JPH0892299A - レニンモノクローナル抗体およびそれを用いる活性型レニンの免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】精度よく活性型レニンを測定することのできる
モノクローナル抗体およびこれを利用する高感度の活性
型レニンの測定方法を提供すること。 本測定方法によ
れば、正常者や低レニン活性を示す疾患を含む活性型レ
ニン量の正確な評価が可能となり、高血圧性疾患を初め
とする疾患の診断あるいは治療に、有利に利用すること
ができる。 【構成】リコンビナントヒトレニンを用いて作製された
ハイブリドーマの産生するレニンモノクローナル抗体お
よび、当該抗体を活性型レニンの酵素活性を阻害する抗
体として利用し、これを酵素活性の阻害の弱い抗体と組
合せて、生体液中の活性型レニンを挟み込んで免疫学的
に測定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、レニンモノクローナル
抗体およびこれを用いる活性型レニンの免疫学的測定方
法に関し、更に詳細には、高血圧性疾患の診断において
不可欠なレニンの測定方法において使用することのでき
る、リコンビナントヒトレニンを用い作製されたレニン
モノクローナル抗体およびこれを用いる活性型レニンの
みを特異的に測定する免疫学的測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】レニンはアンジオテンシノーゲンを分解
しアンジオテンシンＩ（ＡＴＩ）に変換する蛋白分解酵
素であり、ＡＴＩは血管平滑筋を収縮させ、その結果血
圧の上昇を惹起する。 このためＡＴＩの産生に関与す
るレニンの測定は高血圧性疾患の病態把握には重要な検
査となっている。

【０００３】特に２次性高血圧症の主たる原因である腎
血管性高血圧症の診断において、血中活性型レニンの測
定は重要である。 また希ではあるがレニンを産生する
腫瘍の存在も知られており、そのような疾患において腫
瘍の性質を明らかにする目的でも血中の活性型レニンの
測定は必須なものである。

【０００４】レニンの測定は以前より行われているが、
レニンを直接測定する方法は当初においては困難であっ
た。 すなわち、初期のレニンに関する測定法は、無麻
酔の犬に試料を注射し、２分以内に平均血圧を３０ｍｍ
Ｈｇ上昇させる時のレニン活性を１ゴールドブラットユ
ニット（Goldblatt Unit）と定義して測定を行ってい
た。 この方法はバイオアッセイと呼ばれる方法である
が、測定感度や測定再現性が悪く、また同じ動物に繰り
返し施行できるものではないため、実用的な方法ではな
かった。

【０００５】その後実用的なレニンの測定が開発された
が、それはレニン自体の測定法ではなかった。 １９６
９年にボイド（Boyd）らが単位時間あたりアンジオテン
シノーゲンからレニンにより産生されるＡＴＩをＲＩＡ
法により測定し、その実質上のＡＴＩ産生能をもってレ
ニン活性量（ｎｇ／ｍｌ／ｈｒ）として代用する方法を
開発した。

【０００６】上記方法は、レニン活性の測定に試料中
（血漿中）に存在しているアンジオテンシノーゲンをレ
ニンの酵素基質として用ているため、測定に際して酵素
反応を行った後に免疫反応を行う必要があり、また試料
中に最初から存在するＡＴＩの量を定量し測定結果より
差し引くといった極めて煩雑な操作が必要であるという
問題点以外にも、血中の基質であるアンジオテンシノー
ゲン濃度の変動により影響を受けるという問題点もあ
る。

【０００７】さらにアンジオテンシンを産生する肝臓の
機能障害等では、レニン基質が減少し、その結果レニン
活性値が過小評価され、逆にアンジオテンシン濃度が高
まるような疾患や妊娠等では、レニン活性値が過大評価
されることが指摘されている。 事実、レニン活性の測
定においてアンジオテンシノーゲンが不足していると考
えられる試料に外部よりアンジオテンシノーゲンを添加
することにより見かけ上のレニン活性が増加する現象が
認められている。 また、この測定系はアンジオテンシ
ノーゲンが含まれていない検体、例として羊水や抽出液
等はそのままでは測定できない。 このほかにも、この
測定系は酵素反応時のコントロールが不完全であると測
定誤差をもたらすことや、レニン以外の蛋白分解酵素の
影響が懸念されていた。

【０００８】一方、レニンの直接測定法は１９７９年に
ガレン（Galen）らにより開発され、レニン産生腫瘍よ
り精製したレニンとこれに対する抗体を用いて直接レニ
ンの測定が可能となった。

【０００９】しかし、レニンには活性型レニンとその前
駆体である非活性型レニン（プロレニン）が存在するこ
とが判明し、通常のレニン抗血清を用いたＲＩＡでは両
者の区別が不可能であることが判明した。 すなわち、
血中に存在するレニンには活性型レニンと不活性型レニ
ンの２種類が存在し、このうち生理的役割を司るとされ
る活性型レニンはトータルレニンの約１０％以下であ
り、活性型レニンの測定においては、トータルレニンの
うち活性型レニンのみを特異的かつ高感度に測定する必
要があった。

【００１０】上記目的のためには、活性レニンを特異的
に認識あるいは結合する性質と同時に低い濃度を測定す
る高い親和性を持ち合わせる抗体を使用する必要がある
が、当初の直接ＲＩＡ法によるレニンの測定においては
ポリクローナル抗体を用いていたために、活性型レニン
のみを特異的に測定することはできなかった。

【００１１】活性型レニンのみを測定する方法として
は、１９８５年にクリストフらが開発したレニンの酵素
活性を極めて強力に阻害するモノクローナル抗体を用い
る活性型レニンの測定法（特開昭６０−２３１６２４
号）が知られている。 この方法により活性型レニンの
特異的な測定が可能となったが、この方法では、５×１
０^-11Ｍの希薄な抗体濃度でもレニンの酵素活性を５０
％以上阻害する極めて特殊な抗体を用いる必要があっ
た。 そして、このような性質を有する抗体は、通常の
モノクローナル抗体作製法で得ることは困難であり、容
易に行える方法ではなかった。

【００１２】また、クリストフらは、上記測定法の例と
して２種類の抗体を用いる活性型レニンのサンドイッチ
測定法も明らかにしているが、組み合わされて使用され
る２つの抗体は何れも強力な活性型レニンの酵素阻害活
性を持つ抗体である。 そして、上記公報中では、これ
ら抗体の認識部位は相違するとしているが、互いに強力
な酵素阻害活性を持つ抗体は、抗体としての認識部位も
互いに接近していると予想され、このサンドイッチ測定
法で正確に活性型レニンを測定しているかについては、
大いに疑問の残るものである。

【００１３】更に、他の測定方法として、１９８７年に
本発明者らがレニン阻害物質とレニン特異抗体を用いて
レニンを測定する方法を開発した（特開昭６３−２１７
２７２号）。 この方法も活性型レニンを特異的に測定
する方法であり、レニン阻害物質としてペプスタチンＡ
が例として使用されているが、ペプスタチンＡのレニン
の酵素阻害活性が弱く（１×１０^-6Ｍ）測定感度が必ず
しも十分ではなかった。 またレニン阻害物質としてペ
プスタチンＡを用いた場合にはトータルレニンのうち活
性型レニンのみを結合するが他の蛋白分解酵素とも結合
するため、レニンに特異的な他の試薬と組み合わせなけ
ればならかった。

【００１４】一方、パスツール社により実用化された血
中活性型レニン濃度を直接測定するキットは、基質濃度
に左右されることのない真に望ましい測定系であるが、
検体量が２５０μｌと大量に用いていながら感度が未だ
不十分であり、正常者においてもしばしば感度以下にな
ってしまう測定系であった。 このためレニンが著しく
低下する疾患である原発性アルドステロン症では大半の
症例で感度以下になってしまうことが指摘されていた。
これは正常人における活性型レニンの血中濃度が数十
から数ピコモル程度のためで、理論上そのようなレニン
を測定するためにはある程度の高い親和性を持ったモノ
クローナル抗体が必要であった。

【００１５】特に活性型レニンの測定においては、活性
型レニンのみを認識する物質ないし抗体が重要であるこ
とは前述の如くであるが、試薬を活性型レニンのみを認
識する抗体とした場合においても、このような抗体は活
性型レニン分子のうち特に酵素活性中心、もしくは近傍
を認識する抗体でなくてはならない。これはレニンの活
性中心からあまり離れた部位を認識する抗体であっては
活性型レニンのみならず非活性型レニンを認識する危惧
があるためである。

【００１６】レニンの分子量は約４万であるが、その酵
素活性中心は極めて限定された領域であることは、容易
に理解できる。 この限られた領域に対し特異的なモノ
クローナル抗体を作製することは一般に困難であり、ま
してや、低濃度の活性型レニンを精度よく測定できるよ
うな、高いレニン酵素阻害活性と高いレニン結合親和性
を同時に有する抗体の作製おいてはいっそう困難であっ
た。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】従って、高い酵素阻害
活性と高い結合親和性を同時に満足する抗体を作製する
か、あるいは通常得られる様な性能の活性型レニンに対
する抗体と他の技術を用いて精度よく活性型レニンの測
定系を開発し、高感度の活性型レニンの測定系の提供が
求められていた。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の活
性型レニンの測定法の欠点を解消したレニンの測定方法
を開発すべく鋭意研究を行った結果、リコンビナントヒ
トレニンを用いて作製されたハイブリドーマが産生する
レニンモノクローナル抗体には、高い酵素阻害活性を有
するものや高い放射能を負荷させることができるものが
存在することを見出した。

【００１９】また、このモノクローナル抗体と、レニン
は認識するが高い酵素阻害活性は有さないモノクローナ
ル抗体を組合せることにより、活性型レニンを精度良く
測定できることが可能であることを見出し、本発明を完
成した。

【００２０】すなわち、本発明の目的は、リコンビナン
トヒトレニンを用いて作製されたハイブリドーマの産生
するレニンモノクローナル抗体を提供することである。
また、本発明の他の目的は、上記モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを提供することである。更に、
本発明の他の別の目的は、上記モノクローナル抗体を利
用する活性型レニンの測定法を提供することである。

【００２１】本発明のリコンビナントヒトレニンに対す
るモノクローナル抗体は、高純度のヒト活性型レニンで
免疫した動物の脾細胞由来のリンパ球と形質転換細胞を
融合させて得たハイブリドーマを培養することにより得
られる。

【００２２】免疫に使用する高純度のヒト活性型レニン
は、例えば、１９８３年に村上らが明らかにしたヒトレ
ニンの遺伝子配列（特開昭６０−４７６８１号）を用い
ることにより得ることができる。 また、動物脾細胞と
しては、リコンビナントヒトレニンで免疫したマウス、
ラット、ヒツジ等の脾細胞が利用され、形質転換細胞と
しては、Ｐ３Ｕ１等のミエローマ細胞が使用される。
動物脾細胞由来のリンパ球と形質転換細胞の融合は、電
気融合やポリエチレングリコールを用いる公知の融合方
法により行うことができる。 このうち、マウス由来の
脾細胞を用いてハイブリドーマを作製することが、その
後の抗体採取を容易に行う上で好都合である。

【００２３】また、上記のようにして得られたハイブリ
ドーマの培養も、例えば、１０％牛胎児血清を含むダル
ベッコ変法最小必須培地（ＤＭＥＭ）や、牛胎児血清を
含まないＤＭＥＭ培地等を用いる公知の方法により行わ
れる。

【００２４】更に、ハイブリドーマからのモノクローナ
ル抗体の採取法としては、Ｂａｌｂ／ｃやヌードマウ
ス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスへ一定量のハイブリ
ドーマを投与し、腹水採取後、これを精製する方法等が
利用可能である。 また、この他にも、アキュシスト等
の細胞培養装置の培養上清を濃縮し、これを精製する方
法も利用できる。 なお、得られた抗体は、プロテイン
Ａカラムやイオン交換カラムを用いる等の公知の精製方
法により容易に精製することができる。

【００２５】本発明においては、免疫用抗原として、高
純度のリコンビナントヒトレニンを用いるため、従来の
抽出品を用いる場合に比べ、均質な抗原に対する多数の
モノクローナル抗体の作製が可能となる。本発明者の行
った実験でも数十クローンにおよぶモノクローナル抗体
が得られ、これらはいずれも生体中のレニン、つまりヒ
ト腎臓より高純度に精製されたレニンと強く結合した
が、それらのレニン酵素活性の阻害の程度は、１×１０
^-6Ｍの濃度ではレニン酵素活性を阻害しない抗体から１
×１０^-8Ｍの濃度でも酵素阻害活性を有する抗体まで多
くの幅を持っていた。

【００２６】そして、レニン酵素阻害活性を有するモノ
クローナル抗体においても、その阻害はかならずしも強
くなく、結合親和性は高いが、５×１０^-9Ｍの濃度では
その阻害活性は不十分な抗体として得られた。

【００２７】上記の如くして得られるモノクローナル抗
体は、常法にしたがって固相に結合することも、また、
酵素や放射性元素を用いて標識することも可能である。
例えば、モノクローナル抗体の標識の例としては、ク
ロラミンＴ等の酸化剤を用い、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹²³Ｉな
どの放射性同位元素で標識する方法や、ヒンジ法等によ
りアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵
素で標識する方法が挙げられる。 また、これら固相に
対する結合や標識等は、モノクローナル抗体そのものを
用いて行う他に、抗体を公知の方法によりＦａｂ'やＦ
（ａｂ'）₂に変換したものや、ビオチン、アビジン等で
修飾したものについて、間接的に固相化や標識を行うこ
とが可能である。

【００２８】得られたモノクローナル抗体のうちには、
通常の放射能より５倍程度高い放射能量を負荷すること
が可能なものが存在することが見出された。例えば、後
記実施例で詳しく説明するモノクローナル抗体１１−６
は、¹²⁵Ｉを２５μＣｉ／μｇという高い比放射能量で
安定に標識できる抗体であった。

【００２９】かくして得られたモノクローナル抗体を用
いて生体液、例えば血清、血漿、尿、腹水、胸水、乳
清、羊水、脊髄液、抽出液、さん出液等に含まれる活性
レニン量を測定するには、通常の免疫学的測定方法を応
用することも可能であるが、活性レニン量を高感度で測
定するには、次に述べる２種類の抗体を用いる活性型レ
ニンのサンドイッチ測定法を利用することが望ましい。

【００３０】このサンドイッチ免疫学的測定法を実施す
る場合、被測定物質が比較的低分子量の物質である場合
は、抗体の認識部位が互いに接近していると良好な反応
が期待できないため、これらの抗体が認識する部位を変
えることが重要になる。

【００３１】本発明では、２つの抗体の認識部位を異な
るものとするため、レニンの酵素活性を阻害する抗体と
酵素活性を阻害しない抗体の２種類を組み合わせ、サン
ドイッチ免疫学的測定法を実施することにより良い結果
を得た。 レニンのサンドウイッチ免疫学的測定法は、
レニンのみを特異的に認識する（但し、活性部位を除
く）固相化された抗体と検体（生体液）とを反応させた
後に洗浄し、レニンの活性部位を認識する、標識された
抗体を反応させることにより行われる。 更には、固相
化されたモノクローナル抗体と標識されたモノクローナ
ル抗体とを１ステップで反応させることが高感度を得る
ために好ましい。

【００３２】より具体的には、サンドウィッチ免疫学的
測定法において、（ａ）使用する二種抗体のうち少なく
とも１種類はリコンビナントヒトレニンを用いて作製さ
れたレニンモノクローナル抗体とし、（ｂ）抗体の一方
が活性型レニンの酵素活性を阻害するが、もう一方の抗
体は酵素活性の阻害が弱いものとすることにより、正確
に活性型レニンを抗体間に挟み込むことが可能となり、
高感度の測定系が得られた。

【００３３】上記（ｂ）のような、異なる抗体の組合せ
は、リコンビナントヒトレニンにより得られた数十のモ
ノクローナル抗体をその性質により幾つかのグループに
分け、モノクローナル抗体の組み合わせ試験やモノクロ
ーナル抗体相互による阻害試験等から適切な抗体の組合
せを検討することにより決定することができるが、本発
明者の試験結果からは、高感度となる抗体の組み合わせ
として、モノクローナル抗体１１−６と既存のレニンモ
ノクローナル抗体１２−１２（Higaki et al,Acta endo
crinologica 120:81-86）の組み合わせを見いだした。

【００３４】上記方法は、例えば、検体２００μｌをチ
ューブに取り、これに¹²⁵Ｉ標識レニンモノクローナル
抗体１００μｌおよびレニン抗体ビーズ１個を入れ混合
し、室温で１〜２４時間、好ましくは３時間攪拌反応
後、反応液を除去し、蒸留水２ｍｌで３回洗浄後、ビー
ズ上の放射能量を計測し、標準血清より得られる標準曲
線から検体中の活性レニン濃度を求めることにより実施
される。

【００３５】本発明方法の大きな特徴は、上記のように
活性型レニン酵素活性阻害能の相違する２種の活性型レ
ニンに対するモノクローナル抗体を利用する点にある
が、リコンビナントヒトレニンを用いたことによる測定
値の精確性の向上にもまた特徴がある。

【００３６】すなわち、免疫学測定法は一般に１０^ー9〜
１０^-12Ｍ程度の微量物質を測定する方法であり、極め
て高感度の測定法である。 このため免疫学的測定法
は、濃度が厳密に検定された標準物質を被検体とともに
測定し、標準物質との対照により被検物質に含まれる濃
度を正確に算出する必要があり、従って標準物質は測定
値の信頼性において最も重要な因子である。

【００３７】しかし、これまでのレニン測定法において
はレニンの標準物質の調製を、生体材料に求めており、
従って、生体抽出物中のレニンの存在濃度が調製毎に変
化することが避けられなかった。 また、さらに問題と
なることは、被検物質と標準物質の抗原性の違いとされ
る、抽出物中のレニンの物性が調製毎に異なる点であ
り、免疫学的測定方法の測定原理の根本に影響する重大
な問題であった。

【００３８】本発明においては、レニンの免疫学的測定
法において測定値の信頼性と再現性を確保するために、
標準物質の起源を生体材料に求めるのではなく、常に均
質で一定量のレニンを安定して供給できる遺伝子工学の
手法により作製されたリコンビナントヒトレニンに求め
た。 このリコンビナントヒトレニンは高純度で高いレ
ニンの酵素活性を有し、しかも抗原性の変化もない均質
なものであるから、これを標準物質として用いることに
より、本発明方法の測定信頼性は従来より大きく改善さ
れた。

【００３９】また、本発明方法を支えるもう一つの要因
は、高放射能負荷を可能とするモノクローナル抗体の存
在である。すなわち、放射免疫学的測定法における標識
抗体の比放射能は、２０〜４０μＣｉ／μｇ、望ましく
は２３〜３５μＣｉ／μｇであるとされており、前記し
たように、レニンモノクローナル抗体１１−６は¹²⁵Ｉ
をその比放射能約２５μＣｉ／μｇで安定に標識でき、
放射免疫学的測定法として十分な放射化強度を得ること
ができるのである。 しかも、このようにして得られた
高比放射能で標識されたレニンモノクローナル抗体１１
−６をサンドイッチ免疫測定に用いた場合、その最大結
合能（Ｂ−ＢＯ）／Ｔ（％）は、製造８週間後において
も製造直後の７０％以上の結合能を安定に維持してい
た。

【００４０】

【作用】本発明は、ヒトレニンに対するモノクローナル
抗体のうち、活性型レニン活性を阻害するものと阻害し
ないものを組合せ、サンドイッチ免疫学的測定法によ
り、体液中の活性型レニンを測定するものである。 ま
た、使用するモノクローナル抗体として高い放射能負荷
が可能なものを用い、また、標準品としてリコンビナン
トレニンを使用することにより、高感度かつ正確な活性
型レニンの測定が可能となったものである。

【００４１】これらにより、従来は極めて高いレニン酵
素阻害活性を有するモノクローナル抗体を用いなければ
測定できなかった活性型レニンを十分な測定感度で、し
かも、従来の測定系でなし得なかった正常下限まで正確
に測定できることが可能となった。

【００４２】

【効果】本発明方法によれば、従来のヒト活性型レニン
の測定系では測定できなかった正常下限の検体において
も、活性型ヒトレニンを高感度に測定することが可能と
なった。また標準物質としてリコンビナントヒトレニン
を用いることにより測定値の信頼性や再現性の向上を図
ることができた。従って、本発明方法によれば、正常者
や低レニン活性を示す疾患を含む活性型レニン量の正確
な評価が可能となり、高血圧性疾患を初めとする疾患の
診断あるいは治療において、有利に利用することが可能
なものである。

【００４３】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。

【００４４】実 施 例 １ レニンモノクローナル抗体の作製：リコンビナントヒト
レニン６μｇをフロイント完全アジュバンドと共にＢａ
ｌｂ／ｃマウスに３週間間隔で投与することにより感作
した。 最終免疫から３日後に脾臓を採取し、洗浄する
ことにより脾臓細胞を得た。 これらの脾臓細胞をプロ
ナーゼ（シグマ社より）により１分間処理し、等張化リ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、塩化マグネシウム、塩
化カルシウムを含んだ等張化マンニトール溶液（ｐＨ
７.４）に懸濁し、同溶液で懸濁したマウスミエローマ
細胞（Ｐ３Ｕ１）と細胞比５：１になるように混合し
た。

【００４５】この混合溶液を電気融合装置の平行チャン
バー（島津製作所）に入れ、４２０ＶでＤＣパルスを加
えることにより両細胞を融合した。 融合後細胞を回収
し、ダルベッコ変法最小必須培地（ＤＭＥＭ）により洗
浄し、１０％の牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁
し、２４ウエルの培養プレートに分注した。 翌日より
ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含んだＤ
ＭＥＭ培地（ＨＡＴ培地）よりハイブリドーマ細胞の選
択を行い、増殖してくるハイブリドーマ細胞の培養上清
をスクリーニングに用いた。

【００４６】ヒト腎臓より精製された高純度ヒト活性型
レニン６μｇを０.８ｍＣｉのＮａ¹²⁵Ｉ、２０μｇクロ
ラミンＴ存在下、室温で２０秒間反応させた。 反応を
５０μｇのメタ重亜硫酸ナトリウム水溶液を加え停止
し、反応液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−
５０カラム（１×３０ｃｍ、ファルマシア社）により精
製し、０.５％ＢＳＡ含有０.０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.４；以下、「緩衝液」と略称する）に希釈し、¹²⁵
Ｉ標識レニンを得た。 反応率は７５％メタノールを展
開液としたペーパクロマトグラフィーにより測定した結
果、６０％で、比活性は１００μＣｉ／μｇであった。

【００４７】スクリーニングに用いる二抗体法ＲＩＡ法
は、培養上清１００μｌに上で得た¹²⁵Ｉ標識レニン１
００μｌ（０.０３μＣｉ）を混合し、４℃で２０時間
反応後、３％マウス正常血清を含む緩衝液１００μｌ、
マウスガンマグロブリンに対する羊抗血清希釈液１ｍｌ
を加え、室温で３０分放置し、３０００ｒｐｍで３０分
間遠心分離後、上清を除去し沈殿の放射活性をガンマー
カウンター（アロカ社ＡＲＣ−１０００）にて測定して
実施した。

【００４８】この二抗体法ＲＩＡにより、上清のレニン
抗体活性を検出した陽性ウエルは、限界希釈法によりク
ローニングを行い、ヒトレニンに対する抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞を得た。 このヒトレニンに対する
抗体を産生する細胞を、予めプリスタンを一週間前に投
与したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与し、一定期間
飼育後腹水を採取した。

【００４９】腹水に含まれるヒトレニンに対するモノク
ローナル抗体を硫安分画後、ＦＰＬＣシステム（ファル
マシア社）を用いイオン交換樹脂カラムにより精製し、
高純度に精製されたヒトレニンモノクローナル抗体を数
十種類得た。 またこれら細胞はホロファイバー型培養
装置、例えばアキュシストＪｒを用いても培養が可能
で、培養により得た培養上清から同様にして高純度レニ
ンモノクローナル抗体を得ることができた。

【００５０】実 施 例 ２ レニンモノクローナル抗体の選定： （１）レニン酵素活性の阻害の強さによるグループ分け 実施例１により得られたレニンモノクローナル抗体およ
び既存のレニンモノクローナル抗体１２−１２の希釈液
２０μｌを、血漿１０ｍｌあたり５ｍｇのトリプシンで
３０分間、３７℃で処理し、次いで１０ｍｇのトリプシ
ンインヒビターを添加した活性化ヒトプール血漿２００
μｌに添加し、３０分間室温で放置した。

【００５１】放置後、レニン活性測定キット（レニンリ
アビーズII ダイナボット社）によりレニン活性を測定
した。 活性阻害はヒトモノクローナル抗体を含有しな
い希釈液２０μｌを上記活性化ヒトプール血漿に添加し
たもののレニン活性測定値で除した結果を阻害率（％）
として計算した。 この結果を表１に示す。

【００５２】 （* 既知のモノクローナル抗体である）

【００５３】（２）ＩＲＭＡによる組み合わせ試験 上記レニンモノクローナル抗体のグループ分けおよび実
施例１における ¹²⁵Ｉ標識レニンとの結合能の結果よ
り、数個のモノクローナル抗体を選定した。 そして一
方を実施例８に準じて作製された¹²⁵Ｉ標識レニンモノ
クローナル抗体１００μｌと、同じく実施例８に準じて
作製された抗体をビーズに固相化したものを用意し、前
記の方法で行ったヒト血漿とトリプシン処理血漿および
処理前の血清１００μｌをサンプルとして測定した。こ
の結果を表２に示す。

【００５４】 （* 既知のモノクローナル抗体である）

【００５５】結果の前半の値はトリプシン活性化前の血
漿の結合率［（Ｂ−Ｂ０）／Ｔ（％）］を、後半の数字
はトリプシン活性化後の結合率を示し、表中にはトリプ
シン活性化前の結合率が２.０％以上のものの結果のみ
示している。活性型レニンのみの測定系としては活性化
の結合率が高く、また血漿の基礎値は相対的に低いこと
が必要条件となる。従って６９−３０と１１−６の組み
合わせ等は活性型レニンと非活性型レニンの両方を測定
する系となる。

【００５６】（３）レニン抗体相互間の阻害試験 試験管に、各レニンモノクローナル抗体（１００μｇ）
１００μｌと実施例１にて作製された¹²⁵Ｉ標識レニン
１００μｌを取り、混合した。 さらに前記で示したレ
ニンモノクローナル抗体を固相化したビーズを加え、６
時間反応後、生理食塩水２ｍｌで２回洗浄後、固相の放
射能をカウントした。 対照としては、レニンモノクロ
ーナル抗体を含まない緩衝液１００μｌを用い、これに
より得られたカウントを１００％とした。

【００５７】固相の放射能のカウントが対照のカウント
の９８％以上であるものを◎、９０〜９８％であるもの
を○、８０〜９０％であるものを△、８０％未満のもの
を×として下の表３に示した。

【００５８】 （*は既知のモノクローナル抗体である）

【００５９】これらの結果より、モノクローナル抗体１
１−６と既存のレニンモノクローナル抗体１２−１２の
２種類のモノクローナル抗体の組合せが最適と判断し、
以降の活性型レニン測定系に用いた。 なお、このモノ
クローナル抗体１１−６を産生するハイブリドーマＡ６
−１１−６は、１９９４年９月２１日付けで、工業技術
院生命工学工業技術研究所に ＦＥＲＭ ＢＰ−４８０４
として寄託した。

【００６０】実 施 例 ３ レニンモノクローナル抗体１１−６の親和性測定：レニ
ンモノクローナル抗体１１−６を緩衝液にて段階希釈
し、実施例１に示す二抗体法ＲＩＡにより¹²⁵Ｉ標識レ
ニンと反応させて結合率［（Ｂ０−Ｎ）／Ｔ（％）；結
合したカウント−非特異的カウント／総カウント×１０
０）］を測定した。これにより求めたモノクローナル抗
体のレニンに対する結合定数はおよそ１×１０^-10Ｍで
あった。

【００６１】実 施 例 ４ レニンモノクローナル抗体１１−６および１２−１２の
レニン活性阻害活性測定：高純度レニンモノクローナル
抗体１１−６および１２−１２を、それぞれ緩衝液にて
６.４５×１０^-7Ｍから６.４５×１０^-12Ｍまで段階希
釈した。 段階希釈により得られた各溶液２０μｌを、
血漿１ｍｌあたり５ｍｇのトリプシンにより１０分間、
３７℃で処理し、次いで１０ｍｇのトリプシンインヒビ
ターを添加した活性化ヒトプール血漿２００μｌに添加
し、３０分間室温で放置した後、レニン活性測定キット
（レニン・リアビーズII ダイナボット社製）によりレ
ニン活性を測定した。

【００６２】活性阻害は、ヒトモノクローナル抗体を含
有しない緩衝液２０μｌを上記活性化ヒトプール血漿に
添加したもののレニン活性測定値で除した値を阻害率
（％）として計算した。 その結果、レニンモノクロー
ナル抗体１１−６は５×１０^-8〜５×１０^-9Ｍの濃度で
はレニンの酵素活性を５０％以上阻害したが、５×１０
^-10Ｍの濃度ではレニンの酵素活性は５０％未満であっ
た。 一方レニンモノクローナル抗体１２−１２は５×
１０^-8Ｍの濃度でレニンの酵素活性は５０％未満であっ
た。

【００６３】実 施 例 ５ レニンモノクローナル抗体の西洋ワサビペルオキシダー
ゼとの結合：モノクローナル抗体１１−６と西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の結合は、活性化マレイミ
ドとＳ−アセチルメルカプトサクシニイミドを用いて行
った。 抗体１０ｍｇを、室温でジメチルフォルムアミ
ドに溶解したＳ−アセチルメルカプトサクシニイミドと
モル比１：１０で反応させた。

【００６４】反応後、アセチル基を塩酸ヒドロキシルア
ミンを用いて除去し、ＳＨ基を遊離させた。 反応液を
セファデックスＧ２５を用いて精製し、溶出分画を集め
濃縮後４℃で保存した。 ＰＯＤ（ベーリンガー社）１
０ｍｇを室温で活性化マレイミド（同仁化学）とモル比
１：１００で反応させた。 反応後反応液をセファデッ
クス Ｇ２５を用いて精製し、溶出分画を集め濃縮し
た。

【００６５】このようにして作製したＳＨ基導入モノク
ローナル抗体１１−６とマレイミド導入ＰＯＤをモル比
で１：１になるように混合し、４℃で一昼夜反応させ
た。翌日、反応液を室温で更に４時間反応させ、反応液
をバイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ）Ａ−０.５ｍ（バイオラ
ッド社）により精製を行った。 溶出分画を集め濃縮
し、ＰＯＤ結合レニンモノクローナル抗体１１−６を得
た。

【００６６】実 施 例 ６ ヒト活性型レニンの酵素免疫学的測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）：反応用トレーに、標準検体２００μｌおよび実施
例５にて作製されたＰＯＤ結合レニンモノクローナル抗
体希釈液１００μｌ添加し、上記レニンモノクローナル
抗体１２−１２を固相化したビーズ１個を加え、３時間
室温にてローテートした。 精製水２ｍｌで３回洗浄し
た後、ビーズを試験管に移し、基質にＯＰＤ溶液３００
μｌを用いる通常の酵素反応を２５℃にて１時間実施
し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。 この結果を表４
に示す。

【００６７】

【００６８】実 施 例 ７ ヒト活性型レニンＥＬＩＳＡのプロレニンに対する反応
性：村上等により作製されたヒトプロレニンをコードす
る発現ベクターを導入しヒトプロレニンを産生する性質
を持ったチャイニーズハムスターの卵母細胞の培養上清
よりヒトプロレニンを得、これを精製した。 この精製
ヒトプロレニンを、実施例６に示すヒト活性型レニンの
サンドイッチＥＩＡにより交差反応性を測定した。

【００６９】即ちヒトプロレニンをサンドイッチＥＩＡ
の標準物質希釈液を用いて段階希釈し、その反応性を評
価した。 また同時にヒトプロレニンをトリプシン（タ
イプII-S シグマ社）により村上等の方法を用いて活性
化し、トリプシンインヒビターを添加した検体を、同様
にしてサンドイッチＥＬＩＳＡ系でその反応性を評価し
た。 この結果を表５に示す。 この結果から、ヒトプロ
レニンはトリプシンの活性化後１０倍以上測定値の上昇
が認められた。 この活性化による上昇は、レニン活性
の測定系にも同様の測定値変化を認めた。 またこのレ
ニン活性測定の結果、精製されたヒトプロレニン中に活
性型レニンが数％程度混入することが認められた。なお
レニン活性は実施例４に示した方法に準じた。

【００７０】

【００７１】実 施 例 ８ 活性型レニンの放射免疫学的測定系の作製方法：本測定
法は、ヒトレニンの活性部位を特異的に認識する抗体
（モノクローナル抗体）とヒトレニンの活性部位以外を
認識する抗体（モノクローナル抗体）により、活性型レ
ニンを特異的に測定する方法である。即ち、活性レニン
を特異的に認識するモノクローナル抗体を標識体とし、
もう一方のモノクローナル抗体をビーズ球に結合させ固
相体にし、レニン標準品と検体とを同時に反応させ、洗
浄後、固相抗体に結合した放射能量を測定して検体中の
活性レニン濃度を求めるものである。

【００７２】従って、その測定に際しては、以下の試薬
を製造することが必要である。 （１）¹²⁵Ｉ標識レニン抗体の製造 標識用抗体には、実施例２に示した阻害活性の高いレニ
ンモノクローナル抗体１１−６を用いた。ＣＩＳ製Ｎａ
¹²⁵Ｉ ０.９ｍＣｉをシリコンコートガラスチューブに
取り、上記モノクローナルレニン抗体溶液４２μｇを入
れ、クロラミンＴ；１０μｇ／１０μｌ（２０ｍＭ−Ｐ
Ｂ、ｐＨ＝７.４）を加えて、６０秒間攪拌反応後、メ
タ重亜硫酸ナトリウムを２０μｇ／２０μｌ（２０ｍＭ
−ＰＢ、ｐＨ＝７.４）を加えて反応を停止した。

【００７３】次いで、反応液をイオン交換樹脂（アンバ
ーライトＩＲＡ４００Ｔ）０.５ｇ／５ｍｌ（緩衝液
１）中に添加し、未反応の¹²⁵Ｉをイオン交換樹脂に吸
着させることにより、¹²⁵Ｉ標識レニン抗体を精製し
た。 なお、反応液の９５％メタノールを展開液とする
ペーパークロマトグラフィーにより求めた標識率は９６
％であり、従って、比放射能は２５.７μＣｉ／μｇで
あった。（９００μＣｉ×０.９６／４２μｇ×０.８；
但し、０.８は計数器の計数効率）

【００７４】また、精製後の反応液について同様に行っ
た純度は９９％以上であった。精製反応液は、緩衝液１
にて希釈し、最終放射能濃度を約３０ｋＢｑ(0.81μCi)
／ｍｌに調製した。（ただし、アッセイに使用する量は
約２ｋＢｑ／１００μｌ／チューブである。）

【００７５】緩衝液１の組成； ０.０５Ｍ−リン酸緩衝液 ３％−ＢＳＡ ０.９％−ＮａＣｌ ０.１％−ＮａＮ₃ ０.００５％−正常マウスグロブリン 赤色２号微量 ｐＨ＝６.８

【００７６】（２）レニン抗体ビーズの製造 固相用抗体には実施例２で示した阻害活性の低いレニン
モノクローナル抗体１２−１２を用いる。直径１／４イ
ンチのポリスチレン製ビーズを５％スキャット溶液で２
時間洗浄後、１ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ＝５.７）に
１０μｇ／ｍｌの濃度に調製したレニンモノクローナル
抗体１２−１２を結合（１ビーズあたり２μｇ）させ、
０.２Ｍ−ＭｇＳＯ₄、０.２５Ｍ−リン酸緩衝液（０.５
％−ＢＳＡ／０.９％−ＮａＣｌ／０.１％−ＮａＮ₃）
で安定化後、液を取り除き、抗体が結合したビーズを恒
温低湿（２５℃／１５％）で乾燥させて製する。

【００７７】（３）活性レニン測定用標準血清（標準レ
ニン血清）の製造 本品は正常馬血清にリコンビナントヒトレニン抗原を添
加して製する。まず、市販の正常馬血清（ＳＥ１０５Ｌ
Ｃ、Ｅｑｉｔｅｃｈ製）を人血清と同等の反応性になる
ように熱処理（５６℃／３０分）し、安定剤として１ｍ
Ｍ−ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフロライド）
／イソプロパノール、０.２％−ＥＤＴＡ２Ｎａ、０.１
％−ＮａＮ₃を添加後、０.２μｍのフィルターでろ過し
てベース血清を製する。

【００７８】次に、リコンビナントヒトレニン抗原（２
５０ｎｇ／ｍｌ）をベース血清に添加して、５、２０、
１００、５００ｐｇ／ｍｌの濃度の標準レニン血清を調
製する。 調製した標準レニン血清は−２０℃以下で凍
結保存するか、凍結乾燥して使用する。 なお、リコン
ビナントヒトレニン抗原の濃度は、ＷＨＯから供給され
たレニン国際標準品（６８／３５６）で検定している。
その際の活性単位・重量単位変換ファクターは、１ｐ
ｇ＝６×１０^-6ＧＵとする。

【００７９】実 施 例 ９ 健常者検体中の活性レニン濃度の測定：各濃度の標準レ
ニン血清 ２００μｌ、¹²⁵Ｉ標識レニン抗体１００μ
ｌ、レニン抗体ビーズ１個をチューブに入れ混合し、室
温で３時間攪拌反応後、反応液を除去し、蒸留水２ｍｌ
で３回洗浄後、ビーズ上の放射能量を計測し、図１に示
す活性レニンの標準曲線を得た。

【００８０】次に、健常者５３６検体について、上記と
同様にしてビーズ上の放射能量を測定し、活性レニンの
標準曲線から各検体中の活性レニン濃度を求めた。結果
を図２に示すが、本測定法は高感度で、高活性レニン濃
度のみならず、健常者の下限値も正確に測定できた。

【００８１】実 施 例 １０ レニン活性との相関性：疾患検体３６４例について、本
測定法とレニン活性の相関を求めた。レニン活性の測定
にはレニン・リアビーズII（ダイナボット社製）を用
い、測定法はキットの使用書に準じた。疾患検体には、
本態性高血圧、腎血管性高血圧、慢性腎不全、原発性ア
ルドステロン症、レニン産性腫瘍、褐色細胞腫、その他
の疾患が含まれる。結果を図３に示すが、Ｙ＝７.０３
Ｘ＋１.４５（ｒ＝０.９４４）で正の相関が認められ
た。 （Ｙ；活性レニン濃度：本測定法、Ｘ；レニン活
性：レニン・リアビーズII）

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明方法の標準曲線を示す図面

【図２】 健常者血清中の活性レニン濃度の分布を示す
図面

【図３】 本発明方法とレニン活性の相関関係を示す図
面 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/60 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リコンビナントヒトレニンを用いて作製
   されたハイブリドーマの産生するレニンモノクローナル
   抗体。
2. 【請求項２】 ５×１０^-9Ｍの抗体濃度において、レニ
   ン酵素活性を５０％以上阻害し、放射性ヨウ素によって
   ２０μＣｉ／μｇ以上の比放射能を負荷せしめ、安定に
   使用できる請求項１記載のレニンモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 レニンモノクローナル抗体１１−６と名
   付けられた、請求項第１項または第２項記載のレニンモ
   ノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 酵素または放射性同位元素により標識さ
   れたものである請求項第１項ないし第３項の何れかの項
   記載のレニンモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 リコンビナントヒトレニンを用いて作製
   されたハイブリドーマ。
6. 【請求項６】 リコンビナントヒトレニンで免疫された
   動物由来の脾細胞と、形質転換細胞を融合して得られる
   ハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 ハイブリドーマＡ６−１１−６と名付け
   られた請求項第５項または第６項記載のハイブリドー
   マ。
8. 【請求項８】 活性型レニン蛋白上の立体的に異なった
   部位を認識する２種類以上のモノクローナル抗体を用
   い、これら抗体間に生体液中の活性型レニンを挟み込ん
   で免疫学的に測定する方法であって、 （ａ）これらの抗体のうち少なくとも１種類はリコンビ
   ナントヒトレニンを用いて作製されたレニンモノクロー
   ナル抗体であり、 （ｂ）抗体の一方が活性型レニンの酵素活性を阻害する
   が、もう一方の抗体は酵素活性の阻害が弱いものである
   ことを特徴とする方法。
9. 【請求項９】 活性型レニンの酵素活性を阻害する抗体
   がレニンモノクローナル抗体１１−６である請求項第８
   項記載の方法。
10. 【請求項１０】 活性型レニンの酵素活性を阻害する抗
    体が標識抗体であり、活性型レニンの酵素活性の弱い抗
    体が固相化抗体である請求項第８項または第９項記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 標識抗体が、放射性ヨウ素により比放
    射能が２０〜４０μＣｉ／μｇで標識されたものである
    請求項第１０項記載の方法。
12. 【請求項１２】 標準物質としてリコンビナントレニン
    を用いる請求項第８項ないし第１１項の何れかの項記載
    の方法。
13. 【請求項１３】 生体液が血清、血漿、尿、腹水、胸
    水、乳清、羊水、脊髄液、抽出液またはさん出液のいず
    れかである請求項第８項ないし第１２項の何れかの項記
    載の方法。