JP3963406B2 - 因子VIIおよび活性化因子VIIaの精製法 - Google Patents
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Description
本発明は固定化可溶トロンボプラスチンへの結合により因子VIIおよび/または活性化因子VIIa(FVII/FVIIa)を精製する方法に関する。
凝固因子VII(FVII)はトロンボプラスチン(組織因子、TF)と一緒に外因性の凝固経路を開始させる複合体を構成する。組織損傷が起ると、TFが露出され、FVIIおよび/またはFVIIaはその細胞外タンパク質ドメインと結合できるようになる。疎水性タンパク質領域はTFを膜に固定する。
【0002】
(好ましくは負電荷の)脂質およびカルシウムの存在下で、FVII/FVIIa混合物の生理学的に活性な成分、すなわちTF−FVIIaは効果的に因子X(FX)を活性化する。引き続いてFXaが(FVa、脂質およびカルシウムと一緒に)トロンビンの生成を触媒する。その後のフィブリンの生成はとりわけ創傷の縫合を確実にする。
膜に位置するTFに結合したFVIIは引き続いて(TF−FVIIaが介在する)自己活性化により、またはFIXa、FXaおよびトロンビンにより活性化され、それにより凝固系のカスケード様活性化をさらに増強する。
【0003】
相応じて、FVIIの欠乏は出血性傾向のような止血性合併症を伴うことがある。生理学的に機能的な分子を生成するその合成がビタミンKの存在に依存する凝固子として、合併症は相応じて例えば手術前の(ビタミンKアンタゴニストを用いた)経口抗凝固に関連して起こりうるものであり、そして消費性凝固障害および肝臓損傷はFVII置換療法を適用するための追加的な徴候である。他方、FVIIaは急性出血に関して使用されうる活性化PPSB製剤の構成成分である。この他に、FVIIaは例えばFVIII不耐性の血友病患者に置換療法を適用する場合に使用される、いわゆる因子VIII−バイパス活性(例えば抗体)を有する。
【0004】
FVII/FVIIaは通常、幾つかの調製工程を使用して血漿または(組換え体調製の場合)培養上澄みから濃縮され、その手順は一般に収率の低下を伴なう。構造的に、またその特性においても他の凝固因子と関係のあるタンパク質として、相当する混合物からのその精製は困難かつ複雑である。この他に、FVIIの場合、精製工程がより複雑になるため、(望ましい調製法に従って)回避しなければならない(FVIIaへの)活性化が起こるという危険がある。適当な固定化モノクローナル抗体を使用する調製法は迅速な方法の例である。しかしながら、一般にタンパク質を非可逆的に傷つける溶離条件(pH3〜pH4)が必要である。部分変性は対応する収率の低下をもたらし、また抗原性にする配座が変った分子構造となる原因となりうる。
したがって、本発明の根元的な目的はFVII/FVIIaの迅速で温和な精製法を提供することである。
【0005】
本目的は次のようにして達成された;FVII/FVIIaを含有する溶液からそれらを固定化sTF(“可溶性”トロンボプラスチン、可溶性組織因子)に結合し、非結合分子をマトリックスから洗浄により除去し、その後FVII/FVIIaを温和な条件下で溶離することによりFVIIおよび/またはFVIIaを取り出すものである。これに関して、sTFはトランスメンブラン部分および細胞質部分を欠乏しており、したがってTFの細胞外ドメインであるトロンボプラスチンである。
【0006】
本発明者らはFVII/FVIIaとsTFの相互作用を利用してFVIIおよび/またはFVIIaを精製することができることを見い出した。すなわち、“生理学的に”完全な(脂質と結合する)TFは自己活性化やFIXa、FXaおよびトロンビンによる結合FVIIのタンパク質分解またはフィードバック活性化を引き起こすが、sTFに結合したFVIIは変わらないままである(MorrisseyのThromb. Haemostas. 74: 185〜188(1995年))。
【0007】
FVIIおよび/またはFVIIaとsTFの結合は二価のイオン、特にカルシウムの存在下で最適にされるが、他のタンパク質を非結合形態で除去することができる。したがって、固定化sTFはマトリックスに吸着され、FVIIおよび/またはFVIIaはカルシウムの存在下で溶液からsTFに結合され、そして非結合分子は固相から洗浄により除去される。溶離はシトレート、オキサレート、タルトレート、EDTAなどのようなキレート化剤を含有する緩衝液を使用して温和な方法で行なわれる。
【0008】
sTFは非共有結合により固相に吸着させることができ、または共有結合により固定することができる。適当な結合相手は慣用的に調製されたsTF(完全TFからタンパク質分解的に調製される)、遺伝子組換えにより調製されたsTFまたはFVII/FVIIa−結合部分(sTFのペプチド領域)である。sTFまたは適当なFVII−結合領域は固定化を簡単または最適にする物質に結合させることができる(例えばスペーサー官能基として、下記参照)。
【0009】
好ましいアプローチでは、LaufferらのEP 464 533に記載のように、Fcフラグメントに結合したsTF(Fc−sTF)が使用される。sTFは最適に与えられ、精製法の有効性は例えばFc−sTFを抗Fcカラム、タンパク質Aマトリックスまたはタンパク質Gマトリックスに結合することにより増大される。Fcフラグメントまたは免疫グロブリンを含有する試料はマトリックスからのFc−sTFの置換をもたらしうるため、知られている方法を使用してFc−sTFをマトリックスに共有結合的に結合させることが適切である。
【0010】
二価のイオン、好ましくはCaCl2の形態のカルシウムは0.01〜500mM、特に好ましくは0.5〜50mMの濃度でFVII/FVIIa含有溶液に加えられる。溶液のpHは5.0〜10.0、好ましくは7.0〜9.5である。この溶液をsTF−マトリックスと接触させ、そしてマトリックスを好ましくは7.0〜9.5のpHおよび0.5〜50mMのカルシウム濃度を有する緩衝液で洗浄する。溶離はキレート化剤、好ましくはシトレート、オキサレート、タルトレート、NTA、EDTAまたはEGTAを0.1〜1000mM、好ましくは5〜200mMの濃度で含有する溶液を使用して行なわれる。溶液のpHは5.0〜10.0、好ましくは5.5〜8.5、特に好ましくは6.0〜7.5である。
【0011】
活性化因子を含有する試料は(おそらく存在する過剰の因子VIIから)FVIIaの追加的な生成をもたらすことがあり、それにより人為的な結果をもたらす。このリスクを回避するため、固定化sTFと接触させる前に抗トロンビンIII/ヘパリンを試料に加えることができる。FVIIaは室温または高めの温度でATIII/ヘパリンにより、他の潜在的に干渉する因子(FIIa、FIXa、FXaなど)と比べてゆっくりと阻害されるため、FVIIaを精製することが目的の場合、FVIIaの含量にあまり影響を及ぼすことなく後者の因子を遮断することができる。ある場合には、TF−結合FVIIaをATIII/ヘパリンによって遊離分子よりも効果的に阻害することができる(しかし、ATIIIは機能的なヘパリンがないと可溶性FVIIaと同様に非常にゆっくりと反応する)。したがって、sTFと接触させる前にプロタミンサルフェート/ポリブレン(登録商標)のような知られている試薬により加えたヘパリンを中和し、次に上記のような方法を行なうことができる。
方法のこの工程において可逆阻害剤、例えばベンズアミジン、およびそれら自体が中和可能な他の補因子依存阻害剤またはそれらの促進剤(例えばヘパリン−補因子II/ヘパリン)もまた適している。
次の実施例により本発明をより詳細に説明する。
【0012】
【実施例】
タンパク質A−セファロースにFc−sTF(10μg/50μlのゲルマトリックス)を負荷し、緩衝液A(50mMのトリス/HCl、150mMのNaCl、10mMのCaCl2、0.1%ヒトアルブミン、pH8.5)で平衡させた。FVII(15IU/ml)を含有する0.5mlのタンパク質溶液にFVIIaを(凝固試験で)FVII活性の5%に相当する濃度まで加えた。溶液はまた、因子II(30IU/ml)、IX(25IU/ml)およびX(30IU/ml)のような他の凝固因子、並びに幾つかの追加的な血漿タンパク質を含有した。この溶液を同量の緩衝液Aで稀釈し、小カラム中のsTF−マトリックスと接触させた。流動液をカラム中を通過させた後、マトリックスを0.5mlの緩衝液Aで洗浄し、次に結合タンパク質を緩衝液B(50mMのトリス/HCl、150mMのNaCl、50mMのクエン酸ナトリウム、pH6.5)で溶離し集めた。
【0013】
溶出液を適当な凝固試験で試験し、そしてFVII/VIIaの収率をその活性により、またELISAにより(出発物質に関連して)定量した。溶出液の純度はSDS−PAGEにより明らかにした。
結果:FVII/FVIIaの収率は出発物質に基づいて、ELISAでは93%、そして活性では90%であった。他の重要な発見は、溶出液中のFVII活性の5%が(加えた)FVIIaから誘導されたものであるということである。これは2つの分子のどちらも優先的に結合していないことを示している。他方、この精製工程の間にFVIIのFVIIaへの活性化が起こるという可能性を除外することができる。
【0014】
FII、FIXまたはFXのいずれも溶出液中に存在しなかったが、それらはすべて(出発物質と対応して)カラムの流動液中に存在した。溶出液の純度、および溶出液中のFVII/VIIaの濃縮における強力な効果はSDS−PAGE分析により明らかにされる。それは精製効果を立証している。
Claims (9)
- 溶液の pH が7 . 0〜9 . 5である因子VIIおよび/または因子VIIaを含有する溶液からそれらを固定化可溶トロンボプラスチンに結合させ、非結合分子を pH 7 . 0〜9 . 5の緩衝液で洗浄することにより除去し、そして因子VIIおよび/または因子VIIaを pH 5 . 5〜8 . 5の溶離液で溶離することにより因子VIIおよび/または因子VIIaを取出すことからなり、自己活性化、タンパク質分解またはフィードバック活性化を引き起こさずに、因子VIIおよび/または因子VIIaを精製する方法。
- 結合因子VIIおよび/または因子VIIaはキレート化剤を使用して溶離される請求項1記載の方法。
- 固定化可溶トロンボプラスチンへの結合に関してCa2+イオンが0.01〜500mMの濃度で加えられる、請求項1または2記載の方法。
- 因子VIIおよび/または因子VIIaを溶離するのに十分な0.1〜1000mMの濃度のシトレート、オキサレート、タルトレート、NTA、EDTAまたはEGTAがキレート化剤として選択される請求項2または3記載の方法。
- 他の干渉する活性化因子は固定化可溶トロンボプラスチンと接触させる前に阻害される請求項1〜4の何れかの項記載の方法。
- 固定化可溶トロンボプラスチンと接触させる前に、他の潜在的に干渉する活性化因子は抗トロンビンIII/ヘパリンを加えることにより不活性化され、適当ならばプロタミンサルフェートが引き続いて加えられる請求項5記載の方法。
- 可溶性トロンボプラスチンは非共有結合により固相に吸着される請求項1〜6の何れかの項記載の方法。
- Fcフラグメントに結合する可溶性トロンボプラスチンが使用される請求項7記載の方法。
- 可溶性トロンボプラスチンは固相に共有結合される請求項1〜6記載の方法。
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