KR100821644B1 - 유전자 발현 및 세포 이동 또는 주화성을 조절하기 위한ＦＶＩＩａ 또는 조직 인자 길항제의 사용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 이동에 관련될 수 있거나, 세포 이동 또는 주화성의 특이적 조절에 의해 치료될 수 있는 병적 상태의 치료에 있어 FVII 및/또는 FVIIa 및/또는 다른 TF 아고니스트 및/또는 FVIIai 및/또는 다른 TF 길항제의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포에 있는 적어도 한 유전자, 예를 들어 Cyr61 유전자의 발현의 조절에 관련될 수 있는 병적 상태의 치료에 있어 FVII 및/또는 FVIIa 및/또는 다른 TF 아고니스트 및/또는 FVIIai 및/또는 다른 TF 길항제의 사용에 관한 것이다.
세포 이동, 주화성, 조직 인자, 응고 인자, Cyr61 유전자
Description
조직 인자(TF)를 발현하는 세포에 대한 응고 인자 VII(FVII) 또는 불활성화 응고 인자 VIIa(FVIIai)와 같은 조직 인자 길항제의 활성을 조절하는 신규한 세포가 설명된다. 본 발명은 세포와 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트, 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제를 접촉시킴에 의해 세포 이동 또는 주화성을 조절하고, 상기 세포의 이동을 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 환자에서 세포 이동을 조절하는 약제의 제조를 위한 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트, 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제의 사용에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 치료 방법, 및 화합물, 특히 세포 이동과 상호작용하는 약물 후보의 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다.
혈액 응고의 외래 경로는 혈장에서 순환하는 FVIIa가 내재 멤브레인 단백질인 조직 인자(TF)와 결합할 때 개시된다. 혈액 응고에 있어 TF의 역할이 광범하게 연구되고 있다. 혈액 응고 캐스캐이드에 단백질 분해 효소로서 FVIIa의 연관은 TF 발현 세포의 세포외 소엽에 한정된다고 여겨진다. FVIIa의 세포내 활성은 TF의 서 열이 사이토킨/인터페론 또는 조혈 리셉터 수퍼패밀리에 상동성을 나타냈을 때 처음으로 수반되었다. 조혈 리셉터 패밀리 서브클래스 I는 성장 호르몬, 프로락틴, 인터루킨 1 내지 7, 과립백혈구-대식세포 콜로니 자극 인자, 에리트로포에틴 및 트롬보포에틴에 대한 리셉터를 포함한다. 서브클래스 II는 TF 및 인터페론 a 및 b에 대한 리셉터를 포함한다.
이 클래스의 리셉터와 TF의 유사점은 결정 구조의 외형으로 더욱 구체화되었다. 인터페론 b 및 g와 IL-10에 대한 리셉터를 포함하는 사이토킨 리셉터 클래스의 특징은 그것들의 활성화가 리셉터 자체 뿐만 아니라 세포내 단백질 부분집합의 빠른 티로신 인산화를 가져온다는 것이다. 최초 티로신 인산화 후 수분 내에 미토겐-활성화(Ser/Thr) 키나제(MAPK)의 배열이 활성화된다. 이들 키나제는 몇개의 병렬 신호화 경로에 배열된다. FVIIa의 추정 세포내 신호화 능력에 대한 면밀한 연구는 그것이 TF를 구조적으로 발현하는 사람 방광 암종 셀라인 J82 및 TF를 발현하도록 인터루킨-1로 전처리된 제정맥 내피 세포에서 세포내 자유 칼슘(Ca2+)의 대사를 유도한다는 것을 밝혔지만, 세포내 티로신 키나제의 어떤 사이토킨-유사 활성화를 밝히는데는 실패했다. 결론적으로, FVIIa는 TF 의존 방식으로 포스포리파제 C의 활성화를 통해 세포내 Ca2+의 대사를 유도한다고 여겨진다. FVIIa가 포스포리파제 C를 활성화하는 메카니즘은 아직 알려지지 않았지만, 티로신 키나제 활성화는 구체적으로 제외되었다.
많은 연구실로부터의 최근 보고는 TF가 맥관형성, 배혈관화 및 종양 전이와 같은 응고 이외의 중요한 생물학적 기능의 배열에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 그러나 현재, TF가 어떻게 이들 생물학적 과정에 기여하는지는 불분명하다. TF의 세포외 도메인은 전형적인 클래스 II 사이토킨 리셉터 세포외 도메인에서 처럼, 2개의 피브로넥틴 III 형-유사 모듈로 구성되며, 이것은 TF가 사이토킨 리셉터의 주요 기능인 신호 변환에서 어떤 역할을 할 수 있는 가능성을 높인다. 그러나, TF는 매우 짧은 세포질 도메인(단지 21 아미노산 잔기 길이)을 가지며, 사이토킨 리셉터 신호화에 불가결한 비-리셉터 Janus 키나제(Jaks)의 결합을 매개하는 멤브레인-기부 모티프가 부족하다. 그럼에도 불구하고, 몇가지의 생물학적 발견은 TF의 신호 변환 기능을 시사한다. 사람 TF 단백질 서열의 분석은 세포질 도메인에 있는 추정 인산화 부위를 밝혔으며, 이것은 마우스, 래트 및 토끼 TF에 보존된다. TF의 세포질 꼬리에 있는 특이적 세린 잔기는 단백질 키나제 C 활성제로 자극된 후 세포에서 인산화된다. 사람 TF 세포질 꼬리는 U87-MG 세포의 여액으로 인큐베이션되었을 때 다수의 부위에서 시험관내 인산화된다. 또한, TF의 전전이 기능이 TF 세포질 도메인에 엄밀하게 의존한다는 것을 나타낸 연구에서는 신호 변환에서 TF 세포질 도메인의 잠재적 역할이 암시된다. 더욱이, TF 세포질 도메인은 액틴-결합 단백질 280(ABP-280)과 상호작용하는 것으로 나타나고, TF-매개 부착 접촉까지 ABP -280의 가입을 통해 세포 부착 및 이동을 지원한다.
그러나, TF는 또한 단백질 분해 메카니즘에 의한 세포외 신호화에 있어 그것의 생리학적 리간드 FVIIa에 대한 보조인자의 역할을 함으로써 어떤 종류의 세포 신호화에 참여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, FVIIa와 세포 표면 TF의 결합은 다수의 TF 발현 세포에서 세포내 Ca2+ 진동, 단핵세포에서 티로신의 일시적 인산화, MAP 키나제의 활성화, 섬유아세포에서 유전자 발현의 변경, 및 종양 세포에서 유로키나제 리셉터의 증진된 발현을 유도하는 것으로 나타난다. 촉매적으로 불활성인 FVIIa(FVIIai)는 Ca2+ 진동에서 MAP 키나제 활성화 및 유전자 감소까지 상기 신호화 반응의 대부분을 유도하지 못하며, FVIIa의 촉매 활성이 적어도 어떤 TF-FVIIa-매개 신호 변환에 필요할 수 있음이 분명하다. 현재, 단백질 분해 활성 FVIIa에 의해 유도되는 신호화 경로(들) 및 FVIIa에 의해 발생된 신호가 어떻게 맥관형성 및 종양 전이에 기여할 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
FVIIa-유도 반응의 기초가 되는 전사의 시간 프로그램을 연구하기 위해서, 본 연구에서는 cDNA 미소배열(microarray)을 사용하여 FVIIa에 대한 사람 섬유아세포의 반응을 시험했다. 데이타는 몇개 유전자의 세포 발현이 FVIIa에의 노출에 의하여 섬유아세포에서 검출가능하게 변경되었다는 것을 밝혔다. 한 그러한 유전자는 성장 인자 -유도성 중간 초기 유전자인 Cyr61이며, 이것의 생성물은 세포 부착을 촉진하고, 성장 인자-유도 DNA 합성을 증대시키며, 섬유아세포 및 내피 세포에서 세포 이동을 자극하는 것으로 나타난다.
(발명의 개요)
본 발명은 세포 이동에 관련되거나 또는 세포 이동 또는 주화성의 특이적 조절에 의해 치료될 수 있는 병적 상태의 치료에 있어 FVII 및/또는 FVIIa 및/또는 다른 TF 아고니스트 및/또는 FVIIai 및/또는 다른 TF 길항제의 용법에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포에 있는 적어도 한 유전자, 예를 들어 Cyr61 유전자의 발현의 조절에 관련될 수 있는 병적 상태의 치료에 있어 FVII 및/또는 FVII 및/또는 다른 TF 아고니스트 및/또는 FVIIai 및/또는 다른 TF 길항제의 사용에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포와 조직 인자 아고니스트를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 이동을 유도 또는 증진하는 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, 조직 인자 아고니스트는 FVII 또는 FVIIa이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포와 조직 인자 길항제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 이동을 감소 또는 억제하는 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, 조직 인자 길항제는 변형 FVII이다.
한 구체예에서, 세포는 섬유아세포, 평활근세포, 종양 세포, 조혈 세포 및 상피 세포를 포함하는 조직 인자를 발현하는 사람 세포이다.
한 구체예에서, 변형 인자 VII는 Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤을 사용하여 변형된 인자 VII로부터 선택된다.
다른 양태로서, 본 발명은 인자 VIIa 또는 인자 VII 또는 다른 조직 인자 아 고니스트 또는 그것들의 조합을 포함하는 유효량의 제약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 상처 치유를 유도 또는 증진하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 조직 인자 길항제를 포함하는 유효량의 제약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 바람직하지 않은 세포 이동, 침입, 이동-유도 세포 증식 또는 맥관형성에 관련된 질환 또는 상태를 가지고 있는 환자에서 세포 이동, 침입, 이동-유도 세포 증식 또는 맥관형성을 억제 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, 질환 또는 상태는 원발성 종양 성장, 종양 침입 또는 전이이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포 이동을 유도 또는 증진하는 약제의 제조를 위한 조직 인자 아고니스트의 사용에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포 이동을 감소 또는 억제하는 약제의 제조를 위한 조직 인자 길항제의 사용에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포와 조직 인자 아고니스트를 접촉시키거나, 또는 세포와 조직 인자 길항제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 있는 적어도 한 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, 유전자는 CCN 유전자 패밀리에 속하는 유전자이다.
다른 구체예에서, 유전자는 Cyr61, CTFG, 도파민 D2 리셉터, EST Incyte PD 395116 또는 P2U 뉴클레오티드 리셉터로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 유전자는 Cyr61 유전자이다.
한 구체예에서, 조절은 발현을 유도 또는 증진한다. 다른 구체예에서, 조절은 발현을 감소 또는 억제한다.
한 구체예에서, 예를 들어 유전자가 CCN 유전자 패밀리에 속하는 유전자이거나, 또는 유전자가 Cyr61, CTFG, 도파민 D2 리셉터, EST Incyte PD 395116 또는 P2U 뉴클레오티드 리셉터로 구성된 군으로부터 선택될 때, FVII 또는 FVIIa 또는 다른 조직 인자 아고니스트는 유전자 발현을 유도 또는 증진하고, 변형 FVII 또는 다른 조직 인자 길항제는 유전자 발현을 감소 또는 억제한다.
다른 구체예에서, 예를 들어 유전자가 EST PD674714일 때, FVII 또는 FVIIa 또는 다른 조직 인자 아고니스트는 유전자 발현을 감소 또는 억제하고, 변형 FVII 또는 다른 조직 인자 길항제는 유전자 발현을 유도 또는 증진한다.
치료될 수 있는 질환 상태는, 예를 들어 죽상경화증, 종양 침착, 종양 성장, 종양 침입, 전이 또는 맥관형성과 같은 병적 상태이다. 치료될 수 있는 다른 상태는, 예를 들어 혈관벽의 재생을 포함하는 상처의 치유 및 화상의 치료, 또는 염증, 또는 예를 들어 조직의 성장과 같은 시험관내 세포 이동의 조절이다.
(발명의 상세한 설명)
본 발명은 세포 이동을 유도 또는 증진하는 제약학적 조성물의 제조를 위한 FVII 또는 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태로서, 본 발명은 상처 치유 또는 맥관형성을 유도 또는 증진하는 제약학적 조성물의 제조를 위한 FVII, FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트의 사용 에 관한 것이다.
더 이상의 양태로서, 본 발명은 세포 이동을 억제 또는 예방하는 제약학적 조성물의 제조를 위한 FVIIai 또는 다른 TF 길항제의 사용에 관한 것이다.
한 구체예에서, 세포 이동은 피험자에서 있다.
더 이상의 양태로서, 본 발명은 맥관형성, 전이, 종양 성장 또는 종양 침입을 억제 또는 예방하는 제약학적 조성물의 제조를 위한 FVIIai 또는 다른 TF 길항제의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태로서, 본 발명은 환자에서 세포 이동을 유도 또는 증진하는 방법에 관한 것이며, 이것은 상기 환자에게 유효량의 FVII 또는 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트를 투여하는 것을 포함한다.
더 이상의 양태로서, 본 발명은 환자에서 세포 이동을 억제 또는 예방하는 방밥에 관한 것이며, 이것은 상기 환자에게 유효량의 FVIIai 또는 다른 TF 길항제를 투여하는 것을 포함한다.
특정한 구체예에서, 유효량은 약 5㎍/kg/일에서 약 500㎍/kg/일까지의 일일 투여량이다.
더 이상의 구체예에서, TF 길항제는 변형 FVIIa, 예를 들어 FFR-FVIIa를 포함한다.
본 발명은 세포 이동의 자극에 관련된 FVII 및/또는 FVIIa의 활성에 관한 메카니즘을 제공한다. 그러한 메카니즘은 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 평활근세포 및 단핵세포/대식세포와 같은 TF 발현 세포가 참여하는 병적 상태에 FVII 및/또는 FVIIa의 연관을 성립시키는데 대한 근거를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 치료적 중재에 유용한 특이적 제약학적 표적을 확인하는데 대한 근거를 제공한다.
따라서, 본 발명은 세포 이동에 관련될 수 있거나, 또는 세포 이동의 특이적 조절에 의해 치료될 수 있는 병적 상태의 치료에 있어 FVII 및/또는 FVIIa 및/또는 FVIIai의 용법에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 세포 이동을 조절하는 약물 후보를 검출하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) TF 발현 세포를 배양하는 단계;
b) 세포의 이동을 측정하는 단계;
c) 약물 후보로 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
d) 인큐베이션된 세포의 이동을 측정하고, 단계 b에서 측정된 이동과 비교하여 이동 레벨의 어떤 변화를 측정하는 단계
를 포함하며, 그러한 변화는 상기 세포에서 생물학적으로 활성인 약물 후보의 표시이다.
일반적으로, 응고 "캐스캐이드"로 간주되는 것에 참여하는 혈액 성분은 그 자체가 활성화된 응집 인자인 활성제의 작용에 의해 단백질 분해 효소로 전환되는 효소적으로 불활성인 단백질인 선구효소 또는 효소원이다. 그러한 전환을 겪는 응고 인자는 일반적으로 "활성 인자"로 간주되며, 응고 인자의 이름에 문자 "a" 를 첨가하여 표시한다(예를 들어, 인자 VIIa).
용어 "아연-킬레이트제"는 인자 VIIa에 결합하여 인자 VIIa 내에서 칼슘 이 온과 아연 이온의 교환을 유도함으로써 인자 VIIa 또는 조직 인자-인자 VIIa 복합체(TF-FVIIa)의 활성을 억제하는 화합물을 포함하도록 의도된다.
본 발명에 따르는 적합한 TF 길항제는 아연-킬레이트화 화합물, 예를 들어 아연 이온을 킬레이트화할 수 있는 위치에 서로 상대적으로 위치한 히드록사메이트 또는 히드라지드 기를 갖는 디히드록사메이트 또는 디히드라지드일 수 있다. 아연 -킬레이트화 화합물은 FVIIa와 조합하여 작용한다. Zn2+ 이온은 Ca2+ 이온의 자극성 효과와 경쟁하여 그것들의 억제성 작용을 발휘한다. Zn2+ 이온이 FVIIa 내에 있는 하나 이상의 칼슘 결합 부위(들)로부터 Ca2+ 이온을 대신할 것이 예상된다. 아연-킬레이트화 화합물, 예를 들어 히드록사메이트 및 히드라지드는 칼슘 이온과 경쟁하여 아연 이온의 결합을 위한 강력한 지지체로서 작용할 수 있다. 이로써, 특이적 화합물은 인자 VIIa/조직 인자 복합체의 활성에 대한 아연 억제의 효력을 더한다. 조직 인자와의 복합체에서 인자 VIIa의 활성은 아연 킬레이트제가 인자 VIIa에 결합하여 Ca2+와 Zn2+의 교환을 용이하게 하는 메카니즘에 의해 억제될 수 있다. 이런 작용에 의하여, 킬레이트제는 혈액 중 자유 Ca2+ 및 Zn2+ 이온의 정상 농도에서 TF에 대한 조정성 효과를 발휘한다.
용어 "FVII" 또는 "인자 VII"는 "단일 사슬"(효소원성) 응고 인자 VII를 의미한다. 용어 "인자 VIIa" 또는 "FVIIa"는 Arg152-Ile153 펩티드 결합의 특이적 절단에 의해 절단된 "2 사슬" 활성화 응고 인자 VII를 의미한다. FVII 및 FVIIa는 혈액으로부터 정제되거나, 또는 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 본원에 설명된 방법의 실행은 정제된 인자 VIIa가 유도되는 방법에는 독립적이며, 따라서 본 발명은 본원에 사용하기에 적합한 어떤 인자 VII 또는 FVIIa 제조물의 사용을 커버하도록 의도된다. 바람직한 것은 인간 FVIIa이다. 또한, FVII 또는 FVIIa는 하나 이상의 아미노산 잔기가 교환된 FVII 변이체를 포함하도록 의도된다.
용어 "변형 인자 VII", "불활성화 FVII" 또는 "FVIIai"는 그것의 촉매 중심에 적어도 하나의 변형을 가지고 있는 FVIIa를 의미하도록 의도되며, 이 변형은 FX 및 FIX를 활성화하는 변형 FVIIa의 능력을 실질적으로 억제한다. 이 용어들은 교환가능하게 사용될 수 있다. 그러한 변형은 3쌍의 촉매 잔기 Ser344, Asp142 및 His193 중 하나 이상의 아미노산 치환(또는 교환)을 포함하며, 또한 유기-인광물질 화합물, 술파닐플루오리드, 펩티드 할로메틸 케톤 또는 아자펩티드와 같은 세린 프로테아제 억제제를 사용한 3쌍의 촉매 잔기의 변형을 포함한다. FFR-FVIIa는 비가역성 억제제인 D-페닐알라닌-L-페닐알라닌-L-아르기닌 클로로메틸 케톤(FFR cmk)으로 FVIIa의 활성 중심을 차단함에 의해 얻어진 FVIIai 유도체의 한 예이다. 다른 적합한 FVIIai 유도체는 L-페닐알라닌-L-페닐알라닌-L-아르기닌 클로로메틸 케톤, Dansyl-L-페닐알라닌-L-페닐알라닌-L-아르기닌 클로로메틸 케톤, 또는 Dansyl-D-페닐알라닌-L-페닐알라닌-L-아르기닌 클로로메틸 케톤으로 활성 중심을 차단함에 의해 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 불활성화 FVIIa이다. 바람직한 것은 FFR-FVIIa (FFR cmk에 의해 불활성화된 FVIIa)이다.
용어 "단백질 키나제"는 펩티드 및/또는 단백질에 있는 세린 및/또는 트레오 닌 및/또는 티로신을 인산화할 수 있는 효소를 나타내도록 의도된다.
용어 "약물 후보"는 생물학적 기능을 가지거나, 또는 세포 시스템에서 생물학적 효과를 발휘하는 어떤 샘플을 나타내도록 의도된다. 샘플은 미생물 또는 식물 추출물과 같은 생물학적 물질의 샘플일 수 있거나, 또는 유기 합성 또는 유전 기법에 의해 제조된 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 함유하는 샘플일 수 있다.
용어 "TF 아고니스트"는
a) TF(예를 들어, FVIIa)에 직접 결합함에 의한 신호 변환,
b) MAPK 캐스캐이드의 자극,
c) MAPK 억제(예를 들어, PTPase 억제제)의 폐지
를 유도하는 화합물을 포함하며, 이 아고니스트는 상기 정의된 바와 같은 약물 후보이다.
용어 "TF 길항제"는
a) 전달 없이 TF에 결합하는 FVIIa와 경쟁하는 시약, 예를 들어 FVIIai,
b) FVIIa에 결합하여 TF와의 결합을 방지하는 시약, 예를 들어 Zn 히드록사메이트,
c) MAPK 캐스캐이드의 구성원들을 방해함에 의해 신호 변환을 억제하는 시약,
d) FVIIa/TF에 결합하여 전달을 방지하는 시약,
e) FVIIa/TF/FX에 결합하여 전달을 방지하는 시약,
f) 사람 조직 인자/인자 VIIa 복합체에 의해 촉매된 사람 인자 X 활성화를 차단하는 시약
을 포함하며, 이 길항제는 상기 정의된 바와 같은 약물 후보이다.
용어 "제약학적 표적"은 TF 발현 세포의 이동을 변경시킬 수 있는 단백질을 나타내도록 의도된다.
용어 "리포터 유전자"는 전사되었을 때 결실될 수 있는 단백질을 생성하는 DNA 구성물을 나타내도록 의도된다.
용어 "SRE 프로모터 요소"는 혈청에 존재하는 성분에 의해 유도된 전사 인자를 결합시키는 DNA 서열을 의미한다.
용어 "TF 발현 세포"는 TF를 발현하는 어떤 포유류 세포를 의미한다.
용어 "단백질 인산화"는 펩티드 및/또는 단백질에 있는 세린 및/또는 트레오닌 및/또는 티로신의 인산화를 나타내도록 의도된다.
세포 이동의 조정 또는 조절은 1) 진행중인 정상적 또는 비정상적 세포 이동을 증가 또는 감소시키고, 2) 정상적 세포 이동을 개시하고, 3) 비정상적 세포 이동을 개시하는 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트, 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제의 능력으로 정의된다.
유전자 발현의 조정 또는 조절은 1) 진행중인 정상적 또는 비정상적 세포 이동을 증가 또는 감소시키고, 2) 정상적 세포 이동을 개시하고, 3) 비정상적 세포 이동을 개시하는 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트, 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제의 능력으로 정의된다.
이와 관련하여, 용어 "치료"는 불리한 상태의 예방, 및 상태를 억제 또는 최 소화하기 위한 이미 발생한 상태의 조절을 모두 포함하도록 의도된다. 따라서, FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트, 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제의 예방적 투여가 용어 "치료"에 포함된다.
이와 관련하여, 용어 "1 유니트"는 정상 혈장 1ml에 존재하는 인자 VII의 양으로 정의되며, 이것은 약 0.5㎍ 단백질에 상응한다. 활성화 후 50 유니트는 약 1㎍ 단백질에 상응한다.
이와 관련하여, 용어 "환자"는 어떤 동물, 특히 포유류, 예컨대 인간으로 정의된다. 용어 "피험자"는 "환자"와 교환가능하게 사용된다.
약어
TF 조직 인자
FVII 단일-사슬 비활성화형 인자 VII
FVIIa 활성화형 인자 VII
RFVIIa 활성화형 재조합 인자 VII
FVIIai 변형(불활성화) 인자 VII
FFR-FVIIai D-Phe-L-Phe-L-Arg 클로로메틸 케톤과의 반응에 의해 불활성화
된 인자 VII
조직 인자(TF)는 인자 FVIIa(FVIIa)에 대한 세포 리셉터이며, 이 복합체는 혈액 응고의 주요한 개시제이다. 우리는 많은 양의 TF를 발현하는 사람 섬유아세포의 세포 이동 및 신호 변환에 대한 TF와 FVIIa 결합의 효과를 연구했다. FVIIa로 인큐베이션된 섬유아세포는 FVIIa와 리게이션되지 않은 섬유아세포 보다 약 100 배 더 낮은 농도의 PDGF-BB 농도 구배를 향해 이동했다. 항-TF 항체는 FVIIa/TF에 의해 유도된 주화성의 증가를 억제했다. 더욱이, PDGF-BB에 의해 유도된 주화성의 명백한 억제가 활성 부위-억제 FVIIa(FFR-FVIIa)를 사용하여 관찰되었다. 초주화성이 FXa 및 트롬빈 활성의 추정 활성에 의해 유도된다는 가능성은 배제되었다.
FVIIa는 PDGF-BB와 동일한 정도까지 이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트의 생성을 유도했다. FVIIa 및 PDGF-BB의 효과는 첨가적이었다. FFR-FVIIa는 이노시톨 -1,4,5-트리포스페이트의 어떤 유리도 유도하지 않았다. PDGF-BB 및 FVIIa에 대한 세포 이동 반응은 PLC-억제제에 의해 전체적으로 차단되었으며, 이것은 PLC의 활성화가 이 반응에 중요하다는 것을 시사한다. 따라서, FVIIa와 TF의 결합은 응고로부터 독립적일 수 있고, 주화성과 같은 세포 반응을 조정하며, FVIIa의 촉매 활성이 필수적이다.
TF는 종양 세포 전이에서 기능을 발휘한다고 여겨지지만, 그 메카니즘은 아직 알려지지 않고 있다. 그러나, Ott 등은 매우 최근에 TF가 종양 세포 전이를 지원할 수 있는 분자 경로를 제공하는 TF 세포질 도메인에 대한 리간드로서 액틴-결합 단백질 280(ABP-280)을 확인했다. 그러나, FVIIa/TF에 의해 변환된 분자 신호 및 생물학적 기능은 아직 이해가 부족하다.
사람 섬유아세포는 TF의 구조적 발현을 갖는다. 이들 세포는 또한 혈소판-유도 성장 인자(PDGF)에 대한 리셉터를 발현한다. PDGF는 그것의 표적 세포에서 미토겐성, 액틴 재구성 및 지정된 세포 이동(주화성)을 유도한다. 우리는 이전에 PDGF-BB가 사람 섬유아세포에 대한 효과적인 주화성 인자이며, 주화성 반응은 β- 리셉터 클래스에 의해 매개된다는 것을 나타냈다. 따라서, 이들 세포가 FVIIa와 TF의 결합에 의해 유도된 추정 신호 변환 및 세포 이동을 연구하기 위해 선택되었다.
아래에서, 우리는 TF와 FVIIa 결합에 의해 유도된 신호화와 성장 인자에 대한 세포 반응 사이의 분명한 관계를 처음으로 나타낸다. 우리는 사람 섬유아세포에서 FVIIa/TF 복합체가 PDGF-BB에 대한 초주화성 반응을 가져온다는 데이타를 제시한다. 더욱이, 활성-부위 억제 FVIIa(FFR-FVIIa)는 용량-의존 방식으로 PDGF-BB를 향한 지정된 이동을 억제했다. PLC 및 포스파티딜이노시톨 3'-키나제(PI3'-키나제)에 대한 특이적 억제제의 사용에 의해, 우리는 또한 FVIIa/TF 신호화에 의해 유도된 PDGF-BB를 향한 초주화성 반응이 포스포리파제 C(PLC)에는 의존하지만, PI3'-키나제로부터는 독립적이라는 것을 증명한다. FVIIa 및 PDGF-BB는 첨가적 방식으로 PLC의 활성화 후 유리된 2차 메신저 중 하나인 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트 (IP3)의 생성을 유도했다.
TF는 혈관 외벽, 그리고 간, 비장 및 신장의 섬유 피막에 있는 간질 섬유아세포와 같은 많은 혈관외 세포의 혈장 멤브레인상에서 구조적으로 발현된다. 따라서, TF의 발현은 순환 혈액으로부터 물리적으로 분리된 부위에서 발견되며, 지혈 외피를 제공한다. 상해시 이 장벽은 출혈에 대해 유기체를 보호한다고 생각된다. 그러나, TF는 사이토킨 및 성장 인자를 포함하는 여러가지 제제에 의해 단핵세포/대식세포, 혈관 평활근세포, 내피 세포, 및 다수의 종양 세포에서 유도될 수 있다. 전사 레벨의 유도는 자극 후 빠르게 발생하며, 이로써 성장-관련 중간 초기 유전자로서 TF가 확인된다.
본 연구에서, 우리는 신호화 리셉터로서 TF의 역할을 조사했다. 우리는 FVIIa의 리간드 결합에 의하여 TF의 구조적 발현을 갖는 사람 섬유아세포가 극도로 낮은 농도의 PDGF-BB를 향해 이동한다는 것을 나타낸다. TF/FVIIa 단독은 증진된 자발적 이동, 즉 무작위 이동을 유도하지 않았다. 따라서, FVIIa/TF에 의한 세포내 신호 변환과 성장 인자 PDGF-BB의 조합이 운동성 반응을 달성하는데 필수적이었다. 활성-부위 억제 FVIIa는 증진된 이동 반응을 이끌어내지 않았으므로, TF와의 결합 뿐만 아니라 TF/FVIIa의 촉매 활성도 필수적이었다. 더욱이, 억제성 단일클론 항체는 FVIIa에 의한 주화성 반응의 증진을 방지했다. 또한, TAP 및 히루딘이 FVIIa/TF-유도 주화성에 대한 효과를 가지지 않았으므로, 우리는 간접 신호화가 FXa 또는 트롬빈으로 인해 발생한다는 것을 배제했다. 우리는 대신 증가된 농도의 FFR-FVIIa 활성적 억제된 PDGF-BB가 주화성을 유도했다는 것을 발견했다. FFR-FVIIa로 인큐베이션된 섬유아세포는 완전한 정상적 무작위 이동을 나타냈다. PDGF-BB-유도 주화성에 대한 FFR-FVIIa의 억제성 효과는 항-TF 항체의 조합의 존재하에서는 관찰되지 않았고, 이로써 FFR-FVIIa가 독성일 가능성이 제외되었다. 이 결과는 PDGF β-리셉터 및 TF를 발현하는 세포에서 FVIIa/TF 복합체가 PDGF-BB에 대한 주화성 반응에 중요하다는 것을 다소 시사한다.
FVIIa가 IP3 생성을 증가시킨다는 우리의 발견 및 특히 MDCK 세포에서 FVIIa/TF 유도 Ca2+ 진동에 대한 이전에 보고된 데이타는 PLC가 다수의 세포에서 FVIIa/TF 신호화에 의해 활성화된다는 견해를 강력하게 지지한다. 여기에 더하여, FVIIa/TF에 의해 유도된 PDGF-BB에 대한 사람 섬유아세포에서의 초주화성 반응은 PLC-억제제에 의해 용량-의존 방식으로 차단되었다. 우리는 이전에 PDGF β-리셉터 Y93F 돌연변이 세포에서 PDGF-BB에 대한 유사한 초주화성 반응을 발견했으며, 이것은 PLC-γ1의 증가된 인산화 및 활성화를 나타냈다. 이들 세포에서, PLC-γ1의 증진된 인산화는 야생형 PDGF β-발현 세포와 비교하여 3배 높은 IP3 생성과 관련이 있었다. FVIIa/TF와 PDGF-BB의 조합은 사람 섬유아세포에서 IP3 생성에 약 2배 증가를 유도했다. 그러나, FVIIa/TF-유도 IP3 생성은 PLC-γ1의 인산화와는 관련이 없었다. FVIIa/TF에 의해 유도된 PLC-γ2의 티로신 인산화가 배제될 수는 없지만, PLC-γ2의 발현이 사람 섬유아세포에서 매우 낮았으므로 가망없을 것 같다. 더욱이, TF의 세포내 부분은 본질적인 단백질 티로신 키나제 활성을 부여받지 않는다. 이들 결과는 FVIIa/TF가 β 및/또는 δ PLC 동질효소의 활성화를 유도한다는 것을 시사한다. IP3 유리 세포에 대한 분석에서, 배양 배지는 약 0.1nM FXa 만을 함유하는 0.1% FBS로 보충되었다. 우리는 20nM FXa 이상의 농도가 IP3 생성을 유도하는데 필수적이라는 것을 발견했다. β 또는 δ PLC 동질효소가 활성화되는 메카니즘은 아직 해명되지 않고 남아 있다. 활성화는 TF와 멤브레인-관련 단백질 사이의 협력을 수반한다고 여겨진다.
최근에, TF와 세포골격의 관계가 확인되었다. TF의 세포질 도메인과 액틴 필라멘트-결합 단백질 ABP 280 사이의 분자 상호작용이 밝혀졌다. 더욱이, TF는 상피 세포를 펼쳤을 때 라멜리포디아 및 주름이 있는 멤브레인 영역에 있는 α-액티닌 및 ABP 280과 같은, 액틴 및 액틴 필라멘트-결합 단백질와 가까이 접촉하고 있는 것이 발견되었다. 필라민 서브패밀리의 일원인 ABP 280은 라멜리포디아의 정상적 기능을 위해 필요하며, 따라서 세포 운동성에도 매우 중요하다. PI3'-키나제 및 PLC 동질효소는 액틴-결합 단백질의 가동화와 같은 주화성 반응에 연관된다. 이전 연구에서, 우리는 PDGF β-리셉터 유도 주화성에서 PI3'-키나제 경로가 PLC-γ1의 과발현 및 증진된 활성을 갖는 세포에서 덜 중요한 것 같다는 것을 관찰했다. 또한, 이것은 TF에 결합된 FVIIa를 갖는 세포에 관한 경우에도 마찬가지였다. 이것은 PI3'-키나제 및 PLC 동질효소의 활성화의 크기가 이들 경로 중 어느 것이 우위를 차지할 것인지를 결정할 것이라는 것을 나타낸다. 함께 선택된 우리의 데이타는 세포 이동이 FVIIa/TF 신호화에 의해 유도된 중요한 형태발생 기능임을 나타낸다.
주화성은 상처 치유, 맥관형성 및 전이에서 중추적 역할을 한다. 또한, 주화성은 죽상경화성 플라그의 발생에 중요한 성분이다. 이들 과정에서, 여러가지 세포는 TF 뿐만 아니라 PDGF 및 PDGF 리셉터를 발현한다. 재협착증은 폐쇄된 동맥의 중재성 과정 후의 주요 합병증이다. PDGF는 평활근세포 및 섬유아세포의 이동 및 증식을 매개함으로써 기계적 상해에 대한 혈관벽의 반응(신혈관내막 형성)에 연관된다. 우리는 이제 처음으로 TF 발현 세포와 FVIIa 결합이 PDGF에 대한 증가된 주화성 반응을 가지며, 이것이 응고로부터 독립적이라는 것을 나타낸다.
현재, 단백질 분해 활성 VIIa에 의해 유도되는 신호화 경로(들) 및 VIIa에 의해 발생된 신호가 어떻게 세포 과정에 기여할 수 있는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 한 가능성은 FVIIa가 세포 과정을 유도하도록 하류를 작용시키는 성장 조절제의 발현을 유도할 수 있다는 것이다. 이 가능성을 조사하기 위해서, 본 연구에서는 8,000 이상의 개별 사람 유전자를 함유하는 cDNA 미소배열을 사용하여 VIIa에의 노출에 대한 반응에서 사람 섬유아세포의 전사 프로그램의 변화를 시험했다. 섬유아세포는 정상적으로 혈청과 마주치고, 물리적(예를 들어, 수술) 및 병리생리학적 상태로 인한 혈관 상해와 관련하여 성장 인자 및 활성화 응집 인자를 함유하므로 섬유아세포를 선택한다. 혈청에 대한 반응에서 관찰된 유전자 발현의 시간 프로그램은 섬유아세포가 일반적 미토겐성 자극이 아니라 특이적 생리학적 신호로서 혈청에의 돌연 노출을 해석하도록 프로그램된다는 것을 시사한다. 또한, 혈청 및 성자 인자에 대한 반응에서 전사 활성화의 특징은 섬유아세포가 염증, 맥관형성 및 상처 치유를 집단적으로 제어하는 다른 종류의 세포 사이의 대화에서 활성 참여자임을 시사한다.
90분간 VIIa에 노출된 섬유아세포로부터 분리된 mRNA를 사용한 cDNA 미소배열 분석은 Cyr61의 상향조절을 나타낸다. 노던 블롯 분석으로 섬유아세포에서 Cyr61의 VIIa-유도 발현을 확인했다. 섬유아세포에서 만큼 확고한 것은 아니지만, VIIa은 또한 혈관 평활근세포에서 Cyr61의 발현을 증가시킨다. FVIIai는 Cyr61의 발현을 유도하는데는 실패했으므로, Cyr61 발현의 유도는 FVIIa의 촉매 활성에 의 존한다. 인자 Xa 및 트롬빈 또한 Cyr61의 발현을 유도할 수 있지만(데이타 나타내지 않음), 이들 화합물은 Cyr61의 FVIIa-유도 발현에 연관되지는 않는다. 우리는 우리의 실험 시스템에서 미량 인자 Xa 및 트롬빈의 발생에 대한 증거를 발견하지 못했다. 더욱이, 인자 Xa 및 트롬빈에 대한 특이적 억제제는 Cyr61의 FVIIa-유도 발현에 대해 의미 있는 효과를 가지지 않았다.
Cyr61은 섬유아세포에 있는 혈청 성장 인자에 의해 전사적으로 활성화된 중간 초기 유전자이다. 그것은 세포외 매트릭스 및 세포 표면과 관련 있는 시스테인-풍부 및 헤파린-결합 단백질인 분비된 40kDa를 코드화한다. Cyr61은 N-말단 분비 신호, 이어서 패밀리의 성원들 사이에서 광범위하게 보존되는 4개의 모듈 구조 도메인 및 38 시스테인 잔기의 존재를 특징으로 하는 보존된 모듈 단백질의 신흥 유전자 패밀리의 성원이다. 이 단백질 패밀리는 현재 Cyr61, 결합성 조직 성장 인자(CTGF) 및 조류 프로토-종양단백질인 Nov(따라서, CCN 패밀리로 명명됨)를 포함하여, 6개의 별개 성원으로 구성된다(CCN 패밀리는 Lau 등의 Exp. Cell Res 248: 44-57, 1999에 더 설명된다). Cyr61 단백질은 (i) 피브로넥틴과 유사한 방식으로 내피 세포의 부착 및 펼쳐짐을 촉진하고, (ii) 섬유아세포 및 혈관 내피 세포의 DNA 합성 속도에 대한 bFGF 및 PDGF의 효과를 증진시키고, (iii) 섬유아세포 및 내피 세포 모두에서 세포 이동을 촉진하는 것으로 나타난다. 최근 연구는 Cyr61이 맥관형성 및 종양 전이를 포함하는 다수의 세포 과정을 조절하는 신호화에 연관된다고 공지된 부착 리셉터 인테그린 αγβ3에 대한 리간드로서 작용하는 것을 나타낸 다. 정제된 Cyr61 단백질은 αγβ3-의존 경로를 통해 배양물에서 사람 미세혈관 내피 세포의 지정된 이동을 자극하고, 래트 각막에서 신혈관화를 유도하는 것으로 나타났다. 더욱이, 종양 세포에서 Cyr61의 발현은 종양 성장 및 혈관화를 촉진한다.
FVIIa가 섬유아세포에서 Cyr61 발현을 유도한다는 것을 나타낸 본 데이타를 기초로 하여, FVIIa-유도 Cyr61이 인테그린 αγβ3를 통해 작용하여 FVIIa-매개 세포 이동 및 종양 전이를 초래한다고 여겨진다. 따라서, Cyr61은 인테그린-신호화 경로에 FVIIa-TF 단백질 분해 신호를 연결한다. VIIa 촉매 활성이 평활근 세포 및 종양 세포의 이동, 및 종양 전이에 필요하다는 관찰은 FVIIa 촉매 활성이 Cyr61의 유도에 필요하다는 다른 관찰과 일관된다.
Cyr61에 더하여, VIIa 또한 FVIIa-유도 생물학적 반응을 매개할 수 있는 다른 조절제를 유도할 수 있다. 췌장암 세포에서 세포 표면 TF와 FVIIa 결합은 uPAR 유전자를 선택적으로 과발현하는 것으로 나타났다. 더 초기에 우리는 FVIIa에 노출된 섬유아세포에서 폴리 (A) 중합효소 유전자 전사의 상향조절을 차등 디스플레이 기법을 사용하여 나타냈다. cDNA 미소배열이 또한 PAP의 차등 발현을 나타내는지의 여부를 발견하는데 관심이 있었지만, 이 필터는 PAP cDNA를 함유하지 않았다. Cyr61에 더하여, 우리의 cDNA 미소배열은 또한 4개의 다른 유전자의 차등 발현을 나타내지만(결과 참조), 차등 발현 비는 경계적 의미에 매우 가까웠다. 예비 실험에서는 노던 블롯 분석에 의해 그것들의 차등 발현을 확인할 수 없었고, 또한 FVIIa-유도 생물학적 반응을 매개하는 이들 유전자 생성물의 능력에 대한 어떤 암 시적 관련 데이타도 없었으므로, 우리는 그것들의 발현을 더 이상 분석하지 않았다. 그러나, CTGF는 Cyr61에 구조적으로 관련된 분자이고, Cyr61과 동일한 생물학적 반응을 이끌어내므로, 우리는 cDNA 미소배열에서 FVIIa-처리 샘플 대 대조표준 샘플의 CTGF 발현의 상대 비율이 1.8(2가 분석에서 실제 크기로 줄잡아 어림한 것이다)일지라도 CTGF의 발현을 시험했다. 데이타는 FVIIa가 또한 CTGF의 발현을 유도하고, CTGF의 VIIa-유도 발현의 동력학이 Cyr61과 유사하다는 것을 밝혔다.
CTGF는 Cyr61과 매우 유사하게 행동하지만, 그것들 사이에는 미세한 차이가 존재한다. 예를 들어, (a) CTGF는 그 자체에 미토겐성이 나타나는 반면, Cyr61은 본질적인 미토겐 활성을 가지지 않지만 성장 인자-유도 DNA 합성을 증대시키고, (b) Cyr61은 주화성을 자극하는 반면, CTGF는 주화성 및 화학운동 모두를 자극하고, (c) Cyr61 및 CTGF는 모두 ECM-관련 신호화 분자이지만, CTGF는 배양 배지에서 분비되는 것으로 나타난다. 따라서, FVIIa는 Cyr61에 의하여 국부적으로 세포 기능을 조절하는 반면, CTGF의 분비를 통해 그것의 부위로부터 어떤 거리를 두고 작용하는 것이 가능하다.
본원에 언급된 바와 같은 FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제로 치료되는 어떤 환자에 대한 섭생은 당업자에 의해 결정되어야 한다. 치료요법에서 투여되는 일일 용량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 사용되는 특정 화합물, 투여 경로, 그리고 환자의 체중 및 상태에 의존할 것이다. 유효량은 약 5㎍/kg/일에서 500㎍/kg/일까지, 바람직하게는 약 10㎍/kg/일에서 300㎍/ kg/일까지, 더 바람직하게는 약 15㎍/kg/일에서 200㎍/kg/일까지, 가장 바람직하게는 약 20㎍/kg/일에서 100㎍/kg/일까지의 일일 투여량이 적합하다.
FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제는 한 단일 용량으로 투여되어야 하지만, 또한 그것은 제공된 용량 및 환자 상태에 의존하여 바람직하게는 4-6-12시간 간격을 갖는 다수 용량으로 제공될 수도 있다.
FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제는 정맥내로 투여될 수 있거나, 또는 연속성 또는 박동성 주입에 의해 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어 종양에 직접 주사되는 것과 같이 관련 부위에 직접 투여될 수 있다. 다. FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제는 바람직하게 정맥내 주사에 의해, 24시간 당 2 내지 4회 반복되어야 하는 용량인, kg 체중 당 약 100 내지 100,000 유니트의 양으로, 바람직하게는 약 5 내지 500㎍/kg에 상응하는 kg 체중 당 약 250 내지 25,000 유니트의 양으로 투여된다.
본 발명에 따라서 사용될 수 있는 제약학적 조성물을 제조하는 종래의 기법은 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985에 설명된다.
본 발명에 따라서 사용되는 조성물은 당업자에 의해 원래 공지된 방법에 의해 제조된다.
간단히 말해서, 본 발명에 따라서 사용하기 적합한 제약학적 제조물은 적합한 보조제 및 적합한 담체 또는 희석제와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 FVII, FVIIa 또는 다른 TF 아고니스트 또는 FVIIai 또는 다른 TF 길항제를 혼합함으로써 만들어진다. 적합한 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 멸균수 및 살린을 포함한다. 이 점에 대해서, 적합한 보조제는 정제된 인자 VIIa를 안정화시키기 위 한 칼슘, 단백질(예를 들어, 알부민), 또는 다른 불활성 펩티드(예를 들어, 글리실글리신) 또는 아미노산(예를 들어, 글리신 또는 히스티딘)을 포함한다. 다른 생리학적으로 허용되는 보조제는 비환원당, 폴리알콜(예를 들어, 소르비톨, 만니톨 또는 글리세롤), 저분자량 덱스트린과 같은 다당류, 세제(예를 들어, 폴리소르베이트) 및 항산화제(예를 들어, 비술파이트 및 아스코르베이트)이다. 보조제는 일반적으로 0.001 내지 4%w/v의 농도로 존재한다. 제약학적 제조물은 또한 프로테아제 억제제, 예를 들어 아프로니틴 및 보존제를 함유할 수 있다.
제조물은, 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 조성물에 멸균제를 조합함에 의해, 조성물을 조사함에 의해, 또는 조성물을 가열함에 의해 멸균될 수 있다. 또한, 그것들은 멸균 고체 조성물의 형태로 제조될 수 있으며, 이것은 멸균수, 또는 사용전 또는 사용전 즉시 주사하기에 적합한 어떤 다른 멸균 배지에 용해될 수 있다.
상이한 양태들로서, 본 발명은 다음에 관한 것이다.
세포에 있는 적어도 한 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서,
a) 상기 세포와 인자 VII(a) 또는 조직 인자 길항제를 접촉시키는 단계,
b) 상기 세포에 있는 상기 유전자의 발현을 측정하는 단계
를 포함하는 방법
상기 세포가 섬유아세포 및 평활근세포를 포함하는 조직 인자를 발현하는 사람 혈관 세포인 상기 방법.
상기 유전자가 Cyr61, CTFG, 도파민 D2 리셉터, EST Incyte PD 395116 또는 P2U 뉴클레오티드 리셉터로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
상기 조직 인자 길항제가 인자 VIIai로서 공지된 변형 인자 VII(a)인 방법.
상기 유전자의 발현을 증진하는 방법.
상기 유전자의 발현을 억제 또는 최소화하는 방법.
세포와 인자 VIIa를 접촉시키는 것을 포함하는 상기 유전자의 발현을 증진하는 방법.
세포와 FVIIai로서 공지된 변형 인자 VII를 접촉시키는 것을 포함하는 상기 유전자의 발현을 억제하는 방법.
상기 유전자가 EST PD674714인 방법.
세포 이동을 조절하는 방법으로서,
a) 상기 세포와 인자 VIIa 또는 조직 인자 길항제를 접촉시키는 단계;
b) 상기 세포의 이동을 측정하는 단계
를 포함하는 방법.
상기 세포가 섬유아세포, 평활근세포, 종양 세포, 조혈 세포 및 상피 세포를 포함하는 조직 인자를 발현하는 사람 세포인 방법.
조직 인자 길항제가 인자 VIIai로서 공지된 변형 인자 VIIa인 방법.
변형 인자 VII가 Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤으로부터 선택되는 방법.
세포와 FVIIa 또는 조직 인자 아고니스트를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 이동을 증진하는 방법.
세포와 조직 인자 길항제를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 이동을 감소 또는 억제하는 방법.
인자 VIIa 또는 조직 인자 아고니스트를 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 상처 치유를 유도 또는 증진하는 방법.
세포와 유효량의 조직 인자 길항제를 접촉시키는 것을 포함하는 종양 세포의 침입을 억제하는 방법.
조직 인자 길항제를 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 바람직하지 않은 세포 이동, 침입, 이동-유도 세포 증식 또는 맥관형성에 관련된 질환 또는 상태를 가지고 있는 환자에서 세포 이동, 침입, 이동 -유도 세포 증식 또는 맥관형성을 억제하는 방법.
질환 또는 상태가 원발성 종양 성장, 종양 침입 또는 전이인 방법.
조직 인자 길항제가 FVIIai로서 공지된 변형 인자 VII인 방법.
세포 이동을 조절하는 약제의 제조를 위한 인자 VIIa 또는 조직 인자 길항제의 사용.
인자 VIIa가 세포 이동을 증진하는 약제의 제조를 위해 사용되는 사용.
조직 인자 길항제가 세포 이동을 감소 또는 억제하는 약제의 제조를 위해 사용되는 사용.
조직 인자 길항제가 인자 VIIai로서 공지된 변형 인자 VIIa인 방법.
변형 인자 VII가 Dansyl-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, Dansyl-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤으로부터 선택되는 사용.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 예시되지만, 보호의 범위를 한정하는 것은 아니다. 앞의 설명 및 다음의 실시예에 개시된 특징은 분리하여 그리고 그것들의 어떤 조합으로 다른 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료일 수 있다.
도 1a 및 도 1b: 섬유아세포에서 TF 발현의 유동 세포계수법 분석(1a). 세포는 음성 대조표준으로서 사용된 뮤린 단일클론성 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)-콘쥬게이트 마우스 항 IgG-항체(채워지지 않은 영역) 또는 단일클론성 FITC-콘쥬게이트 항-조직 인자(TF) 항체(채워진 영역)로 염색되었다. 도 1b는 섬유아세포의 전응고제 활성을 나타낸다. TF 발현이 있는 섬유아세포는 TF 발현이 없는 단구세포와 비교하여 PCA에 10배 증가를 가져왔다.
도 2a: 사람 섬유아세포에서 PDGF-BB 유도 주화성에 대한 FVIIa 및 FFR-FVIIa의 효과. ■는 상이한 농도의 PDGF-BB에 대한 섬유아세포의 주화성 반응을 나타낸다. 섬유아세포는 상이한 농도의 PDGF-BB를 향해 이동되는 100nM FVIIa(●) 또는 100nM FFR-FVIIa(○)로 인큐베이션했다. 결과는 3번의 개별 실험에 대한 평균 및 SEM이다. 0.05 미만의 P-값 *가 통계적으로 의미 있게 고려되었다(스튜던트 t 테스트).
도 3a 내지 도 3d: 섬유아세포에서 PDGF-BB 유도 주화성에 대한 상이한 농도의 FVIIa 또는 FFR-FVIIa의 영향. ■는 상이한 농도의 PDGF-BB에 대한 섬유아세포의 이동을 나타낸다. 세포는 12.5(A), 25(B), 50(C) 및 100(D)nM FVIIa(●) 또는 FFR-FVIIa(○)로 인큐베이션되었고, 상이한 농도의 PDGF-BB를 향하여 보이덴 챔버에서 분석되었다. 결과는 3번의 상이한 실험에 대한 평균 및 SEM이다. * = p<0.05, ** = p<0.01 및 *** = p<0.001 스튜던트 t 테스트.
도 4a: 3개 단일클론성 항체와 TF의 혼합물은 섬유아세포에서 PDGF-BB 유도 주화성에 대한 FVIIa 및 FFR-FVIIa의 효과를 차단한다. ■는 TF 항체가 없는 섬유아세포의 PDGF-BB를 향한 이동을 나타내며, ●는 TF 항체 및 100 nM FVIIa로 사전 인큐베이션된 섬유아세포이고, ○는 TF 항체 및 100nM FFR-FVIIa로 사전 인큐베이션된 섬유아세포이다. 결과는 3번의 개별 실험에 대한 평균 및 SEM이다.
도 5a 및 도 5b: FVIIa에 의해 유도된 PDGF-BB에 대한 주화성 반응에 대한 FXa의 영향. 섬유아세포는 200nM TAP(도 5a, ■) 또는 0.2 내지 2μM TAP(도 5b, ■)로, 다음에 100nM FVIIa(●)로 사전 인큐베이션되었다. TAP는 전체 실험 동안 존재했다. 주화성은 상이한 농도의 PDGF-BB(5a) 또는 0.1ng/ml PDGF-BB(5b)에 의해 유도되었다. 결과는 2개의 개별 실험에 대한 평균 및 SD이다.
도 6a: FVIIa에 의해 유도된 PDGF-BB에 대한 주화성 반응에 대한 트롬빈의 영향. 섬유아세포는 5U/ml(최종 농도) 히루딘으로, 다음에 100nM FVIIa로 사전 인큐베이션되었다. 히루딘은 전체 실험 동안 존재했다. 주화성은 상이한 농도의 PDGF-BB에 의해 유도되었다. ■는 히루딘만으로 인큐베이션된 세포를 나타내고, ●는 히루딘 및 FVIIa로 인큐베이션된 세포를 나타낸다. 결과는 2번의 개별 실험에 대한 평균 및 SD이다.
도 7a: FVIIa로 인큐베이션된 섬유아세포에서 주화성에 대한 PI3'-키나제의 억제 효과. 세포는 37℃에서 30분간 LY294002의 농도를 변화시키면서, 다음에 100nM FVIIa로(●) 또는 FVIIa 없이(■) 사전 인큐베이션되었다. 억제제는 주화성 분석 동안 내내 존재했다. 주화성은 0.1ng/ml PDGF-BB에 의해 유도되었다. 결과는 2번의 개별 실험에 대한 평균 및 SD이다.
도 8a 및 도 8b: FVIIa로 인큐베이션된 섬유아세포에서 주화성에 대한 PLC의 억제 효과. 세포는 37℃에서 30분간 U73122(활성 PLC 억제제, 8a) 또는 U73 343(불활성 대조표준, 8b)의 농도를 변화시키면서 인큐베이션된 후 100nM FVIIa로 또는 FVIIa 없이 인큐베이션되었고, 다음에 0.1ng/ml PDGF-BB의 농도 구배로 보이덴 챔버에서 분석되었다. 제제들은 전체 실험 동안 존재했다. ■는 U73122 또는 U73343만을 사용한 세포를 나타내고, ●는 U73122 또는 U73343 및 FVIIa를 사용한 세포를 나타낸다. 결과는 2번의 개별 실험에 대한 평균 및 SD이다.
도 9: FVIIa, FFR-FVIIa 단독으로, 또는 PDGF-BB와 조합하여 자극된 섬유아세포로부터의 이노시톨 트리포스페이트(IP3)의 유리. 세포는 myo[3H] 이노시톨로 밤새 표지되었고, 10ng/ml 또는 100ng/ml PDGF-BB의 부재 또는 존재하에 100nM FVIIa 또는 FFR-FVIIa로, 또는 FVIIa 또는 FFR-FVIIa 없이 인큐베이션되었다. 다 음에, 세포는 IP3의 유리에 대해 분석되었다. 빈막대는 FVIIa 또는 FFR-FVIIa를 사용하지 않은 세포(대조표준)를 나타내고, 사선막대는 FFR-FVIIa를 사용한 세포를 나타내며, 검은막대는 FVIIa로 인큐베이션된 세포를 나타낸다.
도 10: PDGF-BB 단독(대조표준), PDGF-BB와 조합된 FVIIa 또는 FFR-FVIIa에 대한 반응에서 PLC-γ1의 티로신 인산화. 세포는 1시간 동안 100nM FVIIa 또는 FFR-FVIIa로, 다음에 나타낸 농도의 PDGF-BB로 또는 PDGF-BB 없이 인큐베이션되었다. 세포는 융해되었고 방법에 설명된 바와 같이 PLC-γ1의 티로신 인산화가 검출되었다.
도 1: cDNA 미소배열 분석으로 얻어진 데이타를 확인한 노던 블롯 분석. 10g의 총 RNA(cDNA 미소배열의 혼성화용 프로브를 발생시키도록 폴리 (A) RNA를 분리하는데 사용된 것과 동일한 RNA 샘플로부터)가 노던 블롯 분석되었고, 32P-표지 Cyr61(부분 길이 cDNA, Genomic Systems로부터 입수)로 검사되었다. 패널 B; 혼성화 신호는 PhosphorImager(Molecular Dynamics)로 정량된다.
도 2 및 2b: Cyr61의 시간-의존 인자 VIIa-유도 발현. WI-38 세포의 휴지 단일층이 시간을 변화시키면서 인자 VIIa(5g/ml, 2a) 또는 PDGF-BB(10ng /ml, 2b)로 처리되었다. 총 RNA(10g)가 노던 블롯 분석되었고, 방사성 표지된 Cyr61로 검사되었다. 상응하는 블롯의 28S 리보솜 RNA의 에티듐 브로마이드 염색이 RNA 로딩 대조표준으로서 패널 하부에 나타난다.
도 3: Cyr61의 용량-의존 인자 VIIa-유도 발현. WI-38 세포의 휴지 단일층 이 45분간 0, 0.1, 0.5, 2.0 및 5.0g/ml로 인자 VIIa의 용량을 변화시키면서 처리되었다. 총 RNA(10g)가 노던 블롯 분석되었고, 방사성 표지된 Cyr61로 검사되었다. 상응하는 블롯의 28S 리보솜 RNA의 에티듐 브로마이드 염색이 RNA 로딩 대조표준으로서 패널 하부에 나타난다.
도 4: 인자 VIIa 촉매 활성은 Cyr61의 유도 발현에 필요하다. WI-38 세포의 휴지 단일층이 대조표준 무혈청 배지 또는 인자 VIIa(5g/ml) 또는 활성-부위 불활성화 인자 VIIa(VIIai, 5g/ml)을 함유하는 무혈청 배지로 45분간 처리되었다. 총 RNA(10g)이 노던 블롯 분석되었고, 방사성 표지된 Cyr61로 검사되었다. 상응하는 블롯의 28S 리보솜 RNA의 에티듐 브로마이드 염색은 RNA 로딩 대조표준으로서 패널 하부에 나타난다.
도 5: Cry61의 인자 VIIa-유도 발현은 인자 Xa 및 트롬빈에 대한 특이적 억제제에 의해 없어지지 않는다. WI-38의 휴지 단일층이 45분간 대조표준 배지 또는 인자 VIIa(5g/ml; 100nM)를 함유하는 배지로 처리되었다. 세포는 30분간 200nM 재조합 TAP(레인 3) 또는 히루딘(레인 4)으로 사전 인큐베이션된 후 45분간 인자 VIIa에 노출되었다. 총 RNA(10g)가 노던 블롯 분석되었고, 방사성 표지된 Cyr61로 검사되었다. 상응하는 블롯의 28S 리보솜 RNA의 에티듐 브로마이드 염색이 RNA 로딩 대조표준으로서 패널 하부에 나타난다.
도 6: 인자 VIIa-유도 Cyr61 mRNA 정류-상태 레벨에 대한 액티노마이신-D 및 시클로헥시미드의 효과. WI-38 세포의 휴지 단일층이 30분간 대조표준 부형제, 액티노마이신-D(10g/ml) 또는 시클로헥시미드(10g/ml)로 사전 인큐베이션된 후, 세 포가 45분간 인자 VIIa(5g/ml)에 노출되었다. 총 RNA(10g)가 노던 블롯 분석되었고, 방사성 표지된 Cyr61로 검사되었다. 상응하는 블롯의 28S 리보솜 RNA의 에티듐 브로마이드 염색이 RNA 로딩 대조표준으로서 패널 하부에 나타난다.
도 7: 인자 VIIa는 CTGF의 발현을 유도한다. WI-38 세포의 휴지 단일층이 시간을 변화시키면서 인자 VIIa(5g/ml)로 처리되었다. 총 RNA(10g)가 노던 블롯 분석되었고, 방사성 표지된 CTGF로 검사되었다. 상응하는 블롯의 28S 리보솜 RNA의 에티듐 브로마이드 염색이 RNA 로딩 대조표준으로서 나타난다.
실시예 1
FVII의 제조
본 발명에 사용하기 적합한 사람의 정제된 인자 VIIa를 바람직하게 DNA 재조합 기법에 의해, 예를 들어 Hagen 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83; 2412-2416, 1986 또는 유럽 특허 번호 200.421(ZymoGenetics)에 설명된 바와 같이 만든다. 재조합 기법에 의해 생성된 인자 VIIa는 신뢰할 만한 인자 VIIa 또는 다소간 변형된 인자 VIIa일 수 있다. 단, 그러한 인자 VIIa는 신뢰할 만한 인자 VIIa와 혈액 응고에 대한 동일한 생물학적 활성을 갖는다. 그러한 변형 인자 VIIa는 공지된 수단, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 자연적 FVII를 코드화하는 핵산 서열에 있는 아미노산 코돈을 변경하거나 또는 아미노산 코돈 중 일부를 제거함에 의해, 인자 VII를 코드화하는 핵산 서열을 변형시킴으로써 생성할 수 있다.
또한, 인자 VII는 Broze 및 Majerus, J. Biol. Chem. 255(4): 1242-1247, 1980 및 Hedner 및 Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983에 의해 설명된 방법에 의해 생성할 수 있다. 이들 방법으로 검출가능한 양의 다른 혈액 응고 인자 없이 인자 VII를 얻는다. 더욱 더 정제된 인자 VII 제조물을 최종 정제 단계로서 추가의 겔 여과를 포함함에 의해 얻을 수 있다. 다음에, 인자 VII를 공지된 수단, 예를 들어 몇개의 상이한 혈장 단백질, 예컨대 인자 XIIa, IXa 또는 Xa에 의해 활성화 FVIIa로 전환한다. 또는 달리, Bjoern 등(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에 의해 설명된 바와 같이, 인자 VII를 Mono Q 
(Pharm acia fine Chemicals) 등과 같은 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜 활성화할 수 있다.
실시예 2
FVIIai의 제조
본 발명에 사용하기 적합한 변형 인자 VII를, 예를 들어 국제 공보 번호 92/15686, 94/27631, 96/12800 및 97/47651(ZymoGenetics/Novo Nordisk)에 설명된 바와 같이 제조한다.
실시예 3
PDGF-BB에 대한 섬유아세포의 주화성 반응에 대한 FVIIa 및 FFR-FVIIa의 효과
활성 TF를 발현하는 섬유아세포(도 1a 및 도 1b)를 100nM의 FVIIa로 인큐베이션하고, 상이한 농도로 10% FBS 및 PDGF-BB를 함유하는 배지를 150㎛ 마이크로포어 필터 아래에 첨가하면서 변형된 보이덴 챔버의 상부에 접종했다. PDGF-BB 없이 10% FBS를 함유하는 배지가 필터 아래에 첨가된 조건하에서 세포의 이동을 무작위 이동의 측정으로서 사용하고, 100% 이동으로 계산했다. FVIIa와 리게이션되지 않은 세포에 대한 1ng/ml PDGF-BB와 비교하여, FVIIa에 의해 자극된 세포에 있어 0.01ng/ml PDGF-BB 농도에서, 즉 100배 차이의 농도에서 의미 있는 이동 반응을 기록했다(도 2a). 0.01 내지 0.1ng/ml PDGF-BB에서, FVIIa에 대한 이동 반응은 용량 의존적으로 증가했으며, 25nM FVIIa에서 시작하고, 50 내지 100 FVIIa에서 최대 효과를 가졌다(도 3a 내지 도 3d). FVIIa로 활성화한 후 무작위 이동의 증진은 관찰되지 않았다. 단백질 분해 활성 FVIIa가 PDGF-BB에 대한 초주화성 반응에 필수적인지의 여부를 시험하기 위해서, 섬유아세포를 또한 100nM FFR-FVIIa로 인큐베이션하고, 동일한 방식으로 보이덴 챔버에서 분석했다(도 2a). 0.01 내지 1ng/ml의 낮은 농도의 PDGF-BB에서 FFR-FVIIa를 사용하여 증가된 주화성은 관찰되지 않았다. 반대로, 10 내지 50ng/ml PDGF-BB에 의해 유도된 주화성의 명백한 억제가 100nM FFR-FVIIa에 의해 달성되었다(도 2a 및 도 3a 내지 도 3d). 섬유아세포를 3개의 상이한 TF 항체의 혼합물로 사전 인큐베이션한 후 FVIIa 또는 FFR-FVIIa로 인큐베이션했을 때, PDGF-BB에 대한 이동 반응은 TF에 결합된 리간드가 존재하지 않는 섬유아세포의 반응과 동일했다(도 4a). 부적절한 단일클론 IgG 항체는 FVIIa에 의해 유도된 초주화성을 방지하지 않았고, FFR-FVIIa에 의해 유도된 이동 반응도 억제하지 않았다(데이타 나타내지 않음). IgG 항체 또는 3개의 TF 항체의 존재는 섬유아세포의 무작위 이동을 변화시키지 않았다(데이타 나타내지 않음).
실시예 4
초주화성 반응은 FXa 또는 트롬빈에 의해 매개되지 않는다
PDGF-BB에 대한 초주화성 반응을 가져오는 FVIIa-유도 신호 변환이 FVIIa의 촉매 활성에 의존했으므로, 이것은 신호화가 직접적으로, 또는 FVIIa/TF 복합체에 의해 발생된 FXa 또는 트롬빈에 의하여 발생되었는지의 여부를 측정하는데 중요하다. FVIIa/TF에 의해 변환된 증진된 이동 반응은 Fxa의 활성 부위를 특이적으로 차단하고, 트롬빈 형성을 가져오는 응고 캐스캐이드의 더 이상의 활성화를 방지하는 0.2 내지 10μM Tick 항응고제 펩티드(TAP)에 의해 차단되지 않았다(도 5a, 5b). 특이적 트롬빈 억제제인 히루딘 5U/ml의 첨가는 FVIIa/TF 유도 초주화성에 대해 어떤 효과도 가지지 않았다(도 6a). TAP 및 히루딘은 리간드 FVIIa가 존재하지 않는 PDGF에 대한 반응에서 섬유아세포의 이동에 영향을 미치지 않았다(도 5a, 5b, 6a). 따라서, 주화성에 대한 FVIIa의 효과는 FX 또는 트롬빈의 활성화에 의하여 매개되지 않는 것 같다.
실시예 5
PDGF-BB에 대한 초주화성 반응은 PLC-의존 경로에 의해 영향 받지만, PI3'-키나제로부터는 독립적이다.
PI3'-키나제의 활성화는 최근 PDGF β-리셉터 유도 주화성에 중요하다고 나타났다. 따라서, 우리는 특이적 PI3'-키나제 억제제인 LY294002가 FVIIa/TF 신호화에 의해 유도된 주화성 반응을 차단할 수 있는지의 여부를 조사했다. 섬유아세포를 37℃에서 30분간 나타낸 농도의 LY294002로 전처리한 후 100nM FVIIa를 첨가하고, 설명된 바와 같이 보이덴 챔버에서 분석했다. PDGF-BB의 농도는 분석 동안 내내 0.1ng/ml, 즉 FVIIa/TF가 의미 있는 주화성 반응을 유도하는 대단히 낮은 농도로 일정하게 유지했다. LY294002는 전체 실험 동안 존재했다. 도 7a는 FVIIa /TF-신호화에 의해 매개된 PDGF-BB에 대한 이동 반응이 PI3'-키나제의 억제에 의해 영향 받지 않는다는 것을 나타낸다.
FVIIa/TF-유도 주화성 반응이 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C(PL C)의 활성화를 수반하는지의 여부를 조사하기 위해서, 우리는 상이한 농도의 특이적 PLC-억제제인 U73122로 37℃에서 30분간 섬유아세포를 사전 인큐베이션한 후 100nM FVIIa를 첨가했다. 다음에, 세포를 억제제의 존재하에 주화성 분석했다. PLC에 대한 효과가 없는 가까운 유사체인 U73343을 음성 대조표준으로 사용했다. PDGF-BB의 농도는 이들 실험에서도 0.1ng/ml로 일정하게 유지했다. 활성 PLC-억제제 U73122를 사용한 세포의 전처리는 1μM에서 총 억제를 갖는 용량-의존 방식으로 0.1ng/ml PDGF-BB에 대한 초주화성 반응을 억제했다(도 8a 및 8b). 불활성 유사체 U73343을 사용했을 때는 주화성에 대한 효과가 관찰되지 않았다.
실시예 6
FVIIa/TF는 PLC의 활성화를 유도한다
초주화성 반응에 대한 PLC 활성의 중요성을 더 이상 탐구하기 위해서, 우리는 또한 섬유아세포에서 PLC 활성에 대한 FVIIa/TF의 직접적 효과를 분석했다. PLC의 활성화는 2개의 이차 메신저인 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤의 생성을 가져온다. 섬유아세포를 myo[3H] 이노시톨로 밤새 인큐베이션 한 후, 60분간 100nM FVIIa 또는 FFR-FVIIa로 인큐베이션하고, 이어서 나타낸 농도의 PDGF-BB로 또는 PDGF-BB 없이 인큐베이션했다. 60분간 100nM FVIIa 만을 사용한 처리는 10ng/ml 및 100ng/ml PDGF-BB 만을 사용한 것과 동일한 레벨로 섬유아세포에서 IP3 유리를 유도했다(도 9). 더욱이, 100nM FVIIa 및 10ng/ml 또는 100ng /ml PDGF-BB의 조합은 IP3를 2배로 유리했다. 활성-부위 억제 FVIIa는 IP3의 유리를 유도하지 않았다. 이들 결과는 PLC가 FVIIa와 TF의 결합에 의해 활성화된다는 것을 분명히 나타낸다.
실시예 7
PLC-γ1의 인산화는 섬유아세포에서 TF/FVIIa 신호화에 의해 증진되지 않는다
어떤 티로신 키나제 리셉터에 의해 활성화되는 PLC-γ1 동형이 FVIIa/TF에 의해 유도된 PLC 활성의 증가를 초래했는지의 여부를 측정하기 위해서, PLC-γ1의 티로신 인산화를 연구했다. 섬유아세포를 1시간 동안 100nM FVIIa 또는 FFR-FVIIa의 부재 및 존재하에서 인큐베이션하고, 이어서 0, 2, 10 또는 100ng/ml PDGF-BB로 자극했다. 인큐베이션 5분 후, 세포를 융해하여 PLC-γ1를 면역침전시키고, SDS-PAGE에 의해 분리하여 항포스포티로신 항체로 면역블롯했다. PLC-γ1의 티로신 인산화에 의미 있는 증가가 PDGF-BB의 농도를 증가시킴에 따라 기록된 반면, 섬유아세포에 FVIIa 만의 첨가는 PLC-γ1의 어떤 티로신 인산화도 유도하지 않았다(도 10). 더욱이, 상이한 농도의 FVIIa과 PDGF-BB의 조합은 PDGF-BB 만으로 자극한 것 과 비교하여 어떤 더 이상의 인산화를 유도하지 않았다(도 10). FFR-FVIIa는 PLC-γ1 티로신 인산화에 대한 효과를 가지지 않았다(도 10). 따라서, PLC-γ1 이외의 다른 PLC 동형이 FVIIa 자극 후 PLC 활성화의 증가를 초래한다.
실시예 8
방법
세포 배양
사람 포피 섬유아세포 AG1518 및 AG1523을 10% 태아소혈청(FBS)으로 보충된 Eagle's MEM에서 합류점까지 성장시켰다. 사용전, 세포를 트립신화(37℃에서 10분간 2.5mg/ml)에 의해 분리하고, Hank's 균형 염용액으로 세척하고, 10% FBS를 갖는 Eagle's MEM 또는 0.1% FBS로 보충된 Ham's 배지에 재현탁했다.
단백질
사람 FVIIa(Novo Nordisk A/S, Gentofte, Denmark)를 설명된 바와 같이 발현 및 정제했다29. FFR-FVIIa(Novo Nordisk)를 D-Phe-L-Phe-L-Arg 클로로메틸 케톤을 사용하여 활성 부위에 있는 FVIIa를 차단함으로써 얻었다. 재조합 Tick 항응고제 펩티드(TAP)는 Dr. P. Vlasuk, Corvas(San Deigo, CA)가 제공했다. 히루딘은 Sigma로부터 구입했다. LY294002, U73122 및 U73343을 Biomol(Plymouth Meetin g, PA)로부터 얻었다. 항-TF 단일클론 항체인 TF8-5G9, TF9-5B7 및 MTFH-1(Morriss ey, J. H., Fair, D. S., Edgington, T. S. Monoclonal antibody analysis of puri fied and cell-associated tissue factor. Thromb. Res. 52, 247-261(1988))은 Dr. James H. Morrissey, Oklahoma Medical Research Foundation으로부터 얻었다. 포스포티로신 항체 PY99를 Santa Cruz, California로부터 얻었다.
유동 세포계수법
TF의 표면 발현을 유동 세포계수법을 사용하는 면역형광에 의해 분석했다 (Coulter Epics XL-MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, Coulter Electronics, USA). 기계는 Immuno-CheckTM 또는 Flow CheckTM 캘리브레이션 비드(Coulter)를 사용하여 매일 캘리브레이션했다. 간접적인 면역형광 실험을 위하여, AG1518 또는 AG1523 섬유아세포를 0.1% 소혈청 알부민(BSA)를 함유하는 PBS로 2번 세척하고, 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC)-표지 항-사람 TF 단일클론 항체(4508CJ, American Diagnostica, Greenwich, Ct. USA)로 얼음상에서 30분간 인큐베이션했다. 항-아스페르길루스 니거 글루코스 옥시다제 단일클론 IgG1(Dakopatts)를 음성 대조표준으로 사용했다. 평균 채널 형광 강도(MFI) 및 양성 세포 퍼센트를 각 샘플에 대해 측정했다.
TF 활성의 측정
TF의 전응고제 활성을 Lindmark 등(Lindmark, E., Tenno, T., Chen, J., Sie gbahn, A. IL-10 inhibits LPS-induced human monocyte tissue factor expression in whole blood. Br. J. Haematol. 102, 597-604 (1998))에 의해 설명된 바와 같이 측정했다. 간단히 말해서, 0.2×105 AG1518 또는 AG1523 섬유아세포를 함유하는 알리쿼트를 PBS로 2번 세척하고, 96-웰 마이크로플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark) 의 웰에 두었다. 색소 생산 기질인 S-2222(Chromogenix, Molndal, Sweden)가 FXa에 의해 절단되고, 이것이 차례로 TF/FVIIa 복합체에 의해 FX로부터 활성화되는 경우, 전응고제 활성을 2-단계 아미도 가수분해 분석으로 측정했다. 최종 농도 0.6m M의 S-2222, 2mM CaCl2, 및 최종 농도 1U/ml FVII 및 1.2U/ml FX의 인자 농축물 Prot hromplex-TTM TIM4(Baxter, Vienna, Austria)로부터의 응고 인자를 함유하는 반응 혼합물을 웰에 가하고, 37℃에서 30분 인큐베이션한 후 405nm에서의 흡광도 변화를 측정했다. 측정은 3번 행했다.
주화성 분석
섬유아세포의 이동 반응을 이전에 설명된 바와 같은 변형된 보이덴 챔버에서 선도적인 기법에 의하여 분석했다(Siegbahn, A., Hanimacher, A., Westermark, B., Heldin, C-H. Differential effects of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes, and granulocytes. J. Clin. Invest. 85, 916-920 (1990) 및 Nister, M., Hammacher, A., Mellstrom, K., Siegbahn, A., Ronnstrand, L., Westermark, B., Heldin, C-H. A glioma-derived PDGF A chain homodimer has different functional activities from a PDGF AB heterodimer purified from human platelets. Cell 52, 791-799 (1988)). 마이크로포어 필터(포어 사이즈 8㎛)를 실온에서 1-형 콜라겐 용액으로 밤새 코팅했다. 필터를 사용하기 바로 전에 30분간 공기 건조시켰다. 사람 포피 섬유아세포 AG1523을 10% FBS로 보충된 Eagle's MEM에서 합류점까지 성장시켰다. 세포를 트립 신화(37℃에서 10분간 2.5mg/ml)에 의해 분리하고, 10% PBS를 갖는 Eagle's MEM에 현탁했다. 섬유아세포를 분석전에 FVIIa 또는 FFR-FVIIa로 또는 FVIIa 또는 FFR-FVIIa 없이 10분간 인큐베이션했다. 세포 현탁액(2×105세포/ml) 100㎕를 보이덴 챔버의 필터 위에 첨가했다. PDGF-BB를 분석 배지(10% PBS를 갖는 Eagle's ME M)로 희석하고, 챔버의 필터 아래에 첨가했다. 세포를 95% 공기/5% CO2를 함유하는 가습된 챔버에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션했다. FVIIa 또는 FFR-FVIIa는 전체 실험 동안 존재했다. 다음에, 필터를 떼어내어 에탄올에 고정시키고, Mayer' s Hemalun으로 염색하고 장착했다. 초점이 맞는 한 하이-파워 필드(12.5×24)의 가장 멀리 이동한 2개의 섬유아세포 핵의 거리로서 이동을 측정했다. 각 필터에서 이동 거리는 필터의 적어도 3개의 상이한 부분에 대한 해석의 평균으로서 계산했다. 실험을 화학유인제의 각 농도에 대해 2개 내지 4개의 개별 필터를 사용하여 수행했다. 각 세트의 실험에 있어서, 분석 배지를 향한 섬유아세포의 이동을 대조표준으로서 사용했다.
항-TF 단일클론 항체 또는 응고 인자에 대한 억제제인 TAP 및 히루딘을 사용했을 경우에는, 세포를 이들 제제로 10분간 사전 인큐베이션하고, 다음에 FVIIa 또는 FFR-FVIIa로 또는 FVIIa 또는 FFR-FVIIa 없이 인큐베이션한 후 주화성 분석을 수행했다. 항체, TAP 또는 히루딘 또한 전체 주화성 실험 동안 존재했다. 상이한 억제제들 LY294002, U73122 또는 U73343의 이동 반응에 대한 효과를 시험한 실험에서는 세포를 나타낸 농도의 억제제로 10분간 사전 인큐베이션했다. 이 억제제들 또한 실험 동안 내내 존재해다.
이노시톨 트리포스페이트(IP
3
)의 유리에 대한 분석
AG1518 사람 섬유아세포의 반-합류 배양물을 갖는 6-웰 플레이트를 0.1% FBS를 갖는 2ml Ham's F12 중의 myo[3H] 이노시톨(Amersham) 2μCi로 밤새(대략 20시간) 인큐베이션했다. 배지를 0.1% FBS를 갖는 Ham's F12(2mM CaCl2 함유) 및 20mM LiCl로 교환하고, 세포를 37℃에서 15분간 인큐베이션했다. 다음에, 세포를 1시간 동안 100nM FVIIa 또는 100nM FFR-FVIIa의 부재 및 존재하에 인큐베이션했다. PDGF-BB(0, 10 또는 100ng/ml)를 가하고, 37℃에서 10분간 인큐베이션을 계속했다. IP3 분석을 이전에 Eriksson 등에 의해 설명된 바와 같이 수행했다(Eriksson, A., Nanberg, E., Ronnstrand, L., Engs trom, U., Hellman, U., Rupp, E., Carpenter, G., Heldin, C-H., Claesson-Welsh, L. Demonstration of functionally different interactions between phospholipase C-γ and the two types of platelet-derived growth factor receptors. J. Biol. Chem. 270, 7773-7781 (1995)).
아고니스트-유도 PLC-γ1 인산화에 대한 분석
AG1518의 반-합류 배양물을 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 밤새(대략 20시간) 혈청 결핍시키고, 다음에 1시간 동안 100nM FVIIa 또는 FFR-FVIIa의 부재 또는 존재하에 인큐베이션하고, 이어서 37℃에서 5분간 0, 2, 10 또는 100ng/ml PDGF -BB로 인큐베이션했다. 세포를 융해하고, 소 PLC-γ1(Artega, C. L., Johns on, M. D., Todderud, G., Coffey, R. J., Carpenter, G., Page, D. L. Elevated content of the tyrosine kinase substrate phospholipase C-γ1 in primary human breast carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10435-10439 (1991))의 카르복시말단에 상응하는 펩티드로 토끼를 면역화함에 의해 발생된 항-PLC-γ1 항혈청을 사용하여 본질적으로 이전에 설명된 바와 같이(Hansen, K., Johnell , M., Siegbahn, A., Rorsman, C., Engstrom, U., Wernstedt, C., Heldin, C-H., Ronnstrand, L., Mutation of a Src Phosphorlyation site in the PDGF β-receptor leads to increased PDGF-stimulated chemotaxis but decreased mitogenesis. EMBO J. 15, 5299-5313 (1996)), PLC-γ1를 침전시켰다. 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 포스포티로신 항체 PY99를 사용하여 면역블롯시켰다.
통계적 분석
데이타를 윈도우 팩키지(StatSoft, Tulsa, Okla, USA)용 Statistica TM을 사용하여 분석했다. 의존성 샘플에 대한 스튜던트 t-테스트를 상이한 데이타 세트들 사이의 통계적 의미를 측정하기 위해 사용했다. <0.05의 P 값이 통계적으로 의미 있게 고려되었다.
단백질
Novo Nordisk(Gentofte, Denmark)로부터의 재조합 사람 VIIa를 1 내지 1.3mg /ml의 농도로 멸균수에서 복원했다. 스톡 VIIa 용액을 리물루스 아메바성세포 여액(Bio Whittaker)을 사용하여 미량 레벨의 내독소를 오염시키는지에 대해 조사했지만 아무것도 검출되지 않았다(검출 레벨 30pg). 재조합 Tick 항응고제 단백질 (TAP)은 George Vlasuk(Corvas, San Diego, CA)으로부터 제공받았고, 재조합 히루 딘은 Sigma(St. Louis, MO) 또는 Calbiochem(San Diego, CA)부터 얻었다. 정제된 사람 인자 Xa 및 트롬빈은 Enzyme Research Laboratories(Southbend, IN)으로부터 얻었다.
cDNA 미소배열
WI-38 웰을 80% 합류성까지 배양하고, 혈청을 24시간 동안 제거하여 상기 설명된 바와 같은 휴지 상태에 들어갔다. 배양 배지를 신선한 무혈청 DMEM(5mM CaCl2로 보충)로 교환하고, 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 안정화시켰다. 다음에, 세포를 정제된 재조합 VIIa(5㎍/ml)로 90분간 처리했다. 90분 처리의 마지막에 총 RNA를 Trizol(GZBCO BRL)을 사용하여 미처리(대조표준) 및 VIIa 처리 세포로부터 분리했다. 폴리 (A) RNA를 제조자의 기법 고시에 설명된 바와 같이 Oligo Tex mRNA 분리 칼럼(Qiagen)을 이중 통과시켜 정제했다. 대조표준 및 VIIa-처리 세포로부터의 고도로 정제된 폴리 (A) RNA 800ng을 cDNA 미소배열 분석 서비스(Human UniGEM V microarray, Genome System Inc, St. Louis, MO)로 보냈다.
노던 블롯 분석
총 RNA를 VIIa 및 결과에 설명된 바와 같은 다른 물질에 노출된 WI-38 세포의 휴지 단일층으로부터 TRIZOL 시약을 사용하여 제조했다. 노던 블롯 분석을 표준 과정을 사용하여 실시했다. 간단히 말해서, 총 RNA 10㎍을 1% 아가로스/6% 포름알데히드겔의 겔 전기영동에 의해 크기 분별하고, 모세관 블롯 방법에 의해 니트로셀룰로스 멤브레인위로 옮겼다. 노던 블롯을 42℃에서 50% 포름아미드, 5×SSC, 50mM 트리스 HCl pH 7.5, 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 1% SDS, 1% 폴리비닐피롤리돈, 1% 피콜, 25mM EDTA, 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA 및 1% BSA를 함유하는 용액으로 예비혼성화하고, 32P-표지 Cyr61 cDNA 프로브(106cpm/ml)로 혼성화했다. 혼성화된 멤브레인을 Dupont NEF 또는 Fuji RX X-선 필름에 노출시켰다. 정량을 위해서, 멤브레인을 1 내지 4시간 동인 인광물질 스크린에 노출시키고, 노출된 스크린을 "Image-quant" 소프트웨어를 사용하여 Phosphorlmger(Molecular Dynamics)에서 분석했다. 평균값을 얻기 위해서, 상이한 실험으로부터 얻어진 유니트(수)를 내부 대조표준(대조표준-처리 샘플에 존재하는 수)으로 정규화했다.
색소 생산 분석
WI-38 세포를 96-웰 배양 플레이트에서 배양하고, 그것들을 상기 설명된 바와 같이 휴지로 만들었다. 세포를 세척한 후, 칼슘 1.00㎍ 함유 완충액중의 FVIIa (5㎍/ml)를 세포를 함유하는 배양 웰 또는 완충액으로 코팅된 웰(세포 없음)에 가했다. 30분 인큐베이션 후, 인자 Xa 및 트롬빈에 대한 색소 생산 기질, 즉 Chromozym X 및 Chromozym TH 25㎍을 웰에 가했다. 색 발생 3시간 후, 플레이트를 마이크로플레이트 리더에서 해석했다. 대조표준으로서, 세포를 인자 Xa(50 내지 0.1ng/ml) 또는 트롬빈(0.1 내지 0.002U/ml)의 미량 농도로 인큐베이션했다. 세포에 첨가된 VIIa, 또는 세포를 함유하지 않는 웰에 첨가된 VIIa 사이에 450nm에서 흡광도의 차이는 발견되지 않았다. 이 해석은 가장 낮은 농도의 인자 Xa 또는 트롬빈을 사용하여 얻은 해석 보다도 낮았으며, VIIa 색소 생산 활성을 나타낸다.
실시예 9
cDNA 미소배열
휴지 섬유아세포를 대조표준 무혈청 배지 또는 VIIa(5㎍/ml)로 보충된 무혈청 배지에 90분간 노출시켰다(각 처리에 대해 3개의 T-75 플라스크). 처리 후, 총 RNA를 수집하고, 폴리 (A) RNA를 분리했다. mRNA 600ng을 Cy3 또는 Cy5 형광물질로 표지화한 후, 5,000까지의 공지된 사람 유전자를 나타내는, EST로 입증된 8,000 서열을 함유하는 UniGem Human V 칩에 혼성화시켰다(Genome System Inc에 의해 수행된 유료 서비스). 민감성을 측정하고 역전사 반응을 모니터하기 위해 공지된 농도의 기준 cDNA가 로브 발생 반응으로 스파이크된 대조표준 플레이트 정제는 혼성화 효능 및 혼성화 과정의 성공을 나타내는 분석의 질 및 성능에 대한 전체적인 견해를 결정한다. 실험 데이타의 전체적인 분석은 대조표준과 VII-처리 샘플 사이의 혼성화 신호에 있어 최소 차이를 밝혔다 - 단지 소수의 유전자만이 온건한 차등 발현을 나타냈다. 우리는 5개 유전자의 상향조절(VIIa 처리에서 3.5 내지 2배 더 높은)을 발견했고, 1개 유전자는 VIIa 처리에 의하여 하향조절(2.4배 더 낮은)되었다 (+/-2가 실제 비율의 최소 크기를 결정하기 위해 줄잡아 어림한 것이다). 3.5배 상향조절 유전자의 확인은 독점적인 성질로 인해 밝혀지지 않았다. 다른 VIIa-상향조절 유전자는 Cyr61(2.5배), 도파민 D2 리셉터(2.2배), EST Incyte PD 395116(2배) 및 P2U 뉴클레오티드 리셉터(2배)이다. Cyr61 패밀리에 속하는 유전자인 CTGF가 대조표준 세포와 비교하여 VIIa-처리 세포에서 1.8배 더 높았다는 것을 주지하는 것은 흥미롭다. VIIa-처리 세포에서 하향조절된 전사체는 EST PD674714였다. 우리는 더 이상의 분석을 위해 Cyr61을 선택했다.
실시예 10
Cyr61
의 차등 발현의 확인
미소배열에서 얻어진 데이타를 유효화하기 위해서, 우리는 대조군 및 VIIa-처리 세포로부터의 RNA 샘플(미소배열에서 프로브 발생을 위한 폴리 (A) RNA를 제조하는데 사용했던 것과 동일한 RNA 샘플)을 노던 블롯 분석하고, 방사성 표지된 Cyr61 cDNA로 검사했다. 데이타는 Cyr61 cDNA 프로브가 대조표준 및 VIIa-처리 세포로부터 분리된 RNA의 단일 전사체(대략 2.0kb)에 혼성화했다는 것을 나타낸다. 그러나, 혼성화 신호의 강도는 VIIa-처리 세포로부터 분리된 RNA에서 매우 더 높았다(도 1). 혼성화 신호의 정량은 Cyr61의 발현이 대조표준 처리 세포에 비하여 VIIa에 노출된 세포에서 2.8배 더 높았음을 밝혔다.
실시예 11
Cyr61
의 VIIa-유도 발현의 동력학
Cyr61 발현의 동력학을 측정하기 위해서, 휴지 섬유아세포를 5㎍/ml VIIa로 시간을 변화시키면서 처리했다. 총 RNA를 추출하고 노던 블롯 분석했다. 도 2에 나타낸 바와 같이, Cyr61 발현은 VIIa-처리 세포에서 시간-의존 방식으로 증가했다. 발현은 약 45분에서 최고였고, 이후 2 내지 3시간에서 베이스 레벨까지 떨어졌다. 혈청 및 성장 인자로 자극 후에 마우스 섬유아세포에서 Cyr61의 발현이 수시간 동안 지속된다고 보고되었으므로, 우리는 휴지 사람 섬유아세포 WI-38에서 Cyr61 발현의 동력학에 대한 혈청 및 PDGF의 효과를 시험했다. 도 2b에 나타낸 바 와 같이, Cyr61은 PDGF를 사용한 자극에 의하여 단지 일시적으로만 발현되고, 자극의 추가 후 2시간에 완전히 억제된다. 유사한 결과를 Cyr61의 혈청-유도 발현에서 얻었다(데이타 나타내지 않음).
실시예 12
Cyr61
의 인자 VIIa-용량 의존 유도 발현
VIIa의 용량-의존성을 측정하기 위해서, 휴지 섬유아세포를 FVIIa의 용량을 변화시키면서(0.1 내지 5㎍/ml) 45분간 처리하고, 다음에 세포로부터의 총 RNA 샘플을 노던 블롯 분석했다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 0.1㎍/ml FVIIa 만큼 낮은 농도를 사용한 섬유아세포의 처리는 Cyr61의 발현을 유도하는데 충분했고, FVII(a) (0.5㎍/ml, 10nM)의 혈장 농도는 최대치에 가까운 탁월한 반응을 가져왔다.
실시예 13
인자 VIIa 촉매 활성은
Cyr61
유도에 필요하다
VIIa 촉매 활성이 Cyr61의 유도에 필요한지의 여부를 시험하기 위해서, WI-38 세포를 45분간 VIIa 및 활성-부위 불활성화 FVIIa(FVIIai)로 처리하고, Cyr61의 발현을 노던 블롯 분석에 의해 평가했다. 도 4에 나타낸 바와 같이, FVIIai는 Cyr61의 발현을 유도하지 못했고, 이것은 FVIIa 단백질 분해 활성의 필요성을 시사한다. 이와 관련하여, FVIIai가 FVIIa와 동일하거나 더 높은 친화성으로 세포 표면 TF를 결합시키는 것으로 나타났다는 점이 중요할 수 있다. 우리 실험에서 Cyr61의 VIIa-유도 발현이 하류 응고 인자 FXa 및 트롬빈 발생의 결과였던 것 같지는 않다. 감응성 색소 생산 분석을 사용하여, 우리는 우리 실험 시스템(검출 감도 10pg)에서 인자 Xa 및 트롬빈 발생에 대한 증거를 발견하지 못했다. 더욱이, 인자 Xa 및 트롬빈에 대한 특이적 억제제, 즉 Tick 항응고제 단백질 및 히루딘은 각각 Cyr61의 VIIa 유도 발현을 없애는데 실패했다(도 5).
실시예 14
VIIa에 의한 Cyr61 mRNA 정류-상태 레벨의 유도에 대한 전사 메카니즘의 연관
전사가 mRNA 정류-상태 레벨의 VIIa-매개 증가에 연관되는지의 여부를 조사하기 위해서, 휴지 WI-38 세포를 액티노마이신-D(10㎍/ml)로 30분간 인큐베이션한 후, VIIa를 첨가하여 45분간 인큐베이션했다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 액티노마이신-D는 VIIa의 자극성 효과를 억제했다. 이 발견은 Cyr61의 유도에 대한 전사 메카니즘을 나타낸다.
새로운 단백질 합성이 VIIa에 의한 Cyr61 nRNA의 유도에 필요한지의 여부를 조사하기 위해서, WI-38 세포를 단백질 합성 억제제 시클로헥시미드로 전처리한 후 45분간 VIIa에 노출시켰다. 도 6에 나타낸 바와 같이, VIIa의 자극성 효과는 시클로헥시미드에 의해 차단되었다. 실제로, 시클로헥시미딘은 VIIa 유도 Cyr61 mRNA 정류-상태 레벨을 현저하게 증가시켰다.
Claims (22)
- 조직인자 아고니스트인 FVIIa를 유효성분으로 포함하여 구성되는, 죽상경화증, 종양침착, 종양성장, 종양침입, 전이, 맥관형성, 혈관벽을 포함하는 상처, 화상 및 염증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 병리상태 치료용의 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 FVIIa는 정제된 재조합 FVIIa인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 병리상태는 혈관벽에 대한 기계적 상해인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 FVIIa의 투여량이, kg체중 당 100 내지 100,000 유니트인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 FVIIa의 투여량이, kg체중 당 250 내지 25,000 유니트인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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