JP3776543B2

JP3776543B2 - 免疫検定法の技術を利用する重合体の同定および定量方法

Info

Publication number: JP3776543B2
Application number: JP01768397A
Authority: JP
Inventors: ロレイン・ホロワチ・ケラー; バリー・ヴァインステイン
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1996-01-18
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2006-05-17
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: US6197522B1; EP0785431A1; CN1165298A; NO970167D0; ZA97248B; MX9700286A; PL318010A1; AU1016397A; NO970167L; DE69712805D1; DE69712805T2; CA2195288A1; JPH09218199A; CN1144045C; AU705491B2; BR9700705A; EP0785431B1; SG60035A1; TW454088B

Description

【０００１】
本発明は、免疫学的検定法の技術を利用することによって水性系中の重合体を同定および定量する方法に関する。特に、モノクローナル抗体（monoclonal antibodies（ＭＡｂｓ））が、重合プロセスを開始するのに使用された開始剤（またはその断片）；検定される重合体を製造するために重合プロセスにおいて使用された連鎖移動剤；または連鎖移動剤に結合させることができる官能基；に対して生産される。また、本発明は、これらのＭＡｂｓを発現させる新規なハイブリドーマ（hybridomas）（不死化した細胞系（immortalized cell lines））に関する。特に、本発明は、水処理用途に使用される重合体の濃度を決定するのに有用である。
【０００２】
水溶性重合体は、多くの水性系において、例えば、無機物分散剤として；ボイラー水用、冷却塔用、逆浸透膜装置用、砂糖精製用、紙製造用、地熱プロセス用、および油井用の水処理添加剤として；そしてビルダーとして作用する洗剤添加剤、抗皮膜形成剤、分散剤、金属封鎖剤、およびエンクルステーション防止剤（encrustation inhibitors）として使用される。これらのタイプの用途においては、重合体は、無機物または他の物質と錯体となって水からこれらの物質を除去し、例えば水処理用途において腐食および無機物の堆積〔スケール〕を防止する。経時により重合体の錯体化部位が飽和されると、重合体は不活性化または分解されるので、活性の重合体を更に添加しなければならない。活性な重合体の不足は溶解した無機物による水処理の不良を生じ、激しい腐食およびスケール堆積を生じ、また必要な活性重合体濃度より高い濃度に維持することはコスト高になりかつ非効率であるので重合体の追加は水処理において特に重要である。それ故、追加の重合体を添加すべきか、否かを決定するために、いろいろな時において系内の重合体濃度を容易に検出できることが望ましい。
【０００３】
水性系中の重合体を検出するのに伴う問題の１つは、従来の検出方法例えば比色分析法または蛍光分析法における感度の不足である。なぜなら、一般的に、重合体は、５００ｐｐｍから５ｐｐｍ未満のような非常に低レベルにおいて存在しているからである。水性系中の重合体を検出するのに伴う他の問題は、検出方法が、しばしば、選択性に欠けており、かつ重合体以外の他水性系の成分のために正確でない結果を与えることである。
【０００４】
これらの問題を克服するための試みには、生成物重合体の部分に対してＭＡｂｓを生産し、次いでこれらのＭＡｂｓを使用して、免疫学的検定法の技術を用いて生成物重合体の存在または濃度を検出する方法が含まれている。そのような方法は、例えば欧州特許第５４０３１４Ａ１号〔ベテグローブ等（Wetegrove,et al.）〕、同第５３５３４７Ａ２号〔ベテグローブ等（Wetegrove,et al.）〕、および同第５５９２４９Ａ１号〔ウェザーバイ等（Weatherby,et al.）〕に開示されかつ議論されている。これら方法の全てにおいて、ＭＡｂｓは、重合体上の選ばれた部位に結合するが、ＭＡｂｓと重合体の具体的な部位との間の１対１の対応は、重合体鎖中に多くの繰り返し単位が存在するためうまくとることができない。更に、重合体は鎖長が変化しているので、各重合体に結合しているＭＡｂｓの数に変動がある。それ故、ＭＡｂ：重合体濃度の比の決定はバッチに依存し（例えば、この比は、製造された重合体の具体的なバッチにより変化する）、そしてそのような測定の正確度は比較的大きく変化する。
【０００５】
ＰＣＴＵＳ９４／０９２６４〔ガーナー等（Garner,et al.）〕には、後で同定するために生成物に印をつける方法が開示されている。この方法には、低分子量のハプテン（hapten）を生産し、そのようなハプテンを担体化合物に共有結合的に結合し、そしてそのようなハプテンで標識された化合物を生成物と結合させてその結果ハプテンが免疫学的検定の技術を用いて後で検出できるマーカー（marker）として利用できる方法が包含されている。担体化合物は重合体であることができ、ハプテンは、既に生成した重合体に付けられるか、またはハプテンを重合前の単量体に付けることができる。この方法において有用なことは、ハプテン−標識化合物（マーカー化合物）が、生成物に有害でなく、生成物に関して不活性であり、そして生成物と既に結合していないことである。一般的に、マーカー化合物は、マーカー化合物と生成物とを混合することによって生成物と一緒にしておくが、生成物の包体中に存在してもよくまたは標識付けして存在してもよい。
【０００６】
ガーナー等（Garner,et al.）には、「標識のない化合物に対して一定の比でこの標識化合物を使用することは、標識化合物を追跡することを可能にする」と開示されているが、彼らの方法の本質は、生成物が重合体である場合の生成物濃度の早くかつ便利な決定を妨げている。ガーナー等には、ハプテンを既に生成した重合体、または重合前の単量体に結合させることが教示されている。しかし、いずれの場合にも、ハプテン：重合体の比を絶対的に決定することは可能ではない。なぜなら、各重合体の鎖の長さが一定ではなく、かつ各個別の重合体の鎖に結合するハプテンの数が変動するからである。それ故、ハプテン：重合体の比は、バッチに依存し、重合体濃度の検出を困難にする。標準濃度曲線は、標識重合体の各バッチについて得られなければならない。系に添加された重合体が、前に添加した重合体と同じバッチからの重合体でない場合には、検定のキャリブレーションおよび正確度に影響がでる可能性がある。そして、系における全重合体濃度は、ただ１つのバッチではなく種々なバッチの重合体から組成されるであろうから、検定のキャリブレーションおよび正確度に影響を及ぼすかもしれない。
【０００７】
発明の記述
本発明により、水性系中の重合体を同定および定量する方法であって、前記重合体の少なくとも１部は、連鎖移動剤、開始剤または開始剤断片、および連鎖移動剤に結合した基から選ばれた検出可能な末端を含有しており、前記方法は、（ａ）検出可能な末端にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生産し、（ｂ）試験される水性系の試料を得て、そして前記試料を前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とインキュベートし（incubating）、そして（ｃ）前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合の程度を検出および測定して前記水性系中の重合体を同定し、重合体濃度を決定する工程を含む、前記の水性系中の重合体を同定および定量する方法が提供される。
【０００８】
発明の詳細
本明細書に使用されているような次の用語は、文脈が明らかに別のことを示していなければ、次の定義を有している。
用語「免疫原性の抗原（immunogenic antigen）」または用語「免疫原性の分子（immunogenic molecule）」は、機能的免疫系（functioning immune system）を有する動物の中に導入したときに、免疫の状態に導く免疫応答を顕現させる物質を言及している。
用語「抗原決定基（antigenic determinant）」または用語「エピトープ（epitope）」は、特定の抗体が認識する免疫原性の分子の部分を言及している。用語「ハプテン（hapten）」は、本質的には免疫原性ではないが、免疫原性の分子上の抗原決定基の部分として利用できる低分子量の分子である。すなわち、これらのハプテンが免疫原性の抗原と最初にカップルした場合には、ハプテンと具体的に結合するある種の部分を包含する、複合体の種々の部分に対して抗体が形成されることができる。
用語「標識（tag）」は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を発生させた重合体鎖上の検出可能な末端を言及している。ただし、検出可能な末端は、連鎖移動剤、開始剤（またはその断片）、または連鎖移動剤に結合した基、から選ばれる。そして重合体に関して使用された「標識または標識を付けた（tagged）」は、当該重合体が標識を含んでいることを意味する。
なお、特定した範囲は、特にことわりがなければ包含されるとして読むべきである。
【０００９】
連鎖移動剤が使用されるフリーラジカルによる重合方法において、重合反応は連鎖移動剤によって停止される。かくて生成したラジカルは新しい重合体鎖の始めとなる。アンチスカラント（anti-scalant）においては典型的である低分子量（５０，０００未満）の重合体の場合では一般的であるように、重合体の分枝の量が限定されている場合には、連鎖移動剤：重合体鎖の比は約１：１である。それ故、標識をつけた重合体の濃度を検出する方法は、結果的に、系の中の重合体の全濃度を直接決定することになる。本発明の方法は、感度が高く、選択的な免疫学的検定法を使用して、標識を検出することにより重合体の濃度を検出するためのそのような容易かつ効率的な方法を提供する。
【００１０】
水性系に使用される重合体の全てに標識を付けることができる。また、特定の一部の重合体に標識を付けることもできる。系における重合体の少量だけに標識を付けることが好ましい。一部の重合体だけに標識を付けた場合には、標識を付けない重合体は、標識を付けた重合体と同じである必要はないが、しかし標識を付けた重合体の減少の割合が系全部の減少の割合を正確に反映するように、標識を付けない重合体および標識を付けた重合体が系の中で同じように行動することが好ましい。
【００１１】
本発明の標識を付けた重合体は、連鎖移動剤と重合可能な任意のタイプでありえ、典型的にはビニル重合体である。本発明の標識を付けた重合体が、水処理用重合体を検出するために使用される場合の本発明の態様においては、ポリカルボン酸の重合体または共重合体、特にアクリレート重合体およびそれらの誘導体、を使用することが好ましい。特に有用なアクリレート重合体には、１分子につき３−５個の炭素原子を含有するエチレン性不飽和モノカルボン酸の単量体、および１分子につき４−８個の炭素原子を含有するエチレン性不飽和ジカルボン酸の単量体、それらのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩、およびシスージカルボン酸の無水物から造られた重合体および共重合体が包含される。モノカルボン酸の例には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル酢酸、クロトン酸、およびアクリルオキシプロピオン酸が包含されるが、これらに限定されない。これらの中では、アクリル酸およびメタクリル酸が好ましい。適当なジカルボン酸単量体の例には、マレイン酸、イタコン酸、メサコン酸、フマル酸、シトラコン酸、テトラヒドロフタル酸、テトラヒドロフタル酸無水物、およびマレイン酸無水物が包含されるが、これらに限定されない。ジカルボン酸無水物の中では、マレイン酸無水物が好ましい。
【００１２】
出発重合体は、重合体が水溶性である限り、酸を含まないモノエチレン性不飽和単量体を７０重量％以下の量含んでもよい。そのような他の単量体には、アクリル酸またはメタクリル酸のアルキルエステル、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、およびメタクリル酸イソブチル；アクリル酸またはメタクリル酸のヒドロキシアルキルエステル、例えばアクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、およびメタクリル酸ヒドロキシプロピル；他のタイプのアクリレートまたはメタクリレート、例えば（メタ）アクリル酸２−スルホエチル、（メタ）アクリル酸３−スルホプロピル、（メタ）アクリル酸２−スルファトエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチル、およびメタクリル酸ホスホエチル；アクリルアミドおよびアルキル置換アクリルアミド、例えばメタクリルアミド、ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、および３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド；アクリロニトリル類、例えばメタクリロニトリル；アリルアルコール；アリルスルホン酸；アリルホスホン酸；ビニルホスホン酸；２−ビニルピリデン；４−ビニルピリデン；Ｎ−ビニルピロリドン；Ｎ−ビニルホルムアミド；Ｎ−ビニルイミダゾール；Ｎ−アクリロモルホリン；アクロレイン；エチレングリコールジアクリレート；トリメチロールプロパントリアクリレート；ジアリルフタレート；酢酸ビニル；スチレン；ビニルスルホン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、および２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸；メタリルスルホネートおよび１−アリルオキシ−２−ヒドロキシプロピルスルホネート（ＣＯＰＳ、登録商標）；アクリルアミドグリコール酸；および前記の塩、が包含されるが、これに限定されない。
【００１３】
出発重合体は、最も好ましくはポリアクリル酸、またはアクリル酸とマレイン酸または無水マレイン酸との共重合体である。更に、出発重合体または共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は、５００−１００，０００、更に好ましくは１０００−５０，０００、および最も好ましくは２０００−２５，０００である。
【００１４】
重合体組成物の分子量を調節するのに有用な任意の連鎖移動剤を本発明における標識として使用できる。そのような連鎖移動剤には、メルカプタン、ホスフィネート、ホスホネート、スルフィン酸（例えば、フェニルスルフイン酸およびｐ−トルエンスルフィン酸）およびアミン−チオールが包含されるが、これらに限定されない。適当なホスフィネートには、米国特許第５，２９４，３７１号〔クルブレイ等（Clubley,et al.）〕の式Ｉ（第１欄）の化合物として開示されたホスフィネートおよび米国特許第５，３７６，７３１号〔ケラー等（Kerr,et al.）〕の式ＩＩＩ（第４欄）の化合物として開示されたホスフィネートが包含され、そして適当なアミン−チオールには、米国特許第５，２９８，５８５号〔マッカラム等（McCallum,et al.）〕に開示されたタイプのアミン−チオールが包含される。これらの３つの特許は、該特許が連鎖移動剤のこれらのタイプおよびこれらの製造方法を記載している部分に関し本明細書の記載の一部として参照される。連鎖移動剤として、システイン（ＣＹＳ）、アミノエタンチオール（ＡＥＴ）、またはフェニルホスフィン酸（ＰＰＡ）を使用することが好ましい。
【００１５】
フリーラジカルによる付加重合を開始させるのに有用な任意の開始剤または開始剤断片を、本発明における標識として使用することができる。そのような開始剤または開始剤断片には、パーオキシエステル、例えば過安息香酸ｔ−ブチルおよびパーオキシ安息香酸ｔ−アミル；ジアルキルパーオキサイド、例えばジクミルパーオキサイド；ジアシルパーオキサイド、例えばベンゾイルパーオキサイド；ヒドロパーオキサイド、例えばクメンヒドロパーオキサイド；アゾ化合物、例えば２−フェニルアゾ−４−メトキシ−２，４−ジメチル−バレロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチル−Ｎ−フェニルプロピオンアミジンジハイドロクロライド、２，２’−アゾビス−２（Ｎ−（４−クロロフェニル）−２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド、２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジハイドロクロライド、および２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジハイドロクロライドが包含されるが、これらに限定されない。
【００１６】
標識が連鎖移動剤に結合した基である場合には、選択される連鎖移動剤はアミン−チオ−ル、特にＣＹＳまたはＡＥＴである。そのような連鎖移動剤に結合することができる基は、特に所望の基と反応するが重合体の他の部分と反応しない基である。連鎖移動剤がペンダントアミンを含有しているときは、標識として、それらにアミン反応性基を結合させることが好ましい。好ましいアミン反応性基には、1−（ジメチルアミノ）−５−ナフタレンスルホン酸およびそのハロゲン化物〔ダンシル（dansyl）〕；４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４−スルホン酸およびそのハロゲン化物〔ダブシル（dabsyl）〕；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸およびその塩（ＴＮＴ）；３−べンゾイルキノリン−２−カルボキシアルデヒド；３ー（２ーフルホイル（furfoyl））キノリンー２ーカルボキシアルデヒド；２，４−ジニトロフルオロベンゼン〔サンガ−試薬（Sanger's reagent）〕；およびニンヒドリンが包含されるが、これらに限定されない。特に好ましい基には、ダンシル、ダブシル、およびＴＮＴが含まれる。
【００１７】
本発明のモノクロナール抗体およびポリクローナル抗体は、当業者に知られている技術によって生産することができる。ポリクローナル抗体を生産するための多くの技術が存在しているが、これらには、ビ、エイ、エル、ハーン（B.A.L.Hurn）およびエス、エム、チャントラー（S.M.Chantler）「試薬抗体の生産（Production of Reagent Antibodies）」、Methods of Enzymology,70:104-142(1980)によって記載されているこれらの技術が包含される。また、ＭＡｂｓを生産するための技術は、最初に、Nature,265:495(1975)においてジ−、コーラー（G.Kohler）およびシ−、ミルスタイン（C.Milstein）によって記載された。本発明の免疫検定法の技術においてＭＡｂｓを使用することが好ましい。
【００１８】
特定の標識に対して具体的にＭＡｂｓを生産するために、最初に、標識および免疫原性担体の免疫原性接合体（immunogenic cojugate）を、この接合体を接種したマウスの中で生産する。１−３００日またはそれ以上の期間にわたって複数回の接種を行う。接種はいくつかの経路の中の任意の経路を用いて行うことができ、それらには、１回の注射につき接合体の５−５０マイクログラム（μｇ）の投用量を用いる腹膜腔内注射、静脈注射、または皮下注射が包含される。接合体は、単独で注射してもよく、また接合体の免疫原性を増加させるために他の物質と組み合わせて注射してもよい。免疫期間の終わりにおいて、脾臓からのリンパ球を集め、そして骨髄腫の腫瘍細胞と融合し、ハイブリドーマ（hybridomas）を生産する。次いで、これらのハイブリドーマを分離し、培養し、そして試験して、どのハイブリドーマが標識のために必要な要件および親和性を有しているかを決定する。次いで、これらの選ばれたハイブリドーマからのＭＡｂｓを当業者に知られている技術に従って試験管内または生体内において生長させる。
【００１９】
本発明のハイブリドーマには、スイスまたはバルブ／シーマウス（Swissor Balb/c mice）の免疫によって得られたハイブリッド１（Hybrid1）、ハイブリッド２（Hybrid2）、およびハイブリッド３（Hybrid3）のハイブリドーマが包含される。これらのハイブリドーマによって作り出されるＭＡｂｓは、１ｐｐｍの低濃度において、ＰＰＡ単体、２−カルボキシプロピル−（フェニル）ホスフィン酸（本質的には、ＰＰＡ＋ＡＡの１ユニット）、または標識を付けた重合体と反応するが、標識を付けていない重合体（ＰＡＡ）とは殆どまたは全く親和性がない。これらのＭＡｂｓは、本発明の免疫学的検定法による検出法−これらには、直接サンドイッチ、間接サンドイッチ、および競合的（competitive）エリザ（ELISA）検定法が包含される−において使用するのに適当である。直接サンドイッチエリザ（direct sandwich ELISA）法を使用することが好ましい。
【００２０】
競合的検定法においては、最初に抗原をプラスチック支持体上に吸着させ、次いで遊離（結合していない）抗原を（通常は標準溶液から）加え、次いで抗体を加え、次いで溶液をインキュベートする。インキュベート期間の終わりにおいて溶液を洗い流したときに、結合した抗原に結合した抗体だけが残留し、検出される。残留している抗体の濃度は、試料の中のハプテンの濃度に反比例する。
【００２１】
非競合的な検定法のためには、各々が抗原について異なったエピトープに振り向けられる２種の異なった抗体が用いられる。その１つの抗体は、抗原と結合して固体マトリックスになり、そして第２の抗体は抗原を検出し、そしてその濃度を測定するために振り向けられる。直接サンドイッチ法においては、検出可能な標識は、第２の抗体に直接結合される。一方間接サンドイッチ法においては、第２の抗体が、それ自体、標識を付けた免疫グロブリンを用いて測定される。
【００２２】
標識のための必要な要件および選択性を有するハイブリドーマ細胞によって発現されたＭＡｂｓ（抗標識ＭＡｂｓ：anti-tag MAbs）は、本発明の免疫学的検定法による検出方法に有用である。典型的には、当業者に知られている技術に従って、適当なハイブリドーマ系を選択し、そしてこれらの系によって発現されたＭＡｂｓを試薬として使用し、そして具体的な免疫学的検定法のために最適化する。
【００２３】
次の略字は、以下の実施例において使用される。Ｌ＝リットル；ｍＬ＝ミリリットル；μＬ＝マイクロリットル；ｇ＝グラム；μｇ＝マイクログラム；Ｍ＝モル；ｍＭ＝ミリモル；ｒｐｍ＝毎分回転数；そしてｎｍ＝ナノメーター。ＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）；ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ＯＶＡ＝オボアルブミン；およびＡＰ＝アルカリ性ホスファターゼ。ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント（Complete Freund's Adjuvant）；およびＩＦＡ＝不完全フロイントアジュバンド。更に、次の試薬が、以下の実施例において使用された。ＰＢＳ：１３．８ｍＭＮａＣｌ＋２．７ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．４。１０×ＰＢＳ（１０Ｌ）：１３８ｍＭＮａＣｌ（８００ｇ）＋２．７ｍＭＫＣｌ（２０ｇ）＋４．２８ｍＭＮａＰＯ₄、二塩基性７Ｈ₂Ｏ（１１５ｇ）＋１．４６ｍＭＫＰＯ₄（２０ｇ）、ｐＨ７．２。ＰＴ（２０Ｌ）：１０×ＰＢＳ（２Ｌ）＋５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（２００ｍＬ）＋水（ｑ．ｓ．）。ＰＣＴ（１Ｌ）：ＰＢＳ（９９０ｍＬ）＋カゼイン（１０ｇ）＋５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１０ｍＬ）、ｐＨ７．２。組織培養培地（１Ｌ）：ウシ胎児血清（１０％）＋Ｌ−グルタミン（１％）＋２−メルカプタノール（６％）＋イスコブ変性ダルベッコ培地（ｑ．ｓ．）（Iscove's modified Dulbecco's medium）。ＴＭＢ：酸性緩衝液中の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（０．４ｇ／Ｌ）。この段落中の全ての％は容量によっている。
【００２４】
実施例１
免疫接合体の製造
Ａ．ＴＮＴ−酵素接合体（ＤＮＰ−ＡＰ）の製造
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）に、種々な（重量／重量）比においてＴＮＴ（ジニトロベンゼンスルホン酸）の誘導体を加えることによって、ＴＮＴ−酵素接合体を造った。未反応のハプテンは、緩衝液に対する詳細な透析によって除去した。
【００２５】
Ｂ．ＰＰＡ−ＰＡＡ−タンパク質接合体の製造
フェニルホスフィン酸（ＰＰＡ）変性重合体（ただし、ＰＰＡは連鎖移動剤として使用されている）のアクリル酸部分を、カルボジイミドの種々なモル比で活性化し、次いでこれら活性化された重合体を担体タンパク質（ＫＬＨ、ＢＳＡ、ＯＶＡまたはＡＰから選ばれる）に種々な（重量／重量）比で加えて、適当なＰＰＡ−ＰＡＡタンパク質接合体を造った。未反応のハプテンは、ＰＢＳに対する詳細な透析によって除去した。また、比較目的のために、ＰＰＡ−タンパク質接合体を類似の方法により造った。
【００２６】
実施例２
ＭＡｂｓの製造
次の免疫の計画案に従って、５匹のマウスの各グループについて、実施例１Ｂの免疫接合体の１つを３ヶ月の期間にわたり注射した。
出産後約２ヶ月において、５匹のスイスマウス（Swiss mice）から血を抜き取り（尾の静脈からの血の抜き取り）、取った血液をため、そして血清を検定した。約２週間後、塩水中においてＣＦＡ０．１ｍＬの中に乳化した抗原（免疫接合体）０．１ｍＬの混合物を、各マウスの腹膜腔の中に注射した。次いで、２週間の間隔において、約３ヶ月間、塩水中の抗原の０．１ｍＬの混合物をＩＦＡ０．１ｍＬの中に乳化し、マウスの腹膜内に注射した。そして、抗体のレベルを監視するために、血液試料を１ヶ月間隔で免疫期間の終結まで採血した。
【００２７】
免疫期間が終結したら、感作リンパ球を脾臓から収集し、そして骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を生産した。多数の骨髄腫細胞系の任意のものが有用であるが、しかし好ましい細胞系は、Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３である。そのような融合の計画案は、当業者に知られおり、例えば、キイアネイ等（Kearney,et al.）によりJImmumol.,123:1548(1979)に記載されている。簡単に述べれば、リンパ球および骨髄腫細胞が、ある期間の間、ポリエチレングリコールの存在において結合し、培養され、そして抗原の種々な部分に対する要件を試験した。
【００２８】
実施例３
ＭＡｂの要件の試験
種々な末端基で標識を付けた重合体を用いて競合的検定法を行った。
システイン（cycteine）変性重合体のアミノ末端をＴＮＢＳと反応させることによりＴＮＴ−ＣＹＳ−重合体（標識を付けた重合体）を造った。未反応のＴＮＢＳは、アミクロンマイクロコンセントレイター〔Amicron（登録商標）microconcentrator〕を使用してダイアフィルトレーション（diafiltration）により除去した。そのようなシステイン変性重合体（ただし、システインは連鎖移動剤として使用されている）は、前述で参照したマッカラム等（McCallum et al.）に記載されている。
【００２９】
２つのプレートのイムロン（Immulon）を、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの精製した抗−ＴＮＴＭＡｂの１００μＬ／ウエル（Ｗｅｌｌ）でおおい、そして４℃において１夜、または３７℃において１時間インキュベートした。インキュベート後、これらのプレートをＰＴで３回洗い、１８０°回転させ、さらにＰＴで３回洗った。この点において、ＰＣＴの１２５μＬ／ウエルを加え、そして１２０ｒｐｍに設定されたプレート振とう器上で室温において１時間プレートをインキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＴで３回洗い、１８０°回転させ、さらにＰＴで３回洗った。種々な濃度のＴＮＴ−ＣＹＳ−重合体、ＣＹＳ−ＰＡＡ、ＰＰＡ−ＰＡＡ、およびアキュゾール〔Acusol(登録商標）〕の抑制溶液（inhibition solution）を造り、そしてこれら抑制溶液の各々を、ＤＮＰ−ＡＰの１：７５希釈液と同時にウエルに加えた。次いで、プレートを、１２０ｒｐｍに設定されたプレート振とう器上で室温において１時間インキュベートした。インキュベート後、これらのプレートをＰＴで３回洗い、１８０°回転させ、さらにＰＴで３回洗った。次いで、各ウエルに、ジエタノール基質緩衝液で希釈されたｐ−ニトロフェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）の１００μＬを加えた。次いで、これらのプレートを、１２０ｒｐｍに設定されたプレート振とう器上で室温においてさらに１５分間インキュベートした。最後に、これらのプレートを、４０５ｎｍに設定された蛍光分析計を使用して分析した。
【００３０】
図１は、この実験の結果を示している。描かれたデーターは、ＴＮＴ−ＣＹＳ−ＰＡＡは、０．１〜１０μｇ／ｍＬの範囲における濃度において容易に検出可能であるが、一方、ＣＹＳ−ＰＡＡ、ＰＰＡ−ＰＡＡ、およびアキュゾール４４５Ｎは同様の濃度において最小の応答しか示さない。更に、図１のデータは、少なくとも試験された濃度範囲においては、反応性と重合体濃度との間には直線状の関係が存在することを示している。
【図面の簡単な説明】
図１は、重合体の濃度（μｇ／ｍＬ）対反応性（阻害％）を描いたグラフであり、そしてＴＮＴの標識を付けた免疫学的検定法における種々な重合体の反応性を例証している。グラフの中の記号は次の如くである：
−◆−=ＴＮＴ−ＣＹＳ−ＰＡＡ
−■−=ＣＹＳ−ＰＡＡ
−▲−=ＰＰＡ−ＰＡＡ
−Ｘ−=アキュゾール４４５Ｎ

Claims

水性系中の重合体を同定および定量する方法であって、前記重合体の少なくとも１部は、連鎖移動剤、開始剤（またはそれの断片）、および連鎖移動剤に結合した基から選ばれた検出可能な末端を含有しており、前記方法は、
（ａ）試験される水性系の試料を得て、そして前記試料を、前記検出可能な末端に対する特異性および選択性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とインキュベートし、そして
（ｂ）前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合の程度を検出および測定して水性系中の重合体を同定し、重合体濃度を決定する、
工程を含む、前記の水性系中の重合体を同定および定量する方法。
検出可能な末端に対する適当なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生産する工程を更に包含する、請求項１に記載の方法。
検出可能な末端が、メルカプタン、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルフィン酸、アミノ−チオール、およびそれらの塩、から成る群から選ばれた連鎖移動剤を含む、請求項１に記載の方法。
連鎖移動剤がアミノ−チオールを含む、請求項３に記載の方法。
検出可能な末端が、パーオキシエステル、ジアルキルパーオキサイド、ジアシルパーオキサイド、ハイドロパーオキサイド、およびアゾ化合物から成る群から選ばれた開始剤または開始剤断片を含む、請求項１に記載の方法。
検出可能な末端が、連鎖移動剤に結合したアミン反応性基を含み、連鎖移動剤が、アミン−チオールを含む、請求項１に記載の方法。
アミン反応性基が、１−（ジメチルアミノ）−５−ナフタレンスルホン酸およびそのハロゲン化物；４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４−スルホン酸およびそのハロゲン化物；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸およびその塩；３−ベンゾイルキノリン−２−カルボキシアルデヒド；３−（２−フルホイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド；２，４−ジフルオロニトロベンゼン；およびニンヒドリン、から選ばれる、請求項６に記載の方法。
エリザ（ＥＬＩＳＡ）検定法を、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合の程度を検出しそして測定するのに使用する、請求項１に記載の方法。