JPH10204068A

JPH10204068A - 新規物質ｙｓｉ−４０−２

Info

Publication number: JPH10204068A
Application number: JP1354197A
Authority: JP
Inventors: Ryosuke Fudo; 亮介不藤; Shigeru Yamanaka; 茂山中; Toshihiko Yoshimura; 敏彦吉村; Hajime Kojika; 小鹿　　一; Hirotsugu Sakagami; 洋次坂神
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-01-28
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 1998-08-04

Abstract

(57)【要約】【課題】強力な抗真菌活性を有し、動物細胞に対
する細胞毒性が低く、しかも、工業的大量生産の容易な
新規抗生物質及びこれを有効成分とする抗真菌剤を提供
する。【解決手段】上記課題は、下記の化学構造を有する新
規物質ＹＳＩ−４０−２、【化１】及び上記記載のＹＳＩ−４０−２又はその塩を有効成分
とする抗真菌剤によって解決される。この新規物質はシ
ストバクター属細菌を培養することによって取得するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規物質ＹＳＩ−
４０−２及びこれを有効成分とする抗真菌剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、カンジダ属、アスペルギルス
属、トリコフィートン属等の真菌類を病原体とする真菌
症に対しては様々な抗真菌剤が用いられている。このよ
うな抗真菌剤としては現在アンホテリシン、ミコナゾー
ル、グリセオフルビン等が知られている。

【０００３】しかしこれら従来の抗真菌薬は抗真菌活性
は有するものの、動物細胞等の真核細胞一般に対する細
胞毒性が強い。従って、使用に際して十分な量を投与す
ることが出来ず、必ずしも十分な治療効果を上げること
が出来ない。このため強力な抗真菌活性を有するととも
に、他の動物細胞等に対する細胞毒性の低い物質が要望
されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した点
に鑑みてなされたものであり、強力な抗真菌活性を有
し、動物細胞に対する細胞毒性が低く、しかも、工業的
大量生産の容易な新規抗生物質及びこれを有効成分とす
る抗真菌剤を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するため鋭意研究を続けた結果、シストバクター属
に属する細菌の培養物が強い抗真菌作用を有することを
見出し、この培養物から抗真菌作用物質の単離に成功し
てこれが新規物質であることを見出した。

【０００６】本発明は、かかる知見に基づいてなされた
ものであり、下記の化学構造を有する新規物質ＹＳＩ−
４０−２及びこのＹＳＩ−４０−２又はその薬理学的に
許容される塩を有効成分とする抗真菌剤に関するもので
ある。

【０００７】

【化２】

【０００８】

【発明の実施の形態】このような本発明に係わる新規物
質ＹＳＩ−４０−２を生産する生産菌としては、例えば
シストバクター属に属するシストバクター・フスカス
（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｆｕｓｃｕｓ；例えばＦＥ
ＲＭＰ−１５９９７）が挙げられる。

【０００９】ＹＳＩ−４０−２生産菌は一般的な微生物
の培養方法を用いて培養することが可能である。

【００１０】培養に用いられる培地としては、ＹＳＩ−
４０−２生産菌が利用できる栄養源を含有するものであ
ればよい。例えば炭素源及び窒素源としてカゼイン、グ
ルテン、大豆粉、酵母エキスなどの各種タンパク質やア
ミノ酸混合物などが適している。また発酵生産に用いた
酵母や細菌の菌体あるいはグルコース、デンプン、デキ
ストリンなどの糖質類や尿素、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウムなどの無機窒素源も利用可能である。ま
た培地は必要に応じて、炭酸カルシウム、リン酸ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を含有することが可
能である。培地のｐＨは６〜９で培養することができる
が、特に７．０〜８．５で培養することが好ましい。ま
た生産物の収量を上げる目的で培地中に各種の吸着樹脂
を添加して培養することも可能である。

【００１１】ＹＳＩ−４０−２生産菌は１０℃〜３８℃
で培養することができるが、特に２７℃〜３０℃で培養
することが最も望ましい。培養時間は通常３日〜５日で
あるが、培養条件により適宜変更することが可能であ
る。

【００１２】培養により生成される新規物質ＹＳＩ−４
０−２は、菌体内および培養上清の両方に蓄積される。
この生産菌の培養液からＹＳＩ−４０−２を得るために
は微生物の代謝産物を採集するのに通常用いられる方法
を用いることが可能である。例えばＹＳＩ−４０−２と
培養物中に含まれる他の物質との溶解度を利用する方
法、イオン結合力との差を利用する方法、吸着親和力の
差を利用する方法、分子量の差を利用する方法等を単独
であるいは適宜組み合わせて、または反復して使用する
ことができる。具体的には例えばＹＳＩ−４０−２生産
菌の培養物及び菌体の抽出液をゲルろ過クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー等を組み合わせて用いて精製することによりＹＳＩ−
４０−２及びその他の活性成分を含む画分が得られる。
この画分を減圧濃縮して得られる固形物をさらに高速液
体クロマトグラフィーを用いて展開して精製することに
より、ＹＳＩ−４０−２を得ることができる。

【００１３】このようにして得られた新規物質ＹＳＩ−
４０−２は以下のような理化学的性質を有する。

【００１４】ａ）外観：無色柱状結晶ｂ）溶解性：ジクロロメタン、メタノール、アセトン、
酢酸エチル、に可溶。ヘキサン、水に難溶ｃ）融点：１１４〜１１５℃ ｄ）旋光度：[α]²⁵ _D＋１０９（ｃ０．２４，ＣＨＣ
ｌ₃）ｅ）紫外部吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：λｍａｘ２２
３(ε３８２００)、２４２(３４５００)、３１０（１２
４００）ｍｍｆ）赤外部吸収スペクトル（ＣＨＣｌ₃）：３１２３、
１７０６、１６２４、１４９９、１４５７、１４４１、
１３８５、１２６７、１１９４、１１５０、１１２７、
１０９４、１０４４、９６９、９２７、８２８ｃｍ^-1 ｇ）¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ
Ｃｌ₃）：７．８７(ｓ，１Ｈ)、７．０９(ｓ，１Ｈ)、
６．５８(ｄ，Ｊ＝１５.６Ｈｚ，１Ｈ）、６．４１（ｄ
ｄ，Ｊ＝１５．６，７．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．９６
（ｓ，１Ｈ）、４．１７（ｄｑ，Ｊ＝８．０，６．８Ｈ
ｚ，１Ｈ）、３．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，７．６Ｈ
ｚ，１Ｈ）、３．６６(ｓ，３Ｈ)、３．６０(ｓ，３
Ｈ)、３.３６(ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ)、
３.３３(ｓ，３Ｈ)、１．４４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，
６Ｈ）、１．２２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）ｈ）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤ
Ｃｌ₃）：１７８．６(ｓ)、１７６．７（ｓ）、１６
７．７（ｓ）、１６２．６（ｓ）、１５４．３（ｓ）、
１４８．６（ｓ）、１３１．８（ｄ）、１２５．４
（ｄ）、１１５．１（ｄ）、１１４．９（ｄ）、９１．
１(ｄ)、８４．４(ｄ)、５７．０（ｑ）、５５．５
（ｑ）、５０．８（ｑ）、３９．８（ｄ）、３３．３
（ｄ）、２３．１（ｑ，２Ｃ）、１４．１（ｑ）ｉ）質量分析：ＭＳ（ＦＡＢ＋、ｍａｔｒｉｘ；ｍ−ｎ
ｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ−ａｌｃｏｈｏｌ）；ｍ／ｚ４
２３（ＭＨ⁺）、３９１、３５９、２７９（ｂａｓｅ）ｊ）ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５８（ｈｅｘａｎｅ−酢酸エチ
ル（２：１））ｋ）元素分析：Ｃ，５６．８２％；Ｈ，６．２９％；
Ｎ，６．５８％計算値：Ｃ，５６．８５％；Ｈ，６．２０％；Ｎ，６．
６３％

【００１５】上記の分析結果から構造を次のようにして
決定した。まず、質量分析スペクトルおよび元素分析値
より分子式はＣ２０−Ｈ２６−０４−Ｓ２である。¹Ｈ
−核磁気共鳴スペクトル、¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクト
ル、二次元ＣＯＳＹスペクトル、及び¹Ｈ−¹³ＣＣＯＳ
Ｙスペクトルから、四級炭素以外の部分構造が推定され
た。四級炭素(６個)やヘテロ原子(７個)により分断され
たこれら部分構造のつながりは、ＨＭＢＣスペクトルに
より推定できた。ビチアゾール構造(下記構造式)は、上
記核磁気共鳴スペクトルデータより推定されたが、ｍｙ
ｘｏｔｈｉａｚｏｌ⁽¹⁾とのＮＭＲの比較から確認でき
たことから本物質の構造を決定した。赤外吸収スペクト
ルもこの構造を支持する。（上記(１)：ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓ；１４７４〜１４７９（１９８０））

【００１６】

【化３】

【００１７】以上のような性質を有するＹＳＩ−４０−
２は各種真菌類に対し強い抗菌活性を有する。カンジダ
等の酵母類及びアスペルギルス等の糸状菌類のいずれに
対しても抗菌活性を有する。

【００１８】この抗菌活性は抗生物質の抗菌スペクトル
を求める方法に従って測定することができ、通常はＹＳ
Ｉ−４０−２の濃度を変えた寒天平板の希釈列を作成
し、そこに各種の菌を植え付けて最小生育阻止濃度を求
めることによって行なう。寒天平板の培地にはポテトデ
キストロース寒天培地、２％麦芽エキス寒天培地等を用
いればよい。

【００１９】従って、ＹＳＩ−４０−２は抗真菌剤とし
て利用する事が可能である。即ちＹＳＩ−４０−２を有
効成分とする低毒性の真菌症治療剤として有用である。

【００２０】このＹＳＩ−４０−２は経口、非経口で投
与する事ができる。

【００２１】経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤等の剤型に、非経口投与の場合は、無菌溶液
剤、懸濁溶剤等の剤型に調製することが望ましい。投与
量は疾病の種類、程度、患者の年齢や体重等の因子によ
り適宜変更することが可能であるが、ヒトに対しては
０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で投与することが望まし
い。

【００２２】またＹＳＩ−４０−２は、薬理学的に許容
される塩として調製することができ、また調剤上必要
な、賦形剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、酸化防止剤、香
料等を用いて調製することが可能である。

【００２３】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。

【００２４】１．ＹＳＩ−４０−２の製造；下記の組成
を有するシード培地を調製し、その１００ｍｌを５００
ｍｌ容三角フラスコに注入し加熱蒸気滅菌した(１２０
℃，２０分)。これにシストバクター・フスカス（ＦＥＲＭＰ−１５９９７）を一白金耳接
種し、２８℃で３日間旋回振盪培養（１８０ｒｐｍ）し
た。

【００２５】 [シード培地組成] カジトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ乾燥酵母（エビオス、アサヒビール製）５ｇ／ｌ麦芽エキス（ディフコ社製）２ｇ／ｌ酵母エキス（ディフコ社製）１ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１ｇ／ｌ寒天（ディフコ社製）０．５ｇ／ｌＨｅｐｅｓ１０ｇ／ｌＭｇ₃（ＰＯ₄）₂・７Ｈ₂Ｏ３ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）

【００２６】次に下記の組成を有する生産培地を調製
し、その１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに注入
し、加熱蒸気滅菌（１２０℃，２０分）した。これに上
述のシード培養液５ｍｌを接種し、２８℃で４日間旋回
培養（１８０ｒｐｍ）した。

【００２７】 [生産培地組成] カジトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ乾燥酵母（エビオス、アサヒビール製）５ｇ／ｌ麦芽エキス（ディフコ社製）２ｇ／ｌ酵母エキス（ディフコ社製）１ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１ｇ／ｌ寒天（ディフコ社製）０．５ｇ／ｌＨｅｐｅｓ１０ｇ／ｌＭｇ₃（ＰＯ₄）₂・７Ｈ₂Ｏ３ｇ／ｌ吸着樹脂ＳＰ２０７（三菱化学製）２０ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）

【００２８】得られた生産培地の培養液から以下の手順
でＹＳＩ−４０−２の単離を行った。

【００２９】即ちこの培養液２．５Ｌを遠心分離にかけ
上清を除去し、湿菌体と吸着樹脂を得た。これにメタノ
ール２００ｍｌ及びアセトン８００ｍｌを加えて、３日
間室温で静置して活性物質を抽出した。次いでろ過によ
って菌体及び吸着樹脂を除去したアセトン（１Ｌ）を減
圧濃縮し粗抽出物（８．２ｇ）を得た。このものをメタ
ノール−水（６：４）１００ｍｌに溶解し、ジクロロメ
タン５０ｍｌで３回抽出し濃縮してジクロロメタン可溶
部（１．６ｇ）を得た。これをシリカゲル（フジシリシ
アＢＷ８２０ＭＨ，１６ｇ）のカラムクロマトグラフィ
ーに供した。溶離液として酢酸エチル、次いでメタノー
ルで溶出した。このうち酢酸エチル溶出画分（７８０ｍ
ｇ）をシリカゲルの中圧液体クロマトグラフィー（野村
化学(株)Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＬＯＰ６０，２４ＩＤｘ
３６０ｍ）により分離した。溶離液として酢酸エチル
−ヘキサン系混液（酢酸エチル１０％→１００％，９０
分の直線グラジエント）を用い、酢酸エチル(５２〜６
２％)溶出画分（７２ｍｇ）を分取した。これをヘキサ
ン−酢酸エチル（２０：１）より再結晶し、ＹＳＩ−４
０−２（３１．６ｍｇ）を純粋で得た。

【００３０】２．抗真菌活性試験ＹＳＩ−４０−２の抗真菌活性を寒天希釈平板法を用い
て求めた。ＹＳＩ−４０−２は少量のメタノールで溶解
した後ポテトデキストロース液体培地で等倍希釈系列を
作製した。その０．１ｍｌを加熱溶解したポテトデキス
トロース寒天培地０．９ｍｌと混合し、２４ウェルプレ
ート(コーニング社)へ分注した。被検菌であるカンジダ
属及びサッカロマイセス属はポテトデキストロース液体
培地（ディフコ社)で一晩培養した後、約１０⁴／ｍｌに
なるよう培地で希釈した。アスペルギルス属及びトリコ
デルマ属はポテトデキストロース寒天培地（ディフコ
社）上で十分生育させた後胞子を集め、約１０⁴／ｍｌ
になるよう培地で希釈した。このような調製した被検菌
を上記の抗生物質含有培地に接種し、２５℃で２晩培養
し生育の認められない最小濃度（ＭＩＣ）を求めた。

【００３１】結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１から明らかなようにＹＳＩ−４０−２
は優れた抗真菌活性を有することがわかった。

【００３４】３．各種動物細胞に対する毒性評価 [試験例１]ＹＳＩ−４０−２のＨＣＴ−１１６細胞（ヒ
ト大腸癌）に対する細胞増殖阻害活性を、ＭＴＴ法によ
り測定した。

【００３５】ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社
製）、１０％牛胎児血清からなる培地(以下培地Ａとい
う）で４.０×１０⁴個／ｍｌに調整した各種細胞を０．
１ｍｌずつ９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分
注した。該プレートを炭酸ガスインキュベーター内で３
７℃，２０時間培養後、これに培地Ａにより適宜希釈し
た検体（試験化合物）０．０２５ｍｌずつを加え、炭酸
ガスインキュベーター内で３７℃，７２時間培養した。
これにダルベッコＰＢＳ(−)（ニッスイ社製）にて５ｍ
ｇ／ｍｌに調製したＭＴＴ溶液を０．０１ｍｌずつ加
え、３７℃，３時間炭酸ガスインキュベーター内で培養
した。次いで、０．０１Ｎ塩酸／２０％ＳＤＳを０．０
５ｍｌずつ加えて生じた結晶を溶解後、マイクロプレー
トリーダーにより５７０ｎｍの吸光度を測定した。無処
理細胞と既知濃度の検体で処理した細胞の吸光度を比較
することにより、細胞の増殖を５０％阻害する検体濃度
(ＩＣ₅₀)を算出した。試験例１の結果を表２に示す。

【００３６】[試験例２]ＹＳＩ−４０−２のＫ５６２細
胞（ヒト慢性骨髄性白血病）に対する細胞増殖阻害活性
を、ＭＴＴ法により測定した。

【００３７】ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社
製）、１０％牛胎児血清からなる培地（以下培地Ａとい
う）で４.０×１０⁴個／ｍｌに調整した各種細胞を０．
１ｍｌずつ９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分
注した。これに培地Ａにより適宜希釈した検体（試験化
合物）０．０２５ｍｌずつを加え、炭酸ガスインキュベ
ーター内で３７℃，７２時間培養した。以下、試験例１
と同様にしてＭＴＴ法により細胞の増殖を５０％阻害す
る検体濃度（ＩＣ₅₀）を算出した。試験例２の結果を表
２に示す。

【００３８】表２の結果よりＹＳＩ−４０−２は比較的
微弱な細胞毒性を有していた。

【００３９】

【表２】

【００４０】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば抗真菌効果にすぐれ細胞毒性が比較的弱い新規
物質ＹＳＩ−４０−２の提供が可能になるという効果を
奏する。この抗生物質は通常の微生物培養法で生産する
ことができ、抽出、精製にも特別の方法を用いないので
工業的な大量生産が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小鹿一愛知県名古屋市千種区不老町（番地なし) 名古屋大学内 (72)発明者坂神洋次愛知県名古屋市千種区不老町（番地なし) 名古屋大学内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の化学構造を有する新規物質ＹＳＩ
−４０−２【化１】
【請求項２】請求項１記載のＹＳＩ−４０−２又はそ
の塩を有効成分とする抗真菌剤