JPH10505056A

JPH10505056A - チロシンキナーゼ阻害剤を含有する免疫接合体

Info

Publication number: JPH10505056A
Application number: JP8508124A
Authority: JP
Inventors: ウックン，ファティ・エム
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1995-08-08
Publication date: 1998-05-19
Also published as: US5587459A; DE69506561T2; EP0776338A1; DE69506561D1; CA2197577A1; WO1996006116A1; US5872223A; ATE174345T1; EP0776338B1; AU3216895A

Abstract

(57)【要約】チロシンキナーゼに関連したレセプタを特異的に阻害できる細胞表面レセプタを標的とするリガンドと結合したチロシンキナーゼ阻害剤を含有する、ヒトにおけるガンおよび自己免疫疾患を処置するための免疫接合体が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】チロシンキナーゼ阻害剤を含有する免疫接合体発明の背景ガンは、ただ心臓病のみに次ぐ、男女両方の主な死亡原因である。ガンに対する戦いにおいて、多数の技術がこれまでに開発されてきており、またガンは、この病気の性質と原因を解明することを目指した、今日の研究対象となっている。さらに研究の目的は、ガンのコントロールと治療のための技術を提供することにある。３種の主要な系列の抗ガン剤が知られている。薬剤のそれぞれの系列は、既に認識された作用メカニズムに連携している。第一の抗ガン剤は、一般に共有結合の方法でＤＮＡと結合して二元損傷を形成させる、アルキル化剤であろう。二元損傷は同一鎖の隣接した塩基もしくは近くの塩基を含み、あるいはまた鎖間架橋を形成する対向鎖上の塩基を含む。第二の抗ガン剤は、ＤＮＡの合成または組立に含まれる酵素を一般に阻害する代謝拮抗薬であろう。言い換えると、代謝拮抗薬はＤＮＡの合成プロセスにおける詐欺を目的とするか、もしくは類似の基質として役立つことができる。第三の抗ガン剤はＤＮＡ螺旋に挿入するか、またはＤＮＡ中に鎖破れ目を導くなどにより作動する、抗生物質であろう。数千の潜在的抗ガン剤が評価されている。本質的には、上記のメカニズムの一つによって、有効な薬剤（極めて少数の薬剤が見つけられた）が作用するようである。医薬品の目標決定は、正常細胞を無傷のままにして、腫瘍細胞を殺すための潜在的に魅力のある、新しい方策である。医薬の目標決定における決定的解決法は、モノクロナール抗体（ＭoＡb）の無制限な供給を可能にする、ハイブリドーマ技術の出現である。腫瘍細胞の一定の集団に対する選択性を持つ試薬を構築するため、ＭoＡbまたは細胞を標的とする他のタンパク質は生物活性剤と結合して、坦体部位の選択性に生物活性部位の効力を結合させる、免疫接合体を形成する。モノクロナール抗体の選定は、クローン原性の発芽の分析によって決定される、悪性細胞の表面抗体の側面に基く。過去十年間で免疫接合体は、様々な腫瘍の治療のために、最近ではリューマチ性関節炎や後天性免疫不全症候群（エイズ）等の免疫学的失調の治療のために検討されてきた。これらの薬物はヒトの病気に対して安全で、有効な治療を提供するいくらかの可能性を示したが、多くの困難が残る。理想的には、標的細胞上の一貫した位置を定めることができ、信頼できるマーカーならば、免疫接合体の結合部位が非標的問題を完全に回避するだろう。実際に、生体の生命を支える器官によって発現される抗体との交差反応性は、しばしばインビボでの適応において許容できない合併症を引き起こす。病気の過程によって患者がすでに免疫反応に抑制を示しても、患者が免疫接合体の個別の要素に対して免疫応答を示す、という可能性もまた存在する。さらに、インビトロの研究で得られた細胞毒性のため、患者が耐性を示しうる投与量での効力の欠如により、臨床適応は限定されよう。ついに、固形腫瘍は完全に浸透し難く、また血液学的悪性腫瘍において、白血病およびリンパ腫における標的細胞へ一層容易に接近できるにもかかわらず、残留する病気が再発の原因となりうる。かくして、免疫接合体治療については重大で、繰り返す問題がある。それ故、様々な病状に関連して細胞集団を標的とし、かつ阻害し、もしくは排除するための、改良された医薬およびその使用法に対する継続した必要性がある。発明の要約本発明は、例えばＳrcプロトオンコジーン系列蛋白質チロシンキナーゼと複合体を形成するレセプタなどの、チロシンキナーゼ活性と連携した細胞表面レセプタと結合する、抗体などの細胞特異性蛋白質リガンドに連携したチロシンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤を含む免疫接合体に関する。チロシンキナーゼ阻害剤はレセプタと連携したチロシンキナーゼを阻害し、他の細胞のチロシンキナーゼに影響を与えずに、標的細胞を阻害するか、もしくは殺すべく作動する。本発明は、細胞内触媒領域を欠く、多数の細胞表面レセプタが、Ｓrcプロトオンコジーン系列蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫs）と連携して、付随した情報形質導入性機能を有する、細胞型特異的膜内外レセプタチロシンキナーゼを形成するという、本発明者らの発見に基くものである。このようなレセプタＰＴＫ複合体中のＳrc系列ＰＴＫは、情報形質導入剤として行動し、そのレセプタを下流の細胞形質の情報を出す通路に連結させる。それ故に、このような細胞型特異的膜内外レセプタキナーゼは、それらが、その関連したレセプタに特異的な抗体を経由して標的となりうるので、ＰＴＫ阻害剤を使用する、生物療法に適している。例えば、Ｌynキナーゼは、多数のガン細胞中のＣＤ１９レセプタと連携して、抗ＣＤ１９モノクロナール抗体を含む免疫接合体によって容易に阻害されるが、ＣＤ１９と連携しないＳykキナーゼはそうではない。さらにまた、ただガン細胞がその連携したレセプタを発現しさえすれば、所定のキナーゼはヒトのガン細胞中で阻害されない。すなわち、ＬynはＣＤ１９の存在しないときには阻害されない。従って、本発明の好ましい態様は、モノクロナール抗体に連結し、ガン細胞上のレセプタに結合する、イソフラボンなどのＴＫ阻害剤を含む。モノクロナール抗体／レセプタの具体例としては、Ｂ４３／抗ＣＤ１９、Ｂ５３／抗ＣＤ４、ＢＸＵ／抗Ｂp４７、ＴＸＵ−１／抗Ｔp１２０、ＮＸＵ／抗神経芽腫、ＴＰ３／抗骨肉腫が挙げられる。好ましい抗体はヒトガン細胞（さらに具体的には、Ｂ４３および抗ＢＰ４７に対するＢ−直系急性リンパ芽球腫白血病細胞およびリンパ腫細胞；Ｂ５３およびＴＸＵ−１に対するＴ−直系白血病細胞およびリンパ腫細胞；ＮＸＵに対する神経芽腫細胞；およびＴＰ３に対する骨肉腫細胞）の表面に特異的に反応する。本明細書中で用いられるように、「抗体」の用語は細胞特異的抗体断片およびそのサブユニットを含む。本免疫接合体のチロシンキナーゼ阻害剤は、思いがけないことだが、標的細胞のアポプトシスを誘発する。これは、放射線誘発アポプトシスを防ぐことが報告されている、ゲニステインなどのシロシンキナーゼ阻害剤の先に報告された活性に対比される。さらにまた、先にＴＫ阻害作用を有していないことが報告されているダイゼインは、細胞標的分子に連結すると本発明の免疫接合体を生成するが、有効なレベルの抗ＴＫ作用を示す。例えば、ゲニステインを含む免疫接合体は、高い量のＢＣＬ２蛋白質を発現する放射線抵抗性で、多薬剤抵抗性腫瘍細胞中にアポプトシスを誘発する。通常ＢＣＬ２蛋白質は全ての既存薬剤の細胞毒性を防止するが、ゲニステインを含む免疫接合体のその作用を阻害するようには見えない。さらにまた、下記実施例に示されるように、本発明の免疫接合体は、インビトロで標的ガン細胞のクローン原性分画を死なせ、ＳＣＩＤマウスモデル中の多くの臓器を浸透することができ、しかもヒトガン細胞にて浸潤されたこれらの臓器中で選択的に蓄積し、扱った動物に全く毒性なしに、ヒト白血病の代理モデルにおいてインビボで治療難治性ヒト白血病細胞を死なせ、単独で用いて、抗体またはＴＫ阻害剤よりも優れており、モデルシステムに試験した全ての他の薬剤よりも優れている。それ故、本発明はまた、上記で議論し、以下に詳細に示すように、ＴＫ作用に連携した、細胞表面レセプタを有する細胞の集団におけるＴＫ作用を阻害する方法を提供する。事前選択した細胞集団は、インビトロでもインビボでもＴＫ作用を阻害し、従って上記集団におけるＴＫ作用に連携した細胞事象を阻害するのに有効な量の、本発明の免疫接合体に接触させる。本発明の免疫接合体は、単独でもしくは免疫毒素と組み合わせて、あるいはそのような病苦に対する慣用の治療と組み合わせて、望ましくないほ乳類の細胞、例えばＢ−細胞、ＮＫ細胞、Ｔ− 細胞などの増殖に連携して病気や病変の治療に有効となることが期待される。そのような病変とは、他のガン、例えば急性リンパ芽球腫白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫など、腫瘍、例えば肺ガン、胸ガン、結腸ガン、子宮ガン等；皮膚ガン；中枢神経のがんや他の白血病を包含する。本発明の免疫接合体はまた臓器拒否反応に連携したＴ−細胞増殖または骨髄移植の拒否反応に巻き込まれたＮＫ細胞を免疫抑制剤として抑制したり、全身性エリテマトーデス、リュウマチ性関節炎、非糸球体ネフローゼ、乾癬、慢性活性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎(膜性)、血小板減少性紫斑病、同種移植拒否反応、溶血性貧血などを含む自己免疫病を治療するため有用である。図面の簡単な説明第１図［Ａ］は、Ｂ４３−ＧＥＮによるＲＡＭＯＳリンパ腫の処理はＣＤ１９に連携したＬＣＫキナーゼを阻害するイムノブロット法を描写する。下部の数字は長い露出時間を示す。第１図［Ｂ］は、Ｂ４３−ＧＥＮによるＲＡＭＯＳリンパ腫細胞の処理は、蛋白質豊富基質のチロシンリン酸化を減少させることを示す、イムノブロット検定法の結果を描写する。第１図［Ｃ］は、Ｂ−直系白血病細胞中でＬＹＮキナーゼを阻害するに際してＢ４３−ＧＥＮが未接合ＧＥＮよりも実質的に有効であることを示す、イムノブロットである。さらに、そのイムノブロットは、Ｂ４３−ＧＥＮを誘発したＬＹＮ阻害はＣＤ１９レセプタに特異的であるという証拠を提供して、ＴＸＵ(抗ＣＤ７)−ＧＥＮ（コントロールとして使用）はＬＹＮキナーゼを阻害しないことを示す。第１図［Ｄ］は、Ｂ−直系白血病細胞においてリン蛋白の豊富な基質のチロシンリン酸化を減少させるに際して、Ｂ４３−ＧＥＮが未接合ＧＥＮよりも実質的により有効であることを示す、イムノブロットである。さらに、そのイムノブロット抗Ｄ７−ＧＥＮが、チロシンリン酸化を減少させないので、この効果はＣＤ１９レセプタに特異的であることを示す。第１図［Ｅ］は、Ｂ−直系白血病細胞をＢ４３−ＧＥＮ免疫接合体で処理すると、ＣＤ１９レセプタに連携した、ＬＹＮキナーゼを阻害するが、未接合Ｂ４３抗体、ＳＡＮＰＡＨ修正Ｂ４３抗体およびコントロール免疫接合体抗ＣＤ７−ＧＥＮはそうではないことを示す、イムノブロット検定法の結果を描写する。第１図［Ｆ］は、Ｂ−直系ＡＬＬ細胞をＢ４３−ＧＥＮ免疫接合体で処理すると、ＣＤ１９レセプタに連結していないＳＹＫチロシンキナーゼを阻害しないことを示す、イムノブロット検定法の結果を描写する。第１図［Ｇ］は、Ｂ−直系白血病細胞をＢ４３−ＧＥＮ免疫接合体で処理すると、ＰＫＣまたはＰＫＣ依存の再生可能なセリンキナーゼを阻害しないことを示す、セリンキナーゼ再生検定法の結果を描写する。第２図は、トポイソメラーゼII酵素はＢ４３−ＧＥＮによって阻害されないことを示す、ゲルである。第２図［Ａ］は、アポプトシスを受けつつある、Ｂ４３−ＧＥＮ処理した白血病細胞の形態学的特徴を例示する、ライト・ギームサ染色サイトスピンスライドを描写する。第３図は、細胞の６４％が処理の２４時間内にアポプトシスを受けることを示す、Ｂ４３−ＧＥＮ処理したＲＡＭＯＳリンパ腫細胞のＤＮＡフロウサイトメトリー分析の描写である。第４図Ａおよび第４図Ｂは、Ｂ４３−ＧＥＮ処理ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞におけるＤＮＡ断裂を描写する。第５図は、細胞結合Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体の命運をグラフとして描写したものである。勾配密度を決めるために密度マーカービーズを用いた。血漿膜(ＰＭ)、ゴルギ(Ｇ)、小胞体(ＥＲ)およびリソソーム(Ｌ)に対する所定の勾配領域は、マーカー酵素５'−ヌクレオチダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ニュートラル−グルコシダーゼおよびヘキソサミジナーゼそれぞれの特性分布プロファイルに基いて決められた。ディックソンら(Ｄickson et al.)、Ｂiochemi stry，２２，5667(1983)。第６図［Ａ］は、ＲＡＭＯＳ細胞を接種したＳＣＩＤマウスの法医学処置の描写である。腎臓(Ａ.１およびＡ.２)：高度に多形性リンパ球様細胞の数個の脈管周囲の皮質浸潤物と同様に濃い骨盤の浸潤物が明らかであった。肝臓(Ｂ.１およびＢ.２)：高度な有糸分裂率を持つ多形性リンパ球様細胞による肝門領域の全身性浸潤が観察された。胃(Ｃ.１およびＣ.２)：一塊りの高度に多形性のリンパ球様細胞が漿膜表面に付着した。リンパ腫細胞が器官壁を侵略し、粘膜下組織領域を膨らました。第６図［Ｂ］は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト直系リンパ腫に対するＢ４３− ＧＥＮの作用の描写である。カプラン−マイアー製品限定法を用いて、何事もなく残存する確率を決め、何事もない間隔曲線を作成した。第７図［Ａ］は、２４時間先行して白血病細胞１×１０⁶ＮＡＬＭ−６を処理したＳＣＩＤマウスへ５８pmol注射による、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体（-□-）および未接合ＧＥＮ（-o-）に対する血漿濃度対時間曲線の描写である。線は二区画モデル模擬実験を示し、記号は測定した濃度を描写する。第７図［Ｂ］は、末期ヒトB-系白血病処理したＳＣＩＤマウスに71pmolを静注にて投与し（-□-）、あるいは白血病細胞を接種していない、健全なＳＣＩＤマウスに５８pmolを静注にて投与（-o-）することによる、Ｂ４３−ＧＥＮに対する血漿濃度対時間曲線の描写である。線は二区画モデル模擬実験を表し、記号は測定した濃度を描写する。第７図［Ｃ］は、末期白血病（断続線）処理したＳＣＩＤマウスまたは白血病処理していない（実線）ＳＣＩＤマウスにＧＥＮ（△）もしくはＢＰ４３−ＧＥＮ（o）を静注にて投与したのち、血漿もしくは組織濃度対時間曲線の描写である。線は生理学的薬動力学的モデルからの模擬実験を表し、記号は測定した濃度を描写する。第８図は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢ−系白血病に対するＢ４３−ＧＥＮ免疫接合体の抗白血病作用のグラフによる描写である。カプラン−メイアー製品制限法を用いて、何事もなく残存する確率を決め、何事もない間隔曲線を作成した。第９図は、ヒトＢ−系白血病細胞に対するＢ４３−ＧＥＮ処理長期残存者由来のＳＣＩＤマウス器官のＰＣＲ分析の描写である。第１０図はＢ４３−ＧＥＮの構造を示す。発明の詳細な説明１．蛋白チロシンキナーゼ細胞成長は、細胞表面上の特定のレセプタに結合する、細胞外リガンドによって大きくコントロールされる。クロスら(Ｃross et al.)，Ｃell，６４，2171(1 991)。ＥＧＦレセプタを含む、多数のこれらのレセプタは、本質的な蛋白チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）作用を有する。ヤルデンら(Ｙarden et al.)，Ａnn.Ｒev. Ｂiochem.，５７，443(1988)。レセプタ連携ＴＫsのリガンド依存活性化またはＴＫオンコプロテインの調整されない合成は、有糸分裂生殖、細胞循環調整、細胞残存および細胞変換の制御に決定的な役割を果たす、細胞基質のチロシンリン酸化となる。ウルリッヒら(Ｕllrich et al.)，Ｃell，６１，203(1990)。信号形質導入に巻き込まれる細胞状酵素の中で、蛋白チロシンキナー(ＰＴＫs )は、様々な信号を送るカスケードの開始に重要な役割を果たすようである。ＰＫsは、その予見した構造に基いて二つの主なグループに分かれる。一般にペプチドホルモンを結合させるように機能する、細胞外領域を有するものを含む、第一のＰＴＫグループはレセプタPＴＫｓである。このグループに含まれるＰＴＫs の具体例は、表皮成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子に対するレセプタ類である。第二のＰＴＫグループは、たとえこのグループの多くのメンバーが、非共有結合にて、ある型の細胞表面リガンド結合する蛋白に連携しているようであろうとも、細胞外領域を欠き、非レセプタＰＴＫsとして分類されるものを含む。このグループのメンバーとしては、fes／fps遺伝子系列のメンバーと同様にＰＴＫs のＳrc系列を含む。非レセプタ群のＰＴＫsは、それが含む所定数の酵素に関して成長し、また予見された構造における驚くべき多様性を示している。造血細胞におけるＳrc ＰＴＫsと表面蛋白（抗原）との連携は、下記表１に要約される。Ｓrc系列の非レセプタPＴＫ酵素は今日９種類：Ｓrc，Ｙes，Ｆyn，Ｌyn，Ｌc k，Ｈck，Ｆgr，ＢＩＫ，Ｙrkを含む。Ｓrc、Ｙes、ＦynおよびＬyn蛋白は、様々な細胞型中にて発現されているが、Ｌck、Ｈck、ＦgrおよびBIK蛋白は主として異なった型の造血細胞中で発現する。選択された造血細胞中のＳrc ＰＴＫsの分布は表２に示される。それぞれの細胞型においてＳrc系列の多くのメンバーが通常存在するという事実は、直ちに明らかである。その中で、それらが発現される造血細胞の型に関して、ある種のＳrc ＰＴＫsは有意義な制限を示すこともまた明らかである。Ｌck蛋白は、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞中に見いだされ、成熟マウス秘蔵、Ｂ細胞中で発現することが、報告されている。キャンベルら(Ｃamp bell et al.)，Ｍol.Ｃell.Ｂiol.，１２，2315(1992)。さらに、Ｓrcは事実上全ての他の型のヒトガンと同様に、結腸ガン、胸ガン、卵巣ガンに連携した細胞により発現する。同じく、ＦynおよびＬynは、事実上全ての型のヒトガン中で発現する。リンパ球の腫瘍発生の形質転換または不朽化は、選択されたＳrc系統メンバーの発現のパターンを変更する。例えば、Ｌynは、ＨＴＬＶ−Ｉまたはヘルペスウイルスサイミリ［Ｙamanashi et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，８６， 6538(1991)］によって形質転換された、Ｔ細胞中で発現され、Lckは不朽化および形質転換したＢ細胞中で発現される。キャンベルら（Ｃampbell et al.）上記で引用。さらにまた、Ｂ−リンパ球抗原レセプタによって開始した信号形質導入はＰＴＫsの活性化を巻き込む。キャンベルら(Ｃampbell et al.)，ＥＭＢＯ.Ｊ.，９，2125(1990)。この見解の支持は、ＬynがネズミＢ細胞ＷＥＨＩ−２３１溶解物由来のsＩgＭによって共沈できるという意見により最初に提供された。ヤマナシら(Ｙamanashi et al.)，Ｓcience，251，192(1991)。なおその上、チロシン特異的蛋白イナーゼ活性は、レトロウイルスＳrc遺伝子系列の腫瘍発生産物に連携していることが知られている。ハンターら(Ｈunter e t al.)，Ａnnu.Ｒev.Ｂiochem.，５４，８９７(1985)。減少したキナーゼ活性を有する変異子が低い形質転換能力を有し、チロシンキナーゼ活性を欠く変異子は形質転換に欠けるので、このキナーゼ活性はレトロウイルスの細胞を形質転換する能力に強く連携する。ビショップ(Ｂishop)，Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.，５２，30 1(1983)。同様のキナーゼ活性もまたＥＧＦ、血小板誘導成長因子、インシュリン、インシュリン様成長因子I等の数種の成長因子に対する細胞状レセプタに連携する。ウシロら(Ｕshiro et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，255，8363(1980)；エクら(Ｅk et al.)，Ｎature，295，419(1982)；カスガら(Ｋasuga et al.)，Ｎatu re，298，667(1982)；ジェイコブズら(Ｊacobs et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，258 ，9581(1983)。それ故に、おそらくは細胞増殖および細胞形質転換のためにチロシンリン酸化が重要な役割を果たす。２．蛋白チロシンキナーゼ阻害剤チロシンキナーゼ作用を阻害することが報告されている化合物がいくつかある。例えば、プロテアーゼ阻害剤Ｎ^β―トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトンは、 pp６０^υ-απに連携したチロシンキナーゼ作用を阻害し、細胞形態、固着、グルコース移送に関する鳥類肉腫ウイルス形質転換を元に戻すことが、示された。リチャートら(Ｒichert et al.)，Ｃell，１８，369(1979)。また、フラボンケルセチンは、cＡＭＰ独立した蛋白キナーゼ、Ｃa²⁺／リン脂質依存酵素蛋白キナーゼＣ、フォスフォリラーゼキナーゼ、Ｎa⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰase、Ｃa²⁺、Ｍg²⁺− ＡＴＰaseの作用と同様にpp６０^υ-απのチロシンキナーゼを阻害すると、報告された。グラジアニら(Ｇraziani et al.),Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.，135，583(1983) ; グラジアニら(Ｇraziani et al.),Ｂiochim.Ｂiophys.Ａcta，714，415(1981) ; グシュベンツら(Ｇschwendt et al.)，Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.，12 4，63(1984); スリラスタバら(Ｓrirastava et al.),Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes. Ｃommun.，131，１(1985)；ラングら(Ｌang et al.)，Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta ，333，180(1974); ショシャンら(Ｓhoshan et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，256，8 87(1981)。エルブスタチンの合成上の誘導体であるチルフォスチン類は、チロシン類縁体のプロトタイプであるが、チロシン残基のリン酸化を防ぎ、殆ど毒性を示さない濃度でＥＧＦに依存する細胞増殖を阻害すると、報告されてきた。ヤイシュら(Ｙaish et al.)，Ｓcience，242，933(1988)。その上、ＰＴＫ阻害作用を示すと、開示されているフラボノイド類縁体がいくつかある。クッシュマン( Ｃushman),Ｊ.Ｍed.Ｃhem.，３４，798(1991)。さらに、アミロライドは、Ｎ^a+ 、Ｋ⁺交互輸送機構に対する阻害剤としてよく知られていて、成長因子レセプタチロシンキナーゼ作用を直接阻害することが、示された。デイビスら(Ｄavis et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，260，2543(1985)。ずっと最近になってハービマイシンは、cＡＭＰ依存蛋白キナーゼまたは蛋白キナーゼＣ作用を減少させるのに有効でないが、様々な細胞質のチロシンキナーゼを不活性化することが示され、それによりこの薬剤が細胞質ＰＴＫsの特異的な阻害剤であることが明らかとなった。フクザワら(Ｆukuzawa et al.),Ｂiochem.Ｐharmacol.,４２,1661(1991)。ａ．ゲニステインシュウドモナス亜種の発酵液から導かれるイソフラボン（５,７,４'−トリヒドロキシイソフラボン）である、ゲニステイン（ＧＥＮ）は、大豆、大豆粉や豆腐中に存在する、天然の特異なチロシンキナーゼ阻害剤である。アキヤマら(Ａk iyama et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，262，5592(1987)。ゲニステインおよび関連イソフラボノイドは消化管から効率よく吸収され、血漿および尿中に測定できる水準に達し、またエストロゲン作用を有する。アドラクロイツら(Ａdlercreutz et al)，Ｌancet，342，1209(1993)。ゲニスタインはチロシンキナーゼに対する相当に特異的な阻害剤であるが、それはセリンキネーゼおよびスレオニンキネーゼの作用を阻害することはほとんどない。オガワラら(Ｏgawara et al.)，Ｊ.Ａntibiot.(Ｔokyo)，３９，606(1986 )。さらに、それは、ras−形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるトポイソメラーゼＩおよびII作用を阻害する。オクラら(Ｏkura et al.)，Ｂiochem.Ｂiophys .Ｒes.Ｃommun.，157，183(1988)。ゲニステインはまたイオン化照射またはＣＤ１９レセプタの関与を受けてきた細胞における、アポプトシスを予防することができることが示された。ウックンら(Ｕckun et al.)，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，８９，9005(1992)。蛋白チロシンキナーゼの活性化は両方の事例では強制的段階であるので、この阻害が、細胞死の誘発には重要な性質を含む細胞における、全てのＰＴＫsに関する、主としてゲニスタインのＰＴＫ阻害作用によって生起する。従って、本発明の免疫接合体は、予想外の結果、すなわち表面レセエプタに連携し、細胞生き残りのために重要である、これらのチロシンキナーゼのみを阻害することによって、標的細胞中でアポプトシスの誘発を提供すると言える（実施例６参照）。ｂ．アポプトシスアポプトシスは、新しい蛋白合成を要する活性のプロセスである。典型的に、このプロセスは、ＡＴＰを要求し、さらに新しいＲＮＡおよび蛋白合成を巻き込み、細胞のＤＮＡを退化させる、内因性エンドヌクレアーゼの活性化を最高に達し、従って細胞の恒常性のために要求される遺伝子テンプレートを破壊する。アポプトシスは、変態、分化および普通の細胞代謝回転の間における細胞の制御された欠失にて観察され、通常レセプタ対の連結した場合に制御されるようである。これらの理由のため、アポプトシスは「プログラムされた細胞死」または「細胞自殺」と呼ばれてきた。全ての細胞は、自殺を犯すべく遺伝子プログラムを有するけれど、通常はそれは抑制されている。通常の環境下では、組織によってもはや要求されない細胞のみがこのプログラムを活性化する。アポプトシス細胞死は、ヌクレオソームの間隔において、血漿膜ベビング、細胞容量損失、核濃縮およびＤＮＡの核内分解によって特徴付けられる。血漿膜保全の喪失はアポプトシスにおける比較的遅い出来事であり、低酸素症やある種の毒素に露出することにより、予め特徴付けられる、細胞死と呼ばれる壊死の形式とは異なっている。３．細胞特異性蛋白リガンドａ．モノクロナール抗体モノクロナール抗体(ＭoＡbs)は、脾臓リンパ球に骨髄原発性腫瘍の悪性細胞（骨髄腫）を融合させて生産される。ミルスタイン(Ｍilstein)，Ｓci.Ａm.，24 3，66(1980)。そのプロセスでリンパ球と骨髄腫細胞株の両方の特徴を持つ、谷地の融合細胞ハイブリッドまたはクローン由来の、ハイブリッド細胞株が得られる。リンパ球（抗原としての羊赤血球で処理した動物から採取）と同様に、融合したハイブリッドまたはハイブリドーマは抗原と反応する抗体（免疫グロブリン）を分泌する。その上、骨髄腫細胞株と同様に、ハイブリッド細胞株は不朽である。特に、ワクチン化した動物から導かれる抗血清は、同一にては再生できない抗体の変わりやすい混合物であるが、ハイブリドーマにより分泌された単一型の免疫グロブリンは、たくさんの抗体分子構造もしくは決定因子（エピトープ）を持つ複合体分子である、抗原上の一つまたは唯一の決定因子に特異的である。ここで、単一の抗原に対して起されたモノクロナール抗体は、その形成を誘導した決定因子に依存して、相互に区別できよう。しかしながら、所定のクローンによって製造される抗体のすべては同一である。さらにまた、ハイブリドーマ細胞株は限定なく再生でき、インビトロ、インビボのいずれでも容易に増殖され、極めて高い濃度でモノクロナール抗体を生産する。Ｂ４３は、世界保健機構（ＷＨＯ）設定ＣＤ（分化の塊）命名法によってＣＤ１９抗原として同定されている、９５kＤa標的Ｂラインの制限されたホスホグリコ蛋白を認識する、κモノクロナール抗体（ＭoＡb）である、ネズミＩgＧ１である。Ｂ４3 ＭoＡbの化学的、免疫学的および生物学的特徴はすでに公表された報告に詳しく記載されている。ウックンら(Ｕckun et al.)，Ｂood，７１，13 (1988)。Ｂ４３はＡＴＣＣからＨＢ 8903を指定して、入手できる。Ｂ４３のキメラで、単鎖のＦv断片もまた開発されており、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体として有効であると立証すべきである。本発明の実用上有用な他のモノクロナール抗体としては、Ｂ５３／ＴＸＵ−５、ＴＸＵ−１、ＢＸＵ／抗Ｂp４７、ＮＸＵおよびＴＰ３が含まれるが、これらに限定すべきでない。Ｂ５３／ＴＸＵ−５は、Ｔヘルパー細胞および小児期T-細胞白血病細胞上のＣＤ４抗原を認識する、ネズミＩgＧ１モノクロナール抗体である。ＣＤ４はＬＣＫキナーゼに連携し、またＢ５３−ＧＥＮは標的細胞をアポプトシスに導き、ＬＣＫキナーゼを効果的に不活性化する。ＴＸＵ−１は、ＮＫ細胞と同様に、正常で、白血病のＴ−細胞上の１２０kＤa新規な抗原を認識する、ネズミＩgＧ１モノクロナール抗体である；標的抗原はＬＣＫおよびＦＹＮチロシンキナーゼに連携する。ＢＸＵ／抗−Ｂp４７は、Ｂ−ラインリンパ球様細胞上に４７kＤa新規抗原を認識するネズミＩgＧ１モノクロナール抗体である；標的抗原はＢＴＫおよびＬＹＮチロシンキナーゼに連携する；抗−Ｂp４７−ＧＥＮは、インビトロで、Ｂ−ライン白血病およびリンパ球様細胞を殺し、またＳＣＩＤマウスでもそうであったが、Ｂ４３−ＧＥＮほども有効でない。ＮＸＵは、神経芽腫細胞上に３０ kＤa抗原を認識するネズミＩgＧ１モノクロナール抗体である(神経芽腫は幼児における最もありふれた固形器官悪性腫瘍である。)；標的抗原はＳＲＣおよびＦＹＮチロシンキナーゼに連携している。ＮＸＵ−ＧＥＮは神経芽腫細胞をころす。ＴＰ３は、ヒト骨肉腫細胞上に８０kＤa抗原を認識する、ネズミＩgＧ２aモノクロナール抗体である。この抗原はＦＹＮおよびＳＲＣキナーゼに連携している。上記抗体またはその活性断片は、ＧＥＮに連携すると、化学的に製造して（Ｆ abまたはＦab２断片）も、あるいは遺伝子組み替えで製造して（単鎖Ｆv断片）も、得体が知れなくてもまた人間的であっても、それらが標的とする細胞を殺すのに有効であると期待される。ｂ．サイトカインさらに、サイトカインは、ゲニステインをその表面レセプタに引き渡すためにも用いられる。それはまたゲニステインおよび他のＴＫ阻害剤に効果的に連結させる官能基をも有する。さらにまた、それ自身本質的なチロシンキナーゼ作用（例えば、表皮成長因子（ＥＦＧ−キナーゼ）および血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ−Ｒキナーゼ）を有する、表面レセプタに反応するので、サイトカインーゲニステイン接合体は一層有効でさえあろう。４．免疫接合体免疫接合体（抗体−治療剤接合体）は、細胞型−に特異的なポリクロナールまたはモノクロナール抗体を、直接的にあるいは結合剤を経由して様々な生物活性材または検出できるラベルに共有結合にて連結することにより製造できる、比較的新しいクラスの免疫薬剤である。５．チロシンキナーゼに連携する、ヒトリンパ細胞上のレセプタ細胞内の触媒領域を欠く、多数の細胞表面レセプタは、Ｓrc系列ＰＴＫsに連携して、補助的信号形質導入機能を有する、細胞型−特異的膜内外レセプタチロシンキナーゼを形成する。このようなレセプタ−ＰＴＫ複合体におけるＳrc系列ＰＴＫは、信号形質導入剤として作動し、そのレセプタを下流の細胞形質を信号化する通路に結ぶ。そのような連携の具体例としては、(a)Ｔ−ラインリンパ球中にてＬＣＫにＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＩＬ−２レセプタβを連携させる、(b)Ｂ−ラインリンパ球におけるＬＹＮにＩＬ−２レセプタβ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＰ４７、sＩgＭおよびsＩgＤを連携させる、(c)Ｔ−ラインリンパ球中にてＦＹＮにＣＤ３、ＣＤ２８、Ｔhy −１、ＩＬ−７レセプタおよびＩＬ−２レセプタβを連携させると同様に、Ｔ− ラインリンパ球中にてＦＹＮにＣＤ２３およびsＩgＭ／sＩgＤを連携させることが挙げられる。すなわち、これらの細胞−表面抗原に特異的な抗体はＰＴＫ阻害剤のための適当な媒介物であり、従ってＰＴＫsに細胞−表面レセプタを連携させると、阻害剤をチロシンキナーゼに引き渡すことになる。さらにまた、表皮成長因子レセプタ（ＥＧＦ−Ｒ）および血小板由来成長因子レセプタ（ＰＤＧＦ−Ｒ）は、胸部ガン、大腸ガンおよび卵巣ガンを含む様々な型のヒトガン上に発現する。従って、これらの細胞表面レセプタ（ＮＧＦ−Ｒ）に特異的な抗体は、ＰＴＫ阻害剤のために適当な媒介物であり、それ故これら細胞表面レセプタに連携させると、阻害剤をチロシンキナーゼに引き渡すことになる。ａ．ＣＤ１９表面抗原ＣＤ１９抗原は、急性リンパ芽腫白血病（ＡＬＬ）を保持する患者の８５％から由来する悪性細胞上に発現される、Ｂライン特異性表面レセプタである。ウックンら(Ｕckun et．al.)，Ｂlood，７１，１３(1988)。ＣＤ１９は、高い密度で（それぞれ＞1,000,000分子／細胞および＞50,000分子／細胞）、Ｂ−ラインリンパ球およびＢ−ライン細胞それぞれの表面上に認められるが、生物学的治療に抗−ＣＤ１９抗体を使用するとき、非特異的毒性のための機械を減らして、血液に関連した骨髄細胞および赤血球、Ｔ−細胞および骨髄幹細胞と同様に、生命維持非造血器官の実質細胞には存在しない。ウックンら(Ｕckun et al.)，Ｊ.Ｅxp .Ｍed.，163，347(1986)。Ｂ−ライン特異性抗原は、Ｂ４３(抗−ＣＤ１９)モノクロナール抗体にたいする高い親和性（Ｋa＞１０⁸Ｍ^-1）を示し、Ｂ４３の拘束を受けるやいなや抗体誘発内在化を受け、細胞表面から脱落しない。ウックンら (Ｕckun et al.)，Ｊ.Ｅxp.Ｍed.，163，347(1986)。ＣＤ１９⁺急性リンパ芽白血病は、個体発生の初期段階に、正常なＢ−細胞先駆体クローン中に推定上発生の損傷に起源すると信じられており、それ故にＢ−ライン白血病Ｆ.Ｍ.と分類される。ウックン(Ｕckun)，Ｂlood，７６，1908(1990)。上記の通り、ＣＤ１９、物理的に、機能的にＳrcプロトオンコジーン系列蛋白はチロシンキナーゼＬＹＮに連携して、補助的な情報伝達機能を有する細胞型特異的膜内外レセプタチロシンキナーゼを形成する。ウックンら(Ｕckun et al.) ，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，268，21172(1993)。この複合体において、ＬＹＮは情報伝達トランスジュウサとして作動し、ＣＤ１９を下流の細胞質情報通路に連結する。ウックンら(Ｕckun et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，268，21172(1993)。ＬＹＮは、Ｂ−ライン白血病細胞中に豊富に発現するので、ＣＤ１９レセプタは、ＰＴＫ阻害剤を用いる、生物学的治療のための適当な標的である。ボーレンら(Ｂolen et al.)，Ａdv.Ｃan.Ｒes.，５７，103(1991)。６．免疫接合体の製造および精製好ましい免疫接合体は、有効な細胞毒量のＧＥＮ分子をＢ４３のそれぞれの分子に結合することにより形成する。例えば、本発明の実施に有効な試薬はＢ４３分子当たりＧＥＮ１分子のＢ４３−ＧＥＮとして約１：１混合物である。モノクロナール抗体−ＰＴＫ阻害剤の形成に有用なヘテロ二官能性アジド含有架橋試薬としては、スルホ−ＳＡＤＰ（チオールおよび還元剤により開裂できる、スルホスクシンイミジル−(４−アジドフエニルヂチオ)プロピオネート）およびスルホ−ＳＡＮＰＡＨ（非開裂で、拡張した鎖長架橋剤である、スルホスクシンイミジル−６−(４'−アジド−２'−ニトロフエニルアミノ)ヘキサノエート）が挙げられる。アゾ基は、光分解の条件下に、例えば２６５−２７５nm（Ｎz）または３００−４６０nm（アゾニトロフエニル）ＮＨ結合を経由して蛋白に結合する。例えば、下記の実施例で使用される特別のＢ４３−ＧＥＮはＢ４３ＭoＡ bに架橋剤スルホ−ＳＡＮＰＡＨで変更し、次いで変更したＢ４３２５：１モル過剰のＧＥＮを反応させて得られる。第１０図参照。同様に、スルホ−ＳＡＤＰ（スルホスクシンイミジル−(４−アジドフエニルジチオ)プロピオネートを用いて、Ｂ４３−ＧＥＮは勿論のこと、抗−Ｂp４７−ＧＥＮも製造し、これは他のＧＥＮ免疫接合体の製造にも使用できる。さらにまた、一般に知られた他の架橋剤（スルホ−ＳＮＡＰＡＨ以外）を用いても、モノクロナール抗体をイソフラボン類に直接連結することはできないが、通常の架橋剤、即ちＮ−スクシンイミジル３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−(２−ピリジルジチオ)−トルエン(ＳＭＰＴ)およびＮ−スクシンイミジル６−[３−( ２−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(ＬＣ−ＳＰＤＰ)を用いると、モノクロナール抗体に結合できる、アミノ−イソフラボン類を製造するためにイソフラボン類を構造修飾できる。７．免疫接合体の投与方法本発明の免疫接合体は、薬剤として処方し、選定された投与経路に適合した様々な形で、即ち経口または非経口投与で、静注、筋注または皮下注にて、ヒト患者などのほ乳類ホストに投与される。ａ．剤型本発明の免疫接合体は、好ましくは、非経口的に、即ち灌流もしくは注射により静脈的にまたは腹腔内に投与される。免疫接合体の溶液または懸濁液は、場合により無毒性界面活性剤を添加して、水またはＰＢＳなどの等張食塩水中で調製できる。分散液もまたグリセロール、液状ポリエチレングリコール、ＤＭＡ、植物油、トリアセチン、それらの混合物中で調製できる。通常の保存および使用条件下では、これらの製剤に、微生物の製造を防止するための防腐剤を添加してもよい。注射または灌流使用に適した薬剤の剤型としては、滅菌した注射可能なもしくは漑流可能な溶液または分散液の即席調製に適した、活性成分を含む滅菌した水溶液もしくは分散液または滅菌した粉末が挙げられる。あらゆる場合に、究極の剤型は、製造および保存の条件下に、滅菌され、液状で、しかも安定でなければならない。液状担体または賦形剤とは、溶媒または液体分散媒体をいい、具体的には水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒性グリセリルエステル、その適当な混合物が挙げられる。適当な液性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合に必要な粒子の大きさの維持によって、あるいは無毒性界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の活動の防止のためには、例えばパラベン、クロロブタノール、フエノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤や抗かび剤を添加すればよい。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、緩衝剤、食塩などを用いることが望ましい。注射できる組成物の吸収持続性は、例えばモノステアリン酸アルミニュウムヒドロゲルやゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に添加して達成される。滅菌した注射できる溶液は、上記の様々な他の成分を含む適当な溶媒中に所定量の免疫接合体を添加し、所望により、滅菌濾過を行って、調製される。滅菌した注射液の調製のための滅菌した粉末の場合に、好ましい調製方法は真空乾燥および冷凍乾燥技術であり、それによって予め滅菌濾過した溶液中に存在する、追加した所望の成分を含む有効成分の粉末を与える。ｂ．投与量上記組成物中における免疫接合体の濃度は、患者の身長、年齢および状態に併せて広く変異できる。免疫接合体の有用な投与量は、動物モデルにおけるそのインビトロの作用およびインビボの作用を、等量のシクロホスファミドの作用を対比して決めることができる。例えば、特定のガンに対してシクロフォスファミドよりも１０−２０倍作用が高い、本発明の免疫接合体は２−５日間約０.２５− ２.５mg／kg／日の投与量で静脈注射することができ、次いで臨床上の改善が明らかである限り、週１回または２回といった、より低い維持投与量を継続できる。投与量は患者の耐性に従って週ごとに調節することができる。本発明は下記の詳細な実施例によってさらに記載される。実施例１Ｂ４３−ゲニスタイン(ＧＥＮ)免疫接合体の製造および特徴付けＢ４３−ＧＥＮ免疫接合体の溶出プロフィールは、¹²⁵ＩでラベルしたＧＥＮに用いて調製した、免疫接合体により最初に決めた。¹²⁵ＩでラベルしたＧＥＮは、ＨＰＬＣ精製の１５０ kＤa Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体から、ＧＥＮラベルのホモ接合体Ｂ４３×Ｂ４３と同様に遊離GENの除去を確認するためにもまた用いられる。本研究を実行するために用いられた手法を以下に示す。ゲニスタイン（pＨ７.５、３５％ＰＢＳ，６５％エタノール中）を、メーカーの指示通りに、ヨード・ビーズ（イリノイ州ロックフォード、ピアス・ケミカル・カンパニー）および¹²⁵Ｉ（マサチューセッツ州ボストン，ＮＥＮ、１７.４Ｃ i/mg、Ｎa、担体を含まず）を含む反応バイアルに入れて室温にて標識ラベル化した。１５分後に、ビーズを除いた反応混合物をバイアルから取り出し、シリカ（カリフォルニア州、トランス、フエノメネックス）５０0mgを含む、ウルトラ −セップ使い捨てカラムを通過させて、遊離のヨウ素を除いた。¹²⁵ＩでラベルしたＧＥＮは、シリカカラムを、トルエン：アセトン：クロロホルム（４０：３５：２５）の混合溶媒で溶出させた。アリコートは、ガンマカウンタ（ニュージャージー州ピスケイタウェイ、ファルマシア社）にて計数し、蛍光指示薬（ペンシルバニア州ピッツバーグ、フィシャー・サイエンティフィック）を含む、シリカゲルＧレジ−プレイト上で薄層クロマトグラフイーに付して、その調製をモニターした。¹²⁵Ｉ−ＧＥＮの精製は、指示薬を含まない２０×２０cmＴＬＣプレートから所望の物質を掻き落とし、ＤＭＳＯで溶出することにより実施した。¹²⁵Ｉ− ＧＥＮの比活性は２.６×１０⁵cpm／ｎモルであった。精製したＢ４３(５mg／mL)は、架橋剤対抗体のモル比２５：１にて、スクシンイミジルを含む光反応性(２６５−４００nmで最適光分解)架橋剤スルホ−ＳＡＮＰＡＨ(ＤＭＳＯ中４０mＭ溶液)（イリノイ州ロックフォード、ピアス・ケミカル・カンパニー）を用いて、１級アミノ基を経て室温にて２時間反応させ修飾させた。過剰の架橋剤は反応液を、ＰＤ−１０を予め充填したＧ２５カラム（ニュージャージー州ピスケイタウェイ、ファルマシア社）に通過させて除いた。次いで、修飾したＢ４３は、モル比２５：１のゲニスタイン(ＧＥＮ；分子量：２７０.２)(カルフォルニア州ラ・ジョラ、カルビオケム)(ＤＭＳＯ中５０mＭ溶液) または¹²⁵Ｉ−ラベルしたＧＥＮに加え、次いで多バンドＵＶ光発生器（モデルＵＶＧＬ−１５ミネライト；カリフォルニア州サン・ガブリエル、ＵＶＰ）を用いて、波長２５４−３６６nmのＵＶ光にて１０分間、軽く混合しながら照射した。反応液中の過剰のＧＥＮまたは¹²⁵Ｉ−ラベルしたＧＥＮは、ＰＤ−１０カラムを通過させて除去し、同時に接合したＧＥＮ含みあるいは含まない３００kＤa Ｂ４３−Ｂ４３ホモ接合体をも除いた。高分子量の反応生成物は、大きさを度外視したＨＰＬＣにより除いた。Ｂ４３−ＧＥＮとＢ−ラインリンパ腫細胞との選択的免疫反応性は、標準的リガンド結合検定法を用いて、１０倍モル過剰の冷Ｂ４３抗体の存在下または不存在下にＢ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮと、ＣＤ１９抗原陽性ＲＡＭＯＳＢ−ラインリンパ腫細胞およびＣＤ１９抗原陰性ＭＯＬＴ−３Ｔ−ライン白血病/リンパ腫細胞との免疫反応性を測定することにより確認した。ウックンら(Ｕckun et al.) ，Ｂlood，７４，761(1989)。Ｂ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮ免疫接合体の純度は、増強スクリーンおよびＫodak ＸＡＲ−５フィルムを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５％分離ゲル、非還元条件）およびオートラジオグラフにより評価した。最終製剤は、５％以下の未接合Ｂ４３抗体またはＧＥＮで混合していて、¹²⁵Ｉ−ＧＥＮを用いて調製した免疫接合体の非活性により定量されるように、４種の独立した接合の中で、各Ｂ４３抗体分子当たり平均１分子（範囲：０.９−１.３）のＧＥＮを含むことが判明した。実施例２免疫複合体キナーゼ検定法免疫複合体キナーゼ検定法は、先にウックンら(Ｕckun et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃ hem，268，21172（1993）で記載したように、外因性ＰＴＫ基質として酸−変性したウサギエノラーゼを用いて、行った。ＮＡＬＭ−６細胞から免疫沈降したＬＹＮキナーゼの酵素活性は、ウックンら(Ｕckun et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，26 8，21172（1993）に記載されたように、Ｂ４３−ＧＥＮまたは[γ３２Ｐ]ＡＴＰ（５０μＣi／μモル）の存在下に１０分間キナーゼ反応によりスルホ−ＳＡＮＰＡＨで修飾したＢ４３モノクロナール抗体と４時間培養して、その前後のデータから定量した。コントロール試薬としては、未修飾のＢ４３モノクロナール抗体、スルフォ−ＳＡＮＰＡＨ修飾Ｂ４３抗体およびＣＤ１９⁺Ｂ−ラインリンパ腫細胞とは反応しない、ＴＸＵ−ＧＥＮ免疫接合体を用いた。表３に示されるように、Ｂ４３抗体は、３２.１±１.８％だけＢ４３−¹²⁵Ｉ −ＧＥＮのＣＤ１９陽性標的ＮＡＬＭ−６、ＮＡＬＭ−１６、およびＲＡＭＯＳ細胞との結合を阻害したが、１０倍モル過剰の無関係コントロール抗体ＴＸＵ( 抗−ＣＤ７)については阻害は認められなかった。3444−5000（平均±標準誤差＝4259±451）フェムトモルのＢ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮは１０⁸標的Ｂ−ラインリンパ腫細胞に特異的に結合した。Ｂ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮ分子の評価数は、細胞当たり、２.１×１０⁴から３.１×１０⁴（平均±標準誤差＝２.６±０.３×１０⁴ ）であった。対比すると、Ｂ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮのＭＯＬＴ−３Ｔ−ライン白血病細胞またはＨＬ６０急性骨髄球白血病細胞への結合は検出できなかった( 表３)。さらに、我々は、二次抗体として蛍光イソシアネート（ＦＩＴＣ）でラベルしたヤギ−抗−マウスＩgＧによる間接的免疫蛍光染色法を用いて、Ｂ４３−ＧＥＮのＣＤ１９抗原陽性Ｂ−ライン白血病細胞との結合をフローサイトメトリーにて調査した。Ｂ４３−ＧＥＮは、広範な濃度について未接合Ｂ４３抗体の場合と同じ強度でＮＡＬＭ−６細胞を染色した；さらにまた、それは、表面結合部位を求めて、未接合Ｂ４３と同じくらい効果的に、フィコエリトリン（ＰＥ）でラベルしたＢ４３またはロイシン１２抗−ＣＤ１９抗体に匹敵した。これらの成果は、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体がＣＤ１９抗原陽性Ｂ−ライン白血病細胞に選択的に結合することを、示す。実施例３Ｂ４３−ＧＥＮによるＣＤ１９連携ＬＣＫキナーゼの阻害ＣＤ１９に連携すると、ＬＣＫキナーゼがＢ４３−ＧＥＮで阻害されるかどうかを決めるため、指示濃度のＢ４３−ＧＥＮと一緒に、ＲＡＭＯＳ細胞を３７℃ で４時間ナノモル濃度の免疫接合体で処理し、ペレット状にし、ノニデットＰ− ４０溶解バッファに溶解させた。免疫複合体キナーゼ検定法は、ウックンら(Ｕc kun et al.)，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，268，21117(1993)に従って上記の通り、外因性ＰＴＫ基質である酸変性ウサギエノラーゼを用いて、実施した。コントロールとして、ＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮ免疫接合体を、ＣＤ７/Ｔp４１Ｔ細胞表面抗原、未接合未修飾Ｂ４３抗体またはＳＡＮＰＡＨ修飾未接合Ｂ４３抗体に向けて、処理した。第１Ａに示されるように、ＲＡＭＯＳ細胞をノナモル濃度でＢ４３−ＧＥＮで処理すると、減少した自動リン酸化あるいは減少したエノラーゼ気質リン酸化によって反映されるように、ＬＣＫキナーゼの阻害が認められた。この阻害は、ポリクロナール抗フォスフォチロシン抗体で免疫ブロットして定量するが、ＲＡＭＯＳ細胞中で豊富な蛋白基質のチロシン残基上に顕著な減少のリン酸化に連携した（第１Ｂ図）。Ｂ４３−ＧＥＮとは違って、未接合Ｂ４３抗体もコントロール免疫接合体ＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮもＬＣＫキナーゼを阻害せず（第１Ａ図）またチロシンリン酸化を減少させない（第１Ｂ図）。これらの結果は、Ｂ４３モノクロナール抗体のＣＤ１９標的化能力と同様にＧＥＮのチロシンキナーゼ阻害作用が、バーキットリンパ腫細胞中でＢ４３−ＧＥＮ誘発されたＬＣＫキナーゼの阻害には要求されることを示す。実施例４Ｂ４３−ＧＥＮによるＣＤ１９−連携ＬＹＮキナーゼの阻害ＣＤ１９に連携するとき、ＬＹＮキナーゼがＢ４３−ＧＥＮにより阻害されるかどうかを決めるため、ＮＡＬＭ−６をノナモル濃度の免疫接合剤と４時間処理し、ＬＹＮの蛋白チロシンキナーゼ作用を免疫複合体蛋白キナーゼ検定法により評価した。コントロールは、ＣＤ７／Ｔp４１Ｔ−細胞表面抗原、未接合、未修飾Ｂ４３抗体あるいはＳＡＮＰＡＨ−修飾、未接合Ｂ−４３抗体に向けた、未接合ＧＥＮ，ＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮ免疫接合体で処理した。ナノモル濃度でのＢ４３−ＧＥＮの処理は、減少した自動リン酸化およびエノラーゼ基質リン酸化により反映されるように、ＬＹＮキナーゼの阻害が生じた（第１Ｃ図および第１Ｅ図）。抗−ＬＹＮ免疫ブロット法により定量される、酵素の豊富さは、減少した比活性と一致するが、実験の過程で変化しなかった。Ｂ４３−ＧＥＮ処理ののち、ＬＹＮキナーゼの阻害は、ポリクロナール抗フォスフォチロシン抗体による免疫ブロット法で定量される、ＮＡＬＭ−６細胞中の豊富な蛋白基質の著しいチロシン脱リン酸化に連携する（第１Ｄ図）。対照として、ミクロモル濃度の未接合ＧＥＮは、ＬＹＮの酵素活性（第１Ｃ図）およびチロシンリン酸化蛋白の基本的リン酸化状態（第１Ｄ図）に影響を及ぼすことができなかった。これらの実験結果により、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体は未接合ＧＥＮよりも、ＬＹＮキナーゼの阻害およびＮＡＬＭ−６細胞中でチロシン脱リン酸化において 1571倍以上高い活性を示すことが、明らかになった。Ｂ４３−ＧＥＮとは違って、未接合Ｂ４３抗体（誘導され、または非誘導のもの）も、コントロール免疫接合体ＴＸＵ−ＧＥＮもＬＹＮキナーゼを阻害せず（第１Ｃ、Ｄ、Ｅ図）、ＣＤ１９−特異的Ｂ４３モノクロナール抗体部位と同様にチロシンキナーゼ阻害部位は、Ｂ−ライン白血病細胞におけるＬＹＮキナーゼＢ４３−ＧＥＮ誘導阻害のために必要であることを、示した。他の実験で明らかになったことであるが、Ｂ４３−ＧＥＮは、ヒトＣＤ１９ｃＤＮＡで形質導入したＫ５６２赤白血球細胞中でＬＹＮキナーゼを効果的に阻害するが、免疫接合体は、非形質導入Ｋ５６２赤白血球細胞または、エクソン６上で切断され、ＬＹＮキナーゼのＳＨ２領域との連携を許容するチロシン残基を有しない、ＣＤ１９欠失突然変異体Ａ３０８を発現する安定なＫ５６２形質転換体においてＬＹＮキナーゼを阻害しない。このように、Ｂ４３−ＧＥＮは、ＬＹＮキナーゼがＣＤ１９レセプタに連携しさえしていれば、このキナーゼを阻害する。ＣＤ１９レセプタに連携しないＳＹＫキナーゼは、ＮＡＬＭ−６細胞をＢ４３ −ＧＥＮで処理したのちには阻害されなかったが(第１Ｆ図)、ＣＤ１９レセプタに連携してＲＡＭＯＳ細胞中で豊富に発現した他のＳrc系列ＰＴＫである、ＬＣＫは顕著な阻害を示した。これらの結果は、Ｂ４３−ＧＥＮが、ＣＤ１９レセプタに連携している、Ｂ−ライン白血病細胞中でこれらのＰＴＫのみを阻害することを、示す。ＣＤ１９⁺白血病細胞におけるＰＫＣおよびＰＫＣ依存再生可能セリンキナーゼの酵素活性に関するＢ４３−ＧＥＮ治療の効果をまた調べた。第１Ｇ図において証明したように、セリンキナーゼはＢ４３−ＧＥＮにより濃度３５０nＭでも阻害されなかった。上記と同様のプロトコールを用いて、ＬＹＮキナーゼの作用を阻害するＢ４３ −ケルセチン、Ｂ４３−ダイゼインおよびＢ４３−アミノ−ゲニスタインの活性をまた評価した。簡単には、ダイゼインまたはケルセチンは、架橋剤スルフォ− ＳＡＮＰＡＨによりＢ４３に連結させたのち、ＮＡＬＭ−６プレ−Ｂ白血病細胞を得られる免疫接合剤で処理した。ＳＰＤＰを用いてＢ４３−アミノ−ゲニスタインを生成した。これらの実験の結果は、Ｂ４３−ケルセチン、Ｂ４３−ダイゼインおよびＢ４３−アミノ−ゲニステインは投与量依存して、ＬＹＮキナーゼ活性を阻害し、さらにまた白血病細胞の急速なアポプトシスが生じた。しかしながら、それらがＢ４３−ＧＥＮよりも低い活性を示した。要するに、これらの実験は、Ｂ４３(抗−ＣＤ１９)−ＧＥＮ免疫接合体は、Ｂ −ライン白血病細胞中において選択的にＣＤ１９−連携ＰＴＫを阻害する、強力な、細胞型特異的ＰＴＫ阻害剤であることを、示した。実施例５トポイソメラーゼII酵素に関するＢ４３−ＧＥＮの効果トポイソメラーゼIIドラッグ・スクリーニング・キット（オハイオ州コロンバス、トポゲン・インク）は、トポイソメラーゼII酵素に関するＢ４３−ＧＥＮの効果を調べるために用いた。このキットは、単一の、高親和性トポイソメラーゼ II認識および開裂部位を含む、超渦巻きＤＮＡ基質（pＲＹＧ）の処理ののちＤＮＡ開裂生成物の形成に基づく。第２図レーン２に示すように、pＲＹＧは、ヒトトポイソメラーゼII酵素で培養ののち、弛緩したモノマーおよびダイマー変換する。さらに、第２図レーン３は、トポイソメラーゼII阻害剤テニポサイド（ＶＭ−２６）は、超渦巻きＤＮＡ基質を弛緩させるヒトトポイソメラーゼIIの能力を害することを、示す。対照として、トポイソメラーゼII酵素ハ、ミクロモル濃度のＢ４３−ＧＥＮでさえ阻害されなかった（第２図レーン４−７）。実施例６アポプトシス検定法Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体による様々な培養時間ののち、ＲＡＭＯＳ細胞を、ダリンキウィズら(Ｄarrynkiewicz et al.)，Ｃytometry，１３，795(1992)に記載の通り、ＤＮＡフロウサイトメトリーによるアポプトシス変化について分析した。さらに、細胞は、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体に３０分から２４時間さらしたのち、収穫し、ＤＮＡ破片の分析用に調製した。次いで、ＤＮＡは１％アガローズゲルによって電気泳動に付し、臭化エチヂウムで染色したのち、ＵＶ光で可視化した。光学顕微鏡により可視化した明白な形態学的変化によって証明されるように、Ｂ４３−ＧＥＮは、４時間以内にＲＡＭＯＳ細胞のアポプトシスを誘発し、８時間以内にＮＡＬＭ−６細胞のアポプトシスを誘発した。広範な細胞損傷の徴候としては、収縮、核クロマチン縮合、核の分断および細胞の７５％以上における原形質膜のブレッブが挙げられた（第２Ａ図）。ＤＮＡフローサイトメトリーにより明らかなように、Ｂ４３−ＧＥＮ処理の開始から２４時間後に、ＲＡＭＯＳ細胞の６４％がアポプトシスを受けた（第３図）。Ｂ４３−ＧＥＮ(７０nＭ)は、明らかに２Ｇy γ光線よりも標的白血病細胞を破壊することでは明らかに高い効果を示した。さらに、Ｂ４３−ＧＥＮ処理したＢ−ライン白血病細胞由来のＤＮＡのアガローズゲル電気泳動は、アポプトシスを誘発する免疫接合体の能力を確認した。ナノモル濃度のＢ４３−ＧＥＮで８−２４時間処理したＲＡＭＯＳ細胞は、ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ分解により分裂させてオリゴヌクレオソームの長さの断片で、２００塩基対の数倍に相当する、梯子様の断片パターンを示したが、ミクロモル濃度の未接合ＧＥＮで処理した細胞由来のＤＮＡは開裂を全く示さなかった（第４Ａ図および第４Ｂ図）。注目すべきことであるが、Ｂ４３−ＧＥＮは、放射線に高い抵抗性ＲＳ４；１１白血病細胞にアポプトシスを誘発することができた（第４Ａ図下部パネル）。Ｂ４３−ＧＥＮ誘発アポプトシスはＣＤ１９レセプタに特異的であったが、その理由は、(a)ＣＤ７／Ｔp４１Ｔ−細胞抗原に向けたコントロール免疫接合体ＴＸＵ−ＧＥＮは、アポプトシスを全く誘発しなかった（第４Ａ図下部パネルおよび第４Ｂ図）、(b)細胞死は１０倍モル過剰の未接合Ｂ４３抗体によりＣＤ１９陽性白血病細胞の前培養によって防止できたが、１０倍モル過剰のＴＸＵ(抗−ＣＤ７)抗体ではそうではなかった（第４ＡおよびＢ下部パネル）。高濃度の未接合ＧＥＮがＤＮＡ分裂を誘発したが、未接合Ｂ４３抗体はそうではなかった（第４Ｂ図下部パネル）ので、白血病細胞のアポプトシスは免疫接合体のＧＥＮ部分により誘発された。従って、これらの実験結果はＢ４３−ＧＥＮ免疫接合体がインビトロでの活性抗−Ｂ−ライン白血病薬であることを確立する。実施例７インビトロにおける標的白血病細胞によるＢ４３(抗−ＣＤ１９)ＧＥＮの取り込み表面向けＢ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮの命運は、ＣＤ１９陽性Ｂ−ライン白血球細胞株系ＮＡＬＭ−６およびＮＡＬＭ−１６において追跡した。免疫接合体による処理から１８時間のちに白血病細胞をホモジナイズし、様々な非細胞成分をパーコール密度勾配で分画した。５'−ヌクレオチダーゼ（原形質のためのマーカー）およびガラクトシルトランスフェラーゼ（ゴルジのためのマーカー）の共沈降により確認されるように、本来の型のパーコール勾配から回収した全cpmの３９％を示す、Ｂ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮの有意義な部分は、ＮＡＬＭ−６細胞の原形質膜またはゴルジ区画に配分された。ジックソンら(Ｄickson et al.)，Ｂioche mistry，２２，5667(1983)。取り込まれたＢ４３−¹²⁵Ｉ−ＧＥＮを示す放射能の残部は、可溶性の細胞質画分（全cpmの１５％；パーコール勾配画分１−３；密度１.０４３g／mL以下）、小胞体（全cpmの２６％；パーコール勾配画分１０ −１９；密度域：１.０４９−１.０５６g／mL）およびリソソーム（全cpmの１４％；パーコール勾配画分２０−２５；密度域１.０５６−１.０６９g／mL）に連携した。同様な結果は、ＮＡＬＭ−１６細胞についても得られた（第５図）。これらの実験の結果は、ＣＰ１９レセプタに結合して１８時間以内にＢ４３− ＧＥＮ分子の半分以上が取り込まれたが、残りの少数は膜／ゴルジ画分との連携を継続することを、示す。実施例８ヒトＢ−ラインリンパ腫のＳＣＩＤマウスモデルにおけるＢ４３− ＧＥＮの抗腫瘍作用ＲＡＭＯＳ細胞５×１０⁶を対抗させた、ＳＣＩＤマウスは、リンパ腫細胞接種から２４時間後に始まる、Ｂ４３−ＧＥＮを日々連続３回腹腔内注射（全部で２５μｇ／マウス＝１６８パーセントモル／マウス、最大耐性量より１０倍以下）を受けた。コントロールマウスは、未接合ＧＥＮ(１０μg／マウス＝３７ノナモル／マウス)、未接合Ｂ４３モノクロナール抗体(５０μｇ／マウス＝３３５パーセントモル／マウス)、ＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮコントロール免疫接合体（５０μg／マウス＝３３５パーセントモル／マウス）またはＰＢＳで処理した。対照として、若干数のマウスに、活性な抗白血病薬である、Ｂ４３−アメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（ＰＡＰ）イムノトキシン（全２５μg/マウス）で処理した。ウックンらの観察によりモニターし、リンパ腫細胞の接種から死亡の日までの事象時間を測定した。事故なしに生き残る確率を定め、ウックンら(Ｕcku n et al.)，Ｎew Ｅngl.Ｊ.Ｍed.，329，1296（1993）に記載された、カプランーマイアー製品制限法を用い、事故なしの間隔曲線を作成した。ＰＢＳ、未接合ＧＥＮ(１０μｇ／マウス＝３７ノナモル／マウス)、未接合Ｂ４３抗体（５０μg／マウス＝３３５パーセントモル／マウス）またはＢ４３− ＰＡＰイムノトキシン（２５μg／マウス）で処理した全コントロールマウスは、接種から２４から６１日目に播種したヒトバーキットリンパ腫により死亡した（事故なしの平均生き残り＝４８.０日）（第６Ａ図および第６Ｂ図）。これらのマウスには腹部器官にまで拡張した大きな腹部塊を認めた。腫瘍細胞の薄片からは、骨髄、脾臓および腹部結節の正常組織成分は抹消されていた。脳への移植は、軟膜におけるリンパ腫細胞の薄い筏の存在により明らかであり、場合によってはリンパ腫細胞による広範な浸潤が大脳皮質や脳幹の灰色部分に認められた。心臓は心外膜に薄く、短い筏を示し、肺の槽隔壁はＲＡＭＯＳ細胞の軽い浸潤を認めた。腎臓（第６Ａ１図および第６Ａ２図）は皮質における軽度から広範な間隙滞留および少数の腫瘍性血管周囲カフと同様に腎周の脂肪中に大きな滞留を有した。大きな滞留は、洞様で、被膜下の空間に多数の小さな巣と一緒に肝臓入門部（第６Ｂ１図および第６Ｂ２図）に見ることができた。有糸分裂率は極めて高く、大部分の組織中において高能力フィールド当たり平均有糸分裂数１５−２０であり、領域によっては高能力フィールド当たり４０−５０の数値を示した。対照として、Ｂ４３−ＧＥＮは、大部分のＳＣＩＤマウスにおいて播種したヒトバーキットリンパ種を防止した。Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体（２５μg／マウス＝１６８パーセントモル／マウス、最大耐性量より１０倍低い）で処理したマウス１０匹のうち７匹は、４カ月以上リンパ腫の臨床上の証明なしに生存した（１００日間に事故なしに生き残る確率＝７０±１５％；事故なし生存平均１２５日以上）(第６Ｂ図)。実施例９ヒトＢ−ライン白血病ＳＣＩＤマウスモデルにおけるＢ４３−ＧＥＮの薬動力学的特徴および抗白血病作用ヒトＢ−ライン白血病を持つＳＣＩＤマウスモデルにおいて、Ｂ４３−ＧＥＮの薬動力学的特徴を次のように評価した。ＮＡＬＭ−６細胞にて攻撃したＳＣＩＤマウスに２５μg／マウス＝１６８パーセントモル／マウス（最大耐性両より１０倍以上低い）または５０μg／マウス＝３３５パーセントモル／マウス（最大耐性量より５倍以上低い）で処理した。全てのコントロールマウスは、未接合ＧＥＮ(１０μg／マウス＝３７ノナモル/マウス)、未接合Ｂ４３抗体(５０μg/ マウス＝３３５パーセントモル／マウス)、ＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮコントロール免疫接合体（５０μg／マウス＝３３５パーセントモル/マウス）またはＰＢＳで処理した。第７Ａ図および表４に示すように、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体は、有意義に長い放出半減期および未接合ＧＥＮよりも遅い血漿クリアランスを示した。さらにまた、第７Ｂ図および表４に記載されているように、免疫接合体は血漿から一層速やかに除かれ、一層短い放出半減期を示し、白血病細胞を接種していない健康なＳＣＩＤマウスにおける配分に対比すると、末期ヒトＢ−ライン白血病を保有するＳＣＩＤマウス（ＣＮＳ巻き添えにより麻痺した、播種したヒトＢ −ライン白血病を保有するＳＣＩＤマウス）において一層多い配分を示した。これらの差異は、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体が、ＳＣＩＤマウス組織に浸潤するＣＤ１９−陽性白血病細胞に結合し、その結果として、末期白血病を保有するマウスにおいて血漿から免疫接合体を一層早く排除することを、示す。この仮説は、白血病細胞を接種されていない健康なＳＣＩＤマウスに対比すると、末期白血病を保有するＳＣＩＤマウスの組織中の免疫接合体の高い濃度を測定することにより、支持される（第７Ｃ図）。脾臓、肝臓および肺は、血漿対組織の最高率を示したが、末期白血病を保有するマウスの脾臓と肝臓において組織配分率はほぼ２倍に増加する（表５）。免疫接合体の大腿骨への組織配分は最小の白血病負荷を有するマウスにおいて低いけれども、末期白血病を有するマウスでは３倍に増加し、免疫接合体の骨髄に浸潤するＣＤ１９陽性ヒトＢ−ライン白血病細胞への結合を反映させた。さらにまた、非放射性Ｂ４３−ＧＥＮの注射から１時間以内に、ＳＣＩＤマウスの骨髄、肝臓および脾臓に浸潤する白血病細胞の表面上に、Ｂ４３−ＧＥＮが存在することは、免疫接合体のＢ４３抗体部分を標的とした、ＦＩＴＣラベルしたヤギの抗マウスＩgＧを用いる、間接的免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いて確認された。未接合ＧＥＮの一層低い組織レベルは、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体よりも早く体内からそれが除かれることを示す（第７Ｃ図）。生理学的モデルによって評価されたＧＥＮおよびＢ４３−ＧＥＮの全身からの放出（表５）は、２区画実験モデルによって評価された、クリアランスと密に一致した（表４）。Ｂ４３−ＧＥＮの抗白血病作用は、上記と同じ薬理学的プロトコールに付した、ＳＣＩＤマウスにおいてもまた評価された。未接合ＧＥＮ、未接合Ｂ４３抗体、ＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮコントロール免疫接合体またはＰＢＳで処理した全てのコントロールマウスは、接種後２４−６１日で播種したヒトＢ−ライン白血病により死亡した（第８図）。対照として、Ｂ４３−ＧＥＮ免疫接合体２５μg ／マウスまたは５０μg／マウス＝３３５パーセントモル／マウスで処理した全てのマウスは、白血病の臨床上の証明なしに４カ月以上生存した。これらの生存マウスは、ヒト白血病細胞の負荷を調べるために、１４２日目で選択的に殺した。多くの器官からの組織切片の死後組織病理学的調査は、白血病浸潤を全く示さなかった。さらに、骨髄、脾臓、肝臓および脳/脳膜由来のＤＮＡをβ−グロブリン遺伝子配列についてＰＣＲにより調査するとき、潜在性白血病の分子上の証拠を見つけることができなかった(第９図)。対照として、ヒトＤＮＡのＰＣＲ証拠と同様に、拡散した白血病浸潤は、ＰＢＳまたはＴＸＵ(抗−ＣＤ７)−ＧＥＮで処理したＳＣＩＤマウスの骨髄、肝臓、脾臓および脳膜中に認められた(第９図)。本発明者らは、先に単一の、ＮＡＬＭ −６細胞の注射はＳＣＩＤマウスにおける播種した致死白血病を引き起こすと、報告した。ウックンら(Ｕckun et al.)，Ｂlood，７９，2201(1992)。ＮＡＬＭ −６細胞１×１０⁶の接種から２０周後にＢ４３−ＧＥＮ処理したＳＣＩＤマウス中に植え付けた白血病細胞が存在しないことは、無毒性レベルにおいてこの免疫接合体はインビボでＮＡＬＭ−６細胞の９９.９９９％以上を殺したことを、示す。Ｂ４３−ＧＥＮは、１０μg（６７パーセントモル）から２５０μg（1667パーセントモル）にわたる投与量でＳＣＩＤマウスに無毒性であった。Ｂ４３−ＧＥＮで処理した４２匹のマウスは３６日の観察期間に副作用も経験もせず、毒性で死亡もしなかった。３６−３７日で選択的に殺された、Ｂ４３−ＧＥＮ処理されていたマウスの期間において、組織病理学的損傷は、全く認められなかった。かくして、Ｂ４３−ＧＥＮの最大耐性量（ＭＴＤ）は、２５０μｇ／マウス（または１２.５mg／kg）に達しなかった。表６に示されるように、アルキル化剤サイクロフォスファミドおよびカルムスチン、トポイソメラーゼII阻害剤エトポシド、トポイソメラーゼI阻害剤トポテカン、抗代謝剤シタラビン、有糸分裂阻害剤タクソールおよびビンクレスチン、ＣＤ１９またはＣＤ７２汎−Ｂ細胞抗原に向けたアメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（ＰＡＰ）イムノトキシン、メチルプレドニソン、ドキソルビシン、Ｌ−アスパラギナーゼまたは全体放射２５０cＧyを含む、標準的または治験中の化学療法剤によって、同じ様なレベルの治療効果は達成できなかった。ＧＥＮよりも活性が低いＰＴＫ阻害剤である、ゲニスタイン類縁体ダイゼイン（ＤＡＩ）を含む、他のＰＴＫ阻害剤抗ＣＤ１９免疫接合体は有効であるが、Ｂ４３−ＧＥＮほども強力ではなかった（表６）。特定した好ましい態様と技術を参照して、本発明を記載してきた。しかしながら、発明の精神と範囲を逸脱しない限り、多くの変更や修飾ができることは、理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．他の細胞チロシンキナーゼを直接阻害せずに、細胞のレセプタに連携しているチロシンキナーゼを阻害する、チロシンキナーゼ作用に連携している細胞の細胞表面レセプタに結合する抗体に連結した、チロシンキナーゼ阻害剤を含有する免疫接合体。２．レセプタがＳrcプロトオンコジーン系列蛋白チロシンキナーゼに連携する、請求項１の免疫阻害剤。３．チロシンキナーゼ阻害剤がイソフラボンである、請求項１の免疫接合体。４．イソフラボンがゲニスタイン、ダイゼイン、アミノ−ゲニスタインまたはケルセチンである、請求項３の免疫接合体。５．チロシンキナーゼ阻害剤が光親和性架橋により抗体に連結する、請求項３の免疫接合体。６．標的とした細胞表面レセプタがＢ−ライン細胞に特異的である、請求項１の免疫接合体。７．標的とする細胞表面レセプタがＣＤ１９表面抗原である、請求項５の免疫接合体。８．抗体がＢ４３またはＢ４３から誘導されたＣＤ特異的抗体である、請求項６の免疫接合体。