JPH09503384A

JPH09503384A - Ｊａｋキナーゼおよびサイトカインシグナルトランスダクションの調節

Info

Publication number: JPH09503384A
Application number: JP7506048A
Authority: JP
Inventors: エヌ．イール，ジェイムズ; エー．ウィッターン，ブルース; ダブリュ．クウル，フレデリック; シルベノイネン，オリー
Original assignee: セントジュードチルドレンスリサーチホスピタル
Priority date: 1993-07-29
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1997-04-08
Also published as: CA2126523A1; JPH07107983A; US6969760B2; US20040205835A1; AU5265493A; AU7518294A; WO1995003701A1; CA2168098A1; US6210654B1; US5728536A; EP0712277A1

Abstract

(57)【要約】サイトカインに対する細胞の応答を伝達する少なくとも１つのＪａｋキナーゼ活性を阻害または増強することによって前記応答を調節する方法が提供される；また、本発明の方法において有用なＪａｋキナーゼ活性またはサイトカイン誘導Ｊａｋキナーゼ活性化のインヒビターを同定するアッセイが提供される；キナーゼ活性を妨害しないでＪａｋキナーゼに対して特異的な少なくとも１つのエピトープのペプチド断片に対して上昇させた抗体；Ｊａｋキナーゼのためのポリペプチド；およびそれをエンコードする核酸。

Description

【発明の詳細な説明】Ｊａｋキナーゼおよびサイトカインシグナルトランスダクションの調節発明の背景発明の分野本発明は、キナーゼのＪａｋファミリーおよびサイトカインのそれらのレセプターへの結合に対する細胞の応答におけるそれらの役割に関する。本発明は、さらに詳しくは、Ｊａｋキナーゼのファミリーの少なくとも１つのサイトカイン誘導活性化、特定のサイトカインとＪａｋキナーゼのファミリーの構成員(members )との間の相互作用の同定、およびこの相互作用に関する化合物、組成物および方法に関する。背景技術真核細胞の成長、分化および機能は、ここにおいて全体的にサイトカインと呼ぶ、細胞外因子により、大部分において調節される。これらのサイトカインは、それらのそれぞれのレセプターに結合することによって細胞の応答を誘導する。サイトカインレセプターは２つの主要なファミリー、すなわち、サイトカインレセプターのスーパーファミリーおよびチロシンキナーゼレセプターのスーパーファミリーに属する。チロシンキナーゼのスーパーファミリーに属するレセプターは、サイトカイン −レセプター結合シグナルのトランスダクションに関係する同定可能な細胞質チロシンキナーゼドメインの存在により特徴づけられる。このレセプターのファミリーの構成員はさらに３つの構造上のサブグループに分類される(Yarden ら、An n.Rev.Biochem.57.443-478(1988)。第１サブグループの構成員は、それらの細胞外ドメイン内に２つのシステインに富んだ領域をもつモノマーとして特徴づけられ、そして、例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）およびＴＧＦ−αのレセプターを包含する（参照、例えば、Ullrichla、Nature 309:418-425(1984)）。第２サブグループはヘテロテトラマーとして機能するとして特徴づけられ、そしてインスリンのレセプター(Ullrichら、前掲、(1985);Ebinaら、Cell 40:747-758(1985 ))およびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）（Ullrichら、EMBO J.5:2503 -2512(1986)）。第３サブグループの構成員は、保存された構造の存在および長い（７７〜１０７アミノ酸）の挿入配列による触媒ドメインの中断により特徴づけられる。この第３サブグループは、例えば、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ− Ｒ）（Yardenら、Nature 323:226-232(1986)）およびコロニー刺激成長因子（ＣＳＦ−１）(Sherrら、Cell 41:665-676(1985))を包含する。サイトカインレセプターのスーパーファミリーに属するレセプターは、細胞外ドメインにおける４つの位置的に保存されたシステインおよびＷＳＸＷＳ（配列番号：１）のモチーフの存在により特徴づけられる。このスーパーファミリーは、また、非常に限定された類似性を示しそしてシグナルのトランスダクションの機構を示すことができる同定可能なモチーフを含有しない、変動する大きさの細胞質ドメインにより特徴づけられる。サイトカインレセプターのスーパーファミリーの構成員は、造血成長因子のレセプター、成長ホルモンのレセプター、プロラクチンレセプター、毛様好中性因子などを包含する(Bazan、Science 257:410- 413(1992))。インターフェロンのレセプターは、いっそう関係が薄いが、このレセプターのスーパーファミリーに共通の祖先から発生したと考えられて来ている。触媒ドメインを欠失するにかかわらず、かなりの証拠はサイトカインレセプターのスーパーファミリーの構成員のシグナルのトランスダクションがチロシンリン酸化を含むことを示唆している(Miyajimaら、Annu.Rev.Immunol.10:295-331(1 992));Metcalf、Nature 339:27-30(1989))。また、このレセプターの配合の構成員がシグナルのトランスダクションのための共通のチロシンリン酸化経路を利用できるといういくつかの証拠が存在する。詳しくは、造血成長因子のそれらのレセプターへの結合はチロシンリン酸化の匹敵するパターンを誘導することが発見された(Ihle、Interleukins:Molecular Biology and Immunology、Kishimot o 編、Karger、Basel、pp.65-106(1992))。前述の両方のファミリーからのサイトカインレセプターは細胞の成長の調節において重要な役割を演ずることが広く理解されているが、これらのレセプターへのサイトカインの結合によりトリガーされる生化学的カスケードについてほとんど知られていない。これらのレセプターを通るサイトカインシグナルのトランスダクションに関係するステップの理解は、シグナルのトランスダクションにおいて重要な役割を演じそしてこれらのサイトカインの活性の調節のための標的として働くことができる分子を同定するために有用であろう。レセプターのシグナルのトランスダクションの研究のモデルがエリトロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）、造血成長因子のレセプターの１つおよびサイトカインレセプターのスーパーファミリーについて開発された。インターロイキン− ３（ＩＬ−３）依存性細胞系の中へのＥＰＯＲの導入は、ＥＰＯに対する応答して増殖する能力を細胞に付与する(D′Andrea ら、Cell 57:277-285(1989);Miura ら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991)）。トランスフェクションされた細胞において、ＥＰＯはｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｐｉｍ−１およびｅｇｒ−１を包含する１系列の直ぐ初期の遺伝子の発現を誘導する(Miuraら、Mol.Cell.Biol. 13:1788-1795(1993))。さらに、ＥＰＯは１系列の細胞基質の急速なチロシンリン酸化を誘導し（linnekin ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6237-6241(1992);D usanter-Fourtら、j.Biol.Chem.267:10670-10675(1992);QuelleおよびWojchowsk i、J.Biol.Chem.266:609-614(1991);Miura ら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(19 91);Yosimura およびLodish、Mol.Cell.Biol.12:706-715(1992);Damenら、Blood 80:1923-1932(1992)）、ＥＰＯＲがリガンドの結合をタンパク質チロシンキナーゼの活性化に結び付けることによって機能できることを示唆する。ＥＰＯ−ＥＰＯＲ結合に関連する生物学的活性のためのタンパク質チロシンリン酸化の重要性は明瞭に証明されたが、関係しうるキナーゼに関してほとんど知られていない。ＥＰＯＲのカルボキシル領域のチロシンリン酸化の急速な誘導(M iuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991);Yosimura およびLodish、Mol.Cell .Biol.12:706-715(1992);Dusanter-Fourt ら、J.Biol.Chem.267:10670-10675(19 92))は、レセプターが、構成的にまたはリガンドの結合後に、キナーゼに密接に関連することを示唆する。１つの研究(Yosimura およびLodish、Mol.Cell.Biol. 12:706-715(1992))は、レセプターと架橋することができそして抗ホスホチロシン抗体により検出される能力により評価して、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのキナーゼアッセイにおいてチロシンリン酸化される１３０ｋＤａの非グリコシル化タンパク質を同定した。１３０ｋＤａのタンパク質がキナーゼであるかどうかは検出することができなかった。最近の研究(Linnekin ら、Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89:6237-6241(1992))は、また、ＡＴＰのアジド誘導体で放射性標識化することができるチロシンリン酸化の９７ｋＤａの基質を同定し、それがキナーゼであることを示唆した。１３０ｋＤａまたは９７Ｋｄaの潜在的キナーゼが従来特徴づけらているかどうかは決定されなかった。また、サイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）に対する応答において、チロシンリン酸化が観察された。最近の研究(Shuaiら、Science 259:1808-1 812(1992))は、ＩＦＮγが９１ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化を誘導し、そしてこの９１ｋＤａのタンパク質が核に移動しそしてγ−活性化部位に結合することを証明した。チロシンリン酸化は、さらに、サイトカイン成長ホルモン（ＧＨ）に対する応答に関連づけられた。多数のタンパク質の急速なＧＨ依存性チロシンリン酸化、微小管結合タンパク質キナーゼのチロシンリン酸化、および微小管結合タンパク質キナーゼ活性の刺激、ならびに成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）結合チロシンキナーゼのインヒビターによるこれらの作用の阻害を示す３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞における研究(Campbell ら、J.Biol.Chem.268:7427-7434(1993))は、ＧＨによりシグナリングにおけるＧＨＲ結合チロシンキナーゼ活性のための中心的な役割を示唆する。さらに、ＧＨ処理線維芽から調製したＧＨレセプター（ＧＨＲ）との複合したチロシンキナーゼ活性の存在が報告された(Carter-Suら、J.Biol.C hem.264:18654-18661(1989);Stredら、Endocrinol.130.1626-1636(1992);Wangら、J.Biol.Chem.267:17390-17396(1992))。より最近、非レセプターのチロシンリン酸化１２２ｋｄのタンパク質はキナーゼ活性ＧＨ−ＧＨＲの調製において同定された(Wangら、J.Biol.Chem.268:3573-3579(1993))。シグナルのトランスダクションに関係しうるＩＬ−３依存性細胞の中で発現されるタンパク質チロシンキナーゼのスペクトルを同定するために、保存されたタンパク質チロシンキナーゼのドメインに対する変性オリゴヌクレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された(Wilks、Methods.Enzymol.200: 533-546(1991))。このアプローチおよびノザンブロット分析を使用して、ＩＬ− ３依存性細胞はｌｙｎ、Ｔｅｃ、ｃ−ｆｅｓ、Ｊａｋ１およびＪａｋ２を包含するある数のタンパク質チロシンキナーゼのための遺伝子を発現するすることが示された(Mano ら、Oncogene 8:417-424(1993))。これらのチロシンキナーゼ、または他のまだ同定されていないチロシンキナーゼ、がサイトカインのシグナルのトランスダクションに関係するかどうかはほとんど未知である。シグナルのトランスダクションにおけるｌｙｎキナーゼの潜在的関係は、ＩＬ −３の刺激が免疫沈降におけるｌｙｎキナーゼ活性を増加したことを示した最近の研究により示された(Torigoeら、Blood 80:617-624(1992))。ＩＬ−３依存性細胞の中で発現された他のチロシンキナーゼの２つ、Ｊａｋ１およびＪａｋ２、は、キナーゼのＪａｋファミリーに属する。キナーゼのＪａｋ（Ｊａｎｕｓキナーゼ；また、また、適当な他のキナーゼ（ｊｕｓｔａｎｏｔｈｅｒｋｉｎａｓｅ）と呼ぶ）ファミリーは、造血細胞におけるチロシンキナーゼドメインのＰＣＲ増幅において最初に検出された(Wilks、Proc.Natl.Acad.S ci.USA 86:1603-1607(1989))。これらの研究は２つの密接に関係する遺伝子（ＦＤ１７およびＦＤ２２；後にＪａｋ２およびＪａｋ１と呼ぶ）を同定し、これらから主要なＰＣＲ増幅生成物が誘導された。ヒトＪａｋ１遺伝子の完全な構造が報告され(Wiks ら、Mol.Cell.Biol.11:2057-2065(1991))そして、最近、ネズミＪａｋ２遺伝子の部分的配列が発表された(Harpur ら、Oncogene 7:1347-1353(1 992))。ｃ−fｍｓ遺伝子からのチロシンキナーゼドメインのプローブでｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、ファミリーの第３構成員（Ｔｙｋ２）が独立に同定された(Firmbach-Kraft ら、Oncogene 5:1329-1336(1990) )。このファミリーは２つのキナーゼドメインの存在により特徴づけられ、それらの１つはタンパク質キナーゼのすべての特質を有するカルボキシルドメインである。第２ドメインはアミノ末端にすぐ接して存在し、そしてタンパク質キナーゼのすべての特質を有するが、タンパク質およびセリン／スレオニンキナーゼの両方から有意に異なる。キナーゼドメインに対してアミノ末端に、非レセプターのチロシンキナーゼの大部分を特徴づけるＳＨ２およびＳＨ３は存在しない。しかしながら、Ｊａｋファミリーの構成員の間に広範な類似性が存在し、そしてある数の相同性のドメインが定められた(Harpur ら、Oncogene 7:1347-1353(1992) )。キナーゼのＪａｋファミリーの１つの構成員とインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）のシグナルのトランスダクションとの間の連鎖が最近報告された(Velaz quezら、Cell 70:313-322(1992);Fu、Cell 70:323-335(1992);Schindler ら、Sc ience 257:809-813(1992))。遺伝のアプローチを使用して、ＩＦＮαに対して非応答性である突然変異のヒト細胞系におけるＩＦＮαに対する細胞の応答を機能的に再構成する能力により、Ｔｙｋ２遺伝子はクローニングされた。Ｔｙｋ２、またはＪａｋキナーゼのファミリーの他の構成員と、ＩＦＮα以外のサイトカインのシグナルのトランスダクションとの間の他の関連は報告されていない。毛様好中性因子（ＣＮＴＦ）は、その名前が意味するように、ｉｎｖｉｔｒｏで胚のニワトリ毛様体神経節ニューロンの生存に特別に要求されるタンパク質である(Manthorpeら、J.Neurochem.34:69-75(1980))。ＣＮＴＦは、Ｓｅｎｄｔｎｅｒらによる１９９０年９月１４日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５２４１号（引用によって加える）に記載されているように、真核ならびに細菌の発現系においてクローニングおよび合成された。過去１０年にわたって、毛様体神経節ニューロンの生存を支持する能力に加えて、ある数の生物学的作用がＣＮＴＦに帰属された。ＣＮＴＦは周産期ラットの視神経および脳における両能性グリア始原細胞の分化を誘導すると信じられる(H ughes ら、Nature 335：70-73(1988))。さらに、それは胚性ニワトリ背根神経節感覚ニューロンの生存を促進することが観察された(ShkaperおよびVaron、Brain Res.389:39-46(1986))。ＣＮＴＦのいくつかの新規な活性が、また、発見され、このような活性は運動ニューロンおよび海馬ニューロンの生存および分化を支持し、そして海馬星状細胞の増殖速度を増加するその能力を包含する（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５２４１号、前掲）。ＣＮＴＦレセプター（ＣＮＴＦＲまたはＣＮＴＦＲα）は、１９９１年６月３日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３８９６号（その全体を引用によって加える）に記載されているように、真核細胞においてクローニングおよび発現された。ＣＮＴＦＲの配列は、細胞外ドメイン、疎水性トランスメンブレンドメイン、および細胞質ドメインを含有する大部分のレセプターと異なり、ＣＮＴＦＲは細胞質ドメインを有するように思われない。さらに、トランスメンブレンの疎水性ドメインはタンパク質分解的にプロセシングされ、ＣＮＴＦＲの成熟形態は、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連鎖（Ｉｄ．）と呼ぶ、普通でない連鎖により細胞表面に定着されるようになる。ＧＰＩ連鎖タンパク質、例えば、ＣＮＴＦＲは、酵素のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣにより、ＧＰＩアンカーの切断を通して細胞表面から解放されることができる。他の既知のレセプター配列のうちで、ＣＮＴＦＲは、ＩＬ−６、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を包含する、ここにおいてＣＮＴＦ／ＩＬ− ６／ＬＩＦレセプターのファミリーと呼ぶ、ある数のレセプターに関係づけられる(Bazan、Neuron 7:197-208(1991);Rose およびBruce、Proc.Natl.Acad.Sci.88 :8641-8645(1991))が、ＩＬ−６のレセプターの配列に最も密接に関係づけられる。しかしながら、ＩＬ−６はＧＰＩ連鎖タンパク質であると示されなかった（例えば、Tagaら、Cell 51:573-581(1989));Hibi ら、Cell 63:1149-1157(1989) ）。ＣＮＴＦレセプター（ＣＮＴＦＲ）のクローニング、配列決定および発現は、ＣＮＴＦＲおよびＣＮＴＦが膜結合した、シグナル・トランスデューシング成分と相互作用する複合体であるうるという発見に導き、従って可溶性ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲレセプターの複合体の治療作用を示唆した。ＣＮＴＦの高いアフィニティー結合および細胞の引き続く機能的応答に関係する１つのこのようなシグナル・トランスデューシング化合物は、レセプターのＩＬ−６、ＯＳＭ、ＬＩＦファミリーに共通のｇｐ１３０、β成分として同定された(Fukunaga ら、EMBO J.10:2855-2865(1991);Gearing ら、EMBO J.10:2839-284 8(1991);Gearing ら、Science 255:1434-1437(1992);Ipら、Cell 69:1121-1132( 1991))。ＬＩＦ（ＬＩＦＲβ）に対する応答する結合およびシグナルのトランスダクションに関係するとして同定された他のβ成分は、ＣＮＴＦに対する応答に必要なβ成分と同一であるか、またはそれに類似するように思われる。（ＣＮＴＦの結合およびシグナルのトランスダクションに必要なβ成分の同定の結果として、本来ＣＮＴＦＲと一般に命名されたものが現在ＣＮＴＦＲαと呼ばれている）。ＩＬ−６は広範な種類の細胞に作用し、時には細胞の分化を伴う、成長促進および阻害および特定の遺伝子の発現を発揮する、多面作用性サイトカインである；それは炎症、自己免疫性およびリンパ性悪性疾患を包含するいくつかの疾患に関係するとして結び付けられた(Kishimotoら、Science 258:593(1992))。ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＯＳＭは、独特の成長調節活性を有するにかかわらず、造血の間にならびに他のプロセスにおいていくつかの共通の作用を共有する、すべての広く作用する因子する。例えば、すべては増殖を阻害し、そしてネズミ骨髄性白血病細胞系、Ｍ１の分化を誘導する(Rose およびBruce、Proc.Natl.Acad.Sci. 88:8641-8645(1991))。ＬＩＦおよびＯＳＭは、ＣＮＴＦにより誘導された応答と区別できない、ニューロン細胞におけるチロシンリン酸化および遺伝子の活性化を誘導した(Ip ら、Cell 69:1121-1132(1992))。ＣＮＴＦの結合およびレセプターの活性化を取り囲む事象は最近明らかにされた(Davisら、Science 253:59-63(1991);Ipら、Cell 69:1121-1132(1992);Stahl ら、Cell 74:587-590(1993);Davis ら、Science 260:1805-1018(1993))、細胞の内側でシグナルのトランスダクションが開始される機構はよく理解されていない。拡張されたサイトカインファミリー−これはインターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＧＨ、およびインターフェロンを包含する（(Bazan、J.F.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6934-6938(1990);Baza n.J.F.、Neuron 7:197-208(1991)）−の他の関係が薄いレセプターに似て、ＣＮＴＦレセプターβサブユニットｇｐ１３０およびＬＩＦＲβはそれらの細胞質領域の中にタンパク質チロシンキナーゼのドメインをもたない(Hibi ら、Cell 63:1149-115(1990);Gearingら、EMBO J.10:2839-2848(1991))。これにかかわらず、βサブユニットのＣＮＴＦ誘導の二量体化はＣＬＩＰｓと呼ぶチロシンリン酸化タンパク質の急速な蓄積を多少生ずる(Ip ら、Cell 69:1121-1132(1992))。前述したように、いっそう顕著なＣＬＩＰｓの２つはβサブユニットそれら自体として同定されたが、他の大部分をなお特徴づけられなくてはならない。１または２以上の細胞質チロシンキナーゼの活性化はＣＮＴＦ作用のために必須であるように思われる。なぜなら、チロシンリン酸化をブロックするインヒビターは、また、引き続く下流の事象、例えば、遺伝子の誘導をブロックする(Ip ら、Ce ll 69:1121-1132(1992))。因子のＣＮＴＦファミリーにより活性化された１または２以上の細胞質チロシンキナーゼの同一性に対する可能な手掛かりは、他の関係が薄いサイトカインがキナーゼのＪａｋ／Ｔｙｋファミリーの活性化を生ずるという発見から得られた (Firmbach-Kraft ら、Oncogene 5:1329-1336(1990);Wilksら、Mo1.Cell.Biol.11 :2057-2065(1991);Harpur ら、Oncogene 7:1347-1353(1992))。非レセプターの細胞質タンパク質チロシンキナーゼのこのファミリーは、３つの既知の構成員− Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＴｙｋ２から成るーこれらはすべて等しく互いに関係しそして２つの潜在的キナーゼドメインを有するが、Ｓｒｃ相同体２（ＳＨ２）ドメインをもたないという特徴を共有する。ＩＦＮａに対して応答しない細胞系における遺伝的欠陥の相補性を包含するエレガントな研究は、ＩＦＮαのシグナリングカスケードの要求される成分としてＴｙｋ２の同定を生じた((Velasque zら、Cell 70:313-322(1992))。より最近、サイトカインのレセプター、例えば、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧＨは、Ｊａｋ２と連合しそしてそれを活性化することが示された(Argetsingerら、Cell 74:237-244(1993);Silvennoinenら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993、印刷中);Witthuhnら、Cell 74:227-236(1993)) 。キナーゼはレセプターの膜の近位の細胞質領域に結合することが示され、そしてＪａｋ２の結合を妨害するこの領域の突然変異は、また、ＥＰＯ誘導増殖を喪失させ、Ｊａｋ２はＥＰＯのシグナリングにおいて重要な役割を演ずることを示唆する。Ｊａｋ１はこれらのレセプター系のいずれによっても有意に活性化されることは報告されてきていない。ＣＮＴＦとレセプターの成分を共有する造血因子の同定は、ＣＮＴＦおよびこのような造血因子に対して通常応答性であるターゲッテッド細胞の活性化に対して特異的なそのレセプター成分の利用を可能とするであろう。ここにおける文献に引用は、このような文献が関係する先行技術であるか、またはこの出願の請求の範囲の特許性に対して考慮した材料であるという容認を意図しない。文献の内容または日付に関する記述は提出時における出願人に入手可能な情報に基づき、そしてこのような記述の正確さに関する容認を構成しない。発明の要約本発明は、一部分、いくつかのサイトカイン、特にサイトカインレセプターのスーパーファミリーの構成員に結合することによって機能するサイトカイン、に対する細胞の応答が、Ｊａｋキナーゼのファミリーの構成員の活性化（すなわち、リン酸化）により伝達されるという発見に基づく。本発明によれば、Ｊａｋキナーゼはサイトカイン−レセプターの結合に応答してそれらのチロシンリン酸化（すなわち、活性化）を通してサイトカイン活性を伝達である。本発明は、また、Ｊａｋキナーゼの活性化によりその活性が伝達されるサイトカインを調節する方法に関する。本発明は、少なくとも１つのＪａｋキナーゼ活性の活性化によりその活性が伝達されるサイトカインに対する細胞の応答を阻害する方法を提供する。本発明は、また、Ｊａｋキナーゼの活性化によりその活性が伝達されるサイトカインに対する過度の応答により引き起こされる疾患、例えば、サイトカイン誘導の過度の真核細胞増殖を治療する方法を提供する。本発明は、また、Ｊａｋキナーゼの活性化によりその活性が伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害できる組成物を同定する方法を提供する。本発明は、また、Ｊａｋキナーゼ活性の活性化によりその活性が伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を増強する方法を提供する。本発明は、さらに、特定のＪａｋタンパク質を、そのキナーゼ活性を妨害しないで、検出および抽出するために有用である抗体を提供する。また、その活性が少なくとも１つのＪａｋキナーゼにより伝達される特定のサイトカインが提供される。本発明は、また、ここに記載するような、特定のＪａｋキナーゼの完全なＤＮＡおよびアミノ酸配列の解明に基づく。従って、本発明は、また、Ｊａｋキナーゼのためのオリゴヌクレオチドのプローブの配列、およびＪａｋキナーゼをコードする遺伝子配列、Ｊａｋキナーゼの一部分または全長の配列を発現できる遺伝子配列を含有する発現媒体、およびそれで形質転換された宿主を提供する。本発明の他の実用性、特徴、態様および方法は、本発明に関する下記の詳細な説明および非限定的実施例から当業者にとって明らかであろう。図面の簡単な説明第１Ａ図〜第１Ｃ図Ｊａｋ２のオープンリーディングフレームおよびフランキング非コーディング領域のヌクレオチド配列が示されている（配列番号：８）。単一文字のアミノ酸配列は下に示されている（配列番号：９）。発表されたＪａｋ２ｃＤＮＡ配列(H arpur ら、Oncogene 7:1347-1353(1992))からのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の情報は、情報が異なる場合、配列の上および下に示されている。ＡＴＧコドンは示されている（＊）。ヌクレオチド位置５２２の上の矢印（＞）は、報告されたＪａｋ２配列の５’末端を表示する。ヌクレオチド位置２２２６における矢印（∧）は、従来の研究(Harpur、前掲(1992))において検出された、７アミノ酸のインサートの位置を示す。３’非コーディング領域における括弧の中のヌクレオチドは従来の研究(Harpur、前掲(1992))において存在したが、われわれの研究において検出されなかった。第２Ａ図〜第２Ｅ図ヒトＪａｋ１キナーゼについての発表されたアミノ酸（配列番号：１１）およびＤＮＡコーディング配列（配列番号：１０）が示されている(Wilkaら、Mol.Ce ll.Biol.11:2057-2065(1991))。ヌクレオチドの番号は発表された配列から保持されており、コーディング配列はヌクレオチド７６で開始しそしてヌクレオチド３５０４で終わる。第３Ａ図〜第３Ｅ図ヒトＴｙｋ２キナーゼについての発表されたアミノ酸（配列番号：１３）およびＤＮＡコーディング配列（配列番号：１２）が示されている(Firmbach-Kraft ら、Oncogene 5:1329-1336(1990))。ヌクレオチドの番号は発表された配列から保持されており、コーディング配列はヌクレオチド３０７で開始しそしてヌクレオチド３８６７で終わる。第４図ＤＡ−３細胞を成長因子から取り出し、そして材料および方法に記載するようにＩＬ−３で刺激しない（−）か、または刺激した（＋）。次いで、細胞抽出物を、競合ペプチド（αＪａｋ２）の不存在または抗血清をそれに対してレイズさせたペプチド（３０μｇ／ｍｌ）（αＪａｋ２＋Ｊａｋ２ペプチド）の存在またはＪａｋ１の匹敵する領域に相当するペプチド（αＪａｋ２＋Ｊａｋ１ペプチド）の同等の量の存在において、正常のウサギ血清（ＮＲＳ）またはＪａｋキナーゼに対して特異的な抗ペプチド抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物は、材料および方法（実施例１）に記載するようにｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイのために使用した。反応の生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、そしてオートラジオグラフィーにより検出した（上部のパネル）。ブロットを引き続いてＪａｋ２に対する抗血清でプロービングした（下部のパネル）。第５Ａ図〜第５Ｄ図Ｊａｋ１（ライン１；配列番号：１４））、Ｔｙｋ２（ライン２；配列番号：１３）、およびＪａｋ２（ライン３；配列番号：９））のアミノ酸配列、ならびにインテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）コンピュータープログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用して発生したコンセンサス配列の整列を示す（複数＝２．００；限界＝１．００；平均重量＝１．００；平均合致＝０．５４；平均ミスマッチ＝−０．４）。第６図Ｊａｋファミリーのキナーゼのアミノ酸配列の比較。ネズミＪａｋ１の（O．S ilvennoinen、J.H.Ihle、未発表のデータ）、ネズミＪａｋ２(Silvennoinen、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8429-8433(1993))およびヒトＴｙｋ２(Firmbach-Kraf t ら、Oncogene 5:1329-1336(1990))アミノ酸配列をネズミＪａｋ３配列と比較する。整列は最初にインテリジェネティクスのプログラムを使用するコンピューター分析により作り、そして引き続いて検査により整列させた。ギャップを導入して整列を最適化した。コンセンサスの整列は、配列の３または４が同一のアミノ酸を有する位置を示す。縮重キナーゼドメインのプライマーおよび一次乳癌組織からのｃＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅を、従来記載されているように、使用して新規なキナーゼ同定した(Canceら、Int.J.Cancer 54:571-577(1993))。ＰＣＲ断片（ＴＫ５）を使用してマウス前Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリー(Schatzら、Cel l 59:1035-1048(1989))を標準の技術によりスクリーニングした。４つのｃＤＮＡクローンが得られ、それらの１つはノザンブロットにより検出された転写体の大きさに近かった。ジデオキシヌクレオチド、鎖終結配列決定(Sanger ら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467(1977))により、ヌクレオチド配列を両方の方向において決定した。第７Ａ図〜第７Ｂ図Ｊａｋファミリーの構成員のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳および抗血清の特性決定。第７Ａ図：ネズミＪａｋ１、Ｊａｋ２およびＪａｋ３およびヒトＴｙｋ２をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウイスコンシン州ミルウォーキー）ＴＮＴＴ３連結網状赤血球系を利用してｉｎｖｉｔｒｏで転写および翻訳し、そして従来記載されているように（³⁵Ｓ）メチオニンで標識化した(Silvennoinen ら、proc.Nat l.Acad.Sci.USA 90:8429-8433(1933))。反応生成物を引き続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてタンパク質をオートラジオグラフィーにより検出した。第７Ｂ図：Ｊａｋに対する抗血清の特性決定。前免疫血清（レーン１）、Ｊａｋ３に対する抗ペプチド抗血清（レーン２）、抗血清をレイズさせた過剰のペプチド（１００μｇ／ｍｌ）の存在におけるＪａｋ３に対する抗血清（レーン３）または無関係のペプチド（レーン４）とのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳反応からの（³⁵Ｓ）標識化Ｊａｋ３タンパク質。抗ペプチド抗血清は、従来記載された技術(Silve nnoinen ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8429-8433(1993))によりＪａｋ３のキナーゼドメインの領域から誘導されたペプチドＡＫＬＬＰＬＤＫＤＹＹＶＶＲＥＰＧ（配列番号：１５）に対してレイズさせた。交差反応性抗ペプチド抗血清をＴｙｋ２からの合成ペプチド（ＳＰＳＥＫＥＨＦＹＱＡＱＨＲＬＰＥＰＳ（配列番号：７）から誘導された合成ペプチドに対して作った。第８図ネズミ細胞系におけるＪａｋ３の発現。ＲＮＡを前述の技術１により示した細胞から調製した。全体のＲＮＡのほぼ１５μｇを電気泳動により分離し、そしてハイブリダイゼーションのためにフィルターにブロットした。ＲＮＡは次のものを包含した：（レーン１）ＩＬ−３依存性骨髄細胞系（ＤＡ３）；（レーン２）ＩＬ−３依存性骨髄細胞系、３２Ｄ（Ｅｐｏ１）、これは内因性ＥＰＯレセプターを発現しそしてＥＰＯに応答して分化した機能を発現する(Migliaccio ら、J. Cell Biol.109:833-841(1989))；（レーン３）ＩＬ−３依存性骨髄細胞系、３２Ｄｃ１３、これはＧ−ＣＳＦに応答して顆粒球の経路に沿って分化することができる(Migliaccio ら、J.Cell Biol.109:833-841(1989))；（レーン４）野生ＭＶＥＰＯレセプターでトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３線維芽；および（レーン５）ＥＰＯレセプターで安定にトランスフェクションされたＩＬ−２依存性細胞障害性Ｔ細胞系、ＣＴＬＬｐｏＲ。ＲＮＡ標準の移動位置が示されている。単一のＪａｋ３転写体は４．０ｋｂの見掛けの大きさで移動する。ＲＮＡ試料は細胞から標準の手順により得られた。ＲＮＡ試料を２．２Ｍのホルムアルデヒド−１％アガロースゲル上で電気泳動させ、そしてゼータ結合（ＮＥＮ）膜に移した。プローブは、ランダムプライミングにより標識化された、ＣＤＮＡの１ｋｂのＳｓｔＩ断片から成っていた。フィルターを６５℃において７５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％のフィコール、１％のポリビニルピロリドン、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡの中にハイブリダイゼーションさせた。フィルターを６５℃において１５ｍＭのＮａＣｌの最終のストリンジェンシイに洗浄し、そして１４時間露出した。第９Ａ図〜第９Ｄ図Ｊａｋ１およびＪａｋ３のチロシンリン酸化のＩＬ−２およびＩＬ−４の活性化およびＪａｋ３のｉｎｖｉｖｏキナーゼ活性の活性化。第９Ａ図：ＣＴＬＬ細胞から１４時間の間成長因子を除去し、そしてＣＴＬＬ細胞を剌激しないで放置し（レーン１、４、７および１０）、１００Ｕ／ｍｌでＩＬ−２（セツス［Ｃｅｔｕｓ］）により１０分間刺激する（レーン２、５、８および１１）か、または１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）で１０分間刺激した（レーン３、６、９および１２）。抽出物を従来記載されているように調製し(Witthuhn ら、 Cell:227-236(1993))そして示した抗血清を使用する免疫沈降のために使用した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移し、そして膜をホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体（ＵＢ１）でプロービングした。第９Ｂ図：ＣＴＬＬ細胞から成長因子を１４時間の間除去し、そして上のようにＣＴＬＬ細胞を刺激せず（レーン１）、ＩＬ−２で刺激し（レーン２）またはＩＬ−４で刺激した（レーン３）。抽出物を調製しそしてＴｙｋ２に対するＪａｋ３／Ｊａｋ１交差反応性抗ペプチド抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物を従来記載されているように（Witthuhnら、Cell:227-236(1 993)）ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて使用し、そして生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより可視化した。第９Ｃ図：ヒトＩＬ−２βレセプター鎖（３２Ｄ／ＩＬ２Ｒβ）でトランスフェクションされた３２Ｄｃ１３細胞からＩＬ−２を１４時間の間除去し、そしてこれらの細胞を刺激しない（レーン１および４）か、または１００Ｕ／ｍｌのＩＬ− ２（レーン２および５）または１０Ｕ／ｍｌの１１−３および６で刺激した）。上のように抽出物を作り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてフィルターに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングした。第９Ｄ図：ＥＰＯレセプターでトランスフェクションされたＣＴＬＬ細胞からＩＬ−２を１４時間の間除去し、そしてこれらの細胞を刺激しないで放置する（レーン１および５）か、または１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（レーン２および６）、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４）または１０Ｕ／ｍｌのＥＰＯ（レーン４および７）で刺激した。上のように抽出物を調製しそしてブロットを作り、そしてホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングした。標準の移動位置を左に示す。細胞を収獲し、そして従来記載されているように(Witthuhn ら、Cell:227-236(1993))抽出物を０．１％のトリトン中で調製した。２×１０⁷細胞からの細胞抽出物を表示した抗血清を使用する免疫沈降のために使用し、そして複合体をプロテインＡセファローズ（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）で集めた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そして電気泳動的にニトロセルロースのフィルターに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体（アプステイト・バイオロジカルス・インコーポレーテッド［ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｎｃ．］）でプロービングした。増強化学発光、ＥＣＬ（アマーシャム［Ａｍｅｒｓｈａｍ］）およびフィルムへの露出により、検出を実施した。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイのための条件は従来記載されている通りである(Witthuhn ら、Cell:227-236(1993)) 。第１０図ＣＮＴＦレセプター複合体との１３０ｋＤａのタンパク質およびチロシンキナーゼ活性の共精製。ＥＷ−１細胞を示した因子で刺激し、次いで細胞をＢｒｉｊ９６洗浄剤の中で溶解し、そして抗ＬＩＦＲｂで免疫沈降させた。左のパネルにおける試料を抗ホスホチロシンで免疫沈降させたが、右のパネルにおける試料は実験の節に記載するようにｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性について試験した。第１１Ａ図〜第１１Ｂ図Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＴｙｋ２は因子のＣＮＴＦファミリーに応答してチロシンリン酸化されるようになった。ＥＷ−１（パネルＡおよびＢ）、Ｕ２６６（パネルＣ）、またはＳＫ−ＭＥＳ（パネルＤ）を示した因子で刺激し、ＬＩＦＲβ、Ｊａｋ１（Ｊ１）、Ｊａｋ２（Ｊ２）、またはＴｙｋ２（Ｔ２）に対する抗血清で免疫沈降させ、次いで抗ホスホチロシンでイムノブロットした。第１２図ＬＩＦＲβはＪａｋ１およびＪａｋ２に因子の不存在において結合する。ＣＯＳ細胞をＪａｋ１またはＪａｋ２をエンコードするプラスミドと、エピトープ標識化ＬＩＦＲβ−ｍｙｃ３（ＬＩＦＲ）または細胞質ドメインの７４アミノ酸および引き続くトリプル−ｍｙｃ標識（ＬＩＦＲ７４）のみをエンコードするＬＩＦＲβの切形バージョンをエンコードするプラスミドと一緒に共トランスフェクションさせた。抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０で免疫沈降させた後、試料をＪａｋ１（上部のパネル）またはＪａｋ２（下のパネル）に対する抗血清でイムノブロットした。下部のパネルにおける矢印は、顕著な非特異的バックグラウンドよりより多いゆっくり移動するＪａｋ２の結合を示す。第１３Ａ図〜第１３Ｄ図ｇｐ１３０とのＪａｋ１またはＪａｋ２の共発現は、ｇｐ１３０のＩＬ−６依存性チロシンリン酸化を増強する。ＣＯＳ細胞を０．５ｍｇのＪａｋ１またはＪａｋ２エンコーディングプラスミドならびに１０ｍｇのｇ１３０ＦＬＡＧエンコーディングプラスミドと共トランスフェクションさせ、次いで示すように４８時間後ＩＬ６＋ｓＩＬ６Ｒαで刺激した。細胞リゼイトを抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ＩＢＩ）で免疫沈降させ、そして抗ホスホチロシンでイムノブロットした。発明の詳細な説明本発明は、一部分、サイトカインに対する細胞の応答を調節する新規な方法に関する。これらの方法は、サイトカインに対して応答する細胞におけるキナーゼのＪａｋファミリーの一般的役割に基づく。「サイトカイン」とは、他の細胞の機能、例えば、生存、有糸分裂、分化または代謝に影響を与える細胞により分泌されたポリペプチドを意味する。サイトカインの例は、ペプチド、ホルモンおよび成長因子を包含するが、これらに限定されない。「サイトカインに対する細胞の応答」または「サイトカイン活性」は、特定のサイトカインとその細胞のレセプターとの連合から究極的に生ずる真核細胞または細胞集団への一般的作用を意味し、そして典型的には細胞内の遺伝子の発現の変更を包含する。本発明は、Ｊａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカイン活性に関する。このような活性の例は、インターロイキン−３（ＩＬ−３）に応答する造血性始原細胞の増殖および分化、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）に応答する赤血球系列細胞の増殖および分化、成長ホルモン（ＧＨ）に応答する幹細胞の成長、およびこの分野において知られている、および／またはここにおいて教示される他の同様な応答を包含するが、これらに限定されない。本発明により教示される方法は、その活性がＪａｋキナーゼの構成員により伝達される任意のサイトカインに適用され、そしてＪａｋキナーゼのファミリーはＪａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３およびＴｙｋ２を包含するが、これらに限定されない。この型のサイトカインは、サイトカインレセプターのスーパーファミリーの構成員に結合することによって機能するもの、およびまた、チロシンキナーゼレセプターのスーパーファミリーの構成員に結合することによって機能するものを包含する。さらに詳しくは、これらのサイトカインは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ− ４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球−マクロファージ特異的コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、プロラクチンホルモンおよび成長ホルモンから成る群より選択される少なくとも１つを包含するが、これらに限定されない。本発明によれば、Ｊａｋキナーゼはサイトカイン−レセプターの結合に応答するそれらのチロシンリン酸化（すなわち、活性化）を通してサイトカイン活性を伝達する。従って、本発明により提供される調節方法に対して感受性のサイトカインは、Ｊａｋキナーゼのファミリーの１または２以上の構成員のチロシンリン酸化（すなわち、活性化）を引き起こすそれらの能力に基づいて同定することができる。サイトカインの刺激後の細胞の中のＪａｋキナーゼのチロシンリン酸化は、例えば、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体に結合するその能力についてアッセイすることによって、検出することができる；チロシンリン酸化されたＪａｋキナーゼのみがこの型の抗体に結合するであろう。Ｊａｋキナーゼのペプチド（ＪＫＰ）。Ｊａｋキナーゼのペプチド（ＪＫＰ）は、本発明によれば、Ｊａｋキナーゼ（ＪＫ）活性を有するＪＫのサブセットと呼ぶことができる。本発明によるペプチド断片は、無傷の分子またはその断片のタンパク質分解の消化により、この分野においてよく知られている化学的ペプチドの合成法により、いっそう詳細に後述する組換えＤＮＡ法により、および／またはＪＫＰを生産できる任意の他の方法により、調製することができ、そしてＪＫの活性部分に類似するコンフォメーションを有しそして、スクリーニングアッセイとして、例えば、ここに記載するように、既知のＪａｋ活性に従い、Ｊａｋキナーゼ活性を有する。活性を有するために最小のペプチド配列は、特定の領域、コンセンサス配列、またはＪａｋキナーゼ活性、例えば、少なくとも１つのサイトカインにより少なくとも１つのチロシンにおいてリン酸化される能力、を有するＪＫのその反復単位を含有するか、または含んでなる最小の単位に基づく。従って、本発明のＪＫＰは、また、既知のＪａｋキナーゼまたはＪＫのグループの少なくとも１つの１５〜４００アミノ酸断片および／またはコンセンサス配列に実質的に相当するＪＫアミノ酸配列の一部分を有するポリペプチドを包含し、ここでＪＫＰは少なくとも８０％、例えば、８０〜９９％の相同性、またはその中の任意の範囲または値の相同性を有すると同時にＪａｋキナーゼの生物学的活性維持し、ここで本発明のＪＫＰは天然に存在しないか、または天然に存在するが、天然に存在しない精製または単離された形態である。好ましくは、本発明のＪＫＰは特定のＪａｋキナーゼ、またはＪａｋキナーゼのグループのＪａｋキナーゼドメインに、コンセンサス配列、例えば、Ｊａｋ１とＪａｋ２との間、として、実質的に相当する。相同性の百分率は、例えば、ウィスコンシン・ジェネティクス・コンピューター・グループの大学[University of Wisconsin Genetics Computer Group])（UW GCG）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０、を使用して配列の情報を比較することによって、決定することができる。ＧＡＰプログラムは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン(Waterman)(Adv.Appl. Math.2:482(1981)により改定された、ニードルマン(Needleman)およびウンシュ( Wunsch)(J.Mol.Biol.48:443(1970)の整列方法を利用する。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似する整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数／２つの配列のうちのより短い配列の中の記号の合計の数として、類似性を定める。ＧＡＰプログラムについて好ましい欠乏のプログラムは、次のものを包含する：（１）単項比較マトリックス（同一性について１および非同一性について０の値）およびＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ、Nucl.Acids Res.14:6745(1986)の重み付き比較マトリックス、Shwartz およびDayhoff、編、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE、National Biomedical Research Foundation、pp.353-358(1979)に記載されている；（２）各ギャップについて３．０のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号について追加の０．１０ペナルティー；および各ギャップについてペナルティーなし。好ましい態様において、本発明のペプチドは第６図の配列の活性部分に相当する。ＪＫの活性部分の基本的構造を有する少なくとも約５〜３３５アミノ酸（またはその中の任意の範囲または値）のペプチドは、１つの態様において、上のＪＫ配列に対して８０〜９９％の相同性（またはその中の任意の範囲または値）を有するとして特徴づけらることができ、前記ペプチドはＪＫ活性を有し、そして本発明の範囲内に入ると考えられる。従って、当業者は、この明細書の中に提供された教示および案内が与えられると、ＪＫの他の位置において他のアミノ酸残基を置換して、置換された、欠失のまたは挿入の変異型を包含する、他のＪＫＰを得る方法を知るであろう。本発明のＪＫＰは、また、ポリペプチドの中の少なくとも１つのアミノ酸残基が少なくとも１つの異なるアミノ酸により同類置換され、挿入されるか、または欠失された変異型を包含する。本発明のＪＫＰのアミノ酸または核酸の配列は、両方の分子の中のアミノ酸または核酸の配列が、ＪＫ活性を有する少なくとも１つのＪＫの対応する断片に、定性的または定量的に、実質的に類似する生物学的活性を有するポリペプチドを提供する場合、それぞれ他のアミノ酸または核酸の配列に「実質的に相当する」 (substantially correspond)と言われる。このような「実質的に相当する」ＪＫＰ配列は、同類のアミノ酸またはヌクレオチドの置換、または個々のアミノ酸またはヌクレオチドの置換がこの分野においてよく知られている縮重ヌクレオチドコドンの置換を包含する。従って、本発明のＪＫＰ、またはそれをコードする核酸は、不都合な実験を行わないで、ここにおいて提供された教示および案内に基づいて、当業者が日常的に得るすることができる置換のペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的に相当する配列の有限の組を包含する。タンパク質の化学および構造の詳細な説明については、下記の文献を参照されたい：Schulz、G.E.ら、Principles of Prot ein Structure、Springer-Verlag、ニューヨーク、1978、およびCreighton、T.E .、Proteins:Structure and Molecular Properties、W.H,Freeman & Co．、サンフランシスコ、1983、これらをここに引用によって加える。ヌクレオチド配列の置換、例えば、コドンの採択、の提案について、下記の文献を参照されたい： Ausubel ら、編、Crent Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc.、ニューヨーク州、ニューヨーク（1987、1988、1989、1990、1991、1992 、1993、1994）、§§A.1.1-A.1.24、およびSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)、付録C およびD 。ＪＫＰについての天然のＪＫのアミノ酸の置換。本発明の同類置換は、ポリペプチドの中の少なくとも１つのアミノ酸残基が少なくとも１つの異なるアミノ酸により同類的に置換、挿入または欠失されている変異型を包含する。このような置換は好ましくは表１に提示されているような下記の列挙に従ってなされ、これらの置換は、合成したポリペプチド分子の修飾された構造的および機能的性質を提供すると同時に、既知のＪＫ活性のアッセイにより決定して、ＪＫの生物学的活性を維持するように日常実験により決定することができる。本発明の関係において、ＪＫＰまたは「に実質的に相当する」という用語はこのような置換を包含する。従って、特定の置換の上の例に基づいて、別の実験は、例えば、ＪＫ活性を提供するＪＫ断片の１または２以上の同類置換を行うことによって、本発明の別のＪＫＰを得るように、日常実験により行うことができる。また、本発明のＪＫＰの置換の他のグループは、タンパク質分子の中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして異なる残基が下記の表２に従いその位置に挿入されたグループである。本発明のタンパク質またはペプチド分子において行うことができる置換の型は、異なる種の相同的タンパク質、例えば、Ｓｃｈｕｌｚら、下を参照、の表１〜２の中に提示されているもの、の間のアミノ酸の変化の頻度の分析に基づくことができる。このような分析に基づいて、別の同類置換(conservative substitutions)は下記の５つのグループの１つの範囲内の交換としてここにおいて定義される。上の括弧内の３つのアミノ酸残基は、タンパク質の構成において特別の役割を有する。Ｇｌｙは側鎖を欠如する唯一の残基であり、従って鎖に柔軟性を付与する。しかしながら、これはα−らせん以外の二次構造の形成を促進する。Ｐｒｏは、その異常な形状寸法をもつために、鎖を緊密に束縛する。それは一般にβ− 回転様構造を促進する傾向があるが、ある場合においてＣｙｓはタンパク質のフォルディングにおいて重要であるジサルファイド結合の形成に参加することができる。Ｓｃｈｕｌｚらは上のグループ１および２を合同することに注意すべきである。また、Ｔｙｒは、水素結合する可能性をもつので、ｓｅｒ、およびＴｈｒなどと有意な類似性を有する。同類アミノ酸置換は、本発明による、例えば、上に提示したような、「実質的に相当する」または「相当する」という用語の中に含められ、この分野においてよく知られており、そしてアミノ酸置換後のポリペプチドの生物学的および構造的性質を維持することが期待されるであろう。本発明による大部分の欠失および挿入、および置換は、タンパク質またはペプチド分子の特性の残基の変化を生成しないものである。「特性」は、非包括的方法で、二次構造、例えば、α−らせんまたはβ−シートの変化、ならびに生理学的活性、例えば、レセプター結合アッセイの変化の両方を規定するために定義される。しかしながら、置換、欠失、または挿入の正確な作用を確証すべきとき、１または２以上の置換の作用は日常のＪＫ活性のスクリーニングアッセイ、イムノアッセイまたはバイオアッセイにより、生物学的活性、例えば、Ｊａｋキナーゼ（しかし、これに限定されない）を確証するために、評価されるであろうことを当業者は理解するであろう。ＪＫＰの中に含まれるようなアミノ酸配列の挿入は、また、１つの残基から本質的に非限定的長さのポリペプチドまでのアミノおよび／またはカルボキシル− 末端の融合、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内の挿入を包含する。配列内の挿入は一般に約１〜１０残基、より好ましくは１〜５の範囲であることができる。末端の挿入の例は、宿主に対して異種または相同的であるかどうかにかかわらず、組換え細菌宿主からの分泌を促進するために、シグナル配列のＪＫＰへの融合を包含する。本発明による変異型の１つの追加のグループは、ペプチド分子の中の少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは１つのみ、が除去されそして異なる残基がその位置に挿入されたものである。タンパク質の化学および構造の詳細な説明については、下記の文献を参照のこと：Schulzら、Principles of Protein Structure、Singer-Verlag、ニューヨーク、1978、;Ausubel、下を参照、これらをここに引用によって加える。本発明によるＪＫＰの大部分の欠失および挿入、および置換は、ペプチド分子のＪａｋキナーゼの特性を維持または改良するものである。しかしながら、置換、欠失、または挿入の正確な作用をそれを実施するの前に予測することが困難であるとき、その作用は日常のスクリーニングアッセイにより評価されるであろうことを当業者は理解するであろう。例えば、ペプチド分子をエンコードする核酸の部位特異的突然変異誘発および細胞培養における変異型ＪＫＰの発現によりまたは、また、化学合成により作られた変異型は、Ｊａｋキナーゼ活性について試験することができる（例えば、知られているようにまたはここに記載するように）。細胞リゼイトまたは精製されたペプチド変異型の活性は、適当なスクリーニングアッセイにおいて、所望の特性、例えば、いくつかのアッセイのいずれかにおいてＪａｋキナーゼ活性、についてスクリーニングすることができる。ペプチドの性質、例えば、レドックスまたは熱安定性、疎水性、タンパク質分解的分解に対する感受性または担体との、またはマルチマーへの凝集の傾向、の変更は、また、当業者によく知られている方法によりアッセイすることができる。また、本発明のＪＫＰの塩は本発明の範囲の中に含められる。ここにおいて使用するとき、「塩」という用語は、タンパク質またはペプチド分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。本発明のＪＫＰのアミノ酸配列の変異型は、また、ＤＮＡにおける突然変異により製造することができる。このような変異型は、例えば、アミノ酸配列内にの残基からの欠失、または残基の挿入または置換を包含する。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、また、最終の構成体が多少のＪａｋキナーゼ活性を有するかぎり、最終の構成体に到達するように作ることができる。好ましくは、非変異型のペプチドのＪａｋキナーゼ活性を超えた、改良されたＪａｋキナーゼ活性が見出される。明らかなように、変異型をエンコードするＤＮＡにおいて作られる突然変異は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、そして好ましくは二次ｍＲＮＡ構造体を生産することができる相補的領域をつくらないであろう（参照、例えば、欧州公開特許出願第75,444号;Ausubel、下を参照;S ambrook、下を参照）。遺伝的レベルで、これらの変異型は、通常、ＪＫＰをエンコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により製造され、これにより変異型をエンコードするＤＮＡを生産し、そしてその後組換え細胞培養物の中でＤＮＡを発現させる。変異型は、典型的には、天然に存在するＪＫと同一の定性的生物学的活性を示す（参照、例えば、Ausubel、下を参照;Sambrook、下を参照）。タンパク質の三次元の構造の知識は、タンパク質が機能する方法を理解する上で極めて重要である。４００より多いタンパク質の三次元構造はタンパク質構造のデータベースにおいて現在入手可能である（配列のデータベース、例えば、遺伝子バンク、ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓＲＥＧＩＳＴＲＹなど、における約２００，０００の既知のタンパク質およびペプチドの配列に比較して）。これらの構造の分析は、それらが認識可能なクラスまたはモチーフに属することを示す。既知の構造の関係するタンパク質に対する相同性に基づいてタンパク質の三次元構造をモデル化することが可能である。比較的低い配列の相同性を有するが、ほとんど同一の三次元構造を有することが発見された例が知られている。このような相同体は、また、本発明のＪＫＰの中に含められる。上の分析を使用してＪａｋキナーゼの構造または特性がいったん決定されると、既知の方法の工程に従い、ＪＫＰを組換え的または合成的に製造するか、または必要に応じて精製して、診断または研究の応用において使用するために商業的に有用な量のＪＫＰを得ることができる（参照、例えば、Ausbel、下を参照、およびSambrook、下を参照、これらの参考文献をここに引用によって加える）。Ｊａｋキナーゼに依存するサイトカイン活性を阻害する方法本発明によれば、サイトカインの活性は細胞へのサイトカインの作用を伝達するＪａｋキナーゼの活性を阻害することによって阻害することができる。本発明の範囲内のＪａｋキナーゼ活性を阻害する１つの方法は、ＪＫ遺伝子の発現を阻害することによる。Ｊａｋキナーゼの発現はアンチセンス分子またはリボザイムを使用して阻害することができる。アンチセンス分子および遺伝子の発現を阻害のためのそれらの使用はこの分野においてよく知られている（参照、例えば、Cohen、J.、0ligodeoxyribonucleot ides、Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press(1989);Toole、WO 92/10590）。Ｊａｋキナーゼの発現を阻害するために有用であるアンチセンス分子は、阻害しようとするＪａｋキナーゼのｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ遺伝子配列に対して相補的であり、そしてそれに結合することができる核酸配列を含有する。このようなアンチセンス分子は、米国特許第５，１９０，９３１号(Inoue 、M.に対して1993年3 月2 日発行された、これをここに引用によって加える)により教示されるように、アンチセンス分子をエンコードするＤＮＡを使用する遺伝的発現を介して細胞に提供することができる。また、本発明のアンチセンス分子は合成的に作り、そして細胞に提供することができる。本発明が考える合成のアンチセンス分子は、未修飾のオリゴヌクレオチドに比較して改良された生物学的活性を有するこの分野において知られているオリゴヌクレオチドの誘導体を包含する（参照、例えば、Cohen、J.、前掲；米国特許第5,023,243号、Tullis、R. H.に対して1991年6 月11日に発行された、そしてこれらをその全体において引用によって加える）。リボザイムおよび遺伝子の発現を阻害するためのそれらの使用は、また、この分野においてよく知られている（参照、例えば、Cechら、j.Biol.Chem.267:1747 9-17482:1992);Hampelら、Biochemistry 28:4929-4933(1989);Haseloffら、Natu re 334:585-591(1988);Eckstein ら、WO92/07065;および米国特許第5,168,053 号、Altmanらに対して発行され、そしてこれらをその全体において引用によって加える）。アンチセンス分子に似て、リボザイムがそれらの発現を阻害するように設計された遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的な標的配列をリボザイムは含有する。Ｊａｋキナーゼの発現を阻害するために有用なリボザイムは、阻害しようとするＪａｋキナーゼのｍＲＮＡ配列に対して相補的である基本的リボザイム構造の中に、標的配列を組み込むことによって設計することができる。Ｊａｋキナーゼをターゲティングするリボザイムは商業的に入手可能な試薬（アプライド・バイオシステムス［ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］）を使用して合成できるか、またはそれらをエンコードするＤＮＡから遺伝的に発現させることができる。当業者は認識するように、アンチセンスおよびリボザイムの分子は、Ｊａｋキナーゼのファミリーの特定の構成員に対してユニークな配列をターゲティングすることによって、その構成員を阻害するように設計することができる。アンチセンスおよびリボザイムの分子は、阻害しようとするＪａｋの構成員が共有する配列をターゲティングすることによって、２以上のＪａｋキナーゼを阻害するように設計計することができる。Ｊａｋキナーゼ活性は、また、キナーゼとして機能するＪａｋタンパク質の能力を阻害する化合物またはペプチドを使用して、阻害することができる。このようなインヒビターは、薬物、抗Ｊａｋキナーゼ抗体、Ｊａｋキナーゼのアゴニストおよびアンタゴニスト、Ｊａｋキナーゼのトランス優性突然変異体、およびチロシンキナーゼ活性の一般的インヒビター、例えば、ＧＥＮＥＳＴＥＩＮを包含するが、これらに限定されない。それらのインヒビターはすべてのＪａｋキナーゼに対して一般的阻害作用を有するか、またはＪａｋキナーゼのファミリーの特別の構成員またはサブセットに対していっそう特異的な阻害作用を有することができる。用語「抗体」は、ここにおいて使用するとき、実質的に相同的集団であるモノクローナル抗体および異種の集団であるポリクローナル抗体の両方を意味する。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを包含する免疫グロブリンのクラスおよびそのサブクラスであることができる。用語「抗体」は、ここにおいて使用するとき、また、無傷の分子ならびにそれらの断片、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂（これらは無傷の抗体に結合することができる）の両方を包含することを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂断片は、無傷の抗体のＦｃ断片を欠如し、循環からいっそう急速に除去され、そして無傷の抗体よりも少ない非特異的組織結合性を有することができる(Wahl ら、J.Nucl.Med.24: 316-325(1983))。このような断片は、典型的には、酵素、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂断片を生成するため）を使用する、タンパク質分解的切断により生成される。参照、一般に、Kohler およびMilstein、Nature 256:495-497(1975);米国特許第4,376,110 号;Ausubel ら、編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Assoc. およびWiley Interscience、ニューヨーク、(19871、1992、1993、1994);および HarlowおよびLane、ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Labo ratory(1988);Colliganら、Current Protocols in Immunology、Greene Publish ing Assoc.およびWiley Interscience、ニューヨーク、（1992、1993）、それらの参考文献の内容の全体をここに引用によって加える。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを包含する免疫グロブリンのクラスおよびそのサブクラスであることができる。Ｊａｋキナーゼに対して両方のモノクローナルおよびポリクローナル抗体はこの分野においてよく知られている方法に従い作ることができる（参照、例えば、 Harlow、前掲;Colligan、前掲;Ausubel、前掲、§§11.4.2-11.13.4）。抗体は組換え的に生産されるか、またはＪａｋキナーゼが天然に存在する細胞および組織から単離されたＪａｋキナーゼタンパク質に対して発生させることができる。抗体は全体のＪａｋキナーゼタンパク質に対して発生させるか、または、より好ましくは、抗体はそのサイトカイン誘導チロシンキナーゼ活性のために要求されるＪａｋキナーゼタンパク質の機能的ドメインを表すペプチドの下位断片に対して発生させる。特定のＪａｋキナーゼを特異的に阻害するための抗体を、そのＪａｋキナーゼに対してユニークなペプチド断片に対して発生させることができる。また、Ｊａｋキナーゼのファミリーの２以上の構成員を遺伝的に阻害するための抗体を、阻害しようとするＪａｋキナーゼが共有するペプチド断片に対して発生させることができる。本発明により教示されるＪａｋキナーゼ活性を阻害する他の方法は、Ｊａｋキナーゼのサイトカイン依存性活性化のインヒビターを使用することである。サイトカインの刺激前に、細胞のＪａｋキナーゼは活性化されない状態で存在する。Ｊａｋキナーゼ活性のインヒビターは、Ｊａｋキナーゼのその触媒的に活性な状態への変換を阻害する能力により同定することができ、これは後述しかつ実施例に記載するｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより検出することができる。本発明者らにより発見されたように、Ｊａｋキナーゼはそれらのサイトカイン誘導チロシンリン酸化により活性化される。従って、また、本発明によれば、インヒビターはＪａｋキナーゼのその触媒的に活性な形態へのサイトカイン誘導チロシンリン酸化をブロックまたは有意に減少する化合物またはペプチドとして同定することができる。サイトカイン刺激後のＪａｋキナーゼのチロシンリン酸化の状態は、例えば、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体で検出できるというＪａｋキナーゼの能力により、アッセイすることができる。特定のサイトカインによるＪａｋキナーゼの活性化は、そのサイトカインのレセプターとのＪａｋキナーゼの物理的連合を必要とすることがある（実施例２参照）。本発明によれば、この連合に関係するＪａｋキナーゼまたはサイトカインレセプターのそれらの部分を模擬するペプチドのアンタゴニストはＪａｋキナーゼ活性のインヒビターとして有用である。これらのペプチドは、サイトカインレセプター（Ｊａｋキナーゼのペプチドのための）またはＪａｋキナーゼ（サイトカインレセプターのペプチドのための）と連合し、このようにサイトカインレセプターとのＪａｋキナーゼの連合をブロックすることによって、インヒビターとして作用すると本発明により考えられる。特に、ＥＰＯによるＪａｋ２の活性化はＥＰＯレセプター（ＥＰＯＲ）とのＪａｋ２の物理的連合を必要とすること、およびこの連合は有糸分裂誘発のために必須なＥＰＯＲの膜近位領域を必要とすることを本発明は教示する。本発明によれば、この膜近位領域を模擬しそしてＥＰＯＲ−Ｊａｋ２相互作用をブロックできるペプチドのアンタゴニストは、ＥＰＯによるＪａｋ２の活性化のインヒビターとして有用である。Ｊａｋキナーゼ活性のインヒビターのアッセイ本発明は、また、前述の方法において有用なＪａｋキナーゼ活性のインヒビターを同定するスクリーニングアッセイを提供する。Ｊａｋチロシンキナーゼ活性は、触媒的に活性なＪａｋキナーゼ、１または２以上のＪａｋリン酸化基質、および、例えば、³²Ｐのような放射性標識で検出可能に標識化されたリンをγ位にもつＡＴＰを組み合わせることによって、ｉｎｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。このアッセイにおいて、ＪａｋキナーゼはＡＴＰから基質への標識化リンの移行を触媒し、そしてＪａｋキナーゼ活性は検出可能に標識化されたリンを含有する基質（すなわち、標識化基質）の発生により検出される。Ｊａｋキナーゼ活性のインヒビターは、アッセイの中に組み込んだとき、標識化基質の発生を有意に減少または排除する化合物またはペプチドとして同定される。このアッセイにおいて使用する触媒的に活性なＪａｋキナーゼは種々の源から得ることができる。好ましくは、触媒的に活性なＪａｋキナーゼは、Ｊａｋキナーゼを高いレベルで発現することができるバキュロウイルスのベクターで形質転換された昆虫細胞から得られる。この方法において生産されたＪａｋ２キナーゼは、触媒的に活性でありそしてｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて有用であることが発見された。同様な方法において昆虫細胞の中の大量に生産された他のＪａｋキナーゼは、また、触媒的に活性であろう。触媒的に活性なＪａｋキナーゼは、また、Ｊａｋキナーゼの構成的活性化を生ずる突然変異を有する細胞から得ることができる。例えば、ＣへのＲ¹⁹⁹として知られているＥＰＯＲ突然変異はＥＰＯＲの構成的活性化を生ずる(Yoshimuraら、Nature 348:647-649(1990))。ＥＰＯの不存在下に、この突然変異を発現する細胞において、Ｊａｋ２キナーゼは構成的にチロシンリン酸化され、そしてｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を有する。各Ｊａｋキナーゼの触媒的に活性な形態は、また、それらの活性化を引き起こすサイトカインで刺激された細胞から得ることができる。例えば、触媒的に活性なＪａｋ２は、ＥＰＯ、成長ホルモン、ＩＬ−３、および他のサイトカインで刺激された細胞得ることができるが、触媒的に活性なＴｙｋ２はＩＦＮαで刺激された細胞から得ることができる。その活性を決定するＪａｋキナーゼのリン酸化基質をアッセイにおいて使用できる。自己リン酸化活性を有するＪａｋキナーゼについて、好ましい基質はＪａｋキナーゼそれ自体、または自己リン酸化部位を含有するその下位断片である。チロシンキナーゼ、例えば、Ｊａｋキナーゼは、一般に、自己リン酸化活性を有する傾向がある（参照、例えば、Hanks、S.K.ら、Science 241:42-52(1988) 。そのうえ、Ｊａｋ２についての自己リン酸化活性が確立され、そして自己リン酸化部位はＪａｋ２のアミノ酸１０００−１０１５を含有するペプチド断片上に存在することが発見された（第１図参照；配列はＶＬＰＱＤＫＥＹＹＫＶＫＥＰＧ（配列番号：２）である）。同様なペプチド断片は、Ｊａｋ１タンパク質の中にアミノ酸１０１５−１０２９に（第２図参照；配列はＡＩＥＴＤＫＥＹＹＴＶＫＤＤＲ（配列番号：３）である）そしてＪａｋ２タンパク質の中にアミノ酸１０４７−１０６１に（第３図参照；配列はＡＶＰＥＧＨＥＹＹＲＶＲＥＤＧ（配列番号：４）である）存在する。Ｊａｋキナーゼの間の構造および機能の類似性、ならびに一般にチロシンキナーゼの間の機能の類似性に基づいて、Ｊａｋキナーゼのファミリーの他の構成員はまた自己リン酸化活性を有することが期待される。本発明は、また、Ｊａｋキナーゼのサイトカイン誘導活性化のインヒビターのアッセイを提供する。Ｊａｋキナーゼのサイトカイン誘導活性化は、ここに記載するように、サイトカイン誘導後の細胞からＪａｋキナーゼ抽出物を調製し、そしてこの抽出物をｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性についてアッセイすることによってアッセイすることができる。サイトカイン誘導活性化のインヒビターは、サイトカイン誘導の前および／または間に存在するとき、サイトカイン誘導後の細胞から調製されたＪａｋキナーゼ抽出物において検出されるｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を有意に減少または排除する化合物またはペプチドとして同定される。本発明は、また、サイトカイン誘導Ｊａｋキナーゼ活性化の潜在的インヒビターである、Ｊａｋキナーゼ−サイトカインレセプターの相互作用のインヒビターについてのアッセイを提供する。活性化Ｊａｋキナーゼによりリン酸化されるサイトカインレセプターについて、Ｊａｋキナーゼ−サイトカインレセプターの相互作用は、前述のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを使用して、サイトカインレセプターをアッセイの中にリン酸化基質の中に組み込むことによって検出することができる。例えば、Ｊａｋ２キナーゼによるエリトロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）のリン酸化は、このアッセイを使用して検出することができる。Ｊａｋキナーゼ−サイトカインレセプターの相互作用のインヒビターは、このアッセイの中に組み込んだとき、リン酸化（標識化）サイトカインレセプターのタンパク質の発生を有意に減少または排除する化合物またはペプチドとして同定される。サイトカインレセプターのタンパク質は、好ましくは、Ｊａｋキナーゼの生産についてここに記載するような目的に適当な組換え宿主から生産および精製することによって、このアッセイにおいて使用するために得られる。好ましい宿主は、サイトカインレセプターを高いレベルで発現できるバキュロウイルスのベクターで形質転換された昆虫細胞である。また、サイトカインレセプターのタンパク質は天然源から単離することができる。Ｊａｋキナーゼに依存するサイトカイン活性を増強する方法サイトカインに対する細胞の生物学的応答をＪａｋキナーゼの不十分な量のために欠如する状況において、本発明は、細胞の中のＪａｋキナーゼのレベルを増加することによって、この応答を増強することを提供する（実施例４参照）。この状況は、細胞が生産するＪａｋキナーゼの量が正常より低いレベルに減少する突然変異のためである。この状況は、また、細胞が生産するＪａｋキナーゼのレベルがサイトカイン誘導後の活性化Ｊａｋキナーゼの十分なレベルを提供しないように、サイトカイン誘導Ｊａｋ活性化の速度または程度を減少する突然変異のためである。Ｊａｋキナーゼのレベルは、Ｊａｋキナーゼタンパク質を細胞に添加するか、またはＪａｋキナーゼを発現できるベクターを細胞の中に導入することによって、細胞において増加することができる。ベクターおよびＪａｋ２の発現方法は後述される。当業者にとって容易に明らかなように、これらの方法は、また、Ｊａｋキナーゼのファミリーの他の構成員の生産および発現に適用することができる。サイトカイン活性を調節する方法の治療上の応用また、前述したようなＪａｋキナーゼ活性を調節する方法は、その活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する異常な細胞の応答により引き起こされる疾患の症状の治療に適用することができることが本発明において考えられる。従って、その活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する過度の細胞の応答により引き起こされる疾患の症状を、Ｊａｋキナーゼ活性を阻害することによって治療することができる。特に、真核細胞の過度の増殖により引き起こされる疾患の症状は、その活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに応答してこの過度の増殖が起こる場合、Ｊａｋキナーゼ活性を阻害することによって治療することができる。このような疾患の症状は、遺伝的に獲得した突然変異または自発的に獲得した突然変異により引き起こされる。例えば、赤血球増加症は始原細胞からの赤血球の過度の増殖を包含する、遺伝的に獲得した疾患である。過度の生産はエリトロポイエチン（ＥＰＯ）に依存し、そしてＥＰＯ−ＥＰＯＲ結合によるＪａｋ２キナーゼ活性の異常な調節を生ずるＥＰＯレセプター（ＥＰＯＲ）の中の突然変異により引き起こされる。匹敵する突然変異は、また、自発的に起こり、そしてこの疾患の症状を生ずる。さらに、Ｊａｋキナーゼ伝達のサイトカインの応答により調節される、類似の疾患の症状は、他の細胞系において起こることがある。また、その活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する細胞の応答の欠乏、または非応答性により引き起こされる疾患の症状は、Ｊａｋキナーゼ活性を増強することによって治療することができる。アンチセンス分子、リボザイム、Ｊａｋ抗体、アンタゴニストなどを包含する、Ｊａｋキナーゼ活性を阻害できるここに記載する組成物の投与は、当業者に知られている方法によって達成することができることが本発明において考えられる。例えば、投与は非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または経皮的ルートによることができるか、または薬学上許容される担体ビヒクルとともに当業者が適当である認識する任意の手段により投与することができる。ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで投与される本発明の医薬化合物または組成物の投与量は、受容体の年令、性別、健康、および体重、存在する場合、同時の治療の種類、治療の頻度、および所望の薬学上の作用の特質に依存するであろうことが理解されるであろう。ここにおいて提供される有効投与量の範囲は、限定を意図せず、そして好ましい投与量の範囲を表す。最も好ましい投与量は、当業者により理解されたかつ決定可能であるように、個々の被検者に対して調節されるであろう。参照、例えば、下記の参考文献を参照のこと：Berkowら、編、The Merk Manual、第16版、Merck and Co．、Rahway、ニュージャージイ州(19 92);Goodmanら、編、Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Th erapeutics、第8 版、Pergamon Press、Inc.、ニューヨーク州エルンスフォード (1990);Avery′s Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharm acology and Therapeutics、第3 版、ADIS Press、LTD、WilliamsおよびWilkins 、マリイランド州バルチモア(1987);Ebadi、Pharmacology、Little、Brawn and Co．、ボストン(1985);Osol ら、編、Remington′s Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishlng Co．、ペンシルベニア州イーストン(1990);Katzung、 Basic and Clinical Pharmacology、AppletonおよびLange、コネチカット州ノーウォーク(1992)；これらの参考文献の全体をここに引用によって加える。各治療に要求される合計の投与量は、多数の投与量または単一の投与量で投与することができる。診断／医薬の化合物または組成物は、単独で、または病理学に指示された、または病理学の他の症状に指示された、他の診断薬および／または医薬と組み合わせて投与することができる。本発明の診断／医薬の化合物または組成物の有効量は、約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、４〜７２時間の間隔で、２時間〜５年の間、および／またはここにおける任意の範囲または値で、例えば、０．０００００１ −０．０００１，０．０００１−０．０１，０．０１−１．０，１−１０，１０ −５０ａｎｄ５０−１００，０．０００００１−０．００００１，０．００００１−０．０００１，０．０００１−０．００１，０．００１−０．０１，０．０１−０．１，０．１−１．０，１．０−１０ａｎｄ５−１０ｍｇ／ｋｇ，１−２，２−４，４−６，６−８，８−１０，１０−１２，１２−１４，１４−１６，１６−１８，１８−２０，２０−２２，２２−２４，２４−２６，２６−２８，２８−３０，３０−３２，３２−３４，３４−３６，３６−４０，４０−４４，４４−４８，４８−５２，５２−５６，５６−６０，６０−６４，６４−６８，６８−７２時間の間隔で、１，２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，６０，７０，８０，９０，１００日または１，２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２４，２８，３２，３６，４０，４４，４８，５２および／またはそれ以上の週、およびまたは１，２，３，４，５，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，３０，３６，４０，５０および／または６０年の間隔で、またはその中の任意の範囲または値で投与される。本発明の化合物および／または組成物の投与の受容体は、任意の脊椎動物、例えば、哺乳動物、鳥類、直骨上目の魚類、カエルおよびヒキガエルであることができる。哺乳動物の間で、好ましい受容体は霊長目（ヒト、エイプおよびサルを含む）、アーテリオダクチラ（Ａｒｔｅｒｉｏｄａｃｔｙｌａ）目（ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む）、齧歯目（マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む）、および食肉目（ネコ、およびイヌを含む）の動物である。鳥類の間で、好ましい受容体はシチメンチョウ、ニワトリおよび同一目の他の構成員である。最も好ましい受容体はヒトである。キナーゼ活性を妨害しないで特定のＪａｋタンパク質に結合できる抗体本発明は、また、それらのキナーゼ活性を崩壊しないで真核細胞から特定のＪａｋキナーゼを検出および抽出するために有用な抗体を提供する。これらの抗体は、各Ｊａｋキナーゼについて異なるドメイン１および２の間のＪａｋヒンジ領域の一部分を表すペプチド断片に対して発生させる。このような抗体の発生に有用なペプチドは、Ｊａｋ２のアミノ酸７５８−７７６（第１図；この配列はＤＳＱＲＫＬＱＦＹＥＤＫＨＱＬＰＡＰＫ（配列番号：５）である）、Ｊａｋ１のアミノ酸７８６−８０４（第２図；この配列はＴＬＩＥＫＥＲＦＹＥＳＲＣＲＰＶＴＰＳ（配列番号：６）である）、およびＴｙｋ２のアミノ酸８１９−８３７（第３図；この配列はＳＰＳＥＫＥＨＦＹＱＲＱＨＲＬＰＥＰＳ（配列番号：７）である）から誘導される。本発明によれば、これらのペプチドに対して発生した抗体は、ペプチドの抗原を誘導したＪａｋタンパク質に、キナーゼ活性を妨害しないで、特異的に結合しそしてそれを認識することができる。標準の免疫沈降技術の適用により、これらの抗体はｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて使用するための特定のＪａｋタンパク質を含有する細胞抽出物を得るために使用することができる。このような使用は、実施例１〜３および５におけるＪａｋ２キナーゼのヒンジ領域に対して発生した抗体について証明される。Ｊａｋ遺伝子およびタンパク質本発明によれば、ｃＤＮＡ配列およびＪａｋキナーゼの対応するアミノ酸配列、例えば、Ｊａｋ３およびネズミＪａｋ２キナーゼが提供される。全長のＪａｋ２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は第１図（配列番号：８）に提供されており、そしてＪａｋ２タンパク質をエンコードする３３８７ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、Ｊａｋ２タンパク質は１１２９アミノ酸の長さであり、そして１３０ｋＤａの計算分子量を有する。第１図におけるＪａｋ２ｃＤＮＡの５’末端は第１ＡＴＧの前に３つの停止コドンを有する。第１ＡＴＧはコザク（Ｋｏｚａｋ）コンセンサスフランキング配列を満足させないが、その直ぐ後に典型的な翻訳開始環境においてＡＴＧコドンが続く(Kozak、M.、Nucl.Acids Res .15:8125-8148(1987))。５’末端は明らかなシグナルペプチドを含有しない。Ｊａｋ２クローンの３’−非翻訳領域のコンパイルした大きさは０．９ｋｂであり、これは４．４ｋｂの転写体に相当する。Ｊａｋ３ｃＤＮＡは３．８ｋｂでありそして１０９９アミノ酸および１２２．６ｋＤａの大きさをもつタンパク質をエンコードする長いオープンリーディングフレームを含有した。この配列（第６図）は他のＪａｋに高度に関係づけられ、そしてＪａｋ３と命名した。ここに提示した教示および案内に基づく、本発明のＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡをクローニングおよび発現するために有用なオリゴヌクレオチドのプローブを合成する既知の方法の工程は、例えば、下記の文献に開示されている：例えば、Ausbel、下を参照;Sambrook、下を参照;およびWuら、Prog.Nucl.Acid.Re s.Molec.Biol.21:101-141(1978)、これらの文献の全体をここに引用によって加える。Ｊａｋ断片をエンコードすることができる（またはそれをエンコードする配列に対して相補的である）適当なオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの組は、上のようにして同定し、合成し、そしてＪａｋ遺伝子を有しおよび／またはＪａｋキナーゼを発現できる細胞から誘導されたＤＮＡまたは、より好ましくは、ｃＤＮＡ調製物に対して、この分野においてよく知られている手段により、ハイブリダイゼーションさせることができる。Ｊａｋ活性をエンコードする配列に対して相補的である一本鎖のオリゴヌクレオチドのプローブは、方法の工程を使用して合成することができる(参照、例えば、Ausubel、下を参照;Sambrook、下を参照)。このような標識化された、検出可能なプローブは、前述したようにゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする既知の手順により、またはＪａｋ核酸またはアミノ酸配列をエンコードする単離されたＲＮＡから発生したｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプローブを合成するための基礎として使用することができる。他の非限定的例として、使用するベクター、ＲＮＡ分析に適当な選択培地を使用するか、または本発明による方法において使用するＪａｋキナーゼとして標的タンパク質に対して特異的な抗体を使用することによって、形質転換体をＪａｋキナーゼの宿主細胞による発現について選択することができる。この種類の標的の検出可能に標識化されたプローブは、Ｊａｋキナーゼをエンコードするポリヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドの断片であることができる。また、合成オリゴヌクレオチドをＪａｋプローブとして使用することができ、Ｊａｋプローブは好ましくは約１０ヌクレオチドの長さ（例えば、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上、またはその中の任意の組み合わせまたは値、１ヌクレオチドの増分）であって、検出、増幅または発現すべき標的核酸に対して特異的であるようにする。プローブはＪａｋをエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡのこのような長さ、例えば、配列番号：１の一部分に相当する配列または第６図に提示されているＪａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３またはｔｒｋ１配列に相当することができ、ここでプローブの配列はＤＮＡを含有する宿主細胞に従い、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、下を参照、の表Ａ１．４に提示されているように、選択される。本発明のＪａｋキナーゼをエンコードする核酸は、１５〜１５００、例えば、１５〜１００９、１５〜１００６、３０〜６００、および９０〜１５００ヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値を包含することができ、第６図に提示される配列の一部分に対して実質的に相補的であり、ここでこの分野においてよく知られているように、コドンは同一または同類置換されたアミノ酸をエンコードするコドンで置換することができる。宿主の培養およびタンパク質の発現の誘導は、それ自体知られている方法により誘導することができる。本発明のＪａｋキナーゼをエンコードする核酸配列は、常用のと技術に従いベクターＤＮＡで組換えることができ、ここでこのような技術は結合のための平滑末端またはスタッガード末端の末端、適当な末端を得るための制限酵素の消化、適当ならば粘着末端のフィルイン、望ましくない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および適当なリガーゼとの結合を包含するが、これらに限定されない。このような操作のための既知の技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、下を参照、に開示されており、そしてこの分野においてよく知られている。核酸分子、例えば、ＤＮＡは、転写および翻訳の調節の情報を含有するヌクレオチド配列を含有する場合、ポリペプチドを「発現することができる」と言い、そしてこのような配列はそのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に「作用可能に連結」されている。作用可能な連結は、調節ＤＮＡ配列および発現させようとするＤＮＡ配列がＪａｋキナーゼまたはＪａｋ活性を有するペプチドの遺伝子の発現を回収可能な量で可能とするような方法で接続されている連結である。遺伝子の発現のために必要な調節領域の正確な特質は、類似の技術においてよく知られているように、生物毎に変化することができる。参照、例えば、Sa mbrook、下を参照;Ausubel、下を参照。本発明によるＪａｋ２キナーゼ遺伝子操作する方法は、ＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡのクローニングおよびこのような配列の発現により促進される。ＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡは、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびそれらの組み合わせを包含する、種々の源から誘導することができる。ゲノムＤＮＡは天然に存在するイントロンを含むか、または含まないことができる。そのうえ、このようなゲノムＤＮＡはＪａｋ遺伝子配列の５’プロモーター領域と関連して得ることができる。５’プロモーター領域は保持し、そしてこのプロモーター領域の中に存在する発現シグナルを認識する宿主細胞の発現のために使用することができる。イントロンを含有しないゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡはいくつかの方法で得ることができる。ゲノムＤＮＡは、この分野においてよく知られている手段により、適当な細胞から抽出しそして精製することができる。また、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、この分野においてよく知られている手段により、Ｊａｋキナーゼを生産する細胞から単離し、そしてｃＤＮＡの調製に使用することができる。このような適当なＤＮＡ調製物を酵素的に切断するか、またはランダムに剪断し、そして組換えベクターの中に結合してゲノムまたはｃＤＮＡ配列のライブラリーを形成することができる(参照、Ausubel、F.M．ら、Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols 発行、§§5.0.3-5.10.2(1987、1992、199 3、1994))。次いで、このようなライブラリーは、第１図（配列番号：８）または第６図の中に提供されたＪａｋ遺伝子の配列に基づく核酸プローブとのハイブリダイゼーションについてスクリーニングして、クローニングされたＪａｋをエンコードする配列を同定しそして単離することができる(参照、Ausubel、F.M.ら、前掲、§§6.0.3-6.6.1)。次いで、このスクリーンにより同定されたライブラリーの構成員を分析して、それらが含有するＪａｋ配列の程度および特質を決定する。前述の組換え法の代わりに、Ｊａｋキナーゼをエンコードする遺伝子配列をこの分野においてよく知られている方法に従い合成的に製造することができる（参照、Ausubel、F.M．ら、前掲、§§2.11.1-2.11.18）。前述の方法により得られた、クローニングされたＪａｋをエンコードする配列は、発現ベクターに作用可能に連結され、そして細菌細胞または真核細胞の中に導入してＪａｋキナーゼを生産することができる。このような操作の技術はこの分野においてよく知られており、そしてAusubel、F.M.ら、前掲、§§3.0.3-3.16 .11 に開示されている。ＤＮＡは、それが転写および翻訳の調節の情報を含有するヌクレオチド配列を含有する場合、ポリペプチドを「発現することができる」と言い、そしてこのような配列はそのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に「作用可能に連結」されている。作用可能な連結は、調節ＤＮＡ配列および発現させようとするＤＮＡ配列がコーディング配列の発現を可能とするような方法で接続されている連鎖である。遺伝子の発現のために必要な調節領域の正確な特質は生物毎に変化することができるが、一般にプロモーター領域を含み、このプロモーター領域は、原核生物において、プロモーター（ＲＮＡの転写開始を指令する）ならびにＤＮＡ配列の両方を含有し、前記ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるとき、コーディング配列の転写開始をシグナルする。このような領域は、通常、転写および翻訳の開始を含む５’−非コーディング配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など、を含むであろう。所望ならば、Ｊａｋ２キナーゼをコードする遺伝子配列に対して３’の非コーディング領域を前述の方法により得ることができる。この領域はその調節配列、例えば、転写停止およびポリアデニル化のシグナルのために保持することができる。従って、ＪａｋキナーゼをコードするＤＮＡ配列に対して自然に隣接する３ ’−領域をすることによって、これらの調節領域を設けることができる。調節シグナルが発現宿主細胞において満足に機能しない場合、宿主細胞の中で機能的な３’ −領域を置換することができる。原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）など）の中でＪａｋキナーゼを発現させるために、Ｊａｋキナーゼをエンコードする配列を機能的原核性プロモーターに作用可能に連結することが必要である。このようなプロモーターは構成的であるか、または、より好ましくは、調節可能（すなわち、誘導可能または抑制解除可能）であることができる。構成的プロモーターの例は、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列、およびｐＰＲ３２５のクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーターなどを包含する。誘導可能な原核性プロモーターの例は、バクテリオファージλの主要な右および左のプロモーター（Ｐ_LおよびＰ_R）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒＰ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、およびｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ(Ulmanen、I．ら、J.Bacteriol.162:176-182(1985)）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉs）のσ−２８−特異的プロモーター(Gilman、M.Z.ら、Gene sequ ence 324:11-20(1984))、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオファージのプロモーター(Gryczna、T.J.、The Molecular Biology of the Bacilli、Academi c Press、Inc.、ニューヨーク(1982))、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプロモーター(Ward、J.M.ら、Mol.Gen.Genet.203:468-478(1986))を包含する。原核性プロモーターは下記の文献において概観されている：Glick、B. R.、J.Ind.Microblol.1:277-282(1987);Cenatiempo、Y.、Biochimie 68:505-516( 1986)；およびGottesman、S.、Ann.Rev.Genet.18:415-442(1984)。原核細胞の中の適切な発現は、また、遺伝子配列をエンコードする配列から上流のリボソーム結合部位の存在を必要とする。このようなリボソーム結合部位は、例えば、下記の文献に記載されている：Gold、L．ら、Ann.Rev.Microbiol.35:36 5- 404(1981)。好ましい真核宿主は、ｉｎｖｉｖｏまたは組織培養における、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞を包含する。宿主として有用であることができる哺乳動物細胞は、ＣＯＳ細胞および線維芽、骨髄性白血病、または正常の造血組織から誘導された細胞または細胞系を包含するが、これらに限定されない。哺乳動物の宿主について、いくつかの可能なベクター系がＪａｋキナーゼの発現のために入手可能である。広範な種類の転写および翻訳の調節配列を、宿主の特質に依存して、使用することができる。転写および翻訳の調節シグナルは、ウイルス源、例えば、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなどから誘導することができ、ここで調節シグナルは高いレベルの発現を有する特定の遺伝子配列に関連する。また、哺乳動物の発現産物、例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどからのプロモーターを使用できる。転写開始の調節シグナルは遺伝子配列の発現を変調できるように、抑制または活性化を可能とする転写開始の調節シグナルを選択することができる。温度を変化させることによって、発現を抑制または開始することができるように、温度感受性であるか、または化学的（例えば、代謝）の調節に付される、調節シグナルは重要である。参照、例えば、Ausubel、ら、下を参照、§§1.5、1.10、7.1、7.3、8.1、9.6、9.7、13.4、16.2、 16.6、および16.8-16.11。特定のプラスミドまたはウイルスのベクターを選択するとき重要な因子は、次のものを包含する：ベクターを含有する受容体の細胞を認識し、そしてベクターを含有しない受容体の細胞から選択することができる容易さ；特定の宿主において所望のベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞の間でベクターを「シャトル」することができることを望むかどうか。触媒的に活性なＪａｋキナーゼの生産のために好ましい宿主は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエの幼虫である。昆虫細胞を宿主として使用するとき、ショウジョウバエのアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターを使用できる (Rubin、G.M.、Science 240:1453-1459(1988))。また、バキュロウイルスのベクターは昆虫細胞の中で大量のＪａｋキナーゼを発現するように操作することができる(参照、例えば、Ausubel、F.M．ら、、Current Protocols in Molecular Biology 、Current Protocols 発行、§§16.8.1-16.11.7(1987、993、1994);Jasny、B.R.、 Science 238:1653(1987);Miller、D.W.ら、Genetic Engineering(1986)、Setlow、J. K.ら、編、Plenum、Vol.8、pp.277-297)。バキュロウイルスのベクターからの昆虫細胞の中のＪａｋキナーゼの発現は、前述したようにＪａｋキナーゼ活性のインヒビターについてのスクリーニングアッセイにおいて使用できる活性化Ｊａｋキナーゼを生産する。前述したように、真核宿主におけるＪａｋキナーゼの発現は真核性調節領域の使用を必要とする。このような領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するために十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核性プロモーターは次のものを包含する：マウスのメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター(Hamer、D．ら、 J.Mol.Appl.Gen.1:273-288(1982))；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター(McK night、S.、Cell 31:355-365(1982))；ＳＶ４０初期プロモーター(Benoist、C.ら、N ature(London)290:304-310(1981))；酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター(John ston、S.A.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:6971-6975(1982);Silver、P.A.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:5951-5955(1984))；および９−２７遺伝子プロモーター(Reid、L.E.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.US A86:840-844(1989);Ausubel、下を参照;Lewin、Genes III、John Wiely & Sons、発行所、ニューヨーク州ニューヨーク(1990);Sambrook ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2 版、 Cold Spring Harbor Laboratory、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989))。広く知られているように、真核性ｍＲＮＡの翻訳は第１メチオニンをエンコードするコドンにおける開始される。この理由で、真核性プロモーターとＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡ配列との間の連結はメチオニンをエンコードするできる介在コドン（すなわち、ＡＵＧ）を含有しないことを保証することが好ましい。このようなコドンの存在は、フラビンタンパク質の形成（ＡＵＧがＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡ配列と同一のリーディングフレームの中に存在する場合）またはフレームシフトの突然変異（ＡＵＧがＪａｋキナーゼをエンコードする配列と同一のリーディングフレームの中に存在しない場合）を生ずる。Ｊａｋキナーゼをエンコードする配列および作用可能に連結されたプロモーターは、受容体の原核細胞または真核細胞の中に、線状分子または、より好ましくは、閉じた共有結合の円形分子であることができる、非複製性ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子の一部分として、導入することができる。このような分子は自律的複製を行うことができないので、Ｊａｋキナーゼの発現は導入された一時的発現を通して起こることができる。また、永久的発現は宿主染色体の中への導入配列の組込みを通して起こることができる。１つの態様において、宿主染色体の中に所望の遺伝子配列を組込むことができるベクターを使用する。導入されたＤＮＡをそれらの染色体の中に安定に組込んだ細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１または２以上のマーカーをまた導入することによって、選択することができる。このマーカーは、栄養要求性宿主にプロトトロピー、生物致死剤耐性、例えば、抗生物質、または重金属、例えば、銅など、を提供することができる。選択可能なマーカーの遺伝子配列は、ＤＮＡ遺伝子配列の中に直接連結することができるか、または同一細胞の中に共トランスフェクションにより導入することができる。また、一本鎖結合タンパク質のｍＲＮＡの最適な合成のために、追加の要素が必要である。これらの要素は、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および停止シグナルを含むことができる。このような要素を取り込んだｃＤＮＡ発現ベクターは、下記の文献に記載されているものを包含する： Okayama、H.、Molec.Cell.Biol.3:280(1983);Ausubel、下を参照;Sambrook、下を参照。好ましい態様において、導入された配列は受容体宿主において自律的複製を行うことができるプラスミドまたはウイルスのベクターの中に取り込まれるであろう。広範な種類のベクターのいずれをもこの目的に使用できる。特定のプラスミドまたはウイルスのベクターの選択において重要な因子は次のものを包含する：ベクターを含有する受容体の細胞を認識し、そしてベクターを含有しない受容体の細胞から選択することができる容易さ；特定の宿主において所望のベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞の間でベクターを「シャトル」することができることを望むかどうか。好ましい原核性ベクターは、プラスミド、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で複製できるもの（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸ。このようなプラスミドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、下を参照、に開示されている）を包含する。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプラスミドは、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などを包含する。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ、Ｔ．(The Molecular Biology of the Bacilli、Academic Press、ニューヨーク(1982)、pp.307-329) により開示された。適当なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプラスミドは、ｐＩＪ１０１(Kendall、K.J．ら、J.Bacteriol.169:4177-4183(198 7))、およびストレプトマイセスのバクテリオファージ、例えば、φＣ３１(Chat er、K.F.ら、Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology、Akade miai Kaido、ハンガリー国ブタペスト(1986)、pp.45-54)。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のプラスミドは、John、J.F.、ら(Rev.Infect.Dis.8:693-704(1986))、およびＩｚａｋｉ、Ｋ．(Jpn.J.Bacteriol.33:729-742(1978))により概観されている。好ましい真核性プラスミドは、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサークルなど、またはそれらの誘導体を包含する。このようなプラスミドはこの分野においてよく知られている(Botstein、D.、ら、Miami Wntr.Symp.19:265-274( 1982);Broach、J.R.、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces Lif e Cycle and Inheritanc e、Cold Spring Harbor Laboratory、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、p.445-470(1981);Broach、J.R.、Cell 28:203-2 04(1982);Bollo n、D.P.、ら、J.Clin.Hematol.Oncol.10:39-48(1980);Maniatis、 T.、Cell Biology:A Comprehensie Treatise、Vol.3、Gene sequence Expression、A cademic Press、ニューヨーク、pp.563-608(1980))。１または２以上の構成体を含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現のためにいったん調製されると、１または２以上のＤＮＡ構成体は種々の適当な手段のいずれによっても適当な宿主の中に導入することができる：形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラストの融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム−沈澱、直接的マイクロインジェクションなど。ベクターの導入後、受容体細胞を選択培地の中で増殖させ、この培地はベクターを含有する細胞の増殖について選択する。１または２以上のクローニングした遺伝子配列はＪａｋキナーゼの生産を生ずる。発現されたＪａｋキナーゼは、ここに記載するように、常用の方法、例えば、抽出、沈澱、免疫沈降、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などを使用して、単離および精製することができる。本発明を一般的に記載したが、本発明は下記の実施例を参照することによっていっそう容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示を目的として提供されそして本発明の限定を意図しない。実施例実施例１：ネズミＪａｋ２タンパク質チロシンキナーゼの構造およびＩＬ−３シグナルトランスダクションにおけるその役割要約インターロイキン３（ＩＬ−３）は、初期の祖先および種々の系列に拘束された細胞を包含する種々の造血細胞の増殖および分化を調節する。ＩＬ−３のレセプターはαおよびβサブユニットから成り、これらは一緒に高いアフィニティーのレセプターのために要求される。ＩＬ−３レセプターの鎖はサイトカインレセプターのファミリーの構成員であり、そして同定可能なキナーゼの触媒ドメインを欠如する細胞質ドメインを含有する。しかしながら、ＩＬ−３の結合はレセプターのβ鎖ならびにある数の細胞タンパク質のチロシンリン酸化を急速に誘導する。ＩＬ−３のシグナルのトランスダクションにおけるタンパク質チロシンキナーゼのＪａｋファミリーの潜在的役割を研究するために、われわれはネズミＪａｋ１およびＪａｋ２のための全長のｃＤＮＡクローンを獲得し、そして予測したタンパク質に対する抗血清を調製した。Ｊａｋ２に対する抗血清を使用して、ＩＬ−３の刺激がＪａｋ２の急速な特別のチロシンリン酸化を生じそしてそのｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を活性化することをわれわれは証明する。これらの結果は、Ｊａｋ２がＩＬ−３の結合をチロシンリン酸化に結び付け、そして究極的にＩＬ−３により伝達される生物学的応答に結び付けるという仮説を支持する。序論造血は種々の成長因子をそれらの同種のレセプターとの相互作用により調節される(Metcalf、D.、Nature 339:27-30(1989);ClarkおよびKamen、Science 236:1229 -1237(1987))。既知の造血成長因子の間で、インターロイキン−３（ＩＬ−３）は初期の祖先ならびにいくつかの骨髄系に拘束された細胞の増殖および分化を支持する(Ihle、J.N.、Interleukins:Molecular Biology and Immunology、Kishimoto 、T.、編、Karger、Basel、pp.65-106(1992))。ＩＬ−３のレセプターは、２つのサブユニット、すなわち、６０−７０ｋＤａのαサブユニットおよび１３０−１４０ｋＤａのβサブユニットから構成され、これらのサブユニットはＩＬ−３の高いアフィニティーの結合のために要求される(Miyajima、A.、ら、Annu.Rev.Immuno l.10:295-331(1992))。両方のαおよびβサブユニットは、サイトカインレセプターのスーパーファミリーにおいて見出される細胞外の保存されたモチーフを含有する。このスーパーファミリーの他の構成員に類似して、レセプターのサブユニットの細胞質ドメインは、他のサイトカインレセプターと制限された類似性のみを共有し、そしてシグナルトランスデューシング機構を示唆しうる検出可能な触媒ドメインを欠如する。触媒ドメインを欠如するにもかかわらず、かなりの証拠はシグナルのトランスダクションがチロシンリン酸化を含むことを示唆する(M etcalf、D.、Nature 339:27-30(1989);Miyajima、A.、ら、Annu.Rev.Immunol.10:29 5-331(1992))。詳しくは、活性化されたチロシンキナーゼはＩＬ−３の要件を除き、そしてＩＬ−３はいくつかの細胞の基質ならびにＩＬ−３レセプター複合体のβサブユニットのチロシンリン酸化を急速に誘導する。これらの理由で、レセプターに関連させることができそしてリガンドの結合により活性化することができるタンパク質チロシンキナーゼを同定することにおいて、かなりの興味がもたれてきた。シグナルのトランスダクションに関係しうるＩＬ−３依存性細胞の中で発現されるタンパク質チロシンキナーゼのスペクトルを同定するために、保存されたタンパク質チロシンキナーゼのドメインに対する縮重オリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した(Wilks、A.F.、Methods Enzymol. 200:533-546))。このアプローチおよびノザンブロット分析を使用して、ＩＬ− ３依存性細胞は、ｌｙｎ、Ｔｅｃ、ｃ−ｆｅｓ、Ｊａｋ１およびＪａｋ２を包含するある数のタンパク質チロシンキナーゼのための遺伝子を発現することが示された(Mano、H.ら、Oncogene 8:417-424(1993))。シグナルのトランスダクションにおけるｌｙｎキナーゼの潜在的掛かり合いは、ＩＬ−３の刺激が免疫沈降物においてｌｙｎキナーゼ活性を増加させることを示した最近の研究により示された(T origoe、T.、ら、Blood 80:617-624(1992))。しかしながら、ｌｙｎキナーゼ活性またはわれわれが検査したネズミＩＬ−３依存性細胞におけるｌｙｎチロシンリン酸化の状態へのＩＬ−３の作用をわれわれは検出しなかった。また、チロシンリン酸化またはＴｅｃまたはｃ−ｆｅｓのキナーゼ活性の活性化をわれわれは検出しなかった。従って、われわれの努力は、ＩＬ−３シグナルのトランスダクションにおけるネズミＪａｋ１およびＪａｋ２遺伝子の役割を評価するための試薬の開発に集中した。キナーゼのＪａｋ（Jａｎｕｓキナーゼ；また、適当な他のキナーゼ［ｊｕｓｔａｎｏｔｈｅｒｋｉｎａｓｅ］）ファミリーは、造血細胞の中のチロシンキナーゼのＰＣＲ増幅において最初に検出された(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad.S ci.USA 86:1603-1607(1989))。これらの研究は２つの密接に関係する遺伝子（ＦＤ１７およびＦＤ２２；後にＪａｋ２およびＪａｋ１と命名した）を同定し、これらから主要なＰＣＲ増幅生成物を誘導した。ヒトＪａｋ１遺伝子の完全な構造は報告され(Wilks、A.F.、Mol.Cell.Biol.11:2 057-2065(1991))そして、最近、ネズミＪａｋ２遺伝子の部分的配列が発表された(Harpur、A.G.、ら、Oncogene 7:1347-1353(1992))。独立に、ｃＤＮＡライブラリーをｃ−ｆｍｓ遺伝子からのチロシンキナーゼドメインのプローブでスクリーニングすることによって、ファミリーの第３構成員（Ｔｙｋ２）が単離された(F irmbach-Kraft、I.ら、Oncogene 5:1329-1336(1990))。このファミリーは２つのキナーゼドメインにより特徴づけられ、それらの１つはタンパク質キナーゼのすべての特質を有するカルボキシルドメインである。第２ドメインはアミノ末端にすぐ接して存在し、そしてタンパク質キナーゼのすべての特質を有するが、タンパク質チロシンおよびセリン／スレオニンの両方のキナーゼと有意に異なる。キナーゼドメインに対してアミノ末端に、非レセプターのチロシンキナーゼの大部分を特性決定するＳＨ２およびＳＨ３ドメインは存在しない。しかしながら、Ｊａｋファミリーの構成員の間に広範な類似性が存在し、そしてある数の相同性のドメインが定められた(Harpur、A.G.、ら、Oncogene 7:1347-1353(1992))。インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）に対する細胞の応答を検査する最近の研究において、シグナルのトランスダクションにおけるキナーゼのＪａｋファミリーの１つの構成員の間の連鎖が確立された(Velazquez、L．ら、Cell 70:313-322 (1992))。遺伝のアプローチを使用して、ＩＦＮαに対する非応答性の突然変異のヒト細胞系において、ＩＦＮαに対する細胞の応答を機能的に再構成する能力によって、Ｔｙｋ２遺伝子をクローニングした。Ｔｙｋ２のキナーゼ活性をＩＦＮαの結合後に活性化し、そしてインターフェロンで刺激した遺伝子因子３α（ＩＳＦＦα）複合体の１１３および９１／８４ｋＤａのタンパク質のリン酸化の原因となる(Fu、X.Y.、Cell 70:323-335(1992);Schindler、C.、ら、Science 257:809 -813(1992))。リン酸化後、この複合体はＩＳＧＦ３γタンパク質と連合し、そして複合体は核に移動しそしてインターフェロンで刺激された応答要素に結合することによって遺伝子の発現を活性化する。エリトロポイエチン（ＥＰＯ）に対する応答におけるＪａｋ２の役割は実施例２に記載されている。記載する研究は、ＥＰＯの刺激がＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導しそしてそのｉｎｖｉｔｒｏの自己リン酸化活性を活性化することを証明した。１系列のＥＰＯＲの突然変異体を使用して、Ｊａｋ２チロシンリン酸化の誘導は生物学的応答の誘導と相関することが発見された。Ｊａｋ２は、また、生物学的活性のために要求されるＥＰＯレセプターの膜近位の細胞質領域と物理的に関連する(associate)ことが示された。ここに提示する研究において、われわれははネズミＪａｋ２遺伝子の完全な構造を開示する。Ｊａｋ２はＩＬ−３に応答して急速にチロシンリン酸化され、そしてそのｉｎｖｉｔｒｏ自己リン酸化活性の関連した活性化が存在することを、われわれは証明する。Ｊａｋ２はＩＬ−３刺激をチロシンリン酸化に連結し、究極的に生物学的応答に連結するタンパク質チロシンキナーゼであるという証拠を結果は提供する。そのうえ、ＩＬ−３およびＥＰＯの両方に対する応答におけるＪａｋ２の掛かり合いは、Ｊａｋ２、またはファミリーの構成員が種々の造血成長因子のレセプターの有糸分裂誘発性シグナリング経路に関係することを示す。材料および方法ネズミＪａｋ２クローンの単離。保存されたドメインに相当する縮重オリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、前述したようにネズミ骨髄誘導単球からｃＤＮＡを増幅した(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad .Sci.USA 86:1603-1607(1989))。Ｊａｋ２ｃＤＮＡクローンをランダムプライミングにより³²Ｐ標識化し、そしてネズミ単球およびＩＬ−３依存性骨髄性ＮＦＳ５８およびＤＡ３細胞ファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した(Yi およびWillman、Oncogene 4:1081-1087(1989);Morishita、K.、ら、 Cell 54:831-840(1988);BartholomewおよびIhle、Mol.Cell.Biol.11:1820-1828( 1991))。単離したｃＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの中にクローニングし、そして制限マッピングおよび配列決定により分析した。大部分の５’ Ｊａｋ２ｃＤＮＡ断片を使用して、引き続くファージライブラリーのスクリーニングを実施した。最長のｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの中にサブクローニングし、そしてジデオキシ連鎖停止法によりヌクレオチド配列を決定した(Sanger、F.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467(1977))。ノザン分析。全体の細胞のＲＮＡおよびポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、従来記載されているように、マウスの組織および細胞系から単離した(Cleveland、J.L.、ら、 Mol.Cell.Biol.9:5685-5695(1989))。ほぼ２０μｇの完全ＲＮＡおよび４μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを１．０％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離し、そしてニトロセルロースのフィルターに移した。フィルターを³²Ｐ標識化ランダムプライムド８００ｂｐのｃＤＮＡ断片をＪａｋ２の５’から誘導した。オートラジオグラフィー後、フィルターをストリッピングし、そしてβ−アクチンでプロービングした。細胞および細胞の培養。これらの研究において使用した細胞系の性質は記載された(Ihle およびAskew、Int.J.Cell.Cloning 1:1-30(1989))。１０％胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）およびＩＬ３依存性細胞のためにネズミＩＬ−３（２５Ｕ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩの中で細胞を維持した。マウス骨髄誘導単球を従来記載されているように増殖させた(Yi およびWillman、Oncogene 4:1081-1087(1989)) 。コンピューター分析。ジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）の配列分析のソフトウェアで、ＤＮＡおよびタンパク質のデータベースをサーチした。ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのプログラムで、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴおよびＧＥＮＢＡＮＫのデータベースをサーチした。抗体の発生。Ｊａｋ２タンパク質のＮ−末端部分（アミノ酸１９−３１）およびドメイン１および２の間のヒンジ領域（アミノ酸７５８−７７６(配列番号：５)）に相当する合成ペプチドをＭＥＳカップリングによりキーホールリンペットヘモシアニンにカップリングし、そしてウサギの免疫化のために使用した。Ｊａｋ１の類似のヒンジ領域（アミノ酸７８６−８０４(配列番号：６)）に対する合成ペプチドを同様に調製し、そして競合の研究のために使用した。特記しない限り、Ｊａｋ２抗体または抗ペプチド抗体、およびＪａｋ２抗体を含む操作に対する示した言及は、ヒンジ領域（アミノ酸７５８−７７６(配列番号：５)）に対して発生した抗体を呼ぶ。ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳および転写。全長のＪａｋ１またはＪａｋ２のｃＤＮＡをｐＢＳＫ（ストラタジーン［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ］）の中に挿入し、そして提供されたプロトコールに従いＴ３ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写体の調製に使用した。ほぼ３μｇのＲＮＡを、³⁵Ｓトランスラベル（ＮＥＮ）の存在において、翻訳反応（ストラタジーン）に使用した。生成物を等しく分割し、そして操作なしにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開するか、またはＪａｋ１またはＪａｋ２抗血清で免疫沈降させた。使用前に、ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）を抗血清と４℃において１時間インキュベートすることによって、ペプチドの競合は実施した。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。プロテインＡ−セファローズ（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上の免疫沈降タンパク質をキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＭｎＣｌ₂、０．１ｍＭのＮａ₂ＶＯ₄、１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４）で洗浄し、そして引き続いて室温において等しい体積の０．２５ｍＣｉ／ｍｌの³²Ｐ−γ−ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液と３０分間インキュベートした。よく洗浄した後、調製をＳＤＳ−ＰＡＧＥのための試料緩衝液で溶離し、そして７％ゲル上で分離した。³²Ｐを含有するタンパク質をオートラジオグラフィーにより可視化した。ｉｎｖｉｔｒｏリン酸化Ｊａｋ２をゲルスライスから単離し、そしてホスホアミノ酸含量を発表された手順により決定した(Cooper、J.A.、ら、Methods Enzymol.99:387-40 2(1983))。結果チロシンキナーゼドメインの保存された領域に相当する縮重オリゴヌクレオチドを使用して、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）により、造血成長因子依存性細胞の中で発現されたタンパク質チロシンキナーゼのスペクトルを定した(Wilks、A.F.、Methods Enzymol.200:533-546(1991))。最も頻繁に単離されたｃＤＮＡクローンはクローンＦＤ１７（再びＪａｋ２と命名した）と同一であることが発見された(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1603-1607(198 9))。初期の発現の分析において、Ｊａｋ２は造血細胞の中で豊富にかつ広く発現されることが示され、そして機能の研究のために全長のｃＤＮＡクローンを得ることにした。ネズミ骨髄性ｃＤＮＡライブラリーはいくつかのオーバーラップするクローンの単離を生じ、それらのうちで最長のもの（４ｋｂ）はＪａｋ２の全体のコーディング領域を含有した。Ｊａｋ２のヌクレオチド配列は３３８７ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、そして５’末端は第１ＡＴＧの前に３つの停止コドンを有する（第１図）。第１ＡＴＧはＫｏｚａｋコンセンサスフランキング配列を満足しないが、そのすぐ後に典型的な転写開始環境の中にＡＴＧコドンが存在する(K ozak、M.、Nucl.Acids Res.15:8125-8148(1987))。５’末端は明らかなシグナルペプチドを含有しない。Ｊａｋ２クローンの３’−非翻訳領域のコンパイルした大きさは０．９ｋｂであり、これは４．４ｋｂの転写体に相当する。１つのｃＤＮＡクローンはヌクレオチド３２７１で分岐し、そして１．４ｋｂの３’−非翻訳領域を有した。このｃＤＮＡのための転写体は４．８ｋｂであり、そして典型的に見られるより大きい転写体に相当する（下を参照）。Ｊａｋ２のＯＲＦは、１３０ｋＤａの計算分子量をもつ１１２９アミノ酸のタンパク質をエンコードする。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｅのアルゴリズムを使用する親水性の分析は、トランスメンブレン領域を同定できなかった。これらの研究過程の間に、Ｊａｋ２の部分的配列が発表され(Harpur、A.G.、Oncogene 7: 1347-1353(1992))、これは最初の１４３アミノ酸を欠如した。配列を比較すると、アミノ酸の９つの変化を生ずる、コーディング領域の７１ヌクレオチドの差が示される（第１図）。われわれが得たｃＤＮＡクローンは、Ｈａｒｐｕｒらの研究 (Oncogene 7:1347-1353(1992))の４つのｃＤＮＡクローンのうちの１つの中に見出される位置７１１に７アミノ酸の挿入を含有しなかった。ネズミＪａｋ２遺伝子は、ヒトＴｙｋ２およびＪａｋ１遺伝子を包含する他のＪａｋファミリーの構成員に非常に密接に関係する（それぞれ、４２％および４３％）。われわれは、また、ネズミＪａｋ１遺伝子のための全長のｃＤＮＡクローンを獲得し、これはコーディング領域においてヌクレオチドのレベルでＪａｋ２に対して４５．５％の同一性を有した。このファミリーの他の構成員と同様に、ネズミＪａｋ２タンパク質は、明らかなＳＨ２またはＳＨ３ドメインを欠如する６００アミノ酸長さのＮ−末端を有する。この後に、キナーゼに関係するドメイン（ドメイン２）およびカルボキシルキナーゼドメイン（ドメイン１）が存在する。カルボキシルキナーゼドメインは、タンパク質チロシンキナーゼに特徴的に関連するサブドメインＶＩ〜ＶＩＩＩの中に保存された残基を包含する、タンパク質チロシンキナーゼに関連する構造的および機能的モチーフのすべてを含有する(Hanks、S.K．ら、Science 241:42-52 (1988))。サブドメインＶＩＩＩは、ハイブリダイゼーションして基質認識に寄与し、Ｊａｋファミリーのすべての構成員において見出されるユニークなＦ−Ｗ −Ｙモチーフを示す。ドメイン２はアミノ酸５４３において開始し、そしてタンパク質キナーゼの１１の保存された構造のサブドメインのすべてを同定することができる。しかしながら、臨界的なサブドメインＩ，ＩＩ，ＶＩおよびＶＩＩＩにおけるアミノ酸の組成および間隔の明瞭な差(Hanks、S.K．ら、Science 241:42- 52(1988))は、このドメインが調節機能を有するか、または現在未知の基質の特異性を示す可能性を生ずる。Ｊａｋファミリーのタンパク質のＮ−末端はキナーゼのドメインより相同性が低い（３６〜３９％／４９〜５６％）が、Ｊａｋタンパク質のＮ−末端の配列を比較すると、相同性のいくつかのストレッチを明らかにする。Ｊａｋ２のＮ−末端の配列を使用するデータベースのサーチは他のタンパク質との有意な相同性を示さなかったが、いくつかの高度に保存されたアミノ酸ドメインの存在はＪａｋタンパク質が機能的に関係することを示す。Ｊａｋの相同ドメイン３を厳密に比較すると、ＳＨ２ドメインに対する多少の類似性が示されるが、配列の類似性の機能的意味は決定されていない。Ｊａｋ２の発現パターンを下記のマウス組織におけるノザンブロット分析により研究した：骨髄、輸卵管、卵巣、精巣、胃、腸、骨格筋、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、脳、胎児脳、胎児肝臓、胎児腸、および胎児肺。Ｊａｋ２の発現のパターンを、また、下記の細胞系においてノザンブロット分析により研究した：線維芽（ＮＩＨ３Ｔ３）；骨髄性細胞（３２Ｄ．３、ＮＦＳ−７０、ＮＦＳ−１０７、ＮＦＳ−１２４、ＤＡ−３、ＤＡ−２２、ＤＡ−２９、ＤＡ３１、ＤＡ−２４、Ｍ１）、マスト細胞系（ＡＦＳＴｈ２）、Ｂ−細胞（ＤＡ−８、ＮＦＳ−１１２、プラズマ細胞腫）、Ｔ−細胞（ＤＡ−２、ＥＬ−４、Ｒ−１２）およびマクロファージ細胞系（ＢＡＣ１．２Ｆ５）。４．４および４．８ｋｂの２つの転写体は試験したすべての組織および細胞系において検出されたが、２つの転写体の発現レベルおよび比較的発生量は変化した。より小さい転写体は骨格筋、脾臓および輸卵管において最も豊富でありそして肝臓、腎および腸においてめったに検出可能ではなかった。成体の肝臓におけるＪａｋ２の発現レベルは非常に低かったが、いっそう豊富なメッセージは胎児肝臓において検出された。Ｊａｋ２の発現は、３Ｔ３線維芽、Ｂリンパ球系および分化および増殖の要件の異なる段階を表す種々の骨髄性細胞を包含する、すべての２０の細胞系において検出された。Ｊａｋ２タンパク質を生化学的に特性決定するために、ネズミＪａｋ１に関してＪａｋ２についてユニークな領域（アミノ酸７５８−７７６(配列番号：５)）に対して抗ペプチド抗血清を調製した。この抗血清の反応性を最初に評価するために、ｉｎｖｉｔｒｏで合成したＪａｋ２を使用して免疫沈降を実施した。Ｊａｋ２ＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳は期待した１３０ｋＤａのタンパク質を与えた。この１３０ｋＤａのタンパク質は、Ｊａｋ２抗ペプチド抗血清で免疫沈降したが、その配列がＪａｋ２の中に見出せないペプチドに対して調製した無関係の抗血清により免疫沈降しなかった。免疫沈降はＪａｋ２抗血清をレイズさせた相同ペプチドにより完結したが、無関係のペプチドまたはＪａｋ１の相同領域であるペプチドにより完結しなかった。Ｊａｋ２抗ペプチド抗血清はｉｎｖｉｔｒｏで合成したＪａｋ１を免疫沈降させなかった。最後に、Ｊａｋ２抗ペプチド抗血清は、また、相同ペプチドが特異的に競合したｉｎｖｉｖｏメチオニン標識化細胞からの、匹敵する１３０ｋＤａのタンパク質を免疫沈降させた。これらの結果から、Ｊａｋ２ｃＤＮＡは１３０ｋＤａのタンパク質をエンコードし、そして抗ペプチド抗血清はＪａｋ２タンパク質を特異的に認識することが証明される。成長因子依存性のＩＬ−３刺激は、ＩＬ−３レセプターのβサブユニットを包含するいくつかの細胞の基質のチロシンリン酸化を急速に誘導する(Ihle、J.N.、 Interleukins:Molecular Biology and Immunology、Kishimoto、T．編、Karger、Ba sel、pp.65-106(1992);Sorensen、P.、ら、J.Biol.Chem.264:19253-19258(1989))。従って、Ｊａｋ２がチロシンリン酸化の基質でありうる可能性をわれわれは検査した。ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（４Ｇ１０）を使用する全体の細胞リゼイトのウェスタンブロットにより、ＩＬ−３刺激後、１３０〜１４０ｋＤａにおける広いバンド、７０ｋＤａにおける小さいバンドおよび５５ｋＤａ、５０ｋＤａおよび３８ｋＤａにおける主要なバンドを含む、いくつかのタンパク質の出現が検出された。細胞抽出物をＪａｋ２抗ペプチド抗血清で免疫沈降させたとき、１３０ｋＤａのタンパク質は刺激した細胞において容易に検出されたが、未刺激の細胞において検出されなかった。また、Ｊａｋ２と共免疫沈降した１１０ｋＤａ、７０ｋＤａおよび６０ｋＤａの誘導されたタンパク質の存在に注意すべきである。これらの基質はＪａｋ２の免疫沈降において絶えず見られた。ネズミＪａｋ１に対する抗血清を使用する免疫沈降は、１３０ｋＤａに弱いバンドを絶えず検出し、Ｊａｋ１がまた基質でありうることを示す。ＩＬ−３のβ鎖の誘導可能なチロシンリン酸化は、ＩＬ−３刺激細胞においてＪａｋ２に関してわずかに減少した移動度をもつ拡散バンドとして、αＩＬ３Ｒβ抗血清で免疫沈降させた抽出物において観察された。従って、全体の細胞リゼイトにおいて見られた広いバンドは、Ｊａｋ２およびＩＬ−３β鎖の両方から成る。ＩＬ−３がＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導することをさらに確立するために、応答の反応速度論およびホスホチロシンに対する第２モノクローナル抗体を使用する誘導を検出する能力を検査した。細胞をＩＬ−３で刺激しそしてホスホチロシンを含有する画分を１Ｇ２抗ホスホチロシンモノクローナル抗体を含有するセファローズビーズへの結合およびそれからの溶離により単離したとき、Ｊａｋ２はＪａｋ２抗ペプチド抗血清を使用するウェスタンブロットにおいて容易に検出された。匹敵する１３０ｋＤａのバンドは未刺激の細胞において検出されなかった。Ｊａｋ２のチロシンリン酸化は５分のＩＬ−３刺激後容易に明らかであり、そして引き続いてＩＬ−３刺激後に見られるチロシンリン酸化の全体的パターンに匹敵する方法で減少した(Isfort、R.、ら、J.Biol.Chem.263:19203-19029(1988)) 。この期間（ＩＬ−３刺激後０〜１２０分）の間に、Ｊａｋ２抗ペプチド抗血清を使用するウェスタンブロットにより評価して、Ｊａｋ２のレベルは変化しなかった。ＩＬ−３の結合がＪａｋ２キナーゼ活性に影響を与えるかどうかを決定するために、細胞をＩＬ−３で１０分間刺激し、Ｊａｋ２を免疫沈降させそしてｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。結果を第４図に示す。抽出物を正常のウサギ血清で免疫沈降させたとき、未刺激または刺激した細胞からの抽出物を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏのキナーゼ活性は検出されなかった。しかしながら、抽出物をＪａｋ２抗ペプチド抗血清で免疫沈降させたとき、免疫沈降したＪａｋ２と共移動したＩＬ−３刺激細胞からの抽出物で、１３０ｋＤａが容易に検出された。対照的に、未刺激の細胞の抽出物を使用したとき、１３０ｋＤａのバンドは検出されなかった。１３０ｋＤａのバンドのホスホアミノ酸分析は主としてホスホチロシンの存在を証明した。興味あることには、ＩｇＧの重鎖を含む、これらのｉｎｖｉｔｒｏ反応においてリン酸化された他の主要なタンパク質のバンドは存在しなかった（第３図）。後述するように、これはＪａｋ２キナーゼの基質特異性を反映することがある。Ｊａｋ２に対する特異性はキナーゼ活性の沈降をブロックする対応するペプチドの能力により示されるが、Ｊａｋ１の対応する領域に対するペプチドは作用をもたなかった。データを総合すると、ＩＬ−３の刺激はＪａｋ２のチロシンリン酸化およびその自己リン酸化活性の活性化を生ずることが証明される。論考われわれの研究は、ネズミＪａｋ２遺伝子の最初の完全な配列を提供する。３系統の証拠は、われわれが得たｃＤＮＡクローンが全体のコーディング領域を含有することを示す。第１に、ネズミＪａｋ２の５’配列をヒトＴｙｋ２およびＪａｋ１の発表された配列と比較すると、すべてのタンパク質は同一部位において開始することが示される。第２に、すべてのリーディングフレームにおいて最初のＡＴＧの前に停止コドンが存在する。最後に、コンパイルしたｃＤＮＡの大きさは４．４および４．８ｋｂの大きさの転写体と一致する。われわれのＪａｋ２ｃＤＮＡの配列は遺伝子の発表された部分的配列から変化し(Harpur、A.G.、ら、Oncogene 7:1347-1353(1992))、そして９アミノ酸の変化を含み、それらの７つは同類置換である。われわれのｃＤＮＡクローンは、発表された配列の中のＪａｋ２ｃＤＮＡクローンの１つにおいて見出される、７アミノ酸のインサートを欠如した。同様な推定上の追加のエクソンは、また、ヒトＴｙｋ２ｃＤＮＡにおいて観察された(Velazquez、L.、ら、Cell 70:313-322(1992))。造血成長因子依存性細胞のＩＬ−３刺激は、ある数の細胞の基質のチロシンリン酸化を急速に誘導することが示された(Ihle、J.N.、Intrleukins:Molecular Bio logy and Immunology、Kishimoto、T.、編、Karger、Basel、pp.65-106(1992));Ihl e、 J.N.、Peptide Growth Factors and Their Receptors、Sporn and Roberts、編、Sp ringer Verlag、ニューヨーク(1990))。われわれの結果は、これらの基質の１つがＪａｋ２であることを証明する(Ihle、J.N.、Intrleukins:Molecular Biology and Imm unology、Kishimoto、T.、編、Karger、Basel、pp.65-106(1992))。ＩＬ−３依存性細胞において発現されそしてわれわれが検査することができたタンパク質の間に、Ｊａｋ２に対する顕著な特異性が存在した。特に、ｌｙｎ、ｔｅｃまたはｃ−ｆｅｓのチロシンリン酸化における変化をわれわれは検出しなかった。しかしながら、ＩＬ−３刺激後にＪａｋ１の低いレベルのチロシンリン酸化をわれわれは絶えず見た。これは使用した抗血清の交差反応性のためではなくそして、Ｊａｋ１およびＪａｋ２の両方は細胞の中で匹敵する局所的で発現されるので、タンパク質レベルの差のためではない。従って、Ｊａｋ１はＩＬ−３レセプター複合体に弱く連合するために十分な類似性を共有するようである。また、潜在的自己リン酸化部位においてＪａｋ１とＪａｋ２との間でかなりの配列の相同性が存在するので、Ｊａｋ１はＪａｋ２のための基質であることができる。今日まで、ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいてＪａｋ１に対するＩＬ−３刺激の作用をわれわれは検出しなかった。ＩＬ−３刺激は、Ｊａｋ２のチロシンリン酸化の誘導およびｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性におけるＪａｋ２の活性化の両方を生ずる。Ｊａｋ２のカルボキシルタンパク質チロシンキナーゼのドメインは、ある数のキナーゼの活性化キナーゼ活性に関連する特徴をなす自己リン酸化部位を含有する(Hanks、S.K.、ら、Scien ce 241:42-52(1988))。ｉｎｖｉｖｏチロシンリン酸化は、チロシンリン酸化および検出可能なｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性の付随的出現に基づいて、この部位において起こることが期待される。キナーゼ活性の検出のためのＩＬ−３の結合の要件は、Ｊａｋ２キナーゼ活性が細胞において高度に調節され、成長の調節における主要な回転に一致することを示す。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ反応の主要な基質はＪａｋ２であった。特に、免疫グロブリンの検出可能なリン酸化は存在せず、また、Ｊａｋ２の基質であるエノラーゼは存在せず、Ｊａｋ２は厳格な基質の特異性を有することができることを示す。レセプターの活性化のための要件および基質の特異性は、従来の研究における種々の条件下にＪａｋ１タンパク質チロシンキナーゼ活性を証明できないことを説明できるであろう(Wilks、A.F.、ら、Mol.Cell.Biol.11.2057-2065)) 。Ｊａｋ２は、また、ＥＰＯ刺激後に、チロシンリン酸化されかつ活性化される（実施例２参照）。そのうえ、これらの研究は、Ｊａｋ２が機能のために必須であるＥＰＯレセプター（ＥＰＯＲ）の細胞質ドメインの膜近位領域に物理的に関連することを証明した。Ｊａｋ２がＩＬ−３レセプターの一方または両方のサブユニットに物理的に関連するかどうかは、現在、試験されている。しかしながら、ＥＰＯＲと同様に、ＩＬ−３レセプターのβサブユニットは急速にチロシンリン酸化され、そしてこのリン酸化はＪａｋ２により伝達されると仮定することができる。ＥＰＯＲの場合において、チロシンリン酸化は細胞質のカルボキシル末端の中の部位において起こり、そしてこの領域は有糸分裂誘発のために要求されない。ＩＬ−３のβサブユニットのチロシンリン酸化が生物学的応答に寄与するかどうかは知られていない。Ｔｙｋ２のチロシンリン酸化および活性化を誘導するＩＬ−３およびＥＰＯの両方の能力は、Ｊａｋ２がいくつかのサイトカインレセプターのシグナル・トランスデューシング経路における１成分である可能性を示す。われわれは、また、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦがＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導することを発見した。これは、これらの造血成長因子がチロシンリン酸化の匹敵するパターンを誘導することを示したいくつかの研究と一致する（Ｉｈｌｅ、Ｊ．Ｎ．、In terleukins:Molecular Biology and Immunology、Kishimoto、T.編、Karger、Basel、 pp.65-106(1992)。われわれは、また、マクロファージ細胞系においてＩＦＮγ に応答するＪａｋ２のチロシンリン酸化を観察した。造血成長因子のレセプターは、また、成長ホルモンのレセプター、プロラクチンのレセプター、毛様好中性因子などを包含する、レセプターのスーパーファミリーの構成員に示す(Bazan、J.F.、Science 257:410-413(1992))。そのうえ、インターフェロンのレセプターは、それほど関係がないが、共通の祖先から進化したと推測られきている。最近の研究(Velazquez、L.、ら、Cell 70:313-322(1992))は、Ｔｙｋ２がＩＦＮαのシグナリングに関係することを示した。われわれの研究において、ＩＬ−３およびＥＰＯ（実施例２参照）ならびにＧ−ＣＳＦ、ＧＭ− ＣＳＦおよびＩＦＮγのシグナリング経路に関係することが示された。さらに、最近研究は成長ホルモンに対する応答にＪａｋ２を関係させた。従って、Ｊａｋキナーゼのファミリーは、レセプターのサイトカイン／インターフェロンのスーパーファミリーのいくつかの構成員が利用する、シグナル・トランスデューシングに関係する。そのうえ、キナーゼのＪａｋファミリーは、また、ＩＳＧＦ３α タンパク質(Schindler、C.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7836-7839(1992);Fu 、X-Y.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7840-7843(1992))およびＩＣＳＢＰ、ＩＲＦＩ、ＩＲＦ２および多分ｍｙｂを包含するＩＳＧＦ３γが関係するＤＮＡの結合タンパク質(Veals、S.A.、ら、Mol.Cell.Biol.12:3315-3324(1992))に関係するファミリーの構成員を含む匹敵する経路を通して、遺伝子の発現を調節することができる。実施例２：Ｊａｋ２はエリトロポイエチンレセプターと関連し、そしてエリトロポイエチンで刺激後チロシンリン酸化および活性化される要約エリトロポイエチン（ＥＰＯ）は、そのレセプター（ＥＰＯＲ）とのその相互作用を通して、赤血球系細胞の増殖および末端の分化を調節する。ＥＰＯＲはサイトカインレセプターのファミリーの構成員であり、そして同定可能なキナーゼの触媒ドメインを欠如する細胞質ドメインを含有する。しかしながら、ＥＰＯの結合は、ＥＰＯＲならびにある数の細胞のタンパク質のチロシンリン酸化を急速に誘導する。チロシンリン酸化を誘導する能力は、すぐ接した初期の遺伝子の転写を誘導しかつ有糸分裂誘発性であるというレセプターの能力と密接に相関する。これらの生物学的応答は、レセプターの細胞質ドメインの膜近位領域を必要とすることが示された。ここで、われわれは、タンパク質のチロシンリン酸化の基質の１つが１３０ｋＤａのＪａｋ２、すなわち、タンパク質チロシンキナーゼであることを証明する。そのうえ、ＥＰＯの刺激はＪａｋ２のｉｎｖｉｔｒｏ自己リン酸化活性を活性化する。ＥＰＯＲの１系列の突然変異体を使用して、Ｊａｋ２のチロシンリン酸化の誘導および自己リン酸化活性は生物学的応答と相関することが発見された。さらに、Ｊａｋ２は生物学的活性のために要求されるＥＰＯＲの細胞質ドメインの膜近位領域と物理的に関連することをわれわれはを示す。結果を総合すると、Ｊａｋ２はＥＰＯの結合をチロシンリン酸化に連結し、そして究極的に赤血球形成に要求される生物学的応答に連結するキナーゼであることを示す。序論造血は種々の造血成長因子とそれらの同種のレセプターとの相互作用を通して調節される(ClarkおよびKamen、Science 236:1229-1237(1987);Metcalf、D.、 Nature 339:27-30(1989))。造血成長因子のレセプターの大部分は、細胞外ドメインにおける４つの位置的に保存されたシトシンおよびＷＳＸＷＳ（配列番号：１）のモチーフの存在により特徴づけられる、共通のサイトカインレセプターに属する。このファミリーは、また、変動する大きさの細胞質ドメインにより特徴づけられ、このドメインは非常に限定された配列の類似性を示しそしてシグナル・トランスデューシング機構を示すことができる同定可能なモチーフを含有しない。エリトロポイエチン（ＥＰＯ）は、赤血球の系列に拘束された細胞の増殖および末端の分化をユニークに支持する造血成長因子である(Krantz、S.B.、Blood 7 7:419-434(1991))。ＥＰＯレセプター（ＥＰＯＲ）を発現クローニングによりクローニングされ(D'Andrea ら、Cell 57:277-285(1989))そしてｃＤＮＡの配列は単一の膜スパニングドメインおよびサイトカインレセプターのスーパーファミリーに関連するモチーフをもつ、５０７アミノ酸のタンパク質を予測する。造血成長因子のレセプターのいくつかと異なり、単一の遺伝子産物はＥＰＯの結合および機能のために十分同定ことが示された(D'Andrea ら、Cell 57:277-285(1989)) 。ＩＬ−３依存性細胞系の中へのＥＰＯＲの導入はＥＰＯに応答して増殖する能力を細胞に付与し、そしてこれはレセプターのシグナルのトランスダクションを研究するために重要なモデルを提供した(D'Andrea ら、Cell 57:277-285(1989);M iura ら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991))。トランスフェクションされた細胞において、ＥＰＯはｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｐｉｍ−１およびｅｇｒ− １を包含する１系列のすぐ接する初期の遺伝子の発現を誘導する(Miuraら、Mol.C ell.Biol.13:1788-1795(1993))。さらに、ＥＰＯは１系列の細胞の基質の急速なチロシンリン酸化を誘導し(Linnekin ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6237-6241 (1992);Dusanter-Fourt ら、J.Biol.Chem.267:10670-10675(1992);Quelle およびWojchowsiki、J.Biol.Chem.266:609-614(1991);Miura ら、Mol.Cell.Biol.114 895-4902(1991);Yoshimura およびLodish、Mol.Cell.Biol.12:706-715(1992);Dam en ら、Blood 80:1923-1932(1992))、ＥＰＯＲがリガンドの結合をタンパク質チロシンキナーゼの活性化に連結することによって機能できることを示唆する。チロシンリン酸化を誘導したＥＰＯの基質の１つはレセプターである(Dusanter-Fo urt ら、J.Biol.Chem.267:10670-10675(1992);YoshimuraおよびLodish、Mol.Cell. Biol.12:706-715(1992);Miura ら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991))。ＥＰＯＲの細胞質ドメインは２３６アミノ酸から成り、そしてＩＬ−２レセプターのβ鎖の細胞質ドメインに対する多少のアミノ酸配列の類似性を含有する(D 'Andrea ら、Cell 58:1023-1024(1989))。ＥＰＯＲは、また、ボックス１および２という名称の、サイトカインレセプターの保存されたドメインに対する類似性を有する領域を含有し、前記ドメインは最初にＩＬ−６のシグナル・トランスデューシングｓｐ１３０タンパク質において定められた(Murakami ら、Proc.Natl.A cad.Sci.USA 88:11349-11353(1991))。細胞質ドメインの膜近位領域は、レセプターの生物学的活性のために必須であることが示された。１０８アミノ酸のカルボキシル・トランケーションは、すぐ接する初期の遺伝子を誘導し、チロシンリン酸化を誘導し、または有糸分裂誘発を引き起こすレセプターの能力に作用をもたない(Miuraら、Mol.Cell.Biol.13:1788-1795(1993)；Miura ら、Mol．Cell.Biol .11:4895-4902(1991))。いくつかの細胞系において、カルボキシル・トランケーションは有糸分裂誘発の応答を増加し(D'Andrea ら、Mol.Cell.Biol．11:1980-19 87(1991a))、膜遠位領域がＥＰＯに対する応答にマイナスの影響を与えることを示唆する。膜近位領域内において、カルボキシル・トランケーションまたはボックス１およびボックス２の欠失はすべての生物学的活性についてレセプターを不活性化することができる(Miuraら、Mol.Cell.Biol.13:1788-1795(1993);Miura ら、Mol. Cell.Biol.11:4895-4902(1991))。この領域の重要性は、さらに、ボックス１とボックス２との間の保存されたＴｒｐ残基の突然変異による反応機能の不活性化によって証明された。結果を総合すると、ＥＰＯＲの膜近位領域は、チロシンリン酸化の誘導を包含する、検査した生物学的応答のすべてに必須であることが証明される。生物学的活性のためのタンパク質のチロシンリン酸化に連結するためのＥＰＯＲの重要性は明瞭に証明されたが、関係しうるキナーゼに関してほとんど知られてきていない。ＥＰＯＲのカルボキシル領域のチロシンリン酸化の急速な誘導(M iuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991);Yoshimura およびLodish、Mol.Cell. Biol.12:706-715(1992);Dusanter-Fourt ら、J.Biol.Chem.267:0670-10675(1992) )は、レセプターが、構成的にまたはリガンドの結合後に、キナーゼと密接に関連することを示唆する。１つの研究(YoshimuraおよびLodish、12:706-715(1992)) は１３０ｋＤａの非グリコシル化タンパク質を同定し、このタンパク質はレセプターと架橋することができ、そして抗ホスホチロシン抗体により検出される能力により評価して、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいてチロシンリン酸化された。この１３０ｋＤａがキナーゼであるかどうかを決定することができなかった。最近の研究(Linnekin ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6237-6241(1992))は、また、ＡＴＰのアジド誘導体で放射性標識化することができ、それがキナーゼであることを示唆する、チロシンリン酸化の９７ｋＤａの基質を同定した。１３０ｋＤａまたは９７ｋＤａの潜在的キナーゼが従来特徴づけられているかどうかは決定されなかった。ＥＰＯのシグナルのトランスダクションに関係しうる、潜在的に新規なタンパク質チロシンキナーゼを検出するために、われわれは下記の文献に記載されているものに匹敵するＰＣＲ増幅のアプローチを利用した：Wilks、A.F.、Proc.Natl.A cad.Sci.USA 86:1603-1607(1989)。Wilks ら(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:1603-1607(1989);Wilks ら、Mol.Cell.Biol.11:2057-2065(1991))ならびに他の研究者ら(Partanen ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8913-8917(1990))の研究と同様に、生成物のうちの２つは２つの密接に関係する遺伝子（Ｊａｋ１およびＪａｋ２）をエンコードし、これらの遺伝子はＪａｎｕｓキナーゼ（また、適当な他のキナーゼファミリーと呼ぶ）を構成し、Ｊａｎｕｓキナーゼは、また、Ｔｙｋ２遺伝子を含む(Firmbach-Kraft ら、Oncogene 5:1329-1336(1990))。Ｔｙｋ２遺伝子産物は、最近、インターフェロンａ（ＩＮＦα）レセプターによるシグナルのトランスダクションと関係づけられた(Velazquezら、Cell 70:313-322 (1992))。造血のシグナルのトランスダクションにおけるＪａｋ１およびＪａｋ２遺伝子の潜在的役割を探査するために、われわれはネズミ遺伝子のための全長のｃＤＮＡクローンを単離し、そしてタンパク質に対する抗血清を調製した（実施例１参照）。ＥＰＯの刺激がＪａｋ２の特異的チロシンリン酸化を急速に誘導し、そしてそのｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を活性化することを、われわれはここに報告する。チロシンリン酸化の誘導およびキナーゼ活性の活性化は、有糸分裂誘発のために必須であるＥＰＯＲの細胞質ドメインの膜近位領域に依存する。最後に、Ｊａｋ２はＥＰＯＲに物理的に関連し、そしてこの関連は膜近位領域を必要とすることをわれわれは証明する。データを総合すると、Ｊａｋ２はＥＰＯＲのシグナルのトランスダクションに関係することが証明される。結果Ｊａｋ２はＥＰＯ刺激後に特異的にかつ急速にチロシンリン酸化されるＥＰＯは、ＥＰＯのレセプターを包含する、ある数の細胞の基質のチロシンリン酸化を誘導し、レセプターが１または２以上の細胞質のチロシンキナーゼと関連することを示唆する(Yosimura ら、Nature 343:647-649(1990);Damen ら、Blood 80:1923-1932(1992);QuelleおよびWojchowski、J.Biol.Chem.266:609-614(1991) ；Quelleら、J.Biol.Chem.267:17055-17060(1992);Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:48 95 -4902(1991);Linnekinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6237-6241(1992);Dusante r-Fourt ら、J.Biol.Chem,267:10670-10675(1992))。関係しうるキナーゼを同定するために、われわれおよび他の研究者ら(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603-1607(1989);Wilks ら、Mol.Cell.Biol.11:2057-2065(1991);Partanen ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8913-8917(1990);実施例1 参照)は、ＰＣＲアプローチを使用して、造血成長因子依存性細胞系の中に存在する既知のおよび潜在的に新規なキナーゼを検出した。これらの研究を、ノザンブロット分析と組み合わせて、ＤＡ３骨髄性細胞の中のｌｙｎ、ｃ−ｆｅｓ、ｔｅｃ、Ｊａｋ１およびＪａｋ２のための転写体を同定した(Mano ら、Oncogene 8:17-424(1993))。これらのキナーゼのいずれかがＥＰＯのシグナルのトランスダクションに関係するかどうかを最初に決定するために、われわれは次のようにしてチロシンリン酸化を誘導するそれらの能力を検査した。ＤＡ３（ＥＰＯＲ）細胞をほぼ１４時間の間断片から除去した。細胞を刺激しない（−）か、または３０Ｕ／ｍｌのヒトＥＰＯで１０分間刺激した（十）。細胞を引き続いて遠心により集め、そして下記の実験手順に記載するように細胞抽出物を調製した。未刺激の細胞および刺激した細胞から抽出物のアリコート（２×１０⁷細胞）をＪａｋ２、Ｊａｋ１、ｃ−ｆｅｓ、ｌｙｎまたはｔｅｃなどに対する抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースのフィルターに移し、そしてフィルターを実験手順に記載するように４Ｇ１０ホスホチロシンモノクローナル抗体でプロービングした。免疫沈降したチロシンキナーゼの各々のレベルを評価するために、匹敵するブロットを下記の実験手順に記載するように個々のキナーゼに対する抗血清でプロービングした。前述の実験において、ＥＰＯ刺激はＪａｋ２に対する抗血清により免疫沈降するｐ１３０ｋＤａのバンドを出現させた。抗血清をレイズさせたペプチドの存在において免疫沈降を実施したとき、このバンドは観察されなかった。ホスホチロシンに対する異なるモノクローナル抗体（ＰＹ２０）でブロットをプロービングしたとき、また、匹敵する結果が得られた。対照的に、匹敵する条件下にｌｙｎ、ｆｅｓまたはｔｅｃのチロシンリン酸化の明らかな誘導は存在しなかった。前述したように実施したいくつかの実験においてＪａｋ１に対する抗血清を使用して、弱い１３０ｋＤａのバンドが見られた。これは抗血清の交差反応性のためであった。両方の抗血清はＪａｋ１とＪａｋ２との間の最小の配列の同一性をもつペプチドに対して調製し、そしてｉｎｖｉｔｒｏ翻訳反応から適当なキナーゼを免疫沈降させるに過ぎない（実施例１参照）。結果を総合すると、ＪａｋキナーゼはＥＰＯに応答して誘導的にチロシンリン酸化されるが、Ｊａｋ２は優先的にリン酸化されることが示される。ＥＰＯ刺激がＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導することをさらに確立するために、われわれはリン酸化の変化を検出するモノクローナル抗体１Ｇ２の能力を検査した。細胞を上のように処理し、溶解し、そして従来記載されているように、１Ｇ２モノクローナル抗体セファローズビーズへの結合およびそれからの溶離により、タンパク質のホスホチロシンを含有する画分を離した(Frackelton ら、M ol.Cell.Biol.3:1343-1352(1983);Isfortら、J.Biol.Chem.263:19203-19209(1988 ))。溶離された調製をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、フィルターにブロットし、そしてフィルターをＪａｋ２に対する抗血清でプロービングした。結果は次の通りであった。ＥＰＯはｐ１３０ｋＤａのバンドの出現を誘導し、このバンドは１Ｇ２溶出液の中のＪａｋ２に対する抗血清で容易に検出可能であった。全体の細胞リゼイトのウェスタンブロッティングは、刺激した細胞および未刺激の細胞の両方においてｐ１３０ｋＤａのＪａｋ２の匹敵するレベルを示した。ｌｙｎ、ｔｅｃまたはｃ−ｆｅｓに対する抗血清によるブロットのプロービングはこれらのキナーゼを検出できなかった。チロシンリン酸化されたＪａｋ２の出現の反応速度論を決定するために、ＤＡ３（ＥＰＯＲ）細胞からの抽出物をＥＰＯ処理後０、５、１０、３０および６０分に調製し、Ｊａｋ２に対する抗血清で免疫沈降させ、そして免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をニトロセルロースに移し、そして４Ｇ１０モノクローナル抗体でウェスタンブロッティングした。これらの条件下に、１３０ｋＤａのバンドの誘導は容易に明らかであった。剌激は５分において最大であり、そして引き続いて傾斜し、そして１時間において明らかではなかった。上の結果を総合すると、ＥＰＯの刺激は、成長因子依存性細胞において、他のタンパク質チロシンキナーゼに関して、Ｊａｋ２の急速なかつ特別のチロシンリン酸化を生じた。ＥＰＯの刺激はＪａｋ２のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を活性化するタンパク質チロシンキナーゼのチロシンリン酸化は普通にキナーゼ活性の活性化に関係づけられる(Hanksら、Science 241:42-52(1988))。従って、われわれは免疫沈降物の中のｉｎｖｉｔｒｏのＪａｋ２キナーゼ活性を検査した。これらの実験において、細胞をＥＰＯで１０分間刺激し、次いで細胞抽出物を調製し、そして正常のウサギ血清（ＮＲＳ）またはＪａｋ２に対して特異的な抗血清で免疫沈降させ、ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施し、そしてリン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。未刺激の細胞またはＥＰＯ刺激細胞からの、正常のウサギ血清を使用する抽出物の免疫沈降物は、検出可能なｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性をもたなかった。対照的に、ＥＰＯ刺激細胞からのＪａｋ２抗血清を使用する抽出物の免疫沈降物は容易に検出可能なキナーゼ活性を有した。リン酸化の主要な生成物は、Ｊａｋ２と共移動する１３０ｋＤａのタンパク質であった。匹敵する活性は未刺激の細胞からの抽出物において検出されなかった。Ｊａｋ２に対する特異性は、Ｊａｋ２抗血清をペプチドに対して上昇させたペプチドのキナーゼ活性の免疫沈降をブロックする能力により示されたが、Ｊａｋ１の匹敵する領域に対するペプチドは作用をもたなかった。２次元の薄層電気泳動により検出されたｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおける主要なホスホアミノ酸はチロシンであると決定された。Ｊａｋ２のチロシンリン酸化およびｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性は有糸分裂誘発と相関するわれわれの前の研究(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991);Miuraら、M ol.Cell.Biol.13:1788-1795(1993))は、チロシンリン酸化の誘導、いくつかのすぐ接する初期の遺伝子の発現の誘導および有糸分裂誘発のために必須である、ＥＰＯＲの細胞質ドメインの膜近位領域を定めた。従って、Ｊａｋ２リン酸化の誘導が匹敵するドメインを必要とするかどうか、およびＪａｋ２のリン酸化をこれらの生物学的応答に関係付けることができるかどうかを決定することは重要であった。従って、われわれは１系列の突然変異したレセプターにより伝達されるＥＰＯ誘導チロシンリン酸化を検査した。ＥＰＯＲのＨ突然変異体カルボキシ末端の１０８アミノ酸欠如するが、完全な生物学的活性を保持する(Miuraら、Mol.Cel l.Biol.13:1788-1795(1993))。Ｈ突然変異体を発現する細胞の発現のＥＰＯ刺激は、１３０ｋＤａのバンドのチロシンリン酸化を生じた。また、Ｈ突然変異体を発現する細胞を使用して観察されたＪａｋ２のチロシンリン酸化は、野生型レセプターを発現する細胞より強かったことに注意すべきである。これは、下のパネルに示すように、Ｊａｋ２のレベルが多少より高いためであるか、またはレセプターのカルボキシル領域におけるマイナスに作用するドメインの除去のためであろう(D'Andrealら、Mol.Cell. Biol.11:1980-1987(1991))。また、これらの実験において、野生型レセプターを発現する細胞の抽出物からのＪａｋ２免疫沈降物の中に検出される誘導可能な７２ｋＤａのリンタンパク質の存在が認められる。これはＥＰＯＲについて期待される大きさであり、そしてそれがＥＰＯＲである可能性はＨ突然変異体を使用する実験における匹敵するバンドの不存在によりさらに支持され、ここでカルボキシル・トランケーションはチロシンリン酸化の部位を除去する(Miuraら、Mol.Ce ll.Biol.11:4895-4902(1991))。この観察はＥＰＯＲがＪａｋ２と物理的に関連することを示した。Ｈ突然変異体より遠く伸長する、例えば、レセプターのカルボキシル１４６アミノ酸を欠如するＳ突然変異体の中に存在する、カルボキシルの欠失は、チロシンリン酸化の誘導、すぐ接する初期の遺伝子の誘導およびＤＡ−３細胞における有糸分裂誘発のためのレセプターを不活性化する(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:48 95-4902(1991))。この突然変異体を発現する細胞のＥＰＯ刺激後に、Ｊａｋ２のチロシンリン酸化の誘導は明らかでなかった。われわれは、以前に、細胞質ドメインの膜近位領域における２０アミノ酸の欠失（ＰＢ突然変異体）がすべての生物学的活性のためのレセプターを不活性化することを証明した。Ｊａｋ２のチロシンリン酸化はこの突然変異体を発現するＥＰＯ処理細胞において検出されなかった。最後に、われわれは、ボックス１領域とボックス２領域との間の保存されたＷ残基のＲへの不活性化性突然変異Ｗ²⁸²を含有する、点突然変異、ＰＭ４、を試験した(Miuraら、Mol.Cell.Biol.13:1788-1795(1993))。Ｊａｋ２のチロシンリン酸化はこの突然変異を含有する細胞において見られなかった。次に、われわれは、Ｊａｋ２の誘導とｉｎｖｉｔｒｏＪａｋ２キナーゼ活性を活性化する能力をもつ突然変異誘発との間の相関を試験した。種々の突然変異のレセプターを発現する細胞のクローンを刺激しなかったか、またはＥＰＯで１０分間剌激した。細胞を溶解し、そしてＪａｋ２を免疫沈降させ、そして沈降物を上のようにしてｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて使用した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分離することによって、リン酸化を評価した。前に記載された結果におけるように、反応において検出されたリン酸化の主要な生成物はＪａｋ２の位置に移動する１３０ｋＤａのリンタンパク質であった。有糸分裂誘発的に活性なＨ突然変異体を発現したＥＰＯ刺激細胞において、Ｊａｋ２のリン酸化は明らかであった。突然変異誘発的に不活性のＳトランケーション突然変異、ＰＢ欠失突然変異またはＰＭ４点突然変異を発現するＥＰＯ刺激細胞の免疫沈降物において、キナーゼ活性は検出されなかった。これらの結果は、生物学的活性に必須である膜近位領域が、また、Ｊａｋ２チロシンリン酸化の誘導およびそのキナーゼ活性の活性化のために要求されることを証明する。ＥＰＯＲを発現する３Ｔ３細胞におけるチロシンリン酸化の誘導Ｊａｋ２は広範な種類の細胞系において発現される（実施例１参照）；Harpur ら、Oncogene 7:1347-1353(1992))。従って、われわれは、Ｊａｋ２がＥＰＯＲとカップリングしそして非造血系において誘導可能にチロシンリン酸化されうるかどうかを決定した。このために、われわれは、ＥＰＯＲ発現構成体でトランスフェクションされそしてＥＰＯの高いアフィニティーのレセプターを発現する３Ｔ３線維芽の応答を試験した。ＥＰＯ刺激がレセプターを発現する線維芽におけるチロシンリン酸化に関係づけられるかどうかを最初に決定するために、細胞のタンパク質ならびにレセプターのチロシンリン酸化を誘導するＥＰＯの能力を検査した。３Ｔ３（ＥＰＯＲ）細胞からの抽出物のブロットを抗ホスホチロシンモノクローナル抗体でプロービングしたとき、種々のバンドが検出されそしてＥＰＯで処理した細胞において検出可能な差は見られなかった。しかしながら、抽出物をまずＥＰＯＲに対する抗血清で免疫沈降させそしてブロットをホスホチロシン含有タンパク質についてプロービングしたとき、７２ｋＤａのタンパク質はＥＰＯ刺激細胞において検出され、ＥＰＯＲのチロシンリン酸化の誘導と一致した。細胞抽出物をまずＪａｋ２に対する抗血清で免疫沈降させ、次いでホスホチロシン含有タンパク質またはＪａｋ２についてウェスタンブロッティングしたとき、得られた結果は次の通りであった。未刺激の線維芽およびＥＰＯで刺激した線維芽は、ブロットをＪａｋ２に対する抗血清でプロービングすることによって評価したとき、匹敵するレベルのＪａｋ２を含有した。細胞をＥＰＯで刺激した後、Ｊａｋ２と共移動する、１３０ｋＤａのバンドがホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（４Ｇ１０）により容易に検出された。ＥＰＯＲを含有しない対照において、匹敵するバンドは検出されなかった。これらのデータは、ＥＰＯＲが線維芽においてＪａｋ２と機能的にカップリングし、そしてＪａｋ２のＥＰＯ誘導チロシンリン酸化を伝達できることを証明する。Ｊａｋ２はエリトロポイエチンの有糸分裂誘発的に活性なレセプターと関連するＥＰＯＲおよびＪａｋ２のチロシンリン酸化の急速な誘導は、Ｊａｋ２がＥＰＯＲに物理的に関連する可能性を示した。従来の研究(YoshimuraおよびLodish、M ol.Cell.Biol.12:706-715(1992))はＥＰＯＲに架橋することができ、そしてｉｎｖｉｔｒｏでリン酸化されるうるであろう１３０ｋＤａのタンパク質を同定したので、この可能性は興味あることであった。Ｊａｋ２およびＥＰＯＲの関連の可能性は、また、ホスホチロシンを含有する７２ｋＤａのタンパク質がＪａｋ２と共免疫沈降するいくつかの実験において示された。ＥＰＯと物理的に関連するＪａｋ２の能力を直接検査するために、ｅｔｙおよび突然変異のＥＰＯＲの細胞質ドメインを含有する１系列のＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質を構成し、そして細菌の中で発現させた。融合タンパク質をグルタチオン−セファローズビーズへのアフィニティー結合により精製し、そしてタンパク質を、ビーズ上で、未刺激またはＥＰＯ刺激のＤＡ３（ＥＰＯＲ）細胞の抽出物とインキュベートした。結合したタンパク質をビーズから回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そしてゲルをニトロセルロースにブロットした。ブロットを引き続いて種々のチロシンキナーゼに対する抗血清でプロービングした。未刺激の細胞または刺激した細胞からの抽出物を使用し、そしてＪａｋ２に対する抗血清でプロービングしたとき、１３０ｋＤａのタンパク質は容易に検出可能であった。抗血清をペプチドに対して上昇させたペプチドの過剰量と、抗血清をインキュベートしたとき、１３０ｋＤａのタンパク質は検出されなかった。１３０ｋＤａのタンパク質は、また、Ｊａｋ１に対する抗血清で検出されたが、そのレベルはＪａｋ２に対する抗血清で見られたレベルより非常に低かった。ブロットをそれぞれの抗血清でプロービングしたとき、ｌｙｎ、ｃ−ｆｅｓまたはｔｅｃの存在と一致するであろうバンドは検出されなかった。これらの結果は、検査したチロシンキナーゼの間で、Ｊａｋ２がＥＰＯＲを含有する細胞質ドメインを含有するＧＳＴ融合タンパク質と関連することを証明した。上で検出されたＪａｋ２およびＥＰＯＲの物理的関連が生物学的に関係する場合、レセプターの有糸分裂誘発活性に影響を与える突然変異が結合を変更させそして、逆に、生物学的活性に影響を与えないレセプターのトランケーションはに影響を与えないことを予測できるであろう。この可能性を探査するために、トランケートしたが、有糸分裂誘発的に活性であるＨ突然変異体ならびに有糸分裂誘発的に不活性なＰＢおよびＰＭ４突然変異体の細胞質部分を含有する融合タンパク質を構成した。細胞抽出物をグルタチオン−セファローズに結合したＧＳＴ単独とインキュベートし、そしてブロットをＪａｋ２に対する抗血清でプロービングしたとき、１３０ｋＤａのタンパク質は検出されなかった。対照的に、Ｈ突然変異体の完全な細胞質ドメインまたはカルボキシル−トランケートした細胞質ドメインを含有する融合タンパク質を使用したとき、１３０ｋＤａのタンパク質は容易に検出された。ＰＢ突然変異体の欠失を含有する融合タンパク質と抽出物をインキュベートしたとき、１３０ｋＤａのタンパク質は検出されなかった。しかしながら、有糸分裂誘発的に不活性なＰＭ４突然変異を含有する融合タンパク質を使用したとき、１３０ｋＤａのタンパク質は検出された。これは、後述するように、機能的相互作用／物理的相互作用を検出するアッセイにおける差のためであろう。これらの結果は、有糸分裂誘発のために要求される膜近位ドメインが、また、ＥＰＯＲおよびＪａｋ２の関連を伝達することを示す。論考これらの研究は、ＥＰＯＲに関連しかつリガンドの結合に応答してチロシンリン酸化および活性化されるタンパク質チロシンキナーゼを同定した最初のものである。従来の研究は、ＥＰＯの結合が細胞の基質、ならびにＥＰＯＲ、のチロシンリン酸化を急速に誘導すること、およびこの能力が有糸分裂誘発の誘導に密接に関連することを証明した(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991);Miura ら、Mol.Cell.Biol.13:1788-1795(1993))。従って、ＥＰＯの結合を生物学的応答に関連づける１または２以上のキナーゼを同定することに、かなりの興味がもたれてきている。ＰＣＲアプローチ(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603 -1607(1989);Wilks、A.F.、Meth.Enzymol.200:533-546(1991);Partanenら、Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 87:8913-8917(1990);Mano ら、Oncogene 8:417-424(1993))を使用して、骨髄性細胞の中に存在しそしてシグナルのトランスダクションに寄与しうるタンパク質チロシンキナーゼのスペクトルを定めことを試みた。ＩＬ−３／ＥＰＯ依存性細胞の中で発現されたキナーゼの間で、シグナルのトランスダクションにおける、ｓｒｃ遺伝子ファミリーのキナーゼの１構成員であるｌｙｎに興味がもたれてきている。これは、Ｔ細胞のＩＬ−２刺激が高度に関係するｌｃｋキナーゼのキナーゼ活性を増加させるという証明(Horakら、Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 88:1996-2000(1991))およびｌｃｋとＩＬ−２レセプターのβ 鎖の細胞質ドメインとの物理的関連の証明(Hatakeyamaら、Science 252:1523-152 8(1991))に基づいた。しかしながら、ｌｃｋは有糸分裂誘発のために要求されないＩＬ−２レセプターのβ鎖の領域に関連することに注意すべきである(Hat akeyama ら、Cell 59:837-845(1989);Hatakeyama ら、Science 252:1523-1528(199 1))。ＩＬ−３のシグナルのトランスダクションにおけるｌｙｎの役割は、ＩＬ −３刺激がｌｙｎキナーゼ活性の増加を誘導することを示す報告により示される (Torigoeら、Blood 80:617-624(1992))。しかしながら、われわれが検査した造血成長因子依存性細胞におけるｌｙｎキナーゼ活性へのＩＬ−３またはＥＰＯの首尾一貫した作用をわれわれは見ることができなかった。ここに例示するように、また、われわれはｌｙｎのチロシンリン酸化の状態へのＥＰＯ結合の作用を検出することができず、またはｌｙｎとＥＰＯＲとの関連を証明することができなかった。また、ｔｅｃのチロシンリン酸化、キナーゼ活性の活性化またはＥＰＯＲとの関連の変化を検出することができなかった。ｔｅｃは骨髄性細胞の中で発現され (Mano ら、Oncogene 8:417-424(1993))そしてその潜在的重要性はＴ細胞、ｉｔｋ（ＩＬ−２誘導可能なＴ細胞キナーゼ）およびＢ細胞ＢＰＫ／ａｔｋ（Ｂ細胞祖先のキナーゼ、無ガンマグロブリン血のチロシンキナーゼ）(Silicano ら、Proc .Natl.Acad.Sci.USA 89:11194-11198(1992);Tsukada ら、Cell(印刷中、1993);Vet rie ら、Nature 361:226-233(1993))における高度に関係するキナーゼの同定により示唆された。ＢＰＫ／ａｔｋ遺伝子はＸ−連鎖無ガンマグロブリン血（ＸＬＡ）に密接に関連づけらせ、そしてキナーゼ活性はＸＬＡ前ＢおよびＢ細胞系において減少しまたは存在しない(Tsukadaら、Cell(印刷中、1993))。そのうえ、キナーゼを不活性化することが予測される遺伝的に獲得した突然変異はＸＬＡの患者におけるＢＰＫ／ａｔｋにおいて検出された(Vetrie ら、Nature 361:226-233(1 993))。従って、ｂｐａはＢ細胞のシグナリングにおいて重要な役割を演ずるようである。ｔｅｃ力滑髄性細胞のいっそう特殊化ｓｉｔａ応答に関係する可能性が現在検査されている。われわれは、また、細胞の増殖を調節するＥＰＯシグナル・トランスデューシング経路におけるｃ−ｆｅｓ遺伝子の役割についての証拠を観察しなかった。ｃ −ｆｅｓの発現のレベルが分化とともに増加し、骨髄性細胞の中へのｃ−ｆｅｓの活性化された形態の導入はそれらの細胞の分化を促進し(Borelliniら、J.Biol. Chem.266:15850-15854(1991))そしてｃ−ｆｅｓアンチセンス構成体は分化を妨害する(Ferrariら、Cell Growth Differ.1:543-548(1990))ので、最近の研究はｃ −ｆｅｓが骨髄性細胞の熱的分化に関係できることを示唆した(Borelliniら、J.B iol.Chem.266:15850-15854(1991))。ｌｙｎ、ｔｅｃまたはｆｅｓを使用して得られた結果と対照的に、Ｊａｋ２を使用する実験はチロシンリン酸化、キナーゼ活性の活性化およびＥＰＯＲと連合する能力への作用を容易に証明した。そのうえ、結果はＪａｋ１に関するＪａｋ２に対する特異性において非常に顕著であった。Ｊａｋ１およびＪａｋ２は高度に関係付けられ、そして触媒のドメインならびにアミノ末端の領域の両方におけるかなりのアミノ酸配列の同一性を有する(Harpur ら、Oncogene 7:1347-1353(19 92); また、ここにおける実施例1 参照）。Ｊａｋ２のアミノ酸配列は、ネズミＪａｋ１キナーゼと４５．５％の同一性を有する、１３０ｋＤａの計算大きさをもつ１１２９アミノ酸のタンパク質をエンコードする。われわれの研究においてＪａｋ２に対する明瞭な特異性が存在したが、Ｊａｋ１は低いレベルですべてのアッセイにおいて絶えず検出された。使用したすべての抗血清は広範なアミノ酸の同一性を含有しない領域からのペプチドに対するものであったので、これは抗血清の交差反応性のためではなかった。さらに、抗血清交差反応性の欠如は、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳されたタンパク質との反応性を検査することによって確立された（実施例１参照）。反応性の差は、２つのキナーゼが匹敵するレベルで発現されるので、両方のキナーゼの発現のレベルの差のためではない。従って、Ｊａｋ１とＪａｋ２との間には、Ｊａｋ１をＥＰＯＲと連合させるために十分な類似性が存在するように思われるが、そのアフィニティーは非常に低い。Ｊａｋ２チロシンリン酸化のＥＰＯ誘導は、ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体との反応性の変化により評価した。重要なことには、チロシンリン酸化は４Ｇ１０およびＰＹ２０の両方モノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット技術により容易に証明可能である。さらに、セファローズに結合した１Ｇ２抗ホスホチロシンモノクローナル抗体を使用するアフィニティー精製により、Ｊａｋ２はＥＰＯ刺激細胞から単離できたが、未刺激の細胞から単離できなかった。これらのアプローチは、タンパク質のチロシンリン酸化の変化を検出するために普通に使用される。われわれの結果は、ＥＰＯ刺激がＪａｋ２のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を活性化し、そして主要な基質がＪａｋ２であることを証明する。従来の研究において、Ｊａｋ１のキナーゼ活性を証明することは困難であることがわかった。特に、Wilks ら、Mol.Cell.Biol.11:2057-2065(1991)は、種々の条件下にＪａｋ１の免疫沈降物の中のタンパク質チロシンキナーゼ活性を証明することができなかった。しかしながら、彼らは、Ｊａｋ１のカルボキシルキナーゼドメインとの融合タンパク質を含有する発現構成体を使用して、細菌の中のタンパク質のチロシンリン酸化を証明することができた。アミノ末端のキナーゼ様ドメインを含有する匹敵する融合タンパク質は活性をもたなかった。興味あることには、比較的わずかの細菌のタンパク質がリン酸化され、Ｊａｋ１が制限された基質の特異性を有することができることを示唆した。Ｊａｋ２のキナーゼ活性を検出できることはＥＰＯによる細胞の刺激にもっぱら依存したので、ｉｎｖｉｔｒｏのＪａｋ１のキナーゼ活性の検出が不可能であることはｉｎｖｉｖｏの適当な活性化の欠如のためであることを、われわれの結果は示すであろう。これに関して、われわれはＪａｋ１のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を証明することができなかったが、Ｊａｋ１はＥＰＯＲと関連するように思われ、そしてＥＰＯ刺激後に弱くチロシンリン酸化される。ｉｎｖｉｔｒｏ反応におけるチロシンリン酸化の主要な基質はＪａｋ２であり、そして詳しくは免疫グロブリンの重鎖のリン酸化は検出されなかった。これはＪａｋ２が非常に特定の基質の特異性を有することができることを示す。Ｊａｋ２の活性化の機構に関すると、リガンドの結合は分子間のリン酸化が生じそしてキナーゼ活性の活性化を生ずるようなＪａｋ２の関連を促進することができる。次いで、活性化されたＪａｋ２は、レセプターのタンパク質チロシンキナーゼに完全に類似する方法で、免疫沈降物においてこのような分子間のリン酸化をｉｎｖｉｔｒｏで続ける能力を有する(Ohtsukaら、Mol.Cell.Biol.10:1664-1671( 1990);Yarden およびSchlessinger、Biochemistry 26:1434-1442(1987))。ＥＰＯ刺激は、Ｊａｋ２のチロシンリン酸化のそれに匹敵する反応速度論で、ＥＰＯＲレセプターの急速なチロシンリン酸化を生ずる。これはＪａｋ２がＥＰＯＲのリン酸化の原因となるキナーゼであることを示す。ＥＰＯＲのリン酸化は、有糸分裂誘発のために要求されない領域である、膜遠位カルボキシルドメインにおいて起こる。膜近位領域に２０アミノ酸の欠失を含有するか、またはこの領域におけるＷ²⁸²がＲに突然変異した突然変異体において、このリン酸化は起こらない。これらの機構の両方は、また、Ｊａｋ２のリン酸化およびキナーゼの活性化に影響を与え、そしてアミノ酸の欠失はｉｎｖｉｔｒｏでＥＰＯＲと連合するＪａｋ２の能力を排除するので、Ｊａｋ２はＥＰＯＲのリン酸化のために必要なキナーゼであるようである。また、他のキナーゼはＪａｋ２と関連し、これによりレセプターのその領域にもたらさることができる。そうである場合、この追加のキナーゼは、また、Ｊａｋ２のリン酸化に要求されるであろう。Ｊａｋ２およびＥＰＯＲを除外して、ＥＰＯ誘導チロシンリン酸化の基質に関して比較的ほとんど知られていない。９２ｋＤａ、７０ｋＤａおよび５５ｋＤａの基質はわれわれの研究において絶えず検出されてきており(Miuraら、Mol.Cell .Biol.11:4895-4902(1991))、そして他のものは同様なならびに追加の基質を同定した(Damenら、Blood 80:1923-1932(1992);QuelleおよびWojchowski、J.Biol.Ch em.266:609-614(1991);Quelle ら、J.Biol.Chem.267:17055-17060(1992);Linneki nら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6237-6241(1992);Dusanter-Fourt ら、J.Biol.C hem.267:10670-10675(1992))。また、Ｊａｋ２と共免疫沈降する５５および７０ｋＤａの誘導可能なチロシンリン酸化の容易に検出可能な基質が存在することに注意することは重要である。われわれは、ｖａｖ、ｒａｔ、ＧＡＰおよびＳＨＣを包含する、ある数の潜在的に興味を起こさせる基質を排除した。しかしながら、われわれは、Ｊａｋファミリーのキナーゼ転写開始の基質であることができかつＩＮＦαの応答に関係する１１３および９１／８４ｋＤａのＩＳＧＦ３αタンパク質を試験しなかった(Schindlerら、Science 257:809-813(1992);Fu、X.Y.、Cel l 70:323-335(1992))。また、ＥＰＯに対する応答に関連する遺伝子の転写活性化を特別に伝達するＪａｋ２と相互作用する、関係するタンパク質は存在であることがある。従来の研究において、ＥＰＯＲと連合する１３０ｋＤａのリンタンパク質が同定された(YoshimuraおよびLodish、Mol.Cell.Biol.12:706-715(1992))。クロスリンクすることによって、それはＥＰＯＲと関連することが示され、それがＩＬ− ３またはＧＭ−ＣＳＦのβ鎖またはＩＬ−６レセプターのｐｐ１３０鎖に匹敵するレセプター複合体のサブユニットである可能性を示唆する。しかしながら、これらのタンパク質と異なり、ｐ１３０はＮ−グリコシル化されず、それが細胞質ゾルのタンパク質であることを示唆する。ｐ１３０のチロシンリン酸化は、抗ホスホチロシン抗体を使用する免疫沈降により証明された。しかしながら、ＥＰＯＲ／ｐ１３０複合体の単離に使用した手順のために、チロシンリン酸化がＥＰＯＲにより誘導されるかどうかを決定することができなかった。関係なく、ｐ１３０の性質はそれがＪａｋ２であるという仮説と一致する。Ｊａｋ２のチロシンリン酸化およびレセプターの関連が有糸分裂誘発に必須である膜近位領域を必要とすることを、われわれの結果は証明する。これは、欠失突然変異体（ＰＢ）およびＷ²⁸²からＲへの点突然変異体により顕著に例示され、それらの突然変異体の両方は有糸分裂誘発的に不活性であり、そして付随的にＪａｋ２のチロシンリン酸化またはキナーゼ活性の活性化に関係付けることができない。しかしながら、２０アミノ酸の欠失をもつ突然変異体（ＰＢ）のみはＪａｋ２と物理的に関連する能力を喪失した。点突然変異はＥＰＯＲおよびＪａｋ２のｉｎｖｉｖｏの機能的相互作用を崩壊するために十分であるが、高いタンパク質濃度において物理的相互作用を排除ために相互作用のアフィニティーを十分に低下しないように思われる。われわれの結果は、ＥＰＯＲとのＪａｋ２の関連がリガンドの結合に対して独立であることを示す。従って、Ｊａｋ２のリン酸化は変化の結果として起こり、レセプター／Ｊａｋ２複合体に影響を与えるということを仮定することができる。ＥＰＯの結合はレセプターの二量体化およびオリゴマー化を誘導し、そしてこれはレセプターの機能のために決定的であるという仮定をかなりの証拠が支持する(Watowich ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2140-2144(1992))。これは、レセプターの構成的活性化を生ずる突然変異体ＥＰＯＲ（Ｒ¹⁹⁹→Ｃ）の存在により支持される(Yshimula ら、Nature 348:647-649(1990))。この突然変異はシステインの変換を必要とし、そしてリガンドの不存在においてジサルファイド連鎖したオリゴマーを形成する能力を生ずる(Watowich ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2 140-2144(1992))。ＥＰＯの不存在において、Ｊａｋ２キナーゼは構成的にチロシンリン酸化され、そしてｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を有する。これらのデータに基づいて、ＥＰＯの結合がＥＰＯＲ／Ｊａｋ２複合体のオリゴマー化を引き起こし、キナーゼ分子を十分に近接させて、分子間のチロシンリン酸化を生ずることを、われわれはさらに仮定する。このモデルはいくつかのレセプターのタンパク質チロシンキナーゼについて提案されたものと同定である(Ullrichおよび Schlessinger、Cell 61:203-212(1990))。ＩＦＮαレセプターを使用する研究は、高いアフィニティー結合がＴｙｋ２の関連を必要とすることがあることを示唆した(Firmbach-Kraft ら、Oncogene 5:1 329-1336(1990))。この可能性は、また、ＥＰＯＲについて存在する。特に、Ｊａｋ２は偏在的に発現されるので、このレセプターの結合のアフィニティーはＪａｋ２の不存在において測定しなかった。そのうえ、ここに証明するように、ＥＰＯＲは線維芽の中でＪａｋ２と機能的関連することができる。従って、レセプターと連合するために十分な相同性をもつＪａｋキナーゼを含有しない、系統発生的に離れた細胞の中でレセプターを発現させることが必要であろう。このような条件下に、レセプターのアフィニティーへのＪａｋ２の結合の役割を処理することができるであろう。Ｊａｋファミリーのキナーゼは偏在的に発現される(Wilksら、Mol.Cell.Biol. 11:2057-2065(1991));また、実施例1 参照）。従って、線維芽において、ＥＰＯＲの発現がチロシンリン酸化の活性化に関連させるために十分であるかどうかを決定することが重要であった。証明されるように、ＥＰＯＲおよびＪａｋ２の両方のチロシンリン酸化はＥＰＯ刺激後に検出された。使用した細胞におけるタンパク質のチロシンリン酸化のバックグラウンドが高いために、われわれはＥＰＯ刺激が他の細胞の基質のチロシンリン酸化をを生じたかどうかを決定することができなかった。しかしながら、血清飢餓細胞のＥＰＯ刺激は有糸分裂誘発の応答を誘導せず、細胞の増殖にリガンドの結合を関連させるために要求されるいくつかの成分が欠けていることを示唆する。また、不十分なレセプターが発現されることがある。対照的に、最近の報告(Watanabe ら、Mol.Cell.Biol.13:1440-1448( 1993))は、線維芽における再構成されたＧＭ−ＣＳＦレセプター複合体が成長促進シグナルをトランスダクションすることができることを証明した。Ｊａｋ２が関連するＥＰＯレセプターの膜近位領域は、他の造血成長因子のレセプターとの制限された配列の類似性を含有する(Murakami ら、Proc,Natl.Acad. Sci.USA 88:11349-11353(1991))。試験したすべての場合において、この領域は有糸分裂誘発に必須であることが示された。従って、造血サイトカインレセプターのスーパーファミリーの他の構成員がＪａｋ２と連合し、または多分キナーゼのＪａｋファミリーの他の構成員と関連するかどうか決定することが重要であろう。これに関して、われわれはＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが、また、Ｊａｋ２の特定のチロシンリン酸化を誘導することを発見した。ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−６を包含するＪａｋファミリーのキナーゼの役割をさらに探査することが重要であろう。Ｊａｋキナーゼの偏在的な発現は、それらのキナーゼが、サイトカインレセプターのスーパーファミリーの他の非造血構成員による有糸分裂誘発にリガンドの結合を関連させることができることをさらに示す。内分泌成長ホルモン、造血サイトカインレセプターの細胞外ドメインにおいて構造的関係、および組織の因子およびインターフェロンのレセプターといっそう遠い可能な関係が存在することが認識された(Bazan、J.F.、Immunol.Today 10:350-354(1991);Bazan、J.F.、Proc.N atl.Acad.Sci.USA 87:6934-6938(1990);DeVosら、Science 255:306-312(1992)) 。これらの関係が１クラスのシグナリングレセプターの分岐進化を反映する場合、それらはＪａｋキナーゼのファミリーの構成員との相互作用を通して同様な方法でシグナルのトランスダクションを関連させることができる。従って、ＩＮＦ αレセプターはＴｙｋ２を通して関連させるが、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ− ＣＳＦおよびＥＰＯはＪａｋ２を通して関連させる。これと一致して、われわれはＩＦＮγがマクロファージ細胞系においてＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導することを発見した。さらに、最近の研究は、成長ホルモンのレセプターがＪａｋ２に結合しそしてそれを活性化することを発見した。Ｊａｋキナーゼのどれがサイトカインレセプターのスーパーファミリーの他の構成員と連合しそしてそれを活性化するかを同定することはかなり興味あることであろう。キナーゼのＪａｋファミリーが遺伝子の調節に影響を与えるために同様な機構を利用するかどうかを決定することは、また、興味あることであろう。Ｔｙｋ２はＩＳＧＦ３α（インターフェロン刺激遺伝子因子３）複合体の１１３ｋＤａおよび９１／４８ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化にＩＮＦα／βの結合を関連させることを、かなりの証拠が示唆している(Fu、X.Y.、Cell 70:323-335(199 2))。リン酸化後、この複合体は４８ｋＤａのＩＳＧＦ３γタンパク質と関連し、そして複合体は核に移動し、ここでそれはインターフェロンで刺激された応答要素に結合し、そして遺伝子の発現を活性化する。最近の研究(Shuaiら、Scienc e 259:1808-1812(1992))は、ＩＦＮγがまた９１ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化を誘導すること、およびそれは核に移動しそしてγ−活性化部位に結合することを証明した。上に記載したように、Ｊａｋ２はＩＦＮγの結合後に誘導可能にチロシンリン酸化され、従って関係するキナーゼであることができる。正しい場合、ＥＰＯ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦによる細胞の刺激は９１ｋＤａのＩＳＧＦ３γタンパク質またはこの遺伝子ファミリーの１構成員のチロシンリン酸化を生ずることがある。これに関して、ＥＰＯまたはＩＬ−３に応答して見られるチロシンリン酸化の主要な基質の１つは、ほぼ９２ｋＤａのタンパク質であることに注意することは重要である(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11: 4895-4902(1991);Miura ら、Mol.Cell.Biol.13:1788-1795(1993))。サイトカインレセプターのスーパーファミリーの構成員は、一部分、リガンドの結合後の自己リン酸化によるＪａｋファミリーのキナーゼの活性化により、リガンドの結合を遺伝子の発現の誘導に関連させ、リガンドの結合はＩＳＧＦ３γファミリーの構成員のリン酸化を生じ、後者の構成員は、引き続いて、ＩＣＳＢＰ、ＩＦＲ−１、ＩＲＦ−２およびｃ−ｍｙｂを包含する、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＳＧＦ３αファミリーの構成員と連合すると仮定することができる(Vealsら、 Mol,Cell.Biol.12:3315-3324(1992))。実験手順細胞系および培養条件野生型レセプターを発現するＤＡ３（ＥＰＯＲ）細胞および種々の突然変異体を発現するＤＡ３細胞を、従来記載されているように５ｍＭのグルタミン、１０％のＦＣＳ１Ｕ／ｍｉのＥＰＯおよびＧ４１８を補充したＲＰＭＩ−１６４０上で維持した(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991))。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして５ｍＭのグルタミンおよび１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ −１６４０の中で成長因子の不存在において１２〜１６時間インキュベートすることによって、細胞の飢餓を実施した。細胞を１０〜３０Ｕ／ｍｌのＥＰＯで刺激した。試薬Ｊａｋ１およびＪａｋ２からのペプチドに対するウサギモノクローナル抗体の調製および性質は実施例１に記載されている。ｃ−ｆｅｓに対する抗血清はＪ．Ｄｏｗｎｉｎｇ（Ｓｔ．ＪｕｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＲｅｓｅａｒｃｈＨｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｎｐｈｉｓ）により提供され、そしてその性質は記載された(Haynes およびDowining、Mol.Cell.Biol.8:2419-2427(1988))。ｌｙｎに対する抗血清は、また、記載された(Yi ら、Mol.Cell.Biol.11:2391-2398(1991))。ネズミＴｅｃに対する抗血清はＧＳＴ−融合タンパク質に対して調製され、そしてＴｅｃを発現する細胞から７０ｋＤａのタンパク質を免疫沈降させるが、対照細胞から免疫沈降させない。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体は、商業的源から購入した４Ｇ１０（ＵＢＩ）、１Ｇ２（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＹ２０（ＩＣＮ）は商業的源から購入した。Ｈ突然変異体ＥＰＯはアムゲン（Ａｍｇｅｎ）から提供された。ｐＸＭＥＰＯＲによる３Ｔ３のトランスフェクションプラスミドｐＸＭ−ＥＰＯＲ(D'Andrea ら、Cell 57:277-285(1989b))を、従来記載されているように、エレクトロポレーションにより３Ｔ３線維芽の中にトランスフェクションする(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991))。細胞を１０％のＦＣＳを含むダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で維持した。この実験において、０．５％のＦＣＳを含有する培地の中で一夜クローニングすることによって細胞を成長因子で飢餓させた。引き続いて細胞を同一培地の中においてＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ）で刺激した。融合タンパク質の構成アミノ末端のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインおよびネズミＥＰＯＲ細胞質ドメインのカルボキシル部分を含有する、細菌的に発現された融合タンパク質を調製した。ＥＰＯＲｃＤＮＡの平滑末端のＢｇＩＩＩ− ＫｐｎＩ断片をｐＧＥＸ−２ＴのＳｍａＩ部位の中に挿入することによって、全長のＥＰＯＲ細胞質ドメイン（アミノ酸２５７−４８３）を含有する構成体を調製した。ＥＰＯＲｃＤＮＡの平滑末端のＢｇＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＧＥＸ−２ＴのＳｍａＩ部位の中に挿入することによって、ＥＰＯＲの膜近位細胞質ドメイン（アミノ酸２５７−３７５）を含有する構成体を調製した。従来記載されたＰＢおよびＰＭ−４突然変異を含有するＥＰＯＲｃＤＮＡを使用して、同一の構成体を調製した(Miuraら、Mol.Cell.Biol.11:4895-4902(1991))。次いで、従来記載されているように、プラスミド構成体で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−アルファ株から融合タンパク質を形成し、そしてグルタチオン −セファローズ（ファーマシア）でアフィニティー精製した(SmithおよびJohnso n、Gene 67:31-40(1988))。融合タンパク質の結合アッセイ成長因子の刺激後、細胞を５×１０⁷細胞／ｍｌで溶解緩衝液［１％のトリトンＸ−１００、５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＮａ₄Ｐ₂Ｏ₇、５０ｍＭのＮａＦ、０．１ｍＭのＮａ₂ＶＯ₄、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５ｍｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．６］の中で溶解した。リゼイトから破片を１２，０００×ｇにおいて１０分間除去し、引き続いてリゼイトをグルタチオンセファローズ上に固定化したＧＳＴ−ＥＰＯＲ融合タンパク質とインキュベートした。樹脂をＢＳＡ不含の溶解緩衝液の中でよく洗浄し、次いで連合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのための試料緩衝液で溶離した。溶離されたタンパク質を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そして種々の抗血清でイムノブロットした。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイプロテインＡ−セファローズ（ファーマシア）上の免疫沈降したタンパク質をキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＭｎＣｌ₂ 、０．１ｍＭのＮａ₂ＶＯ₄、１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４）で洗浄し、引き続いて室温において等しい体積の０．２５ｍＣｉ／ｍｌの³²Ｐ−γ−ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液と３０分間インキュベートした。よく洗浄した後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのための試料緩衝液で溶離し、そして７％のゲル上で分離した。³²Ｐを含有するタンパク質をオートラジオグラフィーで可視化した。ｉｎｖｉｔｒｏリン酸化Ｊａｋ２をゲルスライスから単離し、そしてホスホアミノ酸を発表された手順により決定した(Cooper ら、Methods Enzymol.99:387-40 2(1983))。免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００、１００μＭのバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、および１ｍＭのＥＤＴＡの中で２０分間溶解した。リゼイトを４℃において３０分間遠心することによって前清浄化した。上澄みを取り出し、そして前免疫血清およびプロテインＡ−セファローズ（４０μｌの５０％スラリー）と１時間インキュベートした。次いで、表示した血清またはモノクローナル抗体を添加し、そして４℃において１〜２時間インキュベートした。必要に応じて、プロテインＡ−セファローズ（４０μｌの５０％スラリー）を添加し、免疫沈降物を１ｍｌの冷い溶解緩衝液の中で３回洗浄し、ラメリ（Ｌａｍｅｌｌｉ）試料緩衝液１０％（v／v）のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、５０ｍＭＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および０．００２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーの中に再懸濁させ、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、ゲルをニトロセルロースに電気泳動的に移した。フィルターをブロット（ＴＢＳＳ中の５％の脱水乳、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６および１３７ｍＭのＮａＣｌ）の中で２時間インキュベートし、次いで関係する一次抗体の中で１時間インキュベートし、ＴＢＳＳの中ですすぎ、そしてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（アマーシャム）またはアルカリ性ホスファターゼ（プロメガ）結合抗マウスまたは抗ウサギの中で１時間インキュベートした。次いでフィルターを洗浄し、そしてＥＣＬ^TM（アマーシャム・ライフ・サイエンス）または５−ブロモ−４−クロロー３−インドリルホスフェート／ニトロブルー四ナトリウムの検出に暴露した。ＥＣＬ検出を引き続いてＫｏｄａｋＸＡＲ−５フィルム上に記録した。１００μｇ／ｍｌのペプチドを４℃において１時間インキュベートすることによって、合成ペプチドを使用する競合研究を実施した後、この混合物を細胞リゼイトに添加するか、またはウェスタンブロットのための溶液の中に希釈した。実施例３成長ホルモンレセプター関連チロシンキナーゼとしてのＪａｋ２の同定要約成長ホルモンのレセプター（ＧＨＲ）はチロシンキナーゼと複合体を形成し、成長ホルモン（ＧＨ）による細胞内シグナリングにおいてリガンド活性化チロシンキナーゼの掛かり合いを示唆する。ここで、われわれは、Ｊａｋ２、すなわち、非レセプターのチロシンキナーゼをＧＨＲ連合チロシンキナーゼとして同定する。免疫学的アプローチを使用して、Ｊａｋ２とＧＨＲとの間のＧＨ依存性複合体の形成、Ｊａｋ２チロシンキナーゼ活性の活性化およびＪａｋ２およびＧＨＲの両方のチロシルリン酸化を確立した。ここにおいておよび実施例２に記載するＪａｋ２−ＧＨＲおよびＪａｋ２−エリトロポイエチンレセプターの相互作用は、これらのリガンドに対する生理学的応答におけるチロシルリン酸化の役割についての分子の基礎を提供し、従ってサイトカイン／造血反応のファミリーの構成員の間の共有されたシグナリング機構を明らかにする。序論成長を促進しそして機構を調節する成長ホルモン（ＧＨ）の能力は多年にわたって知られてきている(Cheek、D.B．およびHill、D.E.、¨Effect of growth hormo ne on cell and somatic growth,¨、E.Knobli およびW.H.Sawyer、編、Handbook of Physiolog y、Vol.4:159-185、ワシントン、DC(1974);Davidson、M.B.、Rev.8:11 5-131(1987))が、そのレセプターに結合するＧＨがその多様な応答を引き出す分子の機構は謎のままであった。ＧＨのシグナリングの機構の新しい洞察は、チロシンキナーゼ活性がＧＨ処理した線維芽から調製されたＧＨレセプター（ＧＨＲ）との複合体の中に存在するという証明により提供された(Carter-Su.、 C.ら、J.Biol.Chem.264:18654-18661(1989);Stred、S.E. ら、Endocrinol.130:1626 -1636(1992);Wang、X．ら、J.Biol.Chem.267:17390-17396(1992))。多数のタンパク質の急速なＧＨ依存性チロシルリン酸化、微小管関連タンパク質キナーゼのチロシルリン酸化、および微小管関連タンパク質キナーゼ活性の刺激、ならびにＧＨＲ連合チロシンキナーゼのインヒビターによるこれらの作用の阻害を示す３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞における追加の研究(Campbell、G.S.ら、J.Biol.Chem.268:742 7-7434(1993))は、ＧＨによるシグナリングにおけるＧＨＲ連合チロシンキナーゼのための中心をなす役割を示唆する。最近、非レセプターのチロシルリン酸化された１２２ｋｄのタンパク質がキナーゼ活性ＧＨ−ＧＨＲ調製物において同定された(Wang、X.ら、J.Biol.Chem.268:3573-3579(1993))。自己リン酸化はしばしば活性化されたキナーゼの発現であるので、この１２１ｋdのリンタンパク質はＧＨＲ連合キナーゼであるということが仮定された。この研究において、われわれはＪａｋ２、すなわち、１３０ｋｄのチロシンキナーゼ(Harpur、A.G.ら、Oncogene 7:1347-1553(1992))をＧＨＲ連合キナーゼとして同定する。Ｊａｋ２はＪａｋ１、Ｊａｋ２、およびＴｙｋ２を包含するチロシンキナーゼの最近記載されたＪａｎｕｓファミリーの１構成員である。キナーゼドメインを有することに加えて、これらのタンパク質は第２キナーゼ様ドメインの存在およびＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）、ＳＨ３、および膜スパニングドメインの不存在により特徴づけられる(Wilks、A.F．ら、Mol.Cell.Biol.11:2057-2065(19 91);Firmbach-Kraft、I. ら、Oncogene 5:1329-1336(1990);Harpur、A.F. ら、Onc ogene 7:1347-1553(1992))。ここで、われわれは、ＧＨの結合はＪａｋ２とＧＨＲとの関連、Ｊａｋ２の活性化、およびＪａｋ２およびＧＨＲの両方のチロシルリン酸化を促進することを示す。ＧＨＲのシグナルのトランスダクション経路において初期のシグナリング分子としてのＪａｋ２の同定は、ＧＨＲによるシグナリングおよびＪａｋ２の機能の洞察を提供する。添付の実施例２に提示される研究はＪａｋ２がまたエリトロポイエチン（ＥＰＯ）のレセプターと関連することを示し、そして他のデータはサイトカイン／造血レセプターのファミリー（インターロイキン［ＩＬ］−３のレセプター）、顆粒球−マクロファージのコロニー刺激因子［ＧＭ−ＣＳＦ］、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ］、およびプロラクチン）およびいっそう離れた関係にあるＩＦＮγレセプターの少なくとも４つの他の構成員がＪａｋ２を活性化することを示す（添付の実施例参照）。従って、ここに示すＪａｋ２−ＧＨＲおよびＪａｋ２−ＥＰＯレセプターの相互作用はこの大きいレセプターのスーパーファミリーの多数の構成員によりシグナリングのためのプロトタイプとして働くするように思われる。結果ＧＨはＪａｋ２のチロシルリン酸化を刺激するＧＨＲ連合チロシンキナーゼの存在を確立する従来の研究(Carter-Su.、C.ら、J .Biol.Chem.264:18654-18661(1989);Stred 、S.E. ら、Endocrinol.130:1626-163 6(1992);Wang、X. ら、J.Biol.Chem.268:3573-3579(1993);Campbell、G.S.ら、J.Bio l.Chem.268:7427-7434(1993))に基づいて、ＧＨＲ連合チロシンキナーゼは、第１に、約１２０ｋdのタンパク質であること；第２に、ＧＨに応答してチロシルリン酸化されること；第３に、ＧＨＲとの複合体との複合体の中に存在すること；そして、第４に、ＧＨに応答して増加した活性を示すこと；が期待されるであろう。Ｊａｋ２はＧＨＲ連合キナーゼであるために正しい大きさ（約１３０，０００のＭ_r；実施例１参照）のチロシンキナーゼであり、従ってＧＨＲに応答してリン酸化されるその能力について試験した。ＧＨ処理した３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ線維芽からの安定化タンパク質をＪａｋ２に対する抗血清（αＪａｋ２）で免疫沈降させ、そして抗ホスホチロシン抗体（αＰＹ）イムノブロットにより分析した。細胞を０．５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌまで（使用した標準の濃度）の１０倍増分の範囲の変化する生理的濃度のＧＨと０、０．５、５、５０、および６０分間インキュベートした。Ｊａｋ２に適当なＭ_r（約１３０，０００）をもつタンパク質のＧＨ依存性チロシルリン酸化は、３０秒程度に早い時間にそして５．０ｎｇ／ｍｌ（２３０ｐＭ）程度に低いＧＨの生理的濃度において明瞭に明らかであった。リン酸化は一時的であり、ＧＨの添加後６０分までに大きく減少した。１３０ｋｄのリンタンパク質はαＪａｋ２の免疫沈降物のαＰＹ免疫芽細胞の中に検出された。この１３０ｋｄのタンパク質の出現は、時間経過およびＧＨ投与量の応答で、従来の研究においてｐｐ１２１と表示されたチロシルリン酸化タンパク質の全細胞リゼイトの中の出現に対応した(Campbell、G,S,ら、J.Biol.Chem.268:7427-7434(1993);W ang、X. ら、J.Biol.Chem.268:3573-3579(1993))。これらの２つのチロシルリン酸化の同一性は、チロシルリン酸化ｐｐ１２１およびＪａｋ２の細胞リゼイトにおけるそれらの共移動およびαＪａｋ２で免疫沈降後の細胞リゼイトからのチロシルリン酸化ｐｐ１２１の消耗により示唆される。１３０ｋｄのリンタンパク質はαＪａｋ２により特異的に沈降される。抗体を作るために使用したペプチドで前吸着した、非免疫血清、無関係の免疫血清（α Ｇ−ＬＵＴ−１）、およびαＪａｋ２は、ｐｐ１３０を免疫沈降させることができなかった。ネズミＪａｋ１からの類似のペプチドによるαＪａｋ２の前吸着（実施例１参照）は、αＪａｋ２による１３０ｋdのリンタンパク質の沈降を妨害しなかった。αＪａｋ２を使用するこれらの結果と対照的に、Ｊａｋ１に対して特異的な抗体（αＪａｋ１）およびＴｙｋ２に対して特異的な抗体（αＴｙｋ２）による、それぞれ、３Ｔ３−Ｆ４４２ＡおよびＩＭ−９細胞リゼイトの免疫沈降は、それぞれのタイプの細胞の中のこれらのキナーゼの存在にかかわらず、約１３０ｋｄのタンパク質のＧＨ依存性リン酸化をわずかに明らかにした（αＪａｋ１）か、または全く明らかにしなかった（αＴｙｋ２）。３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞からαＪａｋ２により沈降した１３０ｋｄのタンパク質のチロシルリン酸化は、ＧＨにより特異的に増加した。リン酸化は血小板誘導成長因子、表皮成長因子、またはインスリン様成長因子１により増加しなかった。これらの成長因子はそれらのレセプターに固有のチロシンキナーゼ活性を刺激し(Ulrich、A.およびSchlessinger、J.、Cell 61:203-212(1990)そして３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ線維芽における多数のタンパク質のチロシルリン酸化を促進する(Campb ell、G.S.ら、J.Biol.Chem.268:7427-7434(1993))。Ｊａｋ２チロシルリン酸化を刺激することができないことは、全細胞リゼイトにおけるｐｐ１２１のチロシルリン酸化を刺激するこれらの成長因子の従来報告された不能と一致する(Campbel l、G.S.ら、J.Biol.Chem.268:7427-7434(1993))。Ｊａｋ２はＧＨレセプターと関連するＪａｋ２がＧＨＲと複合体を形成するかどうかを決定するために、ＧＨ−ＧＨＲ複合体および関連したタンパク質を、ＧＨに対する抗体（αＧＨ）を使用して、安定化しＧＨ処理した３Ｔ３−Ｆ４４２Ａから免疫沈降させた。αＧＨ免疫沈降物の中のＪａｋ２の存在はαＪａｋ２を使用するイムノブロッティングによるか、またはαＪａｋ２を使用する免疫沈降およびαＰＹを使用するイムノブロッティングにより評価した。αＧＨを使用して沈降した物質を分析したとき、αＪａｋ２は１３０ｋｄのタンパク質をイムノブロットし、そしてαＪａｋ２が認識するタンパク質を共移動するチロシルリン酸化１３０ｋｄのタンパク質を免疫沈降させることが発見され、Ｊａｋ２をＧＨ−ＧＨＲ複合体と連合することを示す。αＧＨ代わりに、ＧＨＲの細胞質または細胞外のドメインに対する抗体（αＧＨＲ）を使用して初期の免疫沈降を実施したとき、細胞がＧＨとインキュベートしたときにのみ、αＪａｋ２は１３０ｋｄのタンパク質を認識した。ＧＨ結合ＧＨＲとの連合のためにαＧＨＲ沈降物の中のＪａｋ２の存在と一致して、細胞をＧＨとインキュベートしなかったとき、か、または無関係の免疫血清（αＧＬＵＴ−１）を使用して免疫沈降を実施したとき、αＧＨ免疫沈降物のα Ｊａｋ２イムノブロットの中にシグナルは検出されなかった。これらの結果は、ＧＨＲとＪａｋ２との間の複合体の形成のために、ＧＨのそのレセプターへの結合が必要であるという証拠を提供する。Ｊａｋ２であると信じられる１３０ｋdのリンタンパク質に加えて、αＰＹイムノブロットにより同定された約１２０ｋｄの拡散的に移動するリンタンパク質はαＧＨ、αＧＨＲにより沈降し、そしてαＪａｋ２によりより低い程度に沈降する。ＧＨＲであるこの拡散のバンドと一致して、その大きさはこれらの細胞においてＧＨＲについて従来報告された大きさに相当し(Schwartz、J.およびCarter -Su、Endocrinology 122:2247-2256(1988);Stred、S.E.ら、Endocrinol.130:1626-1 636(1992))、そしてそれはαＧＨ免疫沈降物のウェスタンブロットにおけるαＧＨＲにより同定された、同様に拡散する約１２０ｋｄのバンドと共移動する。細胞をＧＨとインキュベートしたときにのみ、チロシル残基がαＧＨＲ免疫沈降物の中に存在する、拡散の１２０ｋｄのタンパク質の中のリン酸化されるという発見は、ＧＨＲのチロシルリン酸化が、Ｊａｋ２のチロシルリン酸化に似て、ＧＨ依存性であるという証拠を提供する。Ｊａｋ２およびＧＨＲの両方がＧＨに応答してチロシルリン酸化されるという追加の証拠は、より小さい（８４ｋｄ）ＧＨＲを発現するトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣の細胞系（ＣＨＯ４）(Eminer、M.ら、Mol.Endocrinol.4:2014-2020(1990);Wang、X.ら、J.Bi ol.Chem.268:3573-3579(1993))において、αＧＨ、αＧＨＲ、およびαＪａｋ２の免疫沈降物の中の１３０ｋｄのタンパク質およびαＧＨおよびαＧＨＲの免疫沈降物の中の拡散的に移動する８４ｋｄのタンパク質のチロシルリン酸化がＧＨ依存性であるという発見により提供される。Ｊａｋキナーゼ活性のＧＨによる刺激従来の研究において、αＧＨ沈降物をＧＨ処理したＣＨＯ４するから調製するとき、ＡＴＰの添加は１３０ｋｄおよび８４ｋｄの両方のタンパク質のチロシルリン酸化を生ずることが確立された(Wang、X.ら、J.Biol.Chem.268:3573-3579(199 3))。このｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいてリン酸化された１３０ｋｄおよび８４ｋｄのタンパク質が、それぞれ、Ｊａｋ２およびＧＨＲであるかどうかを決定するために、ＧＨ−ＧＨＲ複合体および連合したタンパク質をＧＨ処理細胞および対照ＣＨＯ４細胞からαＧＨにより沈降させ、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとインキュベートし、ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝液の中で沸騰させることによって解離させ、そしてαＪａｋ２またはαＧＨＲを使用して再沈降させた。この実験において、α Ｊａｋ２はＪａｋ２に適当な１３０ｋｄの³²Ｐ標識化タンパク質を沈降させることができ、そしてαＧＨＲはＧＨＲに適当な８４ｋｄの³²Ｐ標識化タンパク質を沈降させることができ、Ｊａｋ２およびＧＨＲの両方がｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて³²Ｐを取り込むことができることを示した。Ｊａｋ２がＧＨ依存性チロシンキナーゼとして機能することを評価するために、Ｊａｋ２をＧＨ処理および対照の３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞から、αＪａｋ２を使用する直接の免疫沈降によるか、またはより高い精製度を可能とするために、 αＰＹおよび引き続いてαＪａｋ２を使用する順次の免疫沈降により、精製した。αＪａｋ２免疫複合体を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとインキュベートしたとき、Ｊａｋ２に適当なＭ_r（１３０，０００）で移動する³²Ｐ標識化タンパク質は、細胞をＧＨとインキュベートしたときにのみ、検出され、ＧＨによる活性化に対するＪａｋ２の絶妙な感度を示した。Ｊａｋ２がリンをチロシル残基の中に取り込むことを評価するために、ＧＨ処理した３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞から単離した³²Ｐ標識化１３０ｋｄのタンパク質についてホスホアミノ酸分析を実施した。³²Ｐはほとんどもっぱらチロシル残基の中に取り込まれることが発見され、Ｊａｋ２がＧＨ感受性チロシンキナーゼであることと一致した。少量の³²Ｐ（１％以下）が αＪａｋ２免疫沈降物の中のスレオニン残基の中に取り込まれることは、Ｊａｋ２が混合した機能のスレオニン／セリン／チロシンキナーゼである可能性を残す。論考ＧＨＲのためのシグナリング分子としてのＪａｋ２の同定ＧＨ依存性ＧＨＲ関連チロシンキナーゼとしてのＪａｋ２の同定は、ＧＨＲおよびＪａｋ２の両方によるシグナルのトランスダクションのための重要な関係を有する。ＧＨＲに関すると、Ｊａｋ２はＧＨＲと相互作用しそしてＧＨの結合に応答して活性化されるシグナリング分子として同定される。ＧＨに対するその感受性およびＧＨ添加後の急速な開始は、ＧＨについて知られている最も感受性および急速な応答の間でＪａｋ２のチロシルリン酸化を行う；Ｊａｋ２の活性化はＧＨのシグナルのトランスダクションの開始段階である。チロシンキナーゼはＧＨに帰属されるものに類似する、代謝的応答（例えば、インスリンレセプター）および分化（例えば、神経成長因子のレセプター）を包含する、応答を引き出す（下記の文献により概観されている：Davidson、M.B.、Re v.8:115-131(1987);Isaksson、O.G.P. ら、Endocrinol.Rev.8:426-438(1987);Levi -Montaici、R.、Science 237:1154-1162(1987);Kaplan、D.R.、ら、Science 252:554 -558(1991)）。従って、Ｊａｋ２はＧＨに対する既知の応答を引き出すとき重要な役割を演ずる。これに一致して、ＧＨの結合以外の生物学的機能は、低いレベルのＧＨＲ連合チロシンキナーゼ活性を有する細胞(例えば、COS-7およびマウスL細胞;Leung、D.W. ら、Nature 330:537-543(1987);Wang、X. ら、J.Biol.Chem.267:173 90-17396(1992))において発現されたＧＨＲについて報告されていない。対照的に、種々の生物学的機能(例えば、ＲＩＮ５−ＡＨ細胞におけるインスリンの合成およびチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるタンパク質の合成、微小管関連タンパク質キナーゼ活性、ｃ−ｆｏs遺伝子の発現、および脂質の合成) は、合理的に高いレベルのＧＨＲ連合キナーゼ活性を有する細胞においてクローニングされた肝臓ＧＨＲが発現されるとき、ＧＨの結合により活性化されることができる(Bitlestrup、N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7210-7214(1990);Emine r、M.ら、Mol.Endocrinol.4:2014-2020(1990);Moller、C.、Aspects of the Mechan ism of Growth Hormone Actio n、Ph.D.Thesis、Karolinska Institute、NO-VUM、Hu ddinge、Sweden(1992)、pp.1-9;Wang、X.ら、J.Biol.Chem.267:17390-17396(1992);M oller、C.ら、J.Biol.Chem.267:23403-23408(1992))．さらに、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞において、多数のタンパク質はチロシルリン酸化のＧＨ依存性増加を示す。これらのリン酸化のために要求されるＪａｋ２の活性化に一致して、Ｊａｋ２／ｐｐ１２１のチロシルリン酸化は、試験されたすべての濃度において、ＧＨ依存性チロシルリン酸化を示すすべてのタンパク質のチロシルリン酸化と同時であるか、またはそれに先行する（この研究およびCamp bell、G.S. ら、J.Biol.Chem.268:7427-7434(1993)）。Ｊａｋ２は他のタンパク質をリン酸化することによってＧＨＲのためのシグナリング分子として働く。２つのタンパク質はＪａｋ２の基質として同定された：Ｊａｋ２それ自体およびＧＨＲ。トランケートＧＨＲを使用する研究は、ＧＨＲの細胞質ドメインにおいて、膜に最も近位の４チロシル残基のうちの少なくとも１つはＧＨに応答してリン酸化される。４チロシンのうちのどれがＪａｋ２によりリン酸化されるかを同定するために、ならびに、また、リン酸化されるうるＧＨＲのＣ−末端部分におけるチロシンを同定するために、研究が行われている。Ｊａｋ２およびＧＨＲにおいてリン酸化されたチロシンの同一性および数を決定することは重要である。なぜなら、これらの部位は細胞間のシグナリング経路におけるＳＨ２を含有するタンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ−γ、ｐ８５ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ、およびＧＴＰアーゼ活性化タンパク質；Koch、A.A．ら、Science 252:6 68-674(1991)）のための結合部位であるように思われるからである。リン酸化されたＪａｋ２に結合するＳＨ２含有タンパク質を包含するシグナリング経路はＪａｋ２を活性化するすべてのリガンドにより共有されることが期待されるであろうが、ＧＨＲの中のリン酸化されたチロシル残基に結合するＳＨ２含有タンパク質は、２以上のレセプターにサービスする見掛けの能力をもつキナーゼ（すなわち、Ｊａｋ２）を利用するシグナリング機構に特異性を提供することができるであろう（下を参照）。Ｊａｋ２は、また、ＥＰＯのそのレセプターへの結合後、活性化されることが示された（実施例２）。他のデータは、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびプロラクチンが、また、Ｊａｋ２を活性化することを示す（実施例１参照）。従って、Ｊａｋ２はサイトカイン／造血レセプターのファミリーの多数の構成員のためのキナーゼとして働く。各リガンドは別々の型の応答を引き出すので、キナーゼ活性単独は特異性を説明することができない。前述したように、レセプターのリン酸化に依存する１組の応答は、特異性を提供することができるであろう。さらに、特異性は多数のシグナリング経路の間の相互作用によるか、または特定の細胞のタイプにおけるただ１つのレセプターのタイプの発現により得ることができるであろう。この後者の機構は、適当なレセプターからのｃＤＮＡで感染したＩＬ−３依存性細胞の増殖を剌激するＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＥＰＯの能力により示唆される(Fukunaga、R.ら、EMBO J.10:2855-2865(1991) ;Isizaka-Ikeda、E. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:123-127(1993);Yoshimura、 A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4139-4143(1990))。Ｊａｋ２の活性化の属性の共有は、Ｊａｋ２連結レセプターに結合するリガンドにより活性化される共有される経路が存在することを示唆する。ＩＦＮγにより開始される経路は、ＧＨによる遺伝子の調節の洞察を獲得するために特に重要である。ＩＦＮγに応答して、ＩＳＧＦ−３(ＩＦＮ剌激された遺伝子の因子３) 複合体の９１ｋｄのタンパク質はチロシルリン酸化を行い、次いで核に転座し、ここでそれはＤＮＡにγ活性化された部位において結合する(Shuai、K．ら、Scie nce 258:1808-1812(1992))。ＧＨに応答してリン酸化された９０ｋｄのタンパク質(Campbell、G.S.ら、J.Biol.Chem.268:7427-7434(1993))のＩＳＧＦ−３複合体の９１ｋｄのタンパク質またはファミリーの構成員として同定は、ＧＨが遺伝子の転写に対していくつかの作用を引き出すことができる１つの経路を包含するであろう。ＧＨによるＪａｋ２の活性化ＧＨがＪａｋ２を活性化する正確な機構はまだ知られていない。外因性基質（ポリＧｌｕ、Ｔｙｒ）を使用する初期の研究は、ＧＨＲを対照細胞からよりもＧＨ処理した細胞から調製するとき、より多いチロシンキナーゼ活性がＧＨＲとの複合体の中に存在することを確立した(Stred、S.E．ら、Endocrinol.130:1626-163 6(1992))。この研究は、キナーゼ活性のこのＧＨ誘導増加がＪａｋ２に対するＧＨＲのアフィニティーの増加およびＪａｋ２活性の増加の両方から生ずることを示す。Ｊａｋ２はＧＨＲに直接結合するように思われる。なぜなら、αＰＹおよび次いでαＧＨＲまたはαＧＨを使用する順次の免疫沈降により、高度に精製されたキナーゼ活性ＧＨ−ＧＨＲ複合体をＧＨ処理³⁵Ｓ標識化３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ線維芽から単離したとき、Ｊａｋ２およびＧＨＲに適当な大きさで移動する２つのみのタンパク質が可視化されるからである(Stred、S.E．ら、Endocrinol.130:16 26-1636(19992))。細胞のタンパク質のＧＨ誘導チロシルリン酸化がＧＨＲの二量体化を必要とするように思われるので、ＧＨがＪａｋ２とＧＨＲとの連合およびＪａｋ２の活性化を促進する機構はＧＨＲの二量体化を必要とするようである (Sliva、C.M．ら、Endocrinol.32:101-108(1993))。Ｊａｋ２を介するシグナリングにおけるレセプターの二量体化のための重要な役割は、実施例２に記載するＥＰＯレセプターの二量体化へのＪａｋ２の活性化の研究によりさらに示唆される。ここに報告する結果は、ＧＨＲによるＧＨの結合がＪａｋ２に結合できるリガンド結合ＧＨＲ二量体の形成を生ずるという証拠を提供する。Ｊａｋ２のレクルートメントｈａ、ＧＨ−ＧＨＲ−Ｊａｋ２複合体の形成、Ｊａｋ２チロシンキナーゼ活性の刺激、およびＪａｋ２、ＧＨＲおよび多分他のタンパク質のチロシルリン酸化に導く。活性化されたＪａｋ２がＧＨＲとの複合体の中にのみ存在するか、またはＧＨＲおよびＧＨＲから物理的に離れているリン酸化タンパク質から解離することができるかどうかは現在研究されている。また、ＧＨＲがＪａｋ２以外の、またはそれに加えた、キナーゼとの複合体を形成できる可能性は研究中である。明らかな候補のキナーゼはＪａｋファミリーの他の構成員を包含する。それぞれ、３Ｔ３−Ｆ４４２ＡおよびＩＭ−９細胞において、Ｊａｋ１およびＪａｋ２はＪａｋ２と同じ程度にＧＨＲと連合するように思われない。しかしながら、それらまたは他のまだ同定されていないＪａｋキナーゼは他のタイプ細胞において、または異なる生理学的条件下にそのようになすことができる。要約すると、ここに提示する実験は、実施例２に提示するＥＰＯのレセプターおよびＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、プロラクチン、およびＩＦＮγの他のレセプター（実施例１参照）についての同様な発見と組み合わせて、Ｊａｋ２−レセプターの複合体を包含する機構によるＧＨおよびＥＰＯによるＪａｋ２キナーゼ活性の活性化がサイトカイン／造血ファミリーのレセプターの多数の構成員によるシグナリングのプロトタイプであることを示す。ＧＨＲが重要な初期のシグナリング分子をサイトカイン／造血レセプターのファミリーの他の構成員と共有するという発見は、ＧＨ、ＩＬ−３、ＥＰＯ、プロラクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＦＮγが多少のシグナリング経路を共有するようであることを示す。各レセプターのリン酸化は各リガンドにユニークなシグナリングの能力を提供するので、特異性はなお達成可能である。個々のレセプターの変動する発現、異なる細胞のタイプにおけるすべての可能なシグナリング経路の１サブセットのみの潜在的存在、および他の刺激によるこれらの経路におけるシグナリング分子の調節は、追加のレベルの特異性を可能とする。この発見はＧＨならびにこれらの他のサイトカインの新しい作用の同定に導く。実験手順材料３τ３−Ｆ４４２ＡおよびＣＨＯ４細胞のストックは、それぞれ、Ｈ．グリーン（Ｇｒｅｅｎ）（ハーバード大学、マサチュセッツ州ケンブリッジ）およびＧ．ノーステッド（Ｎｏｒｓｔｅｄｔ）（カロリンスカ研究所[Karonlinska Insti tute]、スウェーデン国ノブム）から提供された。組換えヒトＧＨ（ｈＧＨ）は、エリ・リリイ（ＥｌｉＬｉｌｌｙ）により提供された。血小板誘導成長因子（組換えヒトＢＢ）および組換え表皮成長因子は、コラボレイティブ・リサーチ (Collaborative Research)から入手した。組換えインスリン様成長因子１は、Ｋａｂｌ／ファーマシアから提供された。トリトンＸ−１００（ＳＵＰＦＡＣＴ− ＡＭＰＳＸ−１００）はピアース・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical C ompany)から、アプロチニンおよびロイペプシンはベーリンガー・マンヘイム(BO EHRINGER MANNHEIM)から、組換えプロテインＡ−アガロースはＲＥＰＬＩＧＡＮから、［γ−¹⁷Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｌ／ｍｍｏｌ）はニュー・イングランド・ニュークリアー・コーポレーション(New England Nuclear Corporation)から、そして増強化学発光検出システムはアマーシャム・コーポレーション(Amaersh am Corporation)から入手した。抗体 αＧＨ（ＮＩＤＤＫ−抗ｈＧＨ−１Ｃ３、ロットＣ１１９８１）は、糖尿病および消化性および腎性疾患のナショナル・インスチチュート(National Institut e of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)／ナショナル・ホルモン・アンド・ピチュイタリー・プログラム(National Hormone and Pituitary Progra m)、マリイランド大学およびスクール・オブ・メディシン(School of Medicine ）（バルチモア）から入手した。αＰＹ−ＳｈａｆｅｒはＪ．Ａ．シェイファー（Ｓｈａｆｅｒ）(Merck、Sharp、and Dohme Research Laboratory、ペンシルベニア州ウェストポイント；Pang、D.T．ら、Arch.Biochem.Biophys.242:176-186(19 85))により提供され、そしてαＰＹ−４１Ｇ１０はＵＢＩから購入した。αＪａｋ２はネズミＪａｋ２のドメイン１および２の間のヒンジ領域（アミノ酸７５８ −７７６（配列番号：５）；実施例１参照）に相当する合成ペプチドに対してウサギにおいて調製した。αＪａｋ１はネズミＪａｋ１における対応する領域（アミノ酸７８６−８０４；実施例１参照）に対する合成ペプチドに対して調製した。１つのαＧＨＲ（αＧＨＲ−Ｃ１）はクローニングしたマウス肝臓ＧＨＲの細胞質ドメインに融合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼから構成された融合タンパク質に対してウサギにおいて調製し、そして固定化ＧＨＲ細胞質ドメインを使用してアフィニティー精製した。第２αＧＨＲ（αＧＨＲＰ−ポリ）は、Ｗ．Ｒ．バウムバッチ（Ｂａｕｍｂａｃｈ）博士（アメリカン・サイアナミド［AｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄｏ）、ニュージャージイ州プリンセトン）から贈呈され、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の中で生産された組換えラットＧＨ結合タンパク質を使用してウサギにおいて生産した(Sadeghi、 H．ら、Mol.Endocrinol.4:1799-1805(1990))。αＴｙｋ２はＪ．Ｊ．クロレウスキー（Ｋｒｏｌｅｗｕｓｋｉ）博士（コロンビア大学、ニューヨーク）から贈呈された。αＧＬＵＴ−１はヒト赤血球から精製したバンド４．５を使用してウサギにおいて調製した。それはヒトおよび齧歯類の両方のＧＬＵＴ−１を認識する(Tal、P.-K、ら、J.Biol.Chem.265:21828-21834(1990))。免疫沈降およびウェスタンブロッティング細胞をコンフルエンスに増殖させ、そして従来記載されたように血清を一夜除去した(Wang、X.ら、J.Biol.Chem.268:3573-3579(1993))。細胞を示した時間の間ホルモンまたは成長因子と示されるように３７℃において９５％の空気、５％のＣＯ₂の中でインキュベートし、氷冷１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄の３回の交換ですすぎ、そして氷上の溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％のトリトンＸ −１００、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、および１０μｇ／ｍｌのロイペプチン）の中にすり落として入れた。細胞リゼイトを１２，０００×ｇで１０分間遠心し、そして生ずる上澄みを氷上で示した抗体と９０分間インキュベートした。免疫複合体をプロテインＡ−アガロース上に３０〜６０分間に集め、８℃においてインキュベートし、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％のトリトンＸ−１００、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ）で３回洗浄し、そして溶解緩衝液および（２５０ｍＭのＴｒｉｓ［pＨ６．８］、１０％のＳＤＳ、１０％のβ−メルカプトエタノール、４０％のグリセロール）の混合物の中で５分間沸騰させた。未分画のリゼイトをＴｒｉｓ、ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、およびグリセロールの同一の最終濃度にし、そして５分間沸騰させた。免疫沈降物およびリゼイトをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いで増強化学発光検出システムにより示した抗体（１：１０００〜１：５０００希釈物を使用した）を使用してウェスタンブロット分析した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｇ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７４２７−７４３４（１９９３））。いくつかの実験において、タンパク質を免疫複合体から解離させ、次いで再免疫沈降させた後、ウェスタンブロットにより分析した。免疫複合体の解離および再免疫沈降最初の免疫沈降からの免疫複合体を１回５０ｍＭのＴｒｉｓ、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、等しい体積の２×濃ストックの付加により０．７５％のＳＤＳ、２％のβ−メルカプトエタノール、１００ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのアプロチニン、および１００μｇ／ｍｌのロイペプチンの最終濃度にし、次いで５分間沸騰させた。溶離したタンパク質を１０倍に溶解緩衝液で希釈した。一部分を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料緩衝液と混合（８０：２０）し、そして５分間沸騰させた。残りの試料を氷上で第２抗血清と６０〜９０分間、そしてプロテインＡ−アガロースと８℃において１時間インキュベートした。免疫複合体を３回溶解緩衝液で洗浄し、そして洗浄緩衝液およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料緩衝液の混合物（８０：２０）の中で５分間沸騰させた。キナーゼアッセイのための免疫沈降血清欠乏細胞を２５℃において３０ｎｇ／ｍｌのｈＧＨｔｏ６０分間インキュベートした。比較的長いインキュベーション期間、低いＧＨ濃度、および低い温度を使用して、キナーゼアッセイの間のｐｐ１３０の中への³²Ｐのｉｎｖｉｔｒｏ取り込みを最大にした。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＮａ₂ＣＯ₄，０．１％のトリトンＸ−１００、０．５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン（ｐＨ７．４）（ＨＶＴ）の中で可溶化し、そして４℃において２００，０００×ｇで１時間遠心した。可溶性タンパク質を氷上でαＧＨ（１：１０，０００の希釈）、αＰＹ−Ｓｈａｆｅｒ（５μｇ／細胞のプレート）、またはαＪａｋ２（１：１，５００の希釈）と１時間インキュベートした(Carter-Su.、C.ら、J.Biol.Chem.264:18654-18661(1 989))。プロテインＡ−アガロースをさらに１時間の間８℃においてに添加した。免疫複合体を３回５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、０．５ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．６）（ＮＨＴ）で洗浄し、次いで１回５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、６．２５ｍＭのＭｎＣｌ₃，０．１％のトリトンＸ−１００、０．５ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．６）（ＨＮＭＴ）で洗浄した。 αＰＹおよびαＪａｋ２を使用する順次の免疫沈降 αＰＹ−プロテインＡ−アガロース複合体上に固定化したタンパク質を小さいプラスチックカラムに移し、そして５分間ＨＮＭＴ（溶離緩衝液）中の１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチンと平衡化させた。次いでリンタンパク質を１８０μｌの溶離緩衝液で溶離し、αＪａｋ２（１：２００希釈）を添加し、そしてこの混合物を氷上で１時間インキュベートした。プロテインＡ−アガロースおよび０．７ｍｌの２０ｐｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチンを含有するＨＮＭＴ（リン酸化緩衝液）を添加し、そしてインキュベーションを６℃において１時間続けた。免疫複合体を３回ＮＨＴで洗浄し、そして１回リン酸化緩衝液で洗浄した。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイおよびホスホアミノ酸分析 αＪａｋ２またはαＧＨ上に固定化されたタンパク質を９５μｌのリン酸化緩衝液と混合した。次いで［γ³²Ｐ］ＡＴＰを添加して最終濃度を１０μＭのＡＴＰおよび５ｍＭのＭｎＣｌ₂とした。３０℃において１０分後、ＮＨＴ中の１０ｍＭのＥＤＴＡの添加により反応を停止させた。免疫複合体を３回ＮＨＴで洗浄し、そして１回リン酸化緩衝液で洗浄した。³²Ｐ標識化タンパク質を第２免疫沈降に付すか、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の中で５分間沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。制限した酸加水分解によりハンターおよびセルトンの方法(Hunter、T.および Selton、B.M.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1311-1315(1980))の変更を使用して、従来記載されたように(Carter-Su.、C.ら、J.Biol.Chem.264:18654-18661(1989);S tred、S.E. ら、Endocrinol.127:2506-2516(1990);Wang、X. ら、J.Biol.Chem.267: 17390-17396(1992))、リン酸化タンパク質のホスホアミノ酸含量を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリー従来記載されたように３％〜１０％の勾配のゲル（３０：０．０５アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質を分離した(Carter-Su.、C.ら、J.Biol.Chem.264:18654-18661(1989))。アップル（Ａｐｐｌｅ）ＩＩＥコンピューターに取り付けられたバイオーメド・インスツルメンツ（Ｂｉｏ−ＭｅｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）レーザー走査デンシトメーター（Ｂｉｏ−ＭｅｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＶＩＤＥＯＰＨＯＲＥＳＩＳＩＩデータ分析コンピュータープログラム）を使用して、デンシトメトリーを実施した。実施例４タンパク質チロシンキナーゼＪａｋ２によるインターフェロン−γのシグナル・トランスダクションの経路における突然変異細胞系の欠失の相補性要約細胞表面のマーカーＣＤ２をインターフェロン誘導可能な９−２７遺伝子プロモーターの制御下に配置し、そしてヒトＨＴ１０８０細胞の中に導入した。インターフェロン−α、−βおよび−γに対するＣＤ２のすぐれた応答を示す細胞のクローンを選択し、そして突然変異誘発した細胞のプールをインターフェロン− γに応答するＣＤ２およびクラスＩのＨＬＡの欠陥細胞表面の発現についてスクリーニングした。異なる相補性グループにおける突然変異体を単離した。突然変異体γ−１は試験したすべてのインターフェロン−γ誘導可能な遺伝子の誘導を欠失しているが、インターフェロン−αおよび−βに対する正常の応答を保持する。タンパク質チロシンキナーゼＪａｋ２を使用する突然変異体γ−１のトランスフェクションは、野生型表現型を回復した。インターフェロン−γに対する一次応答におけるＪａｋ２の役割は示された。序論インターフェロン（ＩＦＮ）は細胞に抗ウイルス状態を付与し、そして細胞の増殖および機能の両方に影響を与えることができる(Pestka、S.ら、Annu.Rev.Bioc hem.56:727-777(1987))。ヒトＩＦＮの３つの一次抗原型が存在する：アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）。ＩＦＮｓ−αβおよびＩＦＮ−γによる遺伝子の誘導は別々のレセプターを通してなされる。小さいＩＦＮ−β特異的レセプターの存在は排除することができず(Pellegrini、S.ら、Mol.Cell.Biol.9 :4605-4612(1989))そしてＩＦＮ−αサブタイプの多様性はこれらとＩＦＮ−α βの１または２以上のレセプターとの相互作用が複雑であろうであることを示す。ＩＦＮ−αβおよびＩＦＮ−γの両方のシグナル・トランスダクションの経路に影響を与える突然変異体の単離は、共通の因子が関係することを示した(John、 J,ら、Mol.Cell.Biol.11:4189-4195(1991);McKendry、R、ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:11455-11459(1991))。１つのこのような因子（ｐ９１、以下および実施例４）は最近同定された(Schidler、C.、ら、Science 258;1808-1812(1992);Shuai 、K、ら、Science 258;1808-1812(1992)。ＩＦＮ−結合成分は両方の一次レセプターについてクローニングされた(Aguet、M.、ら、Cell 55:273-280(1988);Uze、G.、ら、Cell 60:225-234(1990))。シグナル・トランスダクションのサブユニットはなお単離すべきであるが、ＩＦＮｓ−αおよび−βに応答して活性化された、一次転写因子ＩＳＧＦ３のｐ４８、ｐ８４、ｐ９１およびｐ１１３のポリペプチド成分はクローニングされ、そして特性決定された(Veals、S.A．ら、Mol.Cell.Biol.12: 3315-3324(1992);Sch1ndler、C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7836-7839(1992) ；;Schindler、C．ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7840-7843(1992))。ＩＦＮ− αに応答するｐ９1、ｐ８４およびｐ１１３およびＩＦＮ−γに応答するｐ９１およびｐ８４のチロシンへの急速なリン酸化が存在する(Shuai、K．ら、Science 258;1808-1812(1992))。さらに、主としてＩＦＮ−αβ応答性６−１６遺伝子プロモーターの制御下に薬物選択可能なマーカーを発現する細胞から単離された突然変異体Ｕ１Ａ（１１．１）の相補性は、ＩＦＮ−αβ応答経路におけるタンパク質チロシンキナーゼＴｙｋ２のための役割を明らかにした(Velazquez、L.、ら、Cell 70:313-322(1992))。ここで、別の選択技術を使用して、タンパク質チロシンキナーゼの同一ファミリーの他の構成員である、Ｊａｋ２によるＩＦＮ−γ における突然変異体の相補性(Wilks、A.F．ら、Mol.Cell.Biol.11:2057-2065(1991 );Harpur、A.G．ら、Oncogene 7:1347-1353(1992);Firmbach-Kraftら、Oncogene 5 :1329-1336(19990); 実施例1)が報告された。結果９−２７遺伝子プロモーターはＩＦＮ−γならびにＩＦＮｓ−αおよび−βにより誘導可能である(Reid、L.E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:840-844(1989)) 。このプロモーターからの有意な構成的発現は薬物選択のプロトコールを妨げた。従って、９−２７プロモーターの制御下に単純細胞表面のマーカーＣＤ２（通常Ｔ細胞上でのみ発現される）を発現する細胞のクローン（２Ｃ４）を誘導し、そして蛍光活性化細胞のソーター（ＦＡＣＳ）を使用してＩＦＮ−γの誘導能力の喪失または獲得についてスクリーニングした。また、内因性クラスＩおよびＩＩのＨＬＡのＩＦＮ誘導可能な発現が挙げられる。２Ｃ４細胞において、ＩＦＮ −γによりすべての３つの抗原およびＩＦＮ−αによるＣＤ２およびクラスＩのすぐれた誘導が観察された。突然変異体γ−１は２Ｃ４の突然変異誘発および数ラウンドの選別により単離された。シス突然変異体よりむしろトランスの単離および二次ＩＦＮ−γ応答経路よりむしろ一次の単離を増強するために、最後の２つの選別をＣＤ２およびクラスＩについて実施した。突然変異体γ−１はＩＦＮ−γに対する応答を欠失していたが、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに対しては欠失していなかった。しかしながら、ネズミＪａｋ２発現構成体（実施例１）を使用するこの突然変異体のトランスフェクションは、トランスフェクション体の濃縮した集団およびクローンにおけるすべての３つの細胞表面のマーカーのＩＦＮ−γの応答を回復した。ネズミＪａｋ１を使用するトランスフェクションは、同一構成体において、無効であった。ＩＦＮ−γ誘導可能なｍＲＮＡのスペクトルの発現を、また、ＲＮアーゼの保護によりモニターした。試験したすべての８つのＩＦＮ誘導可能なｍＲＮＡについて、陽性のＩＦＮ−αの応答（ＩＲＦ１およびＧＢＰについて最小）は２Ｃ４、突然変異体γ−１およびγ−１／Ｊａｋ２トランスフェクション体について同一であったが、ＩＦＮ−γについて、２Ｃ４において観察された応答はγ−１において喪失したが、γ−１／Ｊａｋ２トランスフェクション体において回復した。ガンマ活性化配列（ＧＡＳ）のモチーフはｐ９１によるＧＢＰおよびＩＲＦ１遺伝子の一次のＩＦＮ−γの応答を伝達するとして同定された（参照、実施例1; Decker、T.、ら、EMBOJ.10:927-932(1991);Kanno、Y.、ら、Mol.Cell.Biol.13:3951-3 963(1993)）。試験した遺伝子の残りの一次のＩＦＮ−γの応答を支配するＤＮＡ要素／因子を、なお厳密に確立しなくてはならない。しかしながら、試験した遺伝子のすべてが影響を受けるという事実は、一次のＩＦＮ−γの応答経路にある突然変異体γ−１における欠陥と一致する。すべての場合において、ＩＦＮ−γの応答はＪａｋ２により回復され、そして野生型２Ｃ４およびγ−１／Ｊａｋ２トランスフェクション体についての投与量応答曲線は本質的に同一であった：明瞭な応答が１０ＩＵ／ｍｌにおいて見られ、そして１００ＩＵ／ｍｌにおける最大の応答に近づいた。ＩＦＮ−γの回復は機能的Ｔｙｋ２発現のクローンを使用するγ−１細胞のトランスフェクションで観察されずそして、逆の実験において、Ｊａｋ２はＵ１突然変異体においてＴｙｋ２における欠陥を補足しなかった。野生型に匹敵するレベルがＪａｋ１およびＴｙｋ２の場合のように、ウェスタン転移で観察されたので、突然変異体γ−１細胞における欠陥はＪａｋ２タンパク質の不存在を反映しない。Ｊａｋ２を免疫沈降させそしてウェスタン転移をプロービングするために使用した抗ペプチド抗体はＪａｋ１とＪａｋ２とを区別するように設計し、そしてＪａｋ２に対して高い特異性を有する（実施例１〜２参照）。従って、γ−１における突然変異はＪａｋ２の機能に影響を与えるが、その生産に影響を与えない点または他の突然変異を反映することができる。また、突然変異は上流の成分であることができ、この成分は、１つの突然変異されると、正常のレベルの内因性ヒトＪａｋ２と生産的に相互作用することができないが、高いレベル（実施例５参照）のトランスフェクションされたネズミＪａｋ２によりレスキューされる。関係する突然変異の正確な特質を確認することができる前に、実質的な追加の研究を必要とするであろう。しかしながら、突然変異体γ−１における欠陥は、ＩＦＮ−γのそのレセプターへの結合に明らかな主要な作用を与えない。本質的に同一の結合は、野生型２Ｃ４および突然変異体γ−１の細胞を使用して再現的に観察された。これは突然変異Ｕ１Ａ（もとのコード１１．１）を使用する状況と対照的であり、ここでＴｙｋ２における欠陥はＩＦＮ−αについての高いアフィニティーのレセプターの結合の喪失を生ずる(Pellegrini、S.ら、Mol.Cell.Biol .9:4605-4612(1989))。この欠陥が、それぞれ、Ｕ１Ａおよびγ−１におけるＪａｋ２タンパク質ではなくＴｙｋ２の不存在を反映するか、または２つのキナーゼのそれらのそれぞれのレセプターの複合体との推定上の相互作用のいっそう基本的な差を反映するかどうかを決定することは興味あることであろう。Ｊａｋ２タンパク質は、Ｔｙｋ２と同様に、野生型細胞におけるＩＦＮｓγまたは−α に応答して有意に誘導されるように思われない。論考ここで、試験したすべての遺伝子のＩＦＮ−γの応答を欠如する、突然変異のヒト細胞系はネズミＪａｋ２により補足されることが示された。実施例５は下記の事実を示す：（１）突然変異体γ−１における欠陥は一次応答の経路において初期であるという直接の証拠；（２）Ｊａｋ２はＩＦＮ−γに応答してチロシン上で急速にリン酸化される；そして（３）突然変異の細胞ではなく、野生型において、ＩＦＮ−γに応答するＪａｋ２の急速な活性化および（自己）リン酸化と一致する結果。 γ−１における突然変異の正確な特質に無関係に、これらのデータは一次のＩＦＮ−γの応答におけるＪａｋ２の必須の役割を示す。ＩＦＮ−γの応答経路における追加の相補性のグループにおけるＪａｋ２に対する抗体および突然変異体の入手可能性は、この応答に関係する成分の数および特質の決定において無価値であることを証明するであろう。方法および材料野生型２Ｃ４、突然変異体γ−１細胞およびネズミＪａｋ１ｃＤＮＡ発現構成体で安定にトランスフェクションされた突然変異体γ−１細胞上のＩＦＮｓ−α または−γに応答するトランスフェクションされたＣＤ２および内因性クラスＩおよびＩＩのＨＬＡの細胞表面の発現。濃縮された集団およびγ−１／Ｊａｋ２トランスフェクション体のクローンについてＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）分析装置（３０００データ点、Ｃｏｎｓｏｒｔ３０）を使用してデータを発生させた。細胞を５×１０⁵／１０ｃｍ皿にプレートし、そして次の日に１０³ＩＵ／ｍｌの高度に精製したα−ＩＦＮｓの混合物（ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ１．５×１０⁸ＩＵ／ｍｇのタンパク質、ＷＥＬＬＣＯＭＥＲＥＳＥＡＲＣＨＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳにより供給された、Ｂｅｃｋｅｎｈａｍ、英国）または組換えヒトＩＦＮ−γ（４×１０⁷ＩＵ／ｍｇのタンパク質、ＧｕｎｔｅｒＡｄｏｌｆ博士から入手した、ＥｒｎｓｔＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＡｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、オーストリア国ヴィエンナ、そして商業的にまたは容易に入手可能である）で処理した。細胞（１０⁶）を３０分間０℃においてヒトＣＤ２に対するＲ−フィコエリスリン接合ネズミモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ−ＣＤ２ＭＴ９１０、ＤＡＫＯＡ／Ｓデンマーク国）またはＨＬＡＤＲＡ（クローンＬ２４３、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、またはヒトＨＬＡＡＢＣに対するＦＩＴＣ−接合ネズミモノクローナル抗体（共有決定因子、クローンＷ６／３２、ＳＥＲＡＬＡＢ、英国）で染色し、そして１％のパラホルムアルデヒドで固定した。クローン２Ｃ４を、ヒトＨＴ１０８０細胞の安定な共トランスフェクションにより、Ｇ４１８耐性クローンのｐＤＷ９−２７／ＣＤ２およびｐＴＫＮｃｏおよびＦＡＣＳＣＡＮ分析を使用して誘導した。ｐＤＷ９−２７Ｄ２はＰＪ３オメガの修飾であり(Morgaenstern、J.P.、Nucl.Acids Res.18:1068(1990))この修飾においてＳＶ４０プロモーターは９−２７遺伝子の１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｐＭＩＩプロモーター断片で置換されておりそして前記修飾はポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位に全長のＣＤ２ｃＤＮＡ(Sewel、W.A.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:871 8-8722(1986))を有する。ＩＣＲ１９１を使用する突然変異誘発（５ラウンド）は従来記載された(McKen dry、R、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11455-11459(1991))。ＦＡＣＳＲＡＲＰｌｕｓ細胞ソーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＩＦＮ−γに対して応答しない細胞を「選択」した。５×１０⁷の突然変異誘発させた細胞を５００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−γで４８時間処理し、再懸濁させ、そしてフィコエリスリン接合したＣＤ２に対する抗体および（最後の２回の選別）ＦＩＴＣ接合したＨＬＡクラスＩに対する抗体（上を参照）で染色し、そして直ちに選別した。蛍光を発する細胞の下部５％を集めた。６ラウンドの選別後、クローンγ−１を濃縮集団の限界希釈により単離した。それは従来記載された他のＩＦＮ−γ突然変異体と区別される新規なＩＦＮ−γ^- −α⁺−β⁺表現型を示した(Loh、J.E.、ら、EMBO J.11:1351-1363(1992);Mao、c. 、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2880-2884(1993))。この表現型は少なくとも３カ月間連続的培養に対して安定であった。突然変異体γ−１は、プロマイシン選択可能なマーカーのプラスミドの存在において、ｐＲＫ５の中のＣＭＶプロモーターから下流のネズミＪａｋ２の全長のｃＤＮＡでトランスフェクションすることによって補足された。安定なトランスフェクション体のプロマイシン耐性集団を組換えＩＦＮ−γで処理し、ＦＡＣＳ選別し、そして応答細胞の上部７％を集めそして分析した。濃縮した集団の限界希釈により得られた、γ−１／Ｊａｋ２トランスフェクションされた細胞のクローンを、また、分析し、それについてＩＦＮ−γ応答の完全な回復が観察された。野生型２Ｃ４、突然変異体γ−１および突然変異体γ−１／Ｊａｋ２でトランスフェクションされた細胞におけるＩＦＮ誘導可能な遺伝子の発現：ＩＦＮｓ− αまたは−γに応答するｍＲＮＡの発現を、下記のＩＦＮ誘導可能なｍＲＮＡを検出するためのプローブを使用して、ＲＮアーゼ保護によりモニターした：９− ２７、６−１６、２−５ＡおよびＩＳＧＦ３γ遺伝子およびｐ９１／８４ＩＳＧＦ３γ遺伝子のｐ９１およびｐ８４の交互にスプライスされた生成物およびＩＲＦ１およびＧＢＰ遺伝子。γ−アクチンｍＲＮＡの保護は内部の負荷の対照として働いた。細胞質ＲＮＡを単層細胞からＮＰ４０溶解およびフェノール／クロロホルムの抽出により調製した(Porter、A.C.G.、ら、EMBO J.7:85-95(1988))。ＲＮアーゼの保護は２〜５×１０⁸ｃｐｍ／μｇのインプットＤＮＡに³²ＰＵＴＰで標識化したＲＮＡプローブを使用して実施した(Melton、D.A.、ら、Nucl,Acids Res.12:7035-7056(1984))．１〜３×１０⁵ｃｐｍの各プローブおよび１０μｇのＲＮＡを各アッセイにおいて使用した。野生型２Ｃ４、突然変異体γ−１細胞およびネズミＪａｋ２でトランスフェクションされた突然変異体γ−１細胞（γ−１Ｊａｋ２ｔｒ）の中のＪａｋ２の発現：Ｊａｋ２タンパク質を前清浄した細胞抽出物（１０⁷細胞）からＪａｋ２に対する抗血清（実施例１）およびプロテインＡセファローズ(PHARMACIA;John、J. ら、Mol.Cell.Biol.11:4189-4195(1991))で免疫沈降させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＪａｋ２に対する抗体を使用するウェスタン転移およびＥＣＬ検出システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国）により分析した。突然変異体γ−１について、細胞抽出物の免疫沈降は抗血清をレイズさせたＪａｋ２ペプチド（Ｊａｋ２ｐｅｐｔ）、または、非特異的対照として、無関係のＪａｋ１ペプチド（Ｊａｋ１）の不存在（ペプチドなし）または存在（３０μｇ／ｍｌ）において実施した。２Ｃ４および突然変異体γ−１細胞への¹²⁵Ｉ標識化ＩＦＮ−γの結合：¹²⁵Ｉ −ＩＦＮ−γ（６６７Ｃｉ／ｍＭ、ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国）処理は、１０⁶細胞の三重反復実験の試料を使用して０℃において９０分間実施した。非特異的結合を減じた。それは平行に２００倍過剰の非標識化ＩＦＮ−γの存在において決定し、そして合計の結合した放射能のほぼ４０％を表した。平行の抗ウイルスアッセイＥＭＣウイルスに対して１ｆｍｏｌｅの¹² ⁵ Ｉ−ＩＦＮ−γは０．１５ＩＵに等しかった。ここで最高のＩＦＮ−γ濃度における比結合は約６０００レセプター／細胞に相当した。ＩＦＮをより低い比活性に希釈すると、飽和結合がほぼ１０，０００レセプター／細胞において観察された。実施例５：インターフェロン−γに応答するタンパク質チロシンキナーゼＪａｋ２の活性化要約突然変異体γ−１細胞は通常インターフェロン−αおよび−βに対して応答するが、インターフェロン−γに対して試験したすべての遺伝子の応答を欠く。突然変異体はタンパク質チロシンキナーゼＪａｋ２により補足することができる（実施例４）。野生型細胞において、転写因子ｐ９１は、一次のインターフェロン −γのシグナル・トランスダクション経路において中心となる役割を演じ、インターフェロン−γに応答してチロシン上で急速にリン酸化される。このようなリン酸化は突然変異体γ−１細胞において起こらないが、それはＪａｋ２を使用してγ−１細胞を補足するとき回復する。そのうえ、Ｊａｋ２は野生型細胞の中でインターフェロン−γに応答してチロシン上でそれ自体急速にリン酸化される。Ｊａｋ２のインターフェロン−γ依存性リン酸化は、また、ヒトおよびマウスの細胞からの免疫沈降のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて観察される。このようなリン酸化は突然変異体γ−１細胞において、またはインターフェロン −αに応答して見られない。これらの結果は、一次のインターフェロン−γのシグナル・トランスダクション経路において初期のＪａｋ２についての役割を示す。結果インターフェロン（ＩＦＮｓ）−α、−βおよび−γは明確なレセプターにより遺伝子のオーバーラップする組を誘導する(Pestka、S.ら、Ann.Rev.Biochem.56: 717-777(1987))。関係するシグナル・トランスダクション経路の理解は最近急速に進歩してきている。この中心はｐ９１、すなわち、複合体のＩＦＮ−αβ−誘導可能な転写因子ＩＳＧＦ３の成分、はＩＦＮ−αβおよび−γの応答経路において二重の役割を演ずるという認識であった。ｐ９１はいずれの型のＩＦＮにも応答してチロシン上で急速にリン酸化される (Schindlerら、Science 257:809-813(1992);Schidler、C.ら、Science 258;1808-18 12(1992))。これに一致して、ｐ９１は広いスペクトルの遺伝子のＩＦＮ−γの応答のために要求される。それはＧＢＰ遺伝子の転写の活性化のために必要であるとして最初に同定された、ガンマ活性化因子（ＧＡＦ）に相当するように思われ(Decker ら、EMBO J.10:927-932(1991)）そして、それ以来、共通のＤＮＡのモチーフを通してＩＦＮ−γに応答してある数の追加の遺伝子の活性化に関係づけられた(Shuaiら、Science 258;1808-1812(1992);Pearse ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:4314-4318(1993);Knnoら、Mol.Cell.Biol.13:3951(1993))。従って、突然変異体γ−１をｐ９１のリン酸化についてアッセイした。ｐ９１のリン酸化は、³²Ｐ_iの取り込みによりモニターし、野生型２Ｃ４細胞において急速に起こる。このようなリン酸化は突然変異体γ−１において観察されなかった。ｐ９１のリン酸化は、Ｊａｋ２で補足したγ−１細胞において、³²Ｐ_iの取り込みによりまたはホスホチロシンに対する抗体でモニターしたとき、起こらなかった。正常のレベルのｐ９１が存在しそして、興味あることには、ＩＳＧＦ３α のｐ９１およびｐ１１３成分のＩＦＮ−αによるリン酸化は突然変異体の細胞において正常であった。ＩＦＮｓ−αまたはγに応答するＩＳＧＦ３αのｐ８４成分のリン酸化は常に低く、そしてしばしば検出困難であった(Schindlerら、Scie nce 257:809-813(1992);Shuaiら、Science 258;1808-1812(1992))。さらに、γ−１細胞は機能的ｐ９１発現構成体により補足可能でない。従って、γ−１細胞における欠陥はｐ９１より上流に存在する。特定の抗体を使用する免疫沈降および引き続くホスホチロシンに対する抗体を使用する免疫沈降物のウェスタン転移分析により、Ｊａｋ２のチロシンリン酸化をモニターした。これに基づいて、Ｊａｋ２は野生型においてＩＦＮ−γに応答してチロシン上で急速にリン酸化されるが、突然変異体γ−１細胞においてリン酸化されない。ＩＦＮ−αによるＴｙｋ２のリン酸化が容易に検出される条件と同一の条件下に、ＩＦＮ−αに応答するＪａｋ２のこのようなリン酸化は観察されなかった。ＩＦＮ−γに応答するｐ９１およびＩＦＮ−αに応答するｐ１１３のチロシンリン酸化を、ＩＦＮ活性およびホスホチロシンの検出の両方のための内部の対照として、Ｐｙ−２０および４Ｇ１０抗ホスホチロシン抗体の混合物を使用して平行にモニターした。同一転移をＪａｋ２に対する抗体で再プロービンすると、匹敵するレベルのＪａｋ２タンパク質が野生型およびγ−１突然変異体の細胞において検出された。従って、γ−１における欠陥はJａｋ２の生産よりむしろリン酸化／機能においてである（実施例４参照）。推測すると、Ｊａｋ２の見掛けのリン酸化は免疫学的的に交差反応するタンパク質のものであろう。しかしながら、使用した抗血清は、Ｊａｋ１において保存されずそしてJａｋ２に対する高い特異性を有するＪａｋ２ペプチドに対してレイズされた（実施例１および２参照）。これに一致して、適当な競合するペプチドの存在において免疫沈降を実施したとき、リン酸化されたタンパク質は回収されなかった。 γ−１／Ｊａｋ２トランスフェクション体において、ＩＦＮ−γ処理の不存在においてさえ、過度に発現された外因性ネズミＪａｋ２の高い「バックグラウンドの」レベルのチロシンリン酸化が存在する。この基礎は知られていない。このバックグラウンドに対して、補足された細胞におけるＩＦＮ−γに対する応答において、Ｊａｋ２の全体のチロシンリン酸化の変動する増加が見られる。しかしながら、興味あることには、アッセイしたとき、γ−１／Ｊａｋ２トランスフェクション体においてＪａｋ２のリン酸化の明らかな増加が観察されなかった実験においてさえ、平行のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセィにおいて、ＩＦＮ−γ に対する実質的な応答が絶えず観察された（下を参照）。従って、トランスフェクションされたＪａｋ２はＩＦＮ−γに応答してリン酸化されることができる。野生型細胞においてＩＦＮ−γに応答して観察されるリン酸化はＪａｋ２のためのものであると結論することは合理的である。成長因子に応答するタンパク質チロシンキナーゼの活性化は、古典的には、活性化された酵素の免疫沈降物において検出できるキナーゼ活性を生ずる。ＩＬ３（実施例１）およびエリトロポイエチン（実施例２）に応答して活性化されたＪａｋ２は、同様な見かけ上のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを示す。また、これはＩＦＮ−γに応答するＪａｋ２の場合である。野生型２Ｃ４または突然変異体γ−１／Ｊａｋ２トランスフェクションされた細胞からのＪａｋ２免疫沈降物をアッセイすると、ＩＦＮ−γ依存性キナーゼ活性が観察された。ＩＦＮ−α に対して応答において、または免疫沈降物を突然変異体γ−１細胞からまたは競合するＪａｋ２ペプチドの存在において野生型細胞から調製したとき、このような活性は観察されなかった。Ｊａｋ２のリン酸化はヒトＨＴ１０８０誘導細胞に限定されずそして、また、他のヒトおよび、マウスＬ−細胞を包含する、種々のマウス細胞系において、ＩＦＮ−γに対する応答において見られるが、ＩＦＮ− αに対する応答において見られない。論考ここに提示された結果を実施例４における結果と総合すると、Ｊａｋ２はＩＦＮ−γに応答して活性化され、そしてこのような活性化は一次のＩＦＮ−γの応答経路の初期においてある役割を演ずることが示される。ｐ９１が同一部位（Ｔｙｒ７０１）においてＩＦＮ−αおよびγに応答してリン酸化することが認められると(Schindlerら、Science 257:809-813(1992);Shuaiら、Science 258；1808- 1812(1992))、ＩＦＮ−αに応答するγ−１突然変異体の中のｐ９１の正常のリン酸化はこれに関して興味を起こさせる。Ｔｙｋ２またはＪａｋ２の各々は同一チロシンのリン酸化を実施することができまたは、いっそう興味あることには、関係する１または２以上の追加のキナーゼが存在すると結論することができる。Ｊａｋ２の活性化に関すると、エリトロポイエチンの場合において、これはエリトロポイエチンレセプターとのＪａｋ２の直接の相互作用を通して起こるように思われる（実施例２）。ＩＦＮ−γ経路の場合において同様な相互作用が存在する場合、明らかにかなり興味を起こさせるであろう。エリトロポイエチン、ＩＬ３およびある数の他のサイトカイン（実施例１〜３参照）によるＪａｋ２の共通の活性化は明らかな問題を発生させる。将来の研究の突進は、Ｊａｋ２と相互作用するタンパク質の特質および応答の特異性を決定する因子を同定することであろう。方法および材料正常および突然変異体のγ−１細胞におけるＩＦＮ−γに応答するｐ９１のチロシンリン酸化：野生型（２Ｃ４）、突然変異体γ−１およびＪａｋ２でトランスフェクションされた突然変異体γ−１細胞におけるＩＦＮ−γに応答するｐ９１のリン酸化を、³²Ｐ１１３の取り込みによるか、または抗体を使用するホスホチロシンの中へのウェスタン転移によりモニターした。ウェスタン転移により、ｐ９１タンパク質のレベルならびに１０³ＩＵ／ｍｌにおける１５〜３０分間のＩＦＮ−αに応答するＩＳＧＦ３のｐ９１およびｐ１１３成分のチロシンリン酸化をモニターした。従来記載されたように、ｐ９１に対する抗体およびプロテインＡセファローズ（ファーマシア）を使用して、前清浄した全細胞抽出物（１０⁷ 細胞）からｐ９１を免疫沈降させ(Schindlerら、Science 257:809-813(1992);Sh uaiら、Science 258;1808-1812(1992))そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン転移により、ＰＹ２０（ＩＣＮ）および４Ｇ１０（ＵＢＩ）抗ホスホチロシン抗体の混合物そして、０．１ＭのＴｒｉｓＨ１ｐＨ８．０の中でストリッピングした後、ｐ９１に対する抗体を使用して分析した。ｐ９１およびｐ１１３（ＩＦＮ−α活性化ＩＳＧＦ３αの中で複合化した）をｐ１１３に対する抗体で共免疫沈降させ(Schindlerら、Science 257:809-813(1992))そして上のような抗ホスホチロシン抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン転移により分析した。ウェスタン転移において、ジアミノベンジジン（アマーシャム、英国）で染色したｐ９１抗体のスクリーニングした転移を除外して、検出はＥＣＬ（アマーシャム、英国）により実施した。野生型２Ｃ４、突然変異体γ−１および突然変異体のγ−１Ｊａｋ２トランスフェクションした細胞における、ＩＦＮ−αでなく、ＩＦＮ−γに応答するＪａｋ２のチロシンリン酸化：Ｊａｋ２、および対照としてｐ９１およびｐ１１３のリン酸化を、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびホスホチロシンについてＰｙ− ２０および４Ｇ１０抗ホスホチロシン抗体の混合物を使用するウェスタン転移およびＥＣＬ（アマーシャム・インターナショナル）により検出により、モニターした。ＩＦＮ−γ処理した細胞からの抽出物を、Ｊａｋ２およびｐ１１３に対する抗体の混合物（後者はＩＦＮ−α活性化ＩＳＧＦ３の中で０９１と共沈降物する）で免疫沈降させた。同一ブロットをストリッピングし（前述したように）そしてＪａｋ２に対する抗体で再プロービングした。ＩＦＮ−γで１５分間処理した細胞からの抽出物を、Ｊａｋ２に対する抗体をレイズさせたＪａｋ２ペプチドまたは無関係のＪａｋ１ペプチドの０．１ｍｇ／ｍｌの、示すように、存在または不存在において、Ｊａｋ２に対する抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン転移により、上のようのようなホスホチロシンに対する抗体を使用して分析した。細胞の増殖および１０³ＩＵ／ｍｌの高度に精製したＩＦＮ−γまたはーαを使用する処理は前述した通りであった。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ：Ｊａｋ２のＩＦＮ依存性リン酸化は、（Ａ）野生型（２Ｃ４）および突然変異のγ−１／Ｊａｋ２でトランスフェクションされた細胞、（Ｂ）野生型（２Ｃ４）および突然変異体γ−１細胞および（Ｃ）マウスＬ−細胞からの免疫沈降においてアッセイした。示すようにＩＦＮ −γまたは−α（５００ＩＵ／ｍｌ）を使用する処理は１５分間であった。プロテインＡセファローズ（ファーマシア）上の免疫沈降物を５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＭｎＣｌ₂、０．１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４の中で洗浄し、そして０．２５ｍＣｉ／ｍｌの³²Ｐ−γ −ＡＴＰを含有する同一緩衝液の中で室温において３０分間インキュベートした（実施例１〜２参照）。よく洗浄した後、タンパク質を試料緩衝液の中に溶離し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。前述したように、検出はオートラジオグラフィーによるか、またはホスホチロシンについてウェスタン転移により実施した。ヒト細胞の増殖およびＩＦＮ処理は前述したように実施した。マウスＬ −細胞の増殖およびＩＦＮ処理は同様であったが、組換えネズミＩＦＮ−γ（１〜２×１０⁷ＩＵ／ｍｇタンパク質、グンター・アドルフ（ＧｕｎｔｅｒＡｄｏｌｆ）博士（ＥｒｎｅｓｔＢｏｅｒｉｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＡｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｈｕｎｇ、オーストリア国ヴイエンナ）から贈呈された、および組換えヒトＩＦＮ−αＡ／Ｄ（Ｂｇｌ）、マウス細胞上の高度に活性なハイブリッド（２×１０⁸ＩＵ／ｍｇのタンパク質、シドニー・ペストカ［ＳｉｄｎｅｙＰｅｓｔｋａ］博士［ＲｏｂｅｒｔＷｏｏｄＪｏｈｎｓｏｎＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ、米国ニュージャージイ州］から提供された）を使用した。実施例６：ＥＰＯ活性（ジーンステイン）のインヒビターはＪａｋ２キナーゼ活性を阻害するＪａｋ２の生化学的活性をｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの使用により証明することができる。このアッセイにおいて、精製したＪａｋ２をプロテインＡ −セファローズに結合したＪａｋ２特異的抗血清を使用して、細胞リゼイトから沈降させる。次いで、免疫沈降したＪａｋ２をキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＭｎＣｌ₂、０．１ｍＭのＮａ₃ ＶＯ₄、１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４）で洗浄し、引き続いて室温において等しい体積の０．２５ｍＣｉ／ｍｌの³²Ｐ−ガンマ−ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液と３０分間インキュベートした。よく洗浄した後、タンパク質をＳＤＳ −ＰＡＧＥのために試料緩衝液で溶離し、そして７％のゲル上で特異的する。次いで、３２を含有するタンパク質をオートラジオグラフィーにより可視化する。このアッセイ系を使用して、活性なＪａｋ２は適当なサイトカイン、例えば、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）で処理してある哺乳動物細胞の中にのみ存在することが証明された。従って、Ｊａｋ２の触媒活性の活性化はこれらのサイトカインと相関する。この相関は、ジーンステイン（ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ）として知られているチロシンキナーゼ特異的インヒビターを使用して研究により、さらに支持される。ジーンステインは細胞の増殖を刺激するＥＰＯの能力を阻害することが知られている。前述のｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにジーンステインを０．１ｍＭで含めると、Ｊａｋ２のチロシンキナーゼ活性は２倍減少する。従って、ＥＰＯ誘導の細胞増殖に対するジーンステインの阻害作用は、Ｊａｋ２のその阻害により説明することができる。実施例７：昆虫細胞からの構成的に活性なＪａｋ２キナーゼの生産Ｊａｋ２の活性の形態は、適当なサイトカインで刺激した後にのみ、哺乳動物細胞から単離することができるので、われわれはサイトカインの刺激を必要としない、触媒的に活性なＪａｋ２の発現のための系を開発した。詳しくは、昆虫細胞の中で高いレベルで発現されたとき、Ｊａｋ２は構成的に活性な状態にある。バキュロウイルスの転移ベクターｐＶＬ１３９２（ファーミンゲン［ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ］、カリフォルニア州サンディエゴ）のＮｏｔＩおよびＳｍａＩ部位の間にＪａｋ２ｃＤＮＡを挿入することによって、この発現は達成された。次いで、このＪａｋ２／ベクターの構成体を欠陥バキュロウイルスＤＮＡ（ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤＤＮＡ、ファーミンゲン、カリフォルニア州サンディエゴ）と、昆虫細胞の中に共トランスフェクションした。実施例８：Ｊａｋ３のクローニング、発現および活性多数のサイトカインは、サイトカインレセプターのスーパーファミリーのレセプターとの相互作用により、成長および分化を調節する。サイトカインレセプターは、触媒ドメインを欠如するが、リガンドの結合をタンパク質のチロシンリン酸化の誘導にカップリングする。最近の研究において、Ｊａｎｕｓキナーゼ（Ｊａｋ）のファミリーの１または２以上の構成員はサイトカインレセプターと連合し、リガンドの結合後、チロシンリン酸化されそして活性化されることが示された。報告されたＪａｋファミリーの構成員のいずれも、ＩＬ−２またはＩＬ−４のシグナリングにまだ関係づけられてきていない。ここで、われわれは新しいＪａｋファミリーのキナーゼ、すなわち、Ｊａｋ３を記載し、そしてＪａｋ３、および少ない程度にＪａｋ１、は、チロシンリン酸化され、そしてＪａｋ３はＩＬ −２およびＩＬ−４に応答してならびに骨髄性細胞の中で活性化される。Ｊａｎｕｓキナーゼ（Ｊａｋ）ＤＮＡは、低いストリンジェンシイのスクリーニング(Firmbach-Kraft ら、Oncogene 5:1329-1336(19990))およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のアプローチ(Wilks、A.F.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8913 -8917(1990))により同定された。種々のサイトカインは、Ｊａｋのチロシンリン酸化および活性化を誘導する。Ｊａｋ２は、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）(Wit thuhn ら、Cell:227-236(1993))、成長ホルモン(Artgetslnger ら、Cell 74:237- 244(1993))、プロラクチンホルモン(Campbell ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA印刷中、(1993))、顆粒球特異的コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）(Silvennoinen、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9429-8433)(1 993))および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）(Quelle ら、Mol.Cell.Biol．提出、(1994))により活性化される。インターフェロン（ＩＦＮ）−α／βの応答は活性化し、そしてＪａｋ１および他のファミリーの構成員、Ｔｙｋ２(Velazquezら、Cell 70:313-322(1992);Mullerら、Nature 366、29-135 (1993))が、Ｊａｋ１およびＪａｋ２は活性化し、そしてＩＦＮ−γに対する応答を必要とする(Muller ら、Nature 366、129-135(1993);Watling ら、Nature 366 、166-170(1993))。最後に、共通のｐｇ１３０、またはオンコスタチンＭ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および毛様好中性因子（ＣＮＴＦ）を包含するｇｐ１３０関係サブユニットを利用するサイトカインは、Ｊａｋ１およびＪａｋ２およびある程度Ｔｙｋ２を活性化する(Stahlら、Science 263:92-95(1994);Narazakiら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA、印刷中、(1994))。顕著には、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２またはＴｙｋ２の活性化はＩＬ−２またはＩＬ−４の応答において報告されてきていず、これらはまたサイトカインレセプターのスーパーファミリーのレセプターを使用する。従って、われわれはＩＬ−２およびＩＬ−４により活性化されうる追加のＪａｋファミリーの構成員を探した。従来、ＰＣＲアプローチは乳癌の細胞系におけるタンパク質チロシンキナーゼを同定するために使用され(Canceら、Int.J.Cancer 54:571-577(1993))これらから新規なＪａｋファミリーの構成員をエンコードするｃＤＮＡ断片が得られた。同一のキナーゼは最近ラット海馬ニューロンにおいてＰＣＲにより検出された(S anchezら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1819-1823(1994))。乳癌細胞系からの断片を使用して、われわれはネズミＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーから４つのオーバーラップするｃＤＮＡクローンを得た。最長のｃＤＮＡは３．８ｋｂであり、そして１０９９アミノ酸および１２２．６ｋＤａの予測される大きさをもつタンパク質をエンコードするであろう、長いＯＲＦを含有した。予測された配列（第６図）はＪａｋに高度に関係し、そしてＪａｋ３と命名した。ネズミＪａｋ３は、ネズミＪａｋ２、ネズミＪａｋ１およびヒトＴｙｋ２におけるアミノ酸配列と、それぞれ、４７％、３６％および３６％同一である。Ｊａｋ３は非定型タンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインならびにアミノ末端のキナーゼ様ドメインを含有した。さらに、アミノ末端領域においてＪａｋ３と他のＪａｋファミリーの膜との間に類似性のブロックが存在する。ｉｎｖｉｔｒｏのＪａｋ３ｃＤＮＡの翻訳（第７Ａ図〜第７Ｂ図）は１２０ｋＤａの生成物を与えた。ネズミＪａｋ１、ネズミＪａｋ２およびヒトＴｙｋ２についてのｃＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳生成物を比較すると、各々が大きさにより区別できることを証明した；Ｔｙｋ２は最もゆっくり移動し、次いでＪａｋ１、Ｊａｋ２およびＪａｋ３が続くことはそれらの予測される大きさと一致する。ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳された生成物を使用して、抗ペプチド抗血清の特異性を決定した（第７Ｂ図）。Ｊａｋ３のキナーゼドメインのペプチドに対する抗血清はＪａｋ３を免疫沈降させた（レーン２）が、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２またはＴｙｋ２を免疫沈降させなかった。この沈降は前免疫血清（レーン１）で見られず、そして免疫化ペプチドが競合したが、無関係のペプチドは競合しなかった（レーン４）。同様に、Ｊａｋ１またはＪａｋ２に対する抗ペプチド抗血清(Silvennoi nen、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8429-8433(1993))は特異的であり、そしてＪａｋ３を免疫沈降させなかった。最後に、キナーゼドメインの間からのＴｙｋ２の領域に対する抗ペプチド抗血清を作った。他のものと異なり、この抗血清は交差反応性であり、そしてＪａｋ３およびＪａｋ１ならびにＴｙｋ２を認識したが、Ｊａｋ２をほんの弱く免疫沈降させた。しかしながら、Ｔｙｋ２に対する商業的に入手可能な抗ペプチド抗血清(Santa CRUZ BIOTECHNOLOGY Inc.)は特異的であったが、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２またはＪａｋ３と交差反応しなかった。Ｊａｋ１、Ｊａｋ２およびＴｙｋ２は偏在的に発現される(Firmbach-Kraft ら、 Oncogene 5:1329-1336(1990);Silvennoinen、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8429-84 33(1993);Harpur ら、Oncogene 7:1347-1353(1992);Wilks ら、Mol.Cell.Biol.11: 2057-2065(1991))。Ｊａｋ３が同様に発現されるかどうかを決定するために、１系列の細胞系およびマウスの組織をノザンブロット分析により発現について検査した。第８図に図解するに、最高のレベルの転写体は、単一の４ｋｂの転写体を含有するＩＬ−２依存性細胞障害性Ｔ細胞系において検出された。匹敵する大きさの転写体は、ＩＬ−３依存性骨髄性細胞系において多少低いレベルで検出された。しかしながら、Ｊａｋ３転写体は線維芽またはグリア芽細胞腫細胞系において検出されなかった。組織の間で、転写体は脾臓において最高のレベルで検出され、そしてより少ない程度に肝臓、腎臓、肺および心臓において検出されたが、脳または精巣において検出されなかった。初期のＰＣＲ増幅の結果(Canceら、In t.J.Cancer 54:571-577(1993))に一致して、Ｊａｋ３はまた乳房組織誘導細胞系で発現された。従って、他のＪａｋファミリーの構成員と異なり、Ｊａｋ３の発現は非常にいっそう制限されそして発現部位の１つは造血系列である。シグナリングにおけるＪａｋ３の役割を評価するために、Ｊａｋ３のチロシンリン酸化を誘導するいくつかのサイトカインの能力をホスホチロシンに対するモノクローナル抗体を使用する免疫沈降およびウェスタンブロッティングにより検査した。１系列のＩＬ−３依存性骨髄性細胞系において、ＥＰＯ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−６を使用して、表３の構成的または誘導性チロシンリン酸化は見られなかった。しかしながら、Ｊａｋ３はＩＬ−２またはＩＬ−４剌激ＣＴＬＬ細胞においてチロシンリン酸化された（第９Ａ図〜第９Ｄ図）。ＣＴＬＬ細胞において、ＩＬ−２およびＩＬ− ４は１２０および１３０ｋＤａのタンパク質のダブレットを包含するいくつかの細胞のタンパク質のチロシンリン酸化を誘導し、最近発表された結果に一致した (Kirkenら、J.Biol.Chem.268:22765-22770(1993))。第９Ａ図に図解するに、ＩＬ−２およびＩＬ−４はＪａｋ３（αＪａｋ３）のチロシンリン酸化を誘導し、これは主要な１２０ｋＤａの基質の位置に移動した。ＩＬ−２およびＩＬ−４は、また、１３０ｋＤａの基質と共移動するＪａｋ１（αＪａｋ１）のチロシンリン酸化を誘導し他。Ｊａｋ２またはＴｙｋ２のチロシンリン酸化は、Ｊａｋ２またはＴｙｋ２特異的抗血清で検出されなかった。最後に、Ｔｙｋ２に対するＪａｋ３／Ｊａｋ１交差反応性抗血清は、Ｔｙｋ２の大きさのチロシンリン酸化されたタンパク質を沈降させなかったが、Ｊａｋ１およびＪａｋ３に匹敵する位置に移動したチロシンリン酸化されたタンパク質を免疫沈降させ、特異的抗血清を使用した結果に一致した。ＩＬ−２またはＩＬ−４に応答するＪａｋのリン酸化は刺激後１分以内に検出可能であり、２０〜３０分にピークとなり、そして引き続いて成長ホルモン、ＩＬ−３１端ＥＰＯによるＪａｋ２のリン酸化において見られるパターンに類似して傾斜した(Witthuhnら、Cell:227-236(1993);Artgetsi ngerら、Cell 74:237-244(1993);Silvennoinen、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:842 9-8433(1993))。他のＪａｋのチロシンリン酸化を誘導したサイトカインはそれらのｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ活性化する(Witthuhn ら、Cell:227-236(1993);Artgetsi ngerら、Cell 74:237-244(1993);Silvennoinen、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8429 -8433(1993);Mullerら、Nature 366、129-135(1993);Stahl ら、Science 263:92-95 (1994))。従って、われわれはＩＬ−２またはＩＬ−４のＪａｋ１またはＪａｋ３のキナーゼ活性への作用を検査した。Ｊａｋ１のチロシンリン酸化は、ＥＰＯに対して見られる応答に匹敵する免疫沈降物における証明可能なキナーゼ活性の活性化に関連しなかった(Witthuhn ら、Cell:227-236(1993))。しかしながら、ＩＬ−６またはＣＮＴＦに応答するＪａｋ１のチロシンリン酸化はキナーゼ活性の活性化に関連する(Stahlら、Science 263:92-95(1994);Narazaki ら、Proc.Natl.A cad.Sci.USA、印刷中、(1994))。Ｊａｋ３のキナーゼ活性は、Ｊａｋ３特異的抗ペプチド抗血清の免疫沈降物において検出されなかった。しかしながら、この抗血清は推定上の自己リン酸化部位を含有するペプチド（ＫＤＹＹ）に対するものであり、このペプチドはキナーゼ活性ならびに免疫沈降を妨害することがある。従って、われわれはＴｙｋ２に対するＪａｋ１／Ｊａｋ３交差反応性抗血清を使用して得られた免疫沈降物をアッセイした。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの活性化は、ＩＬ−２またはＩＬ−４で刺激した細胞からの免疫沈降物において容易に検出可能であった（第９Ｂ図）。そのうえ、Ｊａｋ３と共移動するＪａｋの大きさの範囲に単一のリン酸化されたタンパク質が存在した。Ｊａｋ１の位置で移動するタンパク質の検出可能なリン酸化は見られず、Ｊａｋ１特異的抗血清を使用して得られた結果と一致した。ｉｎｖｉｔｒｏリン酸化タンパク質のアミノ酸分析は、リン酸化がもっぱらチロシン上で起こることを示した。ＥＰＯレセプターの細胞質ドメインおよびＩＬ−β鎖はかなりの相同性を有する(D'Andrea、Cell 58:1023-1024(1989))。従って、われわれはＥＰＯレセプターを発現する細胞におけるＪａｋ３のチロシンリン酸化の特異性を評価した。全長の野生型ＥＰＯレセプターで形質転換されたＣＴＬＬ細胞は、トランスフェクションされた骨髄性細胞に匹敵するレベルの高いアフィニティーのＥＰＯレセプターを発現する。細胞はＥＰＯに応答して増殖しないが、ＥＰＯはＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導する（第９Ｃ図）。しかしながら、ＩＬ−２およびＩＬ−４のいずれもＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導しなかった。逆に、ＩＬ−２はＪａｋ３のチロシンリン酸化を誘導したが、ｒｐｏはＪａｋ３のリン酸化に対して作用をもたなかった。ヒトＩＬ−２レセプターの１６鎖を発現するＩＬ−３依存性細胞系、３２Ｄｃ１３（ＩＬ２Ｒβ）を、また、検査した（第９Ｄ図）。これらの細胞はＩＬ−３に匹敵するヒトＩＬ−２に応答して増殖する。ＩＬ−３はＪａｋ２のチロシンリン酸化を誘導したが、Ｊａｋ３のそれを誘導しなかった。ＩＬ−３刺激細胞において、Ｊａｋ１またはＴｙｋ２の検出可能なチロシンリン酸化は存在しなかった。ＩＬ−２による刺激はＪａｋ３のチロシンリン酸化を生じたが、Ｊａｋ２またはＴｙｋ２の検出可能なチロシンリン酸化を生じなかった。重要なことには、また、Ｊａｋ１の検出可能なチロシンリン酸化は存在しなかった。従って、ＩＬ− ２およびＩＬ−４はＪａｋ３の特異的な、一定のチロシンリン酸化を引き起こしたが、他のＪａｋファミリーの構成員のそれを引き起こさなかった。従来の研究において、ＩＬ−２のレセプター鎖の酸性領域がｐ５６１１^lckの連合および活性化のために要求されることが示された(Hatakeyama ら、Cell59:837-845(1989)) 。従って、われわれはセリンに富んだ領域の内部の７０アミノ酸の欠失を含有するＩＬ−２レセプターのβ鎖でトランスフェクションされた３２Ｄｃｌ３細胞を検査した。この突然変異体は、従来特性決定性されたＡ突然変異体であり、これは有糸分裂誘発性を支持するが、Ｐ５６^lck活性化を支持しない(Hatakeyama ら、Science 252:1523-1528(1991);Hatakeyamaら、Cell 59:837-845(1989))。この突然変異体を発現する細胞の刺激は、野生型レセプターを発現する細胞において見られたものに匹敵するＪａｋ３チロシンリン酸化の誘導を生じた。この結果は、試験したサイトカインの間で、Ｊａｋ３はＩＬ−２およびＩＬ− ４に対する細胞の応答において特異的にチロシンリン酸化され、そして活性化された。ＩＬ−２は、また、ｐ５６^lck、ｐ５９^fyn、またはｐ５３／５６^lynのキナーゼ活性を増加する(Taniguchi、T．およびMinami、Y.、Cell 73:5-8(1993))。しかしながら、Ｓｒｃキナーゼの活性化はＩＬ−２レセプターβ鎖の酸性ドメインを必要とし、これは有糸分裂誘発およびＪａｋ３の活性化のためには不必要である。従って、Ｓｒｃキナーゼの活性化について役割は不明瞭であった。対照的に、ボックス１／ボックス２のモチーフを含有する、ＩＬ−２Ｐ鎖の膜近位の、セリンに富んだドメインは有糸分裂誘発のために要求される。ＥＰＯレセプターの同様な領域は、Ｊａｋ２との連合および有糸分裂誘発のために要求される (Witthuhnら、Cell:227-236(1993))。Ｊａｋ３活性化のためのこの領域についての要件を評価するための検査が現在進行中である。ＩＬ−２はβ鎖に架橋することができる１１６ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化を誘導する(Kirken ら、J.Biol.Chem.268:22765-22770(1993))。これらの研究は、ＥＰＯレセプターに架橋する１３０ｋＤａのリンタンパク質を同定した研究に類似し(YoshimuraおよびLodish、Mol.Cell.Biol.12:706-715(1992))このタンパク質は引き続いてＪａｋ２であることが示された（Witthuhnら、Cell:227- 236(1993)）。Ｊａｋと他のレセプターの連合におけるボックス１およびボックス２の領域の役割に基づいて、われわれはＪａｋ３がＩＬ−２レセプターのβ鎖と関連すると仮定するであろう。この仮定を評価するための実験が現在進行中である。Ｊａｋの活性化は、転写のシグナル・トランスデューサーおよびアクチベーター（ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｕｄｕｃｅｒｓａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｓｏｆｔａｎｓｃｔｉｐｔｉｏｎ）（ＳＴＡＴ）のファミリーの構成員のチロシンリン酸化および活性化に関連する。特に、ＩＦＮ−αはＳＴＡＴ（ｐ９１）およびＳＴＡＴ（ｐ１１３）を活性化し、ＩＦＮ−γはＳＴＡＴ１を活性化し(P ellegrini およびSchindler、Trends in Biochemical Sciences 18:338-342(1993 ))、ＩＬ−６はＡＰＲＦまたはＳＴＡＴ３と呼ぶ新しいファミリーの構成員を活性化し(Akiraら、Cell、印刷中、(1994))そしてＩＬ−３は新規なＳＴＡＴタンパク質の性質をもつタンパク質を活性化するこれに関して、ＩＬ−４は他の新規なＳＴＡＴタンパク質の性質とともにＤＮA結合活性のチロシンリン酸化を誘導する( KotanidesおよびReich、Science 262:1265-1267(1993))。同様なＤＮＡ結合活性はＩＬ−２によりＣＴＬＬ細胞において誘導された。ＩＬ−２／ＩＬ−４誘導ＳＴＡＴ様タンパク質がＳＴＡＴファミリーの構成員でありそしてＪａｋ３の特定の基質を構成するかどうかを決定することは重要であろう。それにもかかわらず、ＪａｋおよびSＴＡＴのサイトカイン誘導活性化は、サイトカインの結合が遺伝子の発現の調節に連結されるベクターに一般的機構であるうると仮定することができる。欠陥バキュロウイルスＤＮＡとＪａｋ２／ベクターＤＮＡとの間の組換え事象は、Ｊａｋ２を構成的を発現するであろう生活可能なバキュロウイルスをエンコードするＤＮＡを生ずる。昆虫細胞をこの組換えバキュロウイルスで感染させると、Ｊａｋ２特異的抗血清を使用する免疫沈降により精製できる、活性なＪａｋ２の高いレベルの発現を生ずる。活性なＪａｋ２のこの源は、この酵素の生化学的調製の研究において有用でありそして、また、ここに記載するｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイに基づくＪａｋ２キナーゼ活性のインヒビターについてのアッセイにおいて使用できる。実施例９：ｈｕＩＬ−５ＲαでトランスフェクションされたＢａ／Ｆ３およびＦＤＣＰ−Ｉ細胞において証明されたＩＲＦＩおよびＩＬ−５によりＪａｋの活性化上の実施例と同様に、１６時間の間成長因子を除去したＢａ／Ｆ３−ｈｕＩＬ −５ＲαおよびＦＤＣＰ−Ｉ−ｈｕＩＬ−５Ｒα細胞を刺激しないか、またはＩＬ３またはＩＬ５で１０分間刺激した。細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液の中で２０分間溶解した。リゼイトを抗Ｊａｋ２血清とインキュベートし、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、ゲルを電気泳動的にニトロセルロースに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングしたとき、１３０ｋｄおよび１５０ｋｄにおいて移動する２つのバンドがＩＬ３およびＩＬ５の両方で刺激した細胞において観察された。ＩＬ３およびＩＬ５の刺激はＪａｋ２と共移動するバンドの特異的チロシンリン酸化を生じた。Ｊａｋ２より上のチロシンリン酸化されたバンドはＪａｋ２の連合に帰属され、共通のベータサブユニットはＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ５の間で共有されている。実施例１０：前Ｂ細胞系におけるＩＬ−７によるＪａｋ３の活性化上の実施例と同様に、１６時間の間成長因子を除去したＤ１Ｆ９細胞を刺激しないか、またはＩＬ７で１０分間剌激した。細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液の中で２０分間溶解した。リゼイトを抗Ｊａｋファミリーの血清とインキュベートし、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、ゲルを電気泳動的にニトロセルロースに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングしたとき、２つのバンドがＩＬ７で刺激した細胞において観察された。バンドの移動はそれらをＪａｋ１およびＪａｋ３として同定した。これらの結果はＩＬ２およびＩＬ４で刺激した細胞において見られるものに類似し、ＩＬ２Ｒ−γサブユニットとして期待されるものはＩＬ７レセプターの１成分である。実施例１１：ｍｕＪａｋ２血清により認識されるヒトＭ−０７細胞におけるＩＬ−９によるＪａｋの活性化上の実施例と同様に、１６時間の間成長因子を除去したＭ０７細胞を刺激しないか、またはｈｕＩＬ３およびｈｕＩＬ９で１０分間刺激した。細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液の中で２０分間溶解した。リゼイトを抗Ｊａｋ２血清とインキュベートし、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、ゲルを電気泳動的にニトロセルロースに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングしたとき、ＩＬ３刺激細胞においてＪａｋ２を表す期待したバンドが観察された。ＩＬ９刺激を表すレーンにおいて、Ｊａｋ２より速く移動する単一のバンドが観察された。このバンドの移動はそれが多分Ｊａｋ３であることを示す。実施例１２：線維芽細胞系、３Ｔ３−Ｌ１、におけるＩＬ−１１によるＪａｋの活性化上の実施例と同様に、血清飢餓３Ｔ３−Ｌ１細胞を刺激しないか、またはＩＬ −１１で１０分間刺激した。細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液の中で溶解した。リゼイトを抗Ｊａｋ１またはＪａｋ２血清とインキュベートし、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、ゲルを電気泳動的にニトロセルロースに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングしたとき、ＩＬ１１刺激細胞においてＪａｋ１を表す期待したバンドが観察された。Ｊａｋ２の匹敵するチロシンリン酸化がＩＬ１１に対して応答において観察された。匹敵するブロットをＪａｋ２血清およびＪａｋ１血清でプロービングすると、刺激した細胞および未刺激の細胞において等しい量のＪａｋ２およびＪａｋ１が存在することが示された。実施例１３：Ｇ−ＣＳＦによるＪａｋの活性化上の実施例と同様に、ＮＦＳ６０、Ｂａ／Ｆ３／Ｇ−ＣＳＦＲ、３２Ｄｃ１３／Ｇ−ＣＳＦおよびＦＤＣＰ−Ｉ／Ｇ−ＣＳＦにおいてＪａｋ１およびＪａｋ２のチロシンリン酸化の誘導を実施した。ＮＦＳ６０、Ｂａ／Ｆ３／Ｇ−ＣＳＦＲ、３２Ｄｃｌ３／Ｇ−ＣＳＦおよびFＤＣＰ−Ｉ／Ｇ−ＣＳF細胞から成長因子を１６時間の間除去し、刺激しないか、またはＧ−ＣＳＦで１０分間刺激した。細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液の中で２０分間溶解した。リゼイトを抗Ｊａｋ２および抗Ｊａｋ１血清とインキュベートし、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そして電気泳動的にニトロセルロースに移した。フィルターをホスホチロシンに対する４Ｇ１０モノクローナル抗体でプロービングしたとき、容易に検出可能な結合がＪａｋ２免疫沈降についてＧ−ＣＳＦ刺激細胞において明らかであり、そして低い強度のバンドはＪａｋ１免疫沈降リゼイトにおいて見られる。匹敵するブロットをＪａｋ２血清およびＪａｋ１血清でプロービングすると、刺激した細胞および未刺激の細胞において等しい量のＪａｋ２およびＪａｋ１が存在することが示される。Ｇ−ＣＳＦ依存性増殖を支持するそれらの能力により特徴づけられたＧ−ＣＳＦレセプターの突然変異体を利用して、Ｇ−ＣＳＦ依存性増殖がＩＬ３およびＥｐｏレセプターの突然変異体において証明されるようにＪａｋ活性化と相関するかどうかを検査した。Ｇ−ＣＳＦレセプターおよびレセプターの突然変異体を発現する細胞を検査した。Ｊａｋ２をチロシンリン酸化する能力は、ボックス１の点突然変異を除外して、すべての場合においてＧ−ＣＳＦ依存性に関係付けられる。この場合において、レセプターはＧ−ＣＳＦ依存性増殖を支持するが、Ｊａｋ２はチロシンリン酸化されない。刺激されたおよび未剌激のＮＦＳ−６０細胞抽出物のＪａｋ１およびＪａｋ２免疫沈降物についてのｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより、キナーゼ活性の活性化を検査した。Ｊａｋ１の免疫沈降は、Ｇ−ＣＳＦ刺激ＮＦＳ−６０において自己リン酸化の増加の証拠を示さなかった。Ｂａ／Ｆ３／Ｇ−ＣＳＦＲ、３２Ｄｃｌ３／Ｇ−ＣＳＦおよびＦＤＣＰ−Ｉ／Ｇ−ＣＳＦにおいて、ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおけるＪａｋ１の検査を実行せず、ここでＪａｋ１チロシンリン酸化はＮＦＳ−６０細胞に関係して増加するように思われる。Ｊａｋ２免疫沈降はＧ−ＣＳＦに応答してＪａｋ２と共移動する主要なリン酸化されたバンドを有するが、未刺激の細胞において匹敵するバンドは検出されなかった。実施例１４：ＧＭ−ＣＳＦによるＪａｋの活性化上の実施例と同様に、ＧＭ−ＣＳＦレセプターを発現する細胞におけるＪａｋ１およびＪａｋ２のチロシンリン酸化の誘導を実施する。ＧＭ−ＣＳＦレセプターの細胞から成長因子を１６時間の間除去し、細胞を刺激しないか、またはＧＭ −ＣＳＦで１０分間剌激した。細胞を収獲し、そして１ｍｌの氷冷溶解緩衝液の中で２０分間溶解した。リゼイトを抗Ｊａｋ２および抗Ｊａｋ１血清とインキュベートし、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そして電気泳動的にニトロセルロースに移した。フィルターをホスホチロシンに対するモノクローナル抗体でプロービングしたとき、容易に検出可能な結合がＪａｋ２免疫沈降についてＧＭ−ＣＳＦ刺激細胞において明らかであり、そして低い強度のバンドはＪａｋ１免疫沈降リゼイトにおいて見られる。匹敵するブロットをＪａｋ２血清およびＪａｋ１血清でプロービングすると、刺激した細胞および未刺激の細胞において等しい量のＪａｋ２およびＪａｋ１が存在することが示される。ＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖を支持するそれらの能力により特徴づけられたＧＭ− ＣＳＦレセプターの突然変異体を利用して、ＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖がＩＬ３およびＥｐｏレセプターの突然変異体において証明されるようにＪａｋ活性化と相関するかどうかを検査する。ＧＭ−ＣＳＦレセプターおよびレセプターの突然変異体を発現する細胞を検査する。Ｊａｋ２をチロシンリン酸化する能力は、ボックス１の点突然変異を除外して、すべての場合においてＧＭ−ＣＳＦ依存性に関係付けられる。細胞抽出物を含有する刺激されたおよび未刺激のＧＭ−ＣＳＦレセプターのＪａｋ１およびＪａｋ２免疫沈降物についてのｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより、キナーゼ活性の活性化を検査した。Ｊａｋ１の免疫沈降は、ＧＭ−ＣＳＦ刺激細胞において自己リン酸化の増加の証拠をほんのわずかに示すことが期待される。Ｊａｋ１チロシンリン酸化はＧＭ−ＣＳＦ細胞に関係して増加するように思われる。Ｊａｋ２免疫沈降はＧＭ−ＣＳＦに応答してＪａｋ２と共移動する主要なリン酸化されたバンドを有するが、未刺激の細胞において匹敵するバンドは検出されることが実験されない。実施例１５：キナーゼのＪａｋファミリーは因子のＣＮＴＦファミリーによるシグナルのトランスダクションに関係する材料および方法試薬ＬＩＦＲβ(Stahlら、J.Biol.Chem.268:7628-7631(1993)、ｇｐ１３０(Davisら、Science 260:1805-1808(1993)、Ｊａｋ１およびＪａｋ２(Silvennoinen、Proc. Natl.Acad.Sci.USA、1993(印刷中)に対して特異的な抗血清は記載された。Ｔｙｋ２に対するウサギ抗血清をレイズさせ、そしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質(Velazquezら、Cell 70:313-322(1992))として発現されたＴｙｋ２の一部分に対して精製した。エピトープ標識化ＬＩＦＲβおよびｇｐ１３０のＣＯＳの発現に適当な発現プラスミドは従来記載され(Davlsら、 Science 260:1805-1808(1993)、ただし選択能力が改良されるようにｍｙｃエピトープの３つの連続するコピーを含有するように、ＬＩＦＲβコーディング配列を修飾した。ネズミＪａｋ１およびＪａｋ２のための全長のｃＤＮＡをプラスミドｐＲＫ５の中に準備した。方法細胞系を、従来記載されているように、継代しそして維持した(Ip ら、Cell 69 ：1121-1132(1992)。ＣＯＳ細胞のトランスフェクションをＤＥＡＥプロトコールにより実施した(Davisら、Science 260:1805-1808(1993))。細胞のプレートを血清不含ＲＰＭＩ培地の中で２〜４時間飢餓させ、次いで５０ｎｇ／ｍｌの示した因子で５分間刺激した。従来記載されているように、細胞を収獲しそして溶解した(Stahlら、J.Biol.Chem.268:7628-7631(1993))、ただし１％のＢｒｉｊ９６（シグマ）または１％のＮＰ−４０（ベーリンガー）をに示すように使用した。免疫沈降、電気泳動、およびモノクローナル抗体４Ｇ１０（アプステイト・バイオテクノロジー）を使用する抗ホスホチロシンイムノブロッティングおよび増強した化学発光性（アマシャム）により検出を従来記載されているように実施した（同上）。ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイのために、洗浄したビーズを室温において２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＭｎＣｌ₂、３０ｍＭのナトリウムオルトバナデートおよび１０ＭＣｉの（g−³²Ｐ）ＡＴＰ（ＮＥＮＤＵＰＯＮ）の中で１５分間インキュベートした。電気泳動の試料緩衝液を添加し、そして試料を沸騰させ、ＳＤＳＰＡＧＥに付し、そしてＰＶＤＦにエレクトロブロットした。次いで、オートラジオグラフィーの前に、膜を１ＭのＮａＯＨの中で６５℃において６０分間インキュベートしてセリンおよびスレオニンホスフェートを破壊した。結果ＣＮＴＦ誘導の応答は１３０ｋＤａのタンパク質に関連するＣＮＴＦの添加後、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲα、ｇｐ１３０、およびＬＩＦＲβ から成るレセプター複合体が形成する。洗浄剤Ｂｒｉｊ９６の中で細胞を溶解した後、レセプター複合体をＬＩＦＲβ（第１０図）またはｇｐ１３０（示されていない）に対する抗体で免疫沈降（ＩＰ）させると、チロシンリン酸化された１３０ｋＤａのタンパク質は共精製される。また、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲβに結合しそしてそれらをヘテロ二量体化するＬＩＦおよびＯＳＭ(Gearingら、Scie nce 260:1434-1437(1992);Baumann ら、J.Biol.Chem.268:8414-8417(1993);Davis ら、Science 250:1805-1808(1993))は、また、同一の外観をもつタンパク質の連合およびチロシンリン酸化を示す（第１０図）。精製したレセプター複合体は、また、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲβの両方のチロシンリン酸化をｉｎｖｉｔｒｏで生ずる連合したタンパク質のチロシンキナーゼ活性、ならびに連合した１３０ｋｄのタンパク質を示す。チロシンキナーゼ活性は、また、ＣＮＴＦの不存在においてＬＩＦＲβと連合するが、１３０ｋｄのタンパク質は存在しないか、または因子の不存在において有意にリン酸化されない。他の実験において、このｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性は無傷の細胞にＣＮＴＦを添加したとき観察される感受性と同一の感受性をスタウロスポリンに対してを有することが示され、この連合したチロシンキナーゼ活性がＣＮＴＦ誘導応答を伝達するために細胞において要求される活性に関係することが示唆される。さらに、１３０ｋｄのタンパク質はこのキナーゼのためのすぐれた候補であるように思われる。なぜなら、ＮＰ−４０の中の細胞の溶解は１３０ｋｄのタンパク質またはチロシンキナーゼ活性の共精製を生じないからである。ＣＮＴＦおよび関係する因子はＪａｋ１、Ｊａｋ２およびＴｙｋ２のチロシンリン酸化を誘導するＪａｋ１、Ｊａｋ２およびＲ²の一部分に対してレイズされた特異的抗血清を使用する実験において、これらのキナーゼのすべての３つは、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、およびＩＬ６による刺激後、チロシンリン酸化されるようになることが明らかになる。第１１Ａ図は、ＥＷ−１細胞の中でＣＮＴＦがＪａｋ１およびＪａｋ２の両方のチロシンリン酸化を誘導し、そしてこれらのタンパク質は１３０および１３１ｋＤａのタンパク質と共移動するように思われ、これらのタンパク質はａ−ＬＩＦＲβで免疫沈降したレセプター複合体と共精製することを示す。さらに、ＩＬ６＋ｓＩＬ６Ｒα（第１１Ｂ図）、ならびにＬＩＦおよびＯＳＭ（示されていない）をＥＷ−１細胞に添加すると、また、Ｊａｋ１およびＪａｋ２はリン酸化されるが、Ｔｙｋ２はリン酸化されない。対照的に、ＩＬ６はＵ２６６細胞を刺激して、Ｊａｋ２のリン酸化状態を見掛け上変化させないで、Ｔｙｋ２およびＪａｋ１をチロシンリン酸化させる。ＯＳＭ処理したＳＫ−ＭＥＳ細胞は主としてＪａｋ２のチロシンリン酸化を明らかにし、Ｔｙｋ２およびＪａｋ１における変化は小さい。これらの場合の各々において、ＪａｋまたはＴｙｋ２のチロシンリン酸化はそれらのｉｎｖｉｔｒｏチロシンキナーゼ活性の増加に関係づけられる（示されていない）。これらの結果は従来の結果と対照的であり、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、またはＩＬ−３による刺激のみが、Ｊａｋ２のチロシンリン酸化を生ずることを示す((Artgetsing erら、Cell 74:237-244(1993);Silvennoinen ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(印刷中 ;1993);Witthuhn ら、Cell 74:227-236(1993))。これらの実験から、われわれは、因子のＣＮＴＦファミリーはＪａｋ１、Ｊａｋ２、およびＴｙｋ２を活性化することができるが、多少の変数性が存在し、Ｊａｋ／Ｔｙｋファミリーの構成員は特定の細胞において活性化されるとうことを結論する。ＪａｋはＣＮＴＦβレセプター成分と関連するＣＯＳ細胞における一時的トランスフェクションを使用して、Ｊａｋが因子の不存在においてβレセプター成分と関連できるかどうかを決定した。これらの実験において、モノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されたｃ−ｍｙｃの１０アミノ酸部分を含有するＬＩＦＲβのカルボキシル末端でエピトープ標識化されたバージョンを使用した(Davisら、Science 253:59-63(1991))。ＣＯＳ細胞をＬＩＦＲβの全長のバージョンをエンコードする適当な発現ベクターおよびＪａｋ１またはＪａｋ２で共トランスフェクションし、そしてＢｒｉｊ９６リゼイトを９Ｅ１０で免疫沈降させ、次いでＪａｋ１またはＪａｋ２に対して抗血清でブロットした（第１２図）。これらの実験は、いずれのＪａｋお付加したリガンドの不存在においてＬＩＦＲβと関連できることを示す。さらに、細胞質ドメインの最初の７６アミノ酸のみを含有するＬＩＦＲβのトランケートのバージョンは同様によくＪａｋ１およびＪａｋ２へ完全に結合することができる。これはＬＩＦＲ βの膜近位領域をＪａｋ結合ドメインとして関係づけ、これは因子の結合のときシグナルのトランスダクションのために要求されることが示されたｇｐ１３０およびＥＰＯＲにおける領域とのレセプターのこの領域の間の相同性と一致する(M urakami ら、Science 260:11349-11353(1991);Witthuhn ら、Cell 74:227-236(199 3))。レセプターβ−成分およびＪａｋを使用する共トランスフェクションはリガンド誘導の機能的応答を生ずるＣＯＳ細胞におけるそれ以上の実験を行って、レセプターβ−成分とＪａｋとの共トランスフェクションがリガンド誘導の機能的応答を再構成できるかどうかを確立した。エピトープ標識化ｇｐ１３０ＦＬＡＧおよびＩＬ６をこれらの実験のために選択した。なぜなら、ｇｐ１３０はホモ二量体化しそしてＩＬ６＋可溶性ＩＬ６Ｒαに応答してチロシンリン酸化されるようになり、ＬＩＦＲβとの共トランスフェクションの必要性を排除するからである(Murakami ら、Proc.Natl.A cad.Sci.USA 88:11349-11353(1993);Davis ら、Science 260:1805-1808(1993))。ＩＬ６＋ｓＩＬ６Ｒαにで刺激後、モック・トランスフェクションされた（３Ｔ３−Ｌ１）またはｇｐ１３０ＦＬＡＧトランスフェクションされたＣＯＳ細胞（レーン２〜３）は、抗ＦＬＡＧを使用する免疫沈降およびα−ｐＴｙｒイムノブロッティング後に、ｇｐ１３０の実質的なチロシンリン酸化を明らかにしなかった。（第１３図）。対照的に、Ｊａｋ１（レーン４〜５）、Ｊａｋ２（レーン６〜７）、または両方のＪａｋ１およびＪａｋ２（レーン８〜９）を使用する共トランスフェクションは、ＩＬ６＋ｓＩＬ６Ｒαにで刺激したとき、ｇｐ１３０の誘導されたチロシンリン酸化を実質的に増加する。論考これらの結果を総合すると、ＪａｋはＣＮＴＦレセプターβ成分と連合し、そしてＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＬ６、またはＯＳＭに応答してチロシンリン酸化されるようになることができ、チロシンキナーゼの活性化を伴う。これは、β成分のリガンド誘導のヘテロ二量体化またはホモ二量体化がそれらの結合したＪａｋを密接な付着状態にするので、トランスホスホリレーションを通して起こる可能性が最も強い(StahlおよびYancopoulos、Cell 74:587-590(1993))。Ｊａｋ１またはＪａｋ２との共トランスフェクションのときのｇｐ１３０のリガンド誘導のチロシンリン酸化のＣＯＳ細胞における機能的再構成は、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、またはＴｙｋ２がレセプターβサブユニットの二量体化のとき細胞の内側で活性化された第１キナーゼとして機能することができ、従って因子のＣＮＴＦファミリーのシグナル・トランスダクションの伝達において最も近位の細胞内ステップとして、キナーゼのＪａｋファミリーを配置するという認識と一致する。雑誌の論文または要約、公開されたまたは対応する米国または外国の特許出願、発行されたまたは対応する米国または外国の特許、または他の参考文献を包含する、ここに引用したすべての参考文献は、本明細書の一部をなし、引用された参考文献の中に提示されたすべてのデータ、表、図面、およびテキストを包含する。さらに、ここに引用された参考文献内に引用された参考文献の全体の内容も、また、本明細書の一部とする。既知の方法の工程、常用の方法の工程、既知の方法または常用の方法に対する言及は、本発明の任意の面、記載または態様が関係する技術において開示、教示または示唆されていることをいかなる方法においても認めるものではない。特定の態様の以上の説明は、当業者の知識（ここに引用した参考文献の内容を含む）を適用することによって、実験なしに、本発明の一般的概念から逸脱しないで、種々の応用、例えば、特定の態様のために容易に修飾しおよび／または適応させることができる、本発明の一般的特質を完全に明らかにするであろう。従って、このような適応および修飾は、ここにおいて提示された教示および案内に基づいて、開示した態様の同等のものの意味および範囲内に入ることを意図する。ここにおける語句および用語は説明を目的とし、限定を目的とせず、こうしてこの明細書の用語または語句はここにおいて提示された教示および案内に照らして、当業者の知識と組み合わせて、当業者が解釈すべきであることを理解すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月２５日【補正内容】請求の範囲１．サイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害する方法であって、（Ａ）前記真核細胞の中のＪａｋキナーゼの活性を阻害することを含んでなり、ここで前記応答は前記Ｊａｋキナーゼの活性化により伝達されそして、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインがエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、方法。２．前記サイトカインがチロシンキナーゼレセプターに結合することによって前記生物学的応答を誘発する、請求項１に記載の方法。３．前記サイトカインがサイトカインレセプターに結合することによって前記生物学的応答を誘発する、請求項１に記載の方法。４．ＪａｋキナーゼがＪａｋ１、Ｊａｋ２、およびＴｙｋ２から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。５．前記サイトカインがインターロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球−マクロファージ特異的コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、プロラクチンホルモン、および成長ホルモンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。６．前記サイトカインがインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６０（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、およびインターフェロンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。７．前記真核細胞の中の前記Ｊａｋキナーゼの発現を阻害することができる組成物の有効量を前記真核細胞の中に導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。８．前記組成物がアンチセンス核酸およびリボザイムから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。９．前記Ｊａｋキナーゼの活性を阻害することができる組成物の有効量を前記真核細胞の中に導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。１０．前記組成物が前記Ｊａｋキナーゼに対する抗体、前記Ｊａｋキナーゼに対する拮抗物質、前記Ｊａｋキナーゼのトランス−優性突然変異体、および前記Ｊａｋキナーゼのペプチド断片から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。１１．前記Ｊａｋキナーゼの活性化を阻害することができる組成物の有効量を前記真核細胞の中に導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。１２．前記組成物が前記Ｊａｋキナーゼに対する抗体、前記Ｊａｋキナーゼに対する拮抗物質、前記Ｊａｋキナーゼのトランス−優性突然変異体、および前記Ｊａｋキナーゼのペプチド断片から成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。１３．サイトカインの活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達される、動物における細胞のサイトカインに対する過度の応答により引き起こされる動物における疾患の症状を治療する方法であって、（Ａ）前記細胞における前記Ｊａｋキナーゼの活性を阻害することを含んでなり、ここで、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、前記方法。１４．前記疾患の症状が前記細胞の過度の増殖である、請求項１３に記載の方法。１５．真核細胞の中のＪａｋキナーゼのレベルを増加させることを含んでなる、Ｊａｋキナーゼの活性化によりその活性が伝達される、インターフェロン− α（ＩＦＮα）以外のサイトカインに対する真核細胞の応答の欠如を治療する方法であって、前記応答の欠如が、前記サイトカインとの接触後の前記真核細胞の中のＪａｋキナーゼの活性化形態のレベルが異常に低いことによるものであり、そして、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、方法。１６．前記真核細胞の中のＪａｋキナーゼの発現を増強することによって、前記真核細胞の中の前記Ｊａｋキナーゼのレベルが増加される、請求項１５に記載の方法。１７．前記真核細胞の中でＪａｋキナーゼを発現することができるベクターを導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの発現が増強される、請求項１６に記載の方法。１８．真核細胞におけるサイトカインの活性が少なくとも１つのＪａｋキナーゼのチロシンリン酸化により伝達される、サイトカインに対する前記細胞の生物学的応答を調節することができる組成物を同定するアッセイであって、前記細胞における前記生物学的応答を調節する前記Ｊａｋキナーゼのチロシンリン酸化の、前記組成物による、変化を検出することを含んでなり、ここで前記応答は前記細胞上のサイトカインレセプターへの前記サイトカインの結合により誘導される、アッセイ。１９．前記サイトカインがサイトカインレセプタースーパーファミリーの１つに結合する、請求項１８に記載のアッセイ。２０．前記検出が、（ａ）サイトカインの刺激後に前記細胞においてＪａｋキナーゼのチロシンリン酸化活性を測定する；または（ｂ）サイトカインの刺激後に前記細胞においてＪａｋキナーゼのチロシンリン酸化の状態を測定する；から選択される、請求項１８に記載のアッセイ。２１．前記検出がリン含有分子、抗体、ペプチド、第１化学物質および核酸から成る群より選択される少なくとも１つの化合物の使用を包含する、請求項１８に記載のアッセイ。２２．前記化合物が標識で検出可能に標識化されている、請求項２１に記載のアッセイ。２３．前記標識が放射性標識、酵素標識および選択可能なマーカーから成る群より選択される、請求項２２に記載のアッセイ。２４．前記核酸が転写調節配列、翻訳調節配列、選択可能なマーカー、終止配列、ポリアデニル化シグナル、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター、リボザイム結合部位およびスプライスシグナルから成る群より選択される少なくとも１つを含んでなる、請求項２１に記載のアッセイ。２５．前記化合物が第２化学物質、アンチセンス核酸、リボザイム、ペプチド、薬物、Ｊａｋキナーゼアンタゴニスト、Ｊａｋキナーゼアゴニスト、Ｊａｋキナーゼのトランス優性突然変異体、Ｊａｋキナーゼの欠失突然変異体、チロシンキナーゼ活性の一般的インヒビター、チロシンキナーゼ活性の一般的エンハンサーおよび抗体から成る群より選択される、請求項１８に記載のアッセイ。２６．前記検出工程が、（ａ）前記サイトカインで刺激した後、前記真核細胞の第１集団から第１抽出物を調製し、前記抽出物は前記Ｊａｋキナーゼおよび前記Ｊａｋキナーゼのための基質を含んでなり、（ｂ）前記サイトカインで刺激した後、前記真核細胞の第２集団から第２抽出物を調製し、前記抽出物は前記Ｊａｋキナーゼおよび前記Ｊａｋキナーゼのための基質を含んでなり、ここで前記剌激の前または間に前記組成物は前記第２集団に対して提供され、（ｃ）キナーゼ緩衝液の中の前記第１抽出物とγ位に検出可能に標識化されたリンをもつアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との組み合わせを含んでなる第１反応混合物を調製し、（ｄ）キナーゼ緩衝液の中の前記第２抽出物とγ位に検出可能に標識化されたリンをもつアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との組み合わせを含んでなる第２反応混合物を調製し、そして（ｅ）前記第１および第２の反応混合物の中の前記検出可能に標識化されたリンを含有する前記基質を検出する、ことを含んでなり、ここで前記第２反応混合物が前記第１反応混合物と有意に異なる量で前記検出可能に標識化されたリンを含有する前記基質を含有する場合に、その活性が前記Ｊａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を調節できる組成物を同定する、請求項２２に記載のアッセイ。２７．前記基質が前記Ｊａｋキナーゼまたは前記Ｊａｋキナーゼの自己リン酸化部位を含んでなるその断片である、請求項２６に記載のアッセイ。２８．請求項１８により生産された、Ｊａｋキナーゼ活性のインヒビター。２９．前記インヒビターが前記Ｊａｋキナーゼの前記チロシンリン酸化を阻害する、請求項２８に記載のインヒビター。３０．前記インヒビターがアンチセンス核酸、リボザイム、ペプチド、薬物、Ｊａｋキナーゼアンタゴニスト、Ｊａｋキナーゼのトランス優性突然変異体、Ｊａｋキナーゼの欠失突然変異体、チロシンキナーゼ活性の一般的インヒビター、および抗体から成る群より選択される、請求項２９に記載のインヒビター。３１．Ｊａｋ１（配列番号：６）のアミノ酸７８６−８０４、Ｊａｋ２（配列番号：５）のアミノ酸７５８−７７６、およびＴｙｋ２（配列番号：７）のアミノ酸８１９−８３７から成る群より選択される配列に実質的に相当する配列を有するペプチドのエピトープに選択的に結合する抗体であって、前記抗体が、前記ペプチドが由来するＪａｋキナーゼに前記Ｊａｋキナーゼの活性を妨害しないで特異的に結合することができる、抗体。３２．少なくとも１つのサイトカインによりチロシンのリン酸化を行うことができるＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子。３３．配列番号：２の一部分に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項３２に記載の単離されたＤＮＡ分子。３４．第６図（配列番号：１７）の一部分に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項３２に記載の単離されたＤＮＡ分子。３５．前記ＤＮＡ配列が第１図（配列番号：８）に示すようなネズミＪａｋ２遺伝子配列由来である、請求項３２に記載の単離されたＤＮＡ分子。３６．請求項３２に記載の単離されたＤＮＡ分子を含んでなり、宿主において前記Ｊａｋキナーゼを発現することができる発現ベクター。３７．請求項３６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/48 ＺＣ０７Ｈ 21/04 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ０７Ｋ 16/40 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/04 ＡＢＢＣ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/24 9/12 9051−4Ｃ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/48 9051−4Ｃ 37/66 Ｇ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クウル，フレデリックダブリュ. アメリカ合衆国テネシー州、ゴルドバ、エリクソン、コウブ、8579 (72)発明者シルベノイネン，オリーアメリカ合衆国ニューヨーク州、ニューヨーク、ヨーク、アベニュ、1161、アパートメント、２エイチ

Claims

【特許請求の範囲】１．サイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害する方法であって、（Ａ）前記真核細胞の中のＪａｋキナーゼの活性を阻害することを含んでなり、ここで前記応答は前記Ｊａｋキナーゼの活性化により伝達されそして、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、方法。２．前記サイトカインがチロシンキナーゼレセプターに結合することによって前記生物学的応答を誘発する、請求項１に記載の方法。３．前記サイトカインがサイトカインレセプターに結合することによって前記生物学的応答を誘発する、請求項１に記載の方法。４．ＪａｋキナーゼがＪａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、およびＴｙｋ２から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。５．前記サイトカインがインターロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球−マクロファージ特異的コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、プロラクチンホルモン、および成長ホルモンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。６．前記サイトカインがインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、およびインターフェロンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。７．前記真核細胞の中の前記Ｊａｋキナーゼの発現を阻害することができる組成物の有効量を前記真核細胞の中に導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。８．前記組成物がアンチセンスおよびリボザイムから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。９．前記Ｊａｋキナーゼの活性を阻害することができる組成物の有効量を前記真核細胞の中に導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。１０．前記組成物が前記Ｊａｋキナーゼに対する抗体、前記Ｊａｋキナーゼに対する拮抗物質、前記Ｊａｋキナーゼのトランス−優性突然変異体、および前記Ｊａｋキナーゼのペプチド断片から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。１１．前記Ｊａｋキナーゼの活性化を阻害することができる組成物の有効量を前記真核細胞の中に導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。１２．前記組成物が前記Ｊａｋキナーゼに対する抗体、前記Ｊａｋキナーゼに対する拮抗物質、前記Ｊａｋキナーゼのトランス−優性突然変異体、および前記Ｊａｋキナーゼのペプチド断片から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。１３．サイトカインの活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達される、動物における細胞のサイトカインに対する過度の応答により引き起こされる動物における疾患の症状を治療する方法であって、（Ａ）前記細胞における前記Ｊａｋキナーゼの活性を阻害することを含んでなり、ここで、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、前記方法。１４．前記疾患の症状が前記細胞の過度の増殖である、請求項１３に記載の方法。１５．真核細胞の中のＪａｋキナーゼのレベルを増加させることを含んでなる、Ｊａｋキナーゼの活性化によりその活性が伝達される、インターフェロン− α（ＩＦＮα）以外のサイトカインに対する真核細胞の応答の欠如を治療する方法であって、前記応答の欠如が、前記サイトカインとの接触後の前記真核細胞の中のＪａｋキナーゼの活性化形態のレベルが異常に低いことによるものであり、そして、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、前記方法。１６．前記真核細胞の中のＪａｋキナーゼの発現を増強することによって、前記真核細胞の中の前記Ｊａｋキナーゼのレベルが増加される、請求項１５に記載の方法。１７．前記真核細胞の中でＪａｋキナーゼを発現することができるベクターを導入することによって、前記Ｊａｋキナーゼの発現が増強される、請求項１６に記載の方法。１８．サイトカインの活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達される、サイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害することができる組成物を同定するアッセイであって、前記Ｊａｋキナーゼのｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ活性を阻害する前記組成物の能力を検出することを含んでなり、ここで、前記ＪａｋキナーゼがＪａｋ２であるとき、前記サイトカインはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）以外である、アッセイ。１９．（ａ）キナーゼ緩衝液の中で組み合わせられた、活性化された形態のＪａｋキナーゼ、前記Ｊａｋキナーゼのための基質、およびγ位に検出可能に標識化されたリンをもつアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含んでなる第１反応混合物を調製し、（ｂ）前記組成物と組み合わせられた前記第１反応混合物を含んでなる第２反応混合物を調製し、そして（ｃ）前記第１および第２の反応混合物の中の前記検出可能に標識化されたリンを含有する前記基質を検出する、ことを含んでなり、ここで前記第２反応混合物が前記第１反応混合物より有意に少ない量で前記検出可能に標識化されたリンを含有する前記基質を含有する場合に、その活性が前記Ｊａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害できる組成物を同定する、請求項１８に記載のアッセイ。２０．前記基質がＪａｋキナーゼまたは前記Ｊａｋキナーゼの自己リン酸化部位を含んでなるその断片である、請求項１９に記載のアッセイ。２１．前記Ｊａｋキナーゼが配列番号：２のアミノ酸１００−１０１５に相当するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２０に記載の方法。２２．サイトカインの活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害することができる組成物を同定するアッセイであって、前記活性化を阻害する前記組成物の能力を検出することを含んでなるアッセイ。２３．工程：（ａ）前記サイトカインで刺激した後、前記真核細胞の第１集団から第１抽出物を調製し、前記抽出物は前記Ｊａｋキナーゼおよび前記Ｊａｋキナーゼのための基質を含んでなり、（ｂ）前記サイトカインで刺激した後、前記真核細胞の第２集団から第２抽出物を調製し、前記抽出物は前記Ｊａｋキナーゼおよび前記Ｊａｋキナーゼのための基質を含んでなり、前記刺激の前または間に前記組成物は前記第２集団に対して提供され、（ｃ）キナーゼ緩衝液の中の前記第１抽出物とγ位に検出可能に標識化されたリンをもつアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との組み合わせを含んでなる第１反応混合物を調製し、（ｄ）キナーゼ緩衝液の中の前記第２抽出物とγ位に検出可能に標識化されたリンをもつアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との組み合わせを含んでなる第２反応混合物を調製し、そして（ｅ）前記第１および第２の反応混合物の中の前記検出可能に標識化されたリンを含有する前記基質を検出する、ことを含んでなり、ここで前記第２反応混合物が前記第１反応混合物より有意に少ない量で前記検出可能に標識化されたリンを含有する前記基質を含有する場合に、その活性が前記Ｊａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害できる組成物を同定する、請求項２２に記載のアッセイ。２４．サイトカインの活性がＪａｋキナーゼの活性化により伝達されるサイトカインに対する真核細胞の生物学的応答を阻害することができる組成物を同定するアッセイであって、前記サイトカインの存在下に、前記Ｊａｋキナーゼと前記サイトカインのレセプターとの間の物理的相互作用を阻害する前記組成物の能力を検出することを含んでなる前記アッセイ。２５．Ｊａｋ１（配列番号：６）のアミノ酸７８６−８０４、Ｊａｋ２（配列番号：５）のアミノ酸７５８−７７６、およびＴｙｋ２（配列番号：７）のアミノ酸８１９−８３７から成る群より選択される配列に実質的に相当する配列を有するペプチドのエピトープに選択的に結合する抗体であって、前記抗体が、前記ペプチドが由来するＪａｋキナーゼに前記Ｊａｋキナーゼの活性を妨害しないで特異的に結合することができる、抗体。２７．少なくとも１つのサイトカインによりチロシンのリン酸化を行うことができるＪａｋキナーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子。２８．配列番号：２の一部分に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２７に記載の単離されたＤＮＡ分子。２９．第６図（配列番号：）の一部分に相当するＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２７に記載の単離されたＤＮＡ分子。３０．前記ＤＮＡ配列が第１図（配列番号：８）に示すようなネズミＪａｋ２遺伝子配列由来である、請求項２７に記載の単離されたＤＮＡ分子。３１．請求項２７の単離されたＤＮＡ分子を含んでなり、宿主において前記Ｊａｋキナーゼを発現することができる発現ベクター。３２．請求項３１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。