JPH10504903A - ルシフェラーゼ標識方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ルシフェラーゼを化学物質、特に抗体、抗原または核酸のような特異的結合因子、より特定的には抗体に結合させる方法が提供される。該方法は、（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸のいずれか１種以上とルシフェラーゼとを混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと結合因子との間の共有結合反応を惹起する段階とを含み、Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及び／またはアデノシン三リン酸の量が、共有結合試薬による阻害からルシフェラーゼ活性を保護すべく十分な量であることを特徴とする。好ましくは、段階（ａ）が、ルシフェラーゼとその基質とを溶液中で混合することによって行われ、また好ましくは、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の双方が、アデノシン三リン酸マグネシウム（Ｍｇ²⁺ＡＴＰ）の形態で、任意にＤ−ルシフェリンと共に存在する。本発明の第二の目的によれば、本発明の方法によって提供される活性ルシフェラーゼに結合した化学物質を含む標識化学物質が提供される。好ましくは、化学物質が、特異的結合アッセイでの使用に適した特異的結合因子、好ましくは抗体、抗原または核酸である。結合因子が核酸である場合、核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであるが、ポリヌクレオチドまたはヌクレオシドでもよく、ハイブリダイゼーションプローブまたは鎖延長プライマー、例えばＰＣＲプライマーとして使用されてもよい。抗体をルシフェラーゼに結合させるこれまでの試みは失活に終わっていたので、該物質が抗体である場合が特に有利である。更に、検査キットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ルシフェラーゼ標識方法 本発明は、化学的アッセイ、特にバイオアッセイ、より特定的にはイムノアッ セイのような特異的結合アッセイ及びハイブリダイゼーションプロービング技術 に使用するため、並びに、アッセイフォーマット中で例えばＰＣＲによる特異的 増幅産物にラベルを組込むために、化学的材料、特に生物学的材料を標識する方 法に関する。 ホタルルシフェラーゼが介在するルシフェリンの開裂（反応式１）は高い量子 収率及び安定な光出力を有しており、比較的簡単な計器を用いて極めて低濃度の 酵素自体を検出することが可能である（ＭｃＣａｐｒａ，“バイオルミネセンス 及びケミルミネセンスの潜在的用途（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ ｎｅｓｃｅｎｃｅ）”，Ｔｕｒｎｅｒら（編），Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：ｆｕｎ ｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）：６１７−３７参照）。ルシフェ ラーゼを間接ラベルとして用いる方法は多 数開発されている（Ｗａｎｉｌｕｎｄ ａｎｄ ＤｅＬｕｃａ，“バイオルミネ センスイムノアッセイ：メトキシレート及びＤＮＰを定量するためのルシフェラ ーゼ抗原複合体の使用（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙｓ：Ｕｓｅ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｊｕｇ ａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｘｙｌａｔ ｅ ａｎｄ ＤＮＰ）”，Ｄｅｌｕｃａ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ（編），Ｂｉ ｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ： Ｂａｓｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８１） ：６９３−６９６；Ｇｅｉｇｅｒ ａｎｄ Ｍｉｓｋａ，“バイオルミネセンス 増強エンザイムイムノアッセイ：エンザイムイムノアッセイ用の新しい超高感度 検出システム（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｎｚｙ ｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｎｅｗ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅ ｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ ｙ）”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． （１９８７）２５，３１−３８；及び、Ｍｕｒａｋａｍｉら，“アデニル酸キナ ーゼ及びホタルルシフェラーゼを用いる生物発光検出システムの開発（Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏ ｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）”，Ｓｚａｌａｙら（編），Ｂｉｏｌ ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｓｔ ａｔｕｓ Ｒｅｐｏｒｔ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ ｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９３）２９６−３００参照）。 本発明者らは、ルシフェラーゼを直接ラベルとして使用することによってアッ セイの感度を維持しながらアッセイの設計をはるかに簡単にできることに注目し た。しかしながら、極めて不安定な酵素活性を有することが判っている物質を失 活させることなく検定用結合因子（assay binding agent）に結合させる方法が 必要である。グルタルアルデヒド、ＳＭＣＣ及びＳＭＰＢのような標準的な共有 結合試薬（covalent coupling reagent）はルシフェラーゼ活性を急速にかつ不 可逆的に阻害する。 例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓに由来のルシフェラーゼは４個のシ ステイン残基を含み（Ｗｅｔら，（１９８７），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，７２５−７３７参照）、その２つは活 性部位に近接しているかまたは活性部位の一部を構成している（Ｄｅｌｕｃａ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ，（１９７８），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ，５７，３−１５参照）。本発明者らは、観察された失活の原因は共有 結合試薬が上記の残基に結合するためであろうと推測し、不可逆的阻害から酵素 を保護するようなルシフェラーゼと検定物質との結合方法を提供した。 従って、本発明の第一の目的によれば、ルシフェラーゼを化学物質、特に抗体 、抗原または核酸のような特異的結合因子（binding agent）、より特定的には 抗体に結合させる方法が提供される。該方法は、（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグ ネシウムイオン及びアデノシン三リン酸のいずれか一種以上とルシフェラーゼと を混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと結合因子との 間に共有結合反応を惹起する段階とを含み、Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイ オン及び／また はアデノシン三リン酸の量が、ルシフェラーゼ活性を共有結合試薬による阻害か ら保護するために十分な量であることを特徴とする。好ましくは、段階（ａ）は 、ルシフェラーゼとその基質とを溶液中で混合することによって実施され、また 、好ましくは、マグネシウムとアデノシン三リン酸との双方がアデノシン三リン 酸マグネシウム（Ｍｇ²⁺ＡＴＰ）の形態で、任意にＤ−ルシフェリンと共に存在 する。好ましくは、Ｍｇ²⁺ＡＴＰまたはＤ−ルシフェリンの一方だけが存在する 。Ｍｇ²⁺とＡＴＰとルシフェリンとが３つとも存在するときは、反応混合物から 酸素を排除するのが好ましい。 本発明の第二の目的によれば、本発明の方法によって提供される活性ルシフェ ラーゼに結合した化学物質を含む標識化学物質（labelled chemical entity）が 提供される。好ましくは、化学物質が、特異的結合アッセイでの使用に適した特 異的結合因子、好ましくは抗体、抗原または核酸である。結合因子が核酸である 場合、核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであるが、ポリヌクレオチドまたは ヌクレオシドでもよく、また、該核酸をハイブリダイゼーションプローブもしく は鎖延長プライマー、例えばＰＣＲプライマーとして使用してもよい。該物質が 抗体 である場合が最も有利であるが、その理由は、抗体をルシフェラーゼに結合させ るこれまでの試みはほぼ完全な失活に終わっていたからである。 ルシフェラーゼ標識化学物質、及び、特にルシフェラーゼ標識抗体の提供によ って与えられる特別な利点は、光ガイドを組み込んだ捕捉アッセイ（capture as say）の実施が可能になったことである。このようなアッセイの１つの好適例で は、標的抗原に対する捕捉抗体が光ガイドに固定化され、例えば光ファイバから 成る光ガイドは例えば光電子増倍管から成る光測定デバイスに受容光を導入する ように構成されている。測定すべき抗原を液体サンプル中で光ガイドに作用させ 、ルシフェラーゼで標識されていることを特徴とする第二抗体を溶液中で光ガイ ドと接触させる。第二抗体は、既に捕捉されて捕捉抗体に結合している抗原に結 合する。 捕捉された抗原の存在及び／または量を決定するためには、溶液中のＤ−ルシ フェリン及びＭｇ²⁺ＡＴＰを、抗原−抗体複合体が結合した光ガイドの表面に接 触させ、例えば光電子増倍管から成る光測定デバイスに伝送された放出光の量を 測定するだけでよい。この方法においては、各々が異なる抗原を捕捉し 得る複数の光ガイドを単一のサンプルチャンバに配置して使用することによって 、より高い感度を有する光測定アッセイを複数の特異性を持って実施することが 可能となり、従って、同一段階に複数の異なるルシフェラーゼ標識抗体を添加す ることによって複数の異なるイムノアッセイを同時に実施し得る。 あるいは、一次元または二次元の検出アレイの表面の多数の不連続領域を同時 にモニターするために、電荷結合デバイス（charge couple device：ＣＣＤ）ま たはダイオードアレイもしくは光電子増倍管のような等価のデバイスを使用して もよく、不連続領域の各々には、異なる抗原に特異的な異なる抗体が固定化され ている。その結果として、各々の抗原の存在を光放出の位置によって検出し得る 。標的抗体に特異的な抗原または抗免疫グロブリン抗体をこのような光ガイドま たは電荷結合デバイスに固定化し同様にして使用すると、特異的抗体に対する競 合結合アッセイが可能であり、このように競合用抗体をサンプルの形態で同時に 添加するときには光ガイド上の抗原に結合するルシフェラーゼ標識抗体の量は減 少するであろう。 サンプルとルシフェラーゼ抗体とを除去し、光ガイドをＤ−ルシフェリン及び Ｍｇ²⁺ＡＴＰ基質溶液に浸漬させ、光電子増 倍管で光を検出するとき、検出された光の量は、固定化された抗原または抗免疫 グロブリン抗体に特異的なサンプル中の抗体の量に関連するであろう。 表面にオリゴヌクレオチドプローブが結合した光ガイドを使用し（本出願人の ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１６９８に記載の方法参照）、ルシフェラーゼで標識され たオリゴヌクレオチドを使用するとき、上述の抗体−抗原アッセイと同様の方法 でオリゴヌクレオチド及びポリヌクレチオチドのアッセイも可能であろう。更に 、種々の光ガイドまたはアレイ領域を使用すると、単一サンプルから複数の抗原 及び核酸の同時アッセイが可能であろう。 二次元型導波路（planar waveguide）または光ファイバ（これらは多重化され ていてもよい）のような光ガイドの表面でルシフェラーゼ標識結合アッセイを実 施する特別な利点は、光ガイドの表面の数百ナノメーターの範囲内で発生する光 が検出器によって優先的に検出されながらバルク溶液中で発生する光が検出され ないので、検出対象である種、即ち結合した種から試薬を分離する必要性が少な くなることである。従って、このようなフォーマットを使用するアッセイ（通常 はエバネッセンス （ｅｖａｎｅｓｃｅｎｃｅ）と呼ばれる）は、洗浄段階または試薬の逐次添加を 必要とせず、従って、任意にフローセルを用いる液体流中で極めて迅速に実施で きる。 次に、本発明の標識物質、その製造方法、及び、その使用方法の代表例を以下 の非限定的実施例及び図面に基づいて説明する。図面の簡単な説明 図１は、実施例１に記載の種々の量のＭｇ²⁺ＡＴＰによって保護された共有結 合試薬とルシフェラーゼとのインキュベーション後に得られたルミネセンス対時 間のプロットを示す。 図２は、実施例１に記載の手順で実施したアッセイにおけるルミネセンス対リ シン量のプロットを示す。上部のプロットは１／１００に希釈したＩｇＧ−ルシ フェラーゼ複合体を用いて得られた結果を表しており、下部のプロットは１／１ ０００の希釈度を使用した結果を表している。反応式１：ホタルルシフェラーゼの反応 式中、ＬＨ₂はルシフェリン、Ｅはルシフェラーゼ、ＡＭＰはアデノシン一リ ン酸、ＰＰ₁は無機ピロリン酸塩、Ｌはオキシルシフェリンを示す。実施例１ 光測定にはいずれもＭｕｌｔｉｌｉｔｅ光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）及 び３．５ｍｌのポリスチレン管（Ｂｉｏｔｒａｃｅ Ｂｒｉｄｇｅｎｄ ＵＫ） を使用した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌ−５２５６）、ＤＴＴ、ＢＳＡ（Ｆｒａ ｃｔｉｏｎ Ｖ）、ＡＴＰ及びリシン（ｒｉｃｉｎ）はＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ ，ＵＫ）から得た。Ｄ−ルシフェリンはＦｌｕｋａ（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｕ Ｋ）から得た。スルホスクシンアミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シク ロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）はＰｉｅｒｃｅ ａｎ ｄ Ｗａｒｒｉｎｅｒ（Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）から得た。ヒツジ抗リシン抗体 は慣用の技術によって製造し、他の試薬は分析用グレードであった。 ルシフェラーゼ基質は、０．４ミリモル／リットルのＤ−ルシフェリン、４０ ミリモル／リットルの硫酸マグネシウム、２ミリモル／リットルのＡＴＰ、２ミ リモル／リットルのＥＤＴ Ａ、２ミリモル／リットルのＤＴＴ、０．２％のＢＳＡ及び２マイクロモル／リ ットルのピロリン酸ナトリウムを含有するｐＨ７．７５の１０ミリモル／リット ルのＨＥＰＥＳ緩衝液であった。基質はストック溶液から毎日新しく調製した。 ３．５ｍｌのポリスチレン管中で２μｌの評価すべきサンプルを２００μｌの基 質（上述）に添加することによってルシフェラーゼ活性アッセイを実施し、５秒 の猶予後にルミネセンスを測定し、１０秒間にわたって積算した。 基質保護方法：４．２マイクロモル／リットルのルシフェラーゼをｐＨ７．７ ５の１０ミリモル／リットルのＨＥＰＥＳ緩衝液中の６３０マイクロモル／リッ トルのスルホ−ＳＭＣＣと混合し、混合物を室温で３０分間インキュベートした 。所定の時間間隔をおいて反応混合物からサンプルを採取し、緩衝液で１００倍 に希釈し、サンプルのルシフェラーゼ活性を測定した。種々の濃度のＭｇ²⁺ＡＴ ＰまたはＤ−ルシフェリンを混合物に添加し、活性に対するそれらの効果をモニ タリングし、阻害に対する最も有効な保護を判定した。 スルホ−ＳＭＣＣとの共有結合：２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌと３７ ℃で９０分間反応させることによって、リシ ンに対するヒツジＩｇＧを還元しチオール基を遊離させた（Ｐｉｅｒｃｅ Ｗａ ｒｒｉｎｅｒキットの使用説明書参照）。０．５ミリモル／リットルのＡＴＰと ２．５ミリモル／リットルの硫酸マグネシウムとを含有するｐＨ７．０の１ｍｌ のリン酸塩緩衝液中で４ｍｇのルシフェラーゼを調製した。ｐＨ６．０のリン酸 塩緩衝液中の２０ミリモル／リットルの濃度の５０μｌのスルホ−ＳＭＣＣを添 加し、混合物を室温で３０分間インキュベートした。活性化したルシフェラーゼ を、Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ−５脱塩カラムを用いて精製し、０．２５ミリモル／リ ットルのＥＤＴＡと０．５ミリモル／リットルのＡＴＰと２．５ミリモル／リッ トルの硫酸マグネシウムとを含有するｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液中で活性化ル シフェラーゼと還元ＩｇＧとをモル比１：１で混合した。室温で反応を３０分間 進行させ、次いで１モル／リットルの濃度の１０μｌのシステインを２０分間添 加して反応を停止させた後、ルシフェラーゼ−抗体複合体をＰｉｅｒｃｅ ＧＦ −５脱塩カラムで精製した。生成物を必要になるまで、０．２５ミリモル／リッ トルのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液中で４℃で保存 した。 ＥＬＩＳＡアッセイを以下に記載のごとく実施して、結合したルシフェラーゼ の残留活性を測定した。 管ベース生物発光ＥＬＩＳＡ：０．０２％のチオマーサル（ｔｈｉｏｍｅｒｓ ａｌ）を含有するｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中の１００μｌのリシン によってポリスチレン管を４℃で一夜コーティングした。ルシフェラーゼ−抗体 複合体をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、管を２００μｌの１％Ｂ ＳＡでブロッキングした後、１００μｌの標識抗体を添加し、３７℃で１時間の インキュベーションを実施した。５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで管を ５回洗浄した。各管に２００μｌの基質を添加し、ルミネセンスを直ちに測定し た。 結果：Ｍｇ²⁺ＡＴＰによる基質保護から得られた結果を図１に示す。図１は、 ０．６３マイクロモル／リットルのスルホ−ＳＭＣＣと４．２マイクロモル／リ ットルのルシフェラーゼとＭｇ²⁺ＡＴＰとを含有する反応混合物から採取したサ ンプル（各時点毎に３回反復）中の残留活性％を光度計で読取った値を時間の関 数としてプロットする。プロットは夫々、Ｍｇ²⁺またはＡＴＰ非含有；０．０３ ミリモル／リットルのＡＴＰと ０．２ミリモル／リットルのＭｇ²⁺；０．２５ミリモル／リットルのＡＴＰと２ ．０ミリモル／リットルのＭｇ²⁺；０．２５ミリモル／リットルのＡＴＰと２． ５ミリモル／リットルのＭＧ²⁺とを用いた反応を示す。また、Ｄ−ルシフェリン による保護効果も観察した（結果示さず）。Ｄ−ルシフェリンを用いた場合、活 性はある程度維持されるが、Ｍｇ²⁺ＡＴＰによって維持される活性よりも有意に 少ないことが判明した。試験したＤ−ルシフェリンの最大濃度は１ミリモル／リ ットルであり、スルホ−ＳＭＣＣに３０分間接触させた後に維持されていたルシ フェラーゼ活性の初期値に対する割合は１１％であった。これに比べて、Ｍｇ²⁺ ＡＴＰを用いた場合には４０％を上回る値が得られた。 管ベース生物発光ＥＬＩＳＡの結果を図２に示す。Ｍｕｌｔｉｌｉｔｅ光度計 で光測定を直接行うことができるようにポリスチレン管を使用したが、マイクロ タイタープレート及びプレート光度計の使用も同様に可能である。結果は、活性 ルシフェラーゼ−抗体複合体が産生され、抗体がその結合特性を維持しているこ とを示す。実施例２ リシンに対するヒツジポリクローナル抗体を、光電子増倍管に接続した光ファ イバに共有結合させた。ファイバに結合した抗体を含むファイバの部分は、必要 に応じて種々の溶液を充填及び排出し得るチャンバの内部に存在している。以下 のサイクルでアッセイを実施した。 （Ｉ）ルシフェラーゼが存在するならば光を放出するようにＤ−ルシフェリンを 含有する基質溶液をチャンバに添加した。 （II）基質溶液をリシンを含む試験サンプルによって置換した。 （III）試験サンプル溶液をルシフェラーゼで標識したヒツジ抗リシンＩｇＧを 含有する溶液によって置換した。 （IV）ヒツジ抗リシン溶液をＤ−ルシフェリン含有基質溶液によって置換した。 （Ｖ）基質溶液を再生緩衝液によって置換した。 このフォーマットを使用すると、例えば既知量のリシンのシグナル増加を用い て得られた標準曲線に基づいて、段階（IV）で光電子増倍管から発生したシグナ ルがそれ以前のシグナルに比べたときに示した増加とリシンの量とを関連させる ことによって、試験サンプル中のリシンの量を決定することが可能であ る。 本願に記載されたルシフェラーゼと標識化学物質との結合方法はまた、ＵＫ出 願ＧＢ９４０５７５０．２に対応するＰＣＴ／ＧＢ９５／００６２９に記載され たルシフェラーゼにも適しているであろう。同様に、該方法はまた、ＧＢ９５０ １１７０．６、ＧＢ９５０１１７２．２に記載のルシフェラーゼにも適当であり 、ＧＢ９４１４０９６．９に記載の捕捉アッセイにおいても好適に使用されるで あろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年９月１１日 【補正内容】 ルシフェラーゼ標識方法 本発明は、化学的アッセイ、特にバイオアッセイ、より特定的にはイムノアッ セイのような特異的結合アッセイ及びハイブリダイゼーションプロービング技術 に使用するため、並びに、アッセイフォーマット中で例えばＰＣＲによる特異的 増幅産物にラベルを組込むために、化学的材料、特に生物学的材料を標識する方 法に関する。 ホタルルシフェラーゼが介在するルシフェリンの開裂（反応式１）は高い量子 収率及び安定な光出力を有しており、比較的簡単な計器を用いて極めて低濃度の 酵素自体を検出することが可能である（ＭｃＣａｐｒａ，“バイオルミネセンス 及びケミルミネセンスの潜在的用途（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ ｎｅｓｃｅｎｃｅ）”，Ｔｕｒｎｅｒら（編），Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：ｆｕｎ ｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）：６１７−３７参照）。ルシフェ ラーゼを間接ラベルとして用いる方法は 多数開発されている（Ｗａｎｎｌｕｎｄ ａｎｄ ＤｅＬｕｃａ，“バイオルミ ネセンスイムノアッセイ：メトキシレート及びＤＮＰを定量するためのルシフェ ラーゼ抗原複合体の使用（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙｓ：Ｕｓｅ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｊｕ ｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｘｙｌａ ｔｅ ａｎｄ ＤＮＰ）”，Ｄｅｌｕｃａ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ（編），Ｂ ｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ：Ｂａｓｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｌ ｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８１ ）：６９３−６９６；Ｇｅｉｇｅｒ ａｎｄ Ｍｉｓｋａ，“バイオルミネセン ス増強エンザイムイムノアッセイ：エンザイムイムノアッセイ用の新しい超高感 度検出システム（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｎｚ ｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｎｅｗ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄ ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ）”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｊ．（１９８７）２５，３１−３８；及び、Ｍｕｒａｋａｍｉら，“アデニ ル酸キナーゼ及びホタルルシフェラーゼを用いる生物発光検出システムの開発（ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅ ｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）”，Ｓｚａｌａｙら（編）， Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ ｅ：Ｓｔａｔｕｓ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９３）２９６−３００参照）。 本発明者らは、ルシフェラーゼを直接ラベルとして使用することによってアッ セイの感度を維持しながらアッセイの設計をはるかに簡単にできることに注目し た。しかしながら、極めて不安定な酵素活性を有することが判っている物質を失 活させることなく検定用結合因子（assay binding agent）に結合させる方法が 必要である。グルタルアルデヒド、ＳＭＣＣ及びＳＭＰＢのような標準的な共有 結合試薬（covalent couplihg reagent）はルシフェラーゼ活性を急速にかつ不 可逆的に阻害する。 例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓに由来のルシフェ ラーゼは４個のシステイン残基を含み（Ｗｅｔら，（１９８７），Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，７２５−７３７参照 ）、その２つは活性部位に近接しているかまたは活性部位の一部を構成している （Ｄｅｌｕｃａ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ，（１９７８），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５７，３−１５参照）。本発明者らは、観察された 失活の原因は共有結合試薬が上記の残基に結合するためであろうと推測し、不可 逆的阻害から酵素を保護するようなルシフェラーゼと検定物質との結合方法を提 供した。 従って、本発明の第一の目的によれば、ホタルルシフェラーゼを化学物質、特 に抗体、抗原または核酸のような特異的結合因子（binding agent）、より特定 的には抗体に結合させる方法が提供される。この方法は、（ａ）Ｄ−ルシフェリ ン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸のいずれか一種以上とルシフェ ラーゼとを、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の濃度が夫々０．２ミ リモル／リットル及び０．０５ミリモル／リットルよりも大きい値となるように 混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと上記化学物質と の間に共有結合反応を惹起する段階とを含む。好ましくは、段階（ａ）は、ルシ フェラーゼとその基質とを溶液中で混合することによって実施され、また、好ま しくは、マグネシウムとアデノシン三リン酸との双方がアデノシン三リン酸マグ ネシウム（Ｍｇ²⁺ＡＴＰ）の形態で、任意にＤ−ルシフェリンと共に存在する。 好ましくは、Ｍｇ²⁺ＡＴＰまたはＤ−ルシフェリンの一方だけが存在する。Ｍｇ²⁺ とＡＴＰとルシフェリンとが３つとも存在するときは、反応混合物から酸素を 排除するのが好ましい。 本発明の第二の目的によれば、本発明の方法によって提供される活性ホタルル シフェラーゼに結合した化学物質を含む標識化学物質（labelled chemical enti ty）が提供される。好ましくは、化学物質が、特異的結合アッセイでの使用に適 した特異的結合因子、好ましくは抗体、抗原または核酸である。結合因子が核酸 である場合、核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであるが、ポリヌクレオチド またはヌクレオシドでもよく、また、該核酸をハイブリダイゼーションプローブ もしくは鎖延長プライマー、例えばＰＣＲプライマーとして使用してもよい。該 物質が抗体である場合が最も有利であるが、その理由は、抗体を ルシフェラーゼに結合させるこれまでの試みはほぼ完全な失活に終わっていたか らである。 ルシフェラーゼ標識化学物質、及び、特にルシフェラーゼ標識抗体の提供によ って与えられる特別な利点は、光ガイドを組み込んだ捕捉アッセイ（capture as say）の実施が可能になったことである。このようなアッセイの１つの好適例で は、標的抗原に対する捕捉抗体が光ガイドに固定化され、例えば光ファイバから 成る光ガイドは例えば光電子増倍管から成る光測定デバイスに受容光を導入する ように構成されている。測定すべき抗原を液体サンプル中で光ガイドに作用させ 、ルシフェラーゼで標識されていることを特徴とする第二抗体を溶液中で光ガイ ドと接触させる。第二抗体は、既に捕捉されて捕捉抗体に結合している抗原に結 合する。 捕捉された抗原の存在及び／または量を決定するためには、溶液中のＤ−ルシ フェリン及びＭｇ²⁺ＡＴＰを、抗原−抗体複合体が結合した光ガイドの表面に接 触させ、例えば光電子増倍管から成る光測定デバイスに伝送された放出光の量を 測定するだけでよい。この方法においては、各々が異なる抗原を捕捉し得る複数 の光ガイドを単一のサンプルチャンバに配置して使用 することによって、より高感度を有する光測定アッセイを複数の特異性を持って 実施することが可能となり、従って、同一段階に複数の異なるルシフェラーゼ標 識抗体を添加することによって複数の異なるイムノアッセイを同時に実施し得る 。 あるいは、一次元または二次元の検出アレイの表面の多数の不連続領域を同時 にモニターするために、電荷結合デバイス（charge couple device：ＣＣＤ）ま たはダイオードアレイもしくは光電子増倍管のような等価のデバイスを使用して もよく、不連続領域の各々には、異なる抗原に特異的な異なる抗体が固定化され ている。その結果として、各々の抗原の存在を光放出の位置によって検出し得る 。標的抗体に特異的な抗原または抗免疫グロブリン抗体をこのような光ガイドま たは電荷結合デバイスに固定化し同様にして使用すると、特異的抗体に対する競 合結合アッセイが可能であり、このように競合用抗体をサンプルの形態で同時に 添加するときには光ガイド上の抗原に結合するルシフェラーゼ標識抗体の量は減 少するであろう。 サンプルとルシフェラーゼ標識抗体とを除去し、光ガイドをＤ−ルシフェリン 及びＭｇ²⁺ＡＴＰ基質溶液に浸漬させ、光電子増倍管で光を検出するとき、検出 された光の量は、固定化さ れた抗原または抗免疫グロブリン抗体に特異的なサンプル中の抗体の量に関連す るであろう。 表面にオリゴヌクレオチドプローブが結合した光ガイドを使用し（本出願人の ＷＯ９３０６２４１に記載の方法参照）、ルシフェラーゼで標識されたオリゴヌ クレオチドを使用するとき、上述の抗体−抗原アッセイと同様の方法でオリゴヌ クレオチド及びポリヌクレチオチドのアッセイも可能であろう。更に、種々の光 ガイドまたはアレイ領域を使用すると、単一サンプルから複数の抗原及び核酸の 同時アッセイが可能であろう。実施例１ 光測定にはいずれもＭｕｌｔｉｌｉｔｅ（登録商標）光度計（ｌｕｍｉｎｏｍ ｅｔｅｒ）及び３．５ｍｌのポリスチレン管（Ｂｉｏｔｒａｃｅ Ｂｒｉｄｇｅ ｎｄ ＵＫ）を使用した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌ−５２５６）、ＤＴＴ、Ｂ ＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）、ＡＴＰ及びリシン（ｒｉｃｉｎ）はＳｉｇｍａ （Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から得た。Ｄ−ルシフェリンはＦｌｕｋａ（Ｇｉｌｌｉｎ ｇｈａｍ，ＵＫ）から得た。スルホスクシンアミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ チル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）はＰｉｅ ｒｃｅ ａｎｄ Ｗａｒｒｉｎｅｒ（Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）から得た。ヒツジ 抗リシン抗体は慣用の技術によって製造し、他の試薬は分析用グレードであった 。 ルシフェラーゼ基質は、０．４ミリモル／リットルのＤ−ルシフェリン、４０ ミリモル／リットルの硫酸マグネシウム、２ミリモル／リットルのＡＴＰ、２ミ リモル／リットルのＥＤＴＡ、２ミリモル／リットルのＤＴＴ、０．２％のＢＳ Ａ及び２ｇモル／リットルのピロリン酸ナトリウムを含有するｐＨ７．７５の１ ０ミリモル／リットルのＨＥＰＥＳ緩衝液であっ た。基質はストック溶液から毎日新しく調製した。３．５ｍｌのポリスチレン管 中で２×１０^-6リットルの評価すべきサンプルを２００×１０^-6リットルの基質 （上述）に添加することによってルシフェラーゼ活性アッセイを実施し、５秒の 猶予後にルミネセンスを測定し、１０秒間にわたって積算した。 基質保護方法：４．２ｇモル／リットルのルシフェラーゼをｐＨ７．７５の１ ０ミリモル／リットルのＨＥＰＥＳ緩衝液中の６３０ｇモル／リットルのスルホ −ＳＭＣＣと混合し、混合物を室温で３０分間インキュベートした。所定の時間 間隔をおいて反応混合物からサンプルを採取し、緩衝液で１００倍に希釈し、サ ンプルのルシフェラーゼ活性を測定した。種々の濃度のＭｇ²⁺ＡＴＰまたはＤ− ルシフェリンを混合物に添加し、活性に対するそれらの効果をモニタリングし、 阻害に対する最も有効な保護を判定した。 結果：Ｍｇ²⁺ＡＴＰによる基質保護から得られた結果を図１に示す。図１は、 ０．６３×１０^-6モル／リットルのスルホ−ＳＭＣＣと４．２×１０^-6モル／リ ットルのルシフェラーゼとＭｇ²⁺ＡＴＰとを含有する反応混合物から採取したサ ンプル（各時点毎に３回反復）中の残留活性％を光度計で読取った値を時間の関 数としてプロットする。プロットは夫々、Ｍｇ²⁺またはＡＴＰ非含有；０．０３ ミリモル／リットルのＡＴＰと０．２ミリモル／リットルのＭｇ²⁺；０．２５ミ リモル／リットルのＡＴＰと２．０ミリモル／リットルのＭｇ²⁺；０．２５ミリ モル／リットルのＡＴＰと２．５ミリモル／リットルのＭＧ²⁺とを用いた反応を 示す。また、Ｄ−ルシフェリンによる保護効果も観察した（結果示さず）。Ｄ− ルシフェリンを用いた場合、活性はある程度維持されるが、Ｍｇ²⁺ＡＴＰによっ て維持される活性よりも有意に少ないことが判明した。試験したＤ−ルシフェリ ンの最大濃度は１ミリモル／リットルであり、スルホ−ＳＭＣＣに３０分間接触 させた後に維持されていたルシフェラーゼ活性の初期値に対する割合は１１％で あった。これに比べて、Ｍｇ²⁺ＡＴＰを用いた場合には４０％を上回る値が得ら れた。 管ベース生物発光ＥＬＩＳＡの結果を図２に示す。Ｍｕｌｔｉｌｉｔｅ（登録 商標）光度計で光測定を直接行うことができるようにポリスチレン管を使用した が、マイクロタイタープレート及びプレート光度計の使用も同様に可能である。 結果は、活性ルシフェラーゼ−抗体複合体が産生され、抗体がその結合特性を維 持していることを示す。実施例２ リシンに対するヒツジポリクローナル抗体を、光電子増倍管に接続した光ファ イバに共有結合させた。ファイバに結合した抗体を含むファイバの部分は、必要 に応じて種々の溶液を充填及び排出し得るチャンバの内部に存在している。以下 のサイクルでアッセイを実施した。 （Ｉ）ルシフェラーゼが存在するならば光を放出するようにＤ−ルシフェリンを 含有する基質溶液をチャンバに添加した。 （II）基質溶液をリシンを含む試験サンプルによって置換した。 （III）試験サンプル溶液をルシフェラーゼで標識したヒツジ抗リシンＩｇＧを 含有する溶液によって置換した。 （IV）ヒツジ抗リシン溶液をＤ−ルシフェリン含有基質溶液によって置換した。 （Ｖ）基質溶液を再生緩衝液によって置換した。 このフォーマットを使用すると、例えば既知量のリシンのシグナル増加を用い て得られた標準曲線に基づいて、段階（IV）で光電子増倍管から発生したシグナ ルがそれ以前のシグナルに比べたときに示した増加とリシンの量とを関連させる ことによって、試験サンプル中のリシンの量を決定することが可能である。 本願に記載されたルシフェラーゼと標識化学物質との結合方法はまた、ＷＯ９ ５２５７９８に記載されたルシフェラーゼにも適しているであろう。同様に、該 方法はまた、他のルシフェラーゼにも適当であろう。 請求の範囲 １．（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸のい ずれか１種以上とルシフェラーゼとを、マグネシウムイオン及びアデノシン三リ ン酸の濃度が夫々０．２ミリモル／リットル及び０．０５ミリモル／リットルよ りも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフ ェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹起する段階とを含むホタルルシフ ェラーゼと化学物質との結合方法。 ２．段階（ａ）が、ルシフェラーゼをＤ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及 び／またはアデノシン三リン酸と溶液中で混合させることによって行われること を特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の双方が、アデノシン三リン酸 マグネシウム（Ｍｇ²⁺ＡＴＰ）の形態で存在することを特徴とする請求項１に記 載の方法。 ４．段階（ａ）が、４×１０^-6モル／リットルのルシフェラーゼあたり０．２ミ リモル／リットルまたはそれ以上のＡＴＰを用いて行われることを特徴とする請 求項１に記載の方法。 ５．段階（ａ）が、２ミリモル／リットルのマグネシウムイオンの存在下で行わ れることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．共有結合試薬がグルタルアルデヒド、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイ ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及び／また はスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ） を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。 ７．段階（ｂ）が、ルシフェラーゼをＤ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及 び／またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と混合した後に共有結合試薬によって 行われることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。 ８．０．５ミリモル／リットルのＡＴＰを使用することを特徴とする請求項７に 記載の方法。 ２４．（ａ）Ｄ−ルシフェリンとルシフェラーゼとを、またはマグネシウムイオ ンとアデノシン三リン酸との組合わせとルシフェラーゼとを、マグネシウムイオ ン及びアデノシン三リン酸の濃度が夫々０．２ミリモル／リットル及び０．０５ ミリモル／リットルよりも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結 合試薬を用いてルシフェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹起する段階 とを含むホタルルシフェラーゼと化学物質との結合方法。 ２５．（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の いずれか１種以上とルシフェラーゼとを、マグネシウムイオン及びアデノシン三 リン酸の濃度が夫々０．２ミリモル／リットル及び０．０５ミリモル／リットル よりも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシ フェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹起する段階とを含み、但し、Ｄ −ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の全部が存在する ときは、反応から酸素を排除することを特徴とするホタルルシフェラーゼと化学 物質との結合方法。 【図１】 【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，Ｂ Ｇ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 マーフイー，メレニー・ジエーン イギリス国、ウイルトシヤー・エス・ピ ー・４・０・ジエイ・キュー、ソールズベ リー、ポートン・ダウン、シー・ビー・デ イ・イー、ミニストリー・オブ・デイフエ ンス（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸のい ずれか１種以上とルシフェラーゼとを混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用 いてルシフェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹起する段階とを含み、 Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及び／またはアデノシン三リン酸の量が 共有結合試薬による阻害からルシフェラーゼ活性を保護すべく十分な量であるこ とを特徴とするルシフェラーゼと化学物質との結合方法。 ２．段階（ａ）が、ルシフェラーゼをＤ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及 び／またはアデノシン三リン酸と溶液中で混合させることによって行われること を特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の双方が、アデノシン三リン酸 マグネシウム（Ｍｇ²⁺ＡＴＰ）の形態で存在することを特徴とする請求項１に記 載の方法。 ４．段階（ａ）が、４マイクロモル／リットルのルシフェラーゼあたり０．２ミ リモル／リットルまたはそれ以上のＡＴＰを 用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．段階（ａ）が、２ミリモル／リットルのマグネシウムイオンの存在下で行わ れることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．共有結合試薬がグルタルアルデヒド、ＳＭＣＣ及び／またはＳＭＰＢを含む ことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。 ７．段階（ｂ）が、ルシフェラーゼをＤ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及 び／またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で共有結合試薬によって活性 化した後に行われることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方 法。 ８．０．５ミリモル／リットルのＡＴＰを使用することを特徴とする請求項７に 記載の方法。 ９．請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって提供された活性ルシフ ェラーゼに結合した化学物質を含む標識化学物質。 １０．化学物質が特異的結合アッセイに好適に使用される特異的結合因子である ことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法または標識化学物 質。 １１．化学物質が抗体、抗原または核酸であることを特徴とす る請求項１０に記載の方法または標識化学物質。 １２．請求項９から１１のいずれか一項に記載の標識化学物質の使用を含むこと を特徴とする特異的結合アッセイ。 １３．標的化学物質を請求項６に記載の化学物質に特異的に結合させ、結合した 物質とＤ−ルシフェリンとをルシフェラーゼがＤ−ルシフェリンを開裂させ光の 放出を惹起する条件下で接触させ、放出された光の量と標的化学物質の存在とを 関連させることによって標的化学物質の存在及び／または量を決定することを特 徴とする請求項１２に記載の特異的結合アッセイ。 １４．標的化学物質が抗原であり、前記抗原は、活性ルシフェラーゼに結合した 特異的結合因子に結合する前に抗原特異的捕捉抗体によって捕捉されることを特 徴とする請求項１２または１３に記載の特異的結合アッセイ。 １５．活性ルシフェラーゼに結合した特異的結合因子が標的抗原に特異的な抗体 であることを特徴とする請求項１４に記載の特異的結合アッセイ。 １６．捕捉抗体が光測定デバイスに光を供給する光ガイドに結合していることを 特徴とする請求項１４または１５に記載の特 異的結合アッセイ。 １７．光ガイドが光ファイバであることを特徴とする請求項１６に記載の特異的 結合アッセイ。 １８．光検出デバイスを使用して一次元または二次元の検出アレイ表面上の多数 の不連続領域を同時にモニタリングし、該不連続領域の各々が異なる抗原または 抗体に夫々特異的な異なる固定化された抗体または抗原を有しており、各々の抗 原の存在は検出された光放出の位置によって検出されることを特徴とする請求項 １４に記載の特異的結合アッセイ。 １９．光検出デバイスが電荷結合デバイスであることを特徴とする請求項１８に 記載のアッセイ。 ２０．請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって活性ルシフェラーゼ に結合した特異的結合因子を含むことを特徴とする検査キット。 ２１．活性ルシフェラーゼに結合した抗体を含むことを特徴とする検査キット。 ２２．結合したルシフェラーゼが標識抗体の作製に使用されたルシフェラーゼの 活性の１０％以上の活性を有していることを特徴とする請求項２１に記載の検査 キット。 ２３．抗体、抗原または核酸が固定された光ガイドまたは光検出アレイを含むこ とを特徴とする請求項２１または２２に記載の検査キット。 ２４．（ａ）Ｄ−ルシフェリンとルシフェラーゼとを、またはマグネシウムイオ ンとアデノシン三リン酸との組合わせとルシフェラーゼとを混合する段階と、（ ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹 起する段階とを含み、Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及び／またはアデ ノシン三リン酸の量が共有結合試薬による阻害からルシフェラーゼ活性を保護す べく十分な量であることを特徴とするルシフェラーゼと化学物質との結合方法。 ２５．（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の いずれか１種以上とルシフェラーゼとを混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を 用いてルシフェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹起する段階とを含み 、Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及び／またはアデノシン三リン酸の量 が共有結合試薬による阻害からルシフェラーゼ活性を保護すべく十分な量であり 、但し、Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の全部 が存在するときは、 反応から酸素を排除することを特徴とするルシフェラーゼと化学物質との結合方 法。