JP4443923B2

JP4443923B2 - 親和性向上剤

Info

Publication number: JP4443923B2
Application number: JP2003536383A
Authority: JP
Inventors: チェン‐シン、ケン、チャン; エドムンド、ロッシー
Original assignee: Immunomedics Inc; IBC Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Immunomedics Inc; IBC Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2022-10-15
Also published as: WO2003033653B1; KR101027889B1; JP2005518344A; EP1444267B1; EP1444267A2; CA2463616A1; US20030113333A1; IL161417A0; KR20050036873A; BR0213284A; WO2003033653A3; CN1604910A; RU2004114878A; WO2003033653A2; AU2002335808B2; MXPA04003533A; EP1444267A4; CA2463616C; PL374426A1

Description

アメリカ合衆国の後援による研究または開発の声明
本発明の開発中に行った研究の一部は、米国政府基金を利用した。米国政府は、本発明に相当の権利を有する。本発明に記載されている研究の一部は、GSCCのDr. Robert Sharkeyに授与されたDOE助成金(DE-FG01-00NE22941)の助成を受けた。

関連出願
本出願は、いずれも親和性向上剤という標題の2001年10月15日出願の米国特許仮出願第60/328,835号明細書、および2001年12月21日出願の第60/341,881号明細書について合衆国法典第35巻第119条による優先権の利益を主張するものであり、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。

発明の分野
本発明は、多価の多重特異性結合タンパク質およびキャリヤー分子を含んでなるキットに関する。この結合タンパク質は、2個以上の結合部位であって、少なくとも1個の部位はハプテン残基と結合し、かつ、少なくとも1個の部位はターゲット抗原と結合するものを有する。キャリヤー分子は、診断薬および/または治療薬と、2個以上のハプテンとを有するリンキング分子含んでなる。本発明は、また、ハプテン残基およびターゲット抗原と結合する二特異性ジアボディー(diabody)、およびこれらの機能性ジアボディーを微生物宿主にて発現させるのに有用な組換えベクターに関する。

背景技術
人工の結合タンパク質、特にモノクローナル抗体および遺伝子工学処理を行った抗体または抗体断片は、広汎に試験され、癌、自己免疫疾患、感染性疾患、炎症性疾患、および循環器疾患など様々なヒトの疾患の検出および治療に重要であることが示されている(Filpula and McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents 9: 231-245 (1999))。例えば、放射性同位体にて標識した抗体は、患者に投与した後に当該技術分野で入手可能な検出器を用いて腫瘍を可視化するのに用いられている。抗体または抗体由来の薬剤の臨床的有用性は、主としてターゲット抗原に特異的に結合するその能力に依存している。選択性は、特に同位体、薬剤、酵素、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、またはそれらの抱合誘導体のような診断または治療薬が体内の正常組織にとって毒性がある場合には、診断または治療薬をターゲット位置に効果的に送達し、ヒト疾患の検出および／または治療を行うのに重要である。

抗体系の主要な制限は、Goldenberg, The American Journal of Medicine (1993) 94: 298-299に記載されている。検出および治療技術における本質的パラメーターは、ターゲット細胞が存在する(複数の)部位に特異的に局在した注入量と、取り込み比、すなわち特異的に結合した抗体の濃度対周囲の正常組織に存在する放射能の濃度の比である。抗体を血流中に投与するとき、抗体は代謝されて排泄されるに従って、多数の区画を通過する。抗体は、身体の残りの部分を通過しながらターゲット細胞抗原をつきとめて結合することができなければならない。抗原ターゲッティングを制御する因子としては、抗原位置、抗原密度、抗原の入手可能性、病理組織の細胞組成、およびターゲッティング抗体の薬物動態が挙げられる。抗体による腫瘍ターゲッティングに特異的に影響する他の因子としては、腫瘍および他の組織におけるターゲット抗原の発現、および放射能標識抗体の血液クリアランスが遅いことによって生じる骨髄毒性が挙げられる。

ターゲッティングした腫瘍細胞が融合したターゲッティング抗体の量は、腫瘍の血管新生および抗体浸透に対するバリヤー、並びに腫瘍内圧によって影響を受ける。肝臓、腎臓または骨髄のような非ターゲット臓器による非特異的取り込みは、特に骨髄への照射が線量制限毒性を引き起こすことが多い放射線免疫療法にあっては、もう一つの主要な技術上の制限とされる。

「親和性向上系」(AES)と呼ばれる一つの提唱されている解決法は、診断または治療用放射性同位体を有する抗体により腫瘍ターゲッティングの欠陥を克服する目的で、特別にデザインされた手法である[米国特許第5,256,395号明細書(1993)、Barbet et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals (1999) 14: 153-166]。AESには、放射能標識した二価ハプテンと、ターゲット腫瘍および放射性ハプテンを両方とも認識する抗腫瘍/抗ハプテン二重特異性抗体とが必要である。この手法は、二重特異性抗体を患者に投与し、二重特異性抗体をターゲット腫瘍に局在させることを含む。未結合抗体を血流から除去する目的で十分な時間を置いた後、放射能標識したハプテンを投与する。ハプテンはターゲット細胞の部位にある抗体-抗原複合体に結合して、診断または治療効果を得る。未結合ハプテンは、身体から除かれる。Barbetは、二重特異性抗体が腫瘍表面に結合しているとき、二価ハプテンが二重特異性抗体と架橋することがある可能性を述べている。結果として、放射能標識した複合体は一層安定であり、腫瘍に更に長時間留まる。

2種類の異なるFab'断片を化学的に架橋することによって製造した二重特異性抗体を応用可能な二価ハプテンと共に上手く用いて、動物モデルおよびヒト患者のいずれにおいても腫瘍ターゲッティングを改良するためのAESの有用性が確認されている。しかしながら、当該技術分野では、このような遺伝子工学処理した抗体がAESにとって価値があるかどうかを評価するために組換えDNA技術による二重特異性抗体の製造が求められている。とりわけ、ターゲッティングされた抗原での向上した取り込み、血液からの速やかなクリアランス、および正常組織および細胞の有毒医薬からの最適保護を示す抗体を基剤とする薬剤が求められ続けている。

発明の概要

本発明は、多価の多重特異性結合タンパク質およびキャリヤー分子を含むキットに関する。結合タンパク質は、2つ以上の結合部位であって、少なくとも1つの部位がハプテン残基と結合し、少なくとも1つの部位がターゲット抗原と結合するものを有する。キャリヤー分子は、診断薬および/または治療薬並びに2つ以上のハプテンを有するリンキング分子を含む。本発明の一態様は、ハプテン残基およびターゲット抗原と結合する二重特異性抗体、および微生物宿主でのこれらの機能性抗体の発現に有用な組換えベクターに関する。

第二の態様は、ヒスタミン-スクシニル-グリシル(HSG)残基を含む分子に親和性を有するHSG結合部位と、癌胎児性抗原(CEA)に親和性を有するCEA結合部位とを含んでなる二重特異性ジアボディー(diabody)である。これらのジアボディーは組換えDNA技術によって産生され、HSGおよびCEAに特異性を示す新規なAESを生じる。

本発明の第三の態様は、診断薬、治療薬、またはそれらの組合せをターゲットに送達する方法に関する。この方法は、結合タンパク質をこの薬剤を必要とする被験者に投与し、非結合タンパク質の量を被験者の血流から除去するのに十分な時間を置いて、診断または治療薬を含むキャリヤー分子を投与することを含んでなる。本発明のもう一つの態様は、薬剤をターゲットに送達する方法を用いてヒト疾患を検出し、かつ、治療する方法である。

本発明の目的は、ハプテン残基および抗原と結合することができる結合タンパク質を製造することである。本発明の更にもう一つの目的は、多重特異性抗体をコードするDNA配列を含み、かつ、微生物宿主細胞で容易に発現するベクターを製造することである。更に、本発明は、組換えDNA技術によってジアボディーを製造する方法を包含する。この方法は、宿主細胞を適当な培地で培養して、ジアボディーを単離することを包含する。更に、本発明は、図25-38 (Seq ID)に記載されている様々なジアボディーをコードするDNA配列に関する。

発明の具体的説明

本発明は、ハプテン残基について少なくとも1個の結合部位とターゲット抗原について少なくとも1個の結合部位を含んでなる多価の多重特異性結合タンパク質に関する。ハプテンは、診断薬および/または治療薬を携える小分子に結合する。さらに、本発明は、ハプテン残基およびターゲット抗原と結合する二重特異性ジアボディー、および微生物宿主でのこれらの機能性ジアボディーの発現に有用な組換えベクターに関する。

構造的には、抗体全体は、4本のポリペプチド鎖を含むY形単位の1以上のコピーから構成されている。2本の鎖は重鎖と呼ばれるポリペプチドの同一コピーであり、2本の鎖は軽鎖と呼ばれるポリペプチドの同一コピーである。2本の重鎖は1以上のジスルフィド結合によって互いに結合し、それぞれの軽鎖は1個のジスルフィド結合によって重鎖の一方に結合している。それぞれの鎖は、それぞれ重鎖および軽鎖についてV_HおよびV_Lと呼ばれるN末端可変ドメインを有し、Fv断片と呼ばれるV_HおよびV_Lの対の非共有会合は1つの抗原結合部位を形成する。

不連続のFv断片は、低タンパク質濃度および生理学的条件下で解離しがちであるので[Glockshuber et al., Biochemistry (1990) 29: 1362-1367]、余り実際には使用されない。安定性を向上して潜在的有用性を高めるために、V_H(またはV_L)ドメインのC末端が可変長さのペプチドリンカーを介してV_Lドメイン(またはV_H)のN末端に結合されている組換え一本鎖Fv(scFv)断片を製造して、徹底的に検討されてきた[最近の総説については、Hudson and Kortt, J. Immunological methods (1999) 231: 177-189を参照されたい]。

長さが12アミノ酸残基より大きなリンカー(例えば、15または18残基リンカー)を有するscFvは、同一鎖上のV_HおよびV_Lドメイン間で相互作用することができ、一般に単量体、二量体(ジアボディーと呼ばれる)および少量の一層高質量のマルチマーの混合物を形成する[Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157]。しかしながら、アミノ酸残基が5個以下のscFvでは、同一鎖上のV_HおよびV_Lドメインの分子内対合が妨げられ、異なる鎖上のV_HおよびV_Lドメインと対合せざるを得ない。3−12残基のリンカーは、主として二量体を形成する[Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604]。0-2残基のリンカーでは、三量体(トリアボディーと呼ばれる)、四量体(テトラボディーと呼ばれる)または更に高オリゴマー構造のscFvが有利であるが、オリゴマー化の正確なパターンはリンカーの長さの他にVドメインの組成並びに配向によって変化すると思われる。例えば、抗ノイラミニダーゼ抗体NC10のscFvは、主として0残基リンカーの三量体(V_H-V_L配向)または四量体(V_L-V_H配向)を形成した[Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574]。1および2残基のリンカーでNC10から構築したscFvについては、V_H-V_L配向は主としてジアボディーを形成し[Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604]、対照的にV_L-V_H配向は四量体、三量体、二量体および更に高質量のマルチマーの混合物を形成した[Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574]。V_H-V_L配向において抗CD19抗体HD37から構築したscFvについては、0残基リンカーは三量体のみを形成し、1残基リンカーは四量体のみを形成した[Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168]。

2個以上の同一scFv分子の非共有会合は多価であるが、単一特異性である機能性ジアボディー、トリアボディー(triabody)およびテトラボディー(tetrabody)を形成することができるので、2個以上異なるscFv分子の同様な会合が適性に構築される場合には、機能性の多重特異性scFvマルチマーを形成することがある。二重特異性ジアボディーは2種類の異なるscFvのヘテロ二量体であって、それぞれのscFvが一つの抗体のV_Lドメインに短いリンカーによって結合した別の抗体のV_Hドメインからなるものである。数種類の二重特異性ジアボディーが、一方のシストロンにV_H1−リンカー−VL₂を含んでなる組換え遺伝子構築物および他のシストロンにV_H2−リンカー−V_L1を含んでなる組換え遺伝子構築物を含むジシストロン発現ベクターを用いて、作製されている[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-6448; Atwell et al., Molecular Immunology (1996) 33: 1301-1302; Holliger et al., Nature Biotechnology (1997) 15: 632-631; Helfrich et al., Int. J. Cancer (1998) 76: 232-239; Kipriyanov et al., Int. J. Cancer (1998) 77: 763-772; Holiger et al., Cancer Research (1999) 59: 2909-2916]。更に最近では、二重特異性を有する四価のタンデムジアボディー(タンダブ(tandab)と呼ばれる)も報告されている[Cochlovius et al., Cancer Research (2000) 60: 4336-4341]。二重特異性タンダブは、2個のポリペプチドのホモニ量体であって、それぞれが自己会合時に2種類の異なる特異性のそれぞれについて2つの潜在的結合部位の形成を促進するための配向で結合した2種類の異なる抗体の4種類の可変ドメイン(V_H1, V_L1, V_H2, V_L2)を含むものである。scFvの構築方法は、米国特許第4,946,778号明細書(1990)および米国特許第5,132,405号明細書(1992)に開示されている。上記のような多価および多重特異性のscFvを基剤とする薬剤の製造方法は、二重特異性ジアボディーについて米国特許第5,837,242号明細書(1998)、米国特許第5,844,094号明細書(1998)、およびWO98/44001号明細書(1998)に開示されており、タンデムジアボディーについてはPCT/DE99/01350号明細書に開示されている。

V_HおよびV_Lドメインから多重特異性で多価の抗原結合タンパク質を製造する別態様は、米国特許第5,989,830号明細書および米国特許第6,239,259号明細書に開示されている。このような多価の多重特異性抗原結合タンパク質は、2本のポリペプチド鎖であって、一方のポリペプチド鎖がペプチドリンカーによって直列に結合した2個以上の(同一または異なる抗体からの)V_Hドメインからなり、他のポリペプチド鎖がペプチドリンカーによって直列に結合した相補的V_Lドメインからなるものをコードするジシストロンベクターを発現することによって得られる。

本発明は、2種類のモノクローナル抗体679およびhMN14と、679の2つの点突然変異(679-V_H(I3Q)および679-V_K(C101S))を用いて、抗原特異性ジアボディーを生成する。更に、二重特異性ジアボディーはhMN14およびh679から生成され、これは679のCDRをヒト抗体に見られるアミノ酸残基の枠組構造にグラフトすることによって得られる。679と呼ばれるネズミモノクローナル抗体(IgGl, K)は、ヒスタミン-スクシニル-グリシル(HSG)残基を含む分子に高親和性で結合する(Morel et al., Molecular Immunology, 27,995-1000, 1990)。679の可変ドメイン(V_HおよびV_K)に関するヌクレオチド配列は、決定されている(Qu et al., 未公表結果)。V_Kは、抗体軽鎖VLの2つのアイソタイプの一方である。図1に示されるように、679ジアボディーを発現するための遺伝子構築物(679-scFv-L5)のデザインは、下記の特徴を有する。1) V_Hのカルボキシル末端は、ペプチドリンカーGly-Gly-Gly-Gly-Ser (G₄S)によってV_Kのアミノ末端に結合している。G₄Sペプチドリンカーを用いることによって、分泌したポリペプチドを二量体化してジアボディーとし、HSGの2個の結合部位を形成することができる。2) pelBリーダーシグナルペプチド配列はV_H遺伝子に先行し、E. coliの細胞周辺腔へのポリペプチドの輸送を促進する。3) 6ヒスチジン(His)残基をカルボキシル末端に加えて、IMACによる精製を行うことができる。679-scFv-L5についてのDNAコード配列および相当するコードされたアミノ酸を、図25に示す(配列番号:)。679-I3QについてのDNAコード配列および相当するコードされたアミノ酸を、図26に示す(配列番号:)。679-C101SについてのDNAコード配列および相当するコードされたアミノ酸を、図27に示す(配列番号:)。図1は、pelBリーダーペプチドタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線図、およびHSG結合部位を含む679ジアボディーの棒線図も包含する。

2種類の位置指定点突然変異を行い、可溶性抽出物での679ジアボディーの量を増加した。具体的には、679V_H配列中の残基3のIleからGlnへの転換(I3Q)、または679V_K配列中の残基101のCysからSerへの転換(C101S)、または両方の転換(I3Q/C101S)により、可溶性発現レベルが少なくとも10倍増加した。更に、679はヒト化または完全にヒトであり、ネズミ抗体に対する有害な反応の回避を促進することができる。

hMN14は、CEAに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体(Mab)である(Shevitz et al, J. Nucl. Med. , Supp. , 34, 217P, 1993; 米国特許第6,254,868号明細書(2001))。最初のMabはネズミであったが、現在はヒト化抗体試薬を用いて、ヒト抗マウス抗体反応を減少させるようにしている。この抗体の可変領域を、例1に記載の679-scFv-L5と同様な方法で遺伝子工学処理を行って発現構築物(hMN14-scFv-L5)とした。図3に示されるように、hMN14ジアボディーを発現するための遺伝子構築物(hMN14-scFv-L5)は、下記の特徴を有する。1) V_Hのカルボキシル末端は、ペプチドリンカーGly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)によってV_Kのアミノ末端に結合している。G₄Sペプチドリンカーを用いることによって、分泌されたポリペプチドを二量体化してジアボディーとし、CEAに対する2個の結合部位を形成することができる。2) pelBリーダー配列はV_H遺伝子に先行して、E. coliの細胞周辺腔でのポリペプチドの合成を促進する。3) 6ヒスチジン(His)残基をカルボキシル末端に付加して、IMACによって精製できるようにする。hMN14-scFv-L5のDNAコード配列および相当するコードされたアミノ酸を、図29(配列番号:)に示す。図3は、また、pelBリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画図面、およびCEA結合部位を含むhMN-14ジアボディーの棒線画図面を示す。

ジシストロン発現ベクターは、図8および9に概略が示され、かつ、例6に記載されている一連のサブクローニングの手法によって構築した。二重特異性 hMN14x679ジアボディーのジシストロン発現カセットを、図10に図示する。この発現カセットは、多くの細菌や幾つかの真核生物で染色体外自己複製遺伝子要素を形成する小さな二本鎖DNAであり、かつ、遺伝子工学においてクローニングベクターとして広く用いられるプラスミドに含まれている。クローニングベクターは、微生物宿主細胞でそれ自身について複製することができるDNA分子である。本発明は、二重特異性ジアボディーを発現するベクターを記載する。宿主細胞は複製用ベクターを受容し、ベクターは宿主細胞が分裂するたびに複製する。一般に用いられる宿主細胞は大腸菌(E. Coli)であるが、他の宿主細胞を用いることもできる。

図10に示されるジシストロンカセットがE. coliで発現されるときには、ポリペプチドの幾つかは折り畳まれ、可溶性の二重特異性ジアボディーを自発的に形成する。図10に示される二重特異性ジアボディーは、HSGに高親和性を有する1個の結合部位とCEAに高親和性を有する1個の結合部位を形成する。

この場合には、679MAbのV_Hセグメントのカルボキシル末端が5アミノ酸残基リンカーによってhMN14MAbのV_Kセグメントのアミノ末端に結合し、hMN14MAbのV_Hセグメントのカルボキシル末端は同じ5アミノ酸残基リンカーによって679MAbのV_Kセグメントのアミノ末端に結合している。679xhMN14二重特異性ジアボディーの3種類の変異体を製造して、試験した。BS1は、679およびhMN14可変領域の両者の野生型配列から構成されている。BS1.5は、679V_HI3Q突然変異を組込んでいる。BS2は、679V_HI3Qおよび679V_KC101S突然変異を両方とも組込んでいる。BS1、BS1.5およびBS2の2種類のポリペプチドについてのDNAコード配列および相当するコードされたアミノ酸を、それぞれ図30および31、32および33、および34および35(配列番号:)に示す。更に、h679xhMN14の二重特異性ジアボディーを構築し、BS1.5Hと命名した(図37および38を参照されたい)。

これらの二重特異性ジアボディーの最終的な用途は、CEA陽性腫瘍をプレターゲッティングした後に、HSGを含むペプチドによって運ばれる治療用放射性同位体を特異的に送達することである。これらのジアボディーはターゲッティングされた抗原に選択的に結合し、二価のジ−HSGハプテンと組み合わせることによって親和性を増加し所望な位置における滞留時間を長くすることができる。更に、非抗原結合ジアボディーは体内から速やかに除去され、正常組織の暴露は最小限になる。

本発明による診断または治療を目的とする診断薬または治療薬の標的への送達は、結合タンパク質を被験者に投与し、患者の血流から非結合タンパク質の量を除去する目的で十分な時間を置き、結合タンパク質の結合部位に結合する診断薬または治療薬を投与することを含んでなる。診断では、既知の手法を用いて結合したタンパク質を検出する工程が更に必要である。診断または治療用のキャリヤー分子は、診断または治療上有効な薬剤、リンキング残基、および1個以上のハプテン残基を含んでなる。ハプテン残基は、ハプテン残基が結合タンパク質と同時に結合することができる位置に置かれる。

本発明の結合タンパク質および診断または治療薬の哺乳類への投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、髄腔内、局所カテーテルによる灌流、または直接病変内注射でよい。結合残基を注射によって投与するときには、連続点滴、または一回または多数回のボーラス(bolus)によって投与することができる。

混合していない診断または治療薬と二重特異性抗体は、薬学上許容可能な注射用ビヒクル、好ましくは生理学的pHおよび濃度のリン酸緩衝食塩水(PBS)中のヒトの治療および診断用のキットとして提供することができる。製剤は、好ましくは、特にヒトで使用しようとするときには、滅菌される。このようなキットの任意成分は、通常は安定剤の容器、緩衝剤、標識試薬、放射性同位体、常磁性化合物、クリアランスを高めるための二次抗体、通常のシリンジ、カラム、バイアルなどである。

下記の例は本発明の態様を例示するものであり、特許請求の範囲を制限する目的で用いるべきものではない。

例1−E. coliにおける679ジアボディーの発現のためのプラスミドの構築
標準的組換えDNA法を用いて、下記のようにして679-scFv-L5を得た。679のV_H配列を含むプラスミドを、Pfuポリメラーゼおよび下記の2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いた。
679V _H -左
5'-TCAGCCATGGAAGTGATCCTGGTGGAGTCAGGGGGAGACT-3'
679V _H -右 (G₄S)
5'-TGAGGATCCGCCACCTCCTGAGGAGACGGAGACCGTGGTC-3'

左PCRプライマーは、5'NcoI制限部位を含む。右PCRプライマーは、5アミノ酸残基リンカー(G₄S)の配列およびBamHI制限部位を含む。PCR生成物をNcoIおよびBamHIで消化して、イン・フレーム(in frame)でpelBリーダー配列と連結して、NcoI/BamHIで消化したpET-26bベクター(Novagen)とし、679V_HL5-pET26を生成した。

679のV_K配列を含むプラスミドを、Pfuポリメラーゼおよび下記の2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRの鋳型として用いた。
679V _H -左
5'-CTGAGGATCCGACATTGTGATGTCACAATCT-3'
679V _K -右
5'-ATCCTCGAGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGT-3'

左および右PCRプライマーは、それぞれBamHIおよびXhoI制限部位を含む。PCR生成物をXhoIおよびBamHIで消化して、(イン・フレームで679V_H、G₄Sリンカーおよび6His配列と)連結して、XhoI/BamHIで消化した679VHL5-pET26とし、発現構築物679-scFv-L5を生成した。挿入した遺伝子のDNA配列により、V_HおよびV_K配列は元のcDNAクローンの配列と同一であり、連結部位およびリンカー領域の配列はデザインした通りであった。遺伝子構築物679-scFv-L5を、図1に示す。

例2−E. coliにおける679ジアボディーの発現
コンピテント(competent)E. coli BL21 (P-Lys-S)細胞を、標準的方法によって679-scFv-L5で形質転換した。培養物を、100μg/mL硫酸カナマイシンおよび34μg/mLクロラムフェニコールを補足した2xYT中で振盪し、37℃でOD₆₀₀が1.6−1.8になるまで増殖させた。抗生物質および0.8Mスクロースを補足した等容の室温2xYT培地を培養物に加えた後、これを20℃に移した。20℃で30分後、IPTG 40μMを加えて発現を誘導し、20℃で15−18時間継続した。

679ジアボディーの発現は、(1)細胞培養コンディショニング培地、(2)遠心分離後に細胞ペレットから非変性条件下で抽出した可溶性タンパク質、および(3)数サイクルの抽出および遠心分離の後ペレットに残った不溶性材料で検討した。

可溶性タンパク質は、下記のようにして細菌細胞ペレットから抽出した。ペレットを凍結および融解した後、リーシス緩衝液(2% Triton-X 100; 300mM NaCl; 10mMイミダゾール; 5mM MgSO₄; 25単位/mLベンゾナーゼ; 50mM NaH₂PO₄(pH 8.0))に培養物容積の1% の量を用いて再懸濁した。懸濁液を音波処理によってホモジナイズし、遠心分離によって清浄化し、Ni-NTAIMACカラムに装填した。20mMイミダゾールを含む緩衝液で洗浄した後、カラムを100mMイミダゾール緩衝液(100mMイミダゾール; 50mM NaCl; 25mM Tris(pH 7.5))で溶出し、得られた溶出液をQ-Sepharoseカラム上で更に精製した。

不溶性状材料を、変性Ni-NTA結合緩衝液(8M尿素; 10mMイミダゾール; 0.1M NaH₂PO₄; 10mM Tris(pH 8.0))中で可溶化し、Ni-NTAアガロース(Qiagen, Inc.)1mLと混合した。混合物を室温で1時間振盪した後、樹脂を同じ緩衝液50mLで1回洗浄し、カラムに装填した。カラムを同じ緩衝液20mLで洗浄した後、洗浄緩衝液(8M 尿素; 20mMイミダゾール; 0.1 M NaH₂PO₄; 10mM Tris (pH 8.0))20mLで洗浄した。結合したタンパク質を、変性溶出緩衝液(8M尿素; 250mMイミダゾール; 0.1M NaH₂PO₄; 10mM Tris (pH 8.0))5mLで溶出した。

図2の還元型SDS-PAGEの結果によって示されるように、しっかりした誘導が全細胞溶解物で明らかであり(レーン2)、約28kD(679scFvの予想分子量)のタンパク質に相当する顕著なバンドを示した。しかしながら、誘導タンパク質の実質的に総ては不溶性画分(レーン5)にあり、10倍濃縮した培地には検出されなかった(レーン3)。誘導タンパク質を、変性条件下でNi-NTAカラムの結合した材料を可溶化して溶出した後に、不溶性画分から精製した(レーン1)。可溶性抽出物は微量のHSG結合材料を含み、BIAコア分析により培養物1リットル当たり約1μgと推定された。

例3−scFv突然変異体から形成された679ジアボディー
2つの位置指定点突然変異を行い、可溶性抽出物中の679ジアボディーの量を増加した。具体的には、679V_H配列中の残基3のIleからGlnへの転換(I3Q)、または679V_K配列中の残基101のCysからSerへの転換(C101S)、または両方の転換(I3Q/C101S)により、可溶性発現レベルが少なくとも10倍増加した。突然変異は、PCRに用いる合成オリゴヌクレオチドで導入した。V_H-I3Q突然変異を、下記のオリゴヌクレオチドプライマーに組込んだ。
679V _H I3Q-左
5'-CCATGGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGG-3'

このプライマーを679V_H-右(例1)と対にし、Pfuポリメラーゼを用い679-scFv-L5鋳型からPCRによってV_H-I3Q突然変異体を生成した。

679V_K-C101S突然変異を、下記のオリゴヌクレオチドプライマーに組込んだ。
679V _K C101S-右
5'GCTCGAGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGCT CAGATAATAAACTTGAG-3'

このプライマーを679-V_K左(例1)と対にして、Pfuポリメラーゼを用い679-scFv-L5鋳型からPCRによって679V_K-C101S突然変異体を生成した。ＰＣＲ生成物は例１に記載されたと同様の方法に従って複製された。

可溶性画分の発現レベルを、HSGとカップリングしたセンサーチップを用いてBIAコア分析によって評価した。I3Q、C101SまたはI3Q/C101S突然変異体679ジアボディーの発現レベルは、野生型については約1μg/Lであるのと比較して、約10μg/Lであった。

例4−E. coliにおけるhMN-14ジアボディーの発現のためのプラスミドの構築
標準的組換えDNA法を用いて、下記のようにしてhMN-14-scFv-L5を得た。hMN-14V_HおよびV_K配列は、Pfuポリメラーゼを用いるPCRによりhMN-14 Fab'(Leung et al., Cancer Res. 55: 5968s-5972s (1995))を発現するために構築したベクターから増幅した。hMN-14V_H配列は、下記のオリゴヌクレオチドプライマー
hMN-14V _H -左
5'-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3'
hMN-14V _H -右(G ₄ S)
5'-CATAGGATCCACCGCCTCCGGAGACGGTGACCGGGGT-3'
を用いて増幅した。

左PCRプライマーは、5'NcoI制限部位を含む。右PCRプライマーは、5アミノ酸残基リンカー(G₄S)の配列とBamHI制限部位を含む。PCR生成物をNcoIとBamHIで消化して、イン・フレームでpelBリーダー配列と連結して、NcoI/BamHIで消化したpET-26bベクターとして、hMN-14V_HL5-pET26を生成した。hMN-14V_K配列は、下記のオリゴヌクレオチドプライマー
hMN-14V _K -左
5'-CTGAGGATCCGACATCCAGCTGACCCAGAG-3'
hMN-14V _K -右
5'-GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG-3'
を用いて増幅した。

左および右PCRプライマーは、それぞれBamHIおよびXhoI制限部位を含んでいる。PCR生成物をXhoIおよびBamHIで消化して、イン・フレームでhMN-14V_H、G₄Sリンカーおよび6His配列と連結して、XhoI/BamHIで消化したhMN-14V_HL5-pET26構築物とし、発現構築物hMN-14-scFv-L5を生成した。この構築物のDNA配列を、自動化DNAシークエンシングによって確かめた。核酸構築物hMN-14-scFv-L5を、図3に示す。

例5−E. coliにおけるhMN-14ジアボディーの発現
hMN-14-scFv-L5構築物を用いて、BL21(P-LysS)E. coliを形質転換した。培養条件、誘導、および精製は、hMN14ジアボディーをQ-Sepharoseアニオン交換クロマトグラフィーの代わりに、アフィ(Affi)-ゲル上に固定した抗id抗体に結合することによりアフィニティークロマトグラフィーによって精製したことを除き、例1の679ジアボディーについて記載したのと同様に行った。Ni-NTA樹脂に結合し、これから溶出した可溶性タンパク質を、WI2抗イディオタイプアフィニティーカラムに装填した。カラムをPBSで洗浄し、生成物を0.1Mグリシン; 0.1M NaCl, pH2.5で溶出し、直ちに中和した。

発現したhMN-14scFvのほとんどは不溶性タンパク質として存在したが、培養物1リットル当たり可溶性hMN-14scFv約1.5mgを可溶性画分から精製した。サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって示されるように、主ピークが、IMAC精製物並びにアフィニティー精製材料について図4Aおよび4Bにおいて9.8分に観察された。分子量が約50kDaのhMN14Fab'の保持時間は、図4Bのx軸上に示されるように、9.75分であった。hMN-14scFvの保持時間が極めて類似していることは、モノマー性hMN-14scFvの計算分子量が26kDaであるので、溶液では二量体またはジアボディーとして存在することを示している。図5AにおけるSDS-PAGEゲル分析は、26kDaの予測したM_rの単一バンドを示し、図5Bの等電点電気泳動(IEP)ゲル分析では、pI計算値の7.9附近にpIが8.2のバンドを生じる。競合的ELISAは、hMN14ジアボディーが機能的に活性であり、優れた結合特性を示すことを示した。

CEA陽性GW-39腫瘍を有するヌードマウスに、¹³¹Iで標識したhMN14ジアボディーを投与し、生体内分布を投与後の様々な時間に分析した。かなりの量のジアボディーは96時間を上回る時間、腫瘍と会合したままであったが、遊離ジアボディーの多くは図6に示されるように血液から速やかに除去された。図7は、投与から48時間後の腫瘍、および肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、小腸、および大腸のような正常組織と会合している投与線量の百分率を示している。それぞれの正常組織における投与線量は、腫瘍における量と比較すると非常に低い。表1に、24、48および72時間後の腫瘍における活性と比較した正常組織で見られる活性の相対量をまとめてある。

例6−679xhMN14二重特異性ジアボディー(BS1、BS1.5およびBS2)
PET-ERの構築
HSGおよびCEAの両方に結合することができる二重特異性ジアボディーの合成を指示する発現ベクターに進む前に、新規ベクター(pET-ER)を、図8Aに示される多重クローニング部位MCS2を図8Bに示されるpET-26bベクターに付加することによって生成した。2種類の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、T4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。これらのオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃に加熱した後、混合物を室温まで徐冷するに従ってアニーリングした。重複構造MCS2をpET-26bのBlpI制限部位に連結して、図8Cに示されるpET-ERベクターを生成した。このベクターは、ジシストロン発現カセットの構築を促進し、単一E. coli細胞で2種類の異種ポリペプチドの化学量論的発現の準備をする。

E. coliにおける679xhMN14ジアボディーの構築および発現
ジシストロン発現ベクターを、図9に略記している一連のサブクローニング手法によって構築した。最初に、679scFv-L5およびhMN14-scFv-L5のV_K配列をBamHIおよびXhoIで切出すことによって交換して、2種類の中間体構築物をpET26bに生成した。pET26b構築物からNcoIおよびXhoIで切出した配列679V_H-L5-hMN14V_Kを含むDNA断片を、pET-ERベクターの同じ制限部位に連結して中間体クローン(679V_H-L5-hMN14V_K-pET-ER)を生成した。ポリペプチド2のコード配列(下記)の他にリボソーム結合部位を含む900bp DNA断片を、hMN14V_H-L5-679V_K-pET26bからXbaIおよびBlpIで切出した。この断片を679V_H-L5-hMN14V_K-pET-ERのSpeIおよびBlpI制限部位に連結して、最終的な二重特異性発現構築物を生成した。二重特異性 hMN14x679ジアボディーについてのジシストロン発現カセットを、図10に略記する。BS1、BS1.5およびBS2の第一および第二のポリペプチド配列についての核酸のDNAコード配列および相当するコードされたアミノ酸を、それぞれ図30および31、32および33、並びに、34および35(配列番号:)に示す。ジシストロン発現カセットは、下記のように配列されている2種類のポリペプチド:
ポリペプチド1
Pel B;679V_H; GGGGSリンカー; hMN14V_K; 6His
ポリペプチド2
Pel B; hMN14V_H; GGGGSリンカー;679V_K; 6His
をコードする。

このカセットをE. coliで発現させると、ポリペプチドの幾つかは折り畳まれて、可溶性の二重特異性ジアボディーを自発的に形成する。互いに相互作用する4個のポリペプチドを有する二重特異性ジアボディーを、図10に示す。この場合には、679MAbのV_Hセグメントのカルボキシル末端は5アミノ酸リンカーによってhMN14MAbのV_Kセグメントアミノ末端に接続しており、hMN14MAbのV_Hセグメントのカルボキシル末端は同じ5アミノ酸残基リンカーによって679MAbのV_Kセグメントのアミノ末端に接続している。それぞれの鎖は、679xhMN14ジアボディーの半分を形成している。679xhMN14二重特異性ジアボディーの発現のための3種類の構築物BS1、BS1.5およびBS2を、例1の679scFvについての記載した方法で発現し、精製した。結果を、BS1.5について下記に詳細に説明する。

IPTGによる誘導の後に、BS1.5形質転換E. coli (BL21-pLysS)培養物は、培養物1リットル当たり、可溶性の二重特異性ジアボディー0.5mgを発現した。5L誘導から、例1に記載したのと同様の手法の後に、高度に精製したBS1.5ジアボディー2.4mgを単離した。可溶性細胞抽出物を4mLのNi-NTAアガロースカラム(Qiagen)に装填し、10mMイミダゾール緩衝液20ベッド容積(bed volume)および20mMイミダゾール緩衝液5ベッド容積で洗浄した。ジアボディーを、IMACカラムから100mMイミダゾール溶出緩衝液15mLに溶出した。溶出液を、直ちに4mLのQ-Sepharoseアニオン交換カラムを通し、高度精製したBS1.5をフロースルー画分に採取した。HPLC分析は、図11に示した保持時間9.2分の単一ピークを示しており、2種類の異種ポリペプチド679V_H-GGGGS-hMN14V_KおよびhMN14V_H-GGGGS-679V_Kが二量体またはジアボディーのみを形成することを示していた。3種類の679xhMN14二重特異性ジアボディーの純度を、更に還元型SDS-PAGEおよびIEFによって示した。単一タンパク質バンドが、図12においてBS2についてのクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルの約27kDaに見られる。2種類のポリペプチドの計算分子量26.5kDaおよび27.2kDaであるので、本質的に同一移動パターンを示す。IEFゲルでは、図13に示されるように、BS1、BS1.5およびBS2はそれぞれpIが約8.3の存在を示し、これは3種類の二重特異性ジアボディーの予想pI 7.9に近い。

BS1.5の結合動態を、低密度HSGカップリングセンサーチップを用いるBIAコアによって評価した。結合センサーグラム0−54nMのBS1.5濃度について得て、生成するデーターを、1:1 Langmuir結合モデルを用いるBIAコアヴィアエバリュエーション(BiaEvaluation)ソフトウェアで分析し、BS1.5の固定化HSGへの結合についての相互作用の会合定数K_d 2.4nMを得た。図14は、BS1.5の様々な濃度でのBIAコア結合曲線を示している。同じ方法を用いて、化学的に調製した679xhMN14F(ab')₂抱合体では、K_dは1.55nMである。BS1およびBS2と比較したBS1.5についての結合特性を、表2にまとめている。K_dが低くなれば、抗原に対する親和性が高くなることを示している。BS1.5は最低K_dを有するので、HSGに対する最大の親和性を示す。K_dは、オフ・レイトおよびオン・レイト定数、K_offおよびK_on(但し、K_d=K_off/K_on)の比の尺度である。

BS1.5のCEAへの結合を、競合的ELISAによって明らかにした。マイクロタイタープレートに、可溶性CEA (Scripps Laboratories) 0.5μg/ウェルをコーティングした。4−500nMの範囲の濃度のBS1.5を、CEA結合についてHRP抱合したhMN14IgG (1nM)と競争させた。BS1.5は、679xhMN14F(ab')₂化学的抱合体と同様な競合的結合曲線を示す。これらのデーターは、BS1.5が親のhMN14抗体と同様のCEA結合親和性を有することを示している。BS1.5の二重特異性結合特性を、高密度 HSGカップリングバイオセンサーチップを用いるBIAコアによっても分析した。BS1.5をセンサーチップに予備結合した後、hMN14に高度の特異性を有するWI2と呼ばれる抗イディオタイプMAbを投与した。可溶性CEAをWI2の代わりに用いても、同様の結果を得た。図16に示されるように、BS1.5を60ng投与したところ、620RUの相対応答を得た。続いてWI2を400ng投与したところ、シグナルは400RUまで増加した。二回目のWI2投与(400ng)により、520RUの全量がBS1.5の620RUシグナルに加えられたので、結合は飽和に近づいた。679F(ab')₂を予備結合したまたは予備結合なしの後にWI2を投与しても、応答はほとんど見られなかった。これらのデーターは、BS1.5がHSGおよびCEAを同時に結合する能力を有することを示している。

BS1およびBS2は、それぞれジアボディーの679成分における単一点突然変異によって、BS1.5と異なっている。これらの分子の特性の幾つかを、表2にまとめている。ELISA実験は同様なCEA結合特性を示すことを明らかにしているが、これはジアボディーのhMN14成分が3種類のジアボディーで一致していると仮定すれば意外なものではない。更に、BS1およびBS2は、BIAコア分析により二重特異性であり、かつ、CEAおよびHSGに同時に結合することができることが明らかにされている。BS1.5は、BS1には含まれていない679V_HI3Q突然変異を含み、これは野生型配列のみから構成されている。この突然変異により、HSGに対する結合親和性を低くすることなしに、発現される可溶性ジアボディーの収量が倍増する。BS2は、追加の679V_KC101S突然変異並びに679V_HI3Qを包含する。この第二の変化により、可溶性BS2はBS1.5のレベルの二倍で発現されるが、HSGに対する結合親和性は明らかに減少した。

例7−イン・ビボターゲッティング
これらの二重特異性ジアボディーをCEA陽性腫瘍予備ターゲッティングとして使用して、続いてHSGを含むペプチドによって運ばれる治療用放射性同位体を特異的に送達する可能性を、BS1.5によって明らかにする。GW39(CEA陽性)腫瘍を有するヌードマウスを、BS1.5で予備ターゲッティングした。最初に、生体内分布を¹³¹Iを標識したBS1.5で追跡した。結果を、図17に示す。ジアボディーは1時間以内に腫瘍に速やかに蓄積し、ゆっくりと除去された。ジアボディーは1時間以内に血液にも蓄積したが、血中からのクリアランスは8-12時間以内に起こった。12および24時間のクリアランス時間では、図18に示されるように、腫瘍は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、小腸、および大腸のような正常組織と比較して¹³¹I-BS1.5がかなり高かった。予備ターゲッティング実験を、BS1.5(未標識)を投与後12および24時間のクリアランス時間で行った。2個のHSG基と1個のDOTA残基を含むペプチドに¹¹¹インジウムを加え、BS1.5を予備ターゲッティングしたマウスに投与した。¹¹¹In-IMP241の生体内分布を、投与から3および24時間後に検討した。図19には、予備ターゲッティングして12時間クリアランス後の腫瘍および正常組織における活性を示す。実質的な放射能は3時間以内に腫瘍に蓄積し、24時間後にはごく僅かしか減少しない。少量の放射能が、両時点において腎臓の他にも総ての正常組織に検出されており、ジアボディーが腫瘍および放射性同位体に特異的であるが、正常組織への取り込みは回避されることを示唆している。¹¹¹In-IMP241の腫瘍対非腫瘍比を、表3にまとめてある。

例8−679Vドメインのヒト化
ネズミ形に匹敵するHSG結合親和性を示す679を基剤とするジアボディーのヒト化バージョンを生成した。用いた方法は、総てのCDR残基およびCDR残基と相互作用することが知られている残基を保持し、ヒト枠組構造のデーターベースの相当する位置には見られないマウス枠組構造の残基のみを置換することであった。このような場合には、ヒト枠組構造の2個以上のアミノ酸残基が同じ位置について知られているときには、最も一般的なものがヒト化に選択される。

m679V_Hまたはm679V_Kの枠組構造領域のそれぞれについてのアミノ酸配列を用いて、NCBIデーターベースを検討し、ヒト抗体(hAb)配列とアライン(align)した。ネズミ679枠組構造のほとんどのアミノ酸残基は相当する位置ではデーターベースのヒト枠組構造の幾つかまたは総てと同一であったので、それらをh679の代わりに保存した。ヒト枠組構造のいずれにも見られないネズミ679枠組構造のアミノ酸残基については、相当する位置の同種hAbに見られる最も一般的な残基で置換する。しかしながら、特定の位置における残基が、CDRと相互作用を行いまたはV_HとV_Kの会合に関与すると思われるときには(E. A. Padlan, Molecular Immunology, 31,169-217, 1994)、m679の残基をh679に保持する。

置換
図20は、m679とヒト化h679の配列を示している。Kabat番号系を用い、枠組構造領域(FR)並びにCDRを示している。矢印は、アミノ酸置換を表す。下記の総ての考察について、高レベルの配列同一性を有するヒト配列をm679と比較した。

V _H 枠組構造領域1 (V _H FR-1)
m679V_HFR-1アミノ酸の1個を除く総てはh-Abで一般に見られるので、h679でそのままにした。V_H-3位において、h-Abで常にこの位置にあるグルタミン(Q)を、h-Abでは見られないイソロイシン(I)の代わりに用いる。V_HI3Q置換はm679ジアボディーおよび二重特異性ジアボディーのいずれにも以前に導入されており、発現生成物の溶解度レベルを増加させることが分かった。

V _H 枠組構造領域2 (V _H FR-2)
この領域は小さいが、発散性である。m679のV_HFR-2における3個の位置に見られる残基は、h-Abでは見られない。m679では、ロイシン(L)はV_H-37位にあるが、これはh-Abではほとんど常にバリンである。しかしながら、このロイシンはh679で保持されており、この位置はV_HとV_Kの会合に強力に関与していることが知られており、CDR残基と接触していることが多いからである。V_H42と44位はh-Abでは常にグリシンであり、V_KまたはCDRと接触しない。従って、V_H-42のグルタミン酸(E)とV_H-44のアルギニン(R)はそれぞれグリシンに代わっている。

V _H 枠組構造領域3 (V _H FR-3)
V_HFR-3における32の位置における3箇所の置換により、h679のこの領域が完全にヒト化された。３箇所の位置のいずれもV_H-V_KまたはCDR接触に関与していることは知られておらず、下記の置換はそれぞれの位置について最も一般的なh-Abアミノ酸で行った: V_H-77では、アスパラギン(N)の代わりにセリン(S)、V_H-84ではセリン(S)の代わりにアラニン(A)、およびV_H-85ではアラニン(A)の代わりにグルタミン酸(E)とした。

V _H 枠組構造領域4 (V _H FR-4)
V_H-110におけるセリン(S)をトレオニン(T)で置換することによって、この領域は完全にヒト化される。しかしながら、技術的理由により、h679のV_HFR-4ではTを保持することを選択する。

V _K 枠組構造領域1 (V _K FR-1)
この領域は、h-Ab中でかなりの可変性を有する。V_KFR-1における23個の位置の20におけるm679アミノ酸は、h-Abにとって受容可能である。下記の置換は、それぞれの位置について最も一般的なh-Abアミノ酸を用いて3箇所で行った: V_K-5では、セリン(S)の代わりにトレオニン(T)、V_K-18では、リシン(K)の代わりにアルギニン(R)、およびV_K-21では、メチオニン(M)の代わりにロイシン(L)とした。これらの位置は、V_H−V_KまたはCDR接触に関与していることは知られていない。

V _K 枠組構造領域2 (V _K FR-2)
この短い領域はヒト配列に類似しており、そのまま受容可能である。

V _K 枠組構造領域3 (V _K FR-3)
この大きな(31アミノ酸)領域は、完全なヒト化には4個の置換が必要である。V_K-63においてh-Abに常に見られるセリン(S)は、トレオニン(T)を置換した。V_K-78においてh-Abに常に見られるロイシン(L)は、バリン(V)を置換した。V_K-80でh-Abに通常見られるアラニン(A)は、セリン(S)を置換した。V_K-83においてh-Abに常に見られるバリン(V)は、ロイシン(L)を置換した。これらの位置のいずれも、V_H−V_KまたはCDR接触に関与していることは知られていない。

V _K 枠組構造領域4 (V _K FR-4)
この短い領域はヒト配列に類似しており、そのまま受容可能である。
上記のm679のV_HおよびV_K枠組構造で行った全部で13個だけのアミノ酸置換により、新たな枠組構造は、2個、すなわちV_HとV_Ksの接触に関与していることにより保持されているVH-37位のロイシン、および技術的理由により保持されているVH-110位のトレオニンを除き、h-Abに見られる総ての残基を含む。

方法
上記13個の突然変異のうち12個を含み、m679scFvをh679ジアボディーに転換する8種類のオリゴヌクレオチドPCRプライマーを合成して、4種類のPCR生成物を生成した。突然変異体配列を、Taqポリメラーゼを用いて679scFv-L5プラスミド構築物から増幅した。制限部位を遺伝子工学処理を施してプライマーとし、コードされたアミノ酸配列を保存しながらPCR生成物を連結させた。プライマーのそれぞれに含まれる配列、コード領域、制限部位および特定の突然変異を、表4にまとめている。プライマーとPCR生成物の総体的位置を、図21に図解する。PCR生成物を、それぞれPCRクローニングベクター pGemT (Promega)にクローニングした。標準的方法を用いる数回のサブクローニングにより、4種類のPCR配列を集めて、679V_HI3Qの最初の120ヌクレオチドに付加し、h679scFv-L5-pGemT構築物を生成した。この構築物から、V_HおよびV_Kドメインを一緒に、h679ジアボディーのpET26b発現ベクターに導入し、または完全にヒト化した二重特異性ジアボディーを作製するために個々に導入した。サブクローニング処理を、下記に詳細に説明する。

構築物A 3個のV _H 突然変異を有する1-247
679VH-I3Q突然変異 (679VHI3Q-pGemT) を含むプラスミドクローンを制限酵素BspEI(塩基対121)およびPstI(インサートのpGemTベクター3'における) で消化し、679VHI3Qの最初の121塩基対をベクターと共に残した。ベクター断片をXmaI (5'末端)およびPst I (3'末端)で消化したPCR生成物Aと連結し、構築物Aを生成した。BspEI-XmaI連結は、これらの制限酵素をそれぞれ、その後の工程において用いるので、両方の部位を破壊する点に留意することが重要である。

構築物B 追加の2個のV _H および1個のV _K 突然変異を有する1-415
PCR生成物BをpGem Tにクローニングし、T7配向においてクローンについてスクリーニングした。B断片をpGemTクローンからPstIで切り取り、構築物AのPstI部位に連結した。クローンを、構築物Bについて適正なインサート配向についてスクリーニングした。

構築物C 3個の追加のV _K 突然変異を有する1-589
PCR生成物CをpGem Tにクローニングし、T7配向においてクローンについてスクリーニングした。C断片をpGemTクローンからXmaIおよびNdeI(ベクター部位)で切り取り、同じ酵素で消化した構築物Bに連結した。

構築物D pGemTにおけるヒト化679scFv
PCR生成物DをpGem Tにクローニングし、T7配向においてクローンについてスクリーニングした。D断片をpGemTクローンからBspEIおよびNdeIで切り取り、同じ酵素で消化した構築物Ｃに連結した。

H679scFv-L5の構築およびh679ジアボディーの生成
h679scFv-L5配列をpGemT構築物からNcoIとXhoIで切り取り、同様の方法で消化したpET26bベクターに連結した。この構築物を用いて、BL21 (P-LysS) E. coliを形質転換した。培養条件、誘導、および精製は、例2のm679ジアボディーについて記載したのと同様に行った。可溶性画分における発現レベルは、HSGにカップリングしたセンサーチップを用いるBIAコア分析によって評価した。h679ジアボディーの発現レベルは、野生型m679ジアボディーについて1μg/Lまたはm679I3Qジアボディーについて10μg/Lと比較したところ、50μg/Lであった。h679ジアボディーは、BIAコア分析により、m679I3Qジアボディーに匹敵する結合特性を示した。

例9 BS1.5H
例6に記載の方法を用いて、h679VHおよびh679V_Kドメインを、hMN14のV_HおよびV_Kを有するpET-ERベクターに組込み、完全なヒト化BS1.5H二重特異性ジアボディー構築物を作製した。ジシストロン発現ベクターを、図9に略記した一連のサブクローニングの手法によって構築した。最初に、h679-scFv-L5およびhMN14-scFv-L5のV_K配列をBamHIおよびXhoIによる切り出しによって交換し、pET26bに2種類の中間体構築物を生成した。NcoIおよびXhoIを用いてpET26bから切出した配列h679V_H-L5-hMNl4V_Kを含むDNA断片をpET-ERベクターの同じ制限部位に連結し、中間体クローン(h679V_H-L5-hMN14V_K-pET-ER)を生成した。ポリペプチド2(下記)についてのコード配列の他にリボソーム結合部位を含む900bpのDNA断片を、XbaIおよびBlpIを用いてhMN14V_H-L5-h679V_K-pET26bから切出した。この断片をh679V_H-L5-hMN14V_K-pET-ERのSpeIおよびBlpI制限部位に連結し、最終的な二重特異性発現構築物BS1.5Hを作製した。ジシストロン発現カセットは、下記のような配列を有する2種類のポリペプチドをコードする:
ポリペプチド1
Pel B; h679V_H; GGGGSリンカー; hMN14V_K; 6His
ポリペプチド2
Pel B; hMN14V_H; GGGGSリンカー; h679V_K; 6His

このカセットをE. coliで発現させると、ポリペプチドの幾つかは折り畳まれ、自発的に可溶性の二重特異性ジアボディーを形成する。

BS1.5H構築物を用いて、E. coli (BL21-pLysS)細胞を形質転換した。組換えBS1.5Hタンパク質を、例6に記載の通りに発現させ、精製した。可溶性タンパク質発現のレベルは0.55 mg/Lであり、BS1.5より約10％高かった。精製したBS1.5Hのサイズ排除HPLC分析では、10.16分に単一タンパク質ピークを生じた(図22)。これに対し、BS2は同一条件下では保持時間が10.04分であり、BS1.5Hポリペプチドはジアボディーのみを形成することを示している。BS1.5Hの二重特異性(CEA/HSG)結合特性は、BIAコア分析によって確かめた(図23)。BS1.5HをHSGとカップリングしたセンサーチップに予備結合した後、WI2 (hMN14特異性抗イディオタイプMAb)を投与した。図23に示されるように、BS1.5Hを60ng投与したところ、相対応答は660RUとなった。続いてWI2を1μg投与したところ、シグナルは760RUまで増加した。679F(ab')₂を予備結合した後または予備結合なしの後にWI2を投与しても、応答はほとんど見られなかった。これらのデーターは、BS1.5がHSGおよびCEAを同時に結合する能力を有することを示している。BS1.5Hは679残基のヒト化によってBS1.5と異なっており、これは13アミノ酸残基の置換によって完成した。HSG結合親和性がこれらの変化によって影響されるかどうかを決定するため、BS1.5HのHSG結合についてのBIAコア結合曲線をBS1.5およびBS2と比較した。図24に例示されるように、BS1.5Hについてのオフ・レイトはBS1.5のそれに極めて類似しているが、BS2には類似しておらず、これはHSG結合親和性が低い。これは一貫して分析質濃度の範囲に関する場合であり、HSG結合親和性はヒト化によって余り影響を受けないことを示している。

例10−キャリヤー分子の結合残基/ハプテン抱合体
治療薬は、下記の形態をとることができる:
(薬剤)_m-結合残基- (ハプテン)_n

治療薬は、ペプチド性、タンパク質性、または非タンパク質性残基により共有結合している少なくとも2個のハプテンを含んでなる。ハプテンの非制限的例は、フルオレセインイソチオシアネート、ビタミンB-12、DTPA (ジエチレントリアミン五酢酸)、およびDOTA (1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン四酢酸)残基である。

この例は、カルボキシルエステラーゼ-DTPA抱合体の製造に関する。ウサギ肝カルボキシルエステラーゼ2バイアル(約8.5mgタンパク質含量/バイアル)を50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5 2.3mLで再構成し、溶液を、DTPA pH6.7の0.1M保存溶液0.1mLを用いて、DTPA中4.2mMとした。生成する溶液のpHを7.7−7.8の範囲に調整した後、サイクリックDTPA二無水物10mgと反応させた。室温で1時間攪拌した後、反応混合物を、0.1Mリン酸ナトリウムpH7.3を用いて、平衡にした2本の連続したSECカラムを通過させた。さらに、この溶出液を、TSK G3000SWカラム上調製用HPLCによって、4mL/分の流量にて、0.2Mリン酸ナトリウムpH6.8を溶離液として用いて精製した。精製した抱合体を、リン酸ナトリウムpH6.8を用いて、0.1Mとして、濃縮した。金属結合分析法によって決定したDTPA対カルボキシルエステラーゼのモル置換比は、2.95対1〜4.43対1の範囲であった。

当業者であれば、様々な修飾および変更を本発明による組成物および方法に行うことができることは明らかであろう。従って、本発明は、このような修飾および変更が特許請求の範囲およびそれらと同等なものの範囲内にあるという条件で、これらの修飾および変更を包含するものである。
上記で引用した総ての公表物の開示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。

679-scFv-L5発現プラスミドからE. coliで合成され、かつ、679ジアボディーを形成する679の一本鎖Fv(scFv)ポリペプチドの図解表現である。未処理ポリペプチドをコードする核酸構築物は、pelBシグナルペプチド、5アミノ酸リンカーによってカップリングされた679V_HおよびV_Kコード配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)、およびカルボキシル末端の6ヒスチジン(His)アフィニティータグを含む。この図は、pelBリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画図面、およびHSG結合部位を含む679ジアボディーの棒線画図面も示している。 679scFv-L5で形質転換したE. coli BL21 p-LysS培養物からの679 scFvの発現を分析するのに用いるクーマシーブルーで染色したSDS-PAGEゲル:レーン1-5、イソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)で20℃で一晩誘導;レーン6および7、誘導せず。レーン3では、培地を10倍に濃縮した。可溶性(レーン4および6)および不溶性(レーン5および7)タンパク質を、細胞分解物の遠心分離によって分画した(レーン2)。679scFvを8M尿素中で可溶化した後に固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって不溶性画分から精製した(レーン1)。 hMN-14-scFv-L5発現プラスミドからE. coliで合成され、かつ、hMN-14ジアボディーを形成するhMN14scFvポリペプチドの図解表現である。未処理ポリペプチドの遺伝子構築物はpelBシグナルペプチド、5アミノ酸リンカーによってカップリングされたhMN14V_HおよびV_Kコード配列、およびカルボキシル末端の6ヒスチジンアフィニティータグを含む。この図は、pelBリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画図面、およびCEA結合部位を含むhMN-14ジアボディーの棒線画図面も示している。精製hMN-14ジアボディーのサイズ排除型高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)の結果をまとめて示したものである。図AはIMAC精製したhMN-14ジアボディーのHPLC溶出曲線である。図AおよびBにおけるhMN-14ジアボディーのHPLC溶出ピークを、矢印で示す。図Bは、WI2抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィーによって精製したhMN-14ジアボディーのHPLC溶出曲線である。図Bのx軸上に示した*9.75は、コントロールhMN14-Fab'-S-NEM (MW〜50kDa)のHPLC保持時間(9.75分)である。クーマシーブルーで染色した還元型SDS-PAGEゲル(図A)。このゲルは、IMAC精製およびWI2抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー後のhMN14ジアボディー試料の純度を示す。M_r標準物とhMN-14scFvポリペプチドの位置を、矢印で示す。図Aのレーン1は、IMAC精製したhMN14ジアボディーを含む。同図のレーン2はアフィニティー精製したhMN14ジアボディーを含む。図Bは等電点電気泳動(IEF)ゲルである。pI標準物およびhMN14scFvジアボディーの位置を、矢印で示す。図Bのレーン1は、標準物として用いたhMN14Fab'-S-NEMを含む。同図のレーン2は、WI2精製hMN14ジアボディーを含む。レーン3は、WI2アフィニティーカラムからの未結合フロースルー画分を含み、ペプチドはこの方法によって効果的に精製されることを示している。ジアボディー投与後の最初の96時間の腫瘍および血液に見られる¹³¹I-hMN14ジアボディーの濃度を示す。組織1g当たりの投与線量の百分率(%ID/g)として測定した¹³¹I-hMN-14ジアボディーの濃度を、時間に対してプロットしている。黒塗り四角形は腫瘍試料のデーター点を示し、白抜き四角形は血液試料のデーター点を示す。肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、小腸および大腸などの正常および腫瘍組織における投与から48時間後の¹³¹I-hMN-14ジアボディーの生体内分布を示す。¹³¹I-hMN-14ジアボディーの量は、組織1g当たりの投与線量の百分率(%ID/g)として示す。 pET-ERベクターの作製の図解表現である。図Aは、MCS2の二本鎖DNA配列を示す。制限部位を配列上に示す。MCS2を、図Bに示すpET26bベクターのBlpI制限部位に連結した。図Cは、MCS2配列を含むpET-ERベクターのダイアグラムを示す。 BS1、BS1.5およびBS2によって表される3種類の679xhMN14二重特異性ジアボディー変異体の発現に用いる構築物の生成に伴う工程の図解表現である。 pET-ERベクターにおけるジシストロン発現カセットおよび合成される2つの異種ポリペプチドの棒線図、および679xhMN14二重特異性ジアボディーの形成の図解表現である。ジシストロンカセットは、T7プロモーターを介してT7 RNAポリメラーゼから生成した単一RNAメッセージをコードする。このメッセージは2つのリボソーム結合部位(RBS)および2つの異種ポリペプチドのコード配列を含む。棒線図は、ジシストロン発現カセットから合成される2種類の成熟異種ポリペプチド679V_H(G₄S)hMN14V_K(左)およびhMN14V_H(G₄S)679V_K(右)を示す。679xhMN14二重特異性ジアボディー(BS1、BS1.5またはBS2)は棒線図として表され、異種ポリペプチドの対から形成される。精製後のBS1.5のサイズ排除HPLC分析を示す。BS1.5のHPLC溶出ピークは9.22分である。誘導した5リットルの培養物からの可溶性タンパク質を、Ni-NTAIMACに続いてQ-Sepharoseアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Q-Sepharoseカラムの画分のフローを注入し、HPLC分析を行った。クーマシーブルーで染色し、BS2の精製を分析するのに用いた還元型SDS-PAGEゲルを示す。矢印は、M_r標準物とBS2ポリペプチド成分679V_H-hMN14V_KおよびhMN14V_H-679V_Kの位置を示す。誘導した5リットルの培養物からの可溶性タンパク質を、4mLのNi-NTAカラムに装填した。カラムを40mMイミダゾールを含む緩衝液で洗浄/溶出した後(レーン3)、100mMイミダゾールで2つの画分にて溶出した(レーン1および2)。40mMイミダゾール溶出液の不純物は、溶出液をQ-Sepharoseアニオン交換カラムを通過させることによって除去した(レーン4)。 IEFゲルによるBS1、BS2およびBS1.5の純度を示す。これらの3種類のジアボディーを、Ni-NTAIMACに続いてQ-Sepharoseアニオン交換クロマトグラフィーによって可溶性タンパク質抽出物から精製した。pIマーカーの位置は矢印で示し、試料はレーンには関わりなく同定する。低密度HSGとカップリングしたセンサーチップを用いて様々な濃度のBS1.5について得られたBIAコア結合曲線を示す。これらのデーターを用いて、オン・レイト(on-rates)およびオフ・レイト(off-rates)の計算を行った。競合的酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)の結果をグラフに表したものである。HRP抱合したhMN14IgG(1nM)を4−500nMの範囲の濃度のBS1.5または化学的に結合した679xhMN14F(ab')₂と混合した後、CEAをコーティングした(0.5pg/ウェル)ウェルでインキュベーションした。阻害率(%)を、試料のnM濃度に対してプロットする。 HSGおよびWI2に対するBS1.5の二重特異性結合特性を示すBIAコアセンサーグラムである。BS1.5(60ng)を、高密度HSGとカップリングしたセンサーチップに加え、hMN14結合抗イディオタイプMAb、WI2を400ngずつ2回投与することにより、固定化BS1.5に結合することができた。矢印は、投与時間を示す。ジアボディーの投与後の最初の96時間にわたる腫瘍および血液中の¹³¹I-BS1.5のレベルを示す。組織1g当たりの投与線量の百分率(%ID/g)として測定した¹³¹I-BS1.5の濃度を、時間に対してプロットする。菱形は腫瘍試料についてのデーター点を表し、黒塗り円は血液試料のデーター点を表す。腫瘍、および肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、小腸および大腸などの正常組織における12および24時間後の¹³¹I-BS1.5ジアボディーの生体内分布を示す。¹³¹I-BS1.5の濃度は、組織1g当たりの投与線量の百分率として測定した(% ID/g)。 BS1.5でプレターゲッティングした担癌マウスでの¹¹¹In-IMP241ペプチドの生体内分布である。GW39担癌ヌードマウスに、BS1.5ジアボディーを投与した。クリアランス12時間後に、¹¹¹インジウムを標識したIMP241ペプチドを投与した。腫瘍、および肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、小腸および大腸などの正常組織における放射能を、¹¹¹In-IMP241の投与から3および24時間後に測定した。¹¹¹In-IMP241の濃度は、組織1g当たりの投与線量の百分率として測定した(% ID/g)。 Kabat番号図を用いるネズミ(m)およびヒト化(h)679V_HおよびV_Kアミノ酸配列の整列を示す。ヒト化の際に行ったアミノ酸置換を、矢印で示す。CDRおよび枠組構造領域を、表示している。 679scFv-L5のヒト化に用いたPCRプライマーの相対位置を示す。矢印は、プライマーを表す。中間PCR生成物も示す(A、B、CおよびD)。総ての番号は、679scFv-L5における核酸の位置を表す。精製後のBS1.5Hのサイズ排除HPLC分析を示す。BS1.5HのHPLC溶出ピークは、10.16分である。誘導した5L培養物からの可溶性タンパク質を、Ni-NTA IMACに続いてQ-Sepharoseアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Q-Sepharoseカラムの画分のフローを注入し、HPLC分析を行った。 HSGおよびWI2に対するBS1.5Hの二重特異性結合特性を示すBIAコアセンサーグラムである。BS1.5(60ng)を高密度HSGとカップリングしたセンサーチップに加え、hMN14結合抗イディオタイプMAb、WI2を1μg投与することにより、固定化BS1.5に結合することができた。矢印は、投与時間を示す。 BS1.5H、BS1.5およびBS2の間のBIAコア結合曲線の比較を示す。同量の二重特異性ジアボディーを低密度HSGとカップリングしたセンサーチップに加え、生成する結合曲線を重ね合わせた。 679-scFv-L5についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸を示す。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、679V_Hのコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-780は、679V_Kのコード配列である。787-804は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 679-I3Qについての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸を示す。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、679V_H(I3Q)のコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-780は、679V_Kのコード配列である。787-804は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 679-C101Sについての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸を示す。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、679V_Hのコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-780は、679V_K(C101S)のコード配列である。787-804は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 679I3Q/C101Sについてのコード配列およびコードされたアミノ酸を示す。 hMN14-scFv-L5についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸を示す。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-423は、hMN14V_Hのコード配列である。424-438は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。439-759は、hMNV_Kのコード配列である。766-783は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS1 (679xhMN14二重特異性ジアボディー:変異体1)のポリペプチド#1についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、679V_Hのコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-762は、hMN14V_Kのコード配列である。769-786は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS1 (679xhMN14二重特異性ジアボディー:変異体1)のポリペプチド#2についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-423は、hMN14V_Hのコード配列である。424-438は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。439-777は、679V_Kのコード配列である。784-801は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS1.5 (679xhMN14二重特異性ジアボディー:変異体2)のポリペプチド#1についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、679V_H(I3Q)のコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-762は、hMN14V_Kのコード配列である。769-786は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS1.5 (679xhMN14二重特異性ジアボディー:変異体2)のポリペプチド#2についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-423は、hMN14V_Hのコード配列である。424-438は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。439-777は、679V_Kのコード配列である。784-801は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS2 (679xhMN14二重特異性ジアボディー:変異体3)のポリペプチド#1についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、679V_H (I3Q)のコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-762は、hMN14V_Kのコード配列である。769-786は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS2 (679xhMN14二重特異性ジアボディー:変異体3)のポリペプチド#2についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-423は、hMN14V_Hのコード配列である。424-438は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。439-777は、679V_KC101Sのコード配列である。784-801は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 h679-scFv-L5についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、h679V_Hのコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-780は、h679V_Kのコード配列である。787-804は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS1.5H (h679xhMN14二重特異性ジアボディー)のポリペプチド#1についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-426は、h679V_Hのコード配列である。427-441は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。442-762は、hMN14V_Kのコード配列である。769-786は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。 BS1.5H (h679xhMN14二重特異性ジアボディー)のポリペプチド#2についての核酸のコード配列およびコードされたアミノ酸である。1-66は、pelBリーダーペプチドのコード配列である。70-423は、hMN14V_Hのコード配列である。424-438は、リンカーペプチド(GGGGS)のコード配列である。439-777は、h679V_KC101Sのコード配列である。784-801は、6ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。

Claims

ヒスタミン-スクシニル-グリシル(HSG)残基を含む分子に親和性を有する少なくとも一つのHSG結合部位と、癌胎児性抗原(CEA)に親和性を有する少なくとも一つのCEA結合部位とを含んでなる、多価の多重特異性結合タンパク質であって、
前記HSG結合部位が、HSG結合抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)であって、CDR1配列としてのIYTMS、CDR2配列としてのTLSGDGDDIYYPDSVKG 、およびCDR3配列としてのVRLGDWDFDVを含んでなる、重鎖可変領域の相補性決定領域と、
HSG結合抗体の軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)であって、CDR1配列としてのKSSQSLFNSRTRKNYLG、 CDR２配列としてのWASTRES 、およびCDR３配列としてのTQVYYLCTを含んでなる、軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)と
を含んでなる、多価の多重特異性結合タンパク質。
前記結合タンパク質がネズミ配列、ヒト化配列、またはヒト配列を含んでなる、請求項１に記載の結合タンパク質。
前記HSG抗原結合部位が第一および第二のポリペプチドセグメントを含んでなり、該第一および第二のポリペプチドセグメントが互いに会合して前記HSG抗原結合部位を形成する、請求項１に記載の結合タンパク質であって、
前記第一のポリペプチドセグメントが、前記HSG結合抗体の重鎖可変領域のCDRを含んでなり、
前記第二のポリペプチドセグメントが、前記HSG結合抗体の軽鎖可変領域のCDRを含んでなる、結合タンパク質。
前記第一のポリペプチドセグメントが配列番号10の残基70−426を含む679MAbのV_Hポリペプチドを含んでなり、かつ前記第二のポリペプチドセグメントが配列番号10の残基442−780を含む679MAbのV_Kポリペプチドを含んでなるものである、請求項３に記載の結合タンパク質。
前記第一のポリペプチドセグメントが配列番号32の残基70−426を含むh679MAbのV_Hポリペプチドを含んでなり、かつ前記第二のポリペプチドセグメントが配列番号32の残基442−780を含むh679MAbのV_Kポリペプチドを含んでなるものである、請求項３に記載の結合タンパク質。
前記第一のポリペプチドセグメントが配列番号12の残基70−426を含む679V_HI3QのV_Hポリペプチドを含んでなり、かつ前記第二のポリペプチドセグメントが配列番号10の残基442−780を含む679MAbのV_Kポリペプチドを含んでなるものである、請求項３に記載の結合タンパク質。
前記第一のポリペプチドセグメントが配列番号12の残基70−426を含む679V_HI3QのV_Hポリペプチドを含んでなり、かつ前記第二のポリペプチドセグメントが配列番号14の残基442−780を含む679V_KC101SのV_Kポリペプチドを含んでなるものである、請求項３に記載の結合タンパク質。
前記CEA抗原結合部位が第三および第四のポリペプチドセグメントを含んでなり、該第三および第四のポリペプチドセグメントが互いに会合して前記CEA抗原結合部位を形成する、請求項３に記載の結合タンパク質。
前記第三のポリペプチドセグメントが配列番号18の残基70-423を含むhMN14MAbのV_Hポリペプチドを含んでなり、かつ前記第四のポリペプチドセグメントが配列番号18の残基439-759を含むhMN14MAbのV_Kポリペプチドを含んでなる、請求項８に記載の結合タンパク質。
前記第一および第三のポリペプチドセグメントが第一のリンカーによって連結され、かつ前記第二および第四のポリペプチドセグメントが第二のリンカーによって連結されてなる、請求項８に記載の結合タンパク質。
前記第一のリンカーおよび前記第二のリンカーが、それぞれ0-5個のアミノ酸残基を含んでなるものである、請求項１０に記載の結合タンパク質。
前記結合タンパク質がジアボディー(diabody)である、請求項８に記載の結合タンパク質。
前記ジアボディーが、配列番号20および配列番号22を含んでなるジアボディー、配列番号24および配列番号26を含んでなるジアボディー、配列番号28および配列番号30を含んでなるジアボディー、並びに配列番号34および配列番号36を含んでなるジアボディーからなる群から選択されるものである、請求項１２に記載の結合タンパク質。
前記第一、第二、第三および第四のポリペプチドセグメントが、それぞれ第一、第二、第三および第四のcDNAによってコードされるものである、請求項８に記載の結合タンパク質。
前記第一のcDNAが、配列番号19および配列番号21を含んでなり、前記第二のcDNAが、配列番号23および配列番号25を含んでなり、前記第三のcDNAが、配列番号27および配列番号29を含んでなり、前記第四のcDNAが、配列番号33および配列番号35を含んでなる、請求項１４に記載の結合タンパク質。
前記第一および第三のcDNAが単一の核酸分子に含まれるものである、請求項１４に記載の結合タンパク質。
前記第二および第四のcDNAが単一の核酸分子に含まれるものである、請求項１４に記載の結合タンパク質。
前記第一、第二、第三および第四のcDNAが、単一の発現カセット上にある、請求項１４に記載の結合タンパク質。
前記発現カセットがプラスミドに含まれるものである、請求項１８に記載の結合タンパク質。
請求項１９に記載のプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
結合タンパク質を産生する方法であって、請求項２０に記載の宿主細胞を適当な培地にて培養し、前記結合タンパク質を前記培地から分離することを含んでなる、方法。
診断薬、治療薬、またはそれらの組合せ、リンキング残基、および２つ以上のハプテン残基を含んでなるキャリヤー分子であって、
前記ハプテン残基が、１つ以上の請求項１に記載の結合タンパク質のHSG結合部位と同時に結合することができるように配置されてなる、キャリヤー分子。
診断薬、治療薬、またはそれらの組合せをターゲットに送達するためのキットであって、
請求項１に記載の結合タンパク質と、
請求項２２に記載のキャリヤー分子と
を含んでなる、キット。
請求項１に記載の結合タンパク質が、それらを必要とする被験者に投与され、かつ
請求項２２に記載のキャリヤー分子が、前記被験者の血流から非結合タンパク質を除去するのに十分な時間を置いた後、前記被験者に投与される、
請求項２３に記載のキット。
前記治療薬が、薬剤、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抱合体、および放射性核種からなる群から選択されるものである、請求項２３に記載のキット。
ヒトの疾患を検出または治療するための、請求項２３に記載のキット。
前記ヒトの疾患が、癌、自己免疫疾患、感染症、循環器疾患、および炎症性疾患からなる群から選択されるものである、請求項２６に記載のキット。