MXPA02000468A - Uso del fviia o de un antagonista del factor de tejido para regular la expresion de genes y la migracion celular o la quimiotaxis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso del FVII y/o FVIIa y/u otro agonista del TF, y/o FVIIai y/u otro antagonista del TF, en el tratamiento terapéutico de condiciones patológicas que se pueden relacionar con la migración celular o tratarse por la regulación específica de la migración celular o quimiotaxis. La invención también se refiere al uso de FVII y/o FVIIa y/u otro agonista TF y/o FVIIai y/u otro antagonista TF en el tratamiento terapéutico de condiciones patológicas que se pueden relacionar con la regulación de la expresión de al menos un gen en una célula, por ejemplo, el gen Cyr61.

Description

USO DEL FVIIa O DE UN ANTAGONISTA DEL FACTOR DE TEJIDO PARA REGULAR LA EXPRESIÓN DE GENES Y LA MIGRACIÓN CELULAR O LA QUIMIOTAXIS. CAMPO DE LA INVENCIÓN Ha sido descrita una célula novedosa que regula la actividad del factor de coagulación VII (FVII) o un antagonista del factor de tejido tal como por ejemplo, el factor de coagulación inactivado Vlla (FVIIai) de las células que expresan el factor de tejido (TF) . La presente invención se refiere a un método para regular la migración celular o la quimiotaxis, al hacer contacto de la célula con un FVIIa u otro agonista TF, o un FVIIai u otro antagonista TF y determinar la migración de las células. La invención también se refiere al uso del FVIIa u otro agonista TF, o el FVIIai u otro antagonista TF para la preparación de un medicamento para la regulación de la migración celular en un paciente. Además, la presente invención se refiere a un método de tratamiento y a un método para detectar la actividad de compuestos, en particular los candidatos a medicamentos que interactúan con la migración celular. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La trayectoria extrínseca de la coagulación sanguínea se inicia cuando el FVIIa que circula en el plasma, se enlaza a una proteína de membrana integral, Ref: 135403 factor de tejido (TF) . El papel del TF en la coagulación sanguínea ha sido estudiado ampliamente. El involucramiento del FVIIa como una enzima proteolítica en la cascada de la coagulación sanguínea, se cree que está confinada al foliólo extracelular de las células que expresan el TF. Una actividad intracelular del FVIIa se implico primeramente cuando la secuencia de TF mostró homología con la superfamilia del receptor hematopoyético o de citosina/interferon. La subclase I de la familia del receptor . hematopoyético incluye receptores para la hormona del crecimiento, prolactina, interleucinas 1 a la 7, factores estimulantes de colonias de macrófagos-granulocitos, eritropoyetina y trombopoyetina . La subclase II incluye TF y receptores para el interferon a y . La similitud del TF con esta clase de receptores se sustentó adicionalmente con la aparición de la estructura del cristal. La característica de este tipo de receptores de citosinas que incluyen receptores para el interferon b y g y el IL-10, es que su activación conduce a una fosforilación rápida de tirosina de los receptores mismos, así como a un subconjunto de proteínas intracelulares . Minutos después de la fosforilación inicial de la' tirosina, se activa una configuración de cinasas (MAPK) activadas por mitógenos (Ser/Thr) . Estas cinasas se configuran en diversas trayectorias de señalización paralela. Estudios completos de la capacidad de señalización intracelular supuesta del FVIIa, han demostrado que inducen la movilización de calcio libre intracelular (Ca2+) en la linea celular de carcinoma de vejiga humana, J82, que expresa constitutivamente al TF en las células endoteliales de la vena umbilical que se pretratan con interleucina-1 para expresar TF, pero que han fracasado al demostrar alguna activación similar a la citosina de las tirosinas cinasas intracelulares . En conclusión, se cree que el FVIIa en una forma dependiente del TF, para inducir la movilización del Ca2+ intracelular a través de la activación de la fosfolipasa C. El mecanismo por el cual el FVIIa activa la fosfolipasa C no se conoce, pero se ha descartado específicamente la activación de la tirosina cinasa. Los reportes recientes de diversos laboratorios, indican que el TF puede influenciar una configuración de funciones biológicas importantes diferentes a la coagulación, tal como la angiogénesis , vascularización de embriones y metástasis de tumor. En la actualidad sin embargo, no es clara la manera en que el TF contribuye a estos procesos biológicos. El dominio extracelular de TF consiste de 2 módulos similares a la fibronectina de tipo III, como en el dominio extracelular del receptor de citosina de clase II típico, planteando la posibilidad de que el TF pueda jugar un papel en la transducción de señales, la función primaria del receptor de citosinas. Sin embargo, el TF tiene un dominio citoplásmico muy corto (solamente 21 residuos de aminoácidos de longitud) y carece de porciones proximales de membrana que median el enlace de las cinasas no receptoras de Janus (Jaks) que son esenciales para la señalización del receptor de citosinas. Sin embargo, diversos hallazgos bioquímicos sugieren una función de transducción de señal para el TF. El análisis de la secuencia de proteínas humanas TF, revela un sitio de fosforilación supuesto en el dominio citoplásmico, que se conserva en el TF del ratón, rata y conejo. Los residuos específicos de serina en el extremo citoplásmico del TF, se fosforilan en células después de la estimulación con el activador de la proteína cinasa C. El extremo citoplásmico de TF humano se fosforila in vitro en sitios múltiples cuando se incuba con los lisados de las células U87-MG. Un papel potencial del dominio citoplásmico TF en la transducción de señal, se indica también en estudios que muestran que la función prometaestática del TF, es críticamente dependiente del dominio citoplásmico TF. Además, el dominio citoplásmico TF demuestra interactuar con la proteína de enlace de actina 280 (ABP-280) y apoya la adhesión celular y la migración a través del reclutamiento de la ABP-280 hasta los contactos de adhesión mediados por el TF. Sin embargo, el TF ha demostrado también participar en ciertos tipos de señalización celular, al servir como un cofactor para su ligando fisiológico FVIIa en una señalización extracelular por un mecanismo proteolitico. Por ejemplo, el enlace del FVIIa a la superficie celular TF muestra que induce oscilaciones intracelulares Ca2+ en diversas células que expresan TF, fosforilación transitoria de tirosina en monocitos, activación de la cinasa MAP, alteración en la expresión de genes en fibroblastos y expresión enriquecida del receptor de urocinasa en células de tumor. El FVIIa catalíticamente inactivo (FVIIai) falla al inducir muchas de las respuestas de señalización anteriores, desde oscilaciones Ca2+ hasta la activación de la MAP cinasa y la reducción de genes, y parece que la actividad catalítica de FVIIa puede requerirse para al menos alguna transducción de señal mediada por el TF-FVIIa. En la actualidad, no se conoce mucho acerca de las trayectorias de señalización que se inducen por el FVIIa activo proteolíticamente y de la manera en que las señales que se generan por el FVIIa pueden contribuir a la angiogénesis y metástasis de tumor .

Para estudiar el programa temporal de transcripción que subyace a la respuesta inducida por el FVIIa, en el estudio actual, se ha examinado la respuesta de los fibroblastos humanos al FVIIa usando una microconfiguración de cADN. Los datos revelan que la expresión celular de genes diversos se altera de forma detectable en fibroblastos con la exposición del FVIIa. Uno de tales genes es el Cyr61, un gen temprano intermediario inducible por el factor de crecimiento, cuyo producto demuestra que promueve la adhesión celular, aumento déla síntesis de ADN inducida por el factor de crecimiento, y estimula la migración celular en fibroblastos y células endoteliales . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso del FVII y/o FVIIa y/u otro agonista TF y/o un FVIIai y/u otro antagonista TF, en el tratamiento terapéutico de las condiciones patológicas que se pueden relacionar con la migración celular o tratarse por la regulación específica de la migración celular o quimiotaxis. En otro aspecto, la invención se refiere al uso del FVII y/o FVIIa y/u otro agonista TF y/o un FVIIai y/u otro antagonista TF, en el tratamiento terapéutico de condiciones patológicas, que se pueden relacionar con la regulación de la expresión de al menos un gen en una célula, por ejemplo, el gen Cyr61. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inducir o enriquecer la migración celular, que comprende la etapa de hacer contacto de la célula con un agonista del factor de tejido. En una modalidad, el agonista del factor de tejido es FVII o FVIIa. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para reducir o inhibir la migración celular, que comprende la etapa de hacer contacto de la célula con un antagonista del factor de tejido. En una modalidad, el antagonista del factor de tejido es FVII modificado. En una modalidad, la célula es una célula humana que expresa el factor de tejido, incluyendo fibroblastos, células del músculo liso, células de tumor, células hematopoyéticas y células epiteliales. En una modalidad, el factor modificado VII se selecciona a partir de un factor VII modificado con Dansil-Phe-Pro-Arg clorometil cetona, Dansil-Glu-Gly-Arg clorometil cetona, Dansil-Phe-Phe-Arg clorometil cetona, Phe-Phe-Arg clorometil cetona, Dansil-D-Phe-Pro-Arg clorometil cetona, Dansil-D-Glu-Gly-Arg clorometil cetona, Dansil-D-Phe-Phe-Arg clorometil cetona y D-Phe-Phe-Arg clorometil cetona. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inducir o enriquecer la cicatrización ' de heridas en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al factor FVIIa, o el factor FVII, u otro agonista del factor de tejido o una combinación de los mismos . En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inhibir o reducir la migración celular, invasión, proliferación celular inducida por la migración, o angiogénesis, en un paciente que tiene una enfermedad o condición asociada con la migración indeseable de células, invasión, proliferación celular inducida por la migración o angiogénesis, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del factor de tej ido . En una modalidad, la enfermedad o condición es un crecimiento primario de tumores, invasión por tumores o metástasis . En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un agonista del factor de tejido, para la fabricación de un medicamento para inducir o enriquecer la migración celular. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un antagonista del factor de tejido, para la fabricación de un medicamento para reducir o inhibir la migración celular . En otro aspecto, la invención se refiere a un método de regulación de la expresión de al menos un gen en una célula, que comprende la etapa de hacer contacto de la célula con un agonista del factor de tejido, o hacer contacto de la célula con un antagonista del factor de tej ido . En una modalidad, el gen es un gen que pertenece a la familia de genes CCN. En otra modalidad, el gen se selecciona del grupo que consiste de Cyr61, CTFG, receptor D2 de la dopamina, receptor del nucleótido P2U o EST Incyte PD 395116. En una modalidad el gen es un gen Cyr61. En una modalidad la regulación es inducir o enriquecer la expresión. En otra modalidad, la regulación es reducir o inhibir la expresión. En una modalidad, el FVII o FVIIa u otro agonista del factor de tejido, induce o enriquece la expresión de genes y el FVII modificado u otro antagonista del factor de tejido reduce o inhibe la expresión de genes, por ejemplo, cuando el gen es un gen que pertenece a la familia de genes CCN, o el gen se selecciona del grupo que consiste de Cyr61, CTFG, receptor D2 de la dopamina, receptor EST Incyte PD 395116 o receptor nucleótido P2U. En otra modalidad el FVII o el FVIIa u otro agonista del factor de tejido, reduce o inhibe la expresión de genes, y el FVII modificado u otro antagonista del factor de tejido induce o enriquece la expresión de genes, por ejemplo, cuando el gen es EST PD674714. Los estados de enfermedad que se pueden tratar, son condiciones patológicas tales como por ejemplo ateroesclerosis, deposición de tumores, crecimiento de tumores, invasión de tumores, metástasis o angiogénesis . Otros estados que se pueden tratar son por ejemplo, cicatrización de heridas incluyendo la regeneración de las paredes de los vasos y el tratamiento de quemaduras, inflamación, o la regulación de la migración celular in vitro tal como por ejemplo crecimiento del tejido. LISTA DE FIGURAS (fra 6011) Figura 1A y IB: Análisis citométrico de flujo de la expresión de TF en fibroblastos (1A) . Las células se tiñeron con anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con fluorescein isotiocianato monoclonal de murina (FITC) (área sin relleno) , que se usó como control negativo o un anticuerpo del factor antitejido (TF) conjugado con FITC monoclonal (área llena) . La figura IB muestra la actividad procoagulante de los fibroblastos. Los fibroblastos con la expresión TF generaron un incremento de 10 tantos en el PCA en comparación con los monocitos sin expresión de TF. Figura 2A: Efectos de la FVIIa y FFR-FVIIa en la quimiotaxis inducida por PDGF-BB en fibroblastos humanos. El símbolo ¦ muestra la respuesta quimiotáctica de fibroblastos a concentraciones diferentes de PDGF-BB. Los fibroblastos incubados con FVIIa 100 n (·) o FFR-FVIIa 100 nM (O), migran hacia concentraciones diferentes de PDGF-BB. Los resultados son medias y SEM de tres experimentos separados. Los valores de P menores a 0.05, * se consideran estadísticamente importantes (prueba t de Student) . Figuras 3 A-D: La influencia de concentraciones diferentes FVIIa o FFR-FVIIa en la PDGF-BB inducen la quimiotaxis en fibroblastos. ¦ Muestra la migración de fibroblastos a concentraciones diferentes de PDGF-BB. Las células se incuban con 12.5 (A), 25 (B) , 50 (C) y 100 (D) nM FVIIa (·) o FFR-FVIIa (O) y se ensayan en una cámara Boyden hacia concentraciones diferentes de PDGF-BB. Los resultados son medias y SEM de tres experimentos diferentes. *=p<0.05, **=p<0.01 y ***=p<0.001, prueba t de Student.

Figura 4A: Una mezcla de tres anticuerpos monoclonales para TF bloquea los efectos de FVIIa y FFR-FVIIa en la quimiotaxis inducida por PDGF-BB en fibroblastos. ¦ Muestra la migración hacia PDGF-BB de fibroblastos sin anticuerpos TF, · fibroblastos preincubados con anticuerpos TF y FVIIa 100 nM, y O fibroblastos preincubados con anticuerpos TF y FFR-FVIIa 100 nM. Los resultados son medias y SEM de tres experimentos separados. Figura 5A y 5B: La influencia de FXa en la respuesta quimiotáctica al PDGF-BB inducida por FVIIa. Los fibroblastos se preincuban con TAP 200 nM (fig.5A) (¦) o con TAP 0.2-2 µ? (fig. 5B) (¦) y después con FVIIa 100 nM ( · ) . El TAP está presente durante los experimentos completos. La quimiotaxis se induce por concentraciones diferentes de PDGF-BB (5A) o por 0.1 ng/ml de PDGF-BB (5B) . Los resultados son medias y desviaciones estándar de dos experimentos separados. Figura 6A: La influencia de la trombina en la respuesta quimiotáctica para la PDGF-BB inducida por FVIIa. Los fibroblastos se preincubaron con 5U/mL (concentración final) de hirudina y después con FVIIa 100 nM. La hirudina estaba presente durante los experimentos completos. Se indujo la quimiotaxis por concentraciones diferentes de PDGF-BB. ¦ Muestra células incubadas con hirudina solamente y · células con hirudina y FVIIa. Los resultados son media y desviación estándar de dos experimentos por separado. Figura 7A: Efecto de la inhibición de la cinasa P13' en la quimiotaxis en fibroblastos incubados con FVIIa. Las células se preincubaron con concentraciones variables de LY294002 durante 30 minutos a 37°C, y después con FVIIa 100 nM (·) o sin FVIIa (¦). El inhibidor estaba presente a través del ensayo de quimiotaxis. La quimiotaxis se indujo por PDGF-BB 0.1 ng/mL. Los resultados son la media y la desviación estándar de dos experimentos por separado. Figura 8A y 8B: Efecto de la inhibición PLC en la quimiotaxis en fibroblastos incubados con FVIIa. Las células se incubaron con concentraciones variables de U73122 (inhibidor activo de PLC) (8A) o U73343 (control inactivo) (8B) durante 30 minutos a 37°C antes de la incubación con o sin FVIIa 100 nM, y después se ensayaron en una cámara Boyden hasta un gradiente de concentración de PDGF-BB 0.1 ng/mL. Los agentes estuvieron presentes durante los experimentos completos. ¦ Muestra células con U73122 o U73343 solamente, · células con U73122 o U73343 y FVIIa. Los resultados son la media y la desviación estándar de dos experimentos por separado.

Figura 9: Liberación del trisfosfato de inositol (IP3) de fibroblastos estimulados con FVIIa, FFR-FVIIa solamente o en combinación con PDGF-BB. Las células se etiquetaron durante la noche con mió [3H] inositol, se incubaron con o sin FVIIa o FFR-FVIIa 100 n , en ausencia o presencia de PDGF-BB 10 ng/mL o 100 ng/mL. Las células se analizaron después para la liberación en IP3. Las barras abiertas muestran células sin FVIIa o FFR-FVIIa (control) , las barras sombreadas muestran células con FFR-FVIIa y las barras negras muestran células incubadas con FVIIa. Figura 10: Fosforilación de tirosina de PLC-?? en respuesta al PDGF-BB solamente (control), FVIIa o FFR-FVIIa en combinación con PDGF-BB. Las células se incubaron con FVIIa 100 nM o FFR-FVIIa durante 1 hora, y después con o sin PDGF-BB a las concentraciones indicadas. Las células se lisaron y la fosforilación de tirosina del PLC-?? se detectó como se describe en los métodos . Figura 1. Análisis de manchado Northern que confirma los datos obtenidos con el ensayo de microconfiguración de cADN. 10 gramos de ARN total (de las mismas muestras de ARN que se usaron para aislar el poli (A) ARN para generar sondas para hibridación de la microconfiguración de cADN) fueron sometidos al análisis de manchado Northern y se sondearon con Cyr61 etiquetado con 32P (un cADN de longitud parcial, obtenido de Genomic Systems) . Recuadro B. Las señales de hibridación se cuantificaron con fosforlmager (Molecular Dynamics) . Figura 2 y 2B. Expresión del Cyr61 inducida por el factor Vlla dependiente del tiempo. Las monocapas quiescentes de células WI-38 se trataron con el factor VIla (5 g/ml) (2A) o PDGF-BB (10 ng/ml) (2B) por periodos de tiempo variable. El ARN total (10 g) se sometió al análisis de manchado Northern y se sondeó con Cyr61 radio etiquetado. La tinción con bromuro de etidio del ARN ribosomal 28S del manchado correspondiente se muestra en el panel del fondo como control de carga de ARN. Figura 3. Expresión del Cyr61 inducida por el factor Vlla dependiente de la dosis. Monocapas quiescentes de células WI-38 se trataron con dosis variables del factor Vlla, 0, 0.1, 0.5, 2.0 y 5.0 g/ml durante 45 min. Se sometió el ARN total (10 g) a un análisis de manchado Northern y se sondeó con Cyr61 radioetiquetado . La tinción con bromuro de etidio del ARN ribosomal 28S del manchado correspondiente se muestra en el panel del fondo como control de carga de ARN. Figura 4. Actividad catalítica del factor Vlla que se requiere para la expresión inducida de Cyr61. Las monocapas quiescentes de células WI-38 se trataron con un medio de control libre de suero o un medio libre de suero que contenia el factor Vlla (5 g/ml) o el factor inactivado de sitio activo Vlla (VIlai, 5 g/ml) durante 45 minutos. El ARN total (10 g) se sometió a un análisis de manchado Northern y se sondeó con Cyr61 radio etiquetado. La tinción con bromuro de etidio del ARN ribosomal 28S del manchado correspondiente se muestra en el panel del fondo como control de carga de ARN. Figura 5. Expresión inducida por el factor Vlla de Cyr61, no se elimina por inhibidores específicos del factor Xa y trombina. Las monocapas quiescentes de células WI-38, se trataron con medio de control o el factor Vlla que contenía al medio (5 g/ml; 100 nM) durante 45 minutos. Las células se preincubaron con TAP recombinante 200 nM pista 3) o hirudina (pista 4) durante 30 minutos antes de su exposición al factor Vlla durante 45 minutos. El ARN total (10 g) se sometió a un análisis de manchado Northern y se sondeó con Cyr61 radio etiquetado. La tinción con bromuro de etidio del ARN ribosomal 28S del manchado correspondiente se muestra en el panel del fondo como control de carga de ARN. Figura 6. Efecto de la actinomicina D y la cicloheximida en los niveles de régimen permanente mARN de Cyr61 inducido por el factor Vlla. Las monocapas quiescentes de células WI-38, se preincubaron con un vehículo de control, actinomicina D (10 g/ml) o cicloheximida (10 g/ml) durante 30 minutos antes de que las células se expusieran al factor Vlla (5 g/ml) durante 45 minutos. El ARN total (10 g) se sometió a un análisis de manchado Northern y se sondeó con Cyr61 radio etiquetado. La tinción con bromuro de etidio del ARN ribosomal 28S del manchado correspondiente, se muestra en el panel inferior como control de carga de ARN. Figura 7. Factor Vlla induce la expresión de CTGF. Las monocapas quiescentes de células WI-38 se trataron con el factor Vlla (5 g/ml) por periodos de tiempo variable. El ARN total (10 g) se sometió a un análisis de manchado Northern y se sondeó con CTGF radio etiquetado. La tinción con bromuro de etidio del ARN ribosomal 28S del manchado correspondiente, se muestra como un control de carga de ARN. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de FVII, o FVIIa u otro agonista de TF para la fabricación de una composición farmacéutica, para la inducción o aumento de la migración celular. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso del FVII, FVIIa u otro agonista del TF, para la fabricación de una composición farmacéutica, para inducir o aumentar la cicatrización de heridas o angiogénesis . Todavía en otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso del FVIIa u otro agonista TF para la fabricación de una composición farmacéutica, para inhibir o evitar la migración celular. En una modalidad, la migración celular es en un sujeto. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso del FVIIai u otro agonista del TF, para la fabricación de una composición farmacéutica, para inhibir o evitar la angiogénesis, metástasis, crecimiento de tumor o invasión de tumor. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para inducir o aumentar la migración celular en un paciente, que comprende administrar una cantidad efectiva de FVII o FVIIa u otro agonista TF al paciente . Todavía en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para inhibir o evitar la migración celular en un paciente, que comprende administrar una cantidad efectiva de FVIIai u otro antagonista TF al paciente.

En una modalidad en particular, la cantidad efectiva es una dosis diaria desde alrededor de 5 hasta alrededor de 500 µg/kg/día . En una modalidad adicional, el antagonista TF comprende un FVIIa modificado por ejemplo, FFR-FVIIa. La presente invención proporciona un mecanismo para una actividad de FVII y/o FVIIa que se relaciona con la estimulación de la migración celular. Tal mecanismo proporciona la base para establecer el involucramiento de FVII y/o el FVIIa en condiciones patológicas en las cuales, participan células que expresan el TF como las células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, células del músculo liso y monocitos/macrófagos . La invención proporciona además, la base para identificar objetivos farmacológicos específicos que son útiles para la intervención terapéutica. Así, la presente invención se refiere al uso del FVII y FVIIa y/o FVIIai en el tratamiento terapéutico de condiciones patológicas que se pueden relacionar con la migración celular o tratarse por la regulación específica de la migración celular. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de detección de candidatos a medicamentos que regulan la migración celular, el método comprende a) cultivar la célula que expresa TF; b) medir la migración de la célula; c) incubar la célula con un candidato a medicamento, y d) medir la migración de la célula incubada y determinar cualquier cambio en el nivel de migración en comparación con la migración medida en la etapa b, tal cambio es indicativo del candidato a medicamento biológicamente activo en la célula. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en lo que se ha referido como "cascada" de coagulación, son proenzimas o zimogenos, proteínas enzimáticamente inactivas, que se convierten a enzimas proteolíticas por la acción de un activador, en sí mismo, un factor de coagulación activado. Los factores de coagulación que se han sometido a tal conversión generalmente se refieren como "factores activos", y se designan por la adición de la letra "a" en el nombre del factor de coagulación (por ejemplo factor Vlla) . El término "quelador de zinc" pretende comprender a un compuesto que se enlaza al factor Vlla e induce el reemplazamiento de los iones calcio con iones zinc dentro del factor Vlla, por lo cual se inhibe la actividad del factor Vlla o el complejo de factor de tejido-factor Vlla (TF-FVIIa) . Un antagonista TF apropiado de conformidad con la invención, puede ser un compuesto quelador de zinc, ¦ por ejemplo un dihidroxamato o una dihidrazida con los grupos hidroxamato o hidrazida localizados en relación uno con el otro en una posición tal que pueden ser capaces de quelatar a un ion zinc. El compuesto quelante de zinc actúa en composición con el FVIIa. Los iones Zn2+, ejercen su acción inhibitoria en competencia con un efecto estimulador de los iones Ca2+. Se predice que los iones Zn2+ desplacen a los iones Ca2+ de uno o más sitios de enlace de calcio dentro del FVIIa. Los compuestos queladores de zinc, por ejemplo hidroxamatos e hidrazidas, son capaces de actuar como apoyos poderosos para el enlace de los iones zinc en competencia con los iones calcio. Los compuestos específicos potencian por lo tanto, la inhibición de la actividad del complejo factor Vlla/factor de tejido. La actividad del factor Vlla en complejo con el factor de tejido, se puede inhibir por un mecanismo en el cual un quelador de zinc se enlaza al factor Vlla y facilita el reemplazo del Ca2+ con Zn2+. Mediante esta acción, el quelador ejerce un efecto modulador . en el TF a una concentración normal de Ca2+ libre y iones Zn2+ en la sangre. El término "FVII" o "factor VII" significa un factor de coagulación zimogénica VII de "cadena simple". El término "factor Vlla" o "FVIIa", significa un factor VII de coagulación activado en dos cadenas, desdoblado por un desdoblamiento especifico en el enlace péptido Arg 152-Ile 153. El FVII y el FVIIa se pueden purificar de la sangre o producirse por medios recombinantes . Es evidente que la práctica de los métodos aquí descritos es independiente de la manera en que el factor purificado Vlla se deriva y por lo tanto, la presente invención se contempla para cubrir el uso de cualquier preparación de factor FVII o FVIIa apropiada para su uso aquí. Se prefiere el FVIIa humano. El FVII o el FVIIa también se pretende que incluyan variantes de FVII en donde uno o más residuos de aminoácidos han sido substituidos. El término "factor VII modificado", "FVII inactivado", o "FVIIai", pretende significar un FVIIa que tiene al menos una modificación en su centro catalítico, cuya modificación inhibe substancialmente la capacidad del FVIIa modificado para activar FX y FIX. Los términos se pueden usar de forma intercambiable. Tal modificación incluye la substitución de aminoácidos (o reemplazamiento) de uno o más residuos de la tercia catalítica Ser344, Aspl42 y Hisl93, y también incluyen modificación de los residuos de la tercia catalítica con inhibidores de la serina proteasa tal como compuestos de organofosforo, sulfanilfluoruro, péptido de halometil cetona o azapéptidos. El FFR-FVIIa, es un ejemplo de un derivado FVIIai obtenido al bloquear el centro activo de FVIIa con el inhibidor irreversible, D-fenilalanina-L-fenilalanina-L-arginina clorometil cetona (FFR cmk) . Otros derivados apropiados de FVIIai son FVIIa inactivado obtenido u obtenible al bloquear el centro activo con L-fenilalanina-L-fenilalanina-L-arginina clorometil cetona, dansil-L-fenilalanina-L-fenilalanina-L-arginina clorometil cetona, o dansil-D-fenilalanina-L-fenilalanina-L-arginina clorometil cetona. Se prefiere el FFR-FVIIa (FVIIa inactivado por FFR cmk) . El término "proteína cinasa" pretende indicar una enzima que es capaz de fosforilar a la serina y/o treonina y/o tirosina en péptidos y/o proteínas. El término "candidato a medicamento" pretende indicar cualquier mezcla, que tiene una función biológica o ejerce un efecto biológico en un sistema celular. La muestra puede ser una muestra de · un material biológico tal como un extracto de plantas o microbiano, o puede ser una muestra que contiene un compuesto o mezclas de compuestos preparados por síntesis orgánicas o técnicas genéticas . El término "agonista TF" comprende compuestos que inducen a) la transducción de señal por enlace directo al TF (por e emplo FVIIa) , b) estimulación de la cascada MAPK, c) eliminación de la inhibición MAPK (por ejemplo inhibidores de la PTPasa) , cuyos agonistas son candidatos a medicamentos como se define arriba. El término "antagonista TF" comprende a) reactivos que compiten con FVIIa para el enlace a TF sin transmisión, por ejemplo FVIIai, b) reactivos que se enlazan a FVIIa y evitan el enlace a TF, por ejemplo hidroxamato de Zn, c) reactivos que inhiben la transducción de señal al interferir con los miembros de la cascada MAPK, d) reactivos que se enlazan a FVIIa/TF y evitan la transmisión, e) reactivos que se enlazan a FVIIa/TF/FX y evitan la transmisión, f) reactivos que bloquean la activación del factor X humano catalizado por el complejo de factor de tejido humano/factor Vlla, cuyos antagonistas son candidatos a medicamento como se define arriba. El término "objetivos farmacológicos" se pretende para indicar una proteina que puede alterar la migración de las células que expresan TF. El término "gen reportero" se pretende para indicar un constructo de ADN que cuando se transcribe, produce una proteina que se puede detectar.

El término "elemento promotor" de SRE" significa una secuencia de ADN que enlaza los factores de transcripción inducidos por componentes presentes en el suero. El término "célula que expresa TF" significa cualquier célula mamifera que expresa TF. El término "fosforilación de proteínas" pretende indicar la fosforilación de la serina y/o treonina y/o tirosina en péptidos y/o proteínas. La modulación o regulación de la migración celular, se define como la capacidad del FVIIa u otro agonista TF, o FVIIai u otro antagonista TF para 1) aumentar o disminuir sobre la marcha, la migración celular, normal o anormal, 2) iniciar la migración normal de la célula, y 3) iniciar la migración anormal de la célula. La modulación o regulación de la expresión de genes, se define como la capacidad de FVIIa u otro agonista TF, o FVIIai u otro antagonista TF para 1) aumentar o disminuir sobre la marcha, la migración celular, normal o anormal, 2) iniciar la migración normal de la célula, y 3) iniciar la migración anormal de la célula. En este contexto, el término "tratamiento" significa que incluye la prevención de una condición adversa y la regulación de una condición que ya se presenta, con el propósito de inhibir o minimizar la condición. La administración profiláctica de FVIIa u otro agonista TF, o de FVIIai u otro antagonista TF, se incluye entonces en el término "tratamiento". En este contexto, el término "una unidad" se define como la cantidad de factor VII presente en 1 mi de plasma normal, que corresponde a alrededor de 0.5 de proteina. Después de la activación de 50 unidades, corresponde a alrededor de 1 µg de proteina. En este contexto, el término "paciente" se define como cualquier animal, en particular mamíferos, tales como os humanos. El término "sujeto" se usa intercambiablemente con "paciente". Abreviaturas TF factor de tejido FVII factor VII en su forma de cadena simple FVIIa factor VII en su forma activada RFVIIa factor recombinante VII en su forma activada FVIIai factor modificado VII (inactivado) FFR-FVIIai factor VII inactivado por la reacción D-Phe-L-Arg clorometil cetona El factor de tejido (TF) es el receptor celular para el factor FVIIa (FVIIa) y el complejo es el iniciador principal de la coagulación sanguínea. Se han estudiado los efectos del enlace del FVIIa al TF en la migración celular y la transducción de señales de los fibroblastos humanos que expresan altas cantidades de TF. Los fibroblastos incubados con FVIIa migran hacia un gradiente de concentración de PDGF-BB alrededor de 100 veces una concentración menor, que los fibroblastos no ligados con el FVIIa. Los anticuerpos anti-TF inhiben el incremento en la quimiotaxis inducida por FVIIa/TF. Además, una supresión pronunciada de la quimiotaxis inducida por PDGF-BB, se observa con el FVIIa inhibido en el sitio activo (FFR-RVIIa) . Se excluye la posibilidad de que la hiperquimiotaxis se induzca por una generación supuesta de FXa y la actividad de la trombina. El FVIIa induce la producción de inositol 1,4,5-trisfosfato al mismo grado que el PDGF-BB; los efectos de FVIIa y PDGF-BB fueron aditivos. El FFR-VIIa no induce ninguna liberación del inositol 1, 4, 5-trisfosfato . La respuesta a la migración celular para el PDGF-BB y el FVIIa se bloquea totalmente por un inhibidor PLC, sugiriendo que la activación de PLC es importante para la respuesta. Asi, el enlace de FVIIa a TF puede ser independiente de la coagulación, modular las respuestas celulares tales como la quimiotaxis, y es necesaria la actividad catalítica del FVIIa. El TF se cree que ejerce una función en la metástasis de células de tumor, pero no se conoce todavía el mecanismo. Sin embargo, Ott y colaboradores identificaron muy recientemente la proteina 280 de enlace a la actina (ABP-280) como un ligando para el dominio citoplásmico del TF, suministrando una trayectoria molecular por la cual el TF puede apoyar la metástasis de células de tumor. Las señales moleculares y las señales biológicas transducidas por FVIIa/TF, sin embargo, son todavía pobremente entendidas. Los fibroblastos humanos tienen una expresión constitutiva de TF. Estas células también expresan receptores para el factor de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) . El PDGF induce en su mitogenicidad de células objetivo, la reorganización de actina y la migración dirigida de células (quimiotaxis) . Se ha demostrado previamente que el PDGF-BB es un factor quimiotáctico eficiente para los fibroblastos humanos y que la respuesta quimiotáctica está mediada por la clase de ß-receptor. Por lo tanto, estas células se escogieron para estudiar la transducción de señal supuesta y la migración celular inducida por el enlace de FVIIa a TF. Abajo se demuestra por primera vez, una conexión clara entre la señalización inducida por el enlace de FVIIa al TF y la respuesta celular a un factor de crecimiento. Se presentan datos de que en los fibroblastos humanos, el complejo FVIIa/TF conduce a una respuesta hiperquimiotáctica para PDGF-BB. Además, el FVIIa inhibido en el sitio activo (FFR-FVIIa) en una forma dependiente de la dosis, suprime la migración directa hacia PDGF-BB. Mediante el uso de inhibidores específicos para PLC y la fosfatidilinositol 3' cinasa ( P13' -cinasa) también se demuestra que la respuesta hiperquimiotáctica hacia el PDGF-BB inducida por la señalización de FVIIa/TF, depende de la actividad de la fosfolipasa C (PLC) pero es independiente de la P13'-cinasa.- El FVIIa y el PDGF-BB inducen la producción de inositol-1, 4, 5-trisfosfato (IP3), uno de los segundos mensajeros liberados después de la activación de PLC de una forma aditiva. El TF se expresa constitutivamente en la membrana del plasma de muchas células extravasculares, tales como los fibroblastos estromales en la adventicia vascular y en las cápsulas fibrosas del hígado, vaso y riñon. Así, la expresión de TF se encuentra en sitios físicamente separados de la sangre en circulación y suministra una cubierta hemostática. Al- dañar esta barrera, se piensa que se protege el organismo contra el sangrado. El TF puede sin embargo, inducirse en monocitos/macrófagos, células del músculo liso vasculares, células endoteliales y en diversas células de tumor por una diversidad de agentes, incluyendo citosinas y factores de crecimiento. La inducción en el nivel transcripcional sucede rápidamente después de la estimulación, identificando el TF como un gen temprano inmediato relacionado con el crecimiento. En este estudio, se ha investigado el rol del TF como un receptor de señalización. Se muestra que los fibroblastos humanos con una expresión constitutiva de TF sobre el enlace del ligando de FVIIa, migran hacia concentraciones extremadamente bajas de PDGF-BB. El TF/FVIIa solamente, no induce la migración espontánea enriquecida, estos es migración al azar. Asi, fue necesaria una combinación de transducción de señal intracelular por el FVIIa/TF y el PDGF-BB del factor de crecimiento para lograr la respuesta de la motilidad. No solamente el enlace al TF, sino también la actividad catalítica del TF-FVIIa fueron obligatorias ya que el FVIIa inhibido en el sitio activo no obtuvo una respuesta enriquecida a la migración. Además, los anticuerpos monoclonales inhibitorios, evitaron el enriquecimiento de la respuesta quimiotáctica por el FVIIa. También se excluyó el que la señalización indirecta sucediera debido a un FXa o trombina, ya que el TAP y la hirudina no tuvieron efecto en la quimiotaxis inducida por el FVIIa/TF. Se encontró en su lugar que las concentraciones crecientes de FFR-FVIIa inhibieron activamente la quimiotaxis inducida por PDGF-BB. Los fibroblastos incubados con FFR-FVIIa mostraron una migración aleatoria completamente normal. El efecto inhibitorio del FFR-FVIIa en la quimiotaxis inducida por PDGF-BB no se observó en la presencia de la combinación de anticuerpos anti-TF con lo cual se descarta la posibilidad de que el FFR-VIIa sea tóxico. Los resultados además sugieren, que en las células que expresan los ß-receptores PDGF y el TF, el complejo FVIIa/TF es de importancia para la respuesta quimiotáctica al PDGF-BB. El hallazgo de que el FVIIa incrementa la producción de IP3, y los datos previamente reportados sobre las oscilaciones del Ca2+ inducido por el FVIIa/TF especialmente en células MDCK, apoyan fuertemente la noción de que el PLC se activa por una señalización de FVIIa/TF en diversas células. Además, la respuesta hiperquimiotáctica en los fibroblastos humanos para el PDGF-BB inducida por FVIIa/TF, se bloquea en una forma dependiente de la dosis por un inhibidor PLC. Se ha encontrado previamente una respuesta hiperquimiotáctica similar al PDGF-BB en células mutantes Y934F del ß-receptor de PDGF, que mostraron una fosforilación creciente y una activación del PLC-??. En estas células, la fosforilación creciente del PLC-?? se correlaciona con una producción de IP3 de umbral superior comparada con las células de expresión de PDGF ß de tipo silvestre. La combinación de FVIIa/TF y PDGF-BB, indujo un incremento de alrededor de 2 veces la producción de IP3 en los fibroblastos humanos. La producción de IP3 inducida por FVIIa/TF sin embargo, no se correlaciona con la fosforilación de PLC-??. La fosforilación de tirosina de PLC-y2 inducida por FVIIa/TF no se puede excluir, pero parece improbable ya que la expresión de PLC-y2 es muy baja en los fibroblastos humanos. Además, la parte intracelular de TF no esta dotada con una actividad de la proteina intrínseca tirosina cinasa. Estos resultados sugieren que el FVIIa/TF induce la activación de las isozimas ß y/o d PLC. En el .ensayo para la liberación de IP3, el medio de cultivo celular se complementó con FBS al 0.1% que contenía solamente alrededor de 0.1 nM de FXa. Se encontró que una concentración de más de 20 nM de FXa es necesaria para inducir la producción de IP3. El mecanismo por el cual las isozimas ß o d de PLC se activan permanece por ser definido. Se cree que la activación involucra la cooperación entre el TF y una proteína asociada a la membrana. Posteriormente, se identificó la conexión del TF con el citoesqueleto . Se demostró una interacción molecular entre el dominio citoplásmico de TF y la proteína ABP 280 de enlace al filamento de actina. Además, se encontró que el TF estaba en contacto cercano con la actina y las proteínas de enlace al filamento de actina, tal como la a-actina y la ABP280 en las áreas de membrana rizadas y en la lamelipodia en células epiteliales distribuidas. La ABP280, un miembro de la subfamilia de la filamina, se requiere para la función normal de la lamelipodia y por lo tanto es altamente importante para la motilidad celular. La P13' cinasa y las isozimas de PLC están implicadas en la respuesta quimiotáctica tal como la movilización de proteínas de enlace de actina. En estudios previos, se observa que la trayectoria de la P13' cinasa en el ß receptor de PDGF de quimiotaxis inducida, parece menos importante en células con sobreexpres-ión y actividad enriquecida de PLC-??. Esto fue también el caso de las células con FVIIa enlazado a TF. Esto indica que la magnitud de la activación de la P13' cinasa y las isozimas de PLC, determinarán cuales de estas trayectorias dominarán. Tomados en conjunto, estos datos muestran que la migración celular es una función morfogénica importante inducida por la señalización de FVÍIa/TF. La quimiotaxis juega un rol pivotal en la cicatrización de heridas, angiogénesis y metástasis. La quimiotaxis es también un componente importante en el desarrollo de placas ateroescleróticas . En estos procesos, diversas células expresan el TF así como el PDGF y los receptores de PDGF. La restenosis es una complicación importante que sigue al procedimiento de intervención de arterias obstruidas. El PDGF ha estado implicado en la respuesta de las paredes de los vasos (formación neointima) para la lesión mecánica, al mediar la migración y la proliferación de células de músculo liso y fibroblastos'. Se ha demostrado ahora, por primera vez que el enlace del FVIIa a células que expresan TF tiene una respuesta quimiotáctica creciente al PDGF que es independiente de la coagulación. En la actualidad, no se conoce mucho acerca de las trayectorias de señalización que están inducidas por el Vlla proteoliticamente activo y la manera en que las señales generadas por Vlla pueden contribuir a los procesos celulares. Una posibilidad es que el FVIIa pueda inducir la expresión de reguladores del crecimiento que actúan en la dirección descendente para inducir procesos celulares. Para investigar esta posibilidad en el estudio actual, se han examinado cambios en el programa transcripcional en fibroblastos humanos en respuesta a la exposición al FVIIa usando una microconfiguración de cADN que contiene más de 8,000 genes humanos individuales. Se escogieron fibroblastos ya que estas células encuentran normalmente suero, que contiene factores de crecimiento y factores de coagulación activados, en el contexto de una lesión vascular debida a condiciones físicas (por ejemplo cirugía) y patofisiológicas . El programa temporal de expresión de genes observado en respuesta al suero, • sugiere que los fibroblastos se programan para interpretar la exposición abrupta al suero, no como un estímulo mitogénico general, sino como una señal fisiológica específica. La caracterización de la activación transcripcional en respuesta al suero y a los factores de crecimiento, también sugiere que los fibroblastos están en una participación activa en una conversación entre las células diferentes que colectivamente controlan la inflamación, angiogénesis y la cicatrización de heridas. El análisis de la microconfiguración de cADN con mARN aislados de fibroblastos expuestos al Vlla durante 90 minutos, muestra la sobre regulación del Cyr61. El análisis de manchado Northern confirma la expresión inducida por el Vlla del Cyr61 en fibroblastos. Aunque no está tan robusto como en los fibroblastos, el Vlla también incrementa la expresión de Cyr61 en células vasculares del músculo liso. La inducción de la expresión de Cyr61 depende de la actividad catalítica del FVIIa ya que el FVIIai falla al inducir la expresión de Cyr61. Aunque el factor Xa y la trombina pueden también inducir la expresión de Cyr61 (no se muestran los datos) , estos compuestos no están involucrados en la expresión inducida por FVIIa del Cyr61. No se encuentra evidencia para la generación de rastros del factor Xa y la trombina en el sistema experimental. Además, el inhibidor especifico del factor Xa y la trombina no tuvieron efectos importantes en la expresión inducida por FVIIa del Cyr61. El Cyr61 es un gen inmediato temprano que tiene una actividad transcripcional por los factores de crecimiento del suero en los fibroblastos. Codifica una proteina secretada de enlace a la heparina y rica en cisteina, de 40 kDa, que se asocia con la matriz extracelular y las superficies celulares. El CyrSl es un miembro de una familia de genes emergente de proteínas conservadas y modulares, caracterizado por la presencia de una señal secretora en la terminal N, seguido por cuatro dominios estructurales modulares y 38 residuos de cisteina que se conservan principalmente entre los miembros de la familia. La familia de proteínas consiste ahora de seis miembros diferentes, incluyendo el factor de crecimiento de tejido conectivo de Cyr61 (CTGF) y la proto-oncoproteína de aves, Nov (nombrada así como familia CCN) (la familia CCN se describe además en Lau et al., Exp. Cell Res 248: 44-57, 1999). La proteína Cyr61 demuestra que (i) promueve la colocación y distribución de células endoteliales en una forma similar a aquella de la fibronectina, (ii) incrementa los efectos del bFGF y PDGF en la velocidad de la síntesis de ADN de fibroblastos y células vasculares endoteliales, (iii) promueve la migración celular en los fibroblastos y las células endoteliales. .Los estudios recientes demuestran que el Cyr61 actúa como un ligando para la integrina a?ß3, un receptor de adhesión conocido por involucrarse en la señalización, que regula diversos procesos celulares incluyendo l angiogénesis y la metástasis de tumor. La proteína purificada Cyr61 se demuestra que estimula la migración dirigida de la célula endotelial microvascular humana en un cultivo, a través de una trayectoria dependiente, de ??ß3 e induce la neovascularización en córneas de rata. Además, la expresión de Cyr61 en células de tumor, promueve el crecimiento del tumor y la vascularización. Con base en los datos actuales que demuestran que el FVIIa induce la expresión' de Cyr61 en fibroblastos, se cree que el Cyr61 inducido por FVIIa es responsable de actuar a través de la integrina ??ß3, para la migración de células mediada por el FVIIa y la metástasis de tumor. Así, el CyrSl se une a una señal proteolítica de FVIIa-TF a la trayectoria de señalización de la integrina. Las observaciones de que la actividad catalítica de Vlla se requiere para la ¦ migración de células de músculo liso y células de tumor, y la metástasis de tumor, es consistente con la otra observación de que la actividad catalítica de FVIIa se requiere para la inducción de Cyr61. Además del Cyr61, el VIla puede también inducir otros reguladores que pueden mediar las respuestas biológicas inducidas por FVIIa. El enlace del FVIIa al TF de la superficie celular en células de cáncer pancreático, demuestra que sobre expresa selectivamente el gen uPAR. Previamente se ha demostrado, usando una técnica de despliegue diferencial, sobre regulación y trascripción del gen de la poli (A) polimerasa en fibroblastos expuestos al FVIIa. Aunque habría sido interesante determinar si la microconfiguración de cADN también mostraba una expresión diferencial de PAP, el filtro no contenía el cADN del PAP. Además del Cyr61, esta microconfiguración de cADN también muestra la expresión diferencial de otros cuatro genes (ver resultado) , pero la .relación de la expresión diferencial estaba muy cercana a la importancia de la línea límite. Ya que los experimentos preliminares no pueden confirmar la expresión diferencial por análisis de manchado Nortern y también la ausencia de algunos datos relevantes que sugieren la capacidad de estos productos de genes para mediar las respuestas biológicas inducidas por FVIIa, no se analizó adicionalmente su expresión. Sin embargo, ya que el CTGF es una molécula estructuralmente relacionada con el Cyr61, y se obtienen las mismas respuestas biológicas que con el CyzSl, se ha examinado la expresión del CTGF aunque la relación relativa de la expresión de. CTGF en una muestra tratada con FVIIa contra la muestra de control en la microconfiguración de cADN es de 1.8 (2 es un estimado conservador para ser una magnitud real en el ensayo) . Los datos revelaron que el FVIIa también induce la expresión de CTGF y la cinética de la expresión inducida por Vlla de CTGF fue similar a aquella del Cyr61. Aunque el CTGF se comporta muy similar al Cyr61, existen diferencias sutiles entre ellos. Por ejemplo, (a) el CTGF ha demostrado ser mitogénico en si mismo mientras que el Cyr61 no tiene una actividad mitogénica intrínseca, pero aumenta la síntesis de ADN inducida por el factor de crecimiento (b) el Cyr61 estimula la quimiotaxis mientras que el CTGF estimula tanto la quimiotaxis como la quimiocinesis (c) aunque el Cyr61 y el CTGF son moléculas de señalización asociadas con ECM, el CTGF demuestra secretarse dentro del medio de cultivo. Así, es posible que el FVIIa regule las funciones celulares localmente por medio del Cyr61 mientras que actúa a distancia a partir de su sitio a través de la secreción de CTGF. El régimen para cualquier paciente a ser tratado con FVIIa u otro agonista del TF o FVIIai u otro antagonista del TF como se menciona aquí, se debe determinar por alguien con habilidad en el arte. La dosis diaria a ser administrada en la terapia se puede determinar por un médico y dependerá del compuesto particular empleado, la vía de administración y el peso y condición del paciente. Una cantidad efectiva está apropiadamente en una dosis diaria desde alrededor de 5 µg kg dia hasta alrededor de 500 µg/kg/dia, preferiblemente desde alrededor de 10 µg/kg/dia hasta 300 µg/kg/dia, más preferiblemente desde alrededor de 15 µg/kg dia hasta 200 µg/kg/dia, y mucho más preferiblemente alrededor de 20 µg/kg/dia hasta 100 µg kg dia . El FVIIa u otro agonista TF o el FVIIai u otro antagonista TF se deben administrar en una dosis simple, pero también se pueden dar en dosis múltiples preferiblemente con intervalos de 4-6-12 horas dependiendo de la dosis dada y la condición del paciente. El FVIIa u otro agonista de TF o el FVIIai u otro antagonista de TF se pueden administrar intravenosamente o se pueden administrar por infusión de pulsos o continua o se pueden administrar directamente al sitio relevante tal como por ejemplo, inyectarse directamente dentro de un tumor. El FVIIa u otro agonista TF, o el FVIIai u otro antagonista TF, se administran preferiblemente por inyecciones intravenosas, y en una cantidad de alrededor de 100-100,000 unidades por kilogramo de peso corporal, y preferiblemente en una cantidad de alrededor de 250-25,000 unidades por kilogramo de peso corporal que corresponde alrededor de 5-500 µg kg, una dosis que puede tener que repetirse 2-4 veces durante 24 horas. Las técnicas convencionales para la preparación de composiciones farmacéuticas, que se pueden usar de conformidad con la presente invención, están descritas por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. Las composiciones usadas de conformidad con esta invención se preparan por métodos conocidos per se por el técnico habilitado. En resumen, las preparaciones farmacéuticas apropiadas para su uso de conformidad con la presente invención, se preparan al mezclar FVII, FVIIa u otro agonista de TF o FVIIai u otro antagonista de TF, preferiblemente en forma purificada, con adyuvantes apropiados y un portador o diluyente apropiado. Los portadores o diluyentes apropiados fisiológicamente aceptables incluyen agua estéril y solución salina. Los adyuvantes apropiados a este respecto, incluyen calcio, proteínas (por ejemplo albúminas) , u otros péptidos inertes (por ejemplo, glicilglicina) o aminoácidos (por ejemplo glicina o histidina) para estabilizar el factor purificado Vlla. Otros adyuvantes fisiológicamente aceptables son los azúcares no reductores, polialcoholes (por ejemplo sorbitol, manitol o glicerol), polisacáridos tales como dextrinas de bajo peso molecular, detergentes (por ejemplo polisorbato) y antioxidantes (por ejemplo bisulfito y ascorbato) . Los adyuvantes están presentes generalmente en una concentración desde 0.001 hasta 4% peso/volumen. La preparación farmacéutica puede también contener inhibidores de proteasa, por ejemplo apronitina y agentes conservadores. Las preparaciones se pueden esterilizar mediante por ejemplo, filtración a través de un filtro que retiene bacterias, al incorporar agentes de esterilización dentro de las composiciones, al irradiar las composiciones o al calentar las composiciones. También se pueden fabricar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro medio estéril apropiado para inyección antes de o inmediatamente antes de su uso. En diferentes aspectos la presente invención se refiere ' a : Un método para regular la expresión de al menos un gen en una célula que comprende las etapas de a) poner en contacto la célula con el factor VII (a) o un antagonista del factor de tejido b) determinar la expresión del gen en las células. El método anterior en donde la célula es una célula vascular humana que expresa el factor de tejido, incluyendo fibroblastos y células de músculo liso. El método, en donde el gen se selecciona del grupo que consiste de Cyr61, CTFG, receptor de dopamina D2, EST Incyte PD 395116 o el receptor del nucleótido P2U. El método en donde el antagonista del factor de tejido es un factor Vlla modificado conocido como factor Vllai. Un método en donde la expresión del gen se aumenta.

Un método en donde la expresión del gen se inhibe o minimiza . Un método para enriquecer la expresión del gen, que comprende hacer contacto de la célula con el factor Vlla. Un método para inhibir la expresión del gen que comprende hacer contactó de la célula con el factor VII modificado conocido como FVIIai. El método en donde el gen es EST PD674714. Un método para la regulación de la migración celular, que comprende las etapas de: a) hacer contacto de la célula con el factor Vlla o un antagonista del factor de tejido; b) determinar la migración de la célula. El método, en donde la célula es una célula humana que expresa el factor de tejido, incluyendo fibroblastos, células del músculo liso, células de tumor, células hematopoyéticas y células epiteliales. El método en donde el antagonista del factor de tejido es un factor Vlla modificado conocido como factor Vllai. El método en donde el factor modificado VII se selecciona del Dansil-Phe-Pro-Arg clorometil cetona, Dansil-Glu-Gly-Arg clorometil cetona, Dansil-Phe-Phe-Arg clorometil cetona y Phe-Phe-Arg clorometil cetona. El método para enriquecer la migración celular, que comprende hacer contacto de la célula con FVIIa o un agonista del factor de tejido. Un método para reducir o inhibir la migración celular, que comprende hacer contacto de la célula con un antagonista del factor de tejido. Un método para inducir o enriquecer la cicatrización de heridas en el paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende el factor Vlla o un agonista del factor de tejido.

Un método para inhibir la invasión de células de tumor que comprende hacer contacto de la célula con una cantidad efectiva de un antagonista del factor de tejido.

Un método para inhibir la migración celular, invasión, proliferación celular inducida por la migración o angiogénesis , en un paciente que tiene una enfermedad o condición asociada con la migración indeseable de células, invasión, proliferación o angiogénesis de células inducidas por la migración, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del factor de tejido. El método, en donde la enfermedad o condición es principalmente crecimiento de tumores, invasión de tumores o metástasis. El método, en. donde el antagonista del factor de tejido es un factor VII modificado conocido como FVIIai.

El uso del factor Vlla o un antagonista del factor de tejido, para la fabricación de un medicamento para regular la migración celular. El uso, en donde el factor Vlla se usa para la fabricación de un medicamento para enriquecer la migración celular.

El uso, en donde se usa un antagonista del factor de tejido para la fabricación de un medicamento para reducir o inhibir la migración celular. El método, en donde el antagonista del factor de tejido es un factor Vlla modificado conocido como factor Vllai. El uso, en donde el factor VII modificado se selecciona de Dansil-Phe-Pro-Arg clorometil cetona, Dansil-Glu-Gly-Arg clorometil cetona, Dansil-Phe-Phe-Arg clorometil cetona y Phe-Phe-Arg clorometil cetona. La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos que sin embargo, no se constituyen como limitativos del alcance de la protección. Las características descritas en la descripción anterior y en los siguientes ejemplos pueden, separadamente y en cualquier combinación de las mismas, ser material para liberar la invención en diversas formas de la misma. EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de FVII El factor Vlla purificado humano apropiado para su uso en la presente invención, se hace preferiblemente por tecnología recombinante de ADN, por ejemplo, como se describe por Hagen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 83: 2412-2416, 1986, o como se describe en la patente europea No. 200.421 (ZymoGenetics) . El factor Vlla producido por tecnología recombinante, puede ser un auténtico factor Vlla o un factor Vlla más o menos modificado, con la condición de que tal factor Vlla tenga substancialmente la misma actividad biológica para la coagulación sanguínea que el factor Vlla auténtico. Tal factor modificado Vlla, se puede producir al modificar la secuencia de ácido nucleico que codifica el factor VII, ya sea alterando los codones de aminoácidos o al separar algunos de los codones de aminoácidos en el ácido nucleico que codifica el FVII natural por medios conocidos, por ejemplo, mutagénesis específica del sitio.

El factor VII puede también producirse por los métodos descritos por Broze y Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 y Hedner y Kisiel, J. Clin . Invest . 71: 1836-1841, 1983. Estos métodos resultan en un factor VII sin cantidades detectables de otros factores de coagulación sanguínea. Una preparación de factor VII todavía más purificada, se puede obtener al incluir una filtración adicional de gel como en la etapa de purificación final. El factor VII se convierte después dentro del FVIIa activado por medios conocidos, por ejemplo, por diversas proteínas de plasma diferentes, tales como el factor Xlla, IXa ó Xa. Alternativamente, como se describe por Bjoern et al., (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), el factor VII se puede activar al pasar a través de una columna de cromatografía de intercambio de iones tal como la Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) o similares. Ejemplo 2 Preparación de FVIIai El factor VII modificado, apropiado para su uso en la presente invención se hace por ejemplo, como se describe en las publicaciones internacionales números 92/15686, 94/27631, 96/12800 y 97/47651 ZymoGenetics/Novo Nordisk) . Ejemplo 3 Efectos del FVIIa y el FFR-FVIIa en la respuesta quimiotáctica de fibroblastos al PDGF-BB . Los fibroblastos que expresan el TF (Fig. 1A y Fig.

IB) se incubaron con 100 nM de FVIIa y se sembraron en la parte superior de una cámara Boyden modificada, mientras que los medios que contenían FBS al 10% y PDGF-BB en concentraciones diferentes, se agregaron debajo del filtro de microporo de 150 µp?. La migración de las células bajo condiciones en donde se agregó el medio que contiene FBS al 10% sin PDGF-BB debajo del filtro, se usó como una medida de la migración aleatoria, y se calcula como una migración al 100%. Se registró una respuesta importante a la migración a una concentración de 0.01 ng/ml de PDGF-BB, en células estimuladas por FVIIa en comparación con 1 ng/ml de PDGF-BB para células no ligadas con FVIIa, esto es, una diferencia de 100 veces en la concentración (Fig. 2A) . A 0.01-0.1 ng/ml de PDGF-BB, la respuesta a la migración para el FVIIa incrementa la dosis dependientemente, comenzando a 25 nM y con un efecto máximo a 50-100 nM FVIIa (Fig. 3A-D) . No se observa ningún enriquecimiento de la migración aleatoria después de la activación con el FVIIa. Para probar si el FVIIa proteoliticamente activo obligaba a una respuesta hiperquimiotáctica para el PDGF-BB, se incubaron también fibroblastos con 100 nM de FFR-FVIIa y se ensayaron en la cámara Boyden en la misma manera (Fig.2A). No se observó ninguna quimiotaxis creciente con el FFR-FVIIa a concentraciones bajas de PDGF-BB, 0.01-1 ng/ml. En contraste, una supresión pronunciada de la quimiotaxis inducida por 10-50 ng/ml PDGF-BB, se alcanzó por 100 nM FFR-FVIIa (Fig.2A y 3A-D) . Cuando se preincubaron los fibroblastos con una mezcla de tres anticuerpos diferentes de TF y después con FVIIa o FFR-FVIIa, la respuesta a la migración para el PDGF-BB fue idéntica a la respuesta de los fibroblastos sin la presencia del ligando enlazado a TF (Fig.4A). Un anticuerpo monoclonal irrelevante IgG, no previno la hiperquimiotaxis inducida por FVIIa ni tampoco la inhibición de la respuesta a la migración inducida por FFR-VIIa (no se muestran los datos). La presencia de ¦ los anticuerpos IgG o de los tres anticuerpos TF, no cambió la migración aleatoria de los fibroblastos (no se muestran los datos) . Ejemplo 4 La respuesta hiperquimiotactica no está mediada por FXa o por trombina. Ya que la transducción de señal inducida por FVIIa que conduce a la respuesta hiperquimiotáctica para el PDGF-BB, dependía de la actividad catalítica de FVIIa, era importante determinar si la señalización sucedía directamente o por medio de FXa o trombina generada por el complejo FVIIa/TF. La respuesta a la migración enriquecida transducida por FVIIa/TF no se bloqueó por 0.2-10 . µ? de péptido anticoagulante de la garrapata (TAP) , que bloquea específicamente el sitio activo de FXa y evita una activación adicional de la cascada de coagulación que conduce a la formación de trombina (Fig. 5A, 5B) . Ninguna adición de 5 U/ml hirudina, un inhibidor específico de la trombina, tuvo algún efecto en la hiperquimiotaxis inducida por FVIIa/TF (Fig.6A). El TAP y la hirudina no tuvieron influencia en la migración del fibroblasto en respuesta al PDGF sin la presencia del ligando FVIIa (Fig. 5A, 5B, 6A) . Así, es improbable que el efecto del FVIIa en la quimiotaxis, esté mediado por medio de la activación de FX de la trombina. Ejemplo 5 La respuesta hiperquimiotáctica a PDGF-BB, está influenciada por trayectorias dependientes de PLC pero independientes de la P13' cinasa. La activación de la P13' cinasa, ha sido demostrada recientemente por ser importante para la quimiotaxis inducida ' por el ß-receptor de PDGF. Por lo tanto, se investigó si el LY294002, un inhibidor especifico de la P13' -cinasa, fue capaz de bloquear la respuesta quimiotáctica inducida por la señalización de FVIIa/TF. Se pretrataron fibroblastos con LY294002 a concentraciones indicadas durante 30 minutos a 3 °C antes de la adición de FVIIa 100 nM, y se ensayaron en la cámara Boyden como se describe. La concentración de PDGF-BB se mantuvo constante a 0.1 ng/ml a través del ensayo, esto es, una concentración muy baja a la cual el FVIIa/TF indujo una respuesta quimiotáctica importante. El LY294002 estaba presente durante los experimentos completos. La figura 7A muestra que la respuesta a la migración para el PDGF-BB mediada por la señalización de FVIIa/TF, no se afectaba por la inhibición de la P13'-cinasa.

Para investigar si la respuesta quimiotáctica inducida por FVIIa/TF involucra la activación de la fosfolipasa C especifica del fosfatidil inositol (PLC), se preincubaron los fibroblastos con concentraciones diferentes de U731122, un inhibidor especifico de PLC durante 30 minutos a 37°C, antes de agregar FVIIa 100 nM; las células se sometieron después a un- ensayo con quimiotaxis en presencia del inhibidor. Un análogo cercano, U73343, sin efectos en el PLC se usó como un control negativo. La concentración de PDGF-BB se mantuvo constante a 0.1 ng/ml, también en estos experimentos. El pretratamiento de las células con el U73122 inhibidor del PLC activo, inhibió la respuesta quimiotáctica hasta 0.1 ng/ml de PDGF-BB, en una forma dependiente de la dosis, con una inhibición total a 1 µ? (Fig. 8A y 8B) . No se observo ningún efecto en la quimiotaxis cuando se usó el análogo inactivo U73343. Ejemplo 6 El FVIIa/TF induce la activación de PLC. Para explorar además la importancia de la actividad PLC para la respuesta hiperquimiotáctica, se analizaron también los efectos directos del FVIIa/TF sobre la actividad PLC en fibroblastos. La activación de PLC conduce a la producción de dos mensajeros segundos, inositol 1, 4, 5-trisfosfato (IP3) y diacilglicerol . Se incubaron los fibroblastos con mió [3H] inositol durante la noche, y después con 100 nM de FVIIa o FFR-FVIIa durante 60 minutos, seguido por incubación con o sin PDGF-BB a las concentraciones indicadas. El tratamiento con FVIIa 100 nM solamente durante 60 minutos, indujo la liberación de IP3 en fibroblastos al mismo nivel que los 10 ng/ml y 100 ng/ml de PDGF-BB solamente (figura 9) . Además, la combinación del FVIIa 100 nM y 10 ng/ml o 100 ng/ml de PDGF-BB, doblaron la liberación de IP3. El FVIIa inhibido en el sitio activo, no indujo la liberación de IP3. Estos resultados muestran claramente que el PLC se activa con el enlace del FVIIa al TF. Ejemplo 7 Fosforilación de PLC-?? no se enriquece por la señalización de TF/FVIIa en fibroblastos. Con objeto de determinar si la isoforma PLC-??, que se activa por ciertos receptores de la tirosina cinasa, era responsable de la actividad creciente de PLC inducida por FVIIa/TF, se estudió la fosforilación de tirosina del PLC-??. Se incubaron los fibroblastos en ausencia o presencia de FVIIa o FFR-FVIIa 100 nM durante 1 hora, seguida por la estimulación con 0, 2, 10 o 100 ng/ml de PDGF-BB. Después de 5 minutos de incubación, se lisaron las células y se inmunoprecipitó el PLC-??, separado por SDS-PAGE y se inmunocoaguló con anticuerpos de antifosfotirosina . Mientras se registró un incremento importante en la fosforilación de tirosina del PLC-?? con concentraciones crecientes de PDGF-BB, la adición del FVIIa solamente a los fibroblastos, no indujo ninguna fosforilación de tirosina del PLC-?? (Fig.10). Además, la combinación de FVIIa y PDGF-BB a concentraciones diferentes, no indujo ninguna fosforilación adicional en comparación con la estimulación con PDGF-BB solamente (figura 10) . El FFR-FVIIa no tuvo efecto en la fosforilación de PLC-?? tirosina (Fig.10). Asi, otras isoformas PLC diferentes al PLC-?? son responsables de la actividad creciente de PLC después de la estimulación FVIIa. Ejemplo 8 Métodos Cultivos de células. Fibroblastos de prepucio humano, AG1518 y AG1523 se hicieron crecer para confluir en un MEM de Eagle complementado con suero de bovino fetal al 10% (FBS) . Antes del uso, las células se separaron por tripsinización (2.5 mg/ml durante 10 minutos a 37°C), se lavaron en una solución salina balanceada de Hank, y se volvieron a suspender en MEM de Eagle con FBS al 10% o en un medio de Ham complementado con FBS al 0.1%.

Proteínas. El FVIIa humano (Novo Nordisk A/S, Gentofte, Denmark) se expresó y purificó como se describe. Se obtuvo FFR-FVIIa (Novo Nordisk) al bloquear el FVIIa en el sitio activo con D-Phe-L-Phe-L-Arg clorometil cetona. El péptido anticoagulante recombinante de la garrapata (TAP) se suministró amablemente por el Dr. P. Vlasuk, Corvas (San Diego, CA) . Se compró la hirudina de Sigma. Se obtuvieron el LY294002, U73122 y U73343 de Biomol (Ply-mouth Meeting, PA) . Los anticuerpos monoclonales anti-TF, TF8-5G9, TF9-5B7 y MTFH-1 (Morrissey, J.H., Fair, D.S., Edgington, T.S. Monoclonal antibody analysis of purified and cell-associated tissue factor. Thromb. Res. 52, 247-261 (1988)), fueron un obsequio amable del doctor James H. Morrissey, Oklahoma Medical Research Foundation. El anticuerpo de fosfotirosina, PY99 fue de Santa Cruz, California. Citometria de flujo. La expresión de superficie del TF se analizó por inmunofluorescencia con un citómetro de flujo (Coulter Epics XL-MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, Coulter Electronics, USA) . Se calibró el instrumento diariamente con inmuno-Check™ o perlas de calibración Flow Check™ (Coulter) . Para experimentos de inmunofluorescencia indirecta, se lavaron los fibroblastos AG1518 o AG1523 dos veces con PBS, conteniendo albúmina de suero de bovino al 0.1% (BSA) , incubado durante 30 minutos sobre hielo con anticuerpo monoclonal TF anti humano etiquetado con isotiocianato de fluoresceina (FITC) (4508CJ, American Diagnostica, Greenwich, Ct. USA) . El IgGl monoclonal de glucosa oxidasa anti-Aspergilus niger (Dakopatts) , se usó como control negativo. Se determinaron la intensidad de fluorescencia media del canal 8MFI) y el porcentaje de células positivas para cada muestra. Determinación de la actividad TF. La actividad pro-coagulante de TF se determinó como se describe por Lindmark y colaboradores (Lindmark, E . , Tenno, T., Chen, J., Siegbahn, A. IL-10 inhibits LPS-induced human monocyte tissue factor expression in whole blood. Br. J. Heametol. 102, 597-604 (1998)). Brevemente, las alícuotas que contenían 0.2 x 105 AG1518 o AG1523 de fibroblastos se lavaron dos veces con PBS, se colocaron en pozos de una microplaca de concentración de 96 pozos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) . Se midió la actividad procoagulante en un ensayo amidolítico de dos etapas en donde un substrato cromogénico, S-2222 (Chromogenix, Molndal, Suecia) , se desdobla por FXa, que a su vez se activa del FX por el complejo TF/FVIIa. Se agregó una mezcla de reacción que contenía las concentraciones finales de 0.6 mM S-2222, 2 mM 03012 y los factores de coagulación del concentrado del factor Prothromplex-T™ TIM4 (Baxter, Viena, Austria) , a una concentración final de 1 U/ml de FVII y 1.2 U/ml de FX, a los pozos, y se determinó el cambio en la absorbancia a 4.05 nm después de una incubación de 30 minutos a 37°C. Se hicieron las mediciones por triplicado. Ensayo de quimiotaxis. La respuesta a la migración de fibroblastos se ensayó por medio de la técnica de conducción frontal en una cámara modificada de Boyden como se describió previamente (Sieg-bahn, A., Hanimacher, A., estermark, B., Heldin, C-H. Differential effects of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes, and granulocytes . J. Clin. Invest. 85, 916-920 (1990) and Nister, M . , Hammacher, A., Mellstróm, K. , Siegbahn, A., Ronnstrand, L., Westermark, B., Heldin, C-H. A glioma-derived PDGF A chain homodimer has different functional activities from a PDGF AB heterodimer purified from human platelets. Cell 52, 791-799 (1998)). Se recubrieron filtros de microporo (tamaño de poro 8 µp?) con una solución de colágeno de tipo 1 a temperatura ambiente durante la noche. Los filtros se secaron por aire durante 30 minutos inmediatamente antes de su uso. Los fibroblastos de prepucio humano AG1523, se hicieron crecer a confluencia en un MEM de Eagle complementado con FBS al 10%. Se separaron las células por tratamiento con tripsina (2.5 mg/ml durante 10 minutos a 37°C) y se suspendieron en un MEM de Eagle con FBS al 10%. Se incubaron los fibroblastos durante 10 minutos con o sin FVIIa o FFR-FVIIa antes del ensayo. Se agregaron 100 microlitros de la suspensión de células (2xl05 células/ml) arriba del filtro de la cámara de Boyden. Se diluyó el PDGF-BB en medios de ensayo (MEM de Eagle con FBS al 10%) y se agregaron debajo del filtro en la cámara. Se incubaron las células durante 6 horas a 37°C en una cámara humidificada que contenia 95% de aire/5% de C02. El FVIIa o FFR-FVIIa estaba presente durante el experimento completo. Los filtros se separaron, después se fijaron en etanol, se tiñeron con Hemalun de Mayer y se montaron. Se midió la migración como la distancia de los dos núcleos de fibroblastos que mayormente migraban de un campo de alto poder (12.5x 24) en foco. La distancia de migración en cada filtro se calculó como la media de las lecturas de al menos 3 partes diferentes del filtro. Se llevaron a cabo los experimentos con 2 hasta 4 filtros separados por cada concentración de quimioatrayentes . Para cada conjunto de experimentos, la migración de los fibroblastos hacia los medios de ensayo sirvió como control . En los casos cuando los anticuerpos o inhibidores monoclonales anti-TF a los factores de coagulación, TAP e hirudina, se usaron, se preincubaron células durante 10 minutos con estos agentes, después con o sin FVIIa o FFR-FVIIa antes de que se llevara a cabo el ensayo por quimiotaxis. Los anticuerpos, TAP o hirudina, también estaban presentes durante el experimento completo de quimiotaxis. En los experimentos en donde se probaron los efectos en la respuesta a la migración de los diferentes inhibidores, LY294002, U73122 o U73343, se preincubaron las células durante 30 minutos con los inhibidores a las concentraciones indicadas, y los inhibidores estuvieron también presentes a través de los experimentos. Ensayo para la liberación de la inositol trisfosfato (IP3) . Se incubaron placas de seis pozos con cultivos semiconfluentes de fibroblastos humanos AG1518 durante la noche (aproximadamente 20 horas) con 2 µ?? de mio(3H) de inositol (Amersham) en 2 mi de F12 de Ham con FBS al 0.1%. Se cambio el medio a F12 de Ham con FBS al 0.1% (conteniendo CaCl2 2 mM) y LiCl 20 mM, y se incubaron las células durante 15 minutos a 37°C. Se incubaron después las células en ausencia o presencia de FVIIa 100 nM o FFR-FVIIa 100 nM durante 1 hora. Se agregó PDGF-BB (0, 10 o 100 ng/ml) y se continuó la incubación durante 10 minutos a 37 °C. Se llevó a cabo el ensayo de IP3 como se describió previamente por Eriksson y colaboradores (Eriksson, A., Nanberg, E . , Rónnstrand, L., Engstróm, U., Hellman, U., Rupp, E., Carpenter, G., Heldin, C-H., Claesson- elsh, L. Demonstration of functionally different interactions between phospholipase C-? and the two types of platelet-derived growth factor receptors. J. Biol.. Chem. 270, 7773-7781 (1995)).. Ensayo para la fosforilación de PLC-?? inducida por el agonista. Se pusieron en ayuno durante la noche suero de cultivo semiconfluente AG1518 (aproximadamente 20 horas) en un medio que contenia FBS al 0.1%, y se incubaron después en ausencia o presencia de FVIIa o FFR-FVIIa 100 nM durante una hora, seguido por la incubación de 0, 2, 10 ó 100 ng/ml de PDGF-BB durante 5 minutos a 37°C. Se l-isaron las células y se precipitó el PLC-??, esencialmente como se describió previamente (Hansen, K., Johnell, M., Siegbahn, A., Rorsman, C., Engstróm, U., Wernstedt, C, Heldin, C-H., Ronnstrand, L. Mutation of a Src phosphorylation sitie in the PDGF ß-receptor leads to increased PDGF-stimulated chemotaxis but decreased mitogenesis. EMBO J. 15, 5299-5313 (1996)), con el antisuero anti- PLC-?? generado al inmunizar conejos con un péptido correspondiente al término carboxi del PLC-?? de bovino (Artega, C.L., Jonson, M.D., Todderud, G., Coffey, R.J., Carpenter, G., Page, D.L. Elevated content of the tyrosine kinase substrate phospholipase C-?? in primary human breast carcinomas. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88, 10435-10439 (1991) . Se separaron las muestras por SDS-PAGE y se inmunocoagularon con el anticuerpo PY99 de fosfotirosina . Análisis estadístico. Se analizaron los datos usando la estadística TM para el paquete Windows (StatSoft, Tulsa, Okla. USA) . Una prueba t de Student para muestras dependientes se usó para determinar la importancia estadística entre los diferentes conjuntos de datos. Los valores P de <0.05 se consideraron estadísticamente importantes . Proteínas. El Vlla humano recombinante, un obsequio de Novo Nordisk (Gentofte, Dinamarca) , se reconstituyó en agua estéril a una concentración de 1 hasta 1.3 mg/ml. El lote de solución de Vlla se verificó por niveles de trazas de contaminantes de endotoxina usando el lisado del amebocito limulus (Bio Whittaker) y no se detectó ninguno (nivel de detección 30 pg) . La proteína anticoagulante recombinante de la garrapata (TAP) se suministró amablemente por George Vlasuk (Corvas, San Diego, CA) y la hirudiha recombinante se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO) o Calbiochem (San Diego, CA) . Se obtuvieron el factor Xa purificado humano y la trombina de Enzyme Research Laboratories (Southbend, IN) .

Microconfiguraciones de cADN. Se cultivaron células WI-38 hasta una confluencia del 80% y se privaron de suero durante 24 horas para entrar en un estado quiescente como se describe arriba. El medio de cultivo se substituyó con DMEM libre de suero, fresco (complementado con CaCl2 5 mM) y se dejo estabilizar durante 2 horas en un incubador de cultivo. Después, se trataron las células con Vlla recombinante purificado (5 µ?/p??) durante 90 minutos. Al final del tratamiento de 90 minutos, se aisló el ARN total de células sin tratar (control) y células tratadas con Vlla usando trizol (GIBCO BRL) . Se purificó el poli (A) de ARN por un paso doble sobre columnas de aislamiento de mARN Oligo Tex como se describe en el boletín técnico del fabricante (Qiagen) . Se enviaron ochocientos ng (800 ng) de ARN poli (A) altamente purificado de las células de control y de las tratadas con Vlla, para un servicio de análisis de microconfiguración de cADN (Human UniGE V microarray, Genome Systems Inc, St. Louis, MO) . Análisis de manchado Northern. Se preparó el ARN total usando un reactivo TRIZOL de la monocapa quiescente de células WI-38 que se expusieron a Vlla y otros materiales como se describe en los resultados. Se llevó a cabo el análisis de manchado Northern usando un procedimiento normal. Brevemente, 10 µg de ARN total se fraccionaron por tamaño por electroforesis de gel en geles de agarosa al 1%/formaldehido al 6%, y se transfirieron sobre la membrana de nitrocelulosa por un método de manchado capilar. Se prehibridizaron los manchados Northern a 42 °C con una solución que contenia 50% de formamida, .5 x SSC, 50 mM de Tris. HC1, pH 7.5, pirofosfato de sodio al 0.1%, SDS al 1%, polivinilpirrolidona al 1%, Ficol al 1%, EDTA 2-5 mM, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 µg ml y BSA al 1% y se hibridizaron con una sonda de cADN de Cyr61 etiquetada con 32P (106 cpm/ml) . Se expusieron las membranas hibridizadas a una película Dupont NEF o Fuji de rayos X RX. Para propósitos de cuantificación, las membranas se expusieron a una pantalla de fósforo durante 1 a 4 horas, y las pantallas expuestas se analizaron en un paquete Phos-phorlmager (Molecular Dynamics) usando un paquete de cómputo "Image-quant" . Para obtener los valores medios, las unidades (cuentas) obtenidas de los diferentes experimentos, se normalizaron para un control interno (cuentas presentes en la muestra tratada por control) . Ensayo cromogénico . Se cultivaron células WI-38 en una placa de cultivo de 96 pozos y se hicieron quiescentes como se describe arriba. Después de lavar las células, FVIIa (5 µg ml) en 1.00 µg de calcio que contenia solución amortiguadora, se agregaron a los pozos de cultivo que contenían células o a los pozos recubiertos con solución amortiguadora (sin células) . Después de una incubación de 30 minutos, se agregaron a los pozos 25 g de substratos cromogénicos para el factor Xa y la trombina, estos es, Cromozima X y Cromozima TH. Después de 3 horas de desarrollo del color, se leyó la placa en un lector de microplacas. Como controles, se incubaron las células en concentraciones en trazas del factor Xa (50 hasta 0.1 ng/ml) o trombina (0.1 hasta 0.002 U/ml) . No se encontraron diferencias en la absorbancia a 450 nm entre el Vlla agregado a las células, o el Vlla agregado a los pozos que no contenían células. La lectura fue menor que las lecturas obtenidas con la concentración más baja del factor Xa o la trombina, y representan la actividad cromogénica del Vlla. Ejemplo 9 Micr©configuración de cADN. Se expusieron los fibroblastos quiescentes a un medio de control libre de suero o al medio libre de suero complementado con Vlla (5 µg ml) durante 90 minutos (tres matraces T-75 por cada tratamiento) . Después del tratamiento, se cosechó el ARN total y se aisló el poli (A) ARN. Seiscientos ng de mARN se etiquetaron con fluorescencia de Cy3 o Cy5 y se hibridizaron para la microplaqueta humana V UniGem que contenía EST verificados en una secuencia de 8,000, que representaban hasta 5,000 genes humanos conocidos (servicio proporcionado por el Genome System Inc por una cuota) . La placa de control, en la cual las concentraciones conocidas de cADN de referencia formaban picos en la reacción de generación de sonda, para medir la sensibilidad y observar la reacción de transcripción inversa, purificación, determinar la eficiencia de la hibridación y la vista global de la calidad y desempeño del ensayo, indicaron el éxito del proceso de hibridación. El análisis global de los datos experimentales reveló diferencias mínimas en la señal de hibridación entre las muestras de control y las tratadas con VII. Solamente un número pequeño de genes, mostró una expresión diferencial moderada. Se encontró la sobreregulacion de 5 genes (3.5 hasta 2 veces más alto en el tratamiento con Vlla) mientras que un gen fue subregulado con el tratamiento con Vlla (2.4 veces menor) (+/-2 estimado conservador para determinar la magnitud mínima de las relaciones reales) . La identidad del gen sobreregulado 3.5 veces no se reveló debido a su naturaleza confidencial. Otros genes sobreregulados con Vlla son el Cyr61 (2.5 veces), el receptor D2 de la dopamina (2.2 veces), el EST Incyte PD 395116 (2 veces) y el receptor P2U de nucleótidos (2 veces) . Es interesante observar que el CTGF, un gen que pertenece a la familia del Cyr61, fue 1.8 veces superior en células tratadas con Vlla en comparación con las células de control. El transcripto subregulado en células tratadas con Vlla, fue EST PD674714. Se selecciono el CyrSl para análisis adicional. Ejemplo 10 Confirmación de la expresión diferencial del Cyx61. Para validar los datos obtenidos en la microconfiguración, se han sometido las muestras de ARN de las células tratadas con Vlla y de control (las mismas muestras de ARN que han sido usadas para preparar el poli (A) ARN para generación de sondas en la microconfiguración) para el análisis de manchado Northern y se sondearon con cADN de Cyr61 radioetiquetado. Los datos muestran que la sonda de cADN de Cyr61 se hibridizó hasta un transcripto simple (aproximadamente 2.0 kb) de ARN aislado de las células tratadas con Vlla y de control. Sin embargo, la intensidad de la señal de hibridación fue mucho mayor en el ARN aislado de células tratadas con Vlla (Fig. 1) . La cuantificación de la señal de hibridación, reveló que la expresión de CyrSl fue 2.8 veces superior en células expuestas a Vlla sobre las células tratadas de control.

Ejemplo 11 Cinética de la expresión inducida por VIla de Cyr61.

Para determinar la cinética de la expresión de Cyr61, se trataron fibroblastos quiescentes por periodos de tiempo variables con 5 µg/ml de Vlla. Se extrajo el ARN total y se colocó a pacientes para análisis de manchado Northern. Como se muestra en la figura 2, la expresión de Cyr61 se incrementa en una forma dependiente del tiempo en células tratadas con Vlla. La expresión tuvo un pico alrededor de 45 minutos y posteriormente declinó hasta el nivel base en 2 a 3 horas. Ya que se había reportado que la expresión de Cyr61 en fibroblastos de ratón después de la estimulación con suero y el factor de crecimiento, se sostenía por diversas horas (hasta 8 a 10 horas) antes de que sucediera la represión, se examinó el efecto del suero y el PDGF en la cinética de la expresión de Cyr61 en fibroblastos humanos quiescentes, WI-38. Como se muestra en la figura 2B, el Cyr61 se expresa solamente de forma transitoria con la estimulación con PDGF y se reprime completamente 2 horas después de la adición de estímulos. Se obtienen resultados similares con la expresión inducida por suero del Cyr61 (no se muestran los datos) .

Ejemplo 12 Expresión inducida del Cyr61 dependiente de la dosis del factor VIla. Para determinar la dependencia de la dosis del Vlla, se trataron fibroblastos quiescentes con dosis variables de FVIIa (0.1 hasta 5 µ?/???) hasta 45 minutos, y después se aplicaron a pacientes muestras totales de ARN de la célula para el análisis de manchado Northern. Como se muestra en la figura 3, el tratamiento de los fibroblastos con una concentración tan baja como 0.1 µ?/p?? de FVIIa fue suficiente para inducir la expresión de Cyr61 y una concentración de plasma de FVIIa (0.5 µ?/p??, 10 nM) resultó en una respuesta prominente, cercana al -máximo. Ejemplo 13 Se requiere la actividad catalítica del factor VIla para la inducción del Cyr61. Para probar si se requiere la actividad catalítica de Vlla para la inducción de Cyr61, se trataron células WI-38 con Vlla y FVIIa inactivado en el sitio activo (FVIIai) durante 45 minutos, y se evaluó la expresión de Cyr61 por análisis de manchado Northern. Como se muestra en la figura 4, el FVIIai falló al inducir la expresión de Cyr61, sugiriendo el requerimiento de actividad proteolítica de FVIIa. En este contexto, puede ser importante señalar que el FVIIai demostró enlazarse al TF de la superficie celular con una afinidad igual o superior que el FVIIa. Es improbable que la expresión inducida por el Vlla del Cyr61 en estos experimentos, sea el resultado de la generación de factores de coagulación en la dirección descendente, FXa y trombina. Al usar ensayos cromogénicos sensibles, no se encuentra evidencia de la generación del factor Xa y de la trombina en este sistema experimental (sensibilidad de detección 10 pg) . Además, los inhibidores específicos del factor Xa y la trombina, esto es la proteína anticoagulante de la garrapata y la hirudina respectivamente, fallaron para eliminar la expresión inducida por VIla del Cyr61 (figura 5) . Ejemplo 14 Involucramiento del mecanismo transcripcional para la inducción de niveles de régimen permanente de mMARN del Cyr61 por el VIla. Para investigar si la transcripción está involucrada en el incremento mediado por el Vlla en niveles de régimen permanente de mARN de Cyr61, se incubaron células quiescentes de WI-38 con actinomicina D (10 µg ml) durante 30 minutos antes de la adición de Vlla por 45 minutos. Como se muestra en la figura 6, la actinomicina D inhibió el efecto estimulador del Vlla. Este hallazgo indica un mecanismo transcripcional para la inducción de Cyr61.

Para investigar si la síntesis de proteínas de novo se requiere para la inducción del nARN de Cyr61 por el Vlla, se pretrataron células WI-38 con el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida, antes de que las células se expusieran a Vlla durante 45 minutos. Como se muestra en la figura 6, el efecto estimulador de Vlla no se bloquea por la cicloheximida. De hecho, la cicloheximida incrementó marcadamente los niveles de régimen permanente de mARN de Cyr61 inducido por el Vlla. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para la inducción o aumento de la migración celular, caracterizado porque comprende la etapa de hacer contacto de la célula con un agonista del factor de tejido.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista del factor de tejido es FVII o FVIIa.
3. 3. Un método para la reducción o inhibición de la migración celular, caracterizado porque comprende la etapa de hacer contacto de la célula con un antagonista del factor de tejido.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista del factor de tejido es FVII modificado.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque la célula es una célula humana que expresa el factor de tejido, incluyendo fibroblastos, células del músculo liso, células de tumor, células hematopoyéticas, monocitos, macrofagos y células epiteliales.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula expresa además PDGF y receptores PDGF, especialmente beta-receptores PDGF.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el factor modificado VII se selecciona del Dansil-Phe-Pro-Arg clorometil cetona, Dansil-Glu-Gly-Arg clorometil cetona, Dansil-Phe-Phe-Arg clorometil cetona y A-Phe-Phe-Arg clorometil cetona.
8. 8. Un método para inducir o aumentar la cicatrización de heridas en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende el factor Vlla o el factor VII u otro agonista del factor de tej ido .
9. 9. Un método para inhibir la migración celular, invasión, proliferación celular inducida por la migración o angiogénesis, en un paciente que tiene una enfermedad o condición asociada con la migración indeseable de células, invasión, proliferación o angiogénesis de células inducidas por la migración, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del factor de tejido.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la enfermedad o condición es un crecimiento de tumor primario, invasión por tumores o metástasis .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el antagonista del factor de tejido es un factor VII modificado.
12. 12. El uso de un agonista del factor de tejido para la fabricación de un medicamento para inducir o enriquecer la migración celular.
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agonista del factor de tejido es FVII o FVIIa o una combinación de los mismos.
14. 14. El uso de un antagonista del factor de tejido para la fabricación de un medicamento para reducir o inhibir la migración celular.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el antagonista del factor de tejido es el factor VII modificado.
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el factor VII modificado se selecciona del factor VII modificado por Dansil-Phe-Phe-Arg clorometil cetona, Phe -Phe-Arg clorometil cetona, Dansil-D-Phe-Phe-Arg clorometil cetona y D-Phe-Phe-Arg clorometil cetona.
17. 17. Un método para la regulación de la expresión de al menos un gen en una célula, caracterizado porque comprende la etapa de hacer contacto de la célula con un agonista del factor de tejido o hacer contacto de la célula con un antagonista del factor de tejido.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el agonista del factor de tejido es FVII o FVIIa.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista del factor de tejido es FVII modificado.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el gen es un gen que pertenece a la familia de genes CCN.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el gen se selecciona del grupo que consiste de Cyr61, CTFG, receptor D2 de la dopamina, EST Incyte PD 395116 o receptor del nucleótido P2U.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el gen es el gen Cyr61.