JP2012504964A - アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Aph)およびアナプラズマ・プラチス(Apl)に特異的な抗体を検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】
なし
Description
本出願は米国特許仮出願第61/103,743号(2008年10月8日出願)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に基づく優先権を主張する。
アナプラズマ症は哺乳動物(例えばヒト、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、シカ、および反芻動物)に発生し、マダニ媒介性病原体、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Anaplasma phagocytophilum;「Aph」)(以前はエーリキア・エクイ(Ehrlichia equi)として知られていた)による顆粒球細胞の感染によって引き起こされる。一般的な臨床症状には発熱、嗜眠、歩行困難、血小板減少、リンパ節腫脹、および食欲不振(anexoria)があるが、これらは全て、アナプラズマ症に特異的なものではない。従って、正確な診断のためには特異的な試験が重要である。
本発明のある態様では、SEQ ID NO:8もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列から成るか、または、SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;SEQ ID NO:10のアミノ酸85-130;SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸136-155から成るか、または、SEQ ID NO:1-21のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成るか、または、SEQ ID NO:1-21と少なくとも94%の同一性を有するポリペプチドから成る精製ポリペプチドを1つまたはそれ以上含有する組成物を提供する。この1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドは、指示薬、シグナル配列、輸送停止配列、アミノ酸スペーサー、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、異種ポリペプチド、免疫応答を亢進する部分、精製を促進する部分、ポリペプチドの安定性を向上する部分、SEQ ID NO:1-21を含有する1つもしくはそれ以上の更なるポリペプチド、またはそれらの組み合わせに結合していてもよい。本発明の別の態様では、1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のポリペプチド
本明細書で使用する単数形(「a」、「an」、および「the」)は、特に記載しない限り、その複数形も包含する。
1.SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45(Aph p44-1)(SEQ ID NO:1および12と同じ反応性を有する)
2.SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89(Aph p44-2)(SEQ ID NO:2および13と同じ反応性を有する)
3.SEQ ID NO:10のアミノ酸85-130(Aph p44-3)(SEQ ID NO:3および14と同じ反応性を有する)
4.SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160(Aph p44-4)(SEQ ID NO:4、9、11、15、および20と同じ反応性を有する)
5.SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146(Aph p44-4-1)(SEQ ID NO:5および16と同じ反応性を有する)
6.SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160(Aph p44-4-2)(SEQ ID NO:6および17と同じ反応性を有する)
7.SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155(Aph p44-3)(SEQ ID NO:7および18と同じ反応性を有する)
更に、SEQ ID NO:8および9は同じ反応性を有する、すなわち、それらのポリペプチドは実質的に同様に、アナプラズマ抗原に特異的な抗体と特異的に結合する。
本発明のポリヌクレオチドは全微生物ゲノムより少ないゲノムを含有してもよく、また、1本鎖または2本鎖核酸であってもよい。ポリヌクレオチドはRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学的に合成したRNAもしくはDNA、またはそれらの組み合わせであってもよい。ポリヌクレオチドを精製して、他の成分(例えばタンパク質、脂質、および他のポリヌクレオチド)を含有しないようにしてもよい。例えばポリヌクレオチドは50%、75%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の純度であってもよい。例えばcDNAもしくはゲノム・ライブラリー内の、数百から数百万の他の核酸分子中に存在する核酸分子、またはゲノムDNA制限酵素消化物を含有するゲル切片は、精製ポリヌクレオチドと見なされない。本発明のポリヌクレオチドは上記の本発明のポリペプチドをコードする。本発明のある態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-21に示すポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。
本発明の抗体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチド、アナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、本発明の変異型ポリペプチド、またはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体分子である。本発明の抗体はAphポリペプチド、Aplポリペプチド、変異型ポリペプチド、またはそれらの組み合わせに特異的であってもよく、例えばSEQ ID NO:1-21の1つまたはそれ以上に特異的な抗体であってもよい。本発明の別の態様では、抗体はアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドに特異的である(例えばSEQ ID NOs:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、または20に特異的な抗体)。本発明の別の態様では、抗体はアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドに特異的である(例えばSEQ ID NO:8または19に特異的な抗体)。本発明の別の態様では、抗体はアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドおよびアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドの両方に特異的である(例えばSEQ ID NO:2、3、10、13、14、または21に特異的な抗体)。当業者は、本明細書に記載するアッセイを用いて、抗体がアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドまたはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドに特異的であるか否かを容易に判定できる。本発明の抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、1本鎖抗体(scFv)、または抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントはインタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含むインタクトな抗体の一部分であって、その部分はインタクトな抗体のFc領域の定常重鎖ドメインを含有しない。抗原結合抗体フラグメントの例として、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、およびFvフラグメントがある。
(a)SEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントへの結合を巡って参照抗体と競合する;(b)参照抗体と同じSEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントのエピトープに結合する;(c)参照抗体と実質的に同じKdでSEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントに結合する;および/または、(d)参照抗体と実質的に同じオフレートでSEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントに結合する(ここで、参照抗体はSEQ ID NO:1-21のポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントにKa=107 l/molまたはそれ以上の結合アフィニティーで特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである)。
本発明の方法を用いて、試験サンプル、例えば生体サンプル、環境サンプル、または実験用サンプル中のアナプラズマ抗原、Apl抗原、Aph抗原、Aplポリヌクレオチド、Aphポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体またはその特異的結合フラグメントを検出してもよい。試験サンプルは、Aplポリヌクレオチド、Aphポリヌクレオチド、Aplポリペプチド、アナプラズマ種ポリペプチド、Aphポリペプチド、アナプラズマ種に特異的な抗体、Aplに特異的な抗体、および/もしくはAphに特異的な抗体、無関係のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、もしくは抗原、または上記のものの組み合わせを含有する可能性があるか、あるいは上記のいずれも含有しない可能性があってもよい。生体サンプルには、例えば哺乳動物(ウマ、ネコ、イヌ、またはヒトなど)由来の血清、血液、細胞、血漿、唾液、尿、糞便、または組織がある。試験サンプルは未処理であるか、または沈殿、分画、分離、希釈、濃縮、もしくは精製を行ってもよい。
(a)SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、または20から成るポリペプチドに特異的に結合する1つまたはそれ以上の抗体をポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下でサンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;および
(b)SEQ ID NO:8または19から成るポリペプチドに特異的に結合する1つまたはそれ以上の抗体をポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下でサンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること。
(a)SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、または20を含有する1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下で試験サンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;および
(b)SEQ ID NO:8または19を含有する1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下で試験サンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を使用して、Aplおよび/またはAphに起因する疾患を治療、寛解、または予防することができる。例えば、抗体(例えば本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント)を動物(例えばヒトまたはイヌ)に投与してもよい。本発明のある態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物として動物に投与する。医薬組成物は治療的有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。治療的有効量は、被験体におけるAplおよび/またはAph感染の症状の改善またはAplおよび/またはAph菌体量の低減に有効な量である。
実施例1 Aph p44タンパク質に由来するポリペプチドを用いた抗Aphおよび抗Apl抗体の検出
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したSEQ ID NO:12-18および10に示すポリペプチド(0.5μg/mL)でImmulon(登録商標)4マイクロタイター・プレートを一晩コーティングした。全ての実施例で、SEQ ID NO:10に示すポリペプチドは143位にN、145位にA、および156位にIを有する。
APL_13DPI:実験的にAplに感染させたイヌ(感染13日後)
APL_78DPI:実験的にAplに感染させたイヌ(感染78日後)
APH:ミネソタからのAph感染イヌ(7検体)由来サンプルのプール
neg:無作為抽出した健常イヌ(7検体)由来サンプルのプール
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(Aph p44-4およびApl p44-4は0.5μg/mL;Aph rp44は0.25μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで2回洗浄した後、2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングした。乾燥剤を用いてプレートを一晩乾燥させた。25μLの試験サンプルを50μLのペプチド:HRPコンジュゲート(p44-4-Aph(SEQ ID NO:15):HRPコンジュゲートでは0.5μg/mL、p44-4-Apl(SEQ ID NO:19):HRPコンジュゲートでは1μg/mL、Aph rp44コンジュゲートでは3μg/mL)と混合し、マイクロタイター・プレート上でインキュベートした(インキュベート時間は、図2に示す実験では1時間、図3に示す実験では1時間45分とした)。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μLのTMBをプレートに添加し、10分間インキュベートした。50μLの停止溶液を添加し、A650を測定した。カットオフ値を10検体の陰性サンプルとの反応性に基づいて決定した;カットオフ=平均値+2 x SD(標準偏差)。
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(Aph p44-4およびApl p44-4は0.5μg/mL;Aph rp44は0.25μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで3回洗浄した。プレートを2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングし、一晩放置して乾燥させた。25μLの試験サンプルを50μLのペプチド:HRPコンジュゲート(Aph p44-4コンジュゲートでは0.5μg/mL、Apl p44-4コンジュゲートでは1μg/mL、Aph rp44コンジュゲートでは3μg/mL)と混合し、マイクロタイター・プレート上で1時間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μLのTMBを添加し、10分間インキュベートした。50μLの停止溶液を添加し、A650を測定した。結果を図4に示す。
Aph p44-4(SEQ ID NO:15)およびAph rp44(SEQ ID NO:10)を、実験的にAphに感染させたイヌ由来の血清との反応性に関して、一連の時点において試験した。11検体の無作為抽出した健常なフィールド犬サンプルも試験した。炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(Aph p44-4は0.5μg/mL;Aph rp44は0.25μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで4回洗浄した。プレートを2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングし、乾燥剤を用いてプレートを一晩乾燥させた。25μLの試験サンプルを50μLのペプチド:HRPコンジュゲート(p44-4-Aph(SEQ ID NO:15):HRPコンジュゲートでは0.5μg/mL、Aph rp44コンジュゲートでは3μg/mL)と混合し、プレートに添加した。プレートを1時間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。TMBをプレートに添加し、10分間インキュベートした。50μLの停止溶液を添加し、A650を測定した。結果を図5に示す。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)は、感染後約10〜14日でAph感染を検出できた。Aph rp44(SEQ ID NO:10)は、感染後約10日でAph感染を検出できた。
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(0.5μg/mLまたは1.0μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで4回洗浄した後、2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングした。乾燥剤を用いてプレートを一晩乾燥させた。サンプル希釈剤で1:200に希釈した血清試験サンプル100μlを45分間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。サンプル希釈剤で1:2000に希釈したHRPコンジュゲート・ウサギ抗イヌIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories社、ペンシルバニア州ウェストグローブ;カタログ番号:304-035-003)100μLを添加し、45分間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μlのTMBをプレートに添加し、10分間インキュベートした。50μlの停止溶液を添加し、A650を測定した。試験サンプルは以下の通りである:
陽性(「+」)は後期Aph感染イヌ由来の血清7検体のプールを示す。
陰性(「-」)は無作為抽出した健常イヌ血清7検体のプールを示す。
VML8、VML14、VML21、およびVML156は、IFAでAph陽性であり、アナプラズマ症の急性臨床兆候を示すイヌ4検体由来の血清サンプルを示す。結果を図6に示す。Aph p44-4は4検体の血清と反応した。Aph p44-1およびAph p44-2は4検体の血清と反応せず、Aph p44-3は4検体の血清とわずかに反応した。従って、Aph p44-4およびAph 44-3は、アナプラズマ症の急性臨床兆候を示す被験体におけるAphの検出に使用できる。
Aph p44-4-v(SEQ ID NO:20)を表2に示すサンプルを用いて試験した。
Claims (22)
- SEQ ID NO:8もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列から成る;または、SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;SEQ ID NO:10のアミノ酸85-130;SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸136-155から成る;または、SEQ ID NO:1-21のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成る;または、SEQ ID NO:1-21と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成る精製ポリペプチドを1つまたはそれ以上含有する組成物。
- 請求項1記載の1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドが指示薬、シグナル配列、輸送停止配列、アミノ酸スペーサー、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、異種ポリペプチド、免疫応答を亢進する部分、精製を促進する部分、ポリペプチドの安定性を向上する部分、SEQ ID NO:1-21を含有する1つもしくはそれ以上の更なるポリペプチド、またはそれらの組み合わせに結合している、請求項1記載の組成物。
- 試験サンプル中のアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的に結合する抗体を検出する方法であり、以下:
(a)請求項1記載の1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物を、ポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下で試験サンプルと接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;
を含み、ポリペプチド/抗体複合体の検出が、試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的な抗体の存在を示す、上記方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドが指示薬、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、アミノ酸スペーサー、タンパク質精製リガンド、異種ポリペプチド、免疫応答を亢進する部分、精製を促進する部分、ポリペプチドの安定性を向上する部分、SEQ ID NO:1-21を含有する1つもしくはそれ以上の更なるポリペプチド、またはそれらの組み合わせに結合している、請求項4記載の組成物。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物がSEQ ID NO:8または19のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が、試験サンプルにおけるアナプラズマ・プラチスに特異的な抗体の存在を示す、請求項4記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物がSEQ ID NO:10のアミノ酸配列;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成る;または、SEQ ID NO:10;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的な抗体の存在を示す、請求項4記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物がSEQ ID NO:10のアミノ酸1-45、SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成る;または、SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45、SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドに特異的な抗体の存在を示す、請求項4記載の方法。
- 工程(b)の実施前に工程(a)の複合体を指示薬と接触させることを更に含む、請求項4記載の方法。
- 試験サンプル中の抗体の量を測定する、請求項4記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドが基材に結合する、請求項4記載の方法。
- SEQ ID NO:1-21から成るポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fab'-SHフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖抗体である、請求項12記載の抗体。
- サンプル中のアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方を検出する方法であり、以下:
(a)請求項1記載の1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドに特異的に結合する1つまたはそれ以上の抗体を、ポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下でサンプルと接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;
を含み、ポリペプチド/抗体複合体の検出がサンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方の存在を示す、上記方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドがSEQ ID NO:10のアミノ酸1-45、SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146、SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160、SEQ ID NO: 10のアミノ酸136-155の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドの存在を示す、請求項14記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドがSEQ ID NO:8または19のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドの存在を示す、請求項14記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドがSEQ ID NO:10のアミノ酸配列;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;またはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドまたはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドの存在を示す、請求項14記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fab'-SHフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖抗体である、請求項14記載の方法。
- 医薬的に許容される、または獣医学的に許容されるキャリアを更に含む、請求項1記載の組成物。
- アジュバントを更に含む、請求項19記載の組成物。
- 哺乳動物被験体におけるアナプラズマ・プラチス感染、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム感染、またはその両方を治療または寛解する方法であり、哺乳動物被験体に治療的有効量の請求項19記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
- 哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であり、免疫学的有効量の請求項19記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む上記方法。
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