JPH09165397A - 因子ＶＩＩおよび活性化因子ＶＩＩａの精製法 - Google Patents

因子ＶＩＩおよび活性化因子ＶＩＩａの精製法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 因子VIIおよび／または活性化因子VIIａ（Ｆ
VII／ＦVIIａ）を精製する方法の提供。 【解決手段】 この方法は、因子VIIおよび／または因
子VIIａを含有する溶液からそれらを固定化可溶トロン
ボプラスチンに結合し、非結合分子を洗浄により除去
し、そして結合因子VIIおよび／または因子VIIａを溶離
することにより因子VIIおよび／または因子VIIａを取出
すことからなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は固定化可溶トロンボプラスチンへ
の結合により因子VIIおよび／または活性化因子VIIａ
（ＦVII／ＦVIIａ）を精製する方法に関する。凝固因子
VII（ＦVII）はトロンボプラスチン（組織因子、ＴＦ）
と一緒に外因性の凝固経路を開始させる複合体を構成す
る。組織損傷が起ると、ＴＦが露出され、ＦVIIおよび
／またはＦVIIａはその細胞外タンパク質ドメインと結
合できるようになる。疎水性タンパク質領域はＴＦを膜
に固定する。
【０００２】（好ましくは負電荷の）脂質およびカルシ
ウムの存在下で、ＦVII／ＦVIIａ混合物の生理学的に活
性な成分、すなわちＴＦ−ＦVIIａは効果的に因子Ｘ
（ＦX）を活性化する。引き続いてＦXａが（ＦVａ、脂
質およびカルシウムと一緒に）トロンビンの生成を触媒
する。その後のフィブリンの生成はとりわけ創傷の縫合
を確実にする。膜に位置するＴＦに結合したＦVIIは引
き続いて（ＴＦ−ＦVIIａが介在する）自己活性化によ
り、またはＦIXａ、ＦXａおよびトロンビンにより活性
化され、それにより凝固系のカスケード様活性化をさら
に増強する。
【０００３】相応じて、ＦVIIの欠乏は出血性傾向のよ
うな止血性合併症を伴うことがある。生理学的に機能的
な分子を生成するその合成がビタミンＫの存在に依存す
る凝固子として、合併症は相応じて例えば手術前の（ビ
タミンＫアンタゴニストを用いた）経口抗凝固に関連し
て起こりうるものであり、そして消費性凝固障害および
肝臓損傷はＦVII置換療法を適用するための追加的な徴
候である。他方、ＦVIIａは急性出血に関して使用され
うる活性化ＰＰＳＢ製剤の構成成分である。この他に、
ＦVIIａは例えばＦVIII不耐性の血友病患者に置換療法
を適用する場合に使用される、いわゆる因子VIII−バイ
パス活性（例えば抗体）を有する。
【０００４】ＦVII／ＦVIIａは通常、幾つかの調製工程
を使用して血漿または（組換え体調製の場合）培養上澄
みから濃縮され、その手順は一般に収率の低下を伴な
う。構造的に、またその特性においても他の凝固因子と
関係のあるタンパク質として、相当する混合物からのそ
の精製は困難かつ複雑である。この他に、ＦVIIの場
合、精製工程がより複雑になるため、（望ましい調製法
に従って）回避しなければならない（ＦVIIａへの）活
性化が起こるという危険がある。適当な固定化モノクロ
ーナル抗体を使用する調製法は迅速な方法の例である。
しかしながら、一般にタンパク質を非可逆的に傷つける
溶離条件（pH３〜pH４）が必要である。部分変性は対応
する収率の低下をもたらし、また抗原性にする配座が変
った分子構造となる原因となりうる。したがって、本発
明の根元的な目的はＦVII／ＦVIIａの迅速で温和な精製
法を提供することである。
【０００５】本目的は次のようにして達成された；ＦVI
I／ＦVIIａを含有する溶液からそれらを固定化ｓＴＦ
（“可溶性”トロンボプラスチン、可溶性組織因子）に
結合し、非結合分子をマトリックスから洗浄により除去
し、その後ＦVII／ＦVIIａを温和な条件下で溶離するこ
とによりＦVIIおよび／またはＦVIIａを取り出すもので
ある。これに関して、ｓＴＦはトランスメンブラン部分
および細胞質部分を欠乏しており、したがってＴＦの細
胞外ドメインであるトロンボプラスチンである。
【０００６】本発明者らはＦVII／ＦVIIａとｓＴＦの相
互作用を利用してＦVIIおよび／またはＦVIIａを精製す
ることができることを見い出した。すなわち、“生理学
的に”完全な（脂質と結合する）ＴＦは自己活性化やＦ
IXａ、ＦXａおよびトロンビンによる結合ＦVIIのタンパ
ク質分解またはフィードバック活性化を引き起こすが、
ｓＴＦに結合したＦVIIは変わらないままである（Morri
sseyのThromb. Haemostas. 74: 185〜188（1995
年））。
【０００７】ＦVIIおよび／またはＦVIIａとｓＴＦの結
合は二価のイオン、特にカルシウムの存在下で最適にさ
れるが、他のタンパク質を非結合形態で除去することが
できる。したがって、固定化ｓＴＦはマトリックスに吸
着され、ＦVIIおよび／またはＦVIIａはカルシウムの存
在下で溶液からｓＴＦに結合され、そして非結合分子は
固相から洗浄により除去される。溶離はシトレート、オ
キサレート、タルトレート、ＥＤＴＡなどのようなキレ
ート化剤を含有する緩衝液を使用して温和な方法で行な
われる。
【０００８】ｓＴＦは非共有結合により固相に吸着させ
ることができ、または共有結合により固定することがで
きる。適当な結合相手は慣用的に調製されたｓＴＦ（完
全ＴＦからタンパク質分解的に調製される）、遺伝子組
換えにより調製されたｓＴＦまたはＦVII／ＦVIIａ−結
合部分（ｓＴＦのペプチド領域）である。ｓＴＦまたは
適当なＦVII−結合領域は固定化を簡単または最適にす
る物質に結合させることができる（例えばスペーサー官
能基として、下記参照）。
【０００９】好ましいアプローチでは、LaufferらのＥ
Ｐ ４６４ ５３３に記載のように、Ｆｃフラグメントに
結合したｓＴＦ（Ｆｃ−ｓＴＦ）が使用される。ｓＴＦ
は最適に与えられ、精製法の有効性は例えばＦｃ−ｓＴ
Ｆを抗Ｆｃカラム、タンパク質Ａマトリックスまたはタ
ンパク質Ｇマトリックスに結合することにより増大され
る。Ｆｃフラグメントまたは免疫グロブリンを含有する
試料はマトリックスからのＦｃ−ｓＴＦの置換をもたら
しうるため、知られている方法を使用してＦｃ−ｓＴＦ
をマトリックスに共有結合的に結合させることが適切で
ある。
【００１０】二価のイオン、好ましくはＣａＣｌ2の形
態のカルシウムは０.０１〜５００mM、特に好ましくは
０.５〜５０mMの濃度でＦVII／ＦVIIａ含有溶液に加え
られる。溶液のpHは５.０〜１０.０、好ましくは７.０
〜９.５である。この溶液をｓＴＦ−マトリックスと接
触させ、そしてマトリックスを好ましくは７.０〜９.５
のpHおよび０.５〜５０mMのカルシウム濃度を有する緩
衝液で洗浄する。溶離はキレート化剤、好ましくはシト
レート、オキサレート、タルトレート、ＮＴＡ、ＥＤＴ
ＡまたはＥＧＴＡを０.１〜１０００mM、好ましくは５
〜２００mMの濃度で含有する溶液を使用して行なわれ
る。溶液のpHは５.０〜１０.０、好ましくは５.５〜８.
５、特に好ましくは６.０〜７.５である。
【００１１】活性化因子を含有する試料は（おそらく存
在する過剰の因子VIIから）ＦVIIａの追加的な生成をも
たらすことがあり、それにより人為的な結果をもたら
す。このリスクを回避するため、固定化ｓＴＦと接触さ
せる前に抗トロンビンIII／ヘパリンを試料に加えるこ
とができる。ＦVIIａは室温または高めの温度でＡＴIII
／ヘパリンにより、他の潜在的に干渉する因子（ＦII
ａ、ＦIXａ、ＦXａなど）と比べてゆっくりと阻害され
るため、ＦVIIａを精製することが目的の場合、ＦVIIａ
の含量にあまり影響を及ぼすことなく後者の因子を遮断
することができる。ある場合には、ＴＦ−結合ＦVIIａ
をＡＴIII／ヘパリンによって遊離分子よりも効果的に
阻害することができる（しかし、ＡＴIIIは機能的なヘ
パリンがないと可溶性ＦVIIａと同様に非常にゆっくり
と反応する）。したがって、ｓＴＦと接触させる前にプ
ロタミンサルフェート／ポリブレン（登録商標）のよう
な知られている試薬により加えたヘパリンを中和し、次
に上記のような方法を行なうことができる。方法のこの
工程において可逆阻害剤、例えばベンズアミジン、およ
びそれら自体が中和可能な他の補因子依存阻害剤または
それらの促進剤（例えばヘパリン−補因子II／ヘパリ
ン）もまた適している。次の実施例により本発明をより
詳細に説明する。
【００１２】
【実施例】タンパク質Ａ−セファロースにＦｃ−ｓＴＦ
（１０μｇ／５０μｌのゲルマトリックス）を負荷し、
緩衝液Ａ（５０mMのトリス／ＨＣｌ、１５０mMのＮａＣ
ｌ、１０mMのＣａＣｌ2、０.１％ヒトアルブミン、pH
８.５）で平衡させた。ＦVII（１５IU／ml）を含有する
０.５mlのタンパク質溶液にＦVIIａを（凝固試験で）Ｆ
VII活性の５％に相当する濃度まで加えた。溶液はま
た、因子II（３０IU／ml）、IX（２５IU／ml）およびＸ
（３０IU／ml）のような他の凝固因子、並びに幾つかの
追加的な血漿タンパク質を含有した。この溶液を同量の
緩衝液Ａで稀釈し、小カラム中のｓＴＦ−マトリックス
と接触させた。流動液をカラム中を通過させた後、マト
リックスを０.５mlの緩衝液Ａで洗浄し、次に結合タン
パク質を緩衝液Ｂ（５０mMのトリス／ＨＣｌ、１５０mM
のＮａＣｌ、５０mMのクエン酸ナトリウム、pH６.５）
で溶離し集めた。
【００１３】溶出液を適当な凝固試験で試験し、そして
ＦVII／VIIａの収率をその活性により、またＥＬＩＳＡ
により（出発物質に関連して）定量した。溶出液の純度
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかにした。 結果：ＦVII／ＦVIIａの収率は出発物質に基づいて、Ｅ
ＬＩＳＡでは９３％、そして活性では９０％であった。
他の重要な発見は、溶出液中のＦVII活性の５％が（加
えた）ＦVIIａから誘導されたものであるということで
ある。これは２つの分子のどちらも優先的に結合してい
ないことを示している。他方、この精製工程の間にＦVI
IのＦVIIａへの活性化が起こるという可能性を除外する
ことができる。
【００１４】ＦII、ＦIXまたはＦXのいずれも溶出液中
に存在しなかったが、それらはすべて（出発物質と対応
して）カラムの流動液中に存在した。溶出液の純度、お
よび溶出液中のＦVII／VIIａの濃縮における強力な効果
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により明らかにされる。それは
精製効果を立証している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス−アルノルト・シユテール ドイツ連邦共和国35083ヴエター．シユル シユトラーセ66 (72)発明者 アネツテ・フオイスナー ドイツ連邦共和国35043マルブルク．シユ テテイーナーシユトラーセ15

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 因子VIIおよび／または因子VIIａを含有
    する溶液からそれらを固定化可溶トロンボプラスチンに
    結合し、非結合分子を洗浄により除去し、そして結合因
    子VIIおよび／または因子VIIａを溶離することにより因
    子VIIおよび／または因子VIIａを取出すことからなる、
    因子VIIおよび／または因子VIIａの精製法。
  2. 【請求項２】 結合因子VIIおよび／または因子VIIａは
    キレート化剤を使用して溶離される請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 Ｃａ2+イオンが０.０１〜５００mMの濃
    度で加えられ、そして固定化可溶トロンボプラスチンへ
    の結合に関して５.０〜１０.０のpHが選択される請求項
    １または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 因子VIIおよび／または因子VIIａを溶離
    するのに十分な０.１〜１０００mMの濃度のシトレー
    ト、オキサレート、タルトレート、ＮＴＡ、ＥＤＴＡま
    たはＥＧＴＡがキレート化剤として選択される請求項２
    または３記載の方法。
  5. 【請求項５】 他の干渉する活性化因子は固定化可溶ト
    ロンボプラスチンと接触させる前に阻害される請求項１
    〜４の何れかの項記載の方法。
  6. 【請求項６】 固定化可溶トロンボプラスチンと接触さ
    せる前に、他の潜在的に干渉する活性化因子は抗トロン
    ビンIII／ヘパリンを加えることにより不活性化され、
    適当ならばプロタミンサルフェートが引き続いて加えら
    れる請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 可溶性トロンボプラスチンは非共有結合
    により固相に吸着される請求項１〜６の何れかの項記載
    の方法。
  8. 【請求項８】 Ｆｃフラグメントに結合する可溶性トロ
    ンボプラスチンが使用される請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 可溶性トロンボプラスチンは固相に共有
    結合される請求項１〜６記載の方法。
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