CZ200240A3

CZ200240A3 - Léčivo s obsahem agonisty nebo antagonisty tkáňového faktoru pro regulaci buněčné migrace

Info

Publication number: CZ200240A3
Application number: CZ200240A
Authority: CZ
Inventors: Mirella Ezban; Lars Christian Petersen; Agneta Siegbahn
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2003-04-16
Also published as: ATE411041T1; CN1460024A; PL353035A1; NO20020130D0; US20090036378A1; US20050239708A1; NO20020130L; EP1200116A2; AU5807500A; KR20020025194A; IL147294A0; EP1200116B1; US7829529B2; DE60040539D1; KR100821644B1; MXPA02000468A; HUP0302052A3; CN100411684C; RU2268744C2; US20020193302A1

Description

Léčivo s obsahem agonistg nebo antagonisty tkáňového faktoru pro regulaci buněčné migrace

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález popisuje novou regulační aktivitu koagulačního faktoru VII (FVII) nebo tkáňových antagonistů tohoto faktoru, jako jsou např. inaktivovaný koagulační faktor Vila (FVIIai) buněk exprimujících tkáňový faktor (TF). Navrhovaný vynález popisuje způsob ovlivnění buněčné migrace nebo chemotaxe ovlivněním těchto buněk pomocí FVIIa nebo jiného agonisty TF, nebo FVIIai či jiného antagonisty TF a stanovení migrace takto ovlivněných buněk. Navrhovaný vynález dále popisuje způsob použití FVIIa nebo jiného agonisty TF, nebo FVIIai či jiného antagonisty TF pro přípravu léčiva pro regulaci buněčné migrace u pacientů. Dále navrhovaný vynález popisuje způsob detekce aktivity látek, konkrétně látek které by mohly být léky, ovlivňující buněčnou migraci.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Druhotná dráha aktivace srážení krve je aktivována když se FVIIa normálně cirkulující v plasmě naváže na integrální membránový protein, tkáňový faktor (TF). Úloha TF při srážení krve je v současné době detailně studována. Účast FVIIa jako proteolytického enzymu v aktivační kaskádě při srážení krve je omezena pouze na extracelulámí část TF exprimováného na buňkách. Intracelulární aktivita FVIIa byla poprvé odhalena ve chvíli, kdy bylo zjištěno, že sekvence TF vykazuje homologii k super-rodině cytokinů/interferonů nebo hematopoietických receptorů. Podtřída I rodiny hematopoietických receptorů zahrnuje receptory pro růstové hormony, prolaktin, interleukiny 1 až 7, granulocyto-makrofágové CSF, erythropoietin a thrombopoitin. Podtřída II zahrnuje TF a receptory pro interferony a a β.

Zařazení TF do této rodiny receptorů bylo poté doloženo stanovením krystalické struktury.Charakteristickým znakem cytokinových receptorů, zahrnujících receptory pro interferon β a γ a IL-10 je že po jejich aktivaci dochází k rapidní fosforylací tyrosinových zbytků samotným receptorem, stejně jako jistou podtřídou intracelulárních proteinů. Během několika minut po začátku fosforylace tyrosinů dojde k aktivaci celé řady mitogenem aktivovaných (Ser/Thr) kináz (MAPK). Tyto kinázy jsou uspořádány do několika paralelních aktivačních drah. Při studiu přesné intracelulární signalizační kapacity FVIIa bylo prokázáno, že způsobuje λ .

uvolnění intracelulárních zásob iontů vápníku (Ca ) u lidské nádorové linie karcinomu .ZMĚNĚNÝ LIST’ • · · · · · • ·

močového měchýře, J82, která stabilně exprimuje TF a u endotheliálních buněk z pupečníkové krve, které po ošetření interleukinem 1 exprimují TF, ale nebyla zjištěna žádná aktivace intracelulárních tyrozin kináz jako v případě cytokinů. Obecně se má za to, že FVIIa v případě TF indukuje mobilizaci intracelulámího vápníku pomocí aktivace fosfolipázy C. Mechanismus kterým FVIIA aktivuje fosfolipázu C není známý, ale aktivace tyrozin kináz byla zcela vyloučena.

Poslední zprávy z celé řady laboratoří ukazují, že TF může ovlivňovat celé spektrum dalších biologických funkcí jiných než jen srážení krve, jako je např. angiogeneze, vaskularizace embryí a metastázování nádorů. V současnosti je však nejasné jakými mechanismy TF ovlivňuje tyto biologické procesy. Extracelulámí doména TF se skládá ze dvou domén podobných fibronektinu typu II, jak je pro extracelulámí domény cytokinových receptorů třídy II typické, což naznačuje, že TF může hrát roli při přenosu signálu, což je hlavní funkce cytokinových receptorů. Přesto TF má velmi malou cytoplasmatickou doménu (pouze 21 aminokyselinových zbytků) a postrádá předmembránový motiv, který umožňuje vazbu Janus kináz (Jak) nepatřících k receptorů, které jsou však pro nezbytné pro signalizační vlastnosti receptorů. Nicméně, některá bilochemická pozorování ukazují, že TF je schopno přenášet signál. Analýzou proteinové sekvence lidského TF byly odhaleny fosfory lační domény v cytoplazmatické části, které jsou konzervativní u myšího, králičího a krysího TF. Specifické serinové zbytky v cytoplazmatické části TF jsou fosforylovány u buněk po stimulaci aktivátorem protein kinázy C. U lidského TF je cytoplazmatická část fosforylována in vitro na několika místech po inkubaci s lyzátem z U87MG buněk. Potenciální úloha cytoplazmatické domény TF při přenosu signálu je také uváděna u studií, které prokazují, že prometastatická funkce TF je závislá na cytoplazmatické doméně. Dále bylo prokázáno, že cytoplazmatická doména TF interaguje s actin-vázajícím proteinem (APB280) a zlepšuje buněčnou adhezi a migraci díky vazbě APB-280 na TF.

O TF bylo rovněž prokázáno, že se účastní některých typů buněčné signalizace, kde slouží jako kofaktor pro svůj fyziologický ligand FVIIa v extracelulámí signalizaci a to díky svému proteolytickému účinku. Například vazba FVIIa na molekuly TF nacházející se na buněčném povrchu způsobuje oscilaci intracelulární koncentrace Ca²⁺ v celé řadě buněk exprimujících TF, dočasnou fosforylaci tyrozinu u monocytů, aktivaci MAP kináz, změny v genové expresi u fibroblastů a zvýšenou expresi urokinázového receptorů u nádorových buněk. Katalyticky neaktivní FVIIa (FVIIai) není schopna indukovat většinu výše uvedených signálů, včetně změn v intracelulární koncentraci Ca²⁺, aktivaci MAP kináz a změn v genové expresi a zdá se, že katalytická aktivita FVIIa je nezbytná pro alespoň část signálů přenášených komplexem TFFVIIa. V současnosti není o signalizačních drahách indukovaných proteolyticky aktivním FVIIa • · · · • 9 9 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · · 9 9 9

9 99 99 9 9 9 9 9 99 příliš známo a neví se ani jak mohou tyto signály přispívat k angiogenezi a metastázování nádorů.

Pro studium časově následných transkripcí indukovaných FVIIa, v navrhovaném vynálezu, testovali jsme reakci lidských fibroblastů na FVIIa pomocí cDNA microarray. Získané údaje ukazují, že exprese některých genů u fibroblastů je po interakci s FVIIa podstatně změněna. Jedním z těchto genů je Cyról, což je velmi časný gen indukovaný růstovými faktory, jehož produkt zvyšuje buněčnou adhezi, zvyšuje růstovými faktory indukovanou syntézu DNA a stimuluje buněčnou migraci u fibroblastů a endotheliálních buněk.

PODSTATA VYNÁLEZU

Navrhovaný vynález popisuje použití agonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva vyvolávajícího nebo zlepšujícího buněčnou migraci.

Navrhovaný vynález popisuje použití antagonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva potlačujícího nebo snižujícího buněčnou migraci.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití FVII a/nebo FVIIa a/nebo jiného agonisty TF a/nebo FVIIai a/nebo jiného antagonisty TF pro přípravu léčiva pro terapeutickou léčbu patologických poruch, které souvisí s buněčnou migrací a mohou být ovlivněny specifickou regulací buněčné migrace nebo chemotaxe.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití FVII a/nebo FVIIa a/nebo jiného agonisty TF a/nebo FVIIai a/nebo jiného antagonisty TF pro přípravu léčiva terapeutickou léčbu patologických poruch, které souvisí s regulací exprese alespoň jednoho genu v buňce, např. Cyról genu.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití, ve kterém se vyvolání nebo zvýšení buněčné migrace, dosáhne ovlivněním uvedených buněk přidáním agonisty tkáňového faktoru, v jedné konkrétní variantě je agonista TF FVII a/nebo FVIIa.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití, ve kterém se snížení nebo inhibice buněčné migrace, dosáhne ovlivněním buněk pomocí antagonisty TF. V jedné konkrétní variantě je agonista TF modifikovaná molekula FVII.

V jedné konkrétní variantě jsou buňky exprimující TF lidské fibroblasty, buňky hladkého svalstva, nádorové buňky, hematopoietické buňky a epiteliální buňky.

V jedné konkrétní variantě je modifikovaný faktor VII modifikován např. Dansyl-Phe-ProArg chlormethylketonem, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketonem, Dansyl-Phe-Phe-Arg „ZMĚNĚNÝ UST’ • ··· •· φφφφ

3a chlor-methylketonem, Phe-Phe-Arg chlormethylketonem, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg chlormethyl-ketonem, Dansyl-D-Glu-Gly-Arg chlormethylketonem, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg chlormethyl-ketonem a D-Phe-Phe-Arg chlormethylketonem.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití Faktoru Vila nebo faktoru VII nebo jiného agonisty TF, nebo jejich kombinaci nebo jiného tkáňového faktoru pro přípravu léčiva pro vyvolání nebo zlepšení hojení zranění u pacientů.

ZMĚNĚNÝ LIST” • · 4 4 •··· ·· « 4 4 • · · · · ·

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití antagonistu tkáňového faktoru pro přípravu léčiva pro snížení nebo potlačení buněčné migrace, invazivity, migrací indukované proliferace nebo angiogeneze u pacientů trpících nemocí nebo poruchou související s nežádoucí buněčnou migrací invazivitou, migrací indukovanou proliferaci nebo angiogenezí u pacientů.

V jedné konkrétní variantě je tato nemoc nebo porucha růst primárního nádoru, nádorová invazivita nebo tvorba metastáz.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje způsob regulace exprese alespoň jednoho genu v buňkách, zahrnující ovlivnění těchto buněk za použití agonisty tkáňového faktoru nebo za použití antagonisty tkáňového faktoru.

V jedné konkrétní variantě tento gen spadá do rodiny genů CCN.

V jiné konkrétní variantě patří tento gen do skupiny genů Cyról, CTFG, dopaminový receptor D2, EST Incyte PD 395116 nebo P2U nukleotidový receptor.

V jedné konkrétní variantě je tento gen, gen Cyról.

V jedné konkrétní variantě je regulací míněna indukce nebo zvýšení exprese. V jiné konkrétní variantě je regulací míněno zastavení nebo potlačení exprese.

V jedné variantě FVII nebo FVIIa nebo jiný agonista TF vyvolávají nebo zvyšují expresi genů a modifikovaný FVII nebo jiný antagonista TF potlačují nebo snižují expresi genu, např. pokud gen spadá do rodiny genů CCN nebo pokud gen je Cyról, CTFG, dopaminový receptor D2, EST Incyte PD 395116 nebo P2U nukleotidový receptor.

V jiné konkrétní variantě FVII nebo FVIIa nebo jiný agonista TF indukují nebo zvýšují expresi genu a modifikovaný FVII nebo jiný antagonista TF potlačují nebo snižují expresi genu, např. pokud gen je EST Incyte PD 395116.

Chorobné stavy, které mohou být léčeny, jsou patologické poruchy, jako např. arterioskleróza, růst nádorů, šíření nádorů, usídlování nádorů, metastázování nebo angiogeneze. Dále je možno tímto způsobem léčit např. zranění, včetně regenerace stěn cév a léčbu popálenin nebo zánětů nebo regulaci buněčné migrace in vitro, jako např. při růstu tkáně.

Navrhovaný vynález popisuje použití FVII nebo FVIIa nebo jiného agonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva vyvolávajícího nebo zlepšujícího buněčnou migraci.

„ZMĚNĚNÝ UST’

Navrhovaný vynález popisuje použití FVII nebo FVIIa nebo jiného agonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva vyvolávajícho nebo zlepšujícího hojení zranění nebo angiogenezí.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití FVIIai nebo jiného antagonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva potlačujícího nebo snižujícího buněčnou migraci.

V dalším aspektu je předmětem buněčná migrace.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje použití FVIIai nebo jiného antagonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva potlačujícího nebo snižujícího angiogenezí, metastázování, růst nádoru nebo nádorovou invazivitu.

V dalším aspektu navrhovaný vynález popisuje způsob redukce nebo potlačení buněčné migrace u pacientů, zahrnující podání efektivního množství FVIIai nebo jiného antagonisty TF pacientům.

V jedné konkrétní variantě je efektivní množství denní dávka od asi 5 pg/kg/den do asi 600 pg/kg/den.

V jiné konkrétní variantě antagonista TF zahrnuje modifikovaný FVIIa, např. FFR-FVIIa. Navrhovaný vynález popisuje mechanismus aktivity FVII a/nebo FVIIa, který se vztahuje ke stimulaci buněčné migrace. Tento mechanismus představuje základ pro stanovení vlivu FVII a/nebo FVIIa v patologických stavech při kterých jsou zapojeny buňky exprimující TF na svém povrchu, jako jsou endotheliální buňky, epiteliální buňky, fibroblasty, buňky hladkého svalstva a monocyty/makrofágy. Navrhovaný vynález dále popisuje základní faktory pro identifikaci specifických farmakologických cílů, které jsou použitelné pro terapeutický zásah. Navrhovaný vynález tedy popisuje použití FVII a/nebo FVIIa a/nebo FVIIai při terapeutických zásazích při patologických stavech vztahujících se k buněčné migraci nebo léčitelných specifickou regulací buněčné migrace.

V jiném aspektu navrhovaný vynález popisuje způsob ohodnocení potenciálních léčiv regulujících buněčnou migraci, kdy tato technika zahrnuje

a) kultivaci buněk exprimují cích TF,

b) stanovení migrace buněk,

c) inkubace buněk s potenciálním agens,

d) stanovení migrace inkubovaných buněk a stanovení změn v míře migrace vzhledem k migraci buněk stanovené v kroku b), přičemž tato změna určuje biologickou aktivitu potenciálního agens u příslušných buněk.

„ZMĚNĚNÝ LIST • · • · · · · » · • · « • β, ··♦· • · a · · «· · · · * • · · ···· ««-·· • ••a aa a · · ♦ a · a a a a · · a a aa a a

Obecně, složky krve účastnící se jevu označovaného jako koagulační kaskáda jsou proenzymy zymogenů, enzymaticky neaktivních proteinů, které jsou změněny na proteolytické enzymy pomocí aktivátoru, který sám je aktivován srážecím faktorem. Koagulační faktory které projdou touto změnou jsou obecně označovány jako „aktivní faktory“ a jsou označovány malým písmenem „a“ za názvem koagulačního faktoru (např. faktor Vila).

Termínem „zinkový chelátor“ označujeme látky, které se vážou na faktor Vila a vyvolávají náhradu vápníkových iontů za ionty zinečnaté u faktoru Vila, čímž inhibují aktivitu faktoru Vila a nebo komplexu tkáňový faktor - faktor Vila (TF-VIIa).

Vhodným antagonistou TF podle navrhovaného vynálezu může být chelatační činidlo s aktivitou pro zinek, např. dihydroxamát nebo dihydroazid s hydroxamátovou nebo hydrazidovou skupinou umístěnou vzhledem k ostatním v takové pozici, která umožní vazbu iontu zinku. Látka vázající zinečnaté ionty působí v kombinaci s FVIIa. Ionty Zn²⁺ vykazují svoji inhibiční aktivitu v kompetici se stimulační aktivitou iontů Ca²⁺. Předpokládá se, že Zn²⁺ ionty nahradí Ca²⁺ ionty na jednom nebo několika vazebných pozicích vápníku v rámci FVIIa. Látky s chelatační kapacitou pro zinek, např. hydroxamáty a hydrazidy, jsou schopné fungovat jako látky podporující vazbu zinečnatých iontů v kompetici s vápníkovými ionty. Některé látky jsou tedy schopny potencovat inhibicí aktivity komplexy faktor Vila / tkáňový faktor pomocí zinečnatých iontů. Aktivita faktoru Vila v komplexu s tkáňovým faktorem může být inhibována mechanismem, kdy se látky s chelatační kapacitou pro zinek naváží na Vila a zajistí nahrazení Ca²⁺ s Zn²⁺. Pomocí tohoto mechanismu pak mohou tyto chelatátory vykazovat modulační aktivitu na TF při normální koncentraci volných iontů Ca²⁺ a Zn²⁺ v krvi.

Termín „FVII“ nebo „faktor VII“ popisuje jednořetězcový (zymogenní) koagulační faktor VII. Termín „Vila“ nebo „FVIIa“ znamená dvouřetězcový aktivovaný koagulační faktor VII specificky štěpený v místě Argl52-Ilel53. FVII a FVIIa mohou být získány přečištěním z krve, nebo produkovány rekombinantním způsobem. Je zřejmé, že zde popisované postupy a techniky nezávisejí na tom z jakého zdroje byl faktor Vila získán a je tedy jasné, že navrhovaný vynález zahrnuje všechny způsoby přípravy faktoru VII nebo FVIIa které jsou použitelné. Nejvhodnější je lidský FVIIa. FVII a FVIIa také zahrnují varianty Fvii, kde byly nahrazeny jedna nebo více aminokyselin.

Termín „modifikovaný faktor VII“, „inaktivovaný FVII“ nebo „FVIIai“ popisují takový FVIIa, který obsahuje alespoň jednu modifikaci v aktivním místě, která podstatně inhibuje aktivitu modifikovaného FVIIa aktivovat FX a FIX. Tyto termíny jsou zaměnitelné. Touto modifikací může být aminokyselinová záměna (nebo náhrada) jedné nebo více katalytických triád aminokyselin Ser344, Asp 142 a His 193 a také zahrnuje modifikace katalytických triád • · · · • · *>

» · · ·· ♦ · · · · · ♦ • · · · · • 9 9 9 · 9

9 9 9 9 • · · · 9· 9999 aminokyselin pomocí inhibitorů šeřino vých proteáz, jako jsou organofosfáty, sulanylfluorid, halometylketon peptidu nebo azapeptid. FFV-FVIIa je jedním příkladem FVIIai derivátu získaného blokováním aktivního centraFVIIa pomocí ireversibilního inhibitoru, D-fenylalaninL-fenylalanin-L-arginin chloromethylketon (FFR cmk).

Dalšími vhodnými FVIIai deriváty jsou inaktivované molekuly FVIIa získané blokováním aktivního místa pomocí L-fenylalanin-L-fenylalanin-L-arginin chloromethylketonu, dansyl-Dfenylalanin-L-fenylalanin-L-arginin chloromethylketonu nebo dansyl-L-fenylalanin-Lfenylalanin-L-arginin chloromethylketonu. Nejvhodnější je je FFR-FVIIa (FVIIa inaktivované pomocí FFR cmk).

Termín „protein kináza“ popisuje enzym, který je schopen fosfoiylovat šeřiny a/nebo threoniny a/nebo tyrosiny v peptidech a/nebo proteinech.

Termín „potenciální agens“ popisuje jakýkoliv vzorek, který vykazuje biologickou funkci nebo má vliv na biologii buněčného systému. Tento vzorek může být vzorek biologického materiálu, jako je rostlinný nebo mikrobiální extrakt, nebo to může být vzorek obsahující látky nebo směsi látek připravené organickou syntézou nebo pomocí genetických technik.

Termín „agonista TF“zahmuje látky indukující

a) přenos signálu přímou vazbou na TF (např. FVIIa),

b) aktivaci kaskády mAP kináz,

c) potlačení inhibice MAP kináz (např. PTPázové inhibitory), a jejichž agonisty jsou potenciální agens popisovaná výše.

Termín „antagonista TF“ popisuje

a) látky které jsou v kompetici o vazbu na TF s FVIIa, ale nezpůsobí přenos signálu, např. FVIIai,

b) látky vázající se na FVIIa a zabraňující pozdější vazbě na TF, např. ZN hydroxamát,

c) látky blokující přenos signálu interferencí s některou jednotkou map kinázové kaskády,

d) látky vázající se na FVIIa/TF, ale zabraňující přenosu signálu,

e) látky vázající se na FVIIa/TF/FX, ale zabraňující přenosu signálu,

f) látky blokující aktivaci lidského faktoru X která je katalýzo vána komplexem FVIIa/TF a jejichž antagonisty jsou potenciální agens uvedená výše.

Termín „farmakologický cíl“ popisuje protein který je schopen ovlivnit migraci buněk exprimují cích TF.

Termín „receptorový gen“ popisuje DNA konstrukt, který po transkripci produkuje protein který je detekovatelný.

• · • · • · 1 • · • · • · · · · ···· · · ···· ·· ·· ·· 99

9 19 · i · <

• · · · » 4

119 1 9

119 119 •1 1111 19 119 9

Termín „SRE promotorovy element“ popisuje DNA sekvenci vázající transkripční faktor indukovaný složkami přítomnými v séru.

Termín „buňka exprimující TF“ popisuje jakoukoliv savčí buňku exprimující TF.

Termín „fosforylace proteinu“ popisuje fosforylací serinů a/nebo threoninů a/nebo tyrozinů na peptidu a/nebo proteinu.

Ovlivnění regulace buněčné migrace je definováno jako kapacita FVIIa nebo jiného agonisty TF, nebo FVIIai nebo jiného antagonisty TF 1) buď zvýšit nebo snížit úroveň normální nebo abnormální buněčné migrace, 2) aktivovat normální buněčnou migraci a 3) aktivovat abnormální buněčnou migraci.

Ovlivnění regulace genové exprese je definováno jako kapacita FVIIa nebo jiného agonisty TF, nebo FVIIai nebo jiného antagonisty TF 1) buď zvýšit nebo snížit úroveň normální nebo abnormální buněčné migrace, 2) aktivovat normální buněčnou migraci a 3) aktivovat abnormální buněčnou migraci.

V kontextu navrhovaného vynálezu , termín „léčba“popisuje jak prevenci nežádoucích příznaků, tak regulaci již zjevných poruch za účelem potlačit Či minimalizovat tyto příznaky. Preventivní aplikace FVII nebo jiného agonisty TF nebo FVIIai nebo jiného antagonisty TF je tedy rovněž zahrnuto v termínu „léčba“.

V kontextu navrhovaného vynálezu , termín“jedna jednotka“ je definována jako množství faktoru VII přítomné v 1 ml normální plasmy, což odpovídá asi 0,5 pg proteinu. Když je aktivováno 50 jednotek, odpovídá to asi 1 pg proteinu.

V kontextu navrhovaného vynálezu , termín „pacient“ je definován jako jakékoliv zvíře, lépe pak savec, jako např. člověk. Termín „subjekt“ je zaměnitelný s termínem „pacient“.

Zkratky

TF

FVII

FVIIa

RFVIIa

FVIIai

FFR-FVIIai tkáňový faktor faktor VII ve své jednořetězcové, neaktivované formě faktor VII v aktivované formě rekombinantní faktor VII v aktivované formě modifikovaný (inaktivovaný) faktor VII faktor VII inaktivovaný reakcí s D-Phe-L-Phe-L-Arg chloromethylketonem

Tkáňový faktor (TF) je buněčný receptor pro faktor Vila (FVIIa) a vzniklý komplex tvoří iniciátor srážení krve. Studovali jsme efekt FVIIa po navázání na TF na buněčnou migraci a přenos signálu u lidských fibroblastů, které exprimují velké množství TF. Fibroblasty • · 44 44 4 · « · · · ·· 4 «·

4 ♦ *4 44 ··’·· <44 4«·· « * · ·

4444 «4 4 44 ·

4···*·« · · 4 4 4 · • · 4 ··· 4 4 4 ·· 4 44 ···· ·· 4444 inkubované s FVIIa migrují proti koncentračnímu gradientu PDGF-BB při asi stokrát nižší koncentraci než fibroblasty bez navázaného FVIIa. Protilátky proti TF inhibuj í zvýšenou chemotaxi indukovanou pomocí FVIIa/TF. Navíc silné suprese chemotaxe indukované pomocí PDGF-BB bylo dosaženo pomocí FVIIa inhibované v aktivním místě (FFR-FVIIa). Možnost že by zvýšená chemotaxe byla způsobena vznikem FXa a aktivitou trombinu, byla vyloučena.

FVIIa indukuje tvorbu inositol-l,4,5-trifosfátu ve stejné míře jako PDGF-BB, vliv FVIIa a PDGF-BB jsou kumulativní. FFR-FVIIa nemá na produkci inositol-l,4,5-trifosfátu žádný vliv.

Buněčná migrace, jako reakce na PDGF-BB a FVIIa je zcela blokována inhibitory PLC, což ukazuje, že aktivace PLC je pro reakci nezbytná. Tedy, vazba FVIIa na TF může nezávisle na srážení ovlivňovat buněčnou odpověď, jako např. chemotaxi a katalytická aktivita FVIIa je nezbytná.

TF má pravděpodobně také vliv na metastázování nádorů, ale mechanismus tohoto účinku je stále neznámý. Přesto Ott et al., nedávno identifikoval bílkovinu označovanou jako „actinbinding protein 280“ (ABP 280) jako ligand pro cytoplazmatickou doménu TF, což by mohlo být právě tím hledaným mechanismem, kterým se TF podílí na metastázování nádorů. Molekulární signály a biologické funkce zprostředkovávané komplexem FVIIa/TF jsou však stále známé jen velmi málo.

Lidské fibroblasty stabilně exprimují TF. Tyto buňky také exprimují receptor pro růstový faktor označovaný jako „plateled-derived growth factor“ (PDGF). PDGF indukuje u cílových buněk buněčné dělení, reorganizaci aktinu a cílenou buněčnou migraci (chemotaxi). Již dříve jsme prokázali, že PDGF-BB je účinný chemotaktický faktor pro lidské fibroblasty a že chemotaktická reakce probíhá prostřednictvím receptorů třídy β. Proto jsme pro studie principů přenosu signálu a buněčné migrace indukované vazbou FVIIa na TF zvolili právě tyto buňky.

Dále jsou uvedeny jasné důkazy spojující signály indukované vazbou FVIIa na TF a buněčnou reakcí na růstový faktor. Prokazujeme, že lidské fibroblasty v reakci na vznik komplexu FVIIa/TF vykazují hyperchemotaktickou odpověď na PDGF-BB. Navíc FVIIa s inhibovaným aktivním místem (FFR-FVIIa) v závislosti na dávce potlačí cílenou migraci proti koncentračnímu gradientu PDGF-BB. Použití specifických inhibitorů PLC a fosfatidylinositol 3'-kinázy (PI3'-kináza) prokáže, že hyperchemotaktická reakce proti PDGF-BB indukovaná FVIIa/TF je závislá na aktivitě fosfolipázy C (PLC), ale nezávisí na aktivitě PI3'-kinázy. FVIIa a PDGF-BB indukují produkci inositol-l,4,5-trifosfátu (IP3) jako druhého posla uvolněného po aktivaci PLC aditivním mechanismem.

TF je stabilně exprimován na plazmatické membráně většiny extravaskulámích buněk, jako jsou stromální fibroblasty v oblasti vaskulámí adventicie a ve fibrózních kapsulích jater, sleziny a • · * ♦ *· »· ·· · · »· ·· φ · •

• 9

9 » · ··· <

ledvin. Tedy, exprese TF se projevuje na místech fyzicky separovaných od cirkulace krve a v místech homeostatické stability. Jakmile dojde k poranění, tato bariéra ochraňuje organismus proti vykrvácení. Tf může být tedy indukován u monocytů/makrofágů, buněk hladkého svalstva ve stěnách cév, endotheliálních buněk, celé řady nádorových buněk pomocí různých agens, jako jsou cytokiny a růstové faktory. K indukci na transkripční úrovni dochází bezprostředně po stimulaci, což řadí TF mezi růstové velmi časné geny.

V této studii jsme objasnili roli TF jako signálního receptorů. Prokázali jsme, že fibroblasty, které exprimují TF po vazbě ligandu FVIIa migrují proti extrémně nízkým koncentracím PDGFBB. Komplex TF/FVIIa sám o sobě neindukuje zvýšenou spontánní migraci, tzn. náhodnou migraci. Kombinace intracelulámího signálu pomocí komplexu TF/FVIIa a růstového faktoru PDGF-BB je nezbytné pro dosažení migrační reakce. Nejenom vazba na TF, ale také katalytická aktivita TF/FVIIa je nezbytná, neboť FVIIa inhibované v aktivním místě není schopno vyvolat migrační odpověď. Navíc, inhibiční monoklonální protilátky zabrání zvýšení chemotaktické reakce pomocí FVIIa. Podařilo se nám rovněž vyloučit možnost nepřímé signalizace prostřednictvím vzniku FXa, nebo trombinu, jelikož TAP a hirudin nemají žádný vliv na chemotaktickou odpověď vyvolanou komplexem FVIIa/TF. Zjistili jsme, že zvýšená koncentrace FFR-FVIIa aktivně inhibují chemotaxi indukovanou PDGF-BB. Fibroblasty inkubované s FFR-FVIIa vykazují zcela normální náhodnou migraci. Inhibiční efekt FFR-FVIIa na chemotaxi indukovanou PDGF-BB nebyl pozorován v přítomnosti kombinaci anti-TF protilátek, což vylučuje možnost, že FFR-FVIIa by bylo toxické. Dále uvedené výsledky naznačují, že u buněk exprimujících PDGF-β receptory a TF, komplex FVIIa/TF je nezbytný pro vyvolání chemotaktické reakce na PDGF-BB. Naše zjištění, že FVIIa zvyšuje produkci IP₃ a v kombinaci s dříve publikovanými údaji, že TF/FVIIa indukuje mobilizaci intracelulámích iontů Ca²⁺ zejména v MDCK buňkách, podporují předpoklad, že PLC je aktivována TF/FVIIa komplexem v celé řadě buněk. Navíc, hyperchemotaktická odpověď lidských fibroblastů proti PDGF-BB indukovaná komplexem TF/FVIIa je blokována inhibitory PLC v závislosti na dávce. Již dříve jsme zjistili podobné hyperchemotaktické reakce na PDGF-BB u Y934F buněk mutantních v PDGF-β receptorů, které vykazují zvýšenou fosforylaci a aktivaci PLC-γΙ.

V těchto buňkách zvýšená fosforylace PLC-γΙ koreluje s trojnásobně vyšší produkcí IP3 ve srovnání s buňkami exprimujícími divoký typ PDGF^-receptoru. Kombinace TF/FVIIa a PDGF-BB indukuje asi dvojnásobný nárůst produkce IP3. Produkce IP3 indukovaná komplexem TF/FVIIa nekoreluje s fosforylaci PLC-γΙ. Fosforylace tyrosinu na PLC-y2 indukované komplexem TF/FVIIa nemůže být vyloučena, ale zdá se velice nepravděpodobná, neboť exprese PLC-y2 je v lidských fibroblastech velice nízká. Navíc, intracelulámí část TF neobsahuje vlastní • 9999 9 • 9 • 9 9

9 · • 9 · 9

99*99 • · ·999 «

9 9 9 »9 · • 9 · »99 9 9 • · 9 • 9 9*99

9 * 9

9 > ·999

99 • 9 9 9

9 ·

9 9 • 99 · 99 9 9 doménu s tyrozin kinázovou aktivitou. Tyto výsledky naznačují, že komplex TF/FVIIa indukuje aktivaci β a/nebo δ PLC isoenzymů. V technice detekující IP3 uvolňování je buněčné kultivační médium doplněno 0,1 % FBS obsahujícím pouze asi 0,1 nM FXa. Zjistili jsme, že koncentrace více než 20 nM FXa je pro indukci produkce IP3 nezbytná. Mechanizmy, pomocí kterých jsou aktivovány β nebo δ PLC isoenzymy, nejsou dosud zcela objasněné. Obecně se má za to, že aktivaci způsobuje spolupráce mezi TF a proteinem asociovaným v membráně. Bylo rovněž zjištěno spojení mezi TF a cytoskeletem. Molekulární interakce cytoplazmatické domény TF a bílkoviny označované jako „actin filament-binding“ protein (ABP 280) byly popsány již dříve. Navíc bylo zjištěno, že TF je v úzkém kontaktu s aktinem a ABP, jako jsou α-aktinin a ABP 280 v lamelopodiích a membránových oblastech epiteliálních buněk. ABP 280 je člen podrodiny filaminů a je nezbytný pro normální funkci lamelopodií a tím nezbytný pro buněčnou pohyblivost. PI3‘ - kináza a PLC isoenzymy jsou zapojené chemotaktické reakci a při mobilizaci ABP proteinů. Ve starších studiích jsme potvrdili, že PI3 ‘ - kinázová dráha u PDGF-β receptorů indukující chemotaktickou reakci se zdá méně důležitá u buněk se zvýšenou expresí a aktivitou PLC-γΙ. Jedná se o stejný příklad, jako buňky, které měly na TF navázány FVIIa. To ukazuje, že maximum aktivace PI3 ‘ - kinázy a PLC isoenzymů bude určovat, která z těchto dvou signalizačních drah bude dominantní. Obecně, naše data ukazují, že buněčná migrace je důležitá morfogenetická funkce indukovaná FVIIa/TF signálem.

Chemotaxe hraje klíčovou roli při léčení zranění, angiogeneze a metastázování. Chemotaxe je také důležitou složkou při vzniku arterosklerotických příznaků. V těchto procesech je zapojena celá řada buněk exprimujících TF, stejně jako PDGF a PDGF receptory.

Restenosis je největší komplikace při léčbě ucpaných cév. PDGF je zapojeno do reakce stěn cév (tvorba neointimy), na mechanické poranění vyvoláním migrace a proliferace hladkého svalstva a fibroblastů. Prokázali jsme, že FVIIa po navázání na buňky exprimujicí TF vyvolá zvýšenou chemotaktickou odpověď proti PDGF, která nezávisí na koagulaci.

V současnosti není dostatek údajů o signální dráze indukující proteolytickou aktivitu Vila a ani o tom, jak signály vyvolané Vila mohou přispět k buněčným procesům. Jednou z možností je, že FVIIa indukuje expresi expresi růstových regulátorů, které následně indukují různé buněčné postupy. Pro ověření této možnosti jsme sledovali změny v transkripčním programu lidských fibroblastů v reakci na Vila za použití techniky „cDNA mikroarray“ která zahrnovala více než 8000 jednotlivých lidských genů. Fibroblasty jsme zvolili, protože tyto buňky se normálně setkávají se sérem obsahujícím růstové faktory a aktivované srážecí faktory zejména po poškození cév díky fyzickému zásahu (např. chirurgickému zákroku) a různých patologických poruchách. Časový rozvrh genové exprese pozorovaný v reakci na sérum ukazuje, že fibroblasty • · · • * · 4 ♦ 4 · • 4444 4 « ♦4 4444

• · 4 4 4 •♦Μ 4* 4444 jsou naprogramovány tak aby neočekávaný kontakt se sérem interpretovaly ne jako obecný mitotický stimul, ale jako specifický fyziologický signál. Charakter transkripční aktivace v odpovědi na sérum a růstové faktory také ukazuje, že fibroblasty jsou aktivními účastníky spolupráce celé řady různých buněk kolektivně kontrolujících zánět, angiogenezí a hojení poranění.

Pomocí techniky „cDNA microarray“ z mRNA izolované z fibroblastů vystavených působení Vila po dobu 90 minut byla zjištěna zvýšená exprese Cyról. Pomocí analýzy „northern blot“ jsme potvrdili zvýšenou expresi Cyról ve fibroblastech, indukovanou pomocí Vila. Ačkoliv už ne tak masivně jako ve fibroblastech, Vila také indukuje zvýšenou expresi Cyról v buňkách hladkého svalstva cév. Indukce Cyról je závislá na katalytické aktivitě FVIIa, neboť FVIIai není schopen indukovat expresi Cyról. Ačkoliv faktor Xa a trombin mohou také indukovat expresi Cyról (údaje nejsou uvedeny) tyto látky se nepodílejí na expresi Cyról indukované pomocí FVIIa. Nezjistili jsme žádné důkazy vzniku stopových množství faktoru Xa a trombinu našem experimentálním systému. Navíc, specifický inhibitor faktoru Xa a trombinu nemá žádný vliv na expresi Cyról indukovanou FVIIa.

Cyr 61 je velmi časný gen který je transkripčně aktivován ve fibroblastech sérovými růstovými faktory. Kóduje sekretorický 40 kDa, protein bohatý na cystein a vázající heparin, který se váže na mimobuněčnou hmotu a na buněčné povrchy. Cyról je člen genové rodiny konzervativních a modulárních proteinů charakterizovaných přítomností N-terminálního sekretomího signálu, následovaného čtyřmi modulárními strukturálními doménami a 38 cysteinovými zbytky, které jsou vysoce konzervované v rámci členů genové rodiny. Proteinová rodina se nyní skládá z šesti různých členů, jako jsou Cyról, růstový faktor pojivových tkání (CTGF) a ptačí protoonkoprotein Nov, a je společně označována jako CCN rodina (tato rodina je dále popsána v Lau et al., Exp. Cell Res 284: 44-57, 1999). Protein Cyról je schopen (i) zlepšuje přichycování a rozprostření endotheliálních buněk, podobným způsobem jako to děla fibronektin, (ii) posiluje účinek bFGF a PDGF na úrovni DNA syntézy u fibroblastů a vaskulární ch endotheliálních buněk (III) zesiluje buněčnou migraci u fibroblastů i u endotheliálních buněk.

Nejnovější studie ukazují, že Cyról slouží jako ligand integrinu α_γβ3, adhezivního receptoru účastnícího se signalizace regulující celou řadu buněčných procesů včetně angiogeneze a nádorového metastázování. Přečištěný Cyról protein stimuluje cílenou migraci lidských mikrovaskulámích endotheliálních buněk v kultuře prostřednictvím a^-závislé dráhy a indukují neovaskularizaci v krysích rohovkách. Navíc exprese Cyról v nádorových buňkách posiluje růst nádoru a jeho vaskularizaci.

9 9

9949

9

4 9

44444 Λ 4 . ' * * · · * 9 4 9 ♦*· 94 4.49 •9 99 44

9 9 4 4 4 4

4 φ 4 ·

9 4 4 9 9

9 4 4 9 • 4 9494

V souvislosti s uvedenými údaji prokazujícími, že FVIIa indukuje expresi Cyról ve fíbroblastech, předpokládá se, že Cyról indukovaný prostřednictvím FVIIa je zodpovědný, díky integrinu θγβ₃ za buněčnou migraci a nádorové metastázování vyvolané FVIIa. Tedy Cyról spojuje FVIIa-TF proteolytický signál s integrinovou signalizační kaskádou. Pozorování, že Katalytická aktivita Vila je nezbytná pro migraci buněk hladkého svalstva a nádorových buněk při metastázování je založeno na dalších pozorováních prokazujících, že katalytická aktivita FVIIa je nezbytná pro indukci Cyról.

Kromě Cyról, Viia může také indukovat další regulátory které ovlivňují biologickou rekci vyvolanou FVIIa. Vazba FVIIa na TF na povrchu buněk rakoviny pankreatu selektivně vyvolává over-expresi uPAR genu. Již dříve bylo pomocí techniky „differential display PCR“ zvýšená transkripce poly(A)polymerázového genu u fíbroblastů inkubovaných s FVIIa. Ačkoliv by bylo zajímavé zjistit, zda technika „cDNA microarray“ také prokáže rozdíly v expresi PAP, nebylo to možno provést neboť sada neobsahovala sondu pro příslušný gen. Kromě Cyról, naše testy pomocí „cDNA microarray“ rovněž prokázaly rozdíly v expresi 4 dalších genů (viz výsledky), nicméně rozdíly v jejich expresi byly na hranici významnosti. Neboť jsme v předchozích experimentech nebyli schopni prokázat rozdíly v expresi pomocí analýzy „northem blot“ a díky nepřítomnosti jakýchkoliv dalších údajů nebo publikací o schopnosti těchto genů ovlivnit jakkoliv biologickou reakci indukovanou pomocí FVIIa, nezabývali jsme se nadále jejich analýzou. Protože CTGF je strukturně podobná molekule Cyról a vyvolává podobné biologické reakce jako Cyról, sledovali jsme expresi CTGF ve vzorcích inkubovaných s FVIIa vzhledem ke kontrolním vzorkům a pomocí techniky „cDNA microarray“ jsme naměřili hodnotu 1,8 (2 je konzervativní sledování skutečné důležitosti v této technice). Získaná data ukazují, že FVIIa také indukuje expresi CTGF a kinetika exprese CTGF indukovaná Vila je velmi podobná kinetice Cyról.

Přesto že se CTGF chová velmi podobně jako Cyról, existují mezi nimi drobné rozdíly. Například, (a) CTGF vykazuje mitogenní aktivitu samo o sobě, zatímco Cyról nemá žádnou vlastní mitogenní aktivitu, ale napomáhá a posiluje syntézu DNA indukovanou růstovými faktory, (b) Cyról stimuluje chemotaxi, zatímco VTGF stimuluje jak chemotaxi tak chemokinezi, (c) ačkoliv CTGF i Cyról jsou signální molekuly asociovaní s ECM, CTGF je sekretován do kultivačního média. Je tedy možné, že FVIIa reguluje buněčné funkce lokálně prostřednictvím Cyról a na větší vzdálenosti působí prostřednictvím CTGF.

Léčebný protokol pro pacienty léčené pomocí FVIIa nebo jiných agonistů TF nebo FVIIai nebo jiných antagonistů TF, tak jak jsou zde popisovány, musí být vypracován odborníkem v současném stavu techniky. Denní dávka která je během terapie aplikována závisí na uvážení *· ·♦·· 44 4444 ♦ ·· ·4 ·4 44

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 44 4

4 4444 4 4 · 4 44 4 4 • · · 4 · 4 444 •4 4 44 4·4· «4 4444 lékaře a na konkrétní použité látce, způsobu podání a váze a zdravotním stavu pacienta.

Efektivní dávka je např. denní dávka okolo 5 pg/kg/den až 500 pg/kg/den, lépe pak okolo 10 pg/kg/den až 300 pg/kg/den, ještě lépe okolo 15 pg/kg/den až 200 pg/kg/den a nejlépe okolo 20 pg/kg/den až 100 pg/kg/den.

FVIIa nebo jiné agonisty TF nebo FVIIai nebo jiné antagonisti TF mohou být podávány v jedné dávce, je však lepší aplikovat je v několika dávkách nejlépe v intervalu 4 až 6 až 12 hodin v závislosti na dávce a zdravotním stavu pacienta.

FVIIa nebo jiné agonisty TF nebo FVIIai nebo jiné antagonisti TF mohou být podávány intravenózně, nebo pomocí kontinuální či pulzované infuze, nebo je možné je aplikovat přímo do postiženého místa, jako např. inj ikovat přímo do nádoru. FVIIa nebo jiné agonisty TF nebo FVIIai nebo jiné antagonisty TF mohou být podávány nejlépe pomocí intravenózní injekce a to v množství asi 100 až 100 000 jednotek na kilogram tělesné váhy, lépe pak v množství asi 250 až 25 000 jednotek na kilogram tělesné váhy což odpovídá 5 až 500 pg/kg, dávce která může být opakována 2 až 4 krát za 24 hodin.

Pro přípravu farmaceutických prostředků podle navrhovaného vynálezu mohou být použité konvenční postupy, jako postupy popsané v např. Remingron Pharmaceutical Sciences, 1985.

Prostředky podle navrhovaného vynálezu jsou připravovány technikami známými v současném stavu techniky.

v krátkosti, farmaceutické prostředky použitelné podle navrhovaného vynálezu jsou připraveny smícháním FVII, FVIIa nebo jiných agonistů TF nebo FVIIai nebo jiných antagonistů TF, nejlépe v přečištěné formě, s vhodným adjuvans a vhodným nosičem nebo ředidlem. Vhodné fyziologicky přijatelné nosiče nebo ředidla jsou např. destilovaná voda nebo fyziologický roztok.

Vhodným adjuvans pro stabilizaci přečištěného faktoru Vila může být v tomto případě vápník, proteiny (např. albuminy) nebo jiné inertní peptidy (např. glycylglycin) a aminokyseliny (např. glycin nebo histidin).Jiným fyziologicky přijatelným adjuvans jsou neredukující cukry, polyalkoholy (např. sorbitol, manitol nebo glycerol), polysacharidy jako jsou nízkomolekulámí dextriny, detergenty (např. polysorbát) a antioxidanty (např. bisulfit a askorbát). Adjuvans je obvykle přítomno v koncentraci od 0,001 až 4 % hmotnosti. Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat proteázové inhibitory, např. aprotinin a ochranné složky.

Prostředky mohou být sterilizované např. filtraci přes mikropórové filtry odstraňující bakterie, přidáním sterilizačních složek do prostředku, ozářením prostředku nebo jeho zahřátím. Mohou být rovněž připraveny ve formě sterilní pevné látky, která je rozpustná ve sterilní destilované vodě nebo jiném sterilním médiu použitelném pro injekce, a to těsně před použitím.

V dalších aspektech navrhovaný vynález popisuje:

• · 4 • « • · v • 44·· • 4

Způsob regulace exprese alespoň jednoho genu v buňce, což zahrnuje:

a) inkubaci této buňky s faktorem VII(a) nebo antagonistou TF

b) stanovení exprese sledovaného genu v buňce.

Výše uvedený způsob, kde buňkou je lidská vaskulámí buňka exprimujících TF, jako jsou fibroblasty a buňky hladkého svalstva.

Způsob, kde gen je vybrán ze skupiny Cyról, CTGF, dopaminový D2 receptor, EST Incyte PD395116 nebo P2U nukleotidový receptor.

Způsob, kde antagonistou tkáňového faktoru je modifikovaný faktor VII (a) označovaný jako faktor Vllai.

Způsob, kde je exprese sledovaného genu výšena.

Způsob, kde je exprese sledovaného genu nížena nebo minimalizována.

Způsob zvýšení exprese sledovaného genu zahrnující inkubaci této buňky s faktorem Vila. Způsob snížení exprese sledovaného genu zahrnující inkubaci této buňky s modifikovaným faktorem VII označovaným jako FVIIai.

Způsob kde sledovaným genem je EST PD674714.

Způsob regulace buněčné migrace, zahrnující kroky:

a) inkubaci této buňky s faktorem VII(a) nebo antagonistou TF

b) stanovení migrace sledovaných buněk

Způsob, kde sledovanými buňkami jsou lidské buňky exprimuj ící tkáňový faktor, jako jsou fibroblasty, buňky hladkého svalstva, nádorové buňky, hematopoietické buňky a epiteliální buňky.

Způsob, kde antagonistou TF je modifikovaný faktor Vila, označovaný jako Vllai.

Způsob, kde modifikovaný faktor VII je např. Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormethylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormethylketon, Phe-Phe-Arg chlormethylketon.

Způsob zvýšení buněčné migrace, zahrnující kontakt buněk s FVIIa nebo agonistou TF.

Způsob snížení nebo potlačení buněčné migrace, zahrnující kontakt buněk s antagonistou TF. Způsob zlepšení hojení zranění u pacientů, zahrnující podání efektivního množství farmaceutického prostředku obsahujícího faktor Vila nebo agonistu TF pacientům.

Způsob potlačení invazivity nádorových buněk zahrnujících inkubaci těchto buněk s efektivním množstvím antagonistů TF.

Způsob inhibice buněčné migrace, invazivity, migrací indukované buněčné proliferace nebo angiogeneze u pacientů trpících chorobou nebo poruchou spojenou s nežádoucí buněčnou migrací, invazivitou, migrací indukovanou buněčnou proliferací nebo angiogenezí, zahrnující • ···· ·· ···· ·· ···.

0 00 00 00 00 ♦♦· 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000

ΙΑ 000000 *0000000

000000 000 ·· · 0· 0000 00 0000 podání efektivního množství farmaceutického prostředku obsahujícího antagonistů TF pacientům.

Způsob, kde choroba nebo porucha je primární nádorový růst, nádorová invazivita nebo metastázování.

Způsob, kde antagonista TF je modifikovaný faktor VII označovaný jako FVIIai.

Použití faktoru Vila nebo antagonisty TF pro přípravu léčebného prostředku pro regulaci buněčné migrace.

Použití, kde faktor Vila je použit pro léčebného prostředku pro zvýšení buněčné migrace.

Použití, kde antagonista TF je použit pro léčebného prostředku pro snížení nebo potlačení buněčné migrace.

Způsob, kde antagonista TF je modifikovaný faktor Vila označovaný jako faktor Vllai.

Použití, kde modifikovaný faktor VII je např. Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormethylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormethylketon, Phe-Phe-Arg chlormethylketon.

Navrhovaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které v žádném případě nemohou být brány jako jeho omezení. Jednotlivé rysy popisované v předchozím popisu a v následujících příkladech mohou, buď jednotlivě nebo v kombinaci, sloužit jako návod pro realizaci vynálezu v různých formách.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr. IA a 1B: analýza TF exprese u fibroblastů (IA) pomocí průtokové cytometrie. Buňky byly značeny buď pomocí myší monoklonální protilátky anti-IgG konjugované s fluoresceinizothiokyanátem (FITC) (nevyplněná oblast), které byly použity jako negativní kontrola, nebo pomocí monoklonální protilátky anti-TF konjugované s FITC (vyplněná oblast). Fig. 1B ukazuje prokoagulační aktivitu fibroblastů. Fibroblasty exprimující TF vykazují 10-ti násobný nárůst v PCA v porovnání s monocyty které TF neexprimují.

Obr. 2A Efekt FVIIa a FFR-FVIIa na chemotaxi indukovanou PDGF-BB u lidských fibroblastů.

( ) ukazuje chemotaktickou odpověď fibroblastů na různé koncentrace PDGF-BB. Fibroblasty inkubované s 100 nM FVIIa ( ) nebo 100 nM FFR-FVIIa ( ) migrují proti různým koncentracím PDGF-BB. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky tří nezávislých experimentů. Hodnoty P nižší než 0,05* jsou statisticky významné (Studentův t-test).

• 000· · · • 0

·· · ·

0 •0 0000

00 0 0 0 0

Obr. 3 A-D Vliv různých koncentrací FVIIa nebo FFR-FVIIa na chemotaxi indukovanou PDGFBB u lidských fibroblastů. ( ) ukazuje migraci fibroblastů při různé koncentraci PDGF-BB. Fibroblasty byly inkubovány 12,5 (A), 25 (B(, 50 (C) a 100 (D) nM FVIIa ( ) nebo FFR-FVIIa ( ) a stanovení proběhlo v Boydenově komůrce při různých koncentracích PDGF-BB. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky tří nezávislých experimentů, * p<0,05, ** = p<0,01 (Studentův t-test).

Obr. 4A Směs tří monoklonálních protilátek proti TF blokuje efekt FVIIa a FFR-FVIIa na chemotaxi indukovanou PDGF-BB. ( ) ukazuje migraci fibroblastů s PDGF-BB bez anti-TF protilátek. ( ) fibroblasty předem inkubovány s anti-TF protilátkami a 100 nM FVIIa, a ( ) a fibroblasty předem inkubovány s anti-TF protilátkami a 100 nM FFR-FVIIa. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky tří nezávislých experimentů.

Obr. 5A a 5B Vliv FXa na chemotaktickou odpověď proti PDGF-BB indukovanou pomocí FVIIa. Fibroblasty byly předem inkubovány s 200 nM TAP (obr. 5A) ( ) nebo s 0,2 až 2 μΜ TAP (obr. 5B) ( ) a poté se 100 nM FVIIa ( ). TAP byl přítomen v médiu během celého experimentu. Chemotaxe byla indukována pomocí různých koncentraci PDGF-BB (5A) nebo pomocí 0,4 ng/ml PDGF-BB (5B). Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky dvou nezávislých experimentů.

Obr. 6A Vliv trombinu na chemotaktickou odpověď proti PDGF-BB indukovanou pomocí FVIIa. Fibroblasty byly předem inkubovány s 5 U/ml (konečná koncentrace Hirudinu a poté s 100 nM FVIIa. Hirudin byl přítomen v médiu během celého experimentu. Chemotaxe byla indukována pomocí různých koncentrací PDGF-BB. ( ) ukazuje buňky inkubované se samotným Hirudinem ( ) ukazuje buňky s Hirudinem a FVIIa. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky dvou nezávislých experimentů.

Obr. 7A Vliv inhibice PI3'-kinázy na chemotaktickou odpověď fibroblastů inkubovaných s FVIIa. Fibroblasty byly předem inkubovány s různými koncentracemi LY294002 po dobu 30 minut v 37 °C a poté se 100 nM FVIIa ( )nebo bez FVIIa ( ). Inhibitor byl přítomen v médiu během celého experimentu. Chemotaxe byla indukována pomocí 0,1 ng/ml PDGF-BB. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky dvou nezávislých experimentů.

• 4 · · 4

4

4« 44 44 44

444* 4444

44 444 4

4444 444 4499 4

9 4 9 4 4 9

4· 4944 ·4 44··

Obr 8Α a 8Β Vliv inhibice PLC na chemotaktickou odpověď fibroblastů inkubovaných s FVIIa.

Fibroblasty byly předem inkubovány s různými koncentracemi U73122 (aktivní inhibitor PLC) (8A) nebo s U73343 (neaktivní kontrola) (8B) po dobu 30 minut v 37 °C a poté s nebo bez 100 nM FVIIa a nakonec testovány vBoydenově komůrce na koncentračním gradientu 0,1 ng/ml PDGF-BB. Agens byly přítomny v médiu během celého experimentu. ( ) ukazuje buňky inkubované se samotným U73122 nebo U73343, ( ) ukazuje buňky s U73122 nebo U73343 a s FVIIa.. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnoty a směrodatné odchylky dvou nezávislých experimentů.

Obr. 9 uvolňování inositoltrifosfátu (IP₃) z fibroblastů stimulovaných samotným FVIIa, FFRFVIIa nebo v kombinaci s PDGF-BB. Buňky byly přes noc značené pomocí myo [³H] inositolem a inkubované s 100 nM FVIIa nebo FFR-FVIIa bez a nebo v kombinaci s 10 ng/ml nebo 100 ng/ml PDGF-BB. Poté byl analyzován uvolněný IP3. Prázdné sloupce ukazují buňky bez FVIIa nebo FFR-FVIIa (kontroly), šrafované sloupce ukazují buňky s FFR-FVIIa a černé sloupce ukazují buňky inkubované s FVIIa.

Fosforylace tyrozinu na PLC-γΙ jako reakce na PDGF-BB samotné (kontrola) nebo na FVIIa nebo FFR-FVIIa v kombinaci s PDGF-BB při udaných koncentracích. Buňky byly lyžovány a fosforylace tyrozinů na PLC-γΙ byla stanovena popsanou technikou.

Obr. 1 Analýza pomocí techniky „northem blot“ potvrzující data získaná pomocí cDNA microarray. 10 g celkové RNA (ze stejných vzorků RNA, které byly použity pro izolaci poly-A RNA pro přípravu sond pro hybridizací při cDNA microarray) bylo použito pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značeno pomocí ³²P-Cyr61 značenou sondou (částečná cDNA, získaná z Genomic Systems).

Panel B. Hybridizační signál byl kvantifikován pomocí přístroje Phosphoimager (Molecular Dynamics).

Obr. 2 a 2B Časově závislá exprese Cyról, indukovaná faktorem Vila. Rovnoměrně narostlá vrstva buněk WI-38 byla inkubována s faktorem Vila (5 g/ml) (2A) nebo PDGF-BB (10 ng/ml) (2B) po různé časové úseky. Celková RNA (10 g) byla použita pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značena radioaktivně značené sondy Cyról. Ethidiumbromidem značená 28S ribozomální RNA na odpovídajícím blotu, je zobrazena na spodním panelu a slouží jako RNA kontrola.

• · · • φφφφ • * · ·« φφφφ φ

·· ·ΦΦΦ • Φ ·

Φ Φ

Φ Φ t

• · φ ·· φ • φ φ • · 9 φ φφφ

Φ ΦΦΦΦ • Φ Φ

Obr. 3 Na dávce závislá exprese Cyr61, indukovaná faktorem Vila. Rovnoměrně narostlá vrstva buněk WI-38 byla inkubována s různými dávkami faktoru Vila 0, 0,1 0,5 2,0 a 5,0 g/ml po dobu 45 minut. Celková RNA (10 g) byla použita pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značena radioaktivně značené sondy Cyról. Ethidiumbromidem značená 28S ribozomální RNA na odpovídajícím blotu, je zobrazena na spodním panelu a slouží jako RNA kontrola.

Obr. 4 Katalitická aktivita faktoru Vila je nezbytná pro indukci exprese genu Cyról. Rovnoměrně narostlá vrstva buněk WI-38 byla inkubována v kontrolním bezsérovém médiu nebo v bezsérovém médiu obsahujícím faktor Vila (5 g/ml) nebo faktor Vila s inaktivovaným aktivním místem (Vllai, 5 g/ml) po dobu 45 minut. Celková RNA (10 g) byla použita pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značena radioaktivně značené sondy Cyról. Ethidiumbromidem značená 28S ribozomální RNA na odpovídajícím blotu, je zobrazena na spodním panelu a slouží jako RNA kontrola.

Obr. 5 Faktorem Vila indukovaná exprese genu Cyról není potlačena specifickými inhibitory faktoru Xa a trombinu. Rovnoměrně narostlá vrstva buněk WI-38 byla inkubována v kontrolním médiu nebo v médiu obsahujícím faktor Vila (5 g/ml, 100 nM po dobu 45 minut) Buňky byly předem inkubovány s 200 nM rekombinantním TAP (řádka 3) nebo hirudinem (řádka 4) po dobu 30 minut před přidáním faktoru Vila na 45 minut. Celková RNA (10 g) byla použita pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značena radioaktivně značené sondy Cyról. Ethidiumbromidem značená 28S ribozomální RNA na odpovídajícím blotu, je zobrazena na spodním panelu a slouží jako RNA kontrola.

Obr. 6 Efekt aktinomycinu-D a cyklohexamidu na faktorem Vila indukované ustálené koncentrace mRNA pro Cyról. Rovnoměrně narostlá vrstva buněk WI-38 byla předem inkubována s kontrolním vzorkem, aktinomycinem D (10 g/ml) nebo cyklohexamidem (10 g/ml) 200 po dobu 30 minut než byl přidán faktor Vila (5 g/ml, 45 minut). Celková RNA (10 g) byla použita pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značena radioaktivně značené sondy Cyról. Ethidiumbromidem značená 28S ribozomální RNA na odpovídajícím blotu, je zobrazena na spodním panelu a slouží jako RNA kontrola.

Obr. 7 Faktor Vila indukuje expresi CTGF. Rovnoměrně narostlá vrstva buněk WI-38 byla předem inkubována s faktorem Vila (5 g/ml) po různé časové úseky. Celková RNA (10 g) byla » · 9 •99 ·· 9999

99

9 9 9

9 9

9 9 9

9 9

9999 • 9999 9 • · ·· · »» * • · · • · · 9 • 9 999* • 9 9

9 •99 ·· 9999

99

9 9 9 • » 9 • 99 9 • •9

9*99 použita pro analýzu pomocí „northem blotu“ a značena radioaktivně značené sondy CTGF. Ethidiumbromidem značená 28S ribozomální RNA na odpovídajícím blotu slouží jako RNA kontrola.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1. Příprava FVII

Lidský přečištěný faktor VII vhodný pro použití v navrhovaném vynálezu je nejlépe připraven pomocí technologie rekombinace DNA, např. jako popisuje Hagen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, nebo jako je popsáno v evropském patentu č. 200 421 (ZymoGenetics). Faktor Vila připravený rekombinantní technologií může být buď authentický faktor Vila nebo faktor Vila který je více či méně modifikovaný, ovšem tak aby měl stejnou biologickou aktivitu při srážení krve jako autentický faktor Vila. Tento modifikovaný faktor Vila může být připraven např. modifikací sekvence nukleové kyseliny kódující faktor VII buď záměnou kodónů pro aminokyseliny nebo odstraněním některých aminokyselinových kodónů v nukleové kyselině kódující přirozený FVII známými způsoby, např. místně specifickou mutagenezí.

Faktor VII může být také připraven technikou popsanou v Bronze and Majerus, J. Biol. Chem. 225 (4) 1242-1247, 1980 a Herdner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983. Těmito způsoby je možné připravit faktor VII, který neobsahuje žádné další koagulační faktory z krve v detekovatelném množství. Ještě lépe přečištěný faktor může být získán zavedením gelové filtrace jako konečného přečišťovacího kroku. Faktor Vlije poté přeměněn na aktivovaný FVIIa pomocí známých způsobů, např. pomocí některých známých plazmatických proteinů, jako jsou faktory Xlla, IX nebo Xa. Další možnost aktivace popisuje Bjom et al., (Research Disclosure, 269 September 1986, str. 564-568) kdy faktor VII může být aktivován převedením přes intoměničovou chromatografickou kolonu, jako je např. Mono Q ® (Pharmacia Chemicals) nebo podobně.

PŘÍKLAD 2. Příprava FVIIai

Modifikovaný faktor VII vhodný pro použití v navrhovaném vynálezu je nejlépe připraven pomocí technologií popisovaných např. v mezinárodní patentové přihlášce č. 92/15686, 94/27631, 96/12800 a 97/47651 Zymogenetics/NovoNordisk).

PŘÍKLAD 3. Vliv FVIIa a FFR-FVIIa na chemotaktickou reakci fibroblastů proti podle navrhovaného vynálezu PDGF-BB a

aaa • 9999 « a a

·

9999 r* #*» a · a a « a 9 9 a a a • aaa a · aaaa 9 9 9

9 ·« ·♦9 a • a 99 • 99 a • a a

9 9 ·

Fibroblasty exprimující aktivní TF (obr. 1A a obr. 1B) byly inkubovány se 100 nM FVIIa a nasazeny na horní část modifikované Boydenovy komůrky, médium obsahujícíc 10 % FBS a PDGF-BB v různých koncentracích bylo přidáno pod 150 pm milipórový filtr. Migrace buněk za podmínek, kdy bylo přidáno médium, obsahujících 10 % FBS bez PDGF-BB, byla brána jako míra náhodné migrace a uvažována jako hodnota 100 % migrace. Podstatná migrační reakce byla zjištěna při koncentracích 0,01 ng/ml PDGF-BB u buněk stimulovaných FVIIa, a to i vzhledem k buňkám inkubovaným s 1 ng/ml PDGF-BB, ale dříve neinkubovaným s FVIIa, což je 100 násobný rozdíl v koncentraci (obr. 2a). Při 0,01 až 0,1 ng/ml PDGF-BB migrační reakce FVIIa stoupala v závislosti na dávce, přičemž první reakce byla zaznamenána na koncentraci 25 nM a maximum bylo zaznamenáno při koncentracích 50-100 nM FVIIa (obr 3A až D). Žádné zvýšeni náhodné migrace nebylo zjištěno po aktivaci pouze s FVIIa. Pro ověření, zda proteolyticky aktivní FVIIa je zodpovědný za hyperchemotaktickou reakci na PDGF-BB, byly fibroblasty také inkubovány se 100 nM FFR-FVIIa a testovány v Boydenově komůrce stejným způsobem (obr. 2A). Žádná chemotaktická reakce nebyla pozorována po aplikaci FFR-FVIIa při nízkých koncentracích PDGF-BB 0,01 až 1 ng/ml. Naopak předpokládané potlačení chemotaxe indukované 10-50 ng/ml PDGF-BB bylo pozorováno po aplikaci 100 nM FFR-FVIIa (obr. 2A a 3A až D).

Pokud byly fibroblasty předem inkubovány se směsí tří různých protilátek proti TF a teprve poté s FVIIa nebo s FFR-FVIIa, migrační reakce proti PDGF-BB byla stejná jako reakce fibroblastů které nebyly inkubovány v přítomnosti ligandů TF (obr. 4A). Irelevantní monoklonální protilátka třídy IgG ani nezabraňovala ani nepotlačovala chemotaktickou reakci indukovanou FVIIa nebo potlačovanou FFR-FVIIa (údaje neuvedeny). Přítomnost IgG protilátky nebo tří anti-TF protilátek neovlivnilo žádným způsobem náhodnou migraci fibroblastů (údaje neuvedeny).

V f

PŘIKLAD 4. Hyperchemotaktická reakce není způsobena FXa nebo trombinem

Jelikož přenos signálu indukovaný FVIIa vede k hyperchemotaktické reakci na PDGF-BB je závislý na katalytické aktivitě FVIIa je důležité zjistit, zda signalizace probíhá přes FXa nebo trombin vzniklý účinkem komplexu FVIIa/TF. Zvýšená migrační odpověď vyvolaná komplexem FVIIa/TF není blokována 0,2 až 10 μΜ antikoagulačním peptidem z klíšťat (TAP), specificky blokujícím aktivní místo FXa a brání další aktivaci koagulační kaskády vedoucí k vzniku trombinu (obr. 5A, 5B). Ani přidání 5 U/ml hirudinu, specifického inhibitoru trombinu nemá žádný vliv na hyperchemotaxi indukovanou FVIIa/TF (obr. 6A). TAP a hirudin neovlivňují migraci fibroblastů v reakci na PDGF v nepřítomnosti ligandu FVIIa (obr. 5A, 5B, 6A). Je tedy nepravděpodobné, že by vliv FVIIa na chemotaxi je dán aktivací FX nebo trombinu.

• · · • *··* • 9 «V <* ♦ · * • · · * • · 4··« • · · ·· · ·· »»«» «· #·

9 9 9

9 9 e · t 9

9 9

9999

·· ·*·· ·· ·· • 9 9 9 9 9 9

9 9 9

9 9

9999 ··

PŘÍKLAD 5. Hyperchemotaktická odpověď na PDGF-BB je závislá na aktivační dráze závislé na PLC, ale nezávislá na PI3' kináze.

Jak bylo již dříve prokázáno, aktivace PI3' kinázy je důležitá pro chemotaxi indukovanou receptorem PDGFp. Testovali jsme zda LY294002, specifický inhibitor PI3' kinázy, je schopen blokovat chemotaktickou reakci indukovanou signalizací prostřednictvím FVIIa/TF. Fibroblasty byly předem inkubovány s LY294002 za uvedených koncentrací po dobu 30 minut při 37 °C před přidáním 100 nM FVIIa a testovány vBoydenově komůrce, jak bylo popsáno výše. Koncentrace PDGF-BB byla udržována konstantní na 0,1 ng/ml v průběhu celého testu, tzn. na velmi nízké koncentraci při které je FVIIa/TF indukuje výraznou chemotaktickou odpověď. LY294002 byl přítomen v průběhu celého experimentu. Obr. 7A ukazuje, že migrační odpověď na PDGF-BB vyvolaná FVIIa/TF není ovlivněna inhibici PI3' kinázy.

Pro zjištění, jestli FVIIa/TF indukovaná chemotaktická odpověď je ovlivněna aktivací fosfatidylinositol specifické fosfolipázy C (PLC), inkubovali jsme fibroblasty s různými koncentracemi U73122, specifického inhibitoru PLC, po 30 minut při 37°C před přidáním 100 nM FVIIa a poté byla u buněk sledována jejich chemotaktická aktivita v přítomnosti inhibitoru. Jako negativní kontrola byl použit blízký analog U73343, který však nemá vliv na PLC. Koncentrace PDGF-BB byla udržována na konstantní koncentraci 0,1 ng/ml rovněž v tomto experimentu. Inkubace buněk s aktivním inhibitorem PLC U73122 inhibuje hyperchemotaktickou reakci na 0,1 ng/ml PDGF-BB v závislosti na dávce, kdy naprostého potlačení je dosaženo při koncentraci ΙμΜ (obr. 8A a 8B). Pokud byl použit negativní analog U73343 nebyl pozorován žádný vliv na chemotaxi.

PŘÍKLAD 6. Komplex FVIIa/TF indukuje aktivaci PLC

Pro další stanovení důležitosti aktivity PLC pro chemotaktickou reakcí, stanovovali jsme přímý vliv komplexu FVIIa/TF na aktivitu PLC u fibroblastů. Aktivace PLC vede k produkci dvou molekul sloužících jako druhý posel a to inositol-1, 4, 5-trifosfátu (IP3) a diacylglycerolu. Fibroblasty byly inkubovány s myo [³H] inositolem přes noc a poté s 100 nM FVIIa nebo FFRFVIIa po dobu 60 minut a nakonec s nebo PDGF-BB při uvedených koncentracích. Inkubace s 100 nM FVIIa samotným po dobu 60 minut indukovala mobilizaci IP3 ve fibroblastech na stejné úrovni, jako to způsobilo samotné PDGF-BB v koncentracích 10 ng/ml a 100 ng/ml (obr. 9). Navíc, kombinace 100 nM FVIIa 10 ng/ml nebo 100 ng/ml PDGF-BB zdvojnásobovala množství vzniklého IP3. Molekula FVIIa s inhibovaným aktivním místem neindukovala uvolňování IP₃. Tyto závěry jednoznačně prokazují, že PLC je aktivována po vazbě FVIIa na TF.

• •β ··· ··· ·· · ·· ·«·· ·· ····

PŘÍKLAD Ί. Fosforylace PLC-γΙ není zvyšována signalizací přes FVIIa/TF u fibroblastů Pro stanovení, zda PLC-γΙ izoforma, která je aktivována některými tyrozinkinázovými receptory, je zodpovědná za zvýšenou aktivitu PLC indukovanou komplexem FVIIa/TF, sledovali jsme fosforylaci PLC-γΙ. Fibroblasty byly inkubovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti 100 nM FVIIa nebo FFR-FVila jednu hodinu, a následovala stimulace 0,2, 10 nebo 100 ng/ml PDGF-BB. Po 5 minutách inkubace sbyly buňky lyžovány a PLC-γΙ byla imunoprecipitována, izolována na SDS-PAGE a na imunoblotu inkubována s protilátkami proti fosfotyrozinu. Zatímco po inkubaci s PDGF-BB byl detekován podstatný nárůst fosforylace tyrozinů na PLC-γΙ, přidání samotného FVIIa k fibroblastům, fosforylaci tyrozinů na PLC-γΙ neindukovalo (obr. 10) Navíc, kombinace FVIIa a PDGF-BB v různých koncentracích neindukujesilnější fosforylaci v porovnání se samotným PDGF-BB (obr. 10) FFR-FVIIa nemá žádný vliv na fosforylaci tyrozinů na PLC-γΙ (obr. 10). Je tedy zřejmé, že za zvýšení aktivity PLC po stimulaci FVIIa jsou zodpovědné jiné izoformy PLC než je PLC-yl.

PŘÍKLAD 6. Metodické postupy

Buněčné kultury: lidské podkožní fibroblasty AG1518 a AG1523 byly inkubovány v Eaglově MEM médiu doplněném 10 % fetálního hovězího séra (FBS). Před použitím byly buňky odděleny od podkladu tiypsinizací (2,5 mg/ml po dobu 10 minut při 37°C), promyty v Hanksově roztoku a resuspendovány opět v Eaglově MEM médiu doplněném 10 % fetálního hovězího séra (FBS) nebo v Hamově médiu doplněném 0,1 % FBS.

Proteiny: Lidský FVIIa (Novo Nordisk A/S, Gentofe, Denmark) byl exprimován a přečištěn tak, jak je popsáno výše. FFR-FVIIa (NovoNordisk) byl získán zablokováním aktivního místa FVIIa pomocí D-Phe-L-Phe-L-Arg-chlormethylketonem. Rekombinantní antikoagulační peptid z klíšťat (TAP) byl laskavě poskytnut DR. P. Vlasukem, Corvas (San Diego CA). Hirudin byl zakoupen od fyrmy Sigma. LY294002, U73122 a U73343 byly získány od firmy Biomol (Plymouth Meeting, PA. Monoklonální protilátky proti TF, TF8-5G9, TF9-5B7 a MTFH-1 (Morrissey, J.H., Fair, D.S., Edgington, T.S. Monoclonal antibody analyssi of purified and cellassociated tissue factor. Thromb. Res 52, 247-261 (1988)) byly laskavým darem od DR. J.H. Morrisseyho, Oklahoma Medical Research Foundation. Protilátky proti fosfotyrozinu, PY99 pocházely od Santa Cruz, California.

Průtoková cytometrie: Povrchová exprese TF byla analyzována pomocí imunofluorescence na průtokové cytometrii (Coulter Epics XL-MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, Coulter Electronics, USA). Přístroj byl kalibrovaný denně pomocí Immuno-Check™ nebo Flow

Check™ kalibračních kuliček (Coulter). Pro nepřímou imunofluorescenci byly AG1518 nebo AG1523 fibroblasty promyty dvakrát vPBS obsahujícím 0,1 % hovězího sérového albuminu (BSA), inkubovány 30 minut na ledu s monoklonální protilátkou proti lidskému TF (4508CJ, American Diagnostica, Greenwich, Ct. USA) značenou fluorescein-izothiokyanátem (FITC). Monoklonální protilátka IgGl proti oxidáze glukózy pocházející z plísně Aspergillus niger (Dakopatts) byla použita jako negativní kontrola. Průměrné fluorescence v příslušném kanálu (MFI) a procentuální podíl pozitivních buněk byl stanovován pro každý vzorek.

Stanovení aktivity TF: Koagulační aktivita TF byla stanovována jak popisuje Lindmark et al., (Lindmark E., Tenno T., Chem J., Siegbahn A., IL-10 inhobits LPS-inducedhuman monocyte tissue factor expression whole blood. Br. J. Haematol. 102 597-604 (1998)). Alikvoty obsahující 0,2 x 10⁵ AG1518 nebo AG1523 fíbroblastů, byly dvakrát promyty v PBS, přeneseny do jamek na 96-jamkové destičce (Nunc, Poskilde, Denmark). Prokoagulační aktivita byla stanovována ve dvojstupňovém aminolytickém testu, kde chromogenní substrát S-2222 (Chromogenix, Molndal, Sweden) je štěpen faktorem FXa, který vzniká následkem akivace FX komplexem TF/FVIIa. Reakční směs obsahuje výslednou koncentraci 0,6 mM S-2222, 2 mM CaCh a koagulační faktory z koncentrátu faktorů Prothromplex-T™ TIM4 (Baxter, Vienna, Austria) ve výsledné koncentraci 1 U/ml FVII a 1,2 U/ml FX byly přidány do jamek a po 30 minutách inkubace v 37°C byly stanovovány změny v absorbanci při 405 nm. Měření probíhalo ve třech opakováních.

Chemotaktická technika: Migrační odpověď fíbroblastů, byla stanovována pomocí techniky v modifikované Boydenově komůrce, jak bylo popsáno dříve (Siegbahn A., Hanimacher A., Westmark B., Heldin C-H. Differential effect of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes and granulocytes. J. Clin. Invest. 85, 916-920 (1990) a Nistér M., Hammacher A., Mellstrom K., Siegbahn A., Ronnstrand L., Westermark B., Heldin C-H. A glioma derived PDGF A chain homodimer has different functional activities from PDGF AB heterodimer purifíed from human platelets. Cell 52, 791-799 (1988)). Mikropórový filtr byl (velikost pórů 8 pm) byl potažen roztokem kolagenu typu 1 při pokojové teplotě přes noc. 30 minut před použitím byly filtry vysušeny na vzduchu. Lidské pokožkové fibroblasty AG1523 byly napěstovány v Eaglově MEM médiu doplněném 10 % FBS. Buňky byly sebrány trypsinizací (2,5 mg/ml po dobu 10 minut při 37 °C) a resuspendovány v Eaglově MEM médiu s 10 % FBS. Fibroblasty byly inkubovány 10 minut s nebo bez FVIIa nebo FFR-FVIIa před stanovováním. 100 μΐ buněčné suspenze (2 x 10⁵ buněk/ml) bylo přidáno do Boydenovy komůrky, nad filtr. PDGF-BB bylo naředěno v kultivačním médiu (Eaglově MEM médiu s 10 % FBS) a přidány do komůrky pod filtr. Buňky byly inkubovány 6 hodin při 37 °C ve zvlhčované e · * · · · · · ···· · · · · · · z-jr · · ···· ··· ···· · ········· ·· · ·· ···« ·· ···· komůrce obsahující 95 % vzduchu a 5 % CO2. FVIIa nebo FFR-FVIIa byly přítomny během celého experimentu. Filtry byly poté odstraněny, fixovány v ethanolu, obarveny pomocí roztoku Mayer Hemalun a připraveny pro pozorování. Migrace byla měřena jako vzdálenost nejvzdálenějších fibroblastů v jednom pozorovacím poli (12,5 x 24). Migrační vzdálenost jednotlivých filtrů byla spočítána jako průměr hodnot získaných ze třech různých částí filtru. Experimenty probíhaly s dvěma až čtyřmi nezávislými filtry pro každou koncentraci a každou látku ovlivňující chemotaxi. Pro každou sadu experimentů sloužila jako kontrolní hodnota, hodnota migrace fibroblastů proti samotnému médiu.

V případě, že jsou použity anti-TF protilátky nebo inhibitory koagulačních faktorů, TAP a

Hirudin, byly buňky předem inkubovány 10 minut s těmito látkami, poté s FVIIa nebo FFRFVIIa před nasazením na testování chemotaxe. Protilátky, TAP nebo Hirudin byly rovněž přítomné během celého experimentu stanovujícího chemotaxi. V experimentech, kde byl sledován vliv různých inhibitorů (LY294002, U73122 nebo U73343) na migrační odpověď, byly buňky předem inkubovány 30 minut s inhibitory při uvedených koncentracích a inhibitory byly přítomné během celého experimentu stanovujícího chemotaxi.

Technika stanovení uvolňování inositoltrifosfátu (IP3): Šestijamkové destičky obsahující narostlou kulturu lidských fibroblastů AG1518, bylo inkubováno přes noc (asi 20 hodin) s 2 pCi myo( H)inositolu (Amersham) ve 2 ml Hamova média F12 s0,l % FBS. Médium bylo zaměněno za Hamovo médium F12 s 0,1 % FBS (obsahujícím 2 mM CaCl₂) a 20 mM LiCl a buňky byly inkubovány 15 minut v 37 °C. Buňky byly poté inkubovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti 100 nM FVIIa nebo 100 nM FFR-FVIIa po dobu 1 hodiny. Poté bylo přidáno PDGF-BB (0, 10 nebo 100 ng/ml) a inkubace probíhala dalších 10 minut při 37°C. Technika detekce IP₃ byla prováděna jak bylo popsáno dříve v Eriksson et al., (Eriksson a., Nanberg E.,

Ronnstrand L., Engstrom U., Hellman U., RuppE., Carpenter G., Heldin C-H., Claesson-Welsh L., Demonstration of functionally different interactions between phospholipase C-γ and two types of platelet-derived growth factor receptors. J. Biol. Chem. 270, 7773-7781 (1995)).

Technika pro stanovení fosforylace PLC-γΙ indukované agonistou: Kultura narostlých fibroblastů AG1518 byla hladověna přes noc (asi 20 hodin v médiu obsahujícím 0,1 % FBS a poté inkubována v přítomnosti nebo nepřítomnosti 100 nM FVIIa nebo FFR-FVIIa jednu hodinu a následně inkubována s 0, 2, 10 nebo 100 ng/ml PDGF-BB po dobu 5 minut při 37 °C. Buňky byly lyžovány a PLC-γΙ byla precipitována, jak bylo popsáno dřivé (Hansen K, Johnell M.,

Siegbahn A., Rorsman C., Engstrom U., Wemstedt C., Heldin C-H., Ronnstrand L., Mutation of Src phosphorylation site in the PDGF β-receptor leads to increased PDGF-stimulated chemotaxis but decreased mitogenesis. EMBO J. 15, 5299-5313 (1996)) s anti-PLC-γΙ antisérem • · • · · · · · · · · · » φφφφφφφ a · »· · · φ · φ φφφ ·φ· φ· < φ· φφφφ φφ φφφφ připraveným imunizací králíků speptidem odpovídajícím karboxy konci hovězího PLC-yl (Artega C.L., Johnson M.D., Todderud G., Coffey R.J., Carpenter G., Page D.L. Elevated content of the tyrosine kinase substráte phospholipase C-yl inprimary human breast carcinomas.

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 8810435-10439 (1991)). Vzorky byly rozděleny na SDS-PAGE a identifikovány pomocí imunoblotu s anti-fosfotyrozinovou protilátkou PY99.

Statistická analýza: Data byla analyzována za použití programy Statistica™ pro Windows (StatSopft, Tulsa, Okla. USA). Pro stanovení statistické významnosti mezi různými soubory dat byl použit Studentův t-test pro závislé vzorky. Hodnoty p < 0,05 byly brány jako statisticky významné.

Proteiny: Rekombinantní lidský Vila, dar od NovoNordisk (Gentofite, Denmark), byl rozpuštěn ve sterilní vodě na koncentraci 1 až 1,3 mg/ml. Vzorek roztoku Vila byl kontrolován na kontaminaci stopových množství endotoxinu pomocí lyzátu amoebocytů z kraba rodu Limulus (BioWhittaker) s negativním výsledkem (mezní detekce 30 pg). Rekombinantní antikoagulační peptid z klíšťat (TAP) byl laskavě poskytnut DR. P. Vlasukem, Corvas (Corvas, San Diego CA) a rekombinantní hirudin byl zakoupen buď od firmy Sigma (St. Louis, MO) nebo Calbiochem (San Diego, CA). Přečištěný lidský faktor Xa a thrombin byly získány z Enzyme Research Laboratories (Southbend, IN).

Technika cDNA microarray: Buňky WI-38 byly kultivovány a 24 hodin před experimentem deprivovány absencí séra aby přešly do klidového stavu, jak bylo popsáno výše. Médium bylo nahrazeno čerstvým bezsérovým médiem DMEM (doplněným 5 mM CaCfi) a buňky byly stabilizovány 2 hodiny v inkubátoru. Buňky byly poté inkubovány s přečištěným rekombinantním Víla (5 pg/ml) po dobu 90 minut. Po 90 minutách byla izolována celková RNA z kontrolních buněk i z buněk inkubováných s Vila, pomocí Trizol (Gibco BRL). Póly (A) RNA byla přečištěna dvojitým průchodem přes Oligo Tex mRNA izolační kolonu, jak je popsáno ve výrobcově technickém manuálu (Quiagen). 800 ng vysoce přečištěné poly(A)RNA z kontrolních vzorků a ze vzorků inkubovaných s Vila, byla zaslána do cDNA microarray analysys Service (Human UniGEM V microarray, Genome Systems INC, St. Louis, MO).

Technika Northern blot: Celková RNA izolovaná pomocí reagens Trizol z buněk WI-38 v klidovém stádiu vystavených Vila a dalším faktorům, jak je popsáno ve výsledcích. Northern blot byl prováděn standardním postupem. Zkráceně, 10 pg celkové RNA bylo děleno gelovou elektroforézou v 1 % agarózovém gelu se 6 % formaldehydu a přeneseno na nitrocelulózovou membránu technikou kapilárního blotu. Membrány byly předem hybridizovány při 42 °C s roztokem obsahujícím 50 % formamidu, 5 x SSC, 50 mMTris.HCl, pH 7,5, 0,1 % pyrofosfátu sodného, 1 % SDS, 1 % polyvinylpyrrolidonu, 1 % Ficollu, 25 mM EDTA, 100 pg/ml *> · • 999 9 • · · 9 9 · • · · · * • 9 9 · • 9 9 · 9 · 9

9 9 9 9 9 ·»·· «9 9999 denaturované DNA z lososích spermií a 1 % BSA a hybridizovány s P-Cyr61 cDNA sondou (106 cpm/ml). Hybridizované membrány byly vyvolávány na Dupont NEF nebo Fuji RX X-ray film. Pro kvantifikační účely byly membrány 1 až 4 hodiny exponovány ne speciální membrány a ty byly poté analyzovány na Phospholmageru (Molecular Dynamics) pomocí programu Imagequant. Pro získání průměrných hodnot, jednotky (county) získané z různých experimentů byly normalizovány vzhledem ke kontrole (county v kontrolních vzorcích).

Chromogenní analýza: Buňky WI-38 byly kultivovány a 24 hodin před experimentem deprivovány absencí séra aby přešly do klidového stavu, jak bylo popsáno výše. Po promytí bylo přidáno FVIIa (5 pg/ml) v pufru obsahujícím 1,00 pg vápníku do jamek s buňkami i do jamek ve kterých žádné buňky nebyly. Po 30 minutách inkubace bylo do každé jamky přidáno 25 pg chromogenního substrátu pro faktory Xa a thrombin, tzn. Chromozym X a Chromozym TH. Po 3 hodinách inkubace se vyvinulo zabarvení a jamky byly hodnoceny pomocí zařízení „microplate reader“. Jako kontrola byly buňky inkubovány se stopovými množstvími faktoru Xa (50 až 0,1 ng/ml) nebo trombinu (0,1 až 0,002 U/ml). Nebyl zjištěn žádný rozdíl v absorbanci při 450 nm mezi jamkami kde byl Vila přidán k buňkám a kde byl přidán k prázdným jamkám. Naměřené hodnoty byly nižší, než hodnoty získané z jamek snejnižší koncentrací faktoru Xa nebo trombinu a představovaly chromogenní aktivitu faktoru Vila.

PŘÍKLAD 9. Technika „cDNA microarray“

Fibroblasty v klidovém stavu byly inkubovány s kontrolním bezsérovým médiem, nebo s bezsérovým médiem doplněným Vila (5 pg/ml) po dobu 90 minut (tři T-75 lahve pro každý experiment). Po inkubaci byla izolována celková RNA z ní byla oddělena poly(A)RNA. 600ng mRNA bylo značeno buď Cy3 nebo Cy5fluoroforem a poté hybridizováno na UniGem Human V čipu obsahujícím 8000 sekvencí ověřených EST, představujících až 5000 známých lidských genů (placený servis Genome System lne.). Na kontrolní destičce byla pozitivně otestována referenční cDNA pro stanovení citlivosti a ověření reversní transkripce, hybridizační účinnosti závislé na přečištění a přehled kvality a účinnosti techniky. Celková analýza experimentálních údajů přinesla minimální rozdíly v hybridizačních signálech mezi kontrolami a vzorky inkubovanými s VII. Pouze malé množství genů vykazovalo rozdíly v expresi. Zjistili jsme zvýšení exprese 5 genů (3,5 až dvojnásobek po inkubaci s Vila) zatímco jeden gen vykázal sníženou expresi po inkubaci s Vila (2,4krát nižší) (± 2je konzervativní hodnota pro odlišení minimální odchylky skutečných průměrů). Z technických důvodů nebylo možno identifikovat gen jehož exprese byla 3,5 krát zvýšena. Další geny se zvýšenou expresi po inkubaci s Vila jsou Cyról (2,5 krát), dopaminový receptor D2 (2,2 krát), EST Incyte PD 395116 (2 krát) a P2U • 4 ·· • » • · • · · · nukleotidový receptor (2 krát). Je zajímavé, že gen pro CTGF, který patří do Cyról rodiny, byl zvýšen 1,8 krát u buněk po inkubaci s Vila, ve srovnání s kontrolními buňkami. Gen, jehož exprese byla po inkubaci s Vila snížena byl EST PD674714. Pro další analýzu jsme zvolili Cyról.

PŘIKLAD 10. Potvrzení rozdílů v expresi Cyról.

Pro ověření údajů z cDNA microarray, podrobili jsme vzorky RNA z kontrolních buněk a buněk po inkubaci s Vila (stejné vzorky které byly použity pro přípravu poly(A)RNA pro cDNA microarray) analýze technikou Northern blotu a hybridizaci s radioaktivně značenou cDNA pro Cyról. ^vUdaje ukazují, že Cyról cDNA hybridizuje s jedním transkriptem (asi 2,0 kb) RNA izolované z kontrolních buněk i buněk po inkubaci s Vila. Intenzita hybridizačního signálu je však daleko silnější u RNA izolované z buněk inkubovaných s VII (obr. 1). Kvantifikací hybridizačního signálu bylo zjištěno, že exprese Cyról byla 2,8 krát vyšší u buněk po inkubaci s Vila ve srovnání s kontrolními buňkami.

PŘÍKLAD 11. Kinetika exprese Cyról indukované pomocí Vila.

Pro stanovení kinetiky exprese Cyról, fibroblasty v klidovém stádiu byly inkubovány po různé časové úseky s 5 pg/ml Vila. Byla izolována celková RNA a provedena analýza technikou Northern blot. Jak ukazuje obr. 2, exprese Cyról je zvýšena v závislosti na čase u buněk po inkubaci s Vila. Maximum exprese je dosaženo po 45 minutách a na původní úroveň se vrátí po 2 až 3 hodinách. Neboť bylo publikováno, že exprese Cyról u myších fibroblastů po stimulaci sérem a růstovými faktory přetrvává několik hodin (8 až 10) než začne klesat, zjišťovali jsme vliv séra a PDGF na kinetiku exprese Cyról u klidových fibroblastů WI-38. Jak ukazuje obr. 2B, Cyról je exprimován jen přechodně po stimulaci PDGF a na původní hladinu poklesne 2 hodiny po stimulaci. Podobné výsledky jsme získali při analýze exprese Cyról po stimulaci sérem (údaje neuvedeny).

PŘIKLAD 12: Faktor Vila v závislosti na dávce indukuje expresi Cyról.

Pro stanovení dávkové závislosti Vila, klidové fibroblasty byly inkubovány s různými koncentracemi FVIIa (0,1 až 5 pg/ml) 45 minut. Byla izolována celková RNA a provedena analýza technikou Northern blot. Jak ukazuje obr. 3, inkubace fibroblastů s 0,1 pg/ml FVIIaje dostatečné pro indukci exprese Cyról a běžná koncentrace FVIIa v plazmě (0,5 pg/ml, 10 nM) vede k silné expresi genu blížící se maximu.

• · • * 4 4 4 · 4 * · 4 4 • 4 4 · 44 · 44 · · · 4444 « « 4 44«4 4

LC? 444 444 4 4 4 •4 4 44 »··· 44 4444

PŘÍKLAD 13: Pro indukci Cyról je třeba katalytická aktivita FVIIa.

Pro zjištění zda pro indukci Cyról je třeba katalytická aktivita FVIIa, byly fibroblasty WI-38 inkubovány s Vila a s FVIIa s inhibovaným aktivním místem (FVIIai) 45 minut. Byla izolována celková RNA a provedena analýza technikou Northern blot.Jak ukazuje obr. 4 FVIIai není schopen indukovat expresi Cyról což dokazuje nezbytnost proteolytické aktivity FVIIa pro přenos signálu. V tomto kontextu může být důležité zjistit, zda se FVIIai váže na TF na povrchu buněk se stejnou nebo vyšší afinitou než FVIIa. Je nepravděpodobné, že v našem experimentu pozorovaná exprese Cyról pomocí Vila byla výsledkem vzniku dalších koagulačních faktorů,

Xa a trombinu. Pomocí citlivé chromogenní techniky jsme nezjistili důkazy vzniku Xa a trombinu v našem experimentálním systému (detekční citlivost 10 pg). Dále, specifické inhibitory faktoru Xa a trombinu, tzn. antikoagulační protein z klíšťat a hirudin, nebyly schopny potlačit expresi Cyról indukovanou pomocí Vila (obr. 5).

PŘÍKLAD 14: Vliv transkripční ch mechanismů na indukci Cyról mRNA pomocí Vila.

Pro zjištění, zdaje ovlivněna stabilní hladina transkripce Cyról mRNA pomocí Vila, klidové fibroblasty WI-38 byly inkubovány s aktinomycinem-D (10 pg/ml) po dobu 30 minut před přidáním Vila na 45 minut. Jak je ukázáno na obr. 6, aktinomycin-D inhibuje stimulační efekt Vila. Tyto výsledky prokazují nezbytnost transkripčních mechanismů pro indukci Cyról.

Pro zjištění zda de novo proteinová syntéza je nezbytná pro indukci Cyról mRNA pomocí Vila,

WI-38 fibroblasty byly inkubovány s inhibitorem proteinové syntézy cykloheximidem předtím, než byly inkubovány s Vila po dobu 45 minut. Jak ukazuje obr. 6, stimulační efekt Vila nebyl ovlivněn cykloheximidem. Cyklohexamid výrazně zvyšuje hladiny Cyról mRNA indukované Vila.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití agonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva vyvolávajícího nebo zlepšujícího buněčnou migraci.
2. Použití podle nároku 1, kde agonistou tkáňového faktoru je FVII nebo FVIIa nebo jejich kombinace.
3. Použití podle nároku 2, ve kterém se kontaktuje agonista tkáňového faktoru a příslušné buňky.
4. Použití antagonisty tkáňového faktoru pro přípravu léčiva potlačujícího nebo snižujícího buněčnou migraci.
5. Použití podle nároku 4, kde antagonistou tkáňového faktoru je modifikovaný faktor VII.
6. Použití podle nároku 4, ve kterém se kontaktuje antagonista tkáňového faktoru a příslušné buňky.
7. Použití podle nároku 3 nebo 6, ve kterém příslušné buňky jsou lidské buňky exprimujicí tkáňový faktor včetně fibroblastů, buněk hladkého svalstva, nádorových buněk, hematopoietických buněk, monocytů, makrofágů a epiteliálních buněk.
8. Použití podle nároku 7, ve kterém příslušné buňky dále exprimují PDGF a receptor pro PDGF, zejména pak PDGF-β receptor.
9. Použití podle nároku 5, ve kterém modifikovaný faktor VII je faktor VII modifikovaný Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormethylketonem, Phe-Phe-Arg chlormethylketonem, Dansyl-DPhe-Phe-Arg chlormethyl-ketonem a D-Phe-Phe-Arg chlormethylketonem.
10. Použití faktoru Vila nebo faktoru VII nebo jejich kombinace nebo jiného tkáňového faktoru pro přípravu léčiva vyvolávajícího nebo zlepšujícího léčení zranění u pacientů.
11. Použití antagonistu tkáňového faktoru pro přípravu léčiva pro potlačení nebo snížení buněčné migrace, invaze, migrací indukovaného buněčného dělení nebo angiogeneze u pacientů trpících nemocí nebo poruchou spojenou s buněčnou migrací, invazivitou, migrací indukovaným buněčným dělením nebo angiogenezí.

„ZMĚNĚNÝ LIST’ ···· ·· ····
12. Použití podle nároku 11, ve kterém nemoc nebo porucha je růst primárního nádoru, nádorová invazi vita nebo metastázování.
13. Použití podle nároku 11, ve kterém antagonistou tkáňového faktoru je modifikovaný faktor VII.
14. Způsob regulace exprese alespoň jednoho genu v buňkách vyznačující se tím, že zahrnuje buď inkubaci těchto buněk s agonistou tkáňového faktoru nebo inkubaci těchto buněk s antagonistou tkáňového faktoru.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že agonistou tkáňového faktoru je FVII nebo FVIIa.
16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že agonistou tkáňového faktoru je modifikovaný FVII.
17. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že gen je gen patřící do genové rodiny CCN.
18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že příslušný gen je ze skupiny genů Cyról, CTGF, D2 dopaminový receptor, EST Incyte PD 395116 nebo P2U nukleotidový receptor.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že tímto genemje gen Cyról.