JPH09274035A - コントロール物質およびその染色方法 - Google Patents
コントロール物質およびその染色方法Info
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- JPH09274035A JPH09274035A JP8081670A JP8167096A JPH09274035A JP H09274035 A JPH09274035 A JP H09274035A JP 8081670 A JP8081670 A JP 8081670A JP 8167096 A JP8167096 A JP 8167096A JP H09274035 A JPH09274035 A JP H09274035A
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Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 蛍光パラメータを検出する粒子分析装置の精
度管理用のコントロール物質またはキャリブレータとし
て用いることが可能であり、測定対象とする粒子と同等
の蛍光強度を有する粒子を提供することを目的とする。 【解決手段】 染色に使用される蛍光色素が結合するの
を阻害し、かつ前記蛍光色素と蛍光波長の異なる蛍光強
度調整剤を予め結合した粒子、前記粒子を用いて少なく
とも蛍光パラメータを検出する粒子分析装置の精度管理
前キャリブレーションを行う方法、ならびに前記粒子の
製造方法。
度管理用のコントロール物質またはキャリブレータとし
て用いることが可能であり、測定対象とする粒子と同等
の蛍光強度を有する粒子を提供することを目的とする。 【解決手段】 染色に使用される蛍光色素が結合するの
を阻害し、かつ前記蛍光色素と蛍光波長の異なる蛍光強
度調整剤を予め結合した粒子、前記粒子を用いて少なく
とも蛍光パラメータを検出する粒子分析装置の精度管理
前キャリブレーションを行う方法、ならびに前記粒子の
製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液や尿などの体
液の分析において使用される粒子分析装置の精度管理や
キャリブレーションに使用できる粒子に関する。また、
粒子の蛍光染色に際してその蛍光強度を調整することに
より、種々の目的に適した粒子を製造する方法に関す
る。
液の分析において使用される粒子分析装置の精度管理や
キャリブレーションに使用できる粒子に関する。また、
粒子の蛍光染色に際してその蛍光強度を調整することに
より、種々の目的に適した粒子を製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】血液中の細胞や尿中の粒子などの体液中
の粒子成分の分類計数のために、フローサイトメータを
用いる方法が知られている。この方法は、サンプル試料
中の細胞または粒子を染色液で染色して１個ずつフロー
セル中に流し、染色された細胞または粒子に励起光を照
射し、細胞から発せられる蛍光や散乱光を測定するもの
である。
の粒子成分の分類計数のために、フローサイトメータを
用いる方法が知られている。この方法は、サンプル試料
中の細胞または粒子を染色液で染色して１個ずつフロー
セル中に流し、染色された細胞または粒子に励起光を照
射し、細胞から発せられる蛍光や散乱光を測定するもの
である。
【０００３】ところで、フローサイトメータを用いて分
析するにあたっては、正確なデータが得られるように装
置を校正あるいは維持しておく必要がある。そのために
は、測定対象とする細胞または粒子そのものを用いて精
度管理やキャリブレーションを行うのが好ましい。しか
しながら、これらの細胞や粒子は生体由来のものである
ため、保存安定性に欠け、日が経つにつれて分解し、数
が減ってしまうので、一般にフローサイトメータの精度
管理やキャリブレーションには、固定化された赤血球や
細菌などの細胞、ラテックス粒子、蛍光粒子などが用い
られている。
析するにあたっては、正確なデータが得られるように装
置を校正あるいは維持しておく必要がある。そのために
は、測定対象とする細胞または粒子そのものを用いて精
度管理やキャリブレーションを行うのが好ましい。しか
しながら、これらの細胞や粒子は生体由来のものである
ため、保存安定性に欠け、日が経つにつれて分解し、数
が減ってしまうので、一般にフローサイトメータの精度
管理やキャリブレーションには、固定化された赤血球や
細菌などの細胞、ラテックス粒子、蛍光粒子などが用い
られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】固定化した細胞を用い
る場合、固定化によって生細胞のもつ色素排除能が失わ
れるために、色素で染色されやすくなり蛍光強度が増大
してしまう。このため、生細胞に用いるのと同じ解析プ
ログラムが使用できなくなるという欠点がある。また、
生細胞と類似した人工の粒子を用いる方法は、多くの既
存の粒子または新たに合成した粒子の中から、目的の信
号を出す粒子を選ぶ作業が必要であり、多くの時間と労
力を要する。さらに、目的のものが得られる保証もな
い。
る場合、固定化によって生細胞のもつ色素排除能が失わ
れるために、色素で染色されやすくなり蛍光強度が増大
してしまう。このため、生細胞に用いるのと同じ解析プ
ログラムが使用できなくなるという欠点がある。また、
生細胞と類似した人工の粒子を用いる方法は、多くの既
存の粒子または新たに合成した粒子の中から、目的の信
号を出す粒子を選ぶ作業が必要であり、多くの時間と労
力を要する。さらに、目的のものが得られる保証もな
い。
【０００５】本発明は、上記の欠点を解決するためにな
されたもので、蛍光パラメータを検出する粒子分析装置
の精度管理用のコントロールまたはキャリブレータとし
て用いることが可能であり、測定対象とする粒子と同等
の蛍光強度を有する粒子を提供することを目的とする。
また、粒子の染色に際し、その蛍光強度を任意に調整し
て上述した目的に適した粒子を製造する方法を提供する
ことを目的とする。
されたもので、蛍光パラメータを検出する粒子分析装置
の精度管理用のコントロールまたはキャリブレータとし
て用いることが可能であり、測定対象とする粒子と同等
の蛍光強度を有する粒子を提供することを目的とする。
また、粒子の染色に際し、その蛍光強度を任意に調整し
て上述した目的に適した粒子を製造する方法を提供する
ことを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、染色に使用さ
れる蛍光色素が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光色素
と蛍光波長の異なる蛍光強度調整剤を予め結合した粒子
を提供する。
れる蛍光色素が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光色素
と蛍光波長の異なる蛍光強度調整剤を予め結合した粒子
を提供する。
【０００７】本発明に用いられる粒子状物質の材料とし
ては、測定対象となる粒子成分よりも強く染色されるも
のであれば特に制限はないが、固定化処理または安定化
処理された細胞、クロマトグラフィー用充填剤（例え
ば、架橋アガロース、多孔性シリカ）が好適に使用され
る。また、大きさ情報も測定する場合には、測定対象と
なる粒子とほぼ同じ大きさまたは前方散乱光強度を有す
るものが好ましい。特に、測定対象が細胞であれば、測
定対象とする細胞を固定化または安定化したものを使用
するのがより好ましい。例えば、測定対象が赤血球の場
合には固定化赤血球を用いるのが好ましい。細胞の固定
化には公知の方法を用いることができ、例えばグルタル
アルデヒド法、パラホルムアルデヒド法、ホルムアルデ
ヒド法などを用いることができる。また、細胞の安定化
には、例えば特開昭５５−１５１２６５号、特開昭５５
−１６２９６号、特表昭５８−５０２１６６号に記載の
方法を用いることができる。なお、粒子状物質の材料
が、測定対象となる粒子成分よりも強く染色されること
を必要とするのは、粒子状物質を蛍光強度調整剤によっ
て予備染色することによって、その後に行う蛍光色素に
よる粒子状物質の染色を阻害するためである。これによ
り蛍光色素による染色強度を少なくして、測定対象とな
る粒子とほぼ同じ挙動を示し、フローサイトメータの校
正やキャリブレーションのコントロール物質として使用
することができる。
ては、測定対象となる粒子成分よりも強く染色されるも
のであれば特に制限はないが、固定化処理または安定化
処理された細胞、クロマトグラフィー用充填剤（例え
ば、架橋アガロース、多孔性シリカ）が好適に使用され
る。また、大きさ情報も測定する場合には、測定対象と
なる粒子とほぼ同じ大きさまたは前方散乱光強度を有す
るものが好ましい。特に、測定対象が細胞であれば、測
定対象とする細胞を固定化または安定化したものを使用
するのがより好ましい。例えば、測定対象が赤血球の場
合には固定化赤血球を用いるのが好ましい。細胞の固定
化には公知の方法を用いることができ、例えばグルタル
アルデヒド法、パラホルムアルデヒド法、ホルムアルデ
ヒド法などを用いることができる。また、細胞の安定化
には、例えば特開昭５５−１５１２６５号、特開昭５５
−１６２９６号、特表昭５８−５０２１６６号に記載の
方法を用いることができる。なお、粒子状物質の材料
が、測定対象となる粒子成分よりも強く染色されること
を必要とするのは、粒子状物質を蛍光強度調整剤によっ
て予備染色することによって、その後に行う蛍光色素に
よる粒子状物質の染色を阻害するためである。これによ
り蛍光色素による染色強度を少なくして、測定対象とな
る粒子とほぼ同じ挙動を示し、フローサイトメータの校
正やキャリブレーションのコントロール物質として使用
することができる。
【０００８】本発明で使用できる蛍光色素としては、特
に制限はなく、核酸、細胞や組織染色などに使用可能な
染料がよく使用される。
に制限はなく、核酸、細胞や組織染色などに使用可能な
染料がよく使用される。
【０００９】本発明の粒子を製造するには、測定に使用
する蛍光色素が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光色素
と蛍光波長の異なる蛍光強度調整剤で粒子を予め染色す
る。本発明で使用される蛍光強度調整剤は、染色液中に
含まれる蛍光色素が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光
色素と蛍光波長の異なるものから選択される。具体的に
は、蛍光強度調整剤は、その化学構造が染色に用いられ
る蛍光色素の化学構造と類似したもの、すなわち化学構
造の基本骨格が類似したものを使用することができる。
例えば、以下の化学構造をもつ i）３−ヘキシル−２−
［３−（３−ヘキシル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリ
リデン）−１−プロペニル］ベンズオキサゾリウム・ア
イオダイド（ＤｉＯＣ６（３））が染色に使用される蛍
光色素である場合を例にとると、
する蛍光色素が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光色素
と蛍光波長の異なる蛍光強度調整剤で粒子を予め染色す
る。本発明で使用される蛍光強度調整剤は、染色液中に
含まれる蛍光色素が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光
色素と蛍光波長の異なるものから選択される。具体的に
は、蛍光強度調整剤は、その化学構造が染色に用いられ
る蛍光色素の化学構造と類似したもの、すなわち化学構
造の基本骨格が類似したものを使用することができる。
例えば、以下の化学構造をもつ i）３−ヘキシル−２−
［３−（３−ヘキシル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリ
リデン）−１−プロペニル］ベンズオキサゾリウム・ア
イオダイド（ＤｉＯＣ６（３））が染色に使用される蛍
光色素である場合を例にとると、
【化１】 蛍光強度調整剤としては、以下の構造をもつ蛍光色素を
用いることができる。 ii）３−エチル−２−［７−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１，３，５−ヘプタトリ
エニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド：
用いることができる。 ii）３−エチル−２−［７−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１，３，５−ヘプタトリ
エニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド：
【化２】 iii）３−エチル−２−［（３−エチル−２（３Ｈ）−
ベンズオキサゾリリデン）メチル］ベンズオキサゾリウ
ム・アイオダイド：
ベンズオキサゾリリデン）メチル］ベンズオキサゾリウ
ム・アイオダイド：
【化３】 iv）３−エチル−２−［３−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベンズ
オキサゾリウム・アイオダイド：
−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベンズ
オキサゾリウム・アイオダイド：
【化４】 v）３−エチル−２−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベ
ンゾチアゾリリデン）メチル］ベンズオキサゾリウム・
アイオダイド：
ンゾチアゾリリデン）メチル］ベンズオキサゾリウム・
アイオダイド：
【化５】 vi）３−エチル−２−［３−（１−エチル−４（１Ｈ）
−キノリニリデン）−１−プロペニル］ベンズオキサゾ
リウム・アイオダイド：
−キノリニリデン）−１−プロペニル］ベンズオキサゾ
リウム・アイオダイド：
【化６】 vii）５−（３−エチル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾ
リリデン）２−チオキソ−チアゾリジノン：
リリデン）２−チオキソ−チアゾリジノン：
【化７】 viii）３−アリル−１−カルボキシメチル−５−［２−
（３−エチル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）
エチリデン］−２−チオヒダントイン：
（３−エチル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）
エチリデン］−２−チオヒダントイン：
【化８】 ix）２−［２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］エ
テニル］−３−メチルベンズオキサゾリウム・アイオダ
イド：
テニル］−３−メチルベンズオキサゾリウム・アイオダ
イド：
【化９】 x）２−［２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］エ
テニル］ベンズオキサゾール：
テニル］ベンズオキサゾール：
【化１０】 xi）３−ペンチル−２−［３−（３−ペンチル−２（３
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベ
ンズオキサゾリウム・アイオダイド：
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベ
ンズオキサゾリウム・アイオダイド：
【化１１】 xii）２−［［２−２−［４−（ジメチルアミノ）フェ
ニル］エテニル］−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−イ
リデン］メチル］−３−エチルベンズオキサゾリウム・
パークロレート：
ニル］エテニル］−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−イ
リデン］メチル］−３−エチルベンズオキサゾリウム・
パークロレート：
【化１２】 xiii）３−エチル−２−［５−（３−エチル−２（３
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１，３−ペンタジエ
ニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド：
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１，３−ペンタジエ
ニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド：
【化１３】 上記ii）〜xiii）の蛍光色素は、ベンズオキサゾールの
共通した構造を有する。また、これらの蛍光色素は吸収
極大波長や蛍光波長も、測定対象である粒子成分を染色
する蛍光色素であるＤｉＯＣ６（３）とは異なる。従っ
て、上記の蛍光色素を結合した粒子をＤｉＯＣ６（３）
で染色してフローサイトメータで測定すると、結合して
いない粒子を測定した場合と比較して蛍光強度は小さく
なる。上記蛍光色素の量を調整することにより、測定対
象とする粒子と同程度の蛍光強度に調整することができ
る。
共通した構造を有する。また、これらの蛍光色素は吸収
極大波長や蛍光波長も、測定対象である粒子成分を染色
する蛍光色素であるＤｉＯＣ６（３）とは異なる。従っ
て、上記の蛍光色素を結合した粒子をＤｉＯＣ６（３）
で染色してフローサイトメータで測定すると、結合して
いない粒子を測定した場合と比較して蛍光強度は小さく
なる。上記蛍光色素の量を調整することにより、測定対
象とする粒子と同程度の蛍光強度に調整することができ
る。
【００１０】このように、使用可能な蛍光強度調整剤を
選択するには、染色に用いる蛍光色素の構造を目安とし
て検索することにより見いだすことができる。これは、
粒子との結合に関与する前記蛍光色素中の官能基が不明
な場合に利用でき、類似した構造を有する物質は、類似
した反応をするという経験則に基づいている。なお、染
色のために使用する蛍光色素のどの官能基が粒子のどの
部分（例えば官能基）と結合するのかが分かっていれ
ば、必ずしも類似構造をもつ物質を使用する必要はな
く、粒子の同じ部分に結合して蛍光波長の異なる物質な
らば用いることができる。また、染色に使用される蛍光
色素と結合可能な官能基と蛍光強度調整剤と結合可能な
官能基が異なっていても、それらが粒子上または粒子中
で空間的に近接していれば、蛍光強度調整剤の分子サイ
ズが充分大きなものを用いることで染色を阻害すること
ができる。勿論、蛍光を発しないものも染色に用いる蛍
光色素の結合を阻害するものであれば使用できる。本発
明では、このような蛍光を発しないものも「蛍光波長の
異なる」ものとする。
選択するには、染色に用いる蛍光色素の構造を目安とし
て検索することにより見いだすことができる。これは、
粒子との結合に関与する前記蛍光色素中の官能基が不明
な場合に利用でき、類似した構造を有する物質は、類似
した反応をするという経験則に基づいている。なお、染
色のために使用する蛍光色素のどの官能基が粒子のどの
部分（例えば官能基）と結合するのかが分かっていれ
ば、必ずしも類似構造をもつ物質を使用する必要はな
く、粒子の同じ部分に結合して蛍光波長の異なる物質な
らば用いることができる。また、染色に使用される蛍光
色素と結合可能な官能基と蛍光強度調整剤と結合可能な
官能基が異なっていても、それらが粒子上または粒子中
で空間的に近接していれば、蛍光強度調整剤の分子サイ
ズが充分大きなものを用いることで染色を阻害すること
ができる。勿論、蛍光を発しないものも染色に用いる蛍
光色素の結合を阻害するものであれば使用できる。本発
明では、このような蛍光を発しないものも「蛍光波長の
異なる」ものとする。
【００１１】粒子への蛍光強度調整剤による予備染色、
ならびに蛍光色素による染色は当業界で公知の各種の方
法を用いることができる。
ならびに蛍光色素による染色は当業界で公知の各種の方
法を用いることができる。
【００１２】本発明による粒子染色法は、上述したコン
トロール物質として使用できる粒子の製造に用いること
ができる。しかし、これのみならず、フローサイトメー
タを用いて少なくとも蛍光パラメータを検出する粒子分
析において、測定すべき種々の粒子や細胞自体を二段階
で染色する場合にも使用できる。本発明の粒子染色法を
用いることにより、蛍光強度を任意に調整することが可
能になる。
トロール物質として使用できる粒子の製造に用いること
ができる。しかし、これのみならず、フローサイトメー
タを用いて少なくとも蛍光パラメータを検出する粒子分
析において、測定すべき種々の粒子や細胞自体を二段階
で染色する場合にも使用できる。本発明の粒子染色法を
用いることにより、蛍光強度を任意に調整することが可
能になる。
【００１３】本発明の粒子を用いてフローサイトメータ
のような粒子分析装置のキャリブレーションを行うに
は、まず測定対象とする粒子を染色するのと同じ要領で
本発明の粒子を染色する。次に、粒子分析装置で蛍光強
度を測定し、蛍光強度の平均値（又はピーク値）を求め
る。調整すべき範囲を予め設定しておき、蛍光強度の平
均値（又はピーク値）が所定範囲にあるかどうか確認す
る。もしその範囲に入らなければ、所定範囲に入るよう
に粒子分析装置の感度を調整する。大きさ情報も測定す
る場合は、同じようにして大きさ情報が所定範囲にある
かどうか確認する。精度管理を行う場合も上記と同様の
手順で測定を行い、異常が認められた場合には、粒子分
析装置の機構系、流体系、検出部などをチェックし、異
常があれば適切な処置をとる。
のような粒子分析装置のキャリブレーションを行うに
は、まず測定対象とする粒子を染色するのと同じ要領で
本発明の粒子を染色する。次に、粒子分析装置で蛍光強
度を測定し、蛍光強度の平均値（又はピーク値）を求め
る。調整すべき範囲を予め設定しておき、蛍光強度の平
均値（又はピーク値）が所定範囲にあるかどうか確認す
る。もしその範囲に入らなければ、所定範囲に入るよう
に粒子分析装置の感度を調整する。大きさ情報も測定す
る場合は、同じようにして大きさ情報が所定範囲にある
かどうか確認する。精度管理を行う場合も上記と同様の
手順で測定を行い、異常が認められた場合には、粒子分
析装置の機構系、流体系、検出部などをチェックし、異
常があれば適切な処置をとる。
【００１４】
【発明の効果】本発明によれば、保存安定性がよく、し
かも蛍光強度が測定対象とする粒子と同等のコントロー
ル物質として使用しうる粒子を簡単に得ることができ
る。また、粒子の染色において、過剰な染色を抑えるこ
とができ、蛍光強度を任意に調整することができる。
かも蛍光強度が測定対象とする粒子と同等のコントロー
ル物質として使用しうる粒子を簡単に得ることができ
る。また、粒子の染色において、過剰な染色を抑えるこ
とができ、蛍光強度を任意に調整することができる。
【００１５】
実施例１：固定化赤血球の測定例 （Ａ）固定化赤血球の調製 以下の手順で固定化赤血球を調製した。 １）ヒト全血１５ｍｌを２，０００ｒｐｍで１５分間遠
心する。 ２）血漿とバフィーコートを除去する。 ３）約２５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２、浸
透圧約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）で３回すすぐ。 ４）ＰＢＳを加え、ＲＢＣ（赤血球）濃度を５０万ＲＢ
Ｃ／μｌに調製する。 ５）ビーカーに上記のＲＢＣ懸濁液を１０ｍｌ入れる。 ６）ゆっくり撹拌しながら、１．２５％グルタールアル
デヒド溶液（２５％グルタールアルデヒドをＰＢＳで希
釈することにより調製）５ｍｌを上記ビーカーに加え
る。 ７）１時間室温で撹拌を続ける。 ８）遠心し、上清を除去する。 ９）沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳで３回すすぐ。 １０）ＰＢＳを加え、ＲＢＣ濃度を５０万ＲＢＣ／μｌ
に調製する。 １１）４００倍で鏡検し、ＲＢＣの形状が良いことを確
認する。
心する。 ２）血漿とバフィーコートを除去する。 ３）約２５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２、浸
透圧約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ）で３回すすぐ。 ４）ＰＢＳを加え、ＲＢＣ（赤血球）濃度を５０万ＲＢ
Ｃ／μｌに調製する。 ５）ビーカーに上記のＲＢＣ懸濁液を１０ｍｌ入れる。 ６）ゆっくり撹拌しながら、１．２５％グルタールアル
デヒド溶液（２５％グルタールアルデヒドをＰＢＳで希
釈することにより調製）５ｍｌを上記ビーカーに加え
る。 ７）１時間室温で撹拌を続ける。 ８）遠心し、上清を除去する。 ９）沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳで３回すすぐ。 １０）ＰＢＳを加え、ＲＢＣ濃度を５０万ＲＢＣ／μｌ
に調製する。 １１）４００倍で鏡検し、ＲＢＣの形状が良いことを確
認する。
【００１６】（Ｂ）染色および測定の実施 （Ａ）で調製した固定化赤血球と生の赤血球を用いて、
以下の手順で染色と測定を行った。 １）３−エチル−２−［７−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１，３，５−ヘプタトリ
エニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド（上記i
i）の色素）をエチレングリコールに溶解し、８００、
４００、２００、１５０、１００、５０および０ｐｐｍ
濃度の染色液を調製する。 ２）（Ａ）で調製した固定化赤血球を含む試料９００μ
ｌに、各種濃度の染色液をそれぞれ１００μｌ加え、室
温で１０分間放置して予備染色する（したがって、予備
染色の濃度は上記各濃度の１／１０となる）。 ３）各調製液４００μｌを取り、各々生理食塩水１１６
０μｌ中に加える。 ４）３−ヘキシル−２−［３−（３−ヘキシル−２（３
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベ
ンズオキサゾリウム・アイオダイド（ＤｉＯＣ６
（３）：上記 i）の色素）をエチレングリコールに溶解
して４００ｐｐｍとし、この染色液を工程３）で調製し
た各試料に４０μｌずつ加え、３５℃で３０秒間インキ
ュベートする。 ５）アルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）を光源
とするフローサイトメータにて、各細胞の前方散乱光と
側方蛍光を測定する。 ６）縦軸に前方散乱光強度、横軸に側方蛍光強度とした
分散図を作成する。 ７）一方、対照として、固定化しない生の赤血球は予備
染色を行わず、工程４）の染色液で染色し、これを用い
て同様の分散図を作成する。
以下の手順で染色と測定を行った。 １）３−エチル−２−［７−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１，３，５−ヘプタトリ
エニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド（上記i
i）の色素）をエチレングリコールに溶解し、８００、
４００、２００、１５０、１００、５０および０ｐｐｍ
濃度の染色液を調製する。 ２）（Ａ）で調製した固定化赤血球を含む試料９００μ
ｌに、各種濃度の染色液をそれぞれ１００μｌ加え、室
温で１０分間放置して予備染色する（したがって、予備
染色の濃度は上記各濃度の１／１０となる）。 ３）各調製液４００μｌを取り、各々生理食塩水１１６
０μｌ中に加える。 ４）３−ヘキシル−２−［３−（３−ヘキシル−２（３
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベ
ンズオキサゾリウム・アイオダイド（ＤｉＯＣ６
（３）：上記 i）の色素）をエチレングリコールに溶解
して４００ｐｐｍとし、この染色液を工程３）で調製し
た各試料に４０μｌずつ加え、３５℃で３０秒間インキ
ュベートする。 ５）アルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）を光源
とするフローサイトメータにて、各細胞の前方散乱光と
側方蛍光を測定する。 ６）縦軸に前方散乱光強度、横軸に側方蛍光強度とした
分散図を作成する。 ７）一方、対照として、固定化しない生の赤血球は予備
染色を行わず、工程４）の染色液で染色し、これを用い
て同様の分散図を作成する。
【００１７】得られた結果を図１に示す。図１のＡは生
の赤血球；Ｂは予備染色しない固定化赤血球；Ｃは５ｐ
ｐｍ濃度で予備染色した固定化赤血球；Ｄは１０ｐｐｍ
濃度で予備染色した固定化赤血球；Ｅは１５ｐｐｍ濃度
で予備染色した固定化赤血球；Ｆは２０ｐｐｍで予備染
色した固定化赤血球；Ｇは４０ｐｐｍ濃度で予備染色し
た固定化赤血球；Ｈは８０ｐｐｍ濃度で予備染色した固
定化赤血球の分散図である。予備染色を行わない固定化
赤血球は、生の赤血球に比較して蛍光が強すぎるが、約
１０〜２０ｐｐｍ濃度の予備染色を行った固定化赤血球
は生の赤血球とほぼ同じ位置に観察され、良好なコント
ロール物質として使用できることが明らかとなった。
の赤血球；Ｂは予備染色しない固定化赤血球；Ｃは５ｐ
ｐｍ濃度で予備染色した固定化赤血球；Ｄは１０ｐｐｍ
濃度で予備染色した固定化赤血球；Ｅは１５ｐｐｍ濃度
で予備染色した固定化赤血球；Ｆは２０ｐｐｍで予備染
色した固定化赤血球；Ｇは４０ｐｐｍ濃度で予備染色し
た固定化赤血球；Ｈは８０ｐｐｍ濃度で予備染色した固
定化赤血球の分散図である。予備染色を行わない固定化
赤血球は、生の赤血球に比較して蛍光が強すぎるが、約
１０〜２０ｐｐｍ濃度の予備染色を行った固定化赤血球
は生の赤血球とほぼ同じ位置に観察され、良好なコント
ロール物質として使用できることが明らかとなった。
【００１８】実施例２：固定化白血球の測定例 （Ａ）固定化白血球の調製 １）全血とモノ−ポリ分離液（大日本製薬（株））とを
１：１で混合し、室温で１，５００ｒｐｍ、２０分間遠
心する。 ２）分離した上層を、血小板を吸入しないように注意し
ながら採取する。 ３）採取した上層をＰＢＳで希釈し、８００ｒｐｍで１
０分間遠心した後、上清を除去する。この操作を３回繰
り返す。最後に１０ｍｌのＰＢＳに希釈する。 ４）ゆっくり撹拌しながら、１．２５％グルタールアル
デヒド溶液（２５％グルタールアルデヒドをＰＢＳで希
釈することにより調製）５ｍｌを上記ビーカーに加え
る。 ５）１時間室温で撹拌を続ける。 ６）遠心し、上清を除去する。 ７）沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳで３回すすいだ後、１０
ｍｌのＰＢＳに希釈して固定化白血球とする（１０００
ＷＢＣ／μｌ）。
１：１で混合し、室温で１，５００ｒｐｍ、２０分間遠
心する。 ２）分離した上層を、血小板を吸入しないように注意し
ながら採取する。 ３）採取した上層をＰＢＳで希釈し、８００ｒｐｍで１
０分間遠心した後、上清を除去する。この操作を３回繰
り返す。最後に１０ｍｌのＰＢＳに希釈する。 ４）ゆっくり撹拌しながら、１．２５％グルタールアル
デヒド溶液（２５％グルタールアルデヒドをＰＢＳで希
釈することにより調製）５ｍｌを上記ビーカーに加え
る。 ５）１時間室温で撹拌を続ける。 ６）遠心し、上清を除去する。 ７）沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳで３回すすいだ後、１０
ｍｌのＰＢＳに希釈して固定化白血球とする（１０００
ＷＢＣ／μｌ）。
【００１９】（Ｂ）染色および測定の実施 （Ａ）で調製した固定化白血球と生の白血球を用いて、
以下の手順で染色と測定を行った。 １）３−エチル−２−［７−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１，３，５−ヘプタトリ
エニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド（上記i
i）の色素）をエチレングリコールに溶解し、８００、
４００、２００、１００、７５、５０および０ｐｐｍ濃
度の染色液を調製する。 ２）（Ａ）で調製した固定化白血球を含む試料９００μ
ｌに、各種濃度の染色液をそれぞれ１００μｌ加え、室
温で１０分間放置して予備染色する（したがって、予備
染色の濃度は上記各濃度の１／１０となる）。 ３）各調製液４００μｌを取り、各々生理食塩水１１６
０μｌ中に加える。 ４）３−ヘキシル−２−［３−（３−ヘキシル−２（３
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベ
ンズオキサゾリウム・アイオダイド（ＤｉＯＣ６
（３）：上記 i）の色素）をエチレングリコールに溶解
して４００ｐｐｍとし、この染色液を工程３）で調製し
た各試料に４０μｌずつ加え、３５℃で３０秒間インキ
ュベートする。 ５）アルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）を光源
とするフローサイトメータにて、各細胞の前方散乱光と
側方蛍光を測定する。 ６）縦軸に前方散乱光強度、横軸に側方蛍光強度とした
分散図を作成する。 ７）一方、対照として、固定化しない生の白血球は予備
染色を行わず、工程４）の染色液で染色し、これを用い
て同様の分散図を作成する。
以下の手順で染色と測定を行った。 １）３−エチル−２−［７−（３−エチル−２（３Ｈ）
−ベンズオキサゾリリデン）−１，３，５−ヘプタトリ
エニル］ベンズオキサゾリウム・アイオダイド（上記i
i）の色素）をエチレングリコールに溶解し、８００、
４００、２００、１００、７５、５０および０ｐｐｍ濃
度の染色液を調製する。 ２）（Ａ）で調製した固定化白血球を含む試料９００μ
ｌに、各種濃度の染色液をそれぞれ１００μｌ加え、室
温で１０分間放置して予備染色する（したがって、予備
染色の濃度は上記各濃度の１／１０となる）。 ３）各調製液４００μｌを取り、各々生理食塩水１１６
０μｌ中に加える。 ４）３−ヘキシル−２−［３−（３−ヘキシル−２（３
Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）−１−プロペニル］ベ
ンズオキサゾリウム・アイオダイド（ＤｉＯＣ６
（３）：上記 i）の色素）をエチレングリコールに溶解
して４００ｐｐｍとし、この染色液を工程３）で調製し
た各試料に４０μｌずつ加え、３５℃で３０秒間インキ
ュベートする。 ５）アルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）を光源
とするフローサイトメータにて、各細胞の前方散乱光と
側方蛍光を測定する。 ６）縦軸に前方散乱光強度、横軸に側方蛍光強度とした
分散図を作成する。 ７）一方、対照として、固定化しない生の白血球は予備
染色を行わず、工程４）の染色液で染色し、これを用い
て同様の分散図を作成する。
【００２０】得られた結果を図２に示す。図２のＡは生
の白血球；Ｂは予備染色しない固定化白血球；Ｃは５ｐ
ｐｍ濃度で予備染色した固定化白血球；Ｄは７．５ｐｐ
ｍ濃度で予備染色した固定化白血球；Ｅは１０ｐｐｍ濃
度で予備染色した固定化白血球；Ｆは２０ｐｐｍで予備
染色した固定化白血球；Ｇは４０ｐｐｍ濃度で予備染色
した固定化白血球；Ｈは８０ｐｐｍ濃度で予備染色した
固定化白血球の分散図である。予備染色を行わない固定
化白血球は、生の白血球に比較して蛍光が強すぎるが、
約５〜１０ｐｐｍ濃度の予備染色を行った固定化白血球
は生の白血球とほぼ同じ位置に観察され、良好なコント
ロール物質として使用できることが明らかとなった。
の白血球；Ｂは予備染色しない固定化白血球；Ｃは５ｐ
ｐｍ濃度で予備染色した固定化白血球；Ｄは７．５ｐｐ
ｍ濃度で予備染色した固定化白血球；Ｅは１０ｐｐｍ濃
度で予備染色した固定化白血球；Ｆは２０ｐｐｍで予備
染色した固定化白血球；Ｇは４０ｐｐｍ濃度で予備染色
した固定化白血球；Ｈは８０ｐｐｍ濃度で予備染色した
固定化白血球の分散図である。予備染色を行わない固定
化白血球は、生の白血球に比較して蛍光が強すぎるが、
約５〜１０ｐｐｍ濃度の予備染色を行った固定化白血球
は生の白血球とほぼ同じ位置に観察され、良好なコント
ロール物質として使用できることが明らかとなった。
【図１】生の赤血球、および各種濃度で予備染色した固
定化赤血球を、前方散乱光強度と側方蛍光強度で表した
分散図である。
定化赤血球を、前方散乱光強度と側方蛍光強度で表した
分散図である。
【図２】生の白血球、および各種濃度で予備染色した固
定化白血球を、前方散乱光強度と側方蛍光強度で表した
分散図である。
定化白血球を、前方散乱光強度と側方蛍光強度で表した
分散図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 染色に使用される蛍光色素が結合するの
を阻害し、かつ前記蛍光色素と蛍光波長の異なる蛍光強
度調整剤を予め結合した粒子。 - 【請求項２】 前記粒子が細胞である請求項１記載の粒
子。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の粒子を用いて、
少なくとも蛍光パラメータを検出する粒子分析装置の精
度管理またはキャリブレーションを行う方法。 - 【請求項４】 蛍光色素で染色する前に、前記蛍光色素
が結合するのを阻害し、かつ前記蛍光色素と蛍光波長の
異なる蛍光強度調整剤を粒子に予め結合する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8081670A JPH09274035A (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | コントロール物質およびその染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8081670A JPH09274035A (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | コントロール物質およびその染色方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09274035A true JPH09274035A (ja) | 1997-10-21 |
Family
ID=13752788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8081670A Pending JPH09274035A (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | コントロール物質およびその染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09274035A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007047154A (ja) * | 2005-07-12 | 2007-02-22 | Sysmex Corp | 粒子分析装置用標準物質 |
| JP2008261707A (ja) * | 2007-04-11 | 2008-10-30 | Toyota Motor Corp | 合成樹脂の劣化度測定法 |
| EP1744145B1 (en) * | 2005-07-12 | 2015-09-09 | Sysmex Corporation | Standard material for particle analyzer |
| JP2016070833A (ja) * | 2014-09-30 | 2016-05-09 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置における異常判定方法、分析装置における精度管理方法、および粒子分析装置 |
| WO2017110435A1 (ja) * | 2015-12-25 | 2017-06-29 | リオン株式会社 | 生物粒子計数器の校正方法および生物粒子計数器の校正装置 |
-
1996
- 1996-04-03 JP JP8081670A patent/JPH09274035A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007047154A (ja) * | 2005-07-12 | 2007-02-22 | Sysmex Corp | 粒子分析装置用標準物質 |
| EP1744145B1 (en) * | 2005-07-12 | 2015-09-09 | Sysmex Corporation | Standard material for particle analyzer |
| US9658197B2 (en) | 2005-07-12 | 2017-05-23 | Sysmex Corporation | Standard material for a particle analyzer |
| JP2008261707A (ja) * | 2007-04-11 | 2008-10-30 | Toyota Motor Corp | 合成樹脂の劣化度測定法 |
| JP2016070833A (ja) * | 2014-09-30 | 2016-05-09 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置における異常判定方法、分析装置における精度管理方法、および粒子分析装置 |
| WO2017110435A1 (ja) * | 2015-12-25 | 2017-06-29 | リオン株式会社 | 生物粒子計数器の校正方法および生物粒子計数器の校正装置 |
| JP2017112922A (ja) * | 2015-12-25 | 2017-06-29 | リオン株式会社 | 生物粒子計数器の校正方法および生物粒子計数器の校正装置 |
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