JPH09218199A

JPH09218199A - 免疫検定法の技術を利用する重合体の同定および定量方法

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Publication number: JPH09218199A
Application number: JP9017683A
Authority: JP
Inventors: Lorraine Holowach Keller; ロレイン・ホロワチ・ケラー; Barry Weinstein; バリー・ヴァインステイン
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1996-01-18
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 1997-08-19
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: SG60035A1; CN1165298A; TW454088B; MX9700286A; JP3776543B2; EP0785431A1; DE69712805T2; BR9700705A; PL318010A1; ZA97248B; CN1144045C; NO970167D0; DE69712805D1; AU1016397A; US6197522B1; AU705491B2; CA2195288A1; NO970167L; EP0785431B1

Abstract

(57)【要約】【課題】感度が高く、選択的な免疫学的検定法を使用
して、標識を検出することにより重合体の濃度を検出す
るための容易かつ効率的な方法の提供。【解決手段】水性系中の重合体を同定および定量する
方法であって、前記重合体の少なくとも１部は、連鎖移
動剤、開始剤（またはそれの断片）、および連鎖移動剤
に結合した基から選ばれた検出可能な末端を含有してお
り、前記方法は、（ａ）試験される水性系の試料を得
て、そして前記試料を適当なモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体とインキュベートし、そして（ｂ）
前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結
合の程度を検出および測定して水性系中の重合体を同定
し、重合体濃度を決定する、工程を含む、前記の水性系
中の重合体を同定および定量する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、免疫学的検定法の技術を利用す
ることによって水性系中の重合体を同定および定量する
方法に関する。特に、モノクローナル抗体（monoclonal
antibodies（ＭＡｂｓ））が、重合プロセスを開始す
るのに使用された開始剤（またはその断片）；検定され
る重合体を製造するために重合プロセスにおいて使用さ
れた連鎖移動剤；または連鎖移動剤に結合させることが
できる官能基；に対して生産される。また、本発明は、
これらのＭＡｂｓを発現させる新規なハイブリドーマ
（hybridomas）（不死化した細胞系（immortalized cel
l lines））に関する。特に、本発明は、水処理用途に
使用される重合体の濃度を決定するのに有用である。

【０００２】水溶性重合体は、多くの水性系において、
例えば、無機物分散剤として；ボイラー水用、冷却塔
用、逆浸透膜装置用、砂糖精製用、紙製造用、地熱プロ
セス用、および油井用の水処理添加剤として；そしてビ
ルダーとして作用する洗剤添加剤、抗皮膜形成剤、分散
剤、金属封鎖剤、およびエンクルステーション防止剤
（encrustation inhibitors）として使用される。これ
らのタイプの用途においては、重合体は、無機物または
他の物質と錯体となって水からこれらの物質を除去し、
例えば水処理用途において腐食および無機物の堆積〔ス
ケール〕を防止する。経時により重合体の錯体化部位が
飽和されると、重合体は不活性化または分解されるの
で、活性の重合体を更に添加しなければならない。活性
な重合体の不足は溶解した無機物による水処理の不良を
生じ、激しい腐食およびスケール堆積を生じ、また必要
な活性重合体濃度より高い濃度に維持することはコスト
高になりかつ非効率であるので重合体の追加は水処理に
おいて特に重要である。それ故、追加の重合体を添加す
べきか、否かを決定するために、いろいろな時において
系内の重合体濃度を容易に検出できることが望ましい。

【０００３】水性系中の重合体を検出するのに伴う問題
の１つは、従来の検出方法例えば比色分析法または蛍光
分析法における感度の不足である。なぜなら、一般的
に、重合体は、５００ｐｐｍから５ｐｐｍ未満のような
非常に低レベルにおいて存在しているからである。水性
系中の重合体を検出するのに伴う他の問題は、検出方法
が、しばしば、選択性に欠けており、かつ重合体以外の
他水性系の成分のために正確でない結果を与えることで
ある。

【０００４】これらの問題を克服するための試みには、
生成物重合体の部分に対してＭＡｂｓを生産し、次いで
これらのＭＡｂｓを使用して、免疫学的検定法の技術を
用いて生成物重合体の存在または濃度を検出する方法が
含まれている。そのような方法は、例えば欧州特許第５
４０３１４Ａ１号〔ベテグローブ等（Wetegrove,et a
l.）〕、同第５３５３４７Ａ２号〔ベテグローブ等（We
tegrove,et al.）〕、および同第５５９２４９Ａ１号
〔ウェザーバイ等（Weatherby,et al.）〕に開示されか
つ議論されている。これら方法の全てにおいて、ＭＡｂ
ｓは、重合体上の選ばれた部位に結合するが、ＭＡｂｓ
と重合体の具体的な部位との間の１対１の対応は、重合
体鎖中に多くの繰り返し単位が存在するためうまくとる
ことができない。更に、重合体は鎖長が変化しているの
で、各重合体に結合しているＭＡｂｓの数に変動があ
る。それ故、ＭＡｂ：重合体濃度の比の決定はバッチに
依存し（例えば、この比は、製造された重合体の具体的
なバッチにより変化する）、そしてそのような測定の正
確度は比較的大きく変化する。

【０００５】ＰＣＴＵＳ９４／０９２６４〔ガーナー等
（Garner,et al.）〕には、後で同定するために生成物
に印をつける方法が開示されている。この方法には、低
分子量のハプテン（hapten）を生産し、そのようなハプ
テンを担体化合物に共有結合的に結合し、そしてそのよ
うなハプテンで標識された化合物を生成物と結合させて
その結果ハプテンが免疫学的検定の技術を用いて後で検
出できるマーカー（marker）として利用できる方法が包
含されている。担体化合物は重合体であることができ、
ハプテンは、既に生成した重合体に付けられるか、また
はハプテンを重合前の単量体に付けることができる。こ
の方法において有用なことは、ハプテン−標識化合物
（マーカー化合物）が、生成物に有害でなく、生成物に
関して不活性であり、そして生成物と既に結合していな
いことである。一般的に、マーカー化合物は、マーカー
化合物と生成物とを混合することによって生成物と一緒
にしておくが、生成物の包体中に存在してもよくまたは
標識付けして存在してもよい。

【０００６】ガーナー等（Garner,et al.）には、「標
識のない化合物に対して一定の比でこの標識化合物を使
用することは、標識化合物を追跡することを可能にす
る」と開示されているが、彼らの方法の本質は、生成物
が重合体である場合の生成物濃度の早くかつ便利な決定
を妨げている。ガーナー等には、ハプテンを既に生成し
た重合体、または重合前の単量体に結合させることが教
示されている。しかし、いずれの場合にも、ハプテン：
重合体の比を絶対的に決定することは可能ではない。な
ぜなら、各重合体の鎖の長さが一定ではなく、かつ各個
別の重合体の鎖に結合するハプテンの数が変動するから
である。それ故、ハプテン：重合体の比は、バッチに依
存し、重合体濃度の検出を困難にする。標準濃度曲線
は、標識重合体の各バッチについて得られなければなら
ない。系に添加された重合体が、前に添加した重合体と
同じバッチからの重合体でない場合には、検定のキャリ
ブレーションおよび正確度に影響がでる可能性がある。
そして、系における全重合体濃度は、ただ１つのバッチ
ではなく種々なバッチの重合体から組成されるであろう
から、検定のキャリブレーションおよび正確度に影響を
及ぼすかもしれない。

【０００７】発明の記述本発明により、水性系中の重合体を同定および定量する
方法であって、前記重合体の少なくとも１部は、連鎖移
動剤、開始剤または開始剤断片、および連鎖移動剤に結
合した基から選ばれた検出可能な末端を含有しており、
前記方法は、（ａ）検出可能な末端にモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体を生産し、（ｂ）試験され
る水性系の試料を得て、そして前記試料を前記モノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体とインキュベート
し（incubating）、そして（ｃ）前記モノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体の結合の程度を検出および
測定して前記水性系中の重合体を同定し、重合体濃度を
決定する工程を含む、前記の水性系中の重合体を同定お
よび定量する方法が提供される。

【０００８】発明の詳細本明細書に使用されているような次の用語は、文脈が明
らかに別のことを示していなければ、次の定義を有して
いる。用語「免疫原性の抗原（immunogenic antige
n）」または用語「免疫原性の分子（immunogenic molec
ule）」は、機能的免疫系（functioning immune syste
m）を有する動物の中に導入したときに、免疫の状態に
導く免疫応答を顕現させる物質を言及している。用語
「抗原決定基（antigenic determinant）」または用語
「エピトープ（epitope）」は、特定の抗体が認識する
免疫原性の分子の部分を言及している。用語「ハプテン
（hapten）」は、本質的には免疫原性ではないが、免疫
原性の分子上の抗原決定基の部分として利用できる低分
子量の分子である。すなわち、これらのハプテンが免疫
原性の抗原と最初にカップルした場合には、ハプテンと
具体的に結合するある種の部分を包含する、複合体の種
々の部分に対して抗体が形成されることができる。用語
「標識（tag）」は、モノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体を発生させた重合体鎖上の検出可能な末端
を言及している。ただし、検出可能な末端は、連鎖移動
剤、開始剤（またはその断片）、または連鎖移動剤に結
合した基、から選ばれる。そして重合体に関して使用さ
れた「標識または標識を付けた（tagged）」は、当該重
合体が標識を含んでいることを意味する。なお、特定し
た範囲は、特にことわりがなければ包含されるとして読
むべきである。

【０００９】連鎖移動剤が使用されるフリーラジカルに
よる重合方法において、重合反応は連鎖移動剤によって
停止される。かくて生成したラジカルは新しい重合体鎖
の始めとなる。アンチスカラント（anti-scalant）にお
いては典型的である低分子量（５０，０００未満）の重
合体の場合では一般的であるように、重合体の分枝の量
が限定されている場合には、連鎖移動剤：重合体鎖の比
は約１：１である。それ故、標識をつけた重合体の濃度
を検出する方法は、結果的に、系の中の重合体の全濃度
を直接決定することになる。本発明の方法は、感度が高
く、選択的な免疫学的検定法を使用して、標識を検出す
ることにより重合体の濃度を検出するためのそのような
容易かつ効率的な方法を提供する。

【００１０】水性系に使用される重合体の全てに標識を
付けることができる。また、特定の一部の重合体に標識
を付けることもできる。系における重合体の少量だけに
標識を付けることが好ましい。一部の重合体だけに標識
を付けた場合には、標識を付けない重合体は、標識を付
けた重合体と同じである必要はないが、しかし標識を付
けた重合体の減少の割合が系全部の減少の割合を正確に
反映するように、標識を付けない重合体および標識を付
けた重合体が系の中で同じように行動することが好まし
い。

【００１１】本発明の標識を付けた重合体は、連鎖移動
剤と重合可能な任意のタイプでありえ、典型的にはビニ
ル重合体である。本発明の標識を付けた重合体が、水処
理用重合体を検出するために使用される場合の本発明の
態様においては、ポリカルボン酸の重合体または共重合
体、特にアクリレート重合体およびそれらの誘導体、を
使用することが好ましい。特に有用なアクリレート重合
体には、１分子につき３−５個の炭素原子を含有するエ
チレン性不飽和モノカルボン酸の単量体、および１分子
につき４−８個の炭素原子を含有するエチレン性不飽和
ジカルボン酸の単量体、それらのアルカリ金属塩および
アンモニウム塩、およびシスージカルボン酸の無水物か
ら造られた重合体および共重合体が包含される。モノカ
ルボン酸の例には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル
酢酸、クロトン酸、およびアクリルオキシプロピオン酸
が包含されるが、これらに限定されない。これらの中で
は、アクリル酸およびメタクリル酸が好ましい。適当な
ジカルボン酸単量体の例には、マレイン酸、イタコン
酸、メサコン酸、フマル酸、シトラコン酸、テトラヒド
ロフタル酸、テトラヒドロフタル酸無水物、およびマレ
イン酸無水物が包含されるが、これらに限定されない。
ジカルボン酸無水物の中では、マレイン酸無水物が好ま
しい。

【００１２】出発重合体は、重合体が水溶性である限
り、酸を含まないモノエチレン性不飽和単量体を７０重
量％以下の量含んでもよい。そのような他の単量体に
は、アクリル酸またはメタクリル酸のアルキルエステ
ル、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アク
リル酸ブチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチ
ル、メタクリル酸ブチル、およびメタクリル酸イソブチ
ル；アクリル酸またはメタクリル酸のヒドロキシアルキ
ルエステル、例えばアクリル酸ヒドロキシエチル、アク
リル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ヒドロキシエ
チル、およびメタクリル酸ヒドロキシプロピル；他のタ
イプのアクリレートまたはメタクリレート、例えば（メ
タ）アクリル酸２−スルホエチル、（メタ）アクリル酸
３−スルホプロピル、（メタ）アクリル酸２−スルファ
トエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチル、およびメ
タクリル酸ホスホエチル；アクリルアミドおよびアルキ
ル置換アクリルアミド、例えばメタクリルアミド、ｔ−
ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミ
ド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、および３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピ
ルアクリルアミド；アクリロニトリル類、例えばメタク
リロニトリル；アリルアルコール；アリルスルホン酸；
アリルホスホン酸；ビニルホスホン酸；２−ビニルピリ
デン；４−ビニルピリデン；Ｎ−ビニルピロリドン；Ｎ
−ビニルホルムアミド；Ｎ−ビニルイミダゾール；Ｎ−
アクリロモルホリン；アクロレイン；エチレングリコー
ルジアクリレート；トリメチロールプロパントリアクリ
レート；ジアリルフタレート；酢酸ビニル；スチレン；
ビニルスルホン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、および２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸；メ
タリルスルホネートおよび１−アリルオキシ−２−ヒド
ロキシプロピルスルホネート（ＣＯＰＳ、登録商標）；
アクリルアミドグリコール酸；および前記の塩、が包含
されるが、これに限定されない。

【００１３】出発重合体は、最も好ましくはポリアクリ
ル酸、またはアクリル酸とマレイン酸または無水マレイ
ン酸との共重合体である。更に、出発重合体または共重
合体の数平均分子量（Ｍｎ）は、５００−１００，００
０、更に好ましくは１０００−５０，０００、および最
も好ましくは２０００−２５，０００である。

【００１４】重合体組成物の分子量を調節するのに有用
な任意の連鎖移動剤を本発明における標識として使用で
きる。そのような連鎖移動剤には、メルカプタン、ホス
フィネート、ホスホネート、スルフィン酸（例えば、フ
ェニルスルフイン酸およびｐ−トルエンスルフィン酸）
およびアミン−チオールが包含されるが、これらに限定
されない。適当なホスフィネートには、米国特許第５，
２９４，３７１号〔クルブレイ等（Clubley,et al.）〕
の式Ｉ（第１欄）の化合物として開示されたホスフィネ
ートおよび米国特許第５，３７６，７３１号〔ケラー等
（Kerr,et al.）〕の式ＩＩＩ（第４欄）の化合物とし
て開示されたホスフィネートが包含され、そして適当な
アミン−チオールには、米国特許第５，２９８，５８５
号〔マッカラム等（McCallum,et al.）〕に開示された
タイプのアミン−チオールが包含される。これらの３つ
の特許は、該特許が連鎖移動剤のこれらのタイプおよび
これらの製造方法を記載している部分に関し本明細書の
記載の一部として参照される。連鎖移動剤として、シス
テイン（ＣＹＳ）、アミノエタンチオール（ＡＥＴ）、
またはフェニルホスフィン酸（ＰＰＡ）を使用すること
が好ましい。

【００１５】フリーラジカルによる付加重合を開始させ
るのに有用な任意の開始剤または開始剤断片を、本発明
における標識として使用することができる。そのような
開始剤または開始剤断片には、パーオキシエステル、例
えば過安息香酸ｔ−ブチルおよびパーオキシ安息香酸ｔ
−アミル；ジアルキルパーオキサイド、例えばジクミル
パーオキサイド；ジアシルパーオキサイド、例えばベン
ゾイルパーオキサイド；ヒドロパーオキサイド、例えば
クメンヒドロパーオキサイド；アゾ化合物、例えば２−
フェニルアゾ−４−メトキシ−２，４−ジメチル−バレ
ロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチル−Ｎ−フ
ェニルプロピオンアミジンジハイドロクロライド、２，
２’−アゾビス−２（Ｎ−（４−クロロフェニル）−２
−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド、
２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾ
リン−２−イル）プロパン）ジハイドロクロライド、お
よび２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２
−イル）プロパン）ジハイドロクロライドが包含される
が、これらに限定されない。

【００１６】標識が連鎖移動剤に結合した基である場合
には、選択される連鎖移動剤はアミン−チオ−ル、特に
ＣＹＳまたはＡＥＴである。そのような連鎖移動剤に結
合することができる基は、特に所望の基と反応するが重
合体の他の部分と反応しない基である。連鎖移動剤がペ
ンダントアミンを含有しているときは、標識として、そ
れらにアミン反応性基を結合させることが好ましい。好
ましいアミン反応性基には、1−（ジメチルアミノ）−
５−ナフタレンスルホン酸およびそのハロゲン化物〔ダ
ンシル（dansyl）〕；４−ジメチルアミノアゾベンゼン
−４−スルホン酸およびそのハロゲン化物〔ダブシル
（dabsyl）〕；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホ
ン酸およびその塩（ＴＮＴ）；３−べンゾイルキノリン
−２−カルボキシアルデヒド；３ー（２ーフルホイル（f
urfoyl））キノリンー２ーカルボキシアルデヒド；２，
４−ジニトロフルオロベンゼン〔サンガ−試薬（Sange
r'sreagent）〕；およびニンヒドリンが包含されるが、
これらに限定されない。特に好ましい基には、ダンシ
ル、ダブシル、およびＴＮＴが含まれる。

【００１７】本発明のモノクロナール抗体およびポリク
ローナル抗体は、当業者に知られている技術によって生
産することができる。ポリクローナル抗体を生産するた
めの多くの技術が存在しているが、これらには、ビ、エ
イ、エル、ハーン（B.A.L.Hurn）およびエス、エム、チ
ャントラー（S.M.Chantler）「試薬抗体の生産（Produc
tion of Reagent Antibodies）」、Methods of Enzymol
ogy,70:104-142(1980)によって記載されているこれらの
技術が包含される。また、ＭＡｂｓを生産するための技
術は、最初に、Nature,265:495(1975)においてジ−、コ
ーラー（G.Kohler）およびシ−、ミルスタイン（C.Mils
tein）によって記載された。本発明の免疫検定法の技術
においてＭＡｂｓを使用することが好ましい。

【００１８】特定の標識に対して具体的にＭＡｂｓを生
産するために、最初に、標識および免疫原性担体の免疫
原性接合体（immunogenic cojugate）を、この接合体を
接種したマウスの中で生産する。１−３００日またはそ
れ以上の期間にわたって複数回の接種を行う。接種はい
くつかの経路の中の任意の経路を用いて行うことがで
き、それらには、１回の注射につき接合体の５−５０マ
イクログラム（μｇ）の投用量を用いる腹膜腔内注射、
静脈注射、または皮下注射が包含される。接合体は、単
独で注射してもよく、また接合体の免疫原性を増加させ
るために他の物質と組み合わせて注射してもよい。免疫
期間の終わりにおいて、脾臓からのリンパ球を集め、そ
して骨髄腫の腫瘍細胞と融合し、ハイブリドーマ（hybr
idomas）を生産する。次いで、これらのハイブリドーマ
を分離し、培養し、そして試験して、どのハイブリドー
マが標識のために必要な要件および親和性を有している
かを決定する。次いで、これらの選ばれたハイブリドー
マからのＭＡｂｓを当業者に知られている技術に従って
試験管内または生体内において生長させる。

【００１９】本発明のハイブリドーマには、スイスまた
はバルブ／シーマウス（Swissor Balb/c mice）の免疫
によって得られたハイブリッド１（Hybrid1）、ハイブ
リッド２（Hybrid2）、およびハイブリッド３（Hybrid
3）のハイブリドーマが包含される。これらのハイブリ
ドーマによって作り出されるＭＡｂｓは、１ｐｐｍの低
濃度において、ＰＰＡ単体、２−カルボキシプロピル−
（フェニル）ホスフィン酸（本質的には、ＰＰＡ＋ＡＡ
の１ユニット）、または標識を付けた重合体と反応する
が、標識を付けていない重合体（ＰＡＡ）とは殆どまた
は全く親和性がない。これらのＭＡｂｓは、本発明の免
疫学的検定法による検出法−これらには、直接サンドイ
ッチ、間接サンドイッチ、および競合的（competitiv
e）エリザ（ELISA）検定法が包含される−において使用
するのに適当である。直接サンドイッチエリザ（direct
sandwich ELISA）法を使用することが好ましい。

【００２０】競合的検定法においては、最初に抗原をプ
ラスチック支持体上に吸着させ、次いで遊離（結合して
いない）抗原を（通常は標準溶液から）加え、次いで抗
体を加え、次いで溶液をインキュベートする。インキュ
ベート期間の終わりにおいて溶液を洗い流したときに、
結合した抗原に結合した抗体だけが残留し、検出され
る。残留している抗体の濃度は、試料の中のハプテンの
濃度に反比例する。

【００２１】非競合的な検定法のためには、各々が抗原
について異なったエピトープに振り向けられる２種の異
なった抗体が用いられる。その１つの抗体は、抗原と結
合して固体マトリックスになり、そして第２の抗体は抗
原を検出し、そしてその濃度を測定するために振り向け
られる。直接サンドイッチ法においては、検出可能な標
識は、第２の抗体に直接結合される。一方間接サンドイ
ッチ法においては、第２の抗体が、それ自体、標識を付
けた免疫グロブリンを用いて測定される。

【００２２】標識のための必要な要件および選択性を有
するハイブリドーマ細胞によって発現されたＭＡｂｓ
（抗標識ＭＡｂｓ：anti-tag MAbs）は、本発明の免疫
学的検定法による検出方法に有用である。典型的には、
当業者に知られている技術に従って、適当なハイブリド
ーマ系を選択し、そしてこれらの系によって発現された
ＭＡｂｓを試薬として使用し、そして具体的な免疫学的
検定法のために最適化する。

【００２３】次の略字は、以下の実施例において使用さ
れる。Ｌ＝リットル；ｍＬ＝ミリリットル；μＬ＝マイ
クロリットル；ｇ＝グラム；μｇ＝マイクログラム；Ｍ
＝モル；ｍＭ＝ミリモル；ｒｐｍ＝毎分回転数；そして
ｎｍ＝ナノメーター。ＫＬＨ＝キーホールリンペット
ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）；ＢＳ
Ａ＝ウシ血清アルブミン；ＯＶＡ＝オボアルブミン；お
よびＡＰ＝アルカリ性ホスファターゼ。ＣＦＡ＝完全フ
ロイントアジュバント（Complete Freund's Adjuvan
t）；およびＩＦＡ＝不完全フロイントアジュバンド。
更に、次の試薬が、以下の実施例において使用された。
ＰＢＳ：１３．８ｍＭＮａＣｌ＋２．７ｍＭＫＣ
ｌ、ｐＨ７．４。１０×ＰＢＳ（１０Ｌ）：１３８ｍＭ
ＮａＣｌ（８００ｇ）＋２．７ｍＭＫＣｌ（２０
ｇ）＋４．２８ｍＭＮａＰＯ₄、二塩基性７Ｈ₂Ｏ（１
１５ｇ）＋１．４６ｍＭＫＰＯ₄（２０ｇ）、ｐＨ
７．２。ＰＴ（２０Ｌ）：１０×ＰＢＳ（２Ｌ）＋５％
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（２００ｍＬ）＋水（ｑ．
ｓ．）。ＰＣＴ（１Ｌ）：ＰＢＳ（９９０ｍＬ）＋カゼ
イン（１０ｇ）＋５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１
０ｍＬ）、ｐＨ７．２。組織培養培地（１Ｌ）：ウシ胎
児血清（１０％）＋Ｌ−グルタミン（１％）＋２−メル
カプタノール（６％）＋イスコブ変性ダルベッコ培地
（ｑ．ｓ．）（Iscove's modified Dulbecco's mediu
m）。ＴＭＢ：酸性緩衝液中の３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジン（０．４ｇ／Ｌ）。この段落中の
全ての％は容量によっている。

【００２４】実施例１免疫接合体の製造Ａ．ＴＮＴ−酵素接合体（ＤＮＰ−ＡＰ）の製造アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）に、種々な（重量／
重量）比においてＴＮＴ（ジニトロベンゼンスルホン
酸）の誘導体を加えることによって、ＴＮＴ−酵素接合
体を造った。未反応のハプテンは、緩衝液に対する詳細
な透析によって除去した。

【００２５】Ｂ．ＰＰＡ−ＰＡＡ−タンパク質接合体の
製造フェニルホスフィン酸（ＰＰＡ）変性重合体（ただし、
ＰＰＡは連鎖移動剤として使用されている）のアクリル
酸部分を、カルボジイミドの種々なモル比で活性化し、
次いでこれら活性化された重合体を担体タンパク質（Ｋ
ＬＨ、ＢＳＡ、ＯＶＡまたはＡＰから選ばれる）に種々
な（重量／重量）比で加えて、適当なＰＰＡ−ＰＡＡタ
ンパク質接合体を造った。未反応のハプテンは、ＰＢＳ
に対する詳細な透析によって除去した。また、比較目的
のために、ＰＰＡ−タンパク質接合体を類似の方法によ
り造った。

【００２６】実施例２ＭＡｂｓの製造次の免疫の計画案に従って、５匹のマウスの各グループ
について、実施例１Ｂの免疫接合体の１つを３ヶ月の期
間にわたり注射した。出産後約２ヶ月において、５匹の
スイスマウス（Swiss mice）から血を抜き取り（尾の静
脈からの血の抜き取り）、取った血液をため、そして血
清を検定した。約２週間後、塩水中においてＣＦＡ０．
１ｍＬの中に乳化した抗原（免疫接合体）０．１ｍＬの
混合物を、各マウスの腹膜腔の中に注射した。次いで、
２週間の間隔において、約３ヶ月間、塩水中の抗原の
０．１ｍＬの混合物をＩＦＡ０．１ｍＬの中に乳化し、
マウスの腹膜内に注射した。そして、抗体のレベルを監
視するために、血液試料を１ヶ月間隔で免疫期間の終結
まで採血した。

【００２７】免疫期間が終結したら、感作リンパ球を脾
臓から収集し、そして骨髄腫細胞と融合してハイブリド
ーマ細胞を生産した。多数の骨髄腫細胞系の任意のもの
が有用であるが、しかし好ましい細胞系は、Ｐ３×６３
Ａｇ８．６５３である。そのような融合の計画案は、当
業者に知られおり、例えば、キイアネイ等（Kearney,et
al.）によりJImmumol.,123:1548(1979)に記載されてい
る。簡単に述べれば、リンパ球および骨髄腫細胞が、あ
る期間の間、ポリエチレングリコールの存在において結
合し、培養され、そして抗原の種々な部分に対する要件
を試験した。

【００２８】実施例３ＭＡｂの要件の試験種々な末端基で標識を付けた重合体を用いて競合的検定
法を行った。システイン（cycteine）変性重合体のアミ
ノ末端をＴＮＢＳと反応させることによりＴＮＴ−ＣＹ
Ｓ−重合体（標識を付けた重合体）を造った。未反応の
ＴＮＢＳは、アミクロンマイクロコンセントレイター
〔Amicron（登録商標）microconcentrator〕を使用して
ダイアフィルトレーション（diafiltration）により除
去した。そのようなシステイン変性重合体（ただし、シ
ステインは連鎖移動剤として使用されている）は、前述
で参照したマッカラム等（McCallum et al.）に記載さ
れている。

【００２９】２つのプレートのイムロン（Immulon）
を、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の５μｇ／
ｍＬの精製した抗−ＴＮＴＭＡｂの１００μＬ／ウエル
（Ｗｅｌｌ）でおおい、そして４℃において１夜、また
は３７℃において１時間インキュベートした。インキュ
ベート後、これらのプレートをＰＴで３回洗い、１８０
°回転させ、さらにＰＴで３回洗った。この点におい
て、ＰＣＴの１２５μＬ／ウエルを加え、そして１２０
ｒｐｍに設定されたプレート振とう器上で室温において
１時間プレートをインキュベートした。インキュベート
後、プレートをＰＴで３回洗い、１８０°回転させ、さ
らにＰＴで３回洗った。種々な濃度のＴＮＴ−ＣＹＳ−
重合体、ＣＹＳ−ＰＡＡ、ＰＰＡ−ＰＡＡ、およびアキ
ュゾール〔Acusol(登録商標）〕の抑制溶液（inhibitio
n solution）を造り、そしてこれら抑制溶液の各々を、
ＤＮＰ−ＡＰの１：７５希釈液と同時にウエルに加え
た。次いで、プレートを、１２０ｒｐｍに設定されたプ
レート振とう器上で室温において１時間インキュベート
した。インキュベート後、これらのプレートをＰＴで３
回洗い、１８０°回転させ、さらにＰＴで３回洗った。
次いで、各ウエルに、ジエタノール基質緩衝液で希釈さ
れたｐ−ニトロフェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）の
１００μＬを加えた。次いで、これらのプレートを、１
２０ｒｐｍに設定されたプレート振とう器上で室温にお
いてさらに１５分間インキュベートした。最後に、これ
らのプレートを、４０５ｎｍに設定された蛍光分析計を
使用して分析した。

【００３０】図１は、この実験の結果を示している。描
かれたデーターは、ＴＮＴ−ＣＹＳ−ＰＡＡは、０．１
〜１０μｇ／ｍＬの範囲における濃度において容易に検
出可能であるが、一方、ＣＹＳ−ＰＡＡ、ＰＰＡ−ＰＡ
Ａ、およびアキュゾール４４５Ｎは同様の濃度において
最小の応答しか示さない。更に、図１のデータは、少な
くとも試験された濃度範囲においては、反応性と重合体
濃度との間には直線状の関係が存在することを示してい
る。

【図面の簡単な説明】

図１は、重合体の濃度（μｇ／ｍＬ）対反応性（阻害
％）を描いたグラフであり、そしてＴＮＴの標識を付け
た免疫学的検定法における種々な重合体の反応性を例証
している。グラフの中の記号は次の如くである： −◆−=ＴＮＴ−ＣＹＳ−ＰＡＡ −■−=ＣＹＳ−ＰＡＡ −▲−=ＰＰＡ−ＰＡＡ −Ｘ−=アキュゾール４４５Ｎ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バリー・ヴァインステインアメリカ合衆国ペンシルバニア州19025、ドレシャー、ブルーバード・レーン 419

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水性系中の重合体を同定および定量する
方法であって、前記重合体の少なくとも１部は、連鎖移
動剤、開始剤（またはそれの断片）、および連鎖移動剤
に結合した基から選ばれた検出可能な末端を含有してお
り、前記方法は、（ａ）試験される水性系の試料を得
て、そして前記試料を適当なモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体とインキュベートし、そして（ｂ）
前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結
合の程度を検出および測定して水性系中の重合体を同定
し、重合体濃度を決定する、工程を含む、前記の水性系
中の重合体を同定および定量する方法。
【請求項２】適当なモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体を、検出可能な末端に生産させる工程を更
に包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】検出可能な末端が、メルカプタン、ホス
フィン酸、ホスホン酸、スルフィン酸、アミノ−チオー
ル、およびそれらの塩、から成る群から選ばれた連鎖移
動剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】連鎖移動剤がアミノ−チオールを含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】検出可能な末端が、パーオキシエステ
ル、ジアルキルパーオキサイド、ジアシルパーオキサイ
ド、ハイドロパーオキサイド、およびアゾ化合物から成
る群から選ばれた開始剤または開始剤断片を含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項６】検出可能な末端が、連鎖移動剤に結合し
たアミン反応性基を含み、連鎖移動剤が、アミン−チオ
ールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】アミン反応性基が、１−（ジメチルアミ
ノ）−５−ナフタレンスルホン酸およびそのハロゲン化
物；４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４−スルホン酸
およびそのハロゲン化物；２，４，６−トリニトロベン
ゼンスルホン酸およびその塩；３−ベンゾイルキノリン
−２−カルボキシアルデヒド；３−（２−フルホイル）
キノリン−２−カルボキシアルデヒド；２，４−ジフル
オロニトロベンゼン；およびニンヒドリン、から選ばれ
る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】エリザ（ＥＬＩＳＡ）検定法を、モノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合の程度を
検出しそして測定するのに使用する、請求項１に記載の
方法。