JPH0928396A - ペルオキシダーゼの測定方法 - Google Patents
ペルオキシダーゼの測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高感度なペルオキシダーゼ測定方法を提供す
る。 【解決手段】 ペルオキシダーゼの測定方法であって、
下記の工程：(a) 過酸化水素の存在下でペルオキシダー
ゼの作用によりp-置換フェノール化合物から産生される
フェノキシラジカルをヒドロキシアミン化合物で捕捉し
て安定なラジカル種を生成させる工程；及び(b) 上記安
定ラジカル種の電子スピン共鳴を測定する工程を含む測
定方法。
る。 【解決手段】 ペルオキシダーゼの測定方法であって、
下記の工程：(a) 過酸化水素の存在下でペルオキシダー
ゼの作用によりp-置換フェノール化合物から産生される
フェノキシラジカルをヒドロキシアミン化合物で捕捉し
て安定なラジカル種を生成させる工程；及び(b) 上記安
定ラジカル種の電子スピン共鳴を測定する工程を含む測
定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はペルオキシダーゼの
測定方法に関するものである。また本発明は、上記の測
定方法に用いるペルオキシダーゼ測定用試薬に関する。
測定方法に関するものである。また本発明は、上記の測
定方法に用いるペルオキシダーゼ測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼ（以下、本明細書中で
POD と称する場合がある）の測定方法としてルミノール
等を用いる化学発光法が知られており、この化学発光法
において測定感度の向上のためにp-置換フェノール誘導
体を用いる方法が提案されている。例えば、ルミノール
-H2O2-POD による化学発光がp-ヨードフェノールにより
増発光されることが報告されている (Kricka, et al.,
Anal. Biochem., 145, 96, 1985)。ルミノールは、水溶
液中ではルミノールモノアニオンとして存在しており、
p-置換フェノール化合物の酸化作用によりシアザセミキ
ノンラジカルに転換され、いくつかの中間体を経由した
後に最終産物である3-アミノフタル酸を生成して発光す
る。ヨードフェノール（ヨードフェノールラジカル）は
ルミノールに作用し、シアザセミキノンラジカルの生成
を促進する作用を有する。この原理を用いた免疫測定試
薬「アマライト」(Amerlite)が日本コダック・ダイアグ
ノステックス株式会社から発売されている。
POD と称する場合がある）の測定方法としてルミノール
等を用いる化学発光法が知られており、この化学発光法
において測定感度の向上のためにp-置換フェノール誘導
体を用いる方法が提案されている。例えば、ルミノール
-H2O2-POD による化学発光がp-ヨードフェノールにより
増発光されることが報告されている (Kricka, et al.,
Anal. Biochem., 145, 96, 1985)。ルミノールは、水溶
液中ではルミノールモノアニオンとして存在しており、
p-置換フェノール化合物の酸化作用によりシアザセミキ
ノンラジカルに転換され、いくつかの中間体を経由した
後に最終産物である3-アミノフタル酸を生成して発光す
る。ヨードフェノール（ヨードフェノールラジカル）は
ルミノールに作用し、シアザセミキノンラジカルの生成
を促進する作用を有する。この原理を用いた免疫測定試
薬「アマライト」(Amerlite)が日本コダック・ダイアグ
ノステックス株式会社から発売されている。
【０００３】また、アスコルビン酸-H2O2-POD にp-メト
キシフェノールを添加すると、アスコルビン酸ラジカル
が増幅されることが知られている(Chance, B., Arch. B
iochem. Biophys., 41, 389, 1952)。p-クレゾール(Ohn
ishi, T. et al., Biochem.Biophys. Acta, 172, 357,
1969)や、チロキシン及びチロキシン類似物（Klebanof
f, S.J., J. Biol. Chem., 234, pp.2437-2442, 1972)
を用いても同様の反応が可能である。
キシフェノールを添加すると、アスコルビン酸ラジカル
が増幅されることが知られている(Chance, B., Arch. B
iochem. Biophys., 41, 389, 1952)。p-クレゾール(Ohn
ishi, T. et al., Biochem.Biophys. Acta, 172, 357,
1969)や、チロキシン及びチロキシン類似物（Klebanof
f, S.J., J. Biol. Chem., 234, pp.2437-2442, 1972)
を用いても同様の反応が可能である。
【０００４】p-置換フェノール誘導体がルミノールの増
発光やアスコルビン酸ラジカルの増幅を惹起し、ペルオ
キシダーゼの検出に増感剤（エンハンサー）として有用
な理由は、ペルオキシダーゼにより産生されたフェノキ
シラジカルがそれぞれルミノール及びアスコルビン酸に
作用して一電子引き抜き（酸化）反応を行うためである
と考えられている。しかしながら、これらの増発光やラ
ジカル増幅などを採用した検出方法によってもペルオキ
シダーゼの検出感度は十分とはいえず、特に、ラジカル
増幅によるペルオキシダーゼの検出感度は高々10-3 uni
ts/ml 程度であり、酵素免疫測定試薬としては明らかに
感度不足であった。
発光やアスコルビン酸ラジカルの増幅を惹起し、ペルオ
キシダーゼの検出に増感剤（エンハンサー）として有用
な理由は、ペルオキシダーゼにより産生されたフェノキ
シラジカルがそれぞれルミノール及びアスコルビン酸に
作用して一電子引き抜き（酸化）反応を行うためである
と考えられている。しかしながら、これらの増発光やラ
ジカル増幅などを採用した検出方法によってもペルオキ
シダーゼの検出感度は十分とはいえず、特に、ラジカル
増幅によるペルオキシダーゼの検出感度は高々10-3 uni
ts/ml 程度であり、酵素免疫測定試薬としては明らかに
感度不足であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高感
度なペルオキシダーゼ測定方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、高感度なペルオキシダーゼ
測定を可能にするペルオキシダーゼ測定用試薬を提供す
ることにある。
度なペルオキシダーゼ測定方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、高感度なペルオキシダーゼ
測定を可能にするペルオキシダーゼ測定用試薬を提供す
ることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】p-置換フェノール誘導体
を増感剤として用いた場合、達成される増感効率はペル
オキシダーゼの作用で産生されるフェノキシラジカルの
寿命に依存している可能性がある。そこで、本発明者
は、反応中間体であるルミノール・ラジカルや反応最終
物であるアスコルビン酸ラジカルが安定ラジカルではな
いために上記の方法では大幅な感度向上が達成できない
と考え、安定なフェノキシラジカルを与える増感剤の探
索と、フェノキシラジカルを安定でシグナル強度の強い
他のラジカル種に変換する手段とを鋭意探索した。
を増感剤として用いた場合、達成される増感効率はペル
オキシダーゼの作用で産生されるフェノキシラジカルの
寿命に依存している可能性がある。そこで、本発明者
は、反応中間体であるルミノール・ラジカルや反応最終
物であるアスコルビン酸ラジカルが安定ラジカルではな
いために上記の方法では大幅な感度向上が達成できない
と考え、安定なフェノキシラジカルを与える増感剤の探
索と、フェノキシラジカルを安定でシグナル強度の強い
他のラジカル種に変換する手段とを鋭意探索した。
【０００７】その結果、増感剤であるp-置換フェノール
誘導体から生成するフェノキシラジカルをヒドロキシア
ミン誘導体でトラップすると安定でシグナル強度の強い
ラジカル種が生成すること、並びに、上記のヒドロキシ
アミン誘導体の使用にあたり、p-アセトアミドフェノー
ル誘導体を増感剤として用いると極めて高感度にペルオ
キシダーゼを測定できることを見い出した。本発明は上
記の知見を基にして完成されたものである。
誘導体から生成するフェノキシラジカルをヒドロキシア
ミン誘導体でトラップすると安定でシグナル強度の強い
ラジカル種が生成すること、並びに、上記のヒドロキシ
アミン誘導体の使用にあたり、p-アセトアミドフェノー
ル誘導体を増感剤として用いると極めて高感度にペルオ
キシダーゼを測定できることを見い出した。本発明は上
記の知見を基にして完成されたものである。
【０００８】すなわち本発明は、ペルオキシダーゼの測
定方法であって、下記の工程：(a)過酸化水素の存在下
でペルオキシダーゼの作用によりp-置換フェノール化合
物から産生されるフェノキシラジカルをヒドロキシアミ
ン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成させる工
程；及び(b) 上記安定ラジカル種の電子スピン共鳴を測
定する工程を含む測定方法が提供される。
定方法であって、下記の工程：(a)過酸化水素の存在下
でペルオキシダーゼの作用によりp-置換フェノール化合
物から産生されるフェノキシラジカルをヒドロキシアミ
ン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成させる工
程；及び(b) 上記安定ラジカル種の電子スピン共鳴を測
定する工程を含む測定方法が提供される。
【０００９】この発明の好ましい態様として、p-置換フ
ェノール化合物が下記の式：
ェノール化合物が下記の式：
【化２】 （式中、R1は水素原子又はC1-6アルキル基を示し、R2は
C1-6アルキル基、カルボキシル基、C1-6アルコキシカル
ボニル基を示す）で示される4-アセトアミドフェノール
誘導体である上記方法；及び、p-置換フェノール化合物
が4-メトキシフェノール、4-エトキシフェノール、4-ヨ
ードフェノール、3-(4- ヒドロキシフェニル）プロピオ
ン酸(HPPA)、4-ヒドロキシフェニル酢酸、4-ヒドロキシ
馬尿酸、p-クレゾール、及びチラミンからなる群から選
択される上記方法が提供される。
C1-6アルキル基、カルボキシル基、C1-6アルコキシカル
ボニル基を示す）で示される4-アセトアミドフェノール
誘導体である上記方法；及び、p-置換フェノール化合物
が4-メトキシフェノール、4-エトキシフェノール、4-ヨ
ードフェノール、3-(4- ヒドロキシフェニル）プロピオ
ン酸(HPPA)、4-ヒドロキシフェニル酢酸、4-ヒドロキシ
馬尿酸、p-クレゾール、及びチラミンからなる群から選
択される上記方法が提供される。
【００１０】本発明の別の態様により、過酸化水素とp-
置換フェノール、好ましくは、上記の4-アセトアミドフ
ェノール誘導体の存在下でペルオキシダーゼの作用によ
り形成されるフェノキシラジカルを捕捉して安定なラジ
カル種を生成することができるヒドロキシアミン化合物
からなるペルオキシダーゼ測定用試薬、並びに、過酸化
水素とp-置換フェノール、好ましくは、上記の4-アセト
アミドフェノール誘導体の存在下でペルオキシダーゼの
作用により形成されるフェノキシラジカルを捕捉して安
定なラジカル種を生成することができるフェノキシラジ
カル捕捉剤であるヒドロキシアミン化合物が提供され
る。
置換フェノール、好ましくは、上記の4-アセトアミドフ
ェノール誘導体の存在下でペルオキシダーゼの作用によ
り形成されるフェノキシラジカルを捕捉して安定なラジ
カル種を生成することができるヒドロキシアミン化合物
からなるペルオキシダーゼ測定用試薬、並びに、過酸化
水素とp-置換フェノール、好ましくは、上記の4-アセト
アミドフェノール誘導体の存在下でペルオキシダーゼの
作用により形成されるフェノキシラジカルを捕捉して安
定なラジカル種を生成することができるフェノキシラジ
カル捕捉剤であるヒドロキシアミン化合物が提供され
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の方法に用いるヒドロキシ
アミン化合物はペルオキシダーゼ測定用試薬として作用
する化合物であり、過酸化水素とp-置換フェノール化合
物の存在下でペルオキシダーゼの作用により形成される
フェノキシラジカルを捕捉して、その結果、安定なラジ
カル種を生成する性質を有している。いかなる特定の理
論に拘泥するわけではないが、これらのヒドロキシアミ
ン化合物はフェノキシラジカルを捕捉して安定なNOラジ
カル種を与えるので、電子スピン共鳴(ESR) 装置でこの
安定ラジカル種を検出することにより、極めて高感度に
ペルオキシダーゼを測定することができる。なお、本明
細書において、測定には定性及び／又は定量分析や検出
などのあらゆる目的のものが含まれる。
アミン化合物はペルオキシダーゼ測定用試薬として作用
する化合物であり、過酸化水素とp-置換フェノール化合
物の存在下でペルオキシダーゼの作用により形成される
フェノキシラジカルを捕捉して、その結果、安定なラジ
カル種を生成する性質を有している。いかなる特定の理
論に拘泥するわけではないが、これらのヒドロキシアミ
ン化合物はフェノキシラジカルを捕捉して安定なNOラジ
カル種を与えるので、電子スピン共鳴(ESR) 装置でこの
安定ラジカル種を検出することにより、極めて高感度に
ペルオキシダーゼを測定することができる。なお、本明
細書において、測定には定性及び／又は定量分析や検出
などのあらゆる目的のものが含まれる。
【００１２】ペルオキシダーゼ測定用試薬として用いる
ヒドロキシアミン化合物としては、フェノキシラジカル
を捕捉して安定なラジカル種を生成することができるな
らばいかなるものを用いてもよい。ヒドロキシアミン化
合物が本発明の方法のために望ましい特性を有している
か否かは、本明細書の実施例に記載された方法に従って
当業者が容易に判定することが可能である。なお、一般
的に、ラジカル種の安定性は、ラジカルの寿命やシグナ
ル強度の経時変化などの項目で判定することができる。
ヒドロキシアミン化合物としては、フェノキシラジカル
を捕捉して安定なラジカル種を生成することができるな
らばいかなるものを用いてもよい。ヒドロキシアミン化
合物が本発明の方法のために望ましい特性を有している
か否かは、本明細書の実施例に記載された方法に従って
当業者が容易に判定することが可能である。なお、一般
的に、ラジカル種の安定性は、ラジカルの寿命やシグナ
ル強度の経時変化などの項目で判定することができる。
【００１３】好ましいペルオキシダーゼ測定用試薬とし
て、フリーラジカルのスピンラベル剤として使用可能な
ニトロキシド（ニトロン）化合物を還元して得られる上
記特性のヒドロキシアミン化合物を用いることができ
る。原料として使用可能なニトロキシド化合物として
は、例えば、TEMPO (2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidin
yloxy)及びその誘導体；PRIOXYL 及びその誘導体；PROX
YL (2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidinyloxy)及びその誘
導体；Carboxy-PTIO [2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-te
tramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)及びその誘導
体；DOXYL (4,4-dimethyl-3-oxazolinyloxy)及びその誘
導体などを用いることができる。これらの化合物はいず
れも市販されており（例えば、シグマ社カタログ，95年
度版, 1943 "SPIN LABELS AND SPIN TRAPS" 参照）、容
易に入手可能である。また、例えば、総説として株式会
社同仁化学研究所から頒布されている「ドージンニュー
ス No.1」（渡部徳子著、“生体高分子へのスピンラベ
ル法の応用，1976年）等に記載されているニトロキシド
系スピンラベル剤も原料ニトロキシド化合物として使用
可能である。
て、フリーラジカルのスピンラベル剤として使用可能な
ニトロキシド（ニトロン）化合物を還元して得られる上
記特性のヒドロキシアミン化合物を用いることができ
る。原料として使用可能なニトロキシド化合物として
は、例えば、TEMPO (2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidin
yloxy)及びその誘導体；PRIOXYL 及びその誘導体；PROX
YL (2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidinyloxy)及びその誘
導体；Carboxy-PTIO [2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-te
tramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)及びその誘導
体；DOXYL (4,4-dimethyl-3-oxazolinyloxy)及びその誘
導体などを用いることができる。これらの化合物はいず
れも市販されており（例えば、シグマ社カタログ，95年
度版, 1943 "SPIN LABELS AND SPIN TRAPS" 参照）、容
易に入手可能である。また、例えば、総説として株式会
社同仁化学研究所から頒布されている「ドージンニュー
ス No.1」（渡部徳子著、“生体高分子へのスピンラベ
ル法の応用，1976年）等に記載されているニトロキシド
系スピンラベル剤も原料ニトロキシド化合物として使用
可能である。
【００１４】本発明の方法に好適に使用されるヒドロキ
シアミン化合物として、下記の化合物：
シアミン化合物として、下記の化合物：
【化３】 〔式中、R3は水酸基、置換若しくは無置換アミノ基（好
ましくは無置換アミノ基）、カルボキシル基、又はC1-6
アルコキシカルボニル基を示し；R4は水素原子、C1-6ア
ルキル基（好ましくはメチル基）、又はヒドラジド基を
示し；R5は水酸基、置換若しくは無置換アミノ基（好ま
しくはC1-6アルキルカルボニル置換アミノ基若しくは無
置換アミノ基、カルボキシル基、置換若しくは無置換カ
ルバモイル基（好ましくは無置換カルバモイル基）を示
し；R6は水素原子又はC1-6アルキル基（好ましくはメチ
ル基）を示し；R7は水素原子又はC1-6アルキル基（好ま
しくはメチル基）を示す〕からなる群から選ばれるヒド
ロキシアミン化合物を挙げることができる。
ましくは無置換アミノ基）、カルボキシル基、又はC1-6
アルコキシカルボニル基を示し；R4は水素原子、C1-6ア
ルキル基（好ましくはメチル基）、又はヒドラジド基を
示し；R5は水酸基、置換若しくは無置換アミノ基（好ま
しくはC1-6アルキルカルボニル置換アミノ基若しくは無
置換アミノ基、カルボキシル基、置換若しくは無置換カ
ルバモイル基（好ましくは無置換カルバモイル基）を示
し；R6は水素原子又はC1-6アルキル基（好ましくはメチ
ル基）を示し；R7は水素原子又はC1-6アルキル基（好ま
しくはメチル基）を示す〕からなる群から選ばれるヒド
ロキシアミン化合物を挙げることができる。
【００１５】上記の好ましいヒドロキシアミン化合物
は、いずれもフリーラジカルのスピンラベル剤として使
用可能なニトロキシド化合物を原料として還元により製
造可能であり、フェノキシラジカルを捕捉して安定なラ
ジカル種を生成することができる特性を有している。こ
れらの化合物は、文献に記載の方法、あるいは文献記載
の方法を基にして出発原料や試薬を適宜改変ないし修飾
することにより、いずれも容易に製造することができ
る。さらに、例えば、4-Hydrazonomethyl-1-hydroxy-2,
2,5,5-tetramethyl-3-imidazoline-3-oxide (HHTIO) な
どは市販品を入手することが可能であり（アルドリッチ
社，Code No.33,114-7) 、必要に応じて精製・希釈する
ことにより用いることができる。
は、いずれもフリーラジカルのスピンラベル剤として使
用可能なニトロキシド化合物を原料として還元により製
造可能であり、フェノキシラジカルを捕捉して安定なラ
ジカル種を生成することができる特性を有している。こ
れらの化合物は、文献に記載の方法、あるいは文献記載
の方法を基にして出発原料や試薬を適宜改変ないし修飾
することにより、いずれも容易に製造することができ
る。さらに、例えば、4-Hydrazonomethyl-1-hydroxy-2,
2,5,5-tetramethyl-3-imidazoline-3-oxide (HHTIO) な
どは市販品を入手することが可能であり（アルドリッチ
社，Code No.33,114-7) 、必要に応じて精製・希釈する
ことにより用いることができる。
【００１６】原料化合物であるニトロキシド化合物の還
元には、例えば、アスコルビン酸などの緩和な還元剤を
用いることができる。なお、還元の方法によってはヒド
ロキシアミノ基がさらに還元されてアミノ基となった化
合物(RR'NH) が生成する場合があるが、このようなアミ
ノ化合物は電子スピン共鳴により検出されないので、本
発明のペルオキシダーゼ測定用試薬にこのようなアミノ
化合物が少量混在していても、実用上は問題とならな
い。一般的には、ヒドロキシアミン化合物の純度検定は
1H-NMR測定によって行うことができる。
元には、例えば、アスコルビン酸などの緩和な還元剤を
用いることができる。なお、還元の方法によってはヒド
ロキシアミノ基がさらに還元されてアミノ基となった化
合物(RR'NH) が生成する場合があるが、このようなアミ
ノ化合物は電子スピン共鳴により検出されないので、本
発明のペルオキシダーゼ測定用試薬にこのようなアミノ
化合物が少量混在していても、実用上は問題とならな
い。一般的には、ヒドロキシアミン化合物の純度検定は
1H-NMR測定によって行うことができる。
【００１７】本発明の方法には上記のヒドロキシアミン
化合物の２種以上を組み合わせて用いてもよい。フェノ
キシラジカル捕捉剤及びペルオキシダーゼ測定用試薬と
して特に好適に用いられるヒドロキシアミン化合物の例
を以下に示すが、測定用試薬はこれらに限定されること
はない。
化合物の２種以上を組み合わせて用いてもよい。フェノ
キシラジカル捕捉剤及びペルオキシダーゼ測定用試薬と
して特に好適に用いられるヒドロキシアミン化合物の例
を以下に示すが、測定用試薬はこれらに限定されること
はない。
【化４】
【００１８】本発明の方法に用いられるp-置換フェノー
ル化合物は、少なくともp-位に任意の置換基を有するフ
ェノール化合物であって、かつ、ペルオキシダーゼによ
り触媒される過酸化水素の分解反応の進行とともに、対
応するフェノキシラジカルに容易に変換されるものであ
れば、その種類は特に限定されることはない。このよう
なp-置換フェノール化合物は、本発明の方法においてペ
ルオキシダーゼにより触媒される過酸化水素の分解反応
の増感剤として作用する。p-置換フェノール化合物が上
記の特性を有しているか否かは、実施例に説明した方法
によって当業者が適宜確認することができる。
ル化合物は、少なくともp-位に任意の置換基を有するフ
ェノール化合物であって、かつ、ペルオキシダーゼによ
り触媒される過酸化水素の分解反応の進行とともに、対
応するフェノキシラジカルに容易に変換されるものであ
れば、その種類は特に限定されることはない。このよう
なp-置換フェノール化合物は、本発明の方法においてペ
ルオキシダーゼにより触媒される過酸化水素の分解反応
の増感剤として作用する。p-置換フェノール化合物が上
記の特性を有しているか否かは、実施例に説明した方法
によって当業者が適宜確認することができる。
【００１９】上記のp-置換フェノール化合物は、m-位及
び／又はo-位に置換基を有していてもよい。p-置換フェ
ノール化合物のベンゼン環上に存在するp-位置換基、及
びp-位以外に置換する１または２以上の置換基の種類は
特に限定されず、２以上の置換基を有する場合にはそれ
ぞれの置換基は同一でも異なっていてもよい。このよう
な置換基として、例えば、C1-6アルキル基、C1-6アルケ
ニル基、C1-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、ハロゲ
ン原子、ハロゲン化C1-6アルキル基、カルボキシル基、
カルボキシC1-6アルキル基、C1-6アルコキシカルボニル
基、水酸基、ヒドロキシC1-6アルキル基、置換若しくは
無置換カルバモイル基、アルキル置換若しくは無置換の
アミノ基、アシルアミド基、アルコキシカルボニルアミ
ノ基などを挙げることができる。
び／又はo-位に置換基を有していてもよい。p-置換フェ
ノール化合物のベンゼン環上に存在するp-位置換基、及
びp-位以外に置換する１または２以上の置換基の種類は
特に限定されず、２以上の置換基を有する場合にはそれ
ぞれの置換基は同一でも異なっていてもよい。このよう
な置換基として、例えば、C1-6アルキル基、C1-6アルケ
ニル基、C1-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、ハロゲ
ン原子、ハロゲン化C1-6アルキル基、カルボキシル基、
カルボキシC1-6アルキル基、C1-6アルコキシカルボニル
基、水酸基、ヒドロキシC1-6アルキル基、置換若しくは
無置換カルバモイル基、アルキル置換若しくは無置換の
アミノ基、アシルアミド基、アルコキシカルボニルアミ
ノ基などを挙げることができる。
【００２０】アルキル基、アルケニル基、アルキニル
基、又はアルコキシ基としては、直鎖または分枝のいず
れでもよく、不飽和結合を有する場合にはいかなる位置
に不飽和結合を有していてもよい。ハロゲン原子として
は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原
子のいずれでもよい。具体的なp-置換フェノール化合物
としては、例えば、4-メトキシフェノール、4-エトキシ
フェノール、4-ヨードフェノール、3-(4- ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸(HPPA)、4-ヒドロキシフェニル酢
酸、4-ヒドロキシ馬尿酸、p-クレゾール、又はチラミン
等を挙げることができる。
基、又はアルコキシ基としては、直鎖または分枝のいず
れでもよく、不飽和結合を有する場合にはいかなる位置
に不飽和結合を有していてもよい。ハロゲン原子として
は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原
子のいずれでもよい。具体的なp-置換フェノール化合物
としては、例えば、4-メトキシフェノール、4-エトキシ
フェノール、4-ヨードフェノール、3-(4- ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸(HPPA)、4-ヒドロキシフェニル酢
酸、4-ヒドロキシ馬尿酸、p-クレゾール、又はチラミン
等を挙げることができる。
【００２１】また、本発明の方法に好適なp-置換フェノ
ール化合物として、上記の式（化２）で示される4-アセ
トアミドフェノール誘導体（式中、R1は水素原子又はC
1-6アルキル基を示し、R2はC1-6アルキル基、カルボキ
シル基、C1-6アルコキシカルボニル基を示す）を挙げる
ことができる。これらのうち、特に好適な化合物とし
て、R1が水素原子である上記化合物、並びに、R1が水素
原子であり、かつ、R2が CH3, C2H5, C3H7, COOH, OC
H3, OC2H5 である化合物を例示することができる。
ール化合物として、上記の式（化２）で示される4-アセ
トアミドフェノール誘導体（式中、R1は水素原子又はC
1-6アルキル基を示し、R2はC1-6アルキル基、カルボキ
シル基、C1-6アルコキシカルボニル基を示す）を挙げる
ことができる。これらのうち、特に好適な化合物とし
て、R1が水素原子である上記化合物、並びに、R1が水素
原子であり、かつ、R2が CH3, C2H5, C3H7, COOH, OC
H3, OC2H5 である化合物を例示することができる。
【００２２】本発明の方法の測定対象としては、ペルオ
キシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質、例
えばヘモグロビンなどを挙げることができる。測定方法
の詳細は以下の実施例に詳細に説明されているが、試薬
類の濃度や電子スピン共鳴スペクトルの測定方法及びES
R 装置などは、実施例に説明されたものに限定されるこ
とはなく、実施例の方法や装置に適宜の修飾や改変を加
えることができ、当業者が適宜選択可能であることはい
うまでもない。
キシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質、例
えばヘモグロビンなどを挙げることができる。測定方法
の詳細は以下の実施例に詳細に説明されているが、試薬
類の濃度や電子スピン共鳴スペクトルの測定方法及びES
R 装置などは、実施例に説明されたものに限定されるこ
とはなく、実施例の方法や装置に適宜の修飾や改変を加
えることができ、当業者が適宜選択可能であることはい
うまでもない。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１：ペルオキシダーゼ測定用試薬の製造 (1) Carboxy-PTIO 1 g [2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, 4.99 mmol,
株式会社同仁化学研究所製) をメタノール 5 mlに溶解
し、室温で２倍モル量のアスコルビン酸を添加して白色
沈澱を生じるまで撹拌した。生じた白色沈澱を濾取し、
少量のメタノール及び水で洗浄して乾燥し、本発明のペ
ルオキシダーゼ測定用試薬 Carboxy-PTIOH [2-(4-carbo
xyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-
hydroxide]を得た。
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１：ペルオキシダーゼ測定用試薬の製造 (1) Carboxy-PTIO 1 g [2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, 4.99 mmol,
株式会社同仁化学研究所製) をメタノール 5 mlに溶解
し、室温で２倍モル量のアスコルビン酸を添加して白色
沈澱を生じるまで撹拌した。生じた白色沈澱を濾取し、
少量のメタノール及び水で洗浄して乾燥し、本発明のペ
ルオキシダーゼ測定用試薬 Carboxy-PTIOH [2-(4-carbo
xyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-
hydroxide]を得た。
【００２４】(2) Carboxy-TEMPO 200 mg (4-carboxy-2,
2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy, 7.21 mmol, アルド
リッチ社製) をメタノール 2 ml に溶解し、室温で２倍
モル量のアスコルビン酸を添加して白色沈澱を生じるま
で撹拌した。生じた白色沈澱を濾取し、少量のメタノー
ルと水で洗浄して乾燥し、本発明のペルオキシダーゼ測
定用試薬 (4-carboxy-2,2,6,6-tetramethyl-N-hydroxyp
iperidine)を得た。
2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy, 7.21 mmol, アルド
リッチ社製) をメタノール 2 ml に溶解し、室温で２倍
モル量のアスコルビン酸を添加して白色沈澱を生じるま
で撹拌した。生じた白色沈澱を濾取し、少量のメタノー
ルと水で洗浄して乾燥し、本発明のペルオキシダーゼ測
定用試薬 (4-carboxy-2,2,6,6-tetramethyl-N-hydroxyp
iperidine)を得た。
【００２５】例２：ペルオキシダーゼの測定 測定用緩衝液として 0.015% H2O2含有 0.1M MOPS緩衝液
(pH 6.5)を用い、基質液としてp-アセトアミドフェノー
ル (25 mM 水溶液）を用いた。ペルオキシダーゼ測定用
試薬であるヒドロキシアミン化合物としては、4-Hydraz
onomethyl-1-hydroxy-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazol
ine-3-oxide (HHTIO, アルドリッチ社)50μg/ml DMSO
溶液、又は、例１(2) のヒドロキシアミン化合物(Carbo
xy-PTIOH) 50μg/ml DMSO 溶液を用い、酵素液として
0.01 M DIPSO 緩衝液(pH 6.5)で10-4 units/ml のペル
オキシダーゼ溶液を調製した。
(pH 6.5)を用い、基質液としてp-アセトアミドフェノー
ル (25 mM 水溶液）を用いた。ペルオキシダーゼ測定用
試薬であるヒドロキシアミン化合物としては、4-Hydraz
onomethyl-1-hydroxy-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazol
ine-3-oxide (HHTIO, アルドリッチ社)50μg/ml DMSO
溶液、又は、例１(2) のヒドロキシアミン化合物(Carbo
xy-PTIOH) 50μg/ml DMSO 溶液を用い、酵素液として
0.01 M DIPSO 緩衝液(pH 6.5)で10-4 units/ml のペル
オキシダーゼ溶液を調製した。
【００２６】測定用緩衝液 (100 μl)、超純水 (110 μ
l)、基質液(30 μl)、ヒドロキシアミン化合物(10 μ
l)、及び酵素液(50 μl)を混和し、室温下で15分間反応
させた後、生成したNOラジカル種の量をESR で測定し
た。図１に結果を示す。図中、(a) は Carboxy-PTIOH,
(b) は HHTIOの結果をそれぞれ示しており、上段はブラ
ンクの測定結果を示す。この結果から明らかなように、
p-置換フェノール添加の場合には、ESR シグナル強度が
ブランク(HRP無添加) に比べて顕著に上昇した。ESR の
測定条件は以下のとおりである。中心磁場：3346±50 G
auss；モジュレーション：100 KHz, 1.0 Gauss；パワ
ー：20 mW ；ゲイン： 1×100, 5×10；及び、レスポン
ス：0.1 sec 。
l)、基質液(30 μl)、ヒドロキシアミン化合物(10 μ
l)、及び酵素液(50 μl)を混和し、室温下で15分間反応
させた後、生成したNOラジカル種の量をESR で測定し
た。図１に結果を示す。図中、(a) は Carboxy-PTIOH,
(b) は HHTIOの結果をそれぞれ示しており、上段はブラ
ンクの測定結果を示す。この結果から明らかなように、
p-置換フェノール添加の場合には、ESR シグナル強度が
ブランク(HRP無添加) に比べて顕著に上昇した。ESR の
測定条件は以下のとおりである。中心磁場：3346±50 G
auss；モジュレーション：100 KHz, 1.0 Gauss；パワ
ー：20 mW ；ゲイン： 1×100, 5×10；及び、レスポン
ス：0.1 sec 。
【００２７】例３：p-ヒドロキシアセトアニリド誘導体
を用いたペルオキシダーゼの測定 p-置換フェノール誘導体として、p-ヒドロキシアセトア
ニリド誘導体、p-メトキシフェノール、p-クレゾール、
チロキシン、及び 3-(4-ヒドロキシフェニル）プロピオ
ン酸(HPPA)を用い、ヒドロキシアミン化合物として HHT
IOを用いて、ペルオキシダーゼの測定を行った。測定用
緩衝液として 0.015% H2O2含有 0.1 M MOPS 緩衝液(pH
6.5)を用い、基質液は25 mM 水溶液とした。酵素液とし
ては 0.01 M MOPS(pH 7.0)緩衝液で10-4units/mlのPOD
溶液を調製したものを用い、HHTIO 液は DMSO で50μg/
mlの溶液を調製した。
を用いたペルオキシダーゼの測定 p-置換フェノール誘導体として、p-ヒドロキシアセトア
ニリド誘導体、p-メトキシフェノール、p-クレゾール、
チロキシン、及び 3-(4-ヒドロキシフェニル）プロピオ
ン酸(HPPA)を用い、ヒドロキシアミン化合物として HHT
IOを用いて、ペルオキシダーゼの測定を行った。測定用
緩衝液として 0.015% H2O2含有 0.1 M MOPS 緩衝液(pH
6.5)を用い、基質液は25 mM 水溶液とした。酵素液とし
ては 0.01 M MOPS(pH 7.0)緩衝液で10-4units/mlのPOD
溶液を調製したものを用い、HHTIO 液は DMSO で50μg/
mlの溶液を調製した。
【００２８】測定用緩衝液 100μl 、基質液30μl 、H2
O 120 μl 、HHTIO 液10μl にPOD溶液50μl を加えて
室温下で30分反応させた後、日本電子社製JES-FR80電子
スピン共鳴装置で産生したラジカル量を測定した。ESR
の測定条件は以下のとおりである。中心磁場：3346±50
Gauss；モジュレーション；100 KHz 1.0 Gauss ；パワ
ー: 20 mW ；ゲイン：1 ×100, 5×10；及び、レスポン
ス：0.3 sec 。結果を以下の表１に示す（表中、増感効
率はピーク高さ／ブランクである）。p-ヒドロキシアニ
リド誘導体は、他のフェノール化合物に対し高い増感効
率を示した。
O 120 μl 、HHTIO 液10μl にPOD溶液50μl を加えて
室温下で30分反応させた後、日本電子社製JES-FR80電子
スピン共鳴装置で産生したラジカル量を測定した。ESR
の測定条件は以下のとおりである。中心磁場：3346±50
Gauss；モジュレーション；100 KHz 1.0 Gauss ；パワ
ー: 20 mW ；ゲイン：1 ×100, 5×10；及び、レスポン
ス：0.3 sec 。結果を以下の表１に示す（表中、増感効
率はピーク高さ／ブランクである）。p-ヒドロキシアニ
リド誘導体は、他のフェノール化合物に対し高い増感効
率を示した。
【００２９】
【表１】 ──────────────────────── p-置換フェノール ピーク高さ(mm) 増感効率* ──────────────────────── ブランク 3.0 - R1=H, R2=CH3 610 203.3 R1=H, R2=C2H5 625 208.3 R1=H, R2=C3H7 580 193.3 R1=H, R2=COOH 60 20.0 R1=H, R2=OCH3 710 236.8 R1=H, R2=OC2H5 592 197.3 p-メトキシフェノール 405 135.0 p-クレゾール 125 41.7 チロキシン 10.0 3.3 HPPA 18.0 6.0 ────────────────────────
【００３０】例４：発色試薬ABTS、OPD と本発明の測定
方法の感度比較 ペルオキシダーゼの検出に汎用されている代表的発色試
薬である ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzothiazol
ine-6-sulfonic acid]、及びOPD (o-phenylenediamine)
を用いて、本発明の測定方法との比較を行った。ABTS測
定には、日本化薬社製ラナエンザイム439 キット添付の
基質緩衝液と発色剤とを用い、ABTS濃度を2.5 mg/ml に
調整した基質液を 300μl 使用した。OPD 測定には、ア
ボット社製HBs 抗原測定試薬オースザイムII添付のOPD
錠１錠につきOPD 錠溶解液 5 mlを加え、OPD 濃度を3 m
g/ml に調整した基質液を300 μl 使用した。各基質液3
00 μl にp-ヒドロキシフェノール(HRP: 10-5u/ml) 50
μl を添加して室温下で30分間反応させた。ABTS測定で
は H2O 1000 μl の添加により、POD 測定では1N H2SO4
1000 μl の添加により反応液のクエンチングあるいは
反応停止を行った。最終反応液1000μl を分取し、日立
社製分光光度計 U-2000 を用いてOD値の測定を行った。
ABTS及びOPD の測光波長はそれぞれ414 nm及び490 nmと
した。
方法の感度比較 ペルオキシダーゼの検出に汎用されている代表的発色試
薬である ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzothiazol
ine-6-sulfonic acid]、及びOPD (o-phenylenediamine)
を用いて、本発明の測定方法との比較を行った。ABTS測
定には、日本化薬社製ラナエンザイム439 キット添付の
基質緩衝液と発色剤とを用い、ABTS濃度を2.5 mg/ml に
調整した基質液を 300μl 使用した。OPD 測定には、ア
ボット社製HBs 抗原測定試薬オースザイムII添付のOPD
錠１錠につきOPD 錠溶解液 5 mlを加え、OPD 濃度を3 m
g/ml に調整した基質液を300 μl 使用した。各基質液3
00 μl にp-ヒドロキシフェノール(HRP: 10-5u/ml) 50
μl を添加して室温下で30分間反応させた。ABTS測定で
は H2O 1000 μl の添加により、POD 測定では1N H2SO4
1000 μl の添加により反応液のクエンチングあるいは
反応停止を行った。最終反応液1000μl を分取し、日立
社製分光光度計 U-2000 を用いてOD値の測定を行った。
ABTS及びOPD の測光波長はそれぞれ414 nm及び490 nmと
した。
【００３１】ヒドロキシアミン化合物を用いる本発明の
方法の測定条件は、超純水量を160μl とし、ゲインを
×200 とした以外は、例３に準じて行った。結果を表2
に示す。また、本発明の方法による測定結果を図２示
す。図中、(a) は Carboxy-PTIOH, (b) は HHTIOの結果
をそれぞれ示しており、上段はブランクの測定結果を示
す。ABTS及びOPD を用いた場合のS/N 比はそれぞれ 3.0
及び 3.3であったが、本発明の方法では、HHTIO を用い
た場合のS/N 比が47.6であり、PTIOH を用いた場合のS/
N 比は15.3であり、本発明の測定方法は従来法に比べて
著しく高感度であった。
方法の測定条件は、超純水量を160μl とし、ゲインを
×200 とした以外は、例３に準じて行った。結果を表2
に示す。また、本発明の方法による測定結果を図２示
す。図中、(a) は Carboxy-PTIOH, (b) は HHTIOの結果
をそれぞれ示しており、上段はブランクの測定結果を示
す。ABTS及びOPD を用いた場合のS/N 比はそれぞれ 3.0
及び 3.3であったが、本発明の方法では、HHTIO を用い
た場合のS/N 比が47.6であり、PTIOH を用いた場合のS/
N 比は15.3であり、本発明の測定方法は従来法に比べて
著しく高感度であった。
【００３２】
【表２】 ───────────────────────── 試 料 ABTS(414nm) OPD(490nm) 本発明(mm) ───────────────────────── ブランク 0.004 0.003 2.5 HRP 10-5 u/ml 0.012 0.010 119 ─────────────────────────
【００３３】
【発明の効果】ペルオキシダーゼを高感度で測定するこ
とができ、従来法では測定不可能な希薄なペルオキシダ
ーゼの分析が可能である。
とができ、従来法では測定不可能な希薄なペルオキシダ
ーゼの分析が可能である。
【図１】 フェノキシラジカルにより酸化されたヒドロ
キシアミン化合物のESRスペクトルを示す図である。図
中、(a) はヒドロキシアミン化合物としてCarboxy-PTIO
H を用いた場合を示し、(b) はヒドロキシアミン化合物
としてHHT10 を用いた場合を示しており、上段はブラン
クの測定結果を示す。
キシアミン化合物のESRスペクトルを示す図である。図
中、(a) はヒドロキシアミン化合物としてCarboxy-PTIO
H を用いた場合を示し、(b) はヒドロキシアミン化合物
としてHHT10 を用いた場合を示しており、上段はブラン
クの測定結果を示す。
【図２】 p-ヒドロキシフェノール濃度 10 -5u/mlにお
ける本発明の測定方法のS/N 値を示す図である。図中、
(a) はヒドロキシアミン化合物としてCarboxy-PTIOH を
用いた場合を示し、(b) はヒドロキシアミン化合物とし
てHHT10 を用いた場合を示し、上段はブランクの測定結
果を示す。
ける本発明の測定方法のS/N 値を示す図である。図中、
(a) はヒドロキシアミン化合物としてCarboxy-PTIOH を
用いた場合を示し、(b) はヒドロキシアミン化合物とし
てHHT10 を用いた場合を示し、上段はブランクの測定結
果を示す。
Claims (8)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼの測定方法であって、
下記の工程： (a) 過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によ
りp-置換フェノール化合物から産生されるフェノキシラ
ジカルをヒドロキシアミン化合物で捕捉して安定なラジ
カル種を生成させる工程；及び(b) 上記安定ラジカル種
の電子スピン共鳴を測定する工程を含む測定方法。 - 【請求項２】 p-置換フェノール化合物が、下記の式： 【化１】 （式中、R1は水素原子又はC1-6アルキル基を示し、R2は
C1-6アルキル基、カルボキシル基、C1-6アルコキシカル
ボニル基を示す）で示される4-アセトアミドフェノール
誘導体である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 p-置換フェノール化合物が、4-メトキシ
フェノール、4-エトキシフェノール、4-ヨードフェノー
ル、3-(4- ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、4-ヒド
ロキシフェニル酢酸、4-ヒドロキシ馬尿酸、p-クレゾー
ル、及びチラミンからなる群から選択される請求項１に
記載の方法。 - 【請求項４】 過酸化水素とp-置換フェノール化合物の
存在下でペルオキシダーゼの作用により形成されるフェ
ノキシラジカルを捕捉して安定なラジカル種を生成する
ことができるヒドロキシアミン化合物からなるペルオキ
シダーゼ測定用試薬。 - 【請求項５】 p-置換フェノール化合物が請求項２に記
載の4-アセトアミドフェノール誘導体である請求項４に
記載のペルオキシダーゼ測定用試薬。 - 【請求項６】 ヒドロキシアミン化合物がフリーラジカ
ルのスピンラベル剤として使用可能なニトロキシド化合
物の還元により製造される化合物である請求項４又は５
に記載のペルオキシダーゼ測定用試薬。 - 【請求項７】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の方法に使用する請求項４ないし６のいずれか１項に記
載のペルオキシダーゼ測定用試薬。 - 【請求項８】 過酸化水素とp-置換フェノール誘導体の
存在下でペルオキシダーゼの作用により形成されるフェ
ノキシラジカルを捕捉して安定なラジカル種を生成する
ことができるヒドロキシアミン化合物。
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|---|---|---|---|
| JP18386995A JP3155685B2 (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | ペルオキシダーゼの測定方法 |
| EP96305191A EP0754760B1 (en) | 1995-07-20 | 1996-07-15 | Method and reagent for detecting peroxidase or hydrogen peroxide |
| DE69624760T DE69624760T2 (de) | 1995-07-20 | 1996-07-15 | Methode und Reagenz zum Nachweis von Peroxidase oder Wasserstoffperoxid |
| ES96305191T ES2186757T3 (es) | 1995-07-20 | 1996-07-15 | Metodo y agente para la deteccion de peroxidasa o de peroxido de hidrogeno. |
| US08/683,148 US5780257A (en) | 1995-07-20 | 1996-07-18 | Method and reagent for detecting peroxidase or hydrogen peroxide |
| CA002181500A CA2181500C (en) | 1995-07-20 | 1996-07-18 | Method and reagent for detecting peroxidase or hydrogen peroxide |
| CN96112298A CN1105189C (zh) | 1995-07-20 | 1996-07-20 | 过氧化物酶或过氧化氢的测定方法及测定用试剂 |
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=26502137
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18386995A Expired - Fee Related JP3155685B2 (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | ペルオキシダーゼの測定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0754760B1 (ja) |
| JP (1) | JP3155685B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69624760T2 (ja) |
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| WO1997024145A1 (fr) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Daiichi Radioisotope Laboratories, Ltd. | Medicaments d'aide au diagnostic |
| JP2001255331A (ja) * | 2000-03-13 | 2001-09-21 | Iatron Lab Inc | アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬 |
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| JP3614352B2 (ja) * | 2000-09-04 | 2005-01-26 | 伯東株式会社 | 安定フリーラジカル化合物の濃度測定方法 |
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| CN100335893C (zh) * | 2004-12-23 | 2007-09-05 | 湖南大学 | 堆肥中过氧化物酶活性的电化学测定方法 |
| WO2007064030A1 (en) * | 2005-12-01 | 2007-06-07 | Canon Kabushiki Kaisha | Method and device for detecting target substance using probe carrier |
| WO2011118197A1 (ja) * | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 日本電気株式会社 | 光電変換素子、光センサ及び太陽電池 |
| CN103091312A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-05-08 | 厦门谱尼测试有限公司 | 一种检测食品中残留过氧化氢的酶-比色法 |
| CN104596954B (zh) * | 2014-12-10 | 2017-11-17 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种利用邻对位醛基取代的芳基酚检测过氧化物的方法 |
| CN105158219B (zh) * | 2015-07-28 | 2018-03-13 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种利用含醛基的硼酯化合物检测过氧化物的方法 |
| CN111999350A (zh) * | 2019-05-26 | 2020-11-27 | 谢艳 | 一种检测方法或试剂盒 |
| CN112630252B (zh) * | 2020-11-05 | 2022-04-01 | 浙江大学 | 含有抗氧化剂丁基羟基茴香醚的片剂稳定性无损检测方法 |
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1995
- 1995-07-20 JP JP18386995A patent/JP3155685B2/ja not_active Expired - Fee Related
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1996
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