TWI586365B - 用於偵測對嗜吞噬細胞邊蟲(aph)及片狀邊蟲(apl)具專一性之抗體之組合物及方法 - Google Patents
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Description
本申請案主張在2008年10月8日提出申請之美國專利案第61/103,743號之權益,該案件全文以引用方式併入本文中。
邊蟲病發生於哺乳動物(包括,例如,人類、馬、綿羊、狗、貓、鹿、及反芻動物)中且係因粒細胞經蜱傳播因子嗜吞噬細胞邊蟲(「Aph」)(先前稱作馬埃裏希體(Ehrlichia equi))感染而造成的。常見臨床症狀包括發燒、昏睡、跛行、血小板減少、淋巴結腫脹、及厭食,所有該等症狀均為邊蟲病之非專一性症狀。因此,可用於正確診斷之專一性試驗係十分重要的。
片狀邊蟲(「Apl」)(先前稱作扁平埃裏希氏體(Ehrlichia platys))係密切相關的物種。Apl可造成感染性犬週期性血小板減少(ICCT)。經感染狗在美國通常無症狀但在世界其他部分可呈現臨床疾患。現行邊蟲血清測試由於顯著交叉反應性而不能區別該兩個物種。業內需要偵測Aph及Apl之方法及區別該兩種感染之方法。
在邊蟲病急性期期間出現的臨床症狀發作可能在出現可量測量之針對某些邊蟲抗原之抗體之前。因此,需要一種用於(例如)呈現急性邊蟲病臨床症狀之哺乳動物之Aph感染、Apl感染或二者的迅速、靈敏及可靠的免疫測試。
本發明一個實施例提供一種包含一或多種經純化多肽之組合物,該(等)經純化多肽係由如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列所組成;或由SEQ ID NO:10之胺基酸1至45、SEQ ID NO:10之胺基酸41至89、SEQ ID NO:10之胺基酸85至130、SEQ ID NO:10之胺基酸126至160、SEQ ID NO:10之胺基酸129至146、SEQ ID NO:10之胺基酸144至160、或SEQ ID NO:10之胺基酸136至155所組成;或由如SEQ ID NO:1-21所示的胺基酸序列中之至少17個鄰接胺基酸所組成;或由與SEQ ID NO:1-21具有至少約94%一致性之多肽所組成。該一或多種經純化多肽可連接至指示試劑、信號序列、終止轉移序列、胺基酸間隔子、跨膜結構域、蛋白純化配體、異源性多肽、增強免疫反應之部分、利於純化之部分、利於多肽穩定性之部分、一或多種包含SEQ ID NO:1-21之額外多肽、或其組合。本發明之另一實施例提供一種編碼該一或多種經純化多肽之經分離聚核苷酸。
本發明又一實施例提供一種偵測測試樣品中專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者之抗體的方法。該方法包含使包含一或多種經純化多肽之該組合物與測試樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸。偵測該等多肽/抗體複合物。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該測試樣品中存在對嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者具專一性之抗體。該組合物所含一或多種經純化多肽可由如SEQ ID NO:8或19所示的胺基酸序列中之至少17個鄰接胺基酸所組成。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該測試樣品中存在對片狀邊蟲具專一性之抗體。該組合物所含一或多種經純化多肽可由如SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列、SEQ ID NO:10之胺基酸41-89、或SEQ ID NO:10之胺基酸85-130中之至少17個鄰接胺基酸所組成;或可由與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10之胺基酸41-89、或SEQ ID NO:10之胺基酸85-130具有至少約94%一致性之多肽所組成。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該測試樣品中存在對嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者具專一性之抗體。該組合物所含一或多種經純化多肽可由SEQ ID NO:10之胺基酸1-45、SEQ ID NO:10之胺基酸126-160、SEQ ID NO:10之胺基酸129-146、SEQ ID NO:10之胺基酸144-160、SEQ ID NO:10之胺基酸136-155中之至少17個鄰接胺基酸所組成;或可由與SEQ ID NO:10之胺基酸1-45、SEQ ID NO:10之胺基酸126-160、SEQ ID NO:10之胺基酸129-146、SEQ ID NO:10之胺基酸144-160、SEQ ID NO:10之胺基酸136-155具有至少約94%一致性的多肽所組成。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該測試樣品中存在對嗜吞噬細胞邊蟲多肽具專一性之抗體。該等複合物可在偵測之前與指示試劑接觸。測定該測試樣品中之抗體量。該一或多種經純化多肽可附接至基質。
本發明之又一實施例提供一種可專一性地結合由SEQ ID NO:1-21所組成之多肽的抗體。該抗體可為單株抗體、多株抗體、Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fv片段或單鏈抗體。
本發明之再一實施例提供一種偵測樣品中之嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者之方法。該方法包含使一或多種可專一性地結合該一或多種本發明經純化多肽之抗體與樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸。偵測該等多肽/抗體複合物。偵測到多肽/抗體複合物指示在該樣品中存在嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者。該一或多種經純化多肽可由SEQ ID NO:10之胺基酸1-45、SEQ ID NO:10之胺基酸126-160、SEQ ID NO:10之胺基酸129-146、SEQ ID NO:10之胺基酸144-160、或SEQ ID NO:10之胺基酸136-155中之至少17個鄰接胺基酸所組成。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該該測試樣品中存在嗜吞噬細胞邊蟲多肽。該一或多種經純化多肽可由如SEQ ID NO:8或19所示的胺基酸序列中之至少17個鄰接胺基酸所組成。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該測試樣品中存在片狀邊蟲多肽。該一或多種經純化多肽可由如SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列、SEQ ID NO:10之胺基酸41-89、或SEQ ID NO:10之胺基酸85-130中之至少17個鄰接胺基酸所組成。偵測到該等多肽/抗體複合物指示在該測試樣品中存在嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽。該一或多種抗體可為單株抗體、多株抗體、Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fv片段或單鏈抗體。
在本發明之另一實施例中,包含本發明之經純化多肽之組合物進一步包含醫藥上可接受之或獸醫上可接受之載劑及/或佐劑。
本發明之又一實施例提供一致治療或改善哺乳動物個體之片狀邊蟲感染、嗜吞噬細胞邊蟲感染、或二者之方法,包含對該哺乳動物個體投與治療有效量的包含一或多種本發明經純化多肽之組合物。
本發明之再一實施例提供一種誘導哺乳動物免疫反應之方法,包含投與免疫有效量的包含一或多種本發明經純化多肽之組合物。
因此,本發明提供用於偵測及治療Apl及/或Aph感染之方法及組合物。
除非上下文明確說明否則單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。
多肽係一種藉由醯胺鍵共價連接之兩個或更多個胺基酸之聚合物。多肽可經轉譯後修飾。經純化多肽係一種實質上不含細胞物質、其他類型多肽、化學前體、在該多肽合成中所用化學物質、或其組合之多肽製劑。實質上不含細胞物質、培養基、化學前體、在該多肽合成中所用化學物質等之多肽製劑具有少於約30%、20%、10%、5%、1%或以上之其他多肽、培養基、化學前體及/或在合成中所用其他化學物質。因此,經純化多肽之純度係約70%、80%、90%、95%、99%或更大。經純化多肽不包括純度小於70%之多肽的未經純化或經半純化細胞提取物或混合物。
術語「多肽」可能指一種多肽中之一者或多者(一組多肽)。「多肽」亦可能指兩種或更多種不同多肽之混合物(多肽之混合物)。術語「多肽」(polypeptides或polypeptide)各自亦可意指「一或多種多肽」。
本發明之一個實施例提供一或多種下列多肽:
Aph p44-1 GSDVRAHDDVSALETGGAGYFYVGLDYSPAFSKIRDFSIRESNGE 45(SEQ ID NO:1)
Aph p44-2 ESNGETKAVYPYLKDGKSVKLESHKFDWNTPDPRIGFKDNMLVAMEGSV 49(SEQ ID NO:2)
Aph p44-3 MEGSVGYGIGGARVELEIGYERFKTKGIRDSGSKEDEADTVYLLAK 46(SEQ ID NO:3)
Aph p44-4 YLLAKELAYDVVTGQTDNLAAALAKTSGKDIVQFA 35(SEQ ID NO:4)
Aph p44-4-1 AKELAYDVVTGQTDNLAA 18(SEQ ID NO:5)
Aph p44-4-2 LAAALAKTSGKDIVQFA 17(SEQ ID NO:6)
Aph p44-4-3 VVTGQTDNLAAALAKTSGKD 20(SEQ ID NO:7)
Apl p44-4 AKKLPHTLVSDQSDKFLEELKNTKAAEIVKFA32(SEQ ID NO:8)
p44-4-V YLLAKELAYDVVTGQTDKLTAALAKTSGKDFVQFA 35(SEQ ID NO:9)
Aph rp44 GSDVRAHDDVSALETGGAGYFYVGLDYSPAFSKIRDFSIRESNGETKAVYPYLKDGKSVKLESHKFDWNTPDPRIGFKDNMLVAMEGSVGYGIGGARVELEIGYERFKTKGIRDSGSKEDEADTVYLLAKELAYDVVTGQTDXLXAALAKTSGKDXVQFANAVKISSPTIDGKVCSGDHAAIVSTKGKDYKADPKESGNNGHETSQCSGLSSS 213(SEQ ID NO:10)
在本發明之一個實施例中,在SEQ ID NO:10之143位之X係K或N;在145位之X係T或A;且在156位之X係F或I。
本發明之一個實施例提供下列多肽:
1. SEQ ID NO:10之胺基酸1-45(Aph p44-1)(其與SEQ ID NO:1及12具有相同反應性)。
2. SEQ ID NO:10之胺基酸41-89(Aph p44-2)(其與SEQ ID NO:2及13具有相同反應性)。
3. SEQ ID NO:10之胺基酸85-130(Aph p44-3)(其與SEQ ID NO:3及14具有相同反應性)。
4. SEQ ID NO:10之胺基酸126-160(Aph p44-4)(其與SEQ ID NO:4、9、11、15及20具有相同反應性)。
5. SEQ ID NO:10之胺基酸129-146(Aph p44-4-1)(其與SEQ ID NO:5及16具有相同反應性)。
6. SEQ ID NO:10之胺基酸144-160(Aph p44-4-2)(其與SEQ ID NO:6及17具有相同反應性)。
7. SEQ ID NO:10之胺基酸136-155(Aph p44-3)(其與SEQ ID NO:7及18具有相同反應性)。
進而言之,SEQ ID NO:8及9具有相同反應性,亦即,該等多肽可以實質上相同的方式專一性地結合對邊蟲抗原具專一性之抗體。
在本發明之一個實施例中,該等多肽具有N-末端C-殘基。舉例而言:
Aph p44-1 CGSDVRAHDDVSALETGGAGYFYVGLDYSPAFSKIRDFSIRESNGE(SEQ ID NO:12)
Aph p44-2 CESNGETKAVYPYLKDGKSVKLESHKFDWNTPDPRIGFKDNMLVAMEGSV(SEQ ID NO:13)
Aph p44-3 CMEGSVGYGIGGARVELEIGYERFKTKGIRDSGSKEDEADTVYLLAK(SEQ ID NO:14)
Aph p44-4 CYLLAKELAYDVVTGQTDNLAAALAKTSGKDIVQFA(SEQ ID NO:15)
Aph p44-4-1 CAKELAYDVVTGQTDNLAA(SEQ ID NO:16)
Aph p44-4-2 CLAAALAKTSGKDIVQFA(SEQ ID NO:17)
Aph p44-4-3 CVVTGQTDNLAAALAKTSGKD(SEQ ID NO:18)
Apl p44-4 CAKKLPHTLVSDQSDKFLEELKNTKAAEIVKFA(SEQ ID NO:19)
p44-4-V CYLLAKELAYDVVTGQTDKLTAALAKTSGKDFVQFA(SEQ ID NO:20)
Aph rp44 CGSDVRAHDDVSALETGGAGYFYVGLDYSPAFSKIRDFSIRESNGETKAVYPYLKDGKSVKLESHKFDWNTPDPRIGFKDNMLVAMEGSVGYGIGGARVELEIGYERFKTKGIRDSGSKEDEADTVYLLAKELAYDVVTGQTDXLXAALAKTSGKDXVQFANAVKISSPTIDGKVCSGDHAAIVSTKGKDYKADPKESGNNGHETSQCSGLSSS(SEQ ID NO:21)
在本發明之一個實施例中,在SEQ ID NO:21之144位之X係K或N;在146位之X係T或A;且在157位之X係F或I。
SEQ ID NO:4-7與9可比對如下:
Aphp44-4 YLLAKELAYDVVTGQTDNLAAALAKTSGKDIVQFA(SEQ ID NO:4)
Aphp44-4-1 AKELAYDVVTGQTDNLAA(SEQ ID NO:5)
Aphp44-4-2 LAAALAKTSGKDIVQFA(SEQ ID NO:6)
Aphp44-4-3 VVTGQTDNLAAALAKTSGKD(SEQ ID NO:7)
Aphp44-4-v YLLAKELAYDVVTGQTDKLTAALAKTSGKDFVQFA(SEQ ID NO:9)
SEQ ID NO:4-7與9之共有序列示於SEQ ID NO:11中:
SEQ ID NO:11 YLLAKELAYDVVTGQTDXLXAALAKTSGKDXVQFA
在本發明之一個實施例中,SEQ ID NO:11之18位之X係N或K;20位之X係T或A;且31位之X係F或I。本發明之一個實施例包含SEQ ID NO:11之胺基酸4-21;SEQ ID NO:11之胺基酸19-34;或SEQ ID NO:11之胺基酸11-30。
一個實施例提供一種由SEQ ID NO:1-9及11-21之小於約46、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6個鄰接胺基酸(或介於約46個與約6個胺基酸間之任一範圍)所組成的經純化多肽。一個實施例提供一種由SEQ ID NO:1-9及11-12之大於約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或46個鄰接胺基酸(或介於約46個與約6個胺基酸間之任一範圍)所組成的經純化多肽。天然Aph或Apl胺基酸係由Aph或Apl有機體自然生成的任何多肽。經純化多肽可包含SEQ ID NO:1-21之小於一定數目之鄰接天然邊蟲胺基酸(例如,小於約200、175、150、125、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6個胺基酸(或介於約200與約6個胺基酸間之任一範圍))。亦即,該經純化多肽係小於全長多肽。此等多肽小於全長邊蟲多肽之事實十分重要,此乃因在Apl及/或Aph檢驗中較小多肽比全長多肽可具有更大專一性及/或靈敏性。另外,此等較小多肽與全長多肽相比可能製造起來更便宜且可以更大純度獲得。
另一實施例提供一種由SEQ ID NO:10之小於約200、175、150、125、100、75、50、25、20、15、10、6或更少個鄰接天然邊蟲胺基酸(或介於約200個與約6個胺基酸間之任一範圍)所組成之經純化多肽。另一實施例提供一種由SEQ ID NO:10之大於約6、10、15、25、50、75、100、125、150、175、200或更多個鄰接天然邊蟲胺基酸(或介於約6個與約200個胺基酸間之任一範圍)所組成之經純化多肽。
與在SEQ ID NO:1-21中所示多肽序列具有至少約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致性之變體多肽亦係本發明之多肽。舉例而言,SEQ ID NO:1之變體多肽與SEQ ID NO:1之一致性可約為至少約98%(約1個胺基酸改變)、96%(約2個胺基酸改變)、93%(約3個胺基酸改變)、91%(約4個胺基酸改變)、89%(約5個胺基酸改變)、87%(約6個胺基酸改變)、84%(約7個胺基酸改變)、82%(約8個胺基酸改變)、或80%(約9個胺基酸改變)。SEQ ID NO:2之變體多肽與SEQ ID NO:2之一致性可約為至少98%(約1個胺基酸改變)、96%(約2個胺基酸改變)、94%(約3個胺基酸改變)、92%(約4個胺基酸改變)、90%(約5個胺基酸改變)、88%(約6個胺基酸改變)、約86%(約7個胺基酸改變)、84%(約8個胺基酸改變)、82%(約9個胺基酸改變)、或80%(約10個胺基酸改變)。SEQ ID NO:3之變體多肽與SEQ ID NO:3之一致性可為至少約98%(約1個胺基酸改變)、96%(約2個胺基酸改變)、94%(約3個胺基酸改變)、91%(約4個胺基酸改變)、89%(約5個胺基酸改變)、87%(約6個胺基酸改變)、85%(約7個胺基酸改變)、83%(約8個胺基酸改變)、或80%(約9個胺基酸改變)。SEQ ID NO:4及9之變體多肽與SEQ ID NO:4及9之一致性可約為至少97%(約1個胺基酸改變)、94%(約2個胺基酸改變)、91%(約3個胺基酸改變)、89%(約4個胺基酸改變)、86%(約5個胺基酸改變)、83%(約6個胺基酸改變)、或80%(約7個胺基酸改變)。SEQ ID NO:5之變體多肽與SEQ ID NO:5之一致性可為至少約94%(約1個胺基酸改變)、89%(約2個胺基酸改變)、或83%(約3個胺基酸改變)。SEQ ID NO:6之變體多肽與SEQ ID NO:6之一致性可為至少約94%(約1個胺基酸改變)、88%(約2個胺基酸改變)、或82%(約3個胺基酸改變)。SEQ ID NO:7之變體多肽與SEQ ID NO:7之一致性可約為至少95%(約1個胺基酸改變)、90%(約2個胺基酸改變)、85%(約3個胺基酸改變)或80%(約4個胺基酸改變)。SEQ ID NO:8之變體多肽與SEQ ID NO:8之一致性可約為至少97%(約1個胺基酸改變)、94%(約2個胺基酸改變)、91%(約3個胺基酸改變)、88%(約4個胺基酸改變)、84%(約5個胺基酸改變)、或81%(約6個胺基酸改變)。
變體多肽具有一個或多個保守胺基酸變異或其他次要修飾且保留生物活性(亦即,生物功能等效體)。生物活性等效體在與對應野生型多肽對比時具有實質上等效的功能。在本發明之一個實施例中,多肽具有約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、或更少個保守胺基酸取代。
序列一致性百分比具有業內認可的含義且有許多方法可量測兩多肽或聚核苷酸序列間之一致性。參見,例如,Lesk編寫之Computational Molecular Biology,Oxford University Press,New York,(1988);Smith編寫之Biocomputing:Informatics And Genome Projects,Academic Press,New York,(1993);Griffin & Griffin編寫之Computer Analysis Of Sequence Data,Part I,Humana Press,New Jersey,(1994);von Heinje,Sequence Analysis In Molecular Biology,Academic Press,(1987);及Gribskov & Devereux編寫之Sequence Analysis Primer,M Stockton Press,New York,(1991)。用於比對聚核苷酸或多肽之方法編入電腦程式中,包括GCG程式包(Devereux等人,Nuc. Acids Res.)12:387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul等人,J. Molec. Biol. 215:403(1990))及Bestfit程式(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix第8版,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711),其使用Smith及Waterman之局部同源算法(Adv. App. Math.,2:482-489(1981))。舉例而言,可使用採用FASTA算法之電腦程式ALIGN,仿射空位搜尋的結果是空位開放罰分為-12且空位擴展罰分為-2。
當使用任何序列比對程式來測定一具體序列是否與參考序列具有(例如)約95%一致性時,應將參數設定為能計算全長參考核苷酸之一致性百分比並允許在參考序列中含有佔核苷酸總數目至多5%的同源空隙。
變體多肽通常可藉由修飾一個本發明多肽序列並評定經修飾多肽之性質以測定其是否為生物等效體來鑑別。一種變體倘若在諸如免疫組織化學檢驗、酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)、放射免疫檢驗(RIA)、免疫酶檢驗或西方點漬檢驗等檢驗中與本發明多肽以實質上相同的方式反應(例如,活性為初始多肽之90-110%)則其係生物等效體。在一個實施例中,該檢驗係一種其中該生物等效多肽能夠使本發明多肽與對應反應性抗原或抗體之結合減少約80、95、99或100%之競爭檢驗。可專一性地結合對應野生型多肽之抗體亦可專一性地結合該變體多肽。
保守取代係其中用一種胺基酸取代另一種具有相似性質之胺基酸以使得一名熟習肽化學技術者可預料實質上未改變之多肽之二級結構及水療性質的取代。一般而言,胺基酸之下列基團代表保守變化:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;及(5)phe、tyr、trp、his。
本發明多肽可進一步包含可以共轉譯或後轉譯方式指導蛋白轉移之信號(或前導)序列。該多肽亦可包含便於合成、純化或鑑別該多肽(例如 ,poly-His)或可增強該多肽與固體支持體之結合的連接子或其他序列。舉例而言,多肽可與免疫球蛋白Fc區或牛血清白蛋白偶聯。
一種多肽可以共價方式或以非共價方式連接至通常在本質上與該多肽無關之胺基酸序列,亦即,異源性胺基酸序列。異源性胺基酸序列可來自非-嗜吞噬細胞邊蟲、非片狀邊蟲有機體、合成序列、或通常不位於本發明多肽之羧基或胺基末端之嗜吞噬細胞邊蟲序列或片狀邊蟲序列。另外,多肽可以共價方式或以非共價方式連接至諸如指示試劑等除胺基酸外之化合物或分子。多肽可以共價方式或以非共價方式連接至胺基酸間隔子、胺基酸連接子、信號序列、終止轉移序列、跨膜結構域、蛋白純化配體、或其組合。多肽亦可連接至可增強免疫反應(例如,諸如IL-2等細胞因子)之部分(亦即,可為多肽或其他化合物之官能團)、利於純化之部分(例如,諸如6-組胺酸標籤、trpE、谷胱甘肽、麥芽糖結合蛋白等親和標籤)、或利於多肽穩定性之部分(例如,聚乙二醇;諸如乙醯基、丙基、琥珀醯基、苄基、苄基氧基羰基或第三丁基氧基羰基等胺基末端保護基團;諸如醯胺、甲基醯胺及乙基醯胺等羧基末端保護基團)。在本發明之一個實施例中,蛋白純化配體可為在(例如)本發明多肽之胺基末端或羧基末端的一個或多個C胺基酸殘基。胺基酸間隔子係在本質上與本發明多肽無關之胺基酸序列。胺基酸間隔子可包含約1、5、10、20、100或1,000個胺基酸。
倘若需要,則本發明多肽可為融合蛋白之一部分,其亦可含有諸如胺基酸連接子、胺基酸間隔子、信號序列、TMR終止轉移序列、跨膜結構域等其他胺基酸序列以及諸如谷胱甘肽-S-轉移酶、組胺酸標籤及葡萄球菌蛋白A等可用於蛋白純化之配體、或其組合。其他胺基酸序列可存在於本發明多肽之C或N末端以形成融合蛋白。於融合蛋白中可存在一種以上的本發明多肽。在本發明融合蛋白中可存在若干本發明多肽之片段。一種本發明融合蛋白可包含一或多種本發明多肽、其片段、或其組合。
本發明多肽可呈多聚體形式。亦即,多肽可包含本發明多肽或其組合之一個或多個拷貝。一種多聚體多肽可為多抗原肽(MAP)。參見,例如,Tam,J. Immunol. Methods,196:17-32(1996)。
本發明多肽可包含可藉由對嗜吞噬細胞邊蟲或片狀邊蟲或對嗜吞噬細胞邊蟲及片狀邊蟲二者具專一性之抗體鑑別的抗原決定簇。該多肽可包含一個或多個抗原決定部位(亦即,抗原決定簇)。抗原決定部位可為線性抗原決定部位、順序抗原決定部位或構象性抗原決定部位。在本發明多肽內之抗原決定部位可藉由若干方法來鑑別。參見,例如,美國專利第4,554,101號;Jameson & Wolf,CABIOS 4:181-186(1988)。舉例而言,可分離及篩選本發明多肽。一起跨越整個多肽序列之一系列短肽可藉由蛋白水解裂解來製備。藉由用(例如)30-mer多肽片段開始可測試各片段是否存在於ELISA中所識別出的抗原決定部位。舉例而言,在ELISA檢驗中,使諸如30-mer多肽片段等嗜吞噬細胞邊蟲多肽附接至固體支持體,例如,塑性多孔板之各孔。將一群抗體進行標記、添加至固體支持體並使之在其中非專一性吸附受阻之條件下與未經標記抗原結合,且洗掉任何未結合抗體及其他蛋白。藉由(例如)可將無色基質轉化成有色反應產物之反應來偵測抗體結合。隨後測試來自所鑑別出30-mer之逐漸變小的重疊片段以描繪相關抗原決定部位。
本發明之多肽可以重組方式產生。可將編碼本發明多肽之聚核苷酸引入重組表現載體中,可使用業內熟知技術使其在適宜表現宿主細胞系統中表現。在業內可獲得各種細菌、酵母菌、植物、哺乳動物及昆蟲表現系統且可使用任何此表現系統。視情況,可使編碼多肽之聚核苷酸在不含細胞之轉譯系統中轉譯。多肽亦可以化學方式合成或可自邊蟲細胞獲得。
本發明之免疫原性多肽可包含在SEQ ID NO:1-21中所示胺基酸序列或其片段。免疫原性多肽可誘出可識別具有SEQ ID NO:1-21之多肽之抗原決定部位的抗體或其他免疫反應(例如,免疫系統之T-細胞反應)。本發明之免疫原性多肽亦可為具有SEQ ID NO:1-21中所示胺基酸序列之多肽的片段。本發明之免疫原性多肽片段之長度可為約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或更多個胺基酸。本發明之免疫原性多肽片段之長度可為約200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、或更少個胺基酸。
本發明之聚核苷酸含有不足一整個微生物基因組且可為單鏈或雙鏈核酸。聚核苷酸可為RNA、DNA、cDNA、基因組DNA、以化學方式合成之RNA或DNA、或其組合。該等聚核苷酸可經純化而不含其他組份,例如,蛋白、脂質及其他聚核苷酸。舉例而言,聚核苷酸之純度可為50%、75%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。存於數百個至數百萬個在(例如)cDNA或基因組文庫、或含有基因組DNA限制酶切消化之凝膠切片內之其他核酸分子中的核酸分子並不視為純化聚核苷酸。本發明之聚核苷酸編碼上文所述本發明多肽。在本發明之一個實施例中,該聚核苷酸編碼在SEQ ID NO:1-21中所示多肽或其片段。
本發明之聚核苷酸可由小於約639、450、300、225、147、138、135、105、96、60、54、51、45、30、20、10或更少個鄰接、天然(亦即,Aph或Apl聚核苷酸)或非天然聚核苷酸所組成。本發明之聚核苷酸可由大於約10、20、30、45、51、54、60、96、105、135、138、147、225、300、450、639或更多個鄰接、天然(亦即,Aph或Apl聚核苷酸)或非天然聚核苷酸所組成。經純化聚核苷酸可包含額外異源性核苷酸(亦即,並非來自Aph或Apl之核苷酸)且甚至含有額外Aph或Apl核苷酸,只要其不會與該等聚核苷酸自然地發生鄰接即可。本發明之聚核苷酸可包含其他核苷酸序列,例如,編碼連接子之序列、信號序列、TMR終止轉移序列、跨膜結構域、或諸如谷胱甘肽-S-轉移酶、組胺酸標籤、及葡萄球菌蛋白A等可用於蛋白純化之配體的序列。
可分離本發明之聚核苷酸。經分離聚核苷酸係與其天然結合的5'及3'側翼基因組序列中之一者或兩者不直接鄰接之天然聚核苷酸。經分離聚核苷酸可為(例如)任一長度之重組DNA分子,限制條件為在自然界中直接現於重組DNA分子側翼之核酸序列在天然基因組中經移除或不存在。經分離聚核苷酸亦包括非天然核酸分子。
本發明之聚核苷酸亦可包含編碼免疫原性多肽之片段。本發明之聚核苷酸可編碼全長多肽、多肽片段、及變體或融合多肽。
編碼本發明多肽之退化核苷酸序列以及與本發明聚核苷酸序列具有至少約80%或約85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致性之同源核苷酸序列及其互補序列亦為本發明之聚核苷酸。序列一致性百分比可按照在「多肽」段中所述來計算。退化核苷酸序列係編碼本發明多肽或其片段之聚核苷酸,但核酸序列不同於野生型聚核苷酸序列,此係由遺傳密碼簡並所致。互補DNA(cDNA)分子、物種同系物及編碼生物功能多肽之本發明聚核苷酸之變體亦為本發明之聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸可自存於(例如)諸如來自經感染個體之血液、血清、唾液或組織等生物樣品中之核酸序列獲得。聚核苷酸亦可在實驗室中合成,舉例而言,使用自動合成儀。可使用諸如PCR等擴增方法來擴增來自編碼該等多肽之基因組DNA或cDNA之聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸可包含天然多肽之編碼序列或可編碼在自然界中不存在之變更序列。倘若需要,則可將聚核苷酸選殖入包含表現控制元件之表現載體中,該等表現控制元件包括(例如)複製源、啟動子、增強子或其他可推動本發明聚核苷酸在宿主細胞中表現的調控元件。表現載體可為(例如)質粒(例如,pBR322、pUC或ColEl)或腺病毒載體,例如,腺病毒2型載體或5型載體。視情況,可使用其他載體,包括但不限於辛德比斯病毒(Sindbis virus)、猿猴病毒40、阿爾法病毒載體(alphavirus vectors)、痘病毒載體、及巨細胞病毒及逆轉錄病毒載體,例如,鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)、及勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)。亦可使用諸如MC及MC1等微型染色體、噬菌體、噬菌粒、酵母人工染色體、細菌人工染色體、病毒粒子、病毒樣粒子、黏粒(其中已插入噬菌體λcos位點之質粒)及複製子(能夠在其自身控制下於細胞中複製之基因元件)。
用於製備以可操作方式連接至表現控制序列之聚核苷酸且使其在宿主細胞中表現之方法在業內為眾人所熟知。參見,例如,美國專利第4,366,246號。本發明之聚核苷酸在其毗鄰或靠近一個或多個指導該聚核苷酸轉錄及/或轉譯之表現控制元件定位時以可操作方式連接。
可使用本發明之聚核苷酸作為(例如)探針或引物(例如,PCR引物)以偵測在諸如生物樣品等測試樣品是否存在邊蟲聚核苷酸。探針係能夠與目標核酸相互作用之分子,通常以序列專一性方式,舉例而言,經由雜交。引物係能夠支持酶操控且能夠與目標核酸雜交以便發生酶操控之探針的子集。引物可自業內可獲得的不會干擾酶操控之核苷酸或核苷酸衍生物或類似物之任一組合來製造。
探針或引物可為約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或更多個編碼本發明多肽之鄰接核苷酸。
核酸之雜交在業內為眾人所瞭解且論述於本文中。通常,探針可自業內可獲得的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物之任一組合來製造。此等探針及引物與嗜吞噬細胞邊蟲或片狀邊蟲聚核苷酸序列專一性地雜交之能力能夠使其用於偵測在給定測試樣品中是否存在互補序列。本發明之聚核苷酸探針及引物可與諸如生物樣品等測試樣品中之互補序列雜交,該等生物樣品包括唾液、痰、血液、血漿、血清、尿、糞、腦脊液、羊水、創傷溢泌物或組織。舉例而言,可對來自該樣品之聚核苷酸實施凝膠電泳或其他尺寸分離技術或可在無尺寸分離時固定之。該等聚核苷酸探針或引物可經標記。用於標記探針及引物之適宜標記及方法為業內所知且包括(例如)藉由缺口平移或藉由激酶納入之放射性標記、生物素標記、螢光標記、化學發光標記、生物發光標記、金屬螯合劑標記及酶標記。使來自樣品之聚核苷酸與探針或引物在適當嚴格的雜交條件下接觸。
視應用而定,可利用改變雜交條件來達成探針或引物對目標序列之不同選擇程度。對於需要高選擇性之應用而言,可使用相對嚴格的條件,例如,低鹽及/或高溫條件,例如,提供約0.02M至約0.15M鹽之鹽濃度,在約50℃至約70℃之溫度下。對於需要低選擇性之應用而言,可使用不太嚴格的雜交條件。舉例而言,自約0.14M至約0.9M鹽之鹽條件,在介於約20℃至約55℃間之溫度下。包含探針或引物及來自測試樣品之互補聚核苷酸之雜交複合物的存在指示在該樣品中存在Apl或Apl聚核苷酸序列。
本發明之抗體係可專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或本發明變體多肽或其片段之抗體分子。本發明之抗體可對Aph多肽或Apl多肽或變體多肽或其組合具專一性,舉例而言,對SEQ ID NO:1-21之一者或多者具專一性之抗體。在本發明之另一實施例中,抗體對嗜吞噬細胞邊蟲多肽具專一性(例如,對SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18或20具專一性之抗體)。在本發明之另一實施例中,一種抗體對狀邊蟲多肽具專一性(例如,對SEQ ID NO:8或19具專一性之抗體)。在本發明之另一實施例中,抗體對嗜吞噬細胞邊蟲多肽及片狀邊蟲多肽二者具專一性(例如,對SEQ ID NO:2、3、10、13、14或21具專一性之抗體)。一名熟習此項技術者可使用本文所述檢驗容易地測定抗體對嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽是否具專一性。本發明之抗體可為多株抗體、單株抗體、單鏈抗體(scFv)、或抗體之抗原結合片段。抗體之抗原結合片段係包含抗原結合位點之完整抗體或完整抗體之可變區的一部分,其中該部分不含該完整抗體之Fc區的重鏈恆定結構域。結合抗原之抗體片段之實例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及Fv片段。
本發明之抗體可為任一抗體類別,包括(例如)IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。抗體或其片段可結合本發明多肽之抗原決定部位。抗體可在適宜實驗室動物中於活體內製造或使用重組DNA技術於活體外製造。用於製備及表徵抗體之方式為業內所熟知。參見,例如,Dean,Methods Mol. Biol. 80:23-37(1998);Dean,Methods Mol. Biol. 32:361-79(1994);Baileg,Methods Mol. Biol. 32:381-88(1994);Gullick,Methods Mol. Biol. 32:389-99(1994);Drenckhahn等人Methods Cell.. Biol. 37:7-56(1993);Morrison,Ann. Rev. Immunol. 10:239-65(1992);Wright等人,Crit. Rev. Immunol. 12:125-68(1992)。舉例而言,可藉由對諸如人類或其他靈長類、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、豬、狗、牛、綿羊、猴或馬等動物投與本發明多肽來產生多株抗體。收集來自經免疫動物之血清並藉由(例如)用硫酸銨沉澱繼而實施層析(例如,親和性層析)來自血漿純化抗體。用於生產及加工多株抗體之技術為業內所知。
「專一性地結合」或「對...具專一性」意指與其他非專一性分子相比可以更大親和性識別及結合本發明抗體之第一抗原,例如,嗜吞噬細胞邊蟲或片狀邊蟲多肽。非專一性分子係與該第一抗原無共同抗原決定部位之抗原。在一本發明之較佳實施例中,非專一性分子並非源自邊蟲種。邊蟲種係邊蟲屬之任一物種。舉例而言,針對與非專一性抗原相比可更有效地結合之第一抗原(例如,多肽)產生的抗體可描述為專一性地結合該第一抗原。在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段在以107l/mol或更大之結合親和性Ka結合時可專一性地結合SEQ ID NO:1-21或其片段之多肽。可使用(例如)酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)、放射免疫檢驗(RIA)或西方點漬檢驗使用業內所熟知的方法來測試專一性結合。
本發明之抗體包括如下抗體及其抗原結合片段,其:(a)與參照抗體競爭結合SEQ ID NO:1-21或其抗原結合片段;(b)與參照抗體結合至SEQ ID NO:1-21或其抗原結合片段之相同抗原決定部位;(c)與參照抗體以實質相同的Kd結合至SEQ ID NO:1-21或其抗原結合片段;及/或(d)以與參照抗體實質相同的解離速率結合SEQ ID NO:1-21或其片段,其中該參照抗體係可以107l/mol或更大之結合親和性Ka專一性地結合SEQ ID NO:1-21或其抗原結合片段之多肽的抗體或其抗原結合片段。
另外,亦可容易地產生針對存於本發明多肽上之抗原決定部位的單株抗體。舉例而言,來自諸如小鼠等經本發明多肽免疫化哺乳動物之正常B細胞可與(例如)HAT敏感性小鼠骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤。產生邊蟲專一性抗體之雜交瘤可使用RIA或ELISA來鑑別且可藉由在半固體瓊脂中選殖或藉由限制稀釋來分離。產生邊蟲專一性抗體之選殖體可藉由另一輪篩選來分離。可使用標準技術(舉例而言,藉由使本發明多肽與微量滴定板結合併藉由ELISA檢驗量測單株抗體結合)來篩選具專一性之單株抗體。用於生產及加工單株抗體之技術為業內所熟知。參見,例如,Kohler & Milstein,Nature,256:495(1975)。單株抗體之特定同種型可藉由自初始融合體選擇來直接製備或其次可藉由使用同胞選擇技術分離經類別轉換之變體而自分泌不同同種型單株抗體之親代雜交瘤來製備。參見Steplewski等人,P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985;Spria等人,J. Immunolog. Meth. 74:307,1984。本發明之單株抗體亦可為重組單株抗體。參見,例如,美國專利第4,474,893號;美國專利第4,816,567號。本發明之抗體亦可以化學方式構建。參見,例如,美國專利第4,676,980號。
本發明之抗體可為嵌合抗體(參見,例如,美國專利第5,482,856號)、人源化抗體(參見,例如,Jones等人,Nature 321:522(1986);Reichmann等人,Nature 332:323(1988);Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593(1992))、犬源化抗體、犬類或人類抗體。人類抗體可藉由(例如)直接永生化、噬菌體展示、轉基因小鼠、或三聚體技術(Trimera)方法來製造,參見,例如,Reisener等人,Trends Biotechnol. 16:242-246(1998)。
可專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲抗原以排除片狀邊蟲抗原之抗體(例如,SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18或20)尤其可用於偵測在諸如來自經嗜吞噬細胞邊蟲感染動物之血清、血液、血漿、尿、糞、組織、細胞或唾液樣品等樣品中是否存在嗜吞噬細胞邊蟲抗原。
可專一性地結合片狀邊蟲抗原以排除嗜吞噬細胞邊蟲抗原之抗體(例如,SEQ ID NO:8或19)尤其可用於偵測在諸如來自片狀邊蟲感染動物之血清、血液、血漿、尿、糞、組織或唾液樣品等樣品中是否存在片狀邊蟲抗原。
可專一性地結合片狀邊蟲及嗜吞噬細胞邊蟲抗原之抗體(例如,SEQ ID NO:2、3、10、13、14或21)尤其可用於偵測在諸如來自片狀邊蟲感染或嗜吞噬細胞邊蟲感染動物之血清、血液、血漿、尿、糞、組織或唾液樣品等樣品中是否存在片狀邊蟲及嗜吞噬細胞邊蟲抗原。
邊蟲抗原免疫檢驗可利用一種抗體或若干抗體。邊蟲抗原免疫檢驗可使用(例如)一種對一個邊蟲抗原決定部位具專一性之單株抗體、對一種邊蟲多肽之若干抗原決定部位具專一性之若干單株抗體之組合、對不同邊蟲多肽之若干抗原決定部位具專一性之若干單株抗體、對相同邊蟲抗原具專一性之若干多株抗體、對不同邊蟲抗原具專一性之若干多株抗體、或單株抗體與多株抗體之組合。免疫檢驗協議可基於(例如)競爭、直接反應或三明治型檢驗,使用(例如)經標記抗體。本發明之抗體可用任一類別業內已知標記來標記,包括(例如)螢光、化學發光、放射性、酶、膠體金屬、放射性同位素及生物發光標記。本發明之抗體可僅專一性地結合Aph抗原、僅專一性地結合Apl抗原、或專一性地結合Apl抗原及Apl抗原。
本發明之抗體或其片段可結合至支持體且用於偵測Apl及/或Aph抗原之存在。支持體包括(例如)玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸、澱粉酶、天然及改質纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖以及磁石。
本發明之抗體可藉由免疫親和性管柱而進一步用於分離Apl及/或Aph有機體或抗原。該等抗體可藉由(例如)吸附或藉由共價連接以使得該等抗體保留其免疫選擇活性之方式固定至固體支持體。視情況,可納入間隔基團以使得可容易地到達該抗體之抗原結合位點。該等經免疫化抗體隨後可用於結合來自諸如生物樣品等樣品之邊蟲有機體或邊蟲抗原,該樣品包括唾液、血清、痰、血液、尿、糞、腦脊液、羊水、創傷溢泌物或組織。結合邊蟲有機體或邊蟲抗原可藉由(例如)使pH變化而自管柱基體回收得。
本發明之抗體亦可用於免疫定位研究以分析本發明多肽在各種細胞事件或生理條件中之存在及分佈。抗體亦可用於鑑別參與被動免疫之分子及參與非蛋白抗原生物合成之分子。此等分子之鑑別可用於疫苗研發。包括(例如)單株抗體及單鏈抗體在內之本發明抗體可用於監測由Apl及/或Aph造成的疾病之改善過程。藉由量測來自動物之測試樣品中抗體對Apl及/或Aph之專一性增強或降低,可確定旨在改善該病症之特定治療方案是否有效。可使用(例如)諸如RIA、ELISA或西方點漬檢驗等直接結合檢驗來偵測及/或定量抗體。
本發明之方法可用於偵測諸如生物樣品、環境樣品或實驗室樣品等測試樣品中對邊蟲抗原、Apl抗原、Aph抗原、Apl聚核苷酸、Aph聚核苷酸或其組合具專一性之抗體或其專一性結合片段。測試樣品可能潛在地包含Apl聚核苷酸、Aph聚核苷酸、Apl多肽、邊蟲種多肽、Aph多肽、對邊蟲種具專一性之抗體、對Apl具專一性之抗體及/或對Aph具專一性之抗體、不相關聚核苷酸、多肽、抗體或抗原、上述之組合、或不含上述中任一者。生物樣品可包括(例如)來自諸如馬、貓、狗或人等哺乳動物之血清、血液、細胞、血漿、唾液、尿、糞、或組織。該測試樣品可能未經處理、經沉澱、精製、分離、稀釋、濃縮或純化。
在一個實施例中,本發明之方法包含使一或多種本發明多肽與測試樣品在可形成多肽/抗體複合物(亦即,免疫複合物)之條件下接觸。亦即,本發明之多肽可專一性地結合對位於樣品中之Apl及/或Aph抗原具專一性之抗體。在本發明之一個實施例中,一或多種本發明多肽(例如,SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、20或其片段)可專一性地結合對Aph抗原具專一性且不會專一性地結合Apl抗原之抗體。在本發明之另一實施例中,一或多種本發明多肽(例如,SEQ ID NO:2、3、10、13、14、21或其片段)可專一性地結合對Aph及Apl抗原二者具專一性之抗體。在本發明之一個實施例中,一或多種本發明多肽(例如,SEQ ID NO:8、19或其片段)可專一性地結合對Apl抗原具專一性且不會專一性地結合Aph抗原之抗體。一名熟習此項技術者熟悉可用於偵測抗體/多肽複合物結合之檢驗及條件。偵測在樣品中在多肽與抗-Apl及/或抗-Aph抗體間之複合物形成。抗體/多肽複合物形式指示在該樣品中存在嗜吞噬細胞邊蟲多肽及/或片狀邊蟲多肽。偵測到缺乏多肽/抗體複合物指示在該樣品中不存在嗜吞噬細胞邊蟲多肽及/或片狀邊蟲多肽。
本發明之抗體可藉由獲得來自(例如)懷疑具有Apl及/或Aph感染之人或動物之測試樣品而用於診斷Apl及/或Aph感染之方法。使該測試樣品與本發明之抗體在能夠形成抗體-抗原複合物(亦即,免疫複合物)之條件下接觸。一名熟習此項技術者可意識到能夠及適合形成抗原/抗體複合物之條件。抗體-抗原複合物之量可藉由業內已知方法來測定。高於在對照樣品中所形成者之量指示受Apl及/或Aph感染。對照樣品係一種不含任何Aph及/或Apl多肽或對Aph及/或Apl具專一性之抗體的樣品。在本發明之一個實施例中,該對照不含邊蟲種多肽或對邊蟲種具專一性之抗體。在本發明之一個實施例中,一種抗體僅對Aph抗原具專一性。在本發明之另一實施例中,一種抗體對Aph及Apl抗原二者具專一性。在本發明之另一實施例中,一種抗體僅對Apl抗原具專一性。或者,本發明多肽可與測試樣品接觸。在陽性測試樣品中對Apl及/或Aph具專一性之抗體可在適宜條件下形成抗原-抗體複合物。抗體-抗原複合物之量可藉由業內已知方法來測定。
在本發明之一個實施例中,可偵測個體之嗜吞噬細胞邊蟲及/或片狀邊蟲感染。生物樣品可自該個體獲得。使一或多種包含SEQ ID NO:1-21之經純化多肽或其他本發明多肽與生物樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸。偵測該等多肽/抗體複合物。偵測到該等多肽/抗體複合物指示該哺乳動物具有嗜吞噬細胞邊蟲及/或片狀邊蟲感染。偵測到缺乏該等多肽/抗體複合物指示該哺乳動物不具有嗜吞噬細胞邊蟲感染或片狀邊蟲感染。
由於SEQ ID NO:2、3、10、13、14、及21對抗-Apl及抗-Aph抗體二者具專一性,因此偵測到感染可為Aph感染、Apl感染、或Apl及Aph二者感染。由於SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18及20對抗-Aph抗體具專一性,因此所偵測到感染係Aph感染。由於SEQ ID NO:8及19對抗-Apl抗體具專一性,因此所偵測到感染係Apl感染。偵測到缺乏該等多肽/抗體複合物指示該個體不具有嗜吞噬細胞邊蟲或片狀邊蟲感染。
在本發明之一個實施例中,可在個體獲得Apl及/或Apl感染後約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或更多天時偵測該個體之Apl及/或Aph感染。在本發明之一個實施例中,可在個體獲得Apl及/或Aph感染後約21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天或更少天時偵測該個體之Apl及/或Aph感染。
在本發明之一個實施例中,當諸如酶偶聯物等結合至抗體之指示試劑催化可偵測反應時,偵測到多肽/抗體複合物。視情況,可在可形成多肽/抗體/指示劑複合物之條件下將包含信號產生化合物之指示試劑應用於多肽/抗體複合物。偵測該多肽/抗體/指示劑複合物。視情況,可在形成多肽/抗體複合物之前用指示試劑標記該多肽或抗體。該方法可視情況包含陽性或陰性對照。
在本發明之一個實施例中,一或多種本發明之抗體附接至固體相或基質。向該基質中添加潛在地包含含本發明多肽之蛋白的測試樣品。添加一或多種可專一性地結合本發明多肽之抗體。該等抗體可與在固相上所用抗體相同或可來自不同來源或物種且可連接至諸如酶偶聯物等指示試劑。可在每次添加之前實施洗滌步驟。添加生色團或酶基質並使顏色顯現出。終止顏色反應並可使用(例如)分光光度計來定量顏色。
在本發明之另一實施例中,一或多種本發明之抗體附接至固體相或基質。向該基質中添加潛在地包含含本發明多肽之蛋白的測試樣品。添加可專一性地結合本發明多肽之第二抗-物種抗體。此等第二抗體與該等固相抗體來自不同物種。添加專一性地結合該等第二抗體且不會專一性地結合該等固體相抗體之第三抗物種抗體。該等第三抗體可包含諸如酶偶聯物等指示試劑。可在每次添加之前實施洗滌步驟。添加生色團或酶基質並使顏色顯現出。終止顏色反應並可使用(例如)分光光度計來定量顏色。
本發明之檢驗包括但不限於彼等基於競爭、直接反應或三明治型檢驗者,包括但不限於酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)、西方點漬分析、IFA、放射免疫檢驗(RIA)、紅細胞凝聚(HA)、螢光偏振免疫檢驗(FPIA)、及微量滴定板檢驗(在微量滴定板中之一個或多個孔中實施的任一檢驗)。一個本發明檢驗包含可逆流動層析結合檢驗,例如,SNAP檢驗。參見美國專利第5,726,010號。
檢驗可使用固體相或基質或可藉由免疫沉澱或不利用固體相之任何其他方法來實施。當使用固體相或基質時,一或多種本發明多肽可直接或間接附接至固體支持體或基質,例如,微量滴定孔、磁珠、非磁珠、管柱、基體、膜、由合成或天然纖維(例如,基於玻璃或纖維素之材料或熱塑性聚合物,例如,聚乙烯、聚丙烯或聚酯)所組成之纖維性墊、由顆粒材料(例如,玻璃或各種熱塑性聚合物)所組成之燒結結構、或由硝基纖維素、耐綸、聚碸或諸如此類組成之澆注膜(通常係合成的)。在本發明之一個實施例中,燒結由聚乙烯之細粒(通常稱作多孔聚乙烯,舉例而言,來自Chromex公司(Albuquerque,NM)之10-15微米多孔聚乙烯)形成之基質。所有此等基質材料可以諸如膜、片或板等適宜形狀使用或者可使其塗佈於或結合至或層壓至適當惰性載體,例如,紙、玻璃、塑性膜或織物。將肽固定於固體相上之適宜方法包括離子、疏水性、共價相互作用及諸如此類。
在一種檢驗格式中,一或多種多肽可塗佈於固體相或基質上。將懷疑含有抗-Apl及/或抗-Aph抗體或其抗原結合片段之測試樣品與包含偶聯至對Apl及/或Aph具專一性之抗體或抗原結合抗體片段之信號產生化合物的指示試劑在足以形成抗原/抗體複合物之條件下一起培育一段時間,該等抗原/抗體複合物係測試樣品抗體與固體相多肽之抗原/抗體複合物或者係偶聯至對Apl及/或Aph具專一性之抗體之指示試劑化合物與固體相多肽之抗原/抗體複合物。可定量地量測偶聯至抗-Apl及/或抗-Aph抗體之指示試劑與固體相之結合減少。與自確認陰性Apl及/或確認陰性Aph測試樣品產生之信號相比,可量測信號減少指示在測試樣品中存在抗-Apl及/或抗-Aph抗體。此種檢驗可定量測試樣品中之抗-Apl及/或抗-Aph抗體之量。
在另一種檢驗格式中,將一或多種本發明多肽塗佈於支持體或基質上。本發明之多肽與指示試劑偶聯並添加至測試樣品中。將此混合物施加至支持體或基質上。倘若對Apl及/或Aph具專一性之抗體存於該測試樣品中,則其會結合一或多種與指示試劑偶聯之多肽及一或多種固定在該支持體上之多肽。隨後可偵測到多肽/抗體/指示劑複合物。此種檢驗可定量測試樣品中之抗-Apl及/或抗-Aph抗體之量。
在另一種檢驗格式中,將一或多種本發明多肽塗佈於支持體或基質上。將該測試樣品施加至支持體或基質上並培育之。藉由用洗滌溶液洗滌該固體支持體來洗掉該樣品之未結合組份。倘若Apl-專一性及/或Aph-專一性抗體存於測試樣品中,則其會結合塗佈於該固體相上之多肽。可使用與指示試劑偶聯之第二物種專一性抗體來偵測此多肽/抗體複合物。隨後可偵測到該多肽/抗體/抗-物種抗體指示劑複合物。此種檢驗可定量測試樣品中之抗-Apl及/或抗-Aph抗體之量。
可藉由(例如)放射量測、顏色量測、螢光量測、大小分離或沉澱方法來偵測多肽/抗體複合物或多肽/抗體/指示劑複合物之形成。視情況,藉由添加可與包含信號產生化合物之指示試劑偶合之二級抗體來偵測多肽/抗體複合物。可使用上文所述方法來偵測包含與多肽/抗體複合物相關之信號產生化合物(標記)之指示試劑且該等指示試劑包括生色劑、諸如酶偶聯物等觸媒、諸如螢光素及若丹明(rhodamine)等螢光化合物、諸如二氧雜環丁烷、吖啶鎓、菲啶鎓、釕及發光氨(luminol)等化學發光化合物、放射性元素、直接視覺標記、以及輔因子、抑制劑、磁性粒子、及諸如此類。酶偶聯物之實例包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶及諸如此類。特定標記之選擇並非關鍵,但其本身或聯合一或多種額外物質將能夠產生信號。
複合物的形成表示在測試樣品中存在抗-Apl及/或抗-Aph抗體。因此,本發明方法可用於診斷患者之Apl及/或Aph感染。
本發明方法亦可顯示出抗-Apl及/或抗-Aph抗體在測試樣品中之量或數量。就諸如酶偶聯物等許多指示試劑而言,所存在抗體之量與所產生信號成比例。視測試樣品之類別而定,其可用適宜緩衝試劑稀釋、經濃縮或在無任何操控時與固體相接觸。舉例而言,通常,較佳地,測試先前經稀釋之血清或血漿樣品或諸如尿等經濃縮樣本以便測定抗體是否存在及/或所存在抗體之量。
本發明進一步包含用於偵測樣品中抗-Apl及/或抗-Aph抗體或抗體片段、Apl多肽及/或Aph多肽之檢驗套組(例如,製造物品)。套組包含一或多種本發明多肽及用以測定樣品中多肽與抗-Apl抗體及/或抗-Aph抗體或抗原結合抗體片段之結合的工具。套組或製造物品亦可包含一或多種本發明抗體或抗原結合抗體片段及用以測定樣品中該等抗體或抗原結合抗體片段與Apl多肽及/或Aph多肽之結合的工具。套組可包含含有一或多種本發明之多肽或抗體之裝置及關於使用該一或多種多肽或抗體來(例如)鑑別哺乳動物Apl及/或Aph感染之說明書。該套組亦可包含含標記之封裝材料,該標記指示該套組之一或多種多肽或抗體可用於鑑別Apl及/或Aph感染。諸如緩衝劑、對照及諸如此類等為彼等普通技術者所知的其他組份可包括於此等測試套組中。本發明之多肽、抗體、檢驗及套組可用於(例如)診斷患者之Apl及/或Aph感染個體病例以及關於Apl及/或Aph爆發之流行病學研究。
本發明多肽及檢驗可與其他多肽或檢驗組合以偵測邊蟲以及其他有機體是否存在。舉例而言,本發明多肽及檢驗可與可偵測犬惡絲蟲及/或伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)及/或犬埃裏希氏體(Ehrlichia canis)之試劑組合。
本發明聚核苷酸可用於偵測在樣品中是否存在Apl及/或Aph聚核苷酸。該等聚核苷酸可藉由簡單雜交反應而用於偵測樣品中之Apl及/或Aph聚核苷酸且亦可用於(例如)諸如實時PCR反應等聚合酶鏈反應(PCR)。本發明方法及組合物亦可用於區別於諸如Apl等其他邊蟲種來偵測Aph之存在。
PCR檢驗全面地闡述於業內,包括(例如)美國專利第4,683,195號;美國專利第4,683,202號;美國專利第4,965,188號。一般而言,使聚核苷酸引物複性至目標核酸之變性鏈。藉由用聚合酶聚合脫氧核苷三磷酸來形成引物延伸產物。PCR隨後涉及模板核酸變性、引物複性及藉由熱穩定性聚合酶之作用延伸經複性引物之重複循環。該製程達成測試樣品中目標邊蟲種核酸之指數擴增,此可偵測以十分低的濃度存於樣品中之目標聚核苷酸。
實時PCR檢驗係基於信號偵測,例如,螢光報導信號。此信號增強與反應中PCR產物之量成正比。實時PCR係能夠監測正在進行中之擴增反應之進展的任一擴增技術。參見,Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection,Perkin Elmer Applied Biosystems(1999);PCR Protocols(Academic Press New York,1989)。藉由記錄每一循環之螢光發射量,能夠監測在指數期之PCR反應,其中PCR產物量之第一顯著增加與目標模板之初始量有關。目標核酸之起始拷貝數愈高,觀測到螢光顯著增強愈快。
本發明一個實施例提供一種用於偵測及/或定量測試樣品中之Apl及/或Aph聚核苷酸之方法。可在適合聚合酶鏈反應之條件下向測試樣品中添加同義引物及反義引物。該等引物與Apl及/或Aph聚核苷酸雜交以便於當Apl及/或Aph聚核苷酸存於測試樣品中時形成擴增產物。偵測到擴增產物並測定Apl及/或Aph聚核苷酸之存在及/或數量。可藉助在適合聚合酶鏈反應之條件下與Apl及/或Aph聚核苷酸序列雜交之聚核苷酸探針來偵測擴增產物。可藉由量測來自該探針之偵測信號並比較該偵測信號與來自定量標準之第二探針偵測信號來定量擴增產物。該定量標準與測試樣品平行提取。
本發明之一個實施例提供一種用於區別於樣品中之片狀邊蟲多肽偵測嗜吞噬細胞邊蟲之方法。該方法包含:
(a)使一或多種可專一性地結合由SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18或20所組成之多肽之抗體與樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸並偵測該等多肽/抗體複合物;及
(b)使一或多種可專一性地結合由SEQ ID NO:8或19所組成之多肽之抗體與該樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸並偵測該等多肽/抗體複合物。
倘若在步驟(a)中及在步驟(b)中偵測到該等多肽/抗體複合物,則該樣品含有嗜吞噬細胞邊蟲多肽且含有片狀邊蟲多肽。倘若在步驟(a)中偵測到該等多肽/抗體複合物且在步驟(b)中沒有偵測到該等多肽/抗體複合物,則樣品含有嗜吞噬細胞邊蟲多肽且不含有片狀邊蟲多肽。倘若在步驟(a)中沒有偵測到該等多肽/抗體複合物且在步驟(b)中偵測到該等多肽/抗體複合物,則該樣品含有片狀邊蟲多肽且不含有嗜吞噬細胞邊蟲多肽。倘若在步驟(a)中沒有偵測到該等多肽複合物且在步驟(b)中沒有偵測到該等多肽複合物,則該樣品不含有片狀邊蟲多肽且不含有嗜吞噬細胞邊蟲多肽。
本發明之另一實施例提供一種偵測可專一性地結合片狀 邊蟲多肽、嗜吞噬細胞邊蟲多肽、或結合片狀邊蟲多肽與嗜吞噬細胞邊蟲多肽二者之抗體的方法。該方法包含:
(a)使一或多種包含SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18或20之經純化多肽與樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸並偵測該等多肽/抗體複合物;及
(b)使一或多種包含SEQ ID NO:8或19之經純化多肽與測試樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸並偵測該等多肽/抗體複合物。
倘若在步驟(a)中及在步驟(b)中偵測到該等多肽/抗體複合物,則該樣品含有可專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲多肽及片狀邊蟲多肽之抗體(亦即,能夠專一性地結合片狀邊蟲及嗜吞噬細胞邊蟲多肽二者之抗體)。倘若在步驟(a)中偵測到該等多肽/抗體複合物且在步驟(b)中沒有偵測到該等多肽/抗體複合物,則該樣品含有可專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲多肽之抗體且不含有可專一性地結合片狀邊蟲多肽之抗體。倘若在步驟(a)中沒有偵測到該等多肽/抗體複合物且在步驟(b)中偵測到該等多肽/抗體複合物,則該樣品含有可專一性地結合片狀邊蟲多肽之抗體且不含有可專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲多肽之抗體。倘若在步驟(a)中沒有偵測到該等多肽複合物且在步驟(b)中沒有偵測到該等多肽複合物,則該樣品不含有對片狀邊蟲多肽具專一性之抗體且不含有對嗜吞噬細胞邊蟲多肽具專一性之抗體。
本發明之多肽、聚核苷酸及抗體可用於治療、改善或預防由Apl及/或Aph造成的疾病。舉例而言,可對諸如人或狗等動物投與諸如本發明之單株抗體或其抗原結合片段等抗體。在本發明之一個實施例中,一種抗體或其抗原結合片段可以包含醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物投與動物。一種醫藥組合物包含治療有效量的抗體或其抗原結合片段。治療有效量係可有效地減輕Apl及/或Aph感染症狀或減少個體中Apl及/或Aph有機體之量的量。
本發明之多肽或聚核苷酸可存於免疫原性組合物中且可用於在宿主中誘出免疫反應。免疫原性組合物或免疫原能夠在動物中誘導免疫反應。本發明之免疫原性多肽或聚核苷酸組合物尤其可用於敏化動物之免疫系統以便於(作為一個結果)產生可改善或預防Apl及/或Aph感染效應之免疫反應。免疫反應在動物模型中之誘出可用於確定(例如)最佳劑量或投與途徑。免疫反應之誘出亦可用於治療、預防或改善由Apl及/或Aph造成的疾病或感染。免疫反應包括體液免疫反應或細胞介導之免疫反應、或其組合。免疫反應亦可包含全身性宿主反應之提升,例如,藉由促進防禦素產生。
本發明之一個實施例提供一種包含本發明多肽及一個或多個在羧基末端或胺基末端處共價連接至該多肽之額外區域或部分的免疫原。每一區域或部分能夠(例如)增強疫反應、利於免疫原純化或利於多肽穩定性。
動物抵抗Apl及/或Aph之抗體效價的產生在防止感染及清除感染方面可能十分重要。在遞送多肽或聚核苷酸後偵測及/或定量抗體效價可用於鑑別在誘出抗體效價時特別有效的抗原決定部位。可藉由誘出針對不同長度之Apl及/或Aph多肽之抗體來鑑別對Apl及/或Aph之強抗體反應負責的抗原決定部位。隨後可使用(例如)ELISA檢驗來測試由特定多肽抗原決定部位誘出的抗體以確定哪些多肽含有在產生強反應時最有效的抗原決定部位。隨後可構建含有此等抗原決定部位或編碼該等抗原決定部位之聚核苷酸的多肽或融合蛋白並使用其來誘出強抗體反應。
可將本發明之多肽、聚核苷酸或抗體投與諸如小鼠、兔、豚鼠、短尾瘊、狒狒、黑猩猩、人、牛、綿羊、豬、馬、狗、貓等哺乳動物或投與諸如雞或鴨等動物以在活體內誘出抗體。注射聚核苷酸具有簡化構建及修飾之實際優點。進而言之,注射聚核苷酸可在宿主中合成多肽。因此,將該多肽呈遞給具有天然轉譯後修飾、結構及構象之宿主免疫系統。可將聚核苷酸作為「裸露DNA」遞送給個體。
可藉由業內已知任一方式投與聚核苷酸、多肽或抗體,包括肌內、靜脈內、肺內、肌內、皮內、腹膜腔內或皮下注射、氣溶膠、鼻內、輸液泵、栓劑、黏膜、局部、及經口,包括使用生物彈道槍(「基因槍」)進行注射。聚核苷酸、多肽或抗體可能伴隨蛋白載劑以供經口投與。亦可使用若干投與方法之組合來誘出免疫反應。抗體可以約0.5mg至約200mg之日劑量投與。在本發明之一個實施例中,抗體可以約20至約100mg之日劑量投與。
供治療使用的醫藥上可接受之載劑及稀釋劑以及獸醫上可接受之載劑及稀釋劑在業內為眾人所熟知且闡述於(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing公司(A.R. Gennaro編寫(1985))中。該載劑本身應不會誘導對宿主有害之抗體產生。此等載劑包括但不限於諸如蛋白等較大緩慢代謝之大分子、諸如乳膠官能團化SEPHAROSE、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠粒及諸如此類等多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、諸如聚穀胺酸、聚離胺酸、及諸如此類等聚合胺基酸、胺基酸共聚物、類肽、類脂質及無活性無毒性病毒粒子或細菌細胞。亦可使用脂質體、水凝膠、環糊精、生物可降解之毫微型膠囊及生物黏結劑作為本發明組合物之載劑。
醫藥上可接受之鹽亦可用於本發明組合物,舉例而言,諸如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽等礦物鹽以及諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽等有機酸鹽。尤其有用的蛋白基質係血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風類毒素、及其他為彼等熟習此項技術者熟知的蛋白。本發明之組合物亦可含有諸如水、鹽水、磷酸緩衝鹽溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、漢克氏溶液(Hank's solution)、葡萄糖、甘油、右旋糖、麥芽糖糊精、乙醇或諸如此類等單獨或組合之液體或賦形劑以及諸如潤濕劑、乳化劑、滲透調節劑、清潔劑或pH緩衝劑等物質。亦可使用諸如殺菌劑等額外活性劑。
倘若需要,則本發明組合物可包括諸如B7-1或B7-2等可改良呈遞給淋巴細胞之免疫原的共同刺激分子或者諸如MIP1α、GM-CSF、IL-2及IL-12等細胞因子。視情況,組合物亦可包括佐劑。佐劑係可用於非專一性地增強專一性免疫反應之物質。一般而言,佐劑與本發明多肽在呈遞給免疫系統之前混合或者分開呈遞,但呈遞至動物之相同位點。佐劑可包括(例如)油佐劑(例如,弗氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvants))、礦物鹽(例如,Alk(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、矽石、明礬、Al(OH)3及Ca3(PO4)2)、聚核苷酸(亦即,Poly IC及Poly AU酸)及某些天然物質(例如,來自結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之蠟D)以及發現於小棒桿菌(Corynebacterium parvum)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)及布魯氏菌屬(genus Brucella)成員中之物質。可使用的佐劑包括但不限於MF59-0、氫氧化鋁、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異穀醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異穀醯胺(CGP 11637),稱作去甲-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異穀胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP 19835A,稱作MTP-PE)、及RIBI,其在2%角鯊烯/TWEEN 80(聚山梨醇酯)乳液中含有三種自細菌提取的組份,單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
可將本發明之組合物調配成可攝食錠劑、口含錠劑、含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑、可注射調配物、漱口劑、潔牙劑、及諸如此類。一或多種本發明之多肽、聚核苷酸或抗體在此等組合物及製劑中之百分比可自佔該單元之0.1重量%至60重量%變化。
投與多肽、聚核苷酸或抗體可在動物中誘出免疫反應,持續至少1周、1個月、3個月、6個月、1年或更長。視情況,可藉由在初次注射後在1個月、3個月、6個月、1年或更長時間時提供多肽、聚核苷酸或抗體之一個或多個加強注射來維持免疫反應。倘若需要,則可在該等組合物之前、之後或與其同時提供共同刺激分子或佐劑。
包含多肽、聚核苷酸、抗體或其組合之本發明組合物可以與所用特定組合物相容之方式及以有效地誘出免疫反應(如藉由(例如)ELISA所偵測得)之量投與。聚核苷酸可以1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg、1000ng/kg、0.001mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg之劑量經肌內注射投與諸如狒狒、黑猩猩、狗或人等哺乳動物。多肽或抗體可以0.01、0.05、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg/kg之劑量經肌內注射投與哺乳動物。
多肽、聚核苷酸、或抗體、或其組合可投與未感染Apl及/或Aph之動物或者可投與感染Apl及/或Aph之動物。免疫學上有效量或治療有效量意指以單劑或作為一系列投藥之一部分對個體投與的可有效地治療、改善或預防Apl及/或Aph感染之量。聚核苷酸、多肽或抗體在組合物中之具體劑量可視許多因素而定,該等因素包括但不限於物種、年齡、性別、並存藥物、投與該組合物之哺乳動物的一般狀況及該組合物之投與模式。可僅使用常規實驗來容易地測定本發明組合物之有效量。
所有專利、專利申請案及在本文任何地方所提及其他科學或技術著作均全文以引用方式併入本文中。本文以說明方式闡述之本發明可於缺少本文未具體揭示的任何要素、限制下以適宜方式實施。因此,例如,在本文之每一情形中,術語「包含」、「基本上由...所組成」及「由...所組成」中之任一者都可用另外兩個術語中之任一個來替代,但保留其常用含義。所用術語及措詞用作說明性而非限定性術語,且並非旨在使用此等術語及措詞來排除所示及所述特徵或其部分之任何等效物,而是應瞭解,在所申請本發明範疇內亦可存在各種修改形式。因此,應瞭解,儘管已藉由實施例來具體揭示本發明,然而彼等熟習此項技術者亦可採取本文所揭示概念之可選特徵、修改及變化形式,且此等修改及變化形式仍視為屬於由說明書及隨附申請專利範圍所界定之本發明範疇。
另外,當本發明之特徵或態樣依據Markush群組或其他替代分組闡述時,彼等熟習此項技術者可認識到本發明亦可因此依據Markush群組或其他群組之任一個別成員或若干成員之小組來闡述。
將在SEQ ID NO:12-18及10中所示多肽以0.5μg/mL塗佈於在碳酸鹽緩衝劑(pH 9.6)中之Immulon 4微量滴定板上,過夜。對於所有實例而言,在SEQ ID NO:10中所示多肽在143位具有N、在145位具有A及在156位具有I。
用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌2次。用存於0.1M Tris pH 7.6中之2% TWEEN 20(聚山梨醇酯)/2.5%蔗糖將該等板封阻2h且隨後用乾燥劑乾燥過夜。向該等板中添加測試樣品在偶聯物稀釋劑中之1:200稀釋物並培育40分鐘。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加在偶聯物稀釋劑中以1:2000稀釋之HRP-偶聯之兔抗-狗IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司,West Grove,PA;目錄編號304-035-003)並培育40分鐘。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加60μl 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(「TMB」)並培育10分鐘。添加50μl終止溶並測定A650。測試樣品係如下:
APL_13DPI:以實驗方式感染Apl之狗在感染後13天
APL_78DPI 以實驗方式感染Apl之狗在感染後78天
APH:來自7只感染Aph之明尼蘇達州狗之樣品群
陰性樣品:來自7只任意健康狗之樣品群
結果顯示於表1及圖1中。
所有8種測試肽對來自7只感染Aph之明尼蘇達州狗之血清群均顯示陽性反應性。rp44、p44-2及p44-3在2個不同的感染時間點對以實驗方式感染Apl之狗之血清顯示交叉反應性。p44-1、p44-4、p44-4-1、p44-4-2及p44-4-3與以實驗方式感染Apl之狗之血清的反應性接近背景值。因此,多肽p44-1、p44-4、p44-4-1、p44-4-2及p44-4-3對來自感染Apl之狗之血清無交叉反應性。
將多肽(Aph p44-4及Apl p44-4,在0.5μg/mL下;Aph rp44,在0.25μg/mL下)塗佈於在碳酸鹽緩衝劑pH 9.6中之Immulon 4板上,過夜。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌2次且隨後用存於0.1M Tris pH 7.6中之2% TWEEN 20(聚山梨醇酯)/2.5%蔗糖將其封阻2h。用乾燥劑將該等板乾燥過夜。將25μL測試樣品與50μL肽:HRP偶聯物(對於p44-4-Aph(SEQ ID NO:15):HRP偶聯物而言為0.5μg/mL,對於p44-4-Apl(SEQ ID NO:19):HRP偶聯物而言為1μg/mL,及對於Aph rp44偶聯物而言為3μg/mL)混合並用該微量滴定板培育(培育時間在圖2所示實驗中為1小時且在圖3所示實驗中為1小時45分鐘)。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加60μl TMB並培育10分鐘。添加50μl終止溶液並測定A650。基於對10種陰性樣品之反應性來測定截止值;截止值=平均值+2x SD(標準偏差)。
圖2展示使用來自片狀邊蟲流行病區(HP:亞利桑那,P:巴哈馬)之活狗之片狀邊蟲陽性樣品的結果。rp44(SEQ ID NO:10)對5個「HP」樣品中之4個提供陽性結果及對7個「P」樣品中之7個提供陽性結果。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)對5個「HP」樣品中之0個提供陽性結果及對7個「P」樣品中之0個提供陽性結果。Apl p44-4(SEQ ID NO:19)對5個「HP」樣品中之5個提供陽性結果及對7個「P」樣品中之7個提供陽性結果。因此,Aph p44-4與來自感染Apl之狗之血清並不交叉反應。
圖3展示使用來自Aph流行病區(明尼蘇達州「ME」)之活狗之嗜吞噬細胞邊蟲陽性樣品的結果。rp44(SEQ ID NO:10)對22個ME樣品中之21個提供強陽性結果。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)對22個ME樣品中之20個提供強陽性結果。Apl p44-4(SEQ ID NO:19)對22個ME樣品中之18個提供陰性結果及對22個ME樣品中之4個提供十分弱的陽性結果。因此,Apl p44-4可視為與來自感染Aph之狗之血清並不交叉反應。
將多肽(Aph p44-4及Apl p44-4,在0.5μg/mL下;Aph rp44,在0.25μg/mL下)塗佈於在碳酸鹽緩衝劑pH 9.6中之Immulon 4微量滴定板上,過夜。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌3次。用存於0.1M Tris pH 7.6中之2% TWEEN 20(聚山梨醇酯)/2.5%蔗糖將該等板封阻2h且乾燥過夜。將25μL測試樣品與50μL肽:HRP偶聯物(對於Aph p44-4偶聯物而言為0.5μg/mL,對於Apl p44-4偶聯物而言為1μg/mL,及對於Aph rp44偶聯物而言為3μg/mL)混合並用該微量滴定板培育1小時。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。添加60μl TMB並培育10分鐘。添加50μl終止溶液並測定A650。結果示於圖4中。
結果證明SEQ ID NO:19(Apl p44-4)可用於偵測Apl感染。SEQ ID NO:19能夠在感染後約10天時偵測Apl感染。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)顯示與來自感染Apl之狗之血清無交叉反應性。Aph rp44(SEQ ID NO:10)在約14天時與來自感染Apl之狗之血清交叉反應且可用於偵測Apl及Aph感染。
測試Aph p44-4(SEQ ID NO:15)及Aph rp44(SEQ ID NO:10)與來自以實驗方式感染Aph之狗之血清在一系列時間點時之反應性。亦測試11個任意健康的野外狗樣品。將該等多肽(Aph p44-4,在0.5μg/mL下;Aph rp44,在0.25μg/mL下)塗佈於在碳酸鹽緩衝劑pH 9.6中之Immulon 4微量滴定板上,過夜。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌4次。用存於0.1M Tris pH 7.6中之2% TWEEN 20(聚山梨醇酯)/2.5%蔗糖將該等板封阻2h且隨後用乾燥劑乾燥過夜。將25μL測試樣品與50μL肽:HRP偶聯物(對於p44-4-Aph(SEQ ID NO:15):HRP偶聯物而言為0.5μg/mL,及對於Aph rp44偶聯物而言為3μg/mL)混合並添加至該等板中。將該等板培育1小時。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加TMB並培育10分鐘。添加50μl終止溶液並測定A650。結果示於圖5中。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)能夠在感染後約10天至14天時偵測Aph感染。Aph rp44(SEQ ID NO:10)能夠在感染後約10天時偵測Aph感染。
將多肽以0.5μg/mL或1.0μg/mL塗佈於在碳酸鹽緩衝劑pH 9.6中之Immulon 4板上,過夜。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌4次且隨後用存於0.1M Tris pH 7.6中之2% TWEEN 20(聚山梨醇酯)/2.5%蔗糖將其封阻2h。用乾燥劑將該等板乾燥過夜。將100μl以1:200在樣品稀釋劑中稀釋之測試血清樣品培育45分鐘。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。添加100μl以1:2000在樣品稀釋劑中稀釋之HRP-偶聯之兔抗-狗IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司,West Grove,PA;目錄編號304-035-003)並培育45分鐘。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加60μl TMB並培育10分鐘。添加50μl終止溶液並測定A650。測試樣品係如下:
陽性(「+」)代表7種來自晚期Aph感染之狗的血清群
陰性(「-」)代表7種任意健康的狗之血清樣品群
VML8、VML14、VML21及VML156代表來自4只對Aph為IFA陽性且具有急性邊蟲病臨床跡象之狗的血清樣品。結果示於圖6中。Aph p44-4與該4種血清反應。Aph p44-1及Aph p44-2不與該4種血清反應,而Aph p44-3與該4種血清反應較弱。因此,Aph p44-4及Aph p44-3可用於偵測具有急性邊蟲病臨床跡象之個體之Aph。
用在表2中所列示樣品測試Aph p44-4-v(SEQ ID NO:20)。
將多肽以0.5μg/mL塗佈於在碳酸鹽緩衝劑pH 9.6中之Immulon 4板上,過夜。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌2次且隨後用存於0.1M Tris pH 7.6中之2% TWEEN 20(聚山梨醇酯)/2.5%蔗糖將其封阻2h。用乾燥劑將該等板乾燥過夜。向該等板中添加以1:200在偶聯物稀釋劑中稀釋之測試樣品並培育40分鐘。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加以1:2000在偶聯物稀釋劑中稀釋之HRP-偶聯之兔抗-狗IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司,West Grove,PA;目錄編號304-035-003)並培育40分鐘。用PetChek洗滌緩衝劑將該等板洗滌6次。向該等板中添加60μl TMB並培育10分鐘。添加50μl終止溶液並測定A650。結果示於圖7中且代表一式兩份實驗之平均值。p44-4-v對下列樣品提供陽性結果:VML21;ILS73、APH及+ve;且對下列樣品提供陰性結果:APL及-ve。因此,Aph p44-4-v可偵測急性病例之Aph感染且至少在感染後最早在14天時。Aph p44-4-v與來自感染Apl之狗之血清不交叉反應。
圖1顯示藉助包含SEQ ID NO:12-18及10之多肽完成的檢驗之結果;
圖2顯示藉助包含SEQ ID NO:15、19及10之多肽完成的檢驗之結果;
圖3顯示藉助包含SEQ ID NO:15、19及10之多肽完成的檢驗之結果;
圖4顯示藉助包含SEQ ID NO:15、19及10之多肽完成的時程檢驗之結果;
圖5顯示藉助包含SEQ ID NO:15及10之多肽完成的時程檢驗之結果;
圖6顯示藉助包含SEQ ID NO:12-15之多肽完成的檢驗之結果;及
圖7A-B顯示藉助包含SEQ ID NO:20之多肽完成的檢驗之結果。
(無元件符號說明)
Claims (13)
- 一種包含一或多種經純化多肽之組合物,該一或多種經純化多肽係由如下所組成:(a)如SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列;(b)如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列;(c)如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列;(d)如SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列;(e)如SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列;(f)如SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列;(g)如SEQ ID NO:1、4、5、6、7、8、9、12、15、16、17、18、19或20所示之胺基酸序列中至少17個鄰接胺基酸;(h)與SEQ ID NO:1、8、9、15、16、17、18、19或20具有至少約94%一致性之多肽;或(i)具有少於40個胺基酸且與SEQ ID NO:4、5、6、7或11具有至少約94%一致性之多肽。
- 一種包含一或多種經純化多肽之組合物,該一或多種經純化多肽係由如下所組成:(a)如SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列;(b)如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列;(c)如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列;(d)如SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列;(e)如SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列;(f)如SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列; (g)如SEQ ID NO:1、4、5、6、7、8、9、12、15、16、17、18、19或20所示之胺基酸序列中至少17個鄰接胺基酸;(h)與SEQ ID NO:1、8、9、15、16、17、18、19或20具有至少約94%一致性之多肽;或(i)具有少於40個胺基酸且與SEQ ID NO:4、5、6、7或11具有至少約94%一致性之多肽,其中該一或多種經純化多肽連接至指示試劑、信號序列、終止轉移序列、胺基酸間隔子、跨膜結構域、蛋白純化配體、異源性多肽、可增強免疫反應之部分、幫助純化之部分、幫助多肽穩定性之部分、一或多種包含SEQ ID NO:1-21之額外多肽、或其組合。
- 如請求項1之組合物,其進一步包含醫藥上可接受之或獸醫上可接受之載劑。
- 如請求項3之組合物,其進一步包含佐劑。
- 一種經分離聚核苷酸,其編碼如請求項1之一或多種經純化多肽。
- 一種偵測測試樣品中專一性地結合嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者之抗體之方法,其包含:(a)於體外使包含如請求項1之一或多種經純化多肽之組合物與該測試樣品在可形成多肽/抗體複合物之條件下接觸;(b)偵測該等多肽/抗體複合物;其中偵測到該等多肽/抗體複合物表示在該測試樣品中存 在對嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者具專一性之抗體。
- 如請求項6之方法,其中該一或多種經純化多肽連接至指示試劑、信號序列、終止轉移序列、跨膜結構域、胺基酸間隔子、蛋白純化配體、異源性多肽、增強免疫反應之部分、幫助純化之部分、幫助多肽穩定性之部分、一或多種包含SEQ ID NO:1-21之額外多肽、或其組合。
- 如請求項6之方法,其中該組合物所含一或多種經純化多肽係由如SEQ ID NO:8或19所示的胺基酸序列中之至少17個鄰接胺基酸所組成;且其中偵測到該等多肽/抗體複合物表示在該測試樣品中存在對片狀邊蟲具專一性之抗體。
- 如請求項6之方法,其中該組合物所含一或多種經純化多肽,其係由如下所組成:(a)如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列;或(b)與SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列具有至少約94%一致性之多肽,且其中偵測到該等多肽/抗體複合物表示在該測試樣品中存在對嗜吞噬細胞邊蟲多肽或片狀邊蟲多肽或二者具專一性之抗體。
- 如請求項6之方法,其中該組合物所含一或多種經純化多肽,其係由如下所組成:(a)如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列中之至少17個鄰接胺基酸; (b)如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列;(c)如SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列;(d)如SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列;(e)如SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列;或(f)與SEQ ID NO:1、4、5、6或7所示之胺基酸序列具有至少約94%一致性之多肽,且其中偵測到該等多肽/抗體複合物表示在該測試樣品中存在對嗜吞噬細胞邊蟲多肽具專一性之抗體。
- 如請求項6之方法,其進一步包含在實施步驟(b)之前,使步驟(a)之該等複合物與指示試劑接觸。
- 如請求項6之方法,其中該測試樣品中抗體含量係經測量。
- 如請求項6之方法,其中該一或多種經純化多肽係經附接至基質上。
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