JP3568371B2 - ペルオキシダーゼの測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシダーゼの測定方法に関するものであり、高感度の測定方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼ(以下、本明細書中でPODの称する場合がある)の測定方法としてルミノール等を用いる化学発光方法が知られているが、増感発光やラジカル増感などを採用した検出方法によってもペルオキシダーゼの検出感度は充分とはいえず、特に、ラジカル増感によるペルオキシダーゼの検出感度は大きくても10−3units/ml程度であり、酵素免疫測定試薬としては明らかに感度不足であった。
そこで、本発明者等は、特開平9−28396号公報において、フェノール化合物とヒドロキシアミン体を併用したペルオキシダーゼの高感度測定方法を提案している。この方法では、フェノール化合物とヒドロキシルアミン体を併用し、ペルオキシダーゼ又は過酸化水素のいずれか一方を他方に対して過剰とし、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりp−置換フェノール化合物から生成されるフェノキシラジカルをヒドロキシアミン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成し、生成したラジカルを4−ヒドラゾノメチル−1−ヒドロキシ−2,2,5,5−テトラメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HHTIO)またはCarboxy−PTIO[2−(4−カルボキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン−1−オキシル−3−オキシド)で捕捉して安定なラジカル種として生成させて、電子スピン共鳴を測定するものである。この方法では、高感度であるものの、ダイナミックレンジが狭いという問題を有している。
【0003】
すなわち、測定に用いるヒドロキシルアミン体(>NOH)は、不安定であり、容易に酸化されて安定なニトロキシド化合物(>NO)になることが知られており、これが高いブランク値が生じる原因である。また、ヒドロキシルアミン体は、過酸化水素を含む基質緩衝液中において経時的にブランク値が上昇する。このブランク値の存在、基質緩衝液中における経時的上昇により測定系に添加可能なヒドロキシルアミン量は制限を受けざるを得ない。そのために、高感度ではあっても実用的な測定にはダイナミックレンジが狭いという問題点を有していた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高感度なペルオキシダーゼ、又は過酸化水素の測定方法を提供するものであり、とくに、測定値のバックブランク値が低く、ダイナミックレンジの広い測定方法を提供することを課題とするものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ペルオキシダーゼの測定方法において、ペルオキシダーゼまたは過酸化水素のいずれか一方を他方に対して過剰とし、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりp−置換フェノール化合物から生成されるフェノキシラジカルを下記の化学式1で示されるヒドロキシアミン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成させて、安定ラジカル種の電子スピン共鳴を測定するペルオキシダーゼの測定方法である。
【0006】
【化2】
【0007】
ただし、Rは水素原子、アルキル基、アルコキシル基である。
また、ヒドロキシルアミン化合物として、キレート試薬を含有した溶液を用いた前記のヒドロキシアミン化合物を用いたペルオキシダーゼの測定方法である。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明は、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりフェノール化合物から生成したフェノキシラジカルを捕捉するヒドロキシルアミン体としてとくに、化学式1で示される化合物が好ましいことを見出したものである。とくに、化学式1の化合物において、Rがアルキル基あるいはアルコキシル基である場合には炭素数1〜3のものが好ましい。また、水素である場合には高濃度領域が好ましく、アルキル基あるいはアルコキシ基である場合には、低濃度領域が好ましい。
とくに、1−ヒドロキシ−2,2,5,5−テトラメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HTIO)あるいは1−ヒドロキシ−2,2,4,5,5−ペンタメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HPIO)が、低いブランク値を示すので好ましい。
【0009】
また、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりフェノール化合物から生成したフェノキシラジカルをヒドロキシルアミン体によって捕捉しているので、ヒドロキシルアミン体の濃度を大きくするほど、高濃度のフェノキシラジカルの測定も可能となるが、従来のヒドロキシルアミン体ではバックグランド値も大きくなるので、実質的な測定可能な濃度範囲であるダイナミックレンジを広くすることは困難であったが、本発明の方法のヒドロキシルアミン体は、ブランク値が低いので大量に用いることが可能であり、低濃度から高濃度までのダイナミックレンジの広い測定が可能となる。
【0010】
また、本発明の方法においては、キレート試薬を添加することによってブランク値を低下することができる。
とくにキレート試薬としては、エチレンジアミン−N,N,N’,N’−4酢酸2ナトリウム(EDTA−2Na)、o,o’−ビス(2−アミノエチル)エチレングリコール−N,N,N’,N’−4酢酸(EGTA)、ジエチレントリアミン−N,N,N’,N”N”−5酢酸(DTPA)、トリエチレンテトラアミン−N,N,N’,N”,N”,N”−6酢酸(TTHA)、トランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N’,N’−4酢酸(CyDTA)が好ましい。
【0011】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1(ヒドロキシアミン体ブランク値の比較)
1−ヒドロキシ−2,2,5,5−テトラメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HTIO;ACROS社製)、1−ヒドロキシ−2,2,4,5,5−ペンタメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HPIO;ACROS社製)をそれぞれ、ジメチルスルホキシド(DMSO 関東化学製)によって2mmol/lの濃度に調製した。
3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS 同仁化学研究所)の0.1M、pH6.5の基質緩衝液に1重量%の過酸化水素水を添加し、最終濃度が0.015重量%となるように調製し、p−アセトアミドフェノール(和光純薬)の3mg/ml(20mmol/l)の濃度の水溶液を調製した。
水160μlに、調製した基質緩衝液100μl、p−アセトアミドフェノール水溶液30μl、ヒドロキシアミン溶液10μlをそれぞれ混合し、37℃において、30分間反応させた。アジ化ナトリウム(100mmol/l)の50μlを混合後、生成したNOラジカルの量を電子スピン共鳴装置(日本電子製JES−FR80)によって中心磁場:336.2mT、変調磁場:0.1mT、マイクロ波出力4mW、増幅率:500倍、応答時間:0.3秒の条件で測定した。その測定結果を図1に示す。図1(A)は、HTI0であり、(B)は、HPIOについての測定結果である。
【0012】
比較例1(ヒドロキシアミン体ブランク値の比較)
ヒドロキシルアミンとして、4−ヒドラゾノメチル−1−ヒドロキシ−2,2,5,5−テトラメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HTTIO)に変えた点を除き実施例1と同様にして測定し、その結果を図1において、(C)で示す。
また、実施例1および比較例1のブランクの信号強度の比較を表1に示す。
【0013】
【0014】
HTIO、HPIOは、HTTIOに比し低いブランク値を示し、S/N比の向上に有効であることが示される。
【0015】
実施例2(ペルオキシダーゼのS/N比の改善)
西洋わさび由来のペルオキシダーゼ(HRP 和光純薬製 MW40,000250U/mg)を50重量%エチレングリコール水溶液で希釈して10−5U/mlの溶液を調製し、HRP水溶液50μl、実施例1で調製した基質緩衝液100μl、p−アセトアミドフェノール水溶液30μl、およびヒドロキシアミン溶液10μlを水110μlに混合し、37℃において、30分間反応させた。アジ化ナトリウム(100mmol/l)の50μlを混合後、生成したNOラジカルの量を実施例1と同様の方法によって測定し、その結果を表2に示す。
【0016】
比較例2(ペルオキシダーゼのS/N比の改善)
ヒドロキシルアミンとして、4−ヒドラゾノメチル−1−ヒドロキシ−2,2,5,5−テトラメチル−3−イミダゾリン−3−オキシド(HHTIO)に変更した点を除き実施例2と同様にして測定し、その結果を表2に示す。
【0017】
【0018】
本発明の方法では、大幅にブランク値が低下し、S/N比が改善されることが確認できた。
【0019】
実施例3(ダイナミックレンジの改善)
水70μlに、実施例2と同様に調製した基質緩衝液100μl、p−アセトアミドフェノール水溶液30μl、ヒドロキシルアミン溶液50μlに、濃度が10−6U/ml〜10−2U/mlのHRP溶液の50μlを混合し、37℃において30分間反応させて、アジ化ナトリウム(100mmol/l)の50μlを混合後、生成したNOラジカルの量またはニトロキシドラジカルの量を実施例1と同様の方法によって測定し、その結果を図2に示す。なお、ヒドロキシルアミン体として、HHTIOは、濃度が0.4mmol/lの溶液を用い、HTIOとHPIOはそれぞれ、HHTIOの5倍の濃度である2mmol/lの溶液を用いた。
図2では、横軸に130μlの測定用試験管当たりのモル数を、アトモル(amolすなわち10−18mol )で対数表示をし、縦軸には測定強度の対数の値を示す。
【0020】
実施例4(キレート試薬によるブランク値の低下)
キレート試薬として、o,o’−ビス(2−アミノエチル)エチレングリコール−N,N,N’,N’−4酢酸(EGTA)、エチレンジアミン−N,N,N’,N’−4酢酸2ナトリウム(EDTA−2Na)、トリエチレンテトラアミン−N,N,N’,N”,N”,N”−6酢酸(TTHA)、トランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N’,N’−4酢酸(CyDTA)、ジエチレントリアミン−N,N,N’,N”N”−5酢酸(DTPA)のそれぞれを実施例1と同様のMOPS基質緩衝液(0.1M、pH7.0)によって10mmol/lの濃度に調製した。
水110μlに上記の各キレート試薬の溶液50μlおよび基質緩衝液100μl、実施例1と同様に調製したp−アセトアミドフェノール水溶液30μl、実施例1と同様に調製した濃度6mmol/lのHTIOの10μlを混合し、37℃において、30分間反応させ、次いでアジ化ナトリウム50μlを添加した後に、実施例1と同様に電子スピン共鳴装置によって測定し、測定結果を表3において、キレート試薬無添加のものの強度を100として、相対強度で示す。
【0021】
【0022】
これらのキレート試薬の添加によって、ブランク値を低下させることができることが示される。
【0023】
【発明の効果】
ペルオキシダーゼ、過酸化水素をパラアセトアミドフェノールとの反応によって生成するフェノキシラジカルを、ヒドロキシルアミンに捕捉させた後に、電子スピン共鳴装置によって高感度の測定をすることができる。
【0024】
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒドロキシアミン化合物の種類とブランク値の関係を説明する図である。
【図2】ヒドロキシルアミンを増量した場合のダイナミックレンジを説明する図である。
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