGRGL EWIA（配列番号３
５）であり、ＦＲH3のアミノ酸配列が、RFTIS RDNSK NT
LFL QMDSL RPEDT GVYFC AS（配列番号３６）、RFTIS RD
NAK NTLFL QMDSL RPEDT GVYFC AS（配列番号３７）又は
RVTML RDTSK NGSFL RLSSV TAADT AVYYC AS（配列番号３
８）であり、ＦＲH4のアミノ酸配列が、WGQGT PVTVS S
（配列番号３９）又はWGQGT TVTVS S（配列番号４０）
である（ここで、Ｃはスルフィドリル型又はジスルフィ
ド型であってもよい）パラグラフ３に記載のヒト化モノ
クローナル抗体。
【００７１】５．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体又はその断片の軽鎖可変領域のＣＤＲを含ん
でなるヒト化抗体軽鎖又はその断片であって、該ＣＤＲ
が、KASQD VGTSV A（配列番号２０）を含むＣＤＲ
L1と、WTSTR HT（配列番号２１）を含むＣＤＲL2と、QQ
YSL YRS（配列番号２３）を含むＣＤＲL3とを含んでな
ることを特徴とするヒト化抗体軽鎖又はその断片。
【００７２】６．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体又はその断片の重鎖可変領域のＣＤＲを含ん
でなるヒト化抗体重鎖又はその断片であって、該ＣＤＲ
が、TYWMS（配列番号２３）を含むＣＤＲH1と、EIHPD S
STIN YAPSL KD（配列番号２４）を含むＣＤＲH2と、LYF
GF PWFAY（配列番号２５）を含むＣＤＲH3とを含んでな
ることを特徴とするヒト化抗体重鎖又はその断片。
【００７３】７．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と、ヒト抗
体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とを含んでなるキメ
ラモノクローナル抗体又はその断片であって、該キメラ
抗体は、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル
抗体の特異性を保持しつつ、ヒト患者において該親マウ
スクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免疫原
性が小さく、該キメラモノクローナル抗体が、配列番号
４の軽鎖可変領域と、配列番号２の重鎖可変領域とを含
んでなることを特徴とするキメラモノクローナル抗体ま
たはその断片。
【００７４】８．配列番号４を含むマウスクラスIII抗
ＣＥＡ抗体軽鎖又はその断片。 ９．配列番号２を含むマウスクラスIII抗ＣＥＡ抗体重
鎖又はその断片。
【００７５】１０．該マウスクラスIII抗ＣＥＡモノク
ローナル抗体が、ＭＮ１４モノクローナル抗体であるこ
とを特徴とするパラグラフ１〜９のいずれか一に記載の
モノクローナル抗体、軽鎖、又は重鎖。
【００７６】１１．該断片が、F(ab')2 or Fab'である
パラグラフ１〜４又は７のいずれか一に記載のモノクロ
ーナル抗体又はその断片。 １２．ガン患者の治療に使用するためのパラグラフ１〜
４、７、１０又は１１の何れかに記載のモノクローナル
抗体又はその断片。 １３．ガン患者の治療に使用するためのパラグラフ１２
に記載のモノクローナル抗体又はその断片と治療物質と
の治療用組み合わせ物。
【００７７】１４．ガン患者の診断又は治療に使用する
ための、パラグラフ１〜４、７、１０又は１１に記載の
モノクローナル抗体又はその断片に結合している診断物
質又は治療物質を含んでなる複合体。
【００７８】１５．該治療物質が細胞障害剤を含むこと
を特徴とする、パラグラフ１２に記載のモノクローナル
抗体又はその断片、パラグラフ１３に記載の治療用組み
合わせ物、又はパラグラフ１４に記載の複合体。
【００７９】１６．該細胞傷害剤が、ドキソルビシン、
メソトレキセート、タキソール、リシンＡ、又は放射性
核種であることを特徴とする、パラグラフ１５に記載の
モノクローナル抗体、治療用組み合わせ物又は複合体。 １７．該放射性核種が131Ｉであることを特徴とする、
パラグラフ１６に記載のモノクローナル抗体、治療用組
み合わせ物、又は複合体。
【００８０】１８．該治療物質が免疫調節剤であること
を特徴とする、パラグラフ１２のモノクローナル抗体又
はその断片、パラグラフ１３の治療用組み合わせ物、又
はパラグラフ１４の複合体。 １９．該治療物質が、ガン患者の治療に使用するための
治療物質と結合しているパラグラフ１４の複合体である
ことを特徴とするパラグラフ１３の治療用組み合わせ
物。
【００８１】２０．該治療物質が、ガン患者の診断に使
用するためのイメージング剤を含むことを特徴とするパ
ラグラフ１４の複合体。 ２１．該イメージング剤が、放射性核種であることを特
徴とするパラグラフ２０の複合体。
【００８２】２２． パラグラフ１〜１１のいずれか一
に記載のモノクローナル抗体、軽鎖、又は重鎖をコード
する単離ＤＮＡ。 ２３．パラグラフ２２のＤＮＡ配列を発現するためのベ
クター。 ２４．パラグラフ２２のＤＮＡ配列を発現する形質転換
した細胞。
【００８３】２５．パラグラフ２０の形質転換した細胞
を培養して、モノクローナル抗体、軽鎖又は重鎖を生成
するステップを含む、パラグラフ１〜１１のいずれか一
に記載のモノクローナル抗体、軽鎖、又は重鎖を発現す
るための方法。
【００８４】
【実施例】例１抗体産生細胞の培養 上記Hansen et al. (1993)及び上記Primus et al. (198
3)に従い、クラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
産性するマウス／マウスハイブリドーマ細胞系を確立し
た。
【００８５】標準イソタイプ決定技術を用いて調整培地
(conditioned medium)を試験することにより、κＩｇＧ
１の分泌について細胞を選択した。このための様々なキ
ットが市販されている。これらの細胞を、上述の標準遮
断検定を用いて調整培地を試験することにより、抗体の
産生についてスクリーニングした。この検定において確
認された産生細胞のストックを増殖させ、液体窒素中で
凍結した。
【００８６】例２産生細胞系からのＲＮＡの単離 ＭＮ１４産生細胞を培養で増殖させ、遠心によって集め
て洗浄した。全ＲＮＡを、このペレットの細胞から、Fa
valoro et al., Methods in Enzymology 65: 718 (198
0)及びOrlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA
86: 3833 (1989)に従って単離した。これらは、参照す
ることにより組込まれる。
【００８７】例３ｃＤＮＡ合成及び重鎖可変領域の増幅 ＭＮ１４産生細胞からのｍＲＮＡを、以下に記述される
ように、ｃＤＮＡ合成の標準技術を用いるｃＤＮＡ合成
及びＰＣＲによるＤＮＡ増幅に用いた。一般には、ＰＣ
Ｒに用いられるプライマーは、増幅産物のクローニング
を容易にするため、それらの５’末端に制限エンドヌク
レアーゼ切断部位を有していた。マウスＩｇＧ１重鎖の
第１の定常領域ドメイン（「ＣＨ１」）をコードするＤ
ＮＡのセンス鎖の末端に相補的なオリゴヌクレオチド
を、逆転写酵素による第１鎖ｃＤＮＡ合成の誘発に用い
た。このプライマーの配列、ＣＧ１ＦＯＲ、を表１に示
す。下記表１には、本明細書で用いられる他のオリゴヌ
クレオチド配列も示される。
【００８８】
【表１】
【００８９】クローニングを容易にするためにプライマ
ーに組込まれている制限部位には下線が付されている。
【００９０】次に、重鎖（「ＶＨ」）ｃＤＮＡの可変領
域を、上に引用されるOrlandi et al. (1989)に記述さ
れるように、ＰＣＲにより、同じプライマー、ＣＧ１Ｆ
ＯＲ、及びＶＨ遺伝子の５’末端のコンセンサス配列に
基づくプライマー（ＶＨ１ＢＡＣＫ）を用いて増幅し
た。この反応のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に
より分析した。これにより、エチジウムブロマイド染色
及び蛍光照明で、期待通り約４００ｂｐの１つの主要バ
ンドが明らかになった。
【００９１】第２のｃＤＮＡ調製品からの配列を確かめ
るため、ＰＣＲにおいてシグナル配列プライマーを用い
てＮ末端の真正アミノ酸の決定を可能にした。重鎖シグ
ナル配列コード領域に基づく分解オリゴヌクレオチドで
あるＳＨ１ＢＡＣＫ及びＳＨ２ＢＡＣＫを、ＣＧ１ＦＯ
Ｒに関連する別々の反応に用いた。ＣＧ１ＦＯＲ、ＳＨ
１ＢＡＣＫ増幅から拡散産物バンドが得られた。
【００９２】この産物のＶＨ含量を増大させるため、こ
れを低融点アガロースから切り出し、ＳＨ１ＢＡＣＫ及
び第４のフレームワーク領域コンセンサス配列に相補的
なオリゴヌクレオチド、ＶＨ１ＦＯＲ、を用いて増幅し
た。この反応の産物は、アガロースゲル電気泳動で分析
した場合、別のバンドであった。
【００９３】例４ＰＣＲにより得られた、ＭＮ１４重鎖可変領域をコード
するＤＮＡのクローニング及び配列決定 ＣＧ１ＦＯＲ、ＶＨ１ＢＡＣＫプライマー対を用いて得
られた増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで別々に
消化した。これらの酵素の開裂部位はこれらのＰＣＲプ
ライマーに含まれる。このＶＨ内部にも部位があるのか
どうかを決定することが好ましかった。この制限断片の
アガロースゲル分析は、このＤＮＡの一端に近接する内
部ＰｓｔＩ部位の存在を示した。このＰＣＲ産物をＨｉ
ｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ｍ１３ｍｐ１８及び
Ｍ１３ｍｐ１９にクローニングして、それぞれのクロー
ンの挿入断片（インサート）のＤＮＡ配列を決定した。
大部分のクローンが同じＶＨのＤＮＡの挿入断片を有し
ていた。
【００９４】この配列決定により、このさらなる予期せ
ざるＰｓｔＩ部位の存在が確認された。この部位は、Ｖ
Ｈの最後の２つのアミノ酸を部分的にコードするＣＧ１
ＦＯＲプライマーの配列の３’末端に近接していた。こ
の方法により幾つかの完全長ＶＨクローンが得られた
が、さらなるＰＣＲ産物ＤＮＡをＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断
片としてクローニングした。このため、これらのクロー
ンは完全ＶＨ配列は有するが、ＣＧ１ＦＯＲによって与
えられる定常領域は有していなかった。ＶＫ１ＢＡＣ
Ｋ、ＣＧ１ＦＯＲ産物から、合計１６の完全長クローン
が得られた。これらの実験において、分析されたクロー
ンの約２５％がＶＨ領域と無関係の挿入断片を有してい
た。
【００９５】第２のｃＤＮＡ調製品からのＶＨ配列を確
認し、同時に、このＶＨのＮ末端に対応する、プライマ
ーが指定するものではない本当のＤＮＡ配列を得るた
め、ＶＨ１ＦＯＲ及びＳＨ１ＢＡＣＫプライマーからの
ＰＣＲ産物をクローニングした。これらのプライマー
は、上述のＣＧ１ＦＯＲ及びＶＨ１ＢＡＣＫのＰｓｔＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩ部位ではなく、ＢｓｔＥＩＩ及びＥ
ｃｏＲＩ制限部位を有する。この反応のＰＣＲ産物を、
ＢｓｔＥＩＩで消化し、このＢｓｔＥＩＩ末端を埋め、
ＥｃｏＲＩで消化し、このＥｃｏＲＩ及び平滑末端をＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩで消化されているベクターに
連結することによりクローニングした。このクローニン
グ断片の配列を決定した。このＶＨ断片の収量は比較的
少なかった。これは、おそらく、ＳＨ１ＢＡＣＫの縮重
によって引き起こされるＰＣＲにおける特異性の欠如を
反映している。しかしながら、配列決定された１８のク
ローンのうちの４つは、以前に配列決定されている通り
のＭＮ１４のＶＨ領域をコードするＤＮＡを有してい
た。他の挿入断片はＶＨをコードしているＤＮＡ由来で
はなかった。
【００９６】全部で、２０の完全長ＭＮ１４のＶＨクロ
ーンが得られた。これらのＭＮ１４のＶＨ領域クローン
における配列の中で、５つの一過性変異が観察された。
これらの変異は、増幅の間に、Ｔａｑポリメラーゼによ
る誤った取り込みの結果として導入されたもののようで
ある。
【００９７】例５ＭＮ１４の重鎖可変領域のアミノ酸配列の分析 ＶＨのＤＮＡ配列から翻訳されたマウスＭＮ１４重鎖可
変領域のアミノ酸配列を図１に示す（配列番号１及び配
列番号２）。この配列とマウスＶＨサブグループを表す
配列との比較は、ＭＮ１４の重鎖可変領域がサブグルー
プIIIＢ（Kabatet al. SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMU
NOLOGICAL INTEREST, U. S. GovernmentPrinting Offic
e, 1987を参照）に属することを示した。
【００９８】ＭＮ１４のＣＤＲの配列は、前出のKabat
et al.(1987)によって報告されているいかなるものとも
異なる。さらに、ＭＮ１４重鎖ＶＨフレームワーク領域
の４つの位置のアミノ酸が、他のサブグループIIIＢの
ＶＨ配列のフレームワーク領域のものとは異なる。これ
らの４つの置換（Ｓｅｒ１４、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ９４
及びＰｒｏ１０８）は、IIIＢ ＶＨサブグループ以外
の他のマウスＶＨ領域において観察されているが、Kaba
tの１０８位のプロリンが最も異例である。
【００９９】ＶＨ又はＶＫにおけるあらゆる異例の残基
は、マウスＭＮ１４の結合に有利であることが立証され
ている体細胞変異を表すことがある。
【０１００】例６ｃＤＮＡ合成及びＭＮ１４ ＶＫをコードするＤＮＡの
増幅 ＭＮ１４のκ軽鎖をコードするｃＤＮＡを、上述の重鎖
の可変領域をコードするｃＤＮＡと同様の方法でクロー
ニングした。κ鎖ｃＤＮＡの第１鎖を合成するための逆
転写酵素を誘発するのに、幾つかのプライマーを用い
た。プライマーの１つであるＣＫ２ＦＯＲの配列は、κ
軽鎖遺伝子の定常領域（「ＣＫ」）の５’末端の配列か
ら誘導した。他の２つのプライマー、ＶＫ１ＦＯＲ及び
ＶＫ３ＦＯＲ、の配列は、κ軽鎖遺伝子の可変領域
（「ＶＫ」）の３’末端の配列をベースとした。
【０１０１】第１鎖ＤＮＡ産物を、ＰＣＲにより、多く
のプライマー対を用いて増幅した。一方向への合成を第
１鎖の作製に用いたプライマーにより誘発した。もう一
方の、「逆」方向への重合は、ＶＫ領域の５’末端の配
列であるＶＫ１ＢＡＣＫ、ＶＫ２ＢＡＣＫ、ＶＫ３ＢＡ
ＣＫ、ＶＫ４ＢＡＣＫ及びＶＫ８ＢＡＣＫ、又はシグナ
ルペプチドの最後の４つのアミノ酸及び可変領域の最初
の４つのアミノ酸をコードする配列であるＶＫ５ＢＡＣ
Ｋ、ＶＫ６ＢＡＣＫ及びＶＫ７ＢＡＣＫのいずれかに基
づく配列を有する一連のκ軽鎖特異的プライマーで開始
した。加えて、ＣＫ２ＦＯＲで誘発したｃＤＮＡも、Ｖ
Ｋ１ＦＯＲ及びＶＫ８ＢＡＣＫを用いて増幅した。
【０１０２】これらの増幅産物を、上記の例に記述され
ている方法で、ゲル電気泳動により分析した。ＶＫ１Ｂ
ＡＣＫ、ＶＫ３ＢＡＣＫ、ＶＫ５ＢＡＣＫ、ＶＫ７ＢＡ
ＣＫ及びＶＫ８ＢＡＣＫで誘発する反応からの生成物
が、期待通りの３５０ｂｐのバンドを生じた。
【０１０３】例７ＰＣＲによって得られたＭＮ１４κ軽鎖可変領域のクロ
ーニング及び配列決定 選択されたＰＣＲ産物を、上記例４においてＶＨについ
て説明されているのと同様の様式で増幅プライマーに含
まれる制限部位を用いて、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍ
ｐ１９にクローニングした。ヌクレオチド配列決定によ
り、大部分の挿入断片がＶＫ関連ではなかったことが明
らかとなった。これは、ＶＫのｃＤＮＡのクローニング
を試みる場合、異例のことではなく、ＶＨ特異的プライ
マーよりもＶＫ特異的プライマーを設計することが困難
であるように思われる。
【０１０４】ＶＫ１ＦＯＲ／ＶＫ８ＢＡＣＫの組み合わ
せからＶＫのｃＤＮＡ挿入断片が得られたが、ＣＤＲL3
をコードするｃＤＮＡ内でのフレームシフト及び２３位
に不変Ｃｙｓが存在しないことにより、これは機能的な
ＶＫを生じなかった。このＶＫのｃＤＮＡは他のハイブ
リドーマから単離されており、これはＳｐ２／０融合パ
ートナーに由来する。ＣＫ２／ＶＫ１ＢＡＣＫ産物は、
この場合フレームワーク４の保存残基を欠く、さらなる
４つの異なる異常ＶＫ ｃＤＮＡ挿入断片を生じた。こ
のプライマー対を用いて得られた５０のＶＫ挿入断片
は、明らかにこのプライマーのミスマッチが誘発するず
れによる現象であるＶＫ１ＢＡＣＫの３’末端でのフレ
ーム移動を除いて、機能的ＶＫのものであった。この問
題は、ＶＫ遺伝子までは伸長しないＶＫ８ＢＡＣＫを用
いることにより、回避することができる。しかしなが
ら、ＶＫ１ＦＯＲ／ＶＫ８ＢＡＣＫ産物からのさらなる
クローンの分析は所望の挿入断片を生じなかった。
【０１０５】推定ＶＫを優先的に増幅するため、その真
正第４フレームワーク配列からＶＫ３ＦＯＲを設計し、
ＶＫ１ＦＯＲの代替物として合成した。ＶＫ３ＦＯＲ及
びＶＫ８ＢＡＣＫを用いるＶＫ３ＦＯＲ誘発ｃＤＮＡの
増幅により所望のＶＫを含む４つのクローンが生じ、こ
の戦略は成功した。
【０１０６】マウスＭＮ１４κ軽鎖可変領域のＤＮＡ及
びアミノ酸配列が図２に示されている（配列番号３及び
配列番号４）。このＭＮ１４のＶＫは、KabatのＶＫサ
ブグループＶに位置し得る。このＭＮ１４ ＶＫフレー
ムワーク領域の僅か３つの残基（Ｍｅｔ１０、Ｖａｌ６
６及びＴｈｒ７６）だけがこのサブグループの他のメン
バーに現れない。Ｍｅｔ１０及びＶａｌ６６がこの３つ
のうちで最も異例である。これらは、Kabatに列挙され
ているマウスＶＫのいかなるものにも見出されない。こ
れらのＭＮ１４のＶＫのＣＤＲには、Kabatにおいて以
前報告されている配列はない。
【０１０７】例８ヒト抗体の可変領域へのＭＮ１４のＶＨ及びＶＫのＣＤ
Ｒの移植 ８．１ キメラ抗体発現ベクターの構築 マウス可変領域及びヒト定常領域からなるキメラ抗体の
生成において、親マウス抗体と一緒に試験することは、
正しい可変領域ｃＤＮＡが単離されていることをチェッ
クするのに役立った。また、成功したキメラ抗体は、ヒ
ト化されたものの結合を評価する際、有用な対照として
も機能する。発現のための可変領域のクローニングにお
いて用いられた配列は前出のOrlandi et al. (1989)に
記述されており、図３及び４に示されている。
【０１０８】ＶＨのＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＶＨ
１ＢＡＣＫ及びＶＨ１ＦＯＲを使用するＰＣＲを用い
て、Ｍ１３クローンＭＮＶＨ４１から増幅した。これら
のプライマー中のＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限部位
は、発現のための正しい背景の下で、Ｍ１３ＶＨＰＣＲ
１にＶＨが挿入されることを可能にする。この時点で、
ＶＨの内部ＢａｍＨＩ制限部位を部位指向性突然変異に
より除去した。Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１のＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ断片全体を包含するこの反応生成物をｐＳＶ
ｇｐｔにクローニングし、ＶＨ配列を確認した。
【０１０９】その後、上記Takahashi et al., Cell, 2
9: 671-679 (1962)によって公開されているヒトＩｇＧ
１定常領域遺伝子をこの構築物にＢａｍＨＩ断片として
加え、これにより、ｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕ
ＩｇＧ１と呼ばれるベクターを得た。
【０１１０】同様に、 プライマーＶＫ８ＢＡＣＫ及び
ＶＫ３ＦＯＲ並びにＭ１３ＶＫＰＣＲ１にクローニング
されているＰｖｕＩＩ、ＢｇｌＩＩ消化産物を用いるＰ
ＣＲ増幅より、Ｍ１３クローンＭＮＶＫ１５４からＶＫ
ＤＮＡを得、それにより可変領域の配列をチェックし
た。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＲＦのＤＮＡか
ら切り出し、プラスミドｐＳＶｈｙｇに移した。この構
築物は、Hieter et al., Cell, 22: 197-207 (1980)に
記述されるように、既にヒトκ定常領域遺伝子を有す
る。このようにして得られた最終ベクターはｐＳＶｈｙ
ｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨｕＣＫと名付けられた。
【０１１１】８．２ ハイブリッド抗体の発現及び試験 Ｍ１３ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片をプラスミドｐＳＶｇｐｔに挿入し、発現ベク
ターｐＳＶｇｐｔＫＬＨｕＡＩＧＡＨｕＩｇＧ１を得
た。同様に、Ｍ１３ＨｕＶＫのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片をプラスミドｐＳＶｈｙｇに挿入し、発現ベク
ターｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＲＥＩＨｕＶＫＨｕＣＫを得
た。約５μｇのｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇ
Ｇ１及び１０μｇのｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨｕ
ＣＫ ＤＮＡをＰｖｕｌで直鎖状にして、１７０Ｖ、９
６０μＦのシングルパルスのＢｉｏＲａｄモデル１６５
ＢＲ１１６０ジーン・パルサー・エレクトロポレーター
(Gene Pulser Electroporator)を通常通り用いるエレク
トロポレーションにより、約１０７個の半集密ＳＰ２／
０ミエローマ細胞に移した。２４ウェルプレートにおい
て、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ成長培地にマイコフェノー
ル酸及びキサンチンを添加することにより、ｇｐｔ遺伝
子の発現について細胞を選択した。
【０１１２】生存細胞のコロニーを含むウェルを同定し
た。その培地上清をこれらのウェルから取り除き、ヒト
抗体について検定した。抗体を分泌するコロニーを増殖
させ、より多量の抗体を単離するため０．５Ｌの調整培
地を得た。
【０１１３】通常通り、最初に、プロテインＡアガロー
スアフィニティクロマトグラフィーにより、この培地か
ら抗体を精製した。精製した抗体を、未変性ＭＮ１４抗
体、ヒト抗体及び他の対照を参照して、さらに特徴付け
た。
【０１１４】また、この抗体を、ＭＮ１４遮断検定にお
けるその反応プロフィールによっても特徴付けた。これ
により、このハイブリッド抗体のＣＥＡ結合親和性と、
ポジティブコントロールとして役に立つＭＮ１４マウス
抗体によるＣＥＡ結合とによって、情報を提示する比較
が得られた。
【０１１５】８．３ ＭＮ１４抗体のヒト化 ヒトＮＥＷＭ ＶＨ、ＫＯＬ ＶＨ及びＲＥＩ ＶＫフ
レームワークがヒト体内で寛容性であるように思われる
ため、それらを抗体の再構成のための基礎として選択し
た。ＭＮ１４のＶＨ（配列番号２）及びＶＫ（配列番号
４）とこれらのヒト可変領域とを並べたものを図５に示
す（配列番号５〜７）。
【０１１６】Ａ．ＮＥＷＭベースのヒト化 ＭＮ１４のＣＤＲを導入するための開始点は、必須ＦＲ
及び無関係のＣＤＲをコードするＤＮＡである。これら
のテンプレートの可変領域は、用いられる発現ベクター
に適合する形態、すなわち、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片中にあり、本明細書にはプロモーター領域、シグ
ナルペプチド及びイントロンＤＮＡも含まれる（図３及
び図４）。ＮＥＷＭ ＶＨでのものについては、このテ
ンプレートはＭ１３ＶＨＰＣＲ１（上記Orlandi et a
l.、及び下記８．３項）である。ＫＯＬ ＦＲ及び無関
係のＣＤＲを含む、このテンプレートの誘導体を、ＫＯ
Ｌコード領域の生成に用いた。Ｍ１３ＶＫＰＣＲ１（上
記Orlandi et al.）の誘導体をＨｕＶＫベクターの作製
において用いた。得られたベクターを、Ｍ１３ＮＭＨｕ
ＶＨ、Ｍ１３ＫＬＨｕＶＨ及びＭ１３ＨｕＶＫと名付け
た。ヒト化ＭＮ１４可変領域ＤＮＡを有するＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、本質的に例８．１においてキ
メラＭＮ１４発現ベクターの構築について記述される通
りに、これらのＭ１３ベクターから発現ベクターに移し
た。
【０１１７】ＮＥＷＭ ＦＲは、Poljak et al. Bioche
mistry 16: 3412-20 (1977)に説明されている。そのマ
ウス等価物のものに匹敵する、ＣＥＡに対する親和性を
有するｈＭＮ１４の構築を、段階的なアプローチで達成
した。キメラ抗体の生成は、ヒト化されたものの結合を
評価する場合に、有用な対照を提供する。ヒトＮＥＷＭ
ＶＨ及びＲＥＩ ＶＫフレームワークを抗体を再構成
するための基礎として最初に選択した。これは、これら
がヒト体内において寛容性であることが知られているた
めである。ＭＮ１４の残基Ｐｈｅ２７、Ａｓｐ２８及び
Ｔｈｒ３０は保持した。これは、Ｋａｂａｔの超可変領
域であるＣＤＲ１残基３１〜３５の一部ではないもの
の、それらのアミノ酸がＣＤＲ１構造ループ(Chothia e
t al., J.Mol. Biol. 176: 901-917 (1987))の一部であ
るためである。加えて、以下の理由により、ヒト化ＶＨ
への組込みのために次の残基も選択した。すなわち、Ａ
ｌａ２４、この残基はＣＤＲ１に接触する。Ａｒｇ７
１、この残基の側鎖はこのドメインの中心を通して突き
出し、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２と相互作用する。ほんの少
しのＶａｌの置換はこれらのＣＤＲループの立体配座を
変更し得る。ならびに、Ｓｅｒ９４、大部分の抗体はこ
の位置にＡｒｇを有しており、そこではＣＤＲ３のＡｓ
ｐ残基と相互作用するものと考えられ、ＮＥＷＭがＡｒ
ｇを含むとマウスＣＤＲとの望ましくない相互作用を形
成することがあり得るという理由である。他の再構成分
子において重要であることが立証されている領域に相当
する３つの領域において、このバージョン（ＮＭＨｕＶ
Ｈ）に対する他の変更がなされた。これらの変更は以下
のものであった。
【０１１８】（ｉ）Ｇｌｎ７７Ｐｈｅ７８Ｓｅｒ７９か
らＴｈｒＬｅｕＴｙｒ（ＮＭＨｕＶｈＨＴＬＹ、配列番
号９） （ｉｉ）Ｓｅｒ８２Ｔｈｒ８３Ａｌａ８４Ａｌａ８５か
らＬｙｓＡｒｇＳｅｒＧｌｕ（ＮＭＨｕＶｈＨＫＲＳ
Ｅ、配列番号１０） （ｉｉｉ）Ａｒｇ６６Ｖａｌ６７Ｔｈｒ６８Ｍｅｔ６９
Ｌｅｕ７０からＬｙｓＰｈｅＩｌｅＶａｌＳｅｒ（ＮＭ
ＨｕＶｈＫＦＩＶＳ、配列番号１１）
【０１１９】このＮＥＷＭ ＶＨフレームワークの異な
るバージョン（配列番号５及び８〜１１）とＭＮ１４
ＶＨ（配列番号２）とのアラインメントを図６に示す。
これらのバージョンの各々は、同じＨｕＶＫと対を形成
している。ＴＬＹ又はＫＦＩＶＳモチーフのいずれかを
含むことにより、約２倍の改善が得られた。
【０１２０】上記Kabat et al.(1987)に示されているＮ
ＥＷＮフレームワーク配列とは２つの相違がある。すな
わち、Ｓ１０７からＴ及びＬ１０８からＴ。Kabatは、
残基１をＰＣＡとして、かつ残基５及び６をＥ又はＱと
して列挙している。
【０１２１】Ｂ．ＫＯＬベースのヒト化 ＮＥＷＭ ＶＨの使用と平行して、我々はヒトＫＯＬ
ＶＨも再構成している。ＫＯＬ ＶＨは、Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｚ．ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３
６４：７１３−７４７（１９８７）に説明されている。
抗体のヒト化に用いられたＦＲはＫａｂａｔに示される
ものと同様である。このＫＯＬベースのＶＨの本来のバ
ージョンは、残基の可変性の観点で定義される（上記Ka
bat et al.）、ＭＮ１４のＣＤＲ及び３つのさらなるマ
ウス残基を有していた。ＮＥＷＭＶＨを用いた場合と同
様に、これらの置換のうちの２つが生じた。これは、β
シートフレームワークから伸びる実際のペプチドＣＤＲ
１構造ループが残基２５〜３２からなる（上記Chothia
et al. 1987）ためである。２８位及び３０位での変更
は、このループが全体としてマウス抗体から移植される
のを可能にする。ＫＯＬ ＶＨのＡｒｇ残基がＡｓｐ１
１０との塩架橋に関与し、ＮＥＷＭ ＶＨを用いた場合
と同様に、Ａｒｇ９４の保持がＭＮ１４のＣＤＲ３構造
を撹乱することがあるように思われたため、ＭＮ１４残
基９４が含められた。残基９４の側鎖はＣＤＲ１の残基
とも相互作用し得る。この基本ＭＮ１４ ＫＯＬＨｕＶ
Ｈ（配列番号１２）に対してなされた他の変更は以下の
通りである。
【０１２２】（ｉ）Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４及びＶａ
ｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧｌｙ（ＫＬＨｕＶｈＡＩ
Ｇ、配列番号１３）。 （ｉｉ）Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４、Ｖａｌ４８Ａｌａ
４９からＩｌｅＧｌｙ、及びＳｅｒ７４からＡｌａ（Ｋ
ＬＨｕＶｈＡＩＧＡ、配列番号１４）。 （ｉｉｉ）Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４、Ｖａｌ４８Ａｌ
ａ４９からＩｌｅＧｌｙ、Ｓｅｒ７４からＡｌａ及びＰ
ｈｅ７９からＴｙｒ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧＡＹ、配列番
号１５）。
【０１２３】変異の論理的説明 Ａｌａ２４−ＣＤＲ１のループは、残基２９の側鎖のフ
レームワークへの浸透によって固定されている。残基２
４は、それが相互作用するものの１つである(Chothia e
t al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992))。
【０１２４】Ｉｌｅ４８Ｇｌｙ４９−これらの残基の両
者はＣＤＲ２超可変領域に隣接するものの、実際の構造
ループからはかけ離れている。両残基は完全に埋もれて
おり(Padlan, Mol. Immunolog. 28: 489-498, 199
1)、これらがそれらのパッキング相互作用により結合を
行うことが可能であるように思われた。
【０１２５】Ａｌａ７４−この残基はＶＨ抗原結合表面
に見出される第４ループの一部であり、その側鎖は溶媒
にほとんど完全に露出している（上記Padlan、1991）。
この残基と抗原との直接相互作用を予想することができ
た。
【０１２６】Ｔｙｒ７９−残基７４と同様に、この残基
は抗原結合部位に近接し、結合を行うことが可能であ
る。
【０１２７】ＫＯＬ ＶＨフレームワークの異なるバー
ジョン（配列番号７及び１２〜１５）とＮＥＷＭベース
のバージョン（配列番号５及び８〜１１）及びマウスＭ
Ｎ１４（配列番号２）のアラインメントを図６に示す。
【０１２８】ＭＮ１４ＨｕＶＨ及びＭＮ１４ＨｕＶＬの
ＤＮＡ配列及び翻訳産物をそれぞれ図７及び８に示す
（それぞれ、配列番号１６〜１９）。
【０１２９】抗体ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫのよ
うなヒト化ＫＬＨｕＶＨの変種を精製し、以下のように
遮断検定において試験を行った。抗体を、指定された濃
度で、ＨＲＰ標識ＭＮ１４と共に添加し、最終容積０．
１ｍｌとした。３７℃で３０分間インキュベートし、洗
浄して未結合の抗体を除去した後、残留結合ペルオキシ
ダーゼ活性から抗体の相対親和力を決定した。図９の検
定データによって示されるように、「再構成」（すなわ
ち、ＦＲにＣＤＲが移植されている）ヒト化抗体の活性
は、キメラ及びマウス陽性対照のものと同等であった。
【０１３０】ＫＬＨｕＶＨＡＩＧ／ＨｕＶＫ及びＫＬＨ
ｕＶＨＡＩＧＡＹ／ＨｕＶＫ抗体を分泌する細胞からの
上清液を用いて得られた結果は、これらが、ＫＬＨｕＶ
ＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫ抗体のものと同等の遮断活性を有
することを示唆する。
【０１３１】Ｃ．ＲＥＩベースのヒト化 ＲＥＩ ＶＬは、Epp et al., Eur. J. Biochem., 45:
513-24 (1974)に説明されている。ＲＥＩフレームワー
クにおいては、結合を改善するための変更は行わなかっ
た。Kabat et al. (1987)に示される配列からの変更
は、Ｍ４からＬ、Ｔ３９からＫ、Ｙ７１からＦ、Ｌ１０
４からＶ、Ｑ１０５からＥ、及びＴ１０７からＫであ
る。これらの変更は、ＭＮ１４ ＣＤＲを移植するとき
に用いられるテンプレートに予め存在し、結合を改善す
るために特異的に作製されはしなかった。Ｍ４のＬへの
変更は制限部位を組込むが、残りの相違がＲＥＩフレー
ムワークの異例の残基を取り除く。類似のフレームワー
クが、Foote et al., J. Mol.Biol. 224: 487-9 (1992)
により、ヒトκサブグループＩのコンセンサスと呼ばれ
ている。
【０１３２】例９ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体の発現 ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体の発現について
安定に形質転換された細胞を上述の方法で選択し、クロ
ーニングして個々の産生細胞系を確立した。これらの系
の各々を検定し、正しい抗体の産生を決定して、産生の
効力を評価した。抗体のクラスを決定し、抗ＣＥＡ結合
親和性を評価した。
【０１３３】最良の産生細胞を産生される抗体の全量に
ついてさらに特徴付け、これらのうちの最良のものにつ
いて、トランスフェクション、組込み、増殖又は選別の
間に抗体遺伝子に変異が生じていないことを保証するた
めそのｍＲＮＡから配列を得た。
【０１３４】例１０細胞培養物中で発現したＭＮ１４のＣＤＲを移植された
ヒト化抗体の精製 ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体の最良産生細胞
系を培養し、その成長培地を集めて、０．２ミクロン膜
を通して濾過した。その後、抗体を、プロテインＡクロ
マトグラフィー、次いでイオン交換及びサイズ排除クロ
マトグラフィーのような他の通常の精製ステップにより
精製した。通常の遠心により、細胞をペレット化した。
その上清液から、上述のように抗体を精製した。
【０１３５】例１１診断におけるヒト化ＭＮ１４モノクローナル抗体の使用 Ａ．動物研究 ヒト結腸ガンを有するヌードマウスにおいて、標識ヒト
化ＭＮ１４ ＩｇＧの生体内の分配を測定した。放射性
位置測定研究に対しては、４〜５週齢雌胸腺欠損マウス
（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ、ＩＮ）に、胸腺欠損マウスにおいて順次増殖させた
異種移植片から調製したＬＳ１７４Ｔヒト結腸アデノカ
ルシノーマ(Sharkey et al., Cancer Res., 50: 828-34
(1990))の１０％懸濁液０．２ｍｌを皮下に移植した。
腫瘍の発達を２週間待った後、これらのマウスに、２０
μＣｉ（約２μｇ）の131Ｉ標識ヒト化ＭＮ１４モノク
ローナル抗体を静脈内注射した。その後、時々、４〜５
匹のマウスの群を屠殺し、上記Sharkey et al.に従い、
組織中で放射活性の位置を測定した。表２のデータは注
射された用量／組織ｇの％及び腫瘍：非腫瘍比を示す。
【０１３６】これらの結果は、この抗体の優れた腫瘍結
合性を示し、その最大結合活性は２日以内に生じる。ｈ
ＭＮ１４抗体の血液クリアランスは、親ｍＭＮ１４抗体
よりも迅速であった。加えて、脾臓によるｈＭＮ１４の
取り込みはｍＭＮ１４よりも高く、これはｈＭＮ１４抗
体がマウスにとって「外来性」であるという事実を反映
している。腫瘍：非腫瘍比は優れたものであった。これ
らの結果は、本発明のｈＭＮ１４ ｍＡｂがＣＥＡ産生
腫瘍を標的とすることが可能であることを示す。
【０１３７】
【表２】
【０１３８】Ｂ．131Ｉ標識ヒト化ＭＮ１４のＩｇＧを
用いた臨床研究 ヒト化ＭＮ１４ ＩｇＧのターゲッティング及び薬物速
度論的挙動の先行調査のため、患者を、米国分子薬剤及
び免疫学センター(Center for Molecular Medicine and
Immunology)、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪで、インスティチュ
ーショナル・レビュー・ボード(Institutional Review
Board)認可プロトコルに処した。図１２に示されている
結果の場合、その男性患者は、肝臓に転移している結腸
直腸ガンを有していた。彼に131Ｉ−ｈＭＮ１４ Ｉｇ
Ｇ（８ｍＣｉ、０．６ｍｇ抗体）を静脈注射し、６日間
にわたって撮像した。続いて、この患者に等用量のｍＭ
Ｎ１４ ＩｇＧを注射した。図１２に示される像は、各
注射の約１４０時間後の腹部前面の像を示す。これらの
像は、直接比較することができるように、正確に同じ濃
度に調整されている。これらの結果は、親マウス抗体の
みならずこのヒト化抗体がＣＥＡ産生腫瘍によって取り
込まれることを示す。これらの実験は、本発明のヒト化
ＭＮ１４ ｍＡｂを用いるヒトＣＥＡ産生結腸ガンの診
断が実用上有用なものであることを立証する。
【０１３９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> IMMUNOMEDICS, INC. <120> CDR-GRAFTED TYPE III ANTI-CEA HUMANIZED MOUSE MONOCLONAL ANTIBODIES <130> 9-162div <150> US08/318,157 <151> 1994-10-05 <160> 58 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <220> <223> Description of Artificial Sequence: MN-14HuVH region <400> 1 gag gtg aag ctt ctc gag tct gga ggt ggc ctg gtg cag tct gga gga 48 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc gat ttt act aca tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg atg agt tgg gtc cgg cag gct cca ggg aaa ggc cta gaa tgg att 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gaa att cat cca gat agc agt acg att aac tat gcg ccg tct cta 192 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 aag gat aaa ttc atc gtc tcc aga gac aac gcc aaa aat acg ctg tac 240 Lys Asp Lys Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc aaa gtg aga tct gag gac aca gcc ctt tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg ttt gct tat tgg ggc caa ggg 336 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ccg gtc act gtc tct gca 357 Thr Pro Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: MN-14HuVH region <400> 2 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 3 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <220> <223> Description of Artificial Sequence: human variable regions NEWM VH <400> 3 gaa att cag ctg acc cag tct cac aaa atg atg tcc aca tca gtg gga 48 Glu Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Met Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg ggt act tct 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aga cca gga caa tct cct aaa cta ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg aca tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gtg tct ggg aca gat ttc act ctc acc att acc aat gtg cag tct 240 Ser Val Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 gaa gac ttg gca gat tat ttc tgt cag caa tat agc ctc tat cgg tcg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 85 90 95 ttc ggt gga ggc acc aaa ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: human variable regions NEWM VH <400> 4 Glu Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Met Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Val Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human variable regions NEWM VH <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser Asn Asp 20 25 30 Tyr Tyr Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Val Phe Tyr His Gly Thr Ser Asp Asp Thr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Ile Ala Gly Cys Trp Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human variable regions REI VK <400> 6 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ile Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human KOL VH region <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asp Gln His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly His Gly Phe Cys Ser Ser Ala Ser Cys Phe Gly 100 105 110 Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized CDR <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized MN-14 VH FR <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized MN-14 VH FR <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized MN-14 VH FR <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized MN-14 VH FR <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized MN-14 VH FR <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized MN-14 VH FR <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanazed MN-14 VH FR <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <220> <223> Description of Artificial Sequence:MN-14HuVH region <400> 16 gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga ggt gtt gtg caa cct ggc cgg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc tcg tct ggc ttc gat ttc acc aca tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct gga aaa ggt ctt gag tgg gtt 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct gga aaa ggt ctt gag tgg gtt 192 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 50 55 60 aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac aac agc aag aac aca ttg ttc 240 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa gac acc ggg gtc tat ttt tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg ttt gct tat tgg ggc caa ggg 336 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ccg gtc acc gtc tcc tca 357 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:MN-14HuVH region <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MN-14HuVK region <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 18 gac atc cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt act tct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 gta gct tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg ctg atc 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt 192 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gag gac atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat cgg tcg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 85 90 95 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 318 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: MN-14HuVK region <400> 19 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 20 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 21 Trp Thr Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 22 Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 23 Thr Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 24 Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 25 Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 26 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 27 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 28 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <220> <221> MOD#RES <222> (4) <223> At site 4, Xaa = Ser or Asp <220> <221> MOD#RES <222> (9) <223> At site 9, Xaa = Gly or Val <400> 28 Gly Val Pro Xaa Phe Ser Gly Ser Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 1 5 10 15 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Val 20 25 30 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 29 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr 20 25 30 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr 20 25 30 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 33 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 34 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala 1 5 10 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 35 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 36 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln 1 5 10 15 Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 37 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln 1 5 10 15 Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 38 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 38 Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gly Ser Phe Leu Arg 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 39 Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human CDR <400> 40 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 41 ggaagcttag acagatgggg gtgtcgtttt g 31 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 42 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 43 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 44 tggaattcat ggratggagc 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Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: humanized CDR <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Lys Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（配列番号１及び配列番号２）は、マウス
ＮＥＷＭ ＭＮ１４可変領域重鎖（「ＶＨ」）のコンセ
ンサスＤＮＡ配列及びそのタンパク質翻訳産物を示す。
ＣＤＲは四角で囲まれている。
【図２】図２（配列番号３及び配列番号４）は、マウス
ＭＮ１４可変領域軽鎖（「ＶＫ」）のコンセンサスＤＮ
Ａ配列及びそのタンパク質翻訳産物を示す。ＣＤＲはボ
ックスで囲まれている。
【図３】図３は、キメラもしくはヒト化ＭＮ１４の重鎖
遺伝子の発現のためのベクターを示す。この模式図は、
キメラ及び再構成重鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の
両者並びにｐＳＶｇｐｔ発現ベクターを示す。「キメ
ラ」と表示されている最初の図は、ヒトＩｇＧ１定常領
域をコードするＤＮＡに連結したＭＮ１４マウスＶＨ領
域をコードするＤＮＡを示すマップである。このＭＮ１
４ ＶＨ領域において、３つの黒い領域により３つのＣ
ＤＲが示されている。ＦＲは、４つの点で埋めた領域で
示されている。「再構成」と表示されている真中の図
は、マウスＦＲが、「ヒト」ＶＨ領域で４つの白抜き領
域によって示されるヒトＦＲで置換されているＭＮ１４
ＶＨ領域のヒト化を示す。下方に示される発現ベクタ
ーｐＳＶｇｐｔの円形マップは、Ｉｇｈエンハンサー要
素のすぐ下流の、再構成ＭＮ１４抗体遺伝子のＨｉｎｄ
ＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位を示す。また、このマップ
は、増殖のための大腸菌における複製起点（ｃｏｌＥｌ
ｏｒｉ）及び哺乳動物細胞における複製起点（ＳＶ４
０プロモーター領域）、並びにこのベクターで形質転換
されている細菌を培養するための選択マーカー（Ａ
ｐｒ）及び哺乳動物細胞を培養するための選択マーカー
（ｇｐｔ）をコードする遺伝子を含むこのベクター内の
重要な機能的ドメインの幾つかも示す。この場合の抗体
遺伝子の発現は、この抗体遺伝子のマップでＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位の近傍に黒塗りの丸で示されるＩｇプロモータ
ーを介在する。
【図４】図４は、キメラもしくはヒト化ＭＮ１４κ鎖遺
伝子の発現のためのベクターを示す。この図は、キメラ
及び再構成ＭＮ１４κ軽鎖遺伝子及びｐＳＶｈｙｇ発現
ベクターを示す。「キメラ」と表示される最初の図は、
ヒトκ定常（「ＣＫ」）領域をコードするＤＮＡに結合
するＭＮ１４マウスκ軽鎖可変領域領域（「ＶＫ」）を
コードするＤＮＡを示すマップである。このマウスＶＫ
領域において、３つのＣＤＲが３つの黒い領域で示さ
れ、ＦＲが４つの点で埋められている領域で示されてい
る。「再構成」と表示される真中の図は、マウスＦＲ
が、「ヒト」ＶＫ領域において４つの白抜きの領域で示
されるヒトＦＲで置換されているＭＮ１４ ＶＫ領域の
ヒト化を示す。最後の発現ベクターｐＳＶｈｙｇの円形
マップは、Ｉｇｈエンハンサー要素のすぐ下流の再構成
ＭＮ１４抗体遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入
部位を示す。このマップは、大腸菌増殖のための複製起
点（ｃｏｌ Ｅｌ ｏｒｉ）及び哺乳動物細胞の増殖の
ための複製起点（ＳＶ４０プロモーター領域）、並びに
このベクターで形質転換されている細菌を培養するため
の選択マーカー（Ａｐｒ）及び哺乳動物細胞を培養する
ための選択マーカー（ｇｐｔ）をコードする遺伝子を含
むこのベクター内の重要な機能的ドメインの幾つかも示
す。この場合の抗体遺伝子の発現には、この抗体遺伝子
のマップのＨｉｎｄＩＩＩ部位の近傍で黒塗りの丸で図
示されるＩｇプロモーターが介在する。
【図５】図５は、マウスＭＮ１４可変領域（配列番号２
及び配列番号４）の配列を、ヒト可変領域ＮＥＷＭ Ｖ
Ｈ（配列番号５）及びＲＥＩ ＶＫ（配列番号６）と共
に（図５Ａ）、並びにヒトＫＯＬ ＶＨ領域（配列番号
７）と共に（図５Ｂ）示す。ＣＤＲはボックスで囲ま
れ、このヒト化ＶＨに組込まれているマウスＶＨＦＲ
は、Kabat、et al.SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOG
ICAL INTEREST,U.S.Government Printing Office,Washi
ngton,D.C.,1987のナンバリング・システムに従ってそ
れらの位置が印付けられている。ＫＬＨｕＶＨに含まれ
ていたＣＤＲ外のマウスの残基は、黒丸で示されてい
る。
【図６】図６は、マウスＭＮ１４ ＶＨフレームワーク
領域（ＦＲ）（配列番号２）とヒト化ＭＮ１４ ＶＨフ
レームワーク領域（配列番号５、８〜１１、７及び１２
〜１５）との間のアミノ酸配列の比較を示す。マウスと
異なるヒトＦＲ残基のみが示されている。また、ＮＥＷ
Ｍ及びＫＯＬのＣＤＡも示されていない。それぞれのＦ
Ｒにおけるアミノ酸置換の領域が太字で強調され、その
置換の位置がＫａｂａｔらのナンバリング・システムに
従って示されている。３番目のＣＤＲが、ボックスで囲
まれている。
【図７】図７は、ＭＮ１４ ＨｕＶＨ領域のＤＮＡ配列
とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１６及び配列
番号１７）を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。
【図８】図８は、ＭＮ１４ ＨｕＶＫ領域のＤＮＡ配列
とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１８及び配列
番号１９）を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。
【図９】図９は、（−○−）ＫＬＨｕＶＨ／ＨｕＶＫ、
（−黒四角−）ＫＬＨｕＶＨＡＩＧ／ＨｕＶＫ、（−●
−）ＫＬＨｕＶＫＡＩＧＡＹ／ＨｕＶＫ、（−□−）Ｋ
ＬＨｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫ、（−黒三角−）キメラ
対照、及び（−△−）マウス対照を含むＫＬＨｕＶＨ変
異体の相対結合親和性を比較する、ＭＮ１４の遮断（す
なわち、競合）検定のグラフである。
【図１０】図１０は、ｈＭＮ１４を（ＦＲ１領域でグリ
コシル化されている）ＨＭＮ１４−ＮＶＴと比較する、
ＭＮ１４遮断検定を示す。
【図１１】図１１は、結腸ガン患者に131Ｉ標識ｈＭＮ
１４ＩｇＧ（左パネル）又はｍＭＮ１４ＩｇＧ（右パネ
ル）を投与した後の、その患者の腹部のラジオオートグ
ラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/46 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ Ｃ (72)発明者 アーマー，キャスリン・エル イギリス国、エイビー１ ４ヴイイー ア バディーン、フォーブズ・ストリート １、フラット ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA45 CA04 HA01 4B064 AG27 4C085 AA14 AA16 AA19 AA26 BB02 CC02 CC03 CC04 CC23 DD23 DD62 DD63 EE01 GG01 HH03 JJ01 KA04 KA05 KA29 KB07 KB09 KB15 KB18 LL18 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA20 EA51

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクロー
    ナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来
    の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域のフレームワーク
    （ＦＲ）の各々とを含むヒト化モノクローナル抗体また
    はその断片であって、該ヒト化抗体は、該親マウスクラ
    スIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持する
    ものの、ヒト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥ
    Ａモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さく、該親マ
    ウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖可変
    領域のＣＤＲが、ＫＡＳＱＤ ＶＧＴＳＶ Ａ（配列番
    号２０）を含むＣＤＲL1と、ＷＴＳＴＲ ＨＴ（配列番
    号２１）を含むＣＤＲL2と、ＱＱＹＳＬ ＹＲＳ（配列
    番号２２）を含むＣＤＲL3とを含んでなり、該親マウス
    クラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域
    のＣＤＲが、ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を含むＣＤＲ
    H1と、ＥＩＨＰＤ ＳＳＴＩＮ ＹＡＰＳＬ ＫＤ（配
    列番号２４）を含むＣＤＲH2と、ＬＹＦＧＦ ＰＷＦＡ
    Ｙ（配列番号２５）を含むＣＤＲH3とを含んでなること
    を特徴とするヒト化モノクローナル抗体またはその断
    片。
  2. 【請求項２】 親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクロー
    ナル抗体の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域と、ヒト
    抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とを含んでなるキ
    メラモノクローナル抗体又はその断片であって、該キメ
    ラ抗体は該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル
    抗体の特異性を保持するものの、ヒト患者において該親
    マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免
    疫原性が小さく、該キメラモノクローナル抗体は配列番
    号４の軽鎖可変領域と配列番号２の重鎖可変領域を含ん
    でなることを特徴とするキメラモノクローナル抗体又は
    その断片。
  3. 【請求項３】 請求項１又は２のモノクローナル抗体又
    は断片に結合している診断物質又は治療物質を含んでな
    る複合体。
  4. 【請求項４】 ガン患者の診断又は治療に使用するため
    の請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又は請求
    項３に記載の複合体。
  5. 【請求項５】 請求項１又は２に記載のモノクローナル
    抗体又はその断片をコードする単離ＤＮＡ。
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