CN100335893C

CN100335893C - 堆肥中过氧化物酶活性的电化学测定方法

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Publication number: CN100335893C
Application number: CNB2004100470836A
Authority: CN
Inventors: 汤琳; 曾光明; 黄国和; 章毅
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2024-12-23
Also published as: CN1632551A

Abstract

本发明涉及过氧化物酶活性的电化学测定。本方法以过氧化氢、对苯二酚为酶的底物，测定了接种有黄孢原毛平革菌的堆肥浸出液中过氧化物酶的活性，建立了加入过氧化氢后电流变化斜率与酶活之间的线性关系。通过建立回归模型，快速、灵敏地测定总过氧化物酶的活性。总酶活与加入过氧化氢后电流变化斜率呈线性关系的范围是木质素过氧化物酶为2.27～29.79U/L，锰过氧化物酶为0.085～1.37U/L。本方法应用到堆肥中酶活的测定，能够排除堆肥浸出液中浊度和光干扰物质的干扰，较传统的分光光度法更加快速、灵敏和精确，可成为在城市生活垃圾堆肥控制系统中一套快速、低成本的堆肥腐熟度检测技术。

Description

堆肥中过氧化物酶活性的电化学测定方法

技术领域：

本发明涉及一种过氧化物酶活性的测定方法，具体涉及堆肥复杂系统中过氧化物酶活性的电化学测定。

背景技术：

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一种白腐真菌，在降解城市生活垃圾堆肥中的木质素及多种有机污染物方面具有重要作用。该菌在一些主要营养物质(如氮、碳、硫)受到限制时形成的木质素降解酶系对各种异生物质具有独特的降解能力，它能降解木材中的木质素而使木材呈白色，20世纪80年代以来的研究表明，该菌对底物的氧化具有非特异性的特点，可以降解多种有机物，包括天然高聚物、还原型化合物、氧化型化合物、有毒化合物等。黄孢原毛平革菌合成的木质素降解酶体系中起主要作用的有两种酶：木素过氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)和锰过氧化物酶(manganeseperoxidase，MnP)，它们合成后被分泌到胞外，经过氧化氢启动一系列自由基链反应，依靠氧化还原反应降解各种结构各异的有机物。

在堆肥复杂系统中降解木质素的过氧化物酶类的活性增加意味着堆肥稳定性的提高，这是因为当大量的简单有机化合物已被消耗殆尽时，木质素成为微生物群落主要碳源之一。这样LiP和MnP的酶活成为检测堆肥腐熟度的重要指标。

目前，对于LiP和MnP活性的测定普遍采用分光光度法，如测定LiP活性的藜芦醇法及用某些染料(RB亮兰、苯胺兰、天青等)来作为LiP活性的指示剂都受到底物浊度的限制和光干扰物质的影响；而KMB(2-keto-4-methiolbutyric acid)-乙烯分析法较慢，且除了LiP还有许多氧化剂能够氧化KMB，产生乙烯，选择性不好。一般采用的酚红法、二价锰氧化分光光度法、愈创木酚法测定MnP活性同样对底物浊度要求比较苛刻，受光干扰物质影响，测定的精确度不高。堆肥浸出液浊度过大，阻碍了分光光度法测定过氧化物酶活的应用。因此研究一种适合在堆肥过程控制中的过氧化物酶活测定是极需解决的问题。

发明内容：

本发明旨在运用电化学原理，提供一种过氧化物酶活性的测定方法，提高测定的灵敏性和抗干扰能力，以便更好地应用到城市生活垃圾堆肥处理中，解决堆肥过程控制系统中的实时监测问题。

本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。

堆肥中过氧化物酶活性的电化学测定方法，在接有三电极的电解池中进行，本方法以玻碳电极为基底电极，以过氧化氢、对苯二酚为底物，用计时电流法测定堆肥浸出液中加入过氧化氢后电流变化斜率，用线性回归方程计算木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的总酶活，测定条件为：

还原电位 +0.06V

酒石酸缓冲溶液 pH 3～5

对苯二酚浓度 0.2～0.6mM

过氧化氢浓度 0.05～0.3mM

木素过氧化酶和锰过氧化物酶活性与电流变化斜率关系的三维线性回归方程为：

V＝8.82×10^-3(X+20.61Y)-0.07

V为斜率(μAs^-1)

X为木素过氧化物酶活(U/L)，Y为锰过氧化物酶活(U/L)，(X+20.61Y)为总酶活(U/L)

其中木素过氧化物酶活范围为2.27～29.79U/L

锰过氧化物酶活范围为0.085～1.37U/L。

测定酶活的最佳条件如下：

还原电位 +0.06V

酒石酸缓冲溶液 pH 4.2

对苯二酚浓度 0.25mM

过氧化氢浓度 0.19mM

附图说明：

图1MnP和LiP氧化还原对苯二酚的机制；其中QH₂代表对苯二酚，Q^.代表对苯二酚的氧化物自由基。

图2四种含不同浓度的木质素降解酶的黄孢原毛平革菌粗酶液的电流响应；

图3反映LiP和MnP的活性与电流变化斜率关系的三维线性回归模型。

图4最佳条件下用分光光度法和电流法测得的粗酶液中的总酶活比较。

下面结合附图进一步详述本发明：

在堆肥中，黄孢原毛平革菌分泌的MnP和LiP被过氧化氢氧化成高价态，再通过催化芳香族酚类底物的氧化反应得到相应阳离子自由基而获取一个电子。LiP能在低pH值、有过氧化氢存在的条件下独立氧化对苯二酚；MnP必须在有Mn²⁺做还原剂的条件下才能完成催化循环，而三价的锰离子作为一个扩散性强的氧化剂，可以更有效地氧化对苯二酚。上述反应机制见图1。对苯二酚的氧化物在电极上还原产生可以测定的电流信号。

本发明电化学测定采用美国Princeton Applied Research生产的VMP2多通道电化学系统与25ml电解池中的三电极系统相连接，进行控制与监测。该三电极系统以玻碳电极(直径3mm)作为工作电极(即基底电极)，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，进行稳定的测量。所有工作均在室温(25℃)下完成。本方法以过氧化氢、对苯二酚为底物，测试了接种有黄孢原毛平革菌的堆肥浸出液中过氧化物酶的活性，建立了加入过氧化氢后电流变化斜率与酶活之间的线性关系。

考察了LiP和MnP的测定反应条件，发现在还原电位+0.06V下，在酒石酸缓冲溶液pH值范围为3～5，对苯二酚浓度为0.2～0.6mM和过氧化氢浓度为0.05～0.3mM时，电流对酶活的响应比较显著。最佳条件是在酒石酸缓冲溶液(pH 4.2)中，对苯二酚浓度为0.25mM时，加入0.19mM过氧化氢，通过电流变化斜率测定LiP和MnP的酶活。将本测定方法运用到堆肥处理当中，可以简便、高效地获得目的信息。

把用分光光度法测定的具有不同LiP活性的黄孢原毛平革菌培养所得的粗酶液放进电化学元件中。其中底物对苯二酚浓度为0.25mM，过氧化氢浓度为0.125mM，LiP的活性分别为a)0，b)0.65U/L，c)6.67U/L和d)30.86U/L，还原电位为+0.1V，采用计时电流法，如图2所示。由图可见，我们可以使用电流变化的斜率(Δ_电流/Δ_时间)作为木质素降解酶活性的指标。

采用计时电流法测定一系列不同酶活的粗酶液中LiP和MnP的总酶活，在最佳条件缓冲溶液为酒石酸缓冲液(pH 4.2)，还原电位为+0.06V，对苯二酚浓度(0.25mM)时，加入过氧化氢浓度(0.19mM)。总酶活与加入过氧化氢后电流变化斜率呈线性关系的范围为LiP为2.27～29.79U/L，MnP为0.085～1.37U/L，回归方程：

V＝8.82×10^-3(X+20.61Y)-0.07

其中，V为斜率(μAs^-1)，X为LiP酶活(U/L)、Y为MnP酶活(U/L)，(X+20.61Y)为总酶活(U/L)，相关系数为0.9825，见图3。

具体实施方式：

1、玻碳电极的预处理

用0.5μm Al₂O₃粉末进行抛光至电极表面光洁，然后用水冲洗电极表面，再依次用1∶1的HNO₃、丙酮、水超声波清洗、最后再用水冲洗，自然晾干即可。

2、菌种培养

将黄孢原毛平革菌接种至PDA培养基，在37℃条件下静置培养4天用于菌的扩增。将其孢子接种至Kirk液体培养基，在37℃下以120r/min的速率振荡培养8天，过滤得粗酶液。

PDA培养基组成：土豆40克，琼脂4g，葡萄糖4g，水200ml。

Kirk液体培养基组成：葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.2g/L，吐温80 1g/L，苯甲醇0.54g/L，KH₂PO₄2.56g/L，MgSO₄0.71g/L，VB1 0.001g/L，邻苯二甲酸缓冲液10mmol/L，微量元素液70ml/L；最终pH 4.5。

其中微量元素液(g/L)：氨基乙酸0.6，MnSO₄·H₂O 0.5，NaCl 1，Fe SO₄·7H₂O 0.1，CoSO₄·7H₂O 0.22，CaCl₂·2H₂O 1.56，Zn SO₄·7H₂O 0.1，CuSO₄·5H₂O 0.1，AlK(SO₄)₂·12H₂O 0.01，HBO₃0.01，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01。

3、堆肥条件

A、B、C、D共4个好氧堆肥罐，堆料组成如下，其中土壤为岳麓山东侧表层以下1m处，具体堆料组成见如下：

编号	堆料组成
编号	堆料组成	ABCD	土壤600g，稻草180g，食堂残余物300g，麸皮100g，含水率75％，接种黄孢原毛平革菌质量比为0.8％。土壤600g，稻草180g，食堂残余物300g，麸皮100g，含水率75％，投加了Pb(NO₃)₂80mg/kg。土壤600g，稻草180g，食堂残余物300g，麸皮100g，含水率75％，投加了Pb(NO₃)₂80mg/kg，接种黄孢原毛平革菌质量比为0.8％。土壤600g。

A、B、C环境温度保持在30℃(水浴恒温)，通风量为0.033m³/h，发酵40天；D置于自然通风处，静置40天。

4、堆肥浸出液制备

取A、B、C、D样各10g置于4个锥形瓶中，各加入一定体积蒸馏水，在37℃下振荡120min，速度200r/min，过滤后将滤液离心5min，10000r/min，上清液过滤即得到堆肥浸出液。

5、酶活测定

采用计时电流的方法，以玻碳电极为基底电极，在酒石酸缓冲溶液4mL(pH4.2)和浸出液4mL的混合溶液中，还原电位为+0.06V，对苯二酚浓度为0.25mM时，加入过氧化氢浓度为0.19mM的电流变化斜率测定A、B、C和D四个好氧堆肥罐中以不同浸取比例浸取的堆肥浸出液中LiP和MnP的总酶活(见下表)。由表可见，本发明所采用的电化学测定结果与浸取比例呈线性关系。

堆肥浸出液	浸取比例(g∶mL堆肥∶水)	计时电流法测定的总酶活(U/L)
堆肥浸出液	浸取比例(g∶mL堆肥∶水)	计时电流法测定的总酶活(U/L)	AAAAAABCD	1∶101∶121∶141∶161∶181∶201∶101∶101∶10	54.0944.9737.9833.0529.2527.1419.0223.6115.43

由于本实验中黄孢原毛平革菌的培养条件有限，产生的LiP和MnP的活性不高，故而所建立的回归模型的酶活线性范围受到限制，在大规模的黄孢原毛平革菌的培养和堆肥实验中，该线性范围应该有所扩展。

从上述测定结果和图4的两种方法比较的结果可以清楚地看出，本方法不仅测定结果与分光光度法非常相近而且操作快速、简便，灵敏度高，选择性好，解决了复杂系统中酶活测定的灵敏度以及浊度和光干扰物质的干扰问题，使本方法可以成为在城市生活垃圾堆肥控制系统中一套快速、低成本的堆肥腐熟度检测技术。

Claims

1、一种堆肥中过氧化物酶活性的电化学测定方法，测定在接有三电极的电解池中进行，其特征在于本方法以玻碳电极为基底电极，以过氧化氢、对苯二酚为底物，用计时电流法测定堆肥浸出液中加入过氧化氢后电流变化斜率，用线性回归方程计算木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的总酶活，测定条件为：

还原电位 +0.06V

酒石酸缓冲溶液 pH 4.2

对苯二酚浓度 0.25mM

过氧化氢浓度 0.19mM，

总酶活性与电流变化斜率关系的三维线性回归方程为：

V＝8.82×10^-3(X+20.61Y)-0.07

V为斜率(μAs^-1)

其中木素过氧化物酶活范围为2.27～29.79U/L；

锰过氧化物酶活范围为0.085～1.37U/L。