JPH09512041A - 化学発光検出に有用な新規なアリール ｎ−アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体 - Google Patents
化学発光検出に有用な新規なアリール ｎ−アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体Info
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Abstract
(57)【要約】
化学発光を生じるアリール N アルキルアクリダンチオカルボキシレート化合物。該化合物は過酸化物およびペルオキダーセで発光する。該化合物は種々の試料物質に関するアッセイにおいて基体として使用する。
Description
【発明の詳細な説明】
化学発光検出に有用な新規なアリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレ
ート誘導体
技術分野
本発明は、過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によりアクリダンが発光
（化学発光）する、化学発光性N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導
体に関する。本出願は、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素なとのオキシダント
と、ある種のアリール N-アルキルアクリダンカルボキシレートチオエステルと
の作用により、化学的に発光（化学ルミネセンス）させるための改良された方法
に関する。本出願はまた、特定の物質を用いて前記方法による化学発光の発光量
を増大させるための改良された方法に関する。本出願はまた、前記方法を用いた
ペルオキシダーゼの検出に関する。本出願はまた、前記方法を用いた過酸化水素
の検出に関する。本出願はまた、前記方法を用いた様々な生体分子の検出および
定量に関する。たとえば、この方法は、イムノアッセイの技術によるハプテン、
抗原、抗体の検出、ウェスタンブロッティングによるタンパク質の検出、サザン
ブロッティングおよびノーザンブロッティングによるDNA、RNAの検出に用いるこ
とができる。さらに、この方法は、DNAの配列決定におけるDNA検出に用いること
ができる。さらに、この方法は、従来知られているように、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼなど
、過酸化水素を生成する酵素の検出に用いることができる。
背景技術
生体分子を感度よく検出および定量する方法としては、これまで特定分子を放
射性同位元素で標識する方法が使われてきた。最近になって、放射性物質の持つ
危険性やその取り扱いの難しさを解消するため、放射性物質を使わない技術が数
多く開発されてきている。試料物質を酵素と結合させ、その触媒作用による基質
の反応を測定する方法を使えば、増幅した形で反応が観測されるため、最も高感
度で検出を行うことができる。そのため、着色光、蛍光、化学発光を発生する基
質が作られるようになり、特に化学発光による高感度の検出が可能となってきて
いる。
測定の感度がさらに向上すれば、微量物質の検出が可能となり、また測定に必
が要な時間や試薬の量が削減できるため、化学発光の用途は一層広がる。このよ
うな酵素を用いた化学発光アッセイの検出速度および感度を向上させるためには
、たとえば基質としてより発光効率が高い物質、または長時間発光可能な物質を
選ぶ必要がある。
イムノアッセイ、オリゴヌクレオチドの検出、およびハイブリッド核酸の作成
などの酵素結合法を用いた検出に使われる酵素としては、これまでホースラディ
ッシュペルオキシダーゼが最も一般的だった。従来知られている化学発光用の試
薬では、分析時の感度の限界などにより、この酵素の特性を最大限に活かすこと
ができなかった。ペルオキシダーゼ抱合体(conjgate)を用いて超高感度の検出を
行うには、より微量な酵素の検出ができる試薬が要求される。具体的には、バッ
クグラウンドの発光レベルや分析に不要な領域の発光レベルを上げることなく、
特定領域において高い発光レベルを持つような試薬が必要である。このためには
、従来よりも最大光度を上げるか、または発光持続時間を長くする必要がある。
a．アクリダンの酸化
過酸化ベンゾイル水溶液中でのアクリダンの酸化では、発光効率は非常に低く
(φcL=3×10-7)、しかもアクリシンなどの副生成物が生ずる（S．Steenken，Pho
tochem．Photobiol.，11，279-283(1970)）。N-メチルアクリダンは電気化学的
に酸化されてN-メチルアクリジニウムとなる（P．Hapiot，J．Moiroux，J．M．S
aveant，J．Am．Chem．Soc.，112(4)，1337-43(1990); N．W．Koper，S．A．Jon
ker，J．W.Verhoeven，Recl．Trav．Chim．Pays-Bas，104(11)，296-302(1985)
）。N-アルキルアクリダン化合物の化学的酸化は、ヘキサシアノ鉄（ ）酸イオ
ン（A.Sinha,T．C．Bruice，J．Am．Chem．Soc.，106(23)，7291 2(1984)）、あ
る種のキノン類（A．K．Colter，P．Plank，J．P．Bergsma，R．
Lahti，A．A．Quesnel，A．G．Parsons，Can．J．Chem.，62(9)，1780-4(1984)
）、亜硝酸リチウム（O．N．Chupakhin，I．M．Sosonkin，A．I．Matern，G．N
．Strogov，Dokl．Akad．Nauk SSSR，250(4)，875-7（1980））によって行われ
てきた。N-アルキルアクリダン誘導体の酸化は、コオキシダントとなるフラビン
化合物の存在下または非存在下で、電気化学的に行われてきた（W．R．Knappe，
J．Pharm．Sci.，67(3)，318-20(1978); G．A．Digenis，S．Shakshir，M．A．M
iyamoto，H．B．Kostenbauer，J．Pharm．Sci.，65(2)，247-51（1976））。
10-メチルアクリダン-9-カルボン酸のアリールおよびアルキルエステルは、強
塩基性の双極中性溶媒中で自動酸化されてN-メチルアクリドンとなり、化学発光
を起こす（F．McCapra，Accts．Chem．Res.，9(6)，201-8(1976); F．McCapra，
M．Roth，D．Hysert，K．A．Zaklika in Chemiluminescence and Bioluminescen
ce，Pienum Press，New York，1973，pp．313-321; F．McCapra，Prog．Org．Ch
em.，8，231-277(1971); F．McCapra，Pure Appl．Chem.，24，611-629(1970);
U.S．Patent No．5,283,334 and 5,284,951 to McCapra，and 5,284,952 to Rem
akrishnam）。化学発光の量子収量は、10-5から0.1の範囲で、脱離するフェノー
ルまたはアルコールのpKaが低下するのにしたがって増大することが分かってい
る。また、水溶液中では、中間生成物が発光を伴わない競合反応により分解する
ため、量子収量が有意に低下した。カチオン界面活性剤（CTAB）を添加すると、
この競合反応が抑制されるため、見かけの光収量は130倍に増大した。
本出願人による同時係属出願となる1993年5月17日出願のNo.08 061,810及び19
94年3月2日出願のNo.08 205,093では、酵素を用いてN-アルキルアクリダンカル
ボン酸誘導体およびその置換体を酸化することにより、化学発光を起こさせる方
法が初めて開示されている。ペルオキシダーゼおよび過酸化物の存在下で、N-ア
ルキルアクリダンカルボン酸誘導体は効率的に酸化されてN-アルキルアクリドン
となるとともに、化学発光による青色光を生ずる。
b．アクリジニウムエステルの酸化による化学発光
N-アルキルアクリジニウムカルボン酸の脂肪族および芳香族エステルをアルカ
リ性溶液中でH2O2により酸化することにより発光させる反応はよく知られている
。この場合の化学発光の量子収量は0.1と高いため、生体分子に結合する反応基
を持った誘導体を開発することができるようになり、アクリジニウムエステルを
標識とした化学発光によるイムノアッセイやオリゴヌクレオチトプローブアッセ
イが多数報告されるようになり、特に前記U.S.Patent No.5,284,951及び5,284,9
52に記載されている。
アクリジニウムエステル(AE's)を使用する場合、特にタンパク質やオリゴヌク
レオチドを標識する場合には、2つ問題がある。まず第1に、加水分解の安定性が
低いことである。アクリジニウムエステル抱合体は、室温またはそれよりやや高
い温度で、徐々に分解が進行する。長期間保存するには、脱離基の性質にもよる
が、-20℃に保つことが必要となる。
アクリジニウムエステルの第2の問題は、水などのような求核性試薬を9-部位
に付加することによって自発的に擬似塩基性の中間物を生成し、これがpH値によ
っては発光を伴わずに分解反応を起こすことである。したがって実際に反応させ
る際には、アクリジニウムエステルを含む溶液のpHを、はじめは擬似塩基の生成
を防ぐため低く保ち、H2O2添加後は発光を起こさせるため高くする必要がある。
N-アルキルアクリジニウムカルボン酸のアミド、チオエステル、スルホンアミ
ドも、同様の条件で酸化されることにより、発光することが分かっている（T．K
inkel，H．Lubbers，E．Schmidt，P．Molz，H．J．Skripczyk，J．Biolumin．Ch
emilumin.，4．136-139，(1989); G．Zomer，J．F．C．Stavenuiter，Anal．Chi
m．Acta，227，11-19(1989)）。しかし、このように脱離基を変えても、貯蔵安
定性はわずかしか向上しない。
アクリジニウムエステルの化学発光を利用して標識を行う際に、より根本的な
問題は、標識分子としてタンパク質やオリゴヌクレオチドに直接結合させると、
多くても10分子程度しか結合できないということにある。発光時の量子収量（≦
10%）を考えると、アクリジニウムエステルで標識した試料物質は、多くても光
子1個分の光しか生じないことになる。これに対し、試料物質を酵素で標識し、
その発光反応を検出するようにすれば、酵素の持つ触媒作用の結果、試料物質1
分子当たりの発光量は数桁も高くすることができる。
イムノアッセイにおいて試料物質になるべく多くのアクリジニウムエステル分
子を結合させるため、不特定の数のアクリジニウムエステルを含むリポソームと
抗体との抱合体を作成する方法が採られている（S．J．Law，T．Miller，U．Pir
an，C．Klukas，S．Chang，J．Unger，J．Biolumin．Chemiluim.，4，88-98,（1
989））。この方法では、アクリジニウムエステルの直接標識による方法と比べ
、シグナルはわずかしか増大しない。
c．ホースラディッシュペルオキシダーゼの化学発光検出
ルミノール、イソルミノールなと、アミノ基で置換した環状アシルヒドラジド
は、H2O2および（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、HRPのような）ペルオ
キシダーゼと塩基性環境でと反応して発光する。この反応は、H2O2およびペルオ
キシダーゼの基本的な検出法として使われてきた。さらにその発展として、ルミ
ノール様物質（8-アミノ-5-クロロ-7-フェニルピリド[3,4-d]ピリダジン-1,4(2H
,3H)ジオン）を使ったHRPによる化学発光アッセイが行われてきた（M．li，H．Y
oshida，Y．Aramaki，H．Masuya，T．Hada，M．Terada，M．Hatanaka，Y．Ichim
ori，Biochem．Biophys．Res．Comm.，193(2)，540-5（1993））。この化合物を
イムノアッセイに利用すると、ルミノールを使った場合と比べ、検出能力が2倍
になった。ペルオキシダーゼと過酸化物によって酸化されて発光する化合物とし
ては、他にヒドロキシ基で置換したフタルヒドラジドがある（Akhavan-Tafti，U
.S．Patent Application No．965,231，1992年10月23日出願）。本出願の原出願
となるNo.08 061,810及びNo.08 205,093では、過酸化物およびペルオキシダーゼ
と反応して発光する化学発光性N-アルキルアクリダンカルボン酸のエステルおよ
びスルホンイミドを用いて、ペルオキシダーゼの検出および各種アッセイを行う
方法が開示されている。
ルミノールによる発光の光度および持続時間を向上させる手段として、様々な
強化剤が用いられている。たとえは、D-ルシフェリンのようなベンゾチアゾール
誘導体、p-ヨードフェノールやp-フェニルフェノールを含む種々のフェノール化
合物、芳香族アミンなどである（G．Thorpe，L．Kricka，in Bioluminescence a
nd Chemiluminescence，New Perspectives，J．Scholmerich，et al.，Eds.，
pp．199-208(1987)）。ここでは、フェノール化合物とは、上記のヒドロキシフ
ェノール化合物の置換体の他、2-ナフトール、6-ブロモ-2-ナフトールなど、ペ
ルオキシダーゼによる反応を促進することが知られている化合物を含めた、ヒド
ロキシル基を持つ芳香族化合物を総称するものとする。アミノ基で置換された環
状アシルヒドラジドのペルオキシダーゼによる酸化発光を促進する物質としては
、この他に4-(4-ヒドロキシフェニル）チアゾール（M．li，H．Yoshida，Y．Ara
maki，H．Masuya，T．Hada，M．Terada，M．Hatanaka，Y．Ichimori，Biochem．
Biophys．Res．Conm.，193(2)，540-5（1993））、U.S．patent No.5,171,668(S
ugiyama)で開示された一群の化合物、2-ヒドロキシ-9 フルオレノン、U.S．Pate
nt No.5,206,149（Oyama）で開示された一群のヒドロキシ化ベンゾキサゾール誘
導体などがある。環状アシルヒドラジドが過酸化物およびペルオキシダーゼによ
って酸化される機構は極めて複雑で、議論が大きく分れている（A．Lundin，L．
Hallander，in Bioluminescence and Chemiluminescence，New Perspectives，J
．Scholmerich，et al.，Eds.，pp．555-558(1987); S．Vlasenko，A．Arefyev
，A．Klimov，B．Kim，E．Gorovits，A．Osipov，E．Gavrilova，A．Yegorov，J
．Biolumin．Chemilumin.，4，164-176(1989)）。そのため、ペルオキシダーゼ
の触媒作用を利用した発光反応を新たに開発することが困難となっている。
d．HRPによるアッセイ
ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ルミノールやイソルミノールを基質
とした化学発光の検出による酵素イムノアッセイやDNA ハイブリッド形成アッセ
イに広く使われるようになっている（G．H．Thorpe，L．J．Kricka，S．B．Mose
ly，T．P．Whitehead，Clin．Chem.，31，1335(1985); J．A．Matthews，A．Bat
ki，C．Hynds，L．J．Kricka，Anal．Biochem.，151，205(1985); P．Walsh，J
．Varlaro，R．Reynolds，Nuc．Acids Res．20(19)，5061-5065(1992)）。HRPの
抱合によってルミノールの化学発光を強化させるためのキットも市販されている
。ペルオキシダーゼによる従来の化学発光アッセイでは、極微量の酵素を検出す
ることができないため、甲状腺ホルモンTSHなどの試料物質に対し
ては、極微量の検出が不可能だった。このため、より微量の酵素でも検出可能な
化学発光試薬が要求されている。
e．界面活性剤による化学発光の強化
高分子または低分子の界面活性剤により発光反応を促進する方法が従来より知
られている。これは、発光体の光量子収量を増大させる、励起状態で生成される
目的分子の比率を上げる、競合する副反応を抑制することによって化学発光に関
与する分子の比率を上げる（McCapra，Accts．Chem．Res，9(6)，201-8（1976）
）、または触媒として働く酵素の活性を高める、などの方法により、いずれか一
つまたは二つ以上の反応段階を操作することによって行われている。高分子また
は低分子の界面活性剤が発光反応に与える影響については、明確な、あるいは一
致したパターンがあるわけではない。したがって、ある特定の反応において、界
面活性剤が化学発光を強化するのかどうか、もしするならば、どの界面活性剤が
そうなのかというようなことは、実験事実の積み重ねによる以外には予測が不可
能である。
U.S．Patent No.5,145,772（Voyta）では、高分子化合物の存在下で酵素によ
る1,2-ジオキセタンの化学発光を強化する方法が開示されている。ここでは、あ
る種のカチオン性高分子化合物は化学発光の強化に有効であり、非イオン性高分
子化合物は概して効果がなく、アニオン性高分子化合物の中では、例45に示すも
のが唯一発光量を有意に低下させたと述べられている。
U.S．Patent No.4,927,769（Chang）では、過酸化水素を用いて、アルカリ性
環境で界面活性剤によるアクリジニウムエステルの化学的酸化を促進する方法が
開示されている。ここに記載されているアクリジニウムエステル化合物は、その
反応が酵素の使用を伴なわないで反応するという点で、本発明のアクリダン化合
物とは異なる。実験で使った界面活性剤（該文献の表2参照）の中では、いくつ
かにおいてわずかな反応促進効果が見られたに過ぎないことが述べられている。
ホタルルシフェリンルシフェラーゼ反応に対する界面活性剤の影響に関する研
究（L．J．Kricka，M．DeLuca，Arch．Biochem．Biophys.，217，674（1983））
によると、非イオン界面活性剤による酵素活性の変化の結果として光収量が増大
したとされている。また、カチオン界面活性剤の場合は、酵素阻害効果により、
発光が完全に消失したという。
また、ある研究（T．Goto，H．Fukatsu，Tetrahedron．Lett.，4299(1969)）
によると、ウミホタルルシフェリンの化学的酸化による発光において、発光体か
らの蛍光の量子収量は、カチオン、アニオンおよび非イオン界面活性剤のいずれ
を使った場合でも増大するが、非イオンおよびカチオン界面活性剤が化学発光を
強化するのに対し、アニオン界面活性剤は強化しないことが明らかにされている
。
さらに、別の研究（K．Sasamoto，Y．Ohkura，Chem．Pharm．Bull.，39(2),41
1-6(1991)）では、環状ジアシルヒドラジドのジアルキルアミノベンゾフラニル
化物の化学的酸化による発光が、カチオン界面活性剤によって強化されることが
を報告されている。また、アニオン界面活性剤は発光を強化しなかったが、非イ
オン界面活性剤は発光を低下させたという。
発明の開示
以上に述べたことから、本発明の目的は、ペルオキシダーゼの作用によって化
学発光を生じさせることにより、生体物質および化合物を検出する上で優れた性
質を持ったアリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体を提供
し、さらにそのため改良された方法を提供することである。また、本発明の別の
目的は、溶液中または膜上におけるアリール N-アルキルアクリダンチオカルボ
キシレート誘導体を使って、ペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生じさ
せることにより、ペルオキシダーゼおよび酵素抱合体を検出するための改良され
た方法およびキットを提供することである。さらに、本発明の別の目的は、アリ
ール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体を使って、ペルオキシ
ダーゼの作用によって化学発光を生じさせることにより、溶液中および表面上で
の核酸アッセイを行うための改良された方法およびキットを提供することである
。さらに、本発明の別の目的は、アリール N-アルキルアクリダンチオカルボキ
シレート誘導体を使って、ペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生じさせ
ることにより、ウェスタンブロッティングでタンパク質を、サザンブロッティン
グやそ
の他のDNA ハイブリッド形成アッセイでDNAを検出するための改良された方法お
よびキットを提供することである。さらに、本発明の別の目的は、アリール N-
アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体を使って、ペルオキシダーゼの
作用によって化学発光を生じさせることにより、酵素イムノアッセイでハプテン
、タンパク質および抗体を検出するための改良された方法およびキットを提供す
ることである。
図面の簡単な説明
図1は、本発明によるフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート
（5a）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチルアクリダン-9-カルボ
キシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10-メチルアクリダン-9
-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグラフである。3試薬は
、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反応させた。3試薬の組成
はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5aを含むpH8.0、0.01Mのトリス緩衝
液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025%のTWEEN20、1mM
のEDTA、(2)前記の5aの代わりにフェニル 10-メチルアクリダン-9-カルボキシレ
ートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5aの代わりにエチル 10-メチル
アクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組成の試薬とした。図か
ら分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、他の試薬と比較して、
相対光量単位（RLU）における発光量が大きい。
図2は、本発明による4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカ
ルボキシレート（5b）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチルアクリ
ダン-9-カルボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10-メチ
ルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグラフ
である。3試薬は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反応させ
た。3試薬の組成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5bを含むpH8.0、0.0
1Mのトリス緩衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025%
のTWEEN20、1mMのEDTA、(2)前記の5bの代わりにフェニル 10-メチルアクリダン-
9-カルボキシレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5bの代わりにエ
チル
10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組成の試薬とし
た。図2から分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、他の試薬と
比較して、発光量が大きい。
図3は、本発明による4'-フルオロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカル
ボキシレート（5d）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチルアクリダ
ン-9-カルボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10-メチル
アクリダン-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグラフで
ある。3試薬は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反応させた
。3試薬の組成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5dを含むpH8.0、0.01M
のトリス緩衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025%の
TWEEN20、1mMのEDTA、(2)前記の5dの代わりにフェニル 10-メチルアクリダン-9-
カルボキシレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5dの代わりにエチ
ル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組成の試薬
とした。図3から分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、他の試
薬と比較して、発光量が大きい。
図4は、本発明による4'-トリフルオロメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9
-チオカルボキシレート（5e）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチ
ルアクリダン-9-カルボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル
10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較した
グラフである。3試薬は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反
応させた。3試薬の組成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5eを含むpH8.
0、0.01Mのトリス緩衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、
0.025%のTWEEN20、1mMのEDTA、(2)前記の5eの代わりにフェニル 10-メチルアク
リダン-9-カルボキシレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5eの代わ
りにエチル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組
成の試薬とした。図4から分かるように、本発明による試薬は、この条件下では
、他の試薬と比較して、発光量が大きい。
図5は、本発明による4'-メトキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカル
ボキシレート（5f）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチルアクリダ
ン-
9-カルボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10-メチルアク
リダン-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグラフである
。3試薬は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP 水溶液1μLと反応させた。3
試薬の組成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5fを含むpH8.0、0.01Mの
トリス緩衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025%のTW
EEN20、1mMのEDTA、(2)前記の5fの代わりにフェニル 10-メチルアクリダン-9-カ
ルボキシレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5fの代わりにエチル
10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組成の試薬とし
た。図5から分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、他の試薬と
比較して、発光量が大きい。
図6は、本発明による2',6'-ジクロロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカ
ルボキシレート（5g）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチルアクリ
ダン-9-カルボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10-メチ
ルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグラフ
である。3試薬は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反応させ
た。3試薬の組成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5gを含むpH8.0、0.0
1Mのトリス緩衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025%
のTWEEN20、1mMのEDTA、(2)前記の5gの代わりにフェニル 10-メチルアクリダン-
9-カルボキシレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5ｇの代わりにエ
チル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキンレートを含む以外は同し組成の試
薬とした。図6から分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、他の
試薬と比較して、発光量が大きい。
図7は、本発明による2-ナフチル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレー
ト（5h）を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチルアクリダン-9-カル
ボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10-メチルアクリダン
-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグラフである。3試薬
は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反応させた。3試薬の組
成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5hを含むpH8.0、0.01Mのトリス緩
衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025%のTWEEN20、
1mMのEDTA、(2)前記の5hの代わりにフェニル 10-メチルアクリダン-9-カルボキ
シレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5hの代わりにエチル 10-メ
チルアタリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組成の試薬とした。
図7から分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、他の試薬と比較
して、発光量が大きい。
図8は、本発明による4'-フルオロフェニル 3-メトキシ-10-メチルアクリダン-
9-チオカルボキノレート(5j)を含む試薬、アクリダンとしてフェニル 10-メチル
アクリダン-9-カルボキシレートを含む試薬、およびアクリダンとしてエチル 10
-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む試薬の発光特性を比較したグ
ラフである。3試薬は、別々に、各40μLを1.4×10-16molのHRP水溶液1μLと反応
させた。3試薬の組成はそれぞれ、(1)0.05mMのアクリダン化合物5jを含むpH8.0
、0.01Mのトリス緩衝液、0.4mMの過酸化尿素、0.1mMのp-フェニルフェノール、0
.025%のTWEEN20、1mMのEDTA、(2)前記の5jの代わりにフェニル 10-メチルアクリ
ダン-9-カルボキシレートを含む以外はまったく同じ組成の試薬、(3)5jの代わり
にエチル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外は同じ組成
の試薬とした。図8から分かるように、この条件下では、本発明による試薬は、
他の試薬と比較して、発光量が大きい。
図9は、本発明による試薬とルミノールを含む市販の最適試薬のHRP検出におけ
る直線性を比較したグラフである。アクリダン5aを含む試薬および市販の試薬（
AMERSHAM ECL）各40μLを、別々に、所定量の酵素を含むHRP試料1Lと室温で混合
した。アクリダン5aを含む試薬については15分後のデータを、一方ECL試薬につ
いては最大光度を測定した。図中のS-Bとは、HRP存在下でのRLUにおける化学発
光シグナル(S)を、HRP不存在下でのバックグラウンドの化学発光(B)に対して補
正したものである。アクリダン5aを含む試薬の場合、ECL試薬と比べて検出感度
が100倍であった。
図10は、本発明による試薬とルミノールを含む市販の最適試薬のHRP検出にお
ける直線性を比較したグラフである。アクリダン5dを含む試薬および市販の試薬
(AMERSHAM ECL)各40μLを、別々に、所定量の酵素を含むHRP試料1Lと室温で混合
した。アクリダン5dを含む試薬については15分後のデータを、一方ECL試薬につ
い
ては最大光度を測定した。図中のS-Bの意味は図9と同様である。アクリダン5dを
含む試薬の場合、ECL試薬と比べて検出感度が100倍であった。
図11は、本発明による試薬とルミノールを含む市販の最適試薬のHRP検出にお
ける直線性を比較したグラフである。アクリダン5eを含む試薬および市販の試薬
(AMERSHAM ECL)各40μLを、別々に、所定量の酵素を含むHRP試料ILと室温で混合
した。アクリダン5eを含む試薬については15分後のデータを、一方ECL試薬につ
いては最大光度を測定した。図中のS-Bの意味は図9と同様である。アクリダン5e
を含む試薬の場合、ECL試薬と比べて検出感度が100倍であった。
図12は、本発明による試薬とルミノールを含む市販の最適試薬のHRP検出にお
ける直線性を比較したグラフである。アクリダン5jを含む試薬および市販の試薬
(AMERSHAM ECL)各40μLを、別々に、所定量の酵素を含むHRP試料1Lと室温で混合
した。アクリダン5jを含む試薬については15分後のデータを、一方ECL試薬につ
いては最大光度を測定した。図中のS-Bの意味は図9と同様である。アクリダン5j
を含む試薬の場合、ECL試薬と比べて検出感度が100倍であった。
図13は、分画したヤギ抗ヒトトランスフェリン血清・ウサギ抗ヤギIgGペルオ
キシダーゼ抱合体を（conjugate）用いた、化学発光検出によるPVDF上でのヒト
トランスフェリンのウェスタンブロッティングの実験結果である。ヒトランスフ
ェリンは、5つのスロットにそれぞれ、(1)1000pg、(2)200pg、(3)50pg、(4)20pg
、(5)5pgを加えた。化学発光の検出は、Aはルミノール(ECL)を含む市販の試薬、
Bはアクリダンとして本出願の原出願となるNo.08 061,810で開示された4'-ヒド
ロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-カルボキシレートを含む試薬、Cはアク
リダンとして本発明の5aを含む試薬であって、この3種類の試薬を用いて行った
。ブロットは14分間インキュベートした後、X-OMAT AR X 線フィルムに15秒間暴
露した。画像はスキャンしてデジタル信号処理により再生した。本発明によるア
クリダン5aで最も優れた結果が得られた。
図14は、フルオレセインで標識したv-mosプローブとホースラディッシュペル
オキシダーゼ・抗フルオレセイン抱合体並びにアクリダンとして5aを含む本発明
による試薬を使用して、化学発光検出により、ナイロン上でEcoRI制限マウスゲ
ノムDNAのサザンブロッティングを行った結果を示したものである。ブロットは9
分間
インキュベートした後、X-OMAT AR X 線フィルムに10分間暴露した。画像はスキ
ャンしてデジタル信号処理により再生した。その結果、本発明の検出試薬を用い
ることにより、ブロットの両方のトラックにおいて、シングル複製の遺伝子の画
像を得た。
発明を実施するための最良の形態
化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基
、Yは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発
光（化学発光）させる脱離基（leaving group）である）で表されるアクリダン
は、本出願人による同時係属出願となるU.S.Patent No.08 061,810及び08 205,0
93で開示されている。しかし、アリールチオエステルの誘導体（化学式(I)にお
いてY=S・Ar）など、ある種のアクリダン誘導体が、より優れた化学発光特性を持
つことが分かってきた。
本発明は、
化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される
基、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを
発光させる置換及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビ
フェニル基）並びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサ
ンテニル基）から成る群より選択される基である）で表される改良したアクリダ
ンに関する。
本発明は、ペルオキシダーゼの存在下で発光する試薬組成物に関するものであ
って、
a) 化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Arは過酸化
物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発光させる置換
及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビフェニル基）並
びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサンテニル基）か
ら成る群より選択される基である）で表されるアクリダンと、
b) 場合により、該アクリダンからの発光を強化するフェノール化合物と、
c) 該アクリダンと該ペルオキシダーゼとの反応に関わる過酸化化合物と、
d) 該試薬組成物への該ペルオキシダーゼ添加の前に該過酸化化合物が反応す
るのを防ぐキレート剤と、
e) 界面活性剤と、
を含むことを特徴とする試薬組成物に関する。
本発明は、化学発光を発生させるための改良された方法に関するものであって
、化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基
、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発
光させる置換及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビフ
ェニル基）並びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサン
テニル基）から成る群より選択される基である）で表されるアクリダンを、過酸
化化合物およびペルオキシダーゼと反応させることを含むことを特徴とする方法
に関する。
本発明はまた、ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼと結合したもしくは
結合可能な試料物質を、化学発光反応によってアッセイ法で検出するための、改
良された方法に関するものであって、化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基
、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発
光させる置換及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビフ
ェニル基）並びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサン
テニル基）から成る群より選択される基である）で表されるアクリダンを、過酸
化物およびペルオキシダーゼとの反応によって発光させることにより、該試料物
質を検出することを含むことを特徴とする方法に関する。
本発明はまた、ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼと結合したもしくは
結合可能な試料物質を、化学発光反応によってアッセイ法で検出するための、改
良された方法に関するものであって、
a) 化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基
、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発
光させる置換及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビフ
ェニル基）並びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサン
テニル基）から成る群より選択される基である）で表されるアクリダンと、
該アクリダンと該ペルオキシダーゼとの反応に関わる過酸化化合物と、
該アクリダンからの発光を強化するフェノール化合物などの強化物質と、
該試薬組成物への該ペルオキシダーゼ添加の前に該過酸化化合物が反応するのを
防ぐキレート剤と、
界面活性剤と、
を含むペルオキシダーゼの存在下で発光する試薬組成物を与えることと、
b) 該試料物質検出のため該試薬組成物にペルオキシダーゼを添加して発光さ
せることと、
を含むことを特徴とする方法に関する。
本発明はまた、試料物質を化学発光反応の発光によってアッセイ法で検出する
ためのキットに関するものであって、
a) 化学式、
と、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基
、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発
光させる置換及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビフ
ェニル基）並びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサン
テニル基）から成る群より選択される基である）で表されるアクリダンと、
過酸化物と、
場合により、該アクリダンからの発光を強化するフェノール化合物なとの強化物
質と、
試薬組成物への該ペルオキシダーゼ添加の前に該過酸化化合物が反応するのを防
ぐキレート剤と、
界面活性剤と、
b) 該試薬とペルオキシダーゼとの反応による光をアッセイ法で検出するため
のペルオキシダーゼと、
を、それぞれ独立した容器に含むことを特徴とするキットに関する。
本発明はまた、過酸化水素を化学発光反応によってアッセイ法で検出するため
の改良された方法に関するものであって、化学式、
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される
基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基
、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発
光させる置換及び未置換のアリール基（特に、フェニル基、ナフチル基及びビフ
ェニル基）並びにヘテロアリール基（特に、ピリジル基、キノリル基及びキサン
テニル基）から成る群より選択される基である）で表されるアクリダンを、過酸
化水素およびペルオキシダーゼと反応させることを含むことを特徴とする方法に
関する。
本発明は、以下の少なくともひとつにおいて優れた特性を持つ、改良されたア
リール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体に関する。即ち、発
光持続時間が長い、発光光度が高い、最大発光光度までの立ち上がりが速い、バ
ックグラウンドの発光レベルが低い、シグナル／バックグラウンド比が高い、化
学発光検出試薬の貯蔵安定性が高い、膜上での発光が強い、などである。R基、R1
からR8までの基及びAr基の組み合わせを変えることにより、用途に応じて最適
な性能を有する化合物を選択することができる。
例えば、Ar基がパラ位にフルオロ基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基、
又はメトキシ基で置換したフェニル基を持つアクルダンでは、光度の立ち上がり
が速く、高いピーク光度が得られる。置換基として考えられるものには、アルキ
ル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アリール基、アルコキシル
基、アルコキシアルキル基、ハロゲン原子、カルボニル基、カルボキシル基、カ
ルボキシアミド基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリアルキルアンモニウ
ム基及びニトロ基が含まれる。また、アリール N-アルキルアクリダンチオカル
ボキシレート誘導体を含む化学発光試薬の貯蔵安定性を高めたい場合には、R1か
らR8までの基のうち少なくともひとつをアルキル基、アルコキシ基、アリールオ
キシ基などで置換するとよい。
好適な化合物の例としては、次式
（ここで、Rはアルキル基、アラルキル基又はヘテロアルキル基であり、Xはハロ
ゲン原子、トリハロメチル基、ニトロ基、シアノ基、アンモニウム基、カルボキ
シル基、カルボキシアミド基、アミノ基、置換されたアミノ基、アリール基、ア
ルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基及びヒドロキシ基より選
択される基であり、mは0〜5、nは0〜7の数である）で表される化合物が挙げられ
る。
別の好適な化合物の例としては、次式
（ここで、R、X、m及びnは、上記で定義したとおりであり、R1からR8まではそれぞ
れ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基であり、R1からR8までの少
なくとも1個は、水素原子以外の基である）で表される化合物が挙げられる。よ
り好適な化合物の例としては上記化学式の中で、R1からR8までの少なくとも1個
はアルコキシ基である化合物が挙げられる。
本発明によるアリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体の
うち、ある種のものは、過酸化物およびペルオキシダーゼと反応し、アッセイに
より適した化学発光特性を発揮する。この化学発光は、下記の一般反応式で示さ
れるように、N-アルキルアクリドンまたはその置換体の励起状態から生ずると考
えられる。該反応が進行することが見出されたアリール N-アルキルアクリダン
チオカルボキシレートの誘導体には、置換又は未置換のアリールチオエステル、
特にフェニル及びナフチルチオエステルがある。
本発明は、ペルオキシダーゼ、過酸化化合物、および強化剤の作用によってア
リール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体を酸化することによ
り、化学発光を起こすための方法に関する。本発明はまた、この方法を用いてペ
ルオキシダーゼを高感度で検出するための方法に関する。さらに、本発明は、こ
の方法を用いて、化学的または物理的にこの酵素に結合させた様々な生体分子を
検出および定量するための方法に関する。さらに、本発明は、この方法を用いて
、この酵素に結合可能な様々な生体分子を、例えば、ビオチンで標識した試料や
ストレプタビジン・ペルオキシダーゼ抱合体を使って検出および定量するための
方法に関する。また、フルオレセインと抗フルオレセイン、ジゴキシゲニンと抗
ジゴキシゲニン、相補的配列を持つ核酸同士など、上記以外の親和性の高い一般
的な物質の組を用いて、ペルオキシダーゼを試料物質に結合させることにより、
本発明を適用することもできる。標識された有機分子または生体分子は、得られ
る化学発光の光度から直接定量することができる。この方法は、たとえば、イム
ノアッセイの技術によるハプテン、抗原、抗体の検出、ウェスタンブロッティン
グによるタンパク質の検出、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティン
グによるDNA、RNAの検出に用いることができる。さらに、この方法は、DNAの配
列決定におけるDNA検出に用いることができる。さらに、この方法は、コレステ
ロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸テヒドロ
ゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ガラクトース-6-リン酸デヒドロゲナー
ゼ、アミノ酸オキシダーゼなどの酵素が生成する過酸化水素の検出に用いること
ができる。したがってこの方法は、これら過酸化水素を生成する酵素の検出に用
いることもできる。
本発明による反応は、緩衝液などの溶液中、またはビード、チューブ、マイク
ロウェルプレートもしくは膜などの固体担体の表面上で行うことにより、良好な
結果が得られる。使用できる緩衝液としては、一般的な緩衝液のうち、pHを6〜1
0程度に保つことができるものであればよく、たとえばホスフェート、ボレート
、カーボネート、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、グリシン、トリシ
ン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、ジエタノールアミンなどが挙げられる
。ただし、本発明を適用する際に具体的にどのような条件が適しているかは、
たとえば、イムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング
など、どんな用途に適用するかによって異なる。膜上での分析の場合は、使用す
る膜材料をキットの中に含めることもできる。
アリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体が過酸化物およ
びペルオキシダーゼに酸化されることにより生ずる化学発光は、高感度で検出す
ることができる。化学発光を強化する物質でこの反応を促進すれは、さらに微量
のペルオキシダーゼで化学発光を測定することが可能である。この酵素を分析し
たい生体分子と結合させることにより、その生体分子を高感度で検出することが
できる。
フェノール化合物の置換体のうち、ある種のものを、単独でまたは界面活性剤
とともに反応混合系に加えると、添加されたペルオキシダーゼおよび過酸化物の
存在下で生する化学発光を強化することができる。その結果、光度が増すか、発
光持続時間が伸びるか、またはその両者を併せた効果が得られる。ペルオキシタ
ーゼの関与するその他の反応を促進し、本発明による化学発光を強化することが
分かっているフェノール化合物としては、p-フェニルフェノール、p-ヨードフェ
ノール、p-ブロモフェノール、p-ヒドロキシケイ皮酸、2-ナフトール、6-ブロモ
-2-ナフトールがあるが、これらに限定されるわけではない。また、この他のフ
ェノール化合物および芳香族アミン化合物が本発明の範囲に含まれることは自明
である。そのような化合物には、前記のG．Thorpe，L．Kricka，in Bioluminesc
ence and Chemiluminescence，New Perspectives，J．Scholmerich，et al.，Ed
s.，pp．199-208(1987); M．Ii，H．Yoshida，Y．Aramaki，H．Masuya，T．Hada
，M．Terada，M．Hatanaka，Y．Ichimori，Biochem．Biophys．Res．Comm.，193
(2)，540-5(1993); U.S.Patent Nos．5,171,668，5,206,149などに記載されたホ
タルルシフェリン、6-ヒドロキシベンゾチアゾール、2-シアノ-6-ヒドロキシベ
ンゾチアゾール、4-(4- ヒドロキシフェニル）チアゾール、p-クロロフェノール
、2,4-ジクロロフェノール、2-クロロ-4- フェニルフェノール、1-ブロモ-2-ナ
フトール、1,6-ジブロモ-2-ナフトール、2-ヒドロキシ-9-フルオレノン、6-ヒド
ロキシベンゾキサゾール誘導体、4-ヒドロキシ-3-[3-(4-ヒドロキシフェニル)1-
オキソ-2-プロペニル]-2H-1-ベンゾピラン-2-オンなどがある。
また、PCT GB93 00271に記載されたような、ある種の有機ホウ素化合物は、強化
剤となり得ることも、当業者にとって自明であり、本発明の範囲に含まれる。
ペルオキシダーゼの不存在下で起こる過酸化水素とアリール N-アルキルアク
リダンチオカルボキシレート誘導体からのバックグラウンドの発光反応を抑制す
る添加剤は、本発明の有用性をさらに高めることができる。また、陰イオン、陽
イオン及び非イオンのような、ある種の界面活性剤は、より大きな化学発光のシ
グナルを出し、シグナル／バックグラウンド比を高めることにより、本発明のア
ッセイでのペルオキシダーゼの検出感度を向上させることが分かった。これも、
おそらくアクリダン誘導体の自動酸化による分解速度が低下することにより、ペ
ルオキシダーゼ不存在下でのバックグラウンドの化学発光を最小化するためであ
ると考えられる。
本発明による試薬の好適な成分組成を表1に示す。
本発明は、緩衝液中に
1) フェノール強化剤またはその塩と、
2) 例えば過酸化水素、過酸化尿素、過ホウ酸塩などの過酸化化合物と、
3) 本発明によるアクリダン化合物と、
4) エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、
エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（EGTA）およびこれらの塩など
のキレート剤から成る群より選択することができるカチオン錯化剤と、
5) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などのアニオン界面活性剤または、好まし
く
はポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール
、ポリオキシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル
などの非イオン界面活性剤、またはその池の界面活性剤と、
を含む水溶性緩衝液に関する。
本発明の好適な適用例として、pH6〜8.5の緩衝液中に、終濃度約0.01M〜1×10-6
Mのp-フェニルフェノールなどのフェノール化合物、終濃度約5％〜0.005％（v
v）の非イオン界面活性剤、過酸化水素などの過酸化物源、または、好ましくは
過ホウ酸塩もしくは過酸化尿素、終濃度約1×10-3M〜1×10-5MのEDTAなどのカチ
オン錯化剤を含む水溶液を、本発明によるアクリダン化合物を含む第2の溶液と
混合して終濃度が約0.001M〜1×10-5Mとなるようにし、検出用試薬溶液を調製す
る。この溶液を、溶液中または固体担体上に付着するペルオキシダーゼと接触さ
せる。各成分の最適濃度は、分析毎に個別に決定する必要がある。特に、最大限
の発光光度を得るため、アクリダン化合物と強化剤の濃度は、状況に応じて的確
に決める必要がある。検出反応は、20〜40℃前後の温度範囲で行うことが可能で
ある。室温で行うのが容易であり、かつ良好な結果が得られる。
また、本発明のある種のアクリダンを用いた検出試薬組成物の貯蔵安定性が、
本出願人による同時係属出願となるNo.08 061,810(1993年5月17日出願)及びNo.0
8 205，093(1994年3月2日出願)で開示されたアクリダン化合物よりも、予想外に
向上することが分かった。貯蔵安定性が増すことにより、試薬や費用を削減する
ことができる。この方法にしたがって本発明による検出用試薬を保存すると、ペ
ルオキシダーゼの作用によって生ずる化学発光の光量をより長い期間にわたって
維持することができる。予期に反して、チオエステルの脱離基（leaving group
）を有する本発明の試薬は、アリールエステルの脱離基を有する同様なアクリダ
ンよりも安定性が大きいことが見られた。更に、本発明のアクリダン水溶液の貯
蔵安定性は、前述のU.S.P.No.5,284,951及び5,284,952に記載されたアクリダン
及びアクリジニウムアリールエステルの挙動と実質的に異なる。これらの2特許
に開示されたアクリダンは、有用な貯蔵安定性を得る為にアリールエステル部分
に、2個のオルソ位の電子供与性置換基と、メタ又はパラ位の電子吸引性置換基
との、3個の置換基を必要とする。本発明のアクリダンは、良好な安定性を得る
の
に、オルソ位に如何なる電子供与性置換基をも必要としない。更に、本発明のア
クリダン水溶液の安定性は、溶液からの酸素の除去と、約10℃以下の温度での貯
蔵によって、一層向上させ得る。
本発明によるアリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体お
よび試薬の大きな利点は、発光が良好なためペルオキシダーゼの検出感度が高い
ことと、アリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導体が加水分
解に対して安定であるということである。比較実験の結果、本発明による試薬は
、ルミノールおよび強化剤を含む検出試薬と比較して、HRPの検出限界が100倍高
いことが分かった。アリール N-アルキルアクリダンチオカルボキシレート誘導
体（−SAr）は、また発光能力でアルキルＮ−アルキルアクリダンチオカルボキ
シレート誘導体（−SR）より、予想外に優れている。また別の利点は、ペルオキ
シダーゼ濃度の測定におけるダイナミックレンジ(dynamic range)が広いことで
ある。ある種のアリール N-アルキルアクリダンチオカルボン酸誘導体を用いる
ことによる別の利点は、従来の化合物よりも化学発光の持続時間が長いことであ
る。持続時間が長くなることにより、反応のタイミングを厳密に調整する必要が
なくなるため測定が容易になるたけでなく、フィルムによる検出方法を用いた場
合には検出感度が良くなる。
実施例
例1.アクリダン誘導体の合成
アクリダンカルボン酸誘導体の5a〜5jを反応手順1に示す方法で、相応するア
クリジン-9-カルボン酸から合成した。但し、化合物5bは例外で、その合成は、
実施例3に詳述した。下記の構造で、置換基A及びBは、化学式（II）のR1からR8
までの基に相応する。それ以外の置換基は全て水素原子である。
夫々対応するアクリジン-9-カルボン酸化合物1が、市販品から入手できない場合
には、反応手順2記載の反応順序で製造した。(G.Zomer,J.Stavenuiter,R.Van De
n Berg,E.Jansen，In Luminescence Techniques in Chemical and Biochemical Analysis
,W.Baeyens，D.De Keukeleire,K.Korkidis,eds.,Dekker,New York,505-
化合2a、2i及び2jの一般的合成法
化合物1a、1i、1j(0.2〜0.5g)を、過剰の塩化チオニル(3〜10mL)に懸濁させ、
反応混液を3時間還流した。溶媒を減圧下で溜去して、黄色の固体として、2a、2i、
2jを得、これを直接用いて、化合物3a、3c〜jの製造に使用した。化合3a、3c〜jの一般的合成法
表に示された、相応する化合物1からの誘導体2を用い、これをアルゴン雰囲気
下で塩化メチレンとピリジン(2〜3当量)に溶解した。塩化メチレン中フェノール
(1〜1.5当量)の溶液を滴下した。溶液を室温で一晩中撹拌し、さらに塩化メチレ
ン(100mL)で希釈し、水(3×30mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、濃縮
して生成物を得た。
化合物4a、4c〜jの一般的合成法
化合物3(1〜2mモル)をアルゴン雰囲気下で塩化メチレン(5〜10mL)に溶解し、
メチル トリフルオロメタンスルフォネート(5〜10当量)を加えた。溶液を室温
で一晩中撹拌し、薄い黄色沈殿物を得た。この沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄
し、乾燥して黄色結晶の生成物を得た。
化合物5a、5c、5h及び5jの一般的合成法（方法A）
化合物4(0.2〜0.3mモル)を、無水エタノール(15〜30mL)中に懸濁させ、溶液を
10分間還流して、透明な溶液を得た。過剰の塩化アンモン(10〜50当量)を、溶液
に分割添加し、続いて亜鉛（NH4Cl量と同当量）を添加すると、直ちに溶液が脱
色
された。無色の溶液を30分還流した。冷却した溶液を濾過し、沈殿物をエタノー
ル(3×20mL)で洗浄した。溶液を濃縮し、クリーム状の固体を得、これを塩化メ
チレンに再溶解して、水(3×50mL)で洗浄した。塩化メチレンを蒸発して得た粗
製物をシリカゲルのクロマトグラフにかけ（酢酸エチル／ヘキサン）、純粋な生
成物を白色固体とて得た。化合物5d、5e、5f、5g及び5iの一般的合成法（方法B）
化合物4(0.3〜0.6mモル)を、氷酢酸10mL中に溶解し、黄色溶液を得、亜鉛（10
0当量）を加えると、直ちに溶液が脱色された。室温で5分間撹拌した後、反応混
液の薄膜クロマトグラフによって、無極性物質であることが判った。酢酸をデカ
ントし、固体を塩化メチレンで洗浄した。一緒にした有機溶液を蒸発させ、粗製
の固体を得、これを塩化メチレンに再溶解し、2又は3〜50mLの水で分割洗浄を行
なった。塩化メチレンを蒸発させて得た粗製物をシリカゲルのクロマトグラフ（
20〜30％の酢酸エチル／ヘキサン）にかけ、純品を、白い固体とて得た。
化合物5aから5jまで、及びその中間品を下表の如く製造した。
実施例2．化合物5aの合成
フェニル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3a)．
事実上純粋な生成物を更に減圧下で乾燥した。1H NMR(CDCl3)δ7.48-8.32(m,13H
);13C NMR(CDCl3)δ121.40，124.76，126.79，127.32，129.59，129.93，130.24
，130.57，134.61，142.18，148.54，193 91．フェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート トリフルオロメ タンスルフォネート(4a).
1H NMR(アセトンン-d6)δ5.20(s,3H)，7.61 7.86(m,
5H)，8.20-9.03(m,8H)．フェニル 10-メチルアクリダン-9 チオカルボキシレート(5a).
方法A．1H NMR(C
DCl3)δ3.45(s,3H)，5.08(s,1H)，6.698 7.36(m,13H).13C NMR(CDCl3)δ33.52，
58.28，113.79，121.29，121.41，129.61，129.81，130.58，135.13，143.49，1
50.37，197.17．実施例3．化合物5bの合成 4'-（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）チオフェノール
無水DMF5mL中、4-ヒドロキシチオフェノール(1.0g、7.9ｍモル)と、tert−ブチ
ルジメチルシリルクロリド(1.2g、7.9ｍモル)の溶液に、イミダゾール(1.07g、0.0
15モル)を徐々に加え、溶液を1時間撹拌した。薄層クロマトグラフ（シリカゲル
、30%酢酸エチル／ヘキサン）で、反応の完結を確認した。溶液を25mLの水に注
ぎ、3×25mLのヘキサンで抽出した。ヘキサン溶液を合体し、2×50mLの水で洗浄
、無水Na2SO4で乾燥した。溶液を蒸発して、生成物として油状物質(1.8g)を得た
。1H NMR(CDCl3)δ0.162(s,6H)，0.954(s,9H)，3.35(s,1H)，6.69-6.73(d,2H)，
7.16-7.19(d,2H)．4'-tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニル アクリジン-9-チオカルボキシ レート
アクリジン-9-カルボン酸(1a)(1.45g、6.5ｍモル)を、塩化チオニル(10ml)中に
懸濁させ、該反応混合物を3時間、還流した。溶媒を減圧下で除去し、黄色固体
を得、これを、アルゴン雰囲気下で塩化メチレンとピリジン(4mL)に溶解した。4
'-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)チオフェノール(1.85g、7.6ｍモル)を加え
、溶液を室温で一夜撹拌した。反応混合物を、多量の塩化メチレン(200mL)で希
釈し、水(3×50mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮して粗製物を得
、これをシリカゲル上、20%錯酸エチル／ヘキサンを用いてカラム・クロマトグ
ラフで精製した。1H NMR(CDCl3)δ0.216(s,6H)，0.987(s,9H)，6.85-8.26(m,12H
); 13C NMR(CDCl3)δ-4.37，18.21，25.66，118.17，121.22，121.37，124.80，
127.11，
129.96，130.35，136.15，142.22，148.52，157.59，195.08．4'-tert-ブチルジメチルシリルオキシフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チ オカルボキシレート トリフルオロメタンスルフォネート 及び 4'-ヒドロキ シフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート トリフルオロ メタンスルフォネート
塩化メチレン(15mL)中、4-tert-ブチルジメチルシリルオキシフェニル アク
リジン-9-チオカルボキシレート(1g、2.2ミリモル)の溶液に、アルゴン雰囲気下
でメチルトリフルオロメタンスルフォネート(7.2g、0.04モル)を加えた。反応混
合物を室温で2日間撹拌し、黄色沈殿を得た。沈殿を濾過、乾燥し、黄色結晶を
得たが、これはシリル化した塩と、脱シリル化した塩との混合物(45:55)であっ
た。
4'-tert-ブチルジメチルシリルオキシフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チ
オカルボキシレート トリフルオロメタンスルフォネート 1H NMR(アセトン-d6
)δ0.261(s,6H)，1.003(s,9H)，5.17(s,3H)，7.04-7.07(d,2H)，7.67-7.70(d,2H
)，8.18-9.02(m,8H)；
4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート
トリフルオロメタンスルフォネート 1H NMR(アセトン-d6)δ5.16(s,3H)，6.95-
6.99(d,2H)，7.56-7.59(d,2H)，8.18-9.00(m,8H)，9.12(s,1H)．4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート(5b)
方法A．4'-tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニル 10-メチルアクリジニ
ウム-9-チオカルボキシレート トリフルオロメタンスルフォネートと、4'-ヒド
ロキシフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート トリフル
オロメタンスルフォネートとの混合物(1g)を無水エタノール(75ml)に懸濁させ、
混合物を10分間還流し、溶液とした。塩化アレモン(8.0g、0.149モル)を溶液に少
し宛加え、次に亜鉛(9.5g、0.146モル)を加えた。亜鉛を加えた直後に、溶液の黄
色が、脱色された。無色の溶液を3時間還流した。反応混合物の薄層クロマトグ
ラフにより、2種の無極性物質に完全に転化したことが伴った。溶液を濾過し、
無機性固体をエタノール(3×20ml)で洗浄した。合体した有機性溶液を濃縮し、
固体を得、こ
れを塩化メチレンに再溶解した。塩化メチレンを水(3×50mL)で洗浄し、無水Na2
SO4で乾燥し、濃縮してシリル化した生成物と、脱シリル化した生成物とを得た
。この混合物を分離し、シリカゲル上、30%錯酸エチル／ヘキサンを用い、クロマ
トグラフで精製し、白色固体の生成物を得た。1H NMR(アセトン-d6)δ3.39(s,3H
)，5.17(s,1H)，6.82-7.37(m,12H)，8.73(bs,1H); 13C NMR(アセトン-d6)δ33.0
1，57.57，113.23，116.45，117.91，120.86，129.03，130.02，136.40，142.88
，149.80，158.79，197.64．実施例4.化合物5cの合成 2'6'-ジメチルフェニル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3c).
1H NMR(CDC
l3)δ2.68(s,6H)，7.32-738(m,3H)，7.67-8.47(m,8H)．2',6'-ジメチルフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレートト リフルオロメタンスルフォネート(4c).
1H NMR(アセトン-d6)δ2.68(s,6H)，5.2
3(s,3H)，7.40-7.47(m,3H)，8.26-9 07(m,8H)．2',6'-ジメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート(5c).
方法A．1H NMR(CDCl3)δ2.09(s,6H)，3.46(s,3H)，5.08(s,1H)，6.97-7.36(m,11
H)．実施例5.化合物5dの合成 4'-フルオロフェニル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3d).
1H NMR(CDCl3
)δ7.17-7.47(m,4H)，7.67-8.29(m,12H)．4'-フルオロフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート ト リフルオロメタンスルフォネート(4d).
1H NMR(アセトン-d6)δ5.19(s,3H)，7.3
8-9.04(m,12H)．4'-フルオロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート(5d).
方
法A．1H NMR(CDCl3)δ3.46(s,3H)，5.08(s,H)，6.96-7.38(m,12H)．実施例6．化合物5eの合成 4'-トリフルオロメチルフェニル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3e).
1H
NMR(CDCl3)δ7.64-8.31(m,12H)．4'-トリフルオロメチルフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシ レート トリフルオロメタンスルフォネート(4e).
1H NMR(アセトン-d6)δ5.23(
s,3H)，8.01-9.07(m,12H)．4'-トリフルオロメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレー ト(5e).
方法A． 1H NMR(CDCl3)δ3.46(s,3H)，5.10(s,1H)，7.00-7.55(m,12H)
，実施例7．化合物5fの合成 4'−メトキシフェニル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3f).
1H NMR(CDCl3
)δ3.86(s,3H)，6.99-7.02(d,2H)，7.54-7.57(d,2H)，7.6-8.28(m,8H)．4'-メトキシフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート ト リフルオロメタンスルフォネート(4f).
1H NMR(アセトン−d6)δ3.90(s,3H)，5.
19(s,3H)，7.12-7.15(d,2H)，7.73-7.76(d,2H)，8.20-9.04(m,8H)．4'-メトキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート(5f).
方
法A．1H NMR(CDCl3)δ3.45(s,3H)，3.76(s,3H)，5.07(s,1H)，6.81-7.35(m,12H)
．実施例8．化合物5gの合成 2',6'-ジクロロフェニル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3g).
1H NMR(C
DCl3)δ7.44-762(m,3H)7.66-836(m,8H)．2',6'-ジクロロフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート トリフルオロメタンスルフォネート(4g).
1H NMR(アセトン-d6)δ5.19(s,3H)，
7.38-9.04(m,1H)．2',6'-ジクロロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート(5g).
方法A．1H NMR(CDCl3)δ3.47(s,3H)，5.08(s,1H)，699-738(m,11H)．実施例9．化合物5hの合成 2'-ナフチル アクリジン-9-チオカルボキシレート(3h).
1H NMR(CDCl3)δ 7.57
-8.29(m,15H)．2'-ナフチル 10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレート トリフルオ ロメタンスルフォネート(4h).
1H NMR(アセトン-d6)δ5.19(s,3H)，7.67-9.03(m
,15H)．2'-ナフチル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキンレート(5h).
方法A．1H
NMR(CDCl3)δ3.47(s,3H)，5.13(s,1H)，7.017.79(m,15H)．実施例10.化合物5iの合成 2'-ナフチル 2,7-ジメトキシアクリジン-9-チオカルボキシレート(3i).
1H NM
R(CDCl3)δ4.024(s,6H)，7.265-7.281(t,2H)，7.425-7.466(dd,2H)，7.564-7.66
9(m,3H)，7.86-7.97(m,3H)，8.095-8.125(d,3H)．2'-ナフチル 2,7-ジメトキシ-10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシレー トトリフルオロメタンスルフォネート(4i).
1H NMR(DMSO-d6)δ4.146(s,6H)，4.
876(s,3H)，7.472-7.480(d,2H)，7.669-7.708(m,2H)，7.844-7.878(dd,1H)，8.0
49-8.155(m,5H)，8.481(s,1H)，8.800-8.835(d,2H)．2'-ナフチル 2,7-ジメトキシ-10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート(5 1).
方法A．1H NMR(CDCl3)δ3.401(s,3H)，3.813(s,6H)，5.042(s,1H)，6.902
-6 926(m,6H)，7.265-7.300(dd,1H)，7.428-7.468(m,2H)，7.708-7.790(m,4H)．実施例11．化合物5jの合成 4'-フルオロフェニル 3-メトキシアクリジン-9-チオカルボキシレート(3j).
生
成物を、シリカゲル上、１５％錯酸エチル／ヘキサンを用い、カラムクロマトグ
ラフで更に精製し、生成物を得た。1H NMR(CDCl3)δ4.034(s,3H)，7.171-7.230(
t,2H)，7.307-7.346(dd,1H)，7.486-7.494(d,1H)，7.561-7.651(m,3H)，7.787-7
.84(m,1H)，7.989-8.021(d,1H)，8.068-8.094(d,1H)，8.174-8.202(d,1H)．4'-フルオロフェニル 3-メトキシ-10-メチルアクリジニウム-9-チオカルボキシ レート トリフルオロメタンスルフォネート(4j).
1H NMR(DMSO-d6)δ4.259(s,
3H)，4.769(s,3H)，7.476-7.535(t,2H)，7.707-7.746(dd,1H)，7.863-7.869(d,1
H)，7.937-8.054(m,3H)，8.398-8.452(t,1H)，8.475-8.507(d,2H)，8.766-8.797
(d,1H)．4'-フルオロフェニル 3-メトキシ-10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレー ト(5j).
方法A．1H NMR(CDCl3)δ3.434(s,3H)，3.857(s,3H)，5.025(s,1H)，6.
540-6.601(m,2H)，6.963-7.037(m,4H)，7.193-7.370(m,5H)．化学ルミネセンスの測定
下記の例の実験は、光の減衰についてのニュートラル密度フィルター（neutra
l density filter）を備えたターナー・デザインス(Ｔurner Ｄesigns)ＴＤ−20
e(Sunnyvale，CA)ルミノメーターか、又はラブシステムズ ルミノスカン(Helsi
nki，Finland)ルミノメーターを用いて行なった。データの収集、解析及び表示
はソフトウェアで抑制した。実施例12． 化合物5a〜j、及び2種の他のアクリダンによるHRPの検出に関する光 度−時間分布の比較
3試薬は、別々に、各40μLを、HRPを1.4×10-16モルを含む水溶液1μLと反応
さ
せた。3試薬の組成は、夫々次の通りである。
(1)0.05mMのアクリダン化合物5a〜jを含むpH8.0のトリス緩衝液0.01M、0.4mMの
尿素過酸化物、0.1mMのp-フェニルフェノール、0.025％のTween20、1mMのEDTA。
(2) アクリダン5の代わりに、フェニル 10-メチルアクリダン-9-カルボキシレー
トを含む以外はまったく同一組成の試薬（本出願人による同時係属出願となるNo
.08 061,810)。
(3)アクリダン5の代わりに、先に報告したアクリダンであるエチル 10-メチル
アクリダン-9-チオカルボキシレートを含む以外まったく同じ組成の試薬(F．McC
apra，Pure Appl．Chem.，24，611 629(1970))。
図1〜8に、この条件下で本発明の種々のアクリダン5を含む試薬を使用すると
、他のアクリダンの試薬に比べて、光放射が改良されることを示す。実施例13． 処方の最適化
pH8.0のトリス緩衝液(0.01−0.2M)中、p-ヨードフェノール(0.1〜2.25mM)と、
過酸化尿素(0.1〜1mM)と、Tween20(0〜0.6％)と、2.5%(v v)の2-メトキシエタノ
ールとを含む溶液に、アクリダン5a、5d及び5e(0.1〜0.076mM)を用いて、最適化
の基本的な実験を行なった。酵素1.4×10-15から1.4×10-19モルの範囲内で、HR
Pの検出につき、感度とダイナミックレンジを評価した。特に有効な試薬の組成
は、pH8.0(0.01M)のトリス緩衝液中で、アクリダン(0.05〜0.075mM)、p-ヨード
フェノール(1.1mM)又はp-フェニルフェノール(0.1mM)、過酸化尿素物(0.4〜0.6m
M)、1mMのEDTA、Tween20(0.025％)からなる。これらの条件では、各アクリダン
化合物に対して試験した、酵素の全範囲に亘って、HRPに関して直線的な分析結
果を得た。実施例14． ルミノールに対する、アクリダン5a、5d、5e及び5jによるHRPの検出 感度の比較
本発明の試薬と、ルミノールを含む市販品の最適試薬(Amersham ECL)とを用い
て、HRP検出の直線性を比較した。それぞれの実験で、表に記載した如く、アク
ダリン5a、5d、5e又は5jをそれぞれ含有する溶液各40μLと、市販の試薬(Amersham
ECL、メーカーの指示に従って作られたもの)40μLとを、酵素1.4×10-15乃至1.
4
×10-19モルを含有するHRPのアリコート1μLと室温で混合した。図9〜12は、ア
クダリン5a、5d、5e又は5jをそれぞれ含む試薬を用いて測定したHRP量の直線範囲
の比較である。アクダリン5a、5d、5e又は5jを含有する試薬からのデータは、15分
の所で測定したが、ECL試薬からのデータは、光度の上昇と減衰が早いため、ま
た、試薬に対する酵素量でピーク時間が変るため、光度の最大の点で測定した。
アクダリン5a、5d、5e又は5jを含有する試薬は、ECL試薬よりも100倍の検出感度が
可能であった。アクダリン5a、5d、5e又は5jを含有する試薬を用いると、同様な感
度については、より早い時間で測定できた。
実施例15． アクリダン含有ホースラディシュ（西洋カラシ）ペルオキシターゼ 検出試薬の安定性
検出試薬は、適宜二つの容器に貯蔵し、第一溶液は過酸化物、フェノール強化
剤、TWEEN20及びEDTAを含有する水性緩衝液を含み、第二の溶液は1対1のエタノ
ール／p-ジオキサン又は、好ましくは、2−メトキシエタノール或いは１対１の
プロピレングリコール／エタノールのような水混和性の有機溶剤中にアクリダン
化合物5を含む。この方法で貯蔵すると、試薬組成物は数か月安定である。最終
検出試薬は使用前に二溶液の適量を混合して作る。本発明のアクリダンの利点は
、最終検出試薬混合物の安定性が大なることである。安定性は、一定量のHRPと
反応したアリコート溶液からのピーク光度を測定することによって評価した。pH
8.0のトリス緩衝液0.01M中に化合物5d又は5j(0.075mM)、p-フェニルフェノール(
0.1mM)、過酸化尿素(0.4mM-5d、0.6mM-5j)、TWEEN20(0.025%)、EDTA(1mM)、2.5％
2-メトキシエタノールを含有する2種の検出試薬各41μLと、1.4×10-16モルのHR
Pとを室温で反応させたもので、24時間貯蔵したものから得たピークの光度を、
貯蔵前の値の百分率(%Imax)として以下に示す。
アクリダン5d、5e及び5fで行った他の実験でも特に優れた安定性が得られた。実施例16．緩衝液のpHの影響
pH範囲7.0〜9.0における0.01Mのトリスが、またはpH範囲6.0〜6.5における0.0
1Mのリン酸カリウムのいずれかを用い、実施例13の組成に従って検出試薬溶液を
調製し、HRPと反応させた。試薬バックグランドに対するシグナルの最善の比は
、pH6〜8.5の範囲による試薬で得られた。実施例17． 緩衝塩の影響
種々の緩衝溶液に置き換えた以外は、実施例13の組成に従って、検出試薬溶液を
作成し、HRPと反応させた。試薬のバックグランドに比して有用な光り強度のレ
ベルは、トリス塩酸(tris hydrochloride)、トリス酢酸(tris acetate)、トリス
・マレート(tris malate)、燐酸カリウム、ジグリシン-水酸化ナトリウム及びト
リシンの緩衝液から調製された試薬で得られた。実施例18．強化剤の影響
種々のフェノール系強化剤に置き換え、実施例13の組成に従って検出試薬溶液
を調製し、HRPと反応させた。試薬のバックグランドに比して有用な光度レベル
は、p-ヨードフェノール、p-ヒドロキシシンナミックアシッド及びｐ−フェニル
フェノールを含有する試薬で得られた。実施例19．過酸化物の影響
種々の過酸化物に置き換え、実施例13の組成に従って、検出試薬溶液を調製し
、HRPと反応させた。試薬のバックグランドに比して有用な光度レベルは、過酸
化水
素、過ホウ酸ナトリウム及び過酸化尿素を含有する試薬で得られた。実施例20．界面活性剤の影響
種々の界面活性剤に置き換え、実施例13の組成に従って、検出試薬溶液を調製
し、HRPと反応させた。試薬のバックグランドに比して有用な光度のレベルは、T
WEEN20(Aldrich,Milwaukee,WI)、TRITON X-405(Aldrich)、BRIJ 35(Aldrich)、ナト
リウムドデシルサルフェート、セチルトリメチルアムモニウム ブロマイト、β
-シクロデキストリン及びデキストランサルフェートを含有する試薬で得られた
。実施例21．ウェスターンブロットによる蛋白質の改良された化学発光検出法
ウサギ抗ヤギIgGペルオキシダーゼ抱合体をカペルプロダクツ(Durham,NC)から
得た。ヒトトランスフェリンと、分画したヤギ抗ヒトトランスフェリン血清をノ
グマケミカル社(St．Louis,MO)から購入した。IgGのサンプルは、2分間10,000g
で遠心分離し、上澄液を免疫学的反応に使用した。PVDFの伝達膜(transfer memb
rane)(IMMOBILON P)はミリポア社(Bedford,MA)から入手した。コダック(Rochest
er,NY)のX-OMAT AR フイルムをアッセイ法に使用した。
SDS-PAGEをラエムリ（U.K.Laemmli,Nature(London),227,680(1970)）に記載さ
れた緩衝液システムを用いて実施した。スタッキングゲル(stacking gel)は、4.
38％アクリルアミト：0.12％ビスアクリルアミドとした。セパレーティングゲル
(separating gel)は6.81％アクリルアミド：0.19％ビスアクリルアミドとした。
電気泳動の後、ゲルは伝達緩衝液(transfcr buffer)と7〜8分間平衡状態にあっ
た。その緩衝液は、20mMのトリスと153mMのグリノンと20％(v v)メタノールとを
含有するものとした。そのゲルを伝達膜のシートとクロマトグラフィー紙3MM(Wh
atman)のシートとの間に挟持したものをトランスファーユニット(Bio-Rad Labor
atorles,Richmond,CA)中に設置した。ゲル中の蛋白質を、100ボルトの一定電圧
下4℃で25分間電気溶離した。その後膜を、pH7.4のトリス- HCl緩衝液の生理的
食塩水(TBS)50mM 中に4℃で一晩中放置した。その後、膜を15分間TBで洗浄した
。
膜を、1％の無脂肪粉乳(NFM)を含有する、pH7.4のトリス-HCl緩衝液の生理的
食塩水中における0.05％のTWEEN-20(T-TBS)で、室温にて1時間処理した。このブ
ロッ
クした膜を、1％NFMを含有するT-TBSを用い、一次抗体(ヤキ抗ヒトトランスフェ
リンIgGフラクションの1500分の１の希釈液)と、室温で75分間インキュベートし
た。
次いで、膜を濯ぎ、室温でT-TBSで5分ずつ3回洗浄した。洗浄した膜を室温で1
時間、二次抗体(ウサギ抗ヤギIgG ペルオキシダーゼ抱合体の50,000分の1の希釈
液)と、1％NFMを含有するT-TBSを用いて、インキュベートした。膜をすすぎ、室
温でT-TBSで10分ずつ4回洗浄し、更にTBSで5分洗浄した。
洗浄した膜を、4種の検出試薬の一つに5分間浸積し、脱水して、透明なフイル
ムのシートの間に置いた。試薬Aは、ルミノール(Amersham ECL)を含有する市販
の試薬とした。試薬Bは、本出願人による同時係属出願となるNo.08 061,810に開
示されたアクリダンである4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-カル
ボキシレートを含有したものである。試薬Cは、アクリダン5aを含有したもので
ある。15分間インキュベートした後、エックス線フィルムを種々の時間膜に暴露
し、現像した。アクリダン化合物を含有する検出試薬溶液の組成は以下の通りで
ある。
トリス緩衝液、pH8.8 0.1 M
アクリダン 0.05 mM
p-ヨードフェノール 1.1 mM
TWEEN 20 0.5%(w w)
NaBO3・4H2O 2.5 mM
EDTA 0.5 mM
p-ジオキサン 1.25 ％
エタノール 1.25 ％
用いたトランスフェリンの標準は、コダックのX-OMAT ＡR X線フィルムに15
秒暴露した後、ハックグランド上で5pg slotまで鮮明に見ることができた。膜が
光りを放射し続けたので24時間の間に膜の暴露を何回もすることができた。図13
は、14分インキュベートし、15秒暴露した実験の、デジタルでスキャンしたX線
フィルムの画像である。その結果、本発明のアクリダン5aで、良い画像が得られ
た。実施例22． サザンブロットの化学発光検出
マウスの遺伝子DNA(Clontech Laboratories．Inc.,Palo Alto，CA)を、50μg mL
の濃度で制限酵素EcoR1(Boehringer-Mannheim)で完全に(to completion)分割し
た。制限したDNAをフェノール／クロロホルムで1回、クロロホルムで1回抽出し
て精製し、エタノールで沈澱させた。精製したDNAを、それぞれ34μgと17μgの2
部分に分け0.77％のアガロースゲルの電気泳動で分離した。電気泳動の緩衝液は
40mMのトリスアセテートと2mMのEDTA(pH 8.0)とした。電気泳動の後、ゲルを水
で濯ぎ、次いで0.25Nの塩酸に12分穏やかに撹拌しながら浸漬した。
マグナグラフ ナイロン（Ｍicron Ｓeparations Inc.,Ｗestboro,ＭＡ）を続
けて水と10X SSC(20X SSCは3Mの食塩と0.3Mのクエン酸ナトリウムで、pH7.0)に
それぞれ2分と10分浸漬した。ゲルを水で濯き、次いで0.5M NaOH 1.5M NaClで2
回、それぞれ15分と30分濯いた。ゲルを水で濯ぎ、後1M トリス塩酸(pH7.5)1.5M
食塩水で15分ずつ3回処理した。ゲル中のDNAを毛細管で膜に移し、10X SSCを用
いて一夜ブロッティングした。ブロットを30分風乾し、次いで80℃で2時間加熱
した。
0.5Nの食塩と5％のブロッキング剤(Amersham#RPN.3000)を含有するハイブリッ
ド形成緩衝液(Amersham#RPN.3000)中で、膜を42℃で60分間随時撹拌しながらプ
レハイブリッド操作をした。ハイブリッド形成プローブのv-mos DNA(Clontech L
ab.Inc.)をメーカーの仕様(Amersham#RPN.3000)に従って、HRPで標識し、0.5N食
塩、5％のブロッキング剤および300ng mLのHRPで標識したv-mos DNAを含有する
ハイブリッド形成緩衝液を用いて、42℃で一夜ハイブリッド形成を進行させた。
続けて室温で、膜を0.5X SSC 0.4％SDSで、5分及び30分洗い、その後、55℃でそ
れぞれ15分、3回洗い、更に2X SSCで2回、それぞれ5分室温で洗浄した。
膜を水で濯ぎ、過剰の溶液を除く為、3MMのブロッティングペーパー上に1分間
放置し、その後きれいな容器に移し、本発明のアクリダン5aを含有する実施例21
の検出試薬を加えた。9分間インキュベートした後、過剰の溶液を除去し、ブロ
ットを透明なフィルムのシートの間に挟んで、コダックのX-OMAT XAR 5のフィル
ムに暴露した。
図14に示したように、本発明の試薬は、10分間暴露しただけで、マウスの遺伝
子DNAのシングル複製遺伝子の検出に使うことができる。17μgのリーディングト
ラッ
ク(leading tracks)においてターゲットDNA70pg(7.9×10-17モル)とすると、タ
ーゲット制限断片は14kbである。本発明の試薬を用いれば、シングル複製遺伝子
はブロットの両方のトラックで、明瞭に目視できる。
前記に述べたものは、本発明の例示に過ぎないものであって、本発明は請求の
範囲によってのみ制限される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ザーラ アルガバニ
アメリカ合衆国 ミシガン 48310 スタ
ーリング ハイツ リアン ロード
33858
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．化学式、 （ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダン。 ２．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第1項記載のアクリダン。 ３．未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第2項記載のアクリダン。 ４．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第１項記載のアクリダン。 ５．置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第4項記載のアクリダン。 ６．R1からR8までの基の少なくとも１個がアルコキシ基であり、R1からR8までの 他の基が水素原子である請求の範囲第1項乃至第5項のうちいずれか1項記載のア クリダン。 ７．R1からR8までの基の少なくとも１個がメトキシ基であり、R1からR8までの他 の基が水素原子である請求の範囲第1項乃至第5項のうちいずれか１項記載のアク リダン。 ８.(a) 化学式、 （ここで、Ｒはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダンと、 (b) 場合により、該アクリダンからの発光を強化し得るフェノール化合物と 、 (c) 該アクリダンと該ペルオキシダーゼとの反応に関係する過酸化化合物と 、 (d) 試薬組成物への該ペルオキシダーゼ添加の前に該過酸化化合物が反応す るのを防ぐキレート剤と、 (e) 化学発光を改良し得る量の界面活性剤と、 を含有することを特徴とする、ペルオキシダーゼの存在下で発光する試薬組成物 。 ９．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第8項記載の試薬組成物。 10.未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第9項記載の試薬組成物。 11．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第8項記載の試薬組成物。 12．置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第11項記載の試薬組成物。 13．R1からR8までの基の少なくとも1個がアルコキシ基であり、R1からR8までの 他の基が水素原子である請求の範囲第8項乃至第12項のうちいずれか1項記載の試 薬組成物。 14．Rの少なくとも1個がメトキシ基であり、他の基が水素原子である請求の範囲 第8項乃至第12項のうちいずれか1項記載の試薬組成物。 15．過酸化化合物とペルオキシダーゼと、化学式、 （ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダンとの反応を含むことを特徴とする化学発光を生ずる方法。 16．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第15項記載の方法。 17．未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第16項記載の方法。 18．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第15項記載のアクリダン。 19．置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第18項記載の方法。 20．R1からR8までの基の少なくとも１個がアルコキシ基であり、R1からR8までの 他の基が水素原子である請求の範囲第15項乃至第19項のうちいずれか１項記載の 方法。 21．Rの少なくとも1個がメトキシ基であり、Rの他の基が水素原子である請求の 範囲第15項乃至第19項のうちいずれかI項記載の方法。 22．試料物質を化学発光反応によりアッセイ法で検出する方法において、該試料 物質検出のための発光にアクリダンを過酸化物およびペルオキシダーゼと反応さ せる場合、該アクリダンが、化学式、 （ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダンであることを特徴とする検出方法。 る）で表されるアクリダンを、過酸化物の存在下で反応させることを特徴とする 検出方法。 23．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第22項記載の検出方法。 24．未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第23項記載の検出方法。 25．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第22項記載の検出方法。 26．置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第25項記載の検出方法。 27．R1からR8までの基の少なくとも1個がアルコキシ基であり、R1からR8までの 他の基が水素原子である請求の範囲第22項乃至第26項のうちいずれか１項記載の 検出方法。 28．R1からR8までの基の少なくとも1個がメトキシ基であり、R1からR8までの他 の基が水素原子である請求の範囲第22項乃至第26項のうちいずれか1項記載の検 出方法。 29．試料物質が、ペルオキシダーゼである請求の範囲第22項記載の検出方法。 30．試料物質が、過酸化物である請求の範囲第22項記載の検出方法。 31．試料物質を化学発光反応によるアッセイ法で検出する方法において、 (a) ペルオキシダーゼの存在下で発光する試薬組成物であって、化学式、 （ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダンと、場合により、該アクリダンからの発光を強化するフェノー ル化合物と、該アクリダンと該ペルオキシダーゼとの反応に関係する過酸化 化合物と、該試薬組成物への該ペルオキシダーゼ添加の前に該過酸化化合物が反 応するのを防ぐキレート剤と、化学発光を改良し得る量の界面活性剤とを含有す る該試薬組成物を与えることと、 (b) 該試料物質検出のため該試薬組成物にペルオキシダーゼを添加して発光させ ること、 とを含むことを特徴とする検出方法。 32．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第31項記載の検出方法。 33．未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第32項記載の検出方法。 34．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第31項記載の検出方法。 35．置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第32項記載の検出方法。 36．R1からR8までの基の少なくとも1個がアルコキシ基であり、R1からR8までの 他の基が水素原子である請求の範囲第31項乃至第35項のうちいずれか1項記載の 検出方法。 37．R1からR8までの基の少なくとも1個がメトキシ基であり、R1からR8までの他 の基が水素原子である請求の範囲第31項乃至第35項のうちいずれか1項記載の検 出方法。 38．試料物質が、ペルオキシダーゼである請求の範囲第31項記載の検出方法。 39．試料物質が、過酸化物である請求の範囲第31項記載の検出方法。 40．試料物質を化学発光反応によるアッセイ法で検出するためのキットにおいて 、 (a)化学式、 （ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダンと、 (b) 過酸化物と、 (c) アクリダン化合物を過酸化物およびペルオキシダーゼと反応させることによ るアッセイ法で光を検出する場合、単独のペルオキシダーゼと、または試料物質 と結合した化合物に付着した形のペルオキシダーゼと、 をそれぞれ独立した容器で供給することを特徴とするキット。 41．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第40項記載のキット。 42．未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第41項記載のキット。 43．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第40項記載のキット。 44．置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第43項記載のキット。 45．R1からR8までの基の少なくとも１個がアルコキシ基であり、R1からR8までの 他の基が水素原子である請求の範囲第40項乃至第44項のうちいずれか1項記載の キット。 46．R1からR8までの基の少なくとも1個がメトキシ基であり、R1からR8までの他 の基が水素原子である請求の範囲第40項乃至第44項のうちいずれか1項記載のキ ット。 47．試料物質を化学発光反応によるアッセイ法で検出するためのキットにおいて 、 (a) 化学式、 （ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される 基、R1からR8まではそれぞれ水素原子及び発光を生じさせる基より選択される基 、Arは過酸化物およびペルオキシダーゼと反応することにより該アクリダンを発 光させる置換及び未置換のアリール基から成る群より選択される基である）で表 されるアクリダンと、場合により、該アクリダンからの発光を強化するフェノー ル化合物と、該アクリダンと該ペルオキシダーゼとの反応に関係する過酸化化合 物と、該試薬への該ペルオキシダーゼ添加の前に該過酸化化合物が反応するのを 防ぐキレート剤と、化学発光を改良し得る量の界面活性剤とを含有する、ペルオ キシダーゼの存在下で発光する試薬組成物と、 (b) 試薬組成物をペルオキシダーゼと反応させることによるアッセイ法で光を検 出する場合、単独のペルオキシダーゼと、または試料物質と結合した化合物に付 着した形のペルオキシダーゼと、 をそれぞれ独立した容器で供給することを特徴とするキット。 48．Arが未置換のアリール基である請求の範囲第47項記載のキット。 49．未置換のアリール基がフェニル基及びナフチル基より選択された基である請 求の範囲第48項記載のキット。 50．Arが置換されたアリール基である請求の範囲第47項記載のキット。 51.置換されたアリール基が置換されたフェニル基及び置換されたナフチル基よ り選択された基である請求の範囲第50項記載のキット。 52．R1からR8までの基の少なくとも1がアルコキシ基であり、R1からR8までの他 の基が水素原子である請求の範囲第47項乃至第51項のうちいずれか1項記載のキ ット。 53．R1からR8までの基の少なくとも1個がメトキシ基であり、R1からR8までの他 の基が水素原子である請求の範囲第47項乃至第51項のうちいずれか1項記載のキ ット。 54．フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート。 55．4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルホキシレート。 56．2',6'-ジメチルフェニル 10-メチルアタリダン-9-チオカルボキシレート。 57．4'-フルオロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート。 58．4'-トリフルオロメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシ レート。 59．4'-メトキンフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート。 60．2',6'-ジクロロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート。 61．2'-ナフチル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート。 62．2'-ナフチル 2,7-ジメトキシ-10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレー ト。 63．4'-フルオロフェニル 3-メトキシ-10メチルアクリダン-9-チオカルボキシ レート。 64．アクリダンが、フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、 4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2',6' -ジメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-フルオ ロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-トリフルオロ メチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-メトキシ フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキノレート、2',6'-ジクロロフェ ニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2'-ナフチル 10-メチル アクリダン-9-チオカルボキシレート、2'-ナフチル 2,7-ジメトキシ-10-メチル アクリダン-9-チオカルボキシレート及び4'−フルオロフェニル 3-メトキシ-10 -メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートから成る群から選択されたアクリダ ンである請求の範囲第8項記載の試薬組成物。 65．アクリダンが、フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、 4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2',6' -ジメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-フルオ ロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-トリフルオロ メチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-メトキシ フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2',6'-シクロロフェ ニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2'-ナフチル 10-メチル アクリダン-9-チオカルボキシレート、2'ナフチル 2,7-ジメトキシ-10-メチル アクリダン-9-チオカルボキシレート及び4'-フルオロフェニル 3-メトキシ-10- メチ ルアクリダン-9-チオカルボキシレートから成る群から選択されたアクリダンで ある請求の範囲第15項、第22項または第31項記載の方法。 66．アクリダンが、フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、 4'-ヒドロキシフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2',6' -ジメチルフェニル 10-メチルアクリダン-9チオカルボキシレート、4'-フルオ ロフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-トリフルオロ メチルフェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、4'-メトキシ フェニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2',6'ジクロロフェ ニル 10-メチルアクリダン-9-チオカルボキシレート、2'-ナフチル 10-メチル アクリダン-9-チオカルボキシレート、2'-ナフチル 2,7-ジメトキシ-10-メチル アクリダン-9-チオカルボキシレート及び4'-フルオロフェニル 3-メトキシ-10- メチルアクリダン-9-チオカルボキシレートから成る群から選択されたアクリダ ンである請求の範囲第40項または第47項記載のキット。
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