JPH0881386A - 冬虫夏草の活性留分とその中の活性成分の分離方法 - Google Patents
冬虫夏草の活性留分とその中の活性成分の分離方法Info
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- JPH0881386A JPH0881386A JP6246664A JP24666494A JPH0881386A JP H0881386 A JPH0881386 A JP H0881386A JP 6246664 A JP6246664 A JP 6246664A JP 24666494 A JP24666494 A JP 24666494A JP H0881386 A JPH0881386 A JP H0881386A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 一種の冬虫夏草の活性留分及び分離方法を提
供すること。 【構成】 （一）冬虫夏草の活性留分中の特定の活性成
分の構造、及び（二）活性留分及び特定の活性成分の分
離方法、を包括し、この特定の活性成分をＩｇＡ腎炎を
起こしたハウスマウスの病変及び臨床症状の改善に応用
し、人類の活性化した腎膈細胞を抑制する。
供すること。 【構成】 （一）冬虫夏草の活性留分中の特定の活性成
分の構造、及び（二）活性留分及び特定の活性成分の分
離方法、を包括し、この特定の活性成分をＩｇＡ腎炎を
起こしたハウスマウスの病変及び臨床症状の改善に応用
し、人類の活性化した腎膈細胞を抑制する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一種の冬虫夏草の活性
留分とその中の活性成分の分離方法に関し、特に、冬虫
夏草の活性留分の分離方法及び分離した活性留分より人
類の腎膈細胞（ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ）の活性
化抑制を行いＩｇＡ腎炎を改善し病状が進行して尿毒症
を引き起こすのを防ぐ活性成分（Ｈ１−Ａ）を分離し、
取り出す方法に関する。
留分とその中の活性成分の分離方法に関し、特に、冬虫
夏草の活性留分の分離方法及び分離した活性留分より人
類の腎膈細胞（ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ）の活性
化抑制を行いＩｇＡ腎炎を改善し病状が進行して尿毒症
を引き起こすのを防ぐ活性成分（Ｈ１−Ａ）を分離し、
取り出す方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年来の薬理学上の研究により、蝶蛾類
鱗翅目の昆虫の幼虫を宿主として寄生し、被子体を延ば
して子実体を形成する麥角菌科の冬虫夏草真菌は、多方
面にわたり活性と薬理作用を有することが実証されてお
り、これは、以下のものを包括する： （一）免疫系統： 冬虫夏草の浸出液は動物の巨食細胞
の食指数を高め、第１介白質（ＩＬ−１）分泌を刺激
し、膵臓Ｔｈｙ−１細胞の増殖を誘発し、免疫球蛋白Ｍ
（ＩｇＭ）合成と分泌、Ｔ淋巴細胞の増殖を刺激し、Ｂ
淋巴細胞と更に多くの第２介白質（ＩＬ−２）を受容す
る。その水抽出液は、健康体の人及び白血病患者のナチ
ュラルキラーセル（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃ
ｅｌｌｓ）の活性を高める。 （二）腎機能方面： 冬虫夏草は腎小管の損傷を軽減
し、その細胞膜上のＮａ＋、−Ｋ＋、−ＡＴＰａｓｅ酵
素を保護し、その作用は細胞脂質の過酸化の減少と関係
がある。また、慢性腎機能不全を低減し、マウスの血尿
を改善し、クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）値の
上昇を遅延した。 （三）心血管系統： 冬虫夏草菌糸抽出物は実験動物の
冠状動脈血流量を増加し、動脈、脳、及び周辺血管の抵
抗力を増加し、降圧した。その水溶性の主成分であるア
デノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）は血管平滑筋を弛緩さ
せ、血管を拡張する活性を有する。冬虫夏草はまた血小
板の生成を促進する。このほか、冬虫夏草は抗酸素不足
作用を有し、脳のモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯＢ：
Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｆ Ｂｒａｉ
ｎ）を抑制する作用を有する。
鱗翅目の昆虫の幼虫を宿主として寄生し、被子体を延ば
して子実体を形成する麥角菌科の冬虫夏草真菌は、多方
面にわたり活性と薬理作用を有することが実証されてお
り、これは、以下のものを包括する： （一）免疫系統： 冬虫夏草の浸出液は動物の巨食細胞
の食指数を高め、第１介白質（ＩＬ−１）分泌を刺激
し、膵臓Ｔｈｙ−１細胞の増殖を誘発し、免疫球蛋白Ｍ
（ＩｇＭ）合成と分泌、Ｔ淋巴細胞の増殖を刺激し、Ｂ
淋巴細胞と更に多くの第２介白質（ＩＬ−２）を受容す
る。その水抽出液は、健康体の人及び白血病患者のナチ
ュラルキラーセル（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃ
ｅｌｌｓ）の活性を高める。 （二）腎機能方面： 冬虫夏草は腎小管の損傷を軽減
し、その細胞膜上のＮａ＋、−Ｋ＋、−ＡＴＰａｓｅ酵
素を保護し、その作用は細胞脂質の過酸化の減少と関係
がある。また、慢性腎機能不全を低減し、マウスの血尿
を改善し、クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）値の
上昇を遅延した。 （三）心血管系統： 冬虫夏草菌糸抽出物は実験動物の
冠状動脈血流量を増加し、動脈、脳、及び周辺血管の抵
抗力を増加し、降圧した。その水溶性の主成分であるア
デノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）は血管平滑筋を弛緩さ
せ、血管を拡張する活性を有する。冬虫夏草はまた血小
板の生成を促進する。このほか、冬虫夏草は抗酸素不足
作用を有し、脳のモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯＢ：
Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｆ Ｂｒａｉ
ｎ）を抑制する作用を有する。
【０００３】上述の薬理作用は、完全に純化した冬虫夏
草の活性成分により進行されたものではなく、腎病変の
組織学変化及び臨床症状に関する研究もまた、免疫球蛋
白Ａ（ＩｇＡ）腎炎のモデルに進行したものではない。
草の活性成分により進行されたものではなく、腎病変の
組織学変化及び臨床症状に関する研究もまた、免疫球蛋
白Ａ（ＩｇＡ）腎炎のモデルに進行したものではない。
【０００４】ＩｇＡ腎炎は臨床上、陣発性血尿及び／或
いは蛋白尿で表現する。往々にして慢性病の表現は、台
湾では本症罹患後、その約２０％が尿毒症に進行する。
現在に至るまでこの疾病の進行を阻止できる薬剤の構造
は実証されておらず、故に、その外の治療方法と治療薬
の発見が重要な課題であった。
いは蛋白尿で表現する。往々にして慢性病の表現は、台
湾では本症罹患後、その約２０％が尿毒症に進行する。
現在に至るまでこの疾病の進行を阻止できる薬剤の構造
は実証されておらず、故に、その外の治療方法と治療薬
の発見が重要な課題であった。
【０００５】ＩｇＡ腎炎の発病は、腎病性ＩｇＡ免疫複
合体が腎糸球体の腎膈（Ｍｅｓａｎｇｉａｌ）に堆積
し、もともと休止状態の腎膈細胞（Ｍｅｓａｎｇｉａｌ
ｃｅｌｌ）を活性化し、活性化した腎膈細胞は第１介
質（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１；ＩＬ−１）、第６介質
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死
因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
α；ＴＮＦ α）を放出し、腎膈細胞を増生させ、増生
した腎膈細胞は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、プラテレットデ
ライブドグロウスファクター（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅ
ｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ＰＤＧ
Ｆ）、トランスフォーミンググロウスファクター−β
（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ
ｏｒ−；ＴＧＦ−β）等を放出し、これらの細胞酵素及
び生長因子の作用はオータコイド（ａｕｔｏｃｏｉｄ
ｓ）のようであり、腎膈を増生させて悪性循環を呈す
る。かつ腎膈細胞の、酸素、過酸化水素、血小板活性化
因子（ＰＡＦ）、前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）、トロンボ
クサンＢ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎ Ｂ２；ＴＸ
Ｂ２）、及びニュートラルプロテイナーゼ（ｎｅｕｔｒ
ａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等の放出を促進し、これ
により腎膈増生、糸球体硬化、を形成し、腎基底膜の障
害を引き起こす。
合体が腎糸球体の腎膈（Ｍｅｓａｎｇｉａｌ）に堆積
し、もともと休止状態の腎膈細胞（Ｍｅｓａｎｇｉａｌ
ｃｅｌｌ）を活性化し、活性化した腎膈細胞は第１介
質（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１；ＩＬ−１）、第６介質
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６；ＩＬ−６）、腫瘍壊死
因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
α；ＴＮＦ α）を放出し、腎膈細胞を増生させ、増生
した腎膈細胞は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、プラテレットデ
ライブドグロウスファクター（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅ
ｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ＰＤＧ
Ｆ）、トランスフォーミンググロウスファクター−β
（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ
ｏｒ−；ＴＧＦ−β）等を放出し、これらの細胞酵素及
び生長因子の作用はオータコイド（ａｕｔｏｃｏｉｄ
ｓ）のようであり、腎膈を増生させて悪性循環を呈す
る。かつ腎膈細胞の、酸素、過酸化水素、血小板活性化
因子（ＰＡＦ）、前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）、トロンボ
クサンＢ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎ Ｂ２；ＴＸ
Ｂ２）、及びニュートラルプロテイナーゼ（ｎｅｕｔｒ
ａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等の放出を促進し、これ
により腎膈増生、糸球体硬化、を形成し、腎基底膜の障
害を引き起こす。
【０００６】過去に我々は、人類の分離腎膈細胞の培養
方法を建立し、これは人類の腎膈細胞は活性化後に、細
胞酵素と、腎基底膜を障害しうる化学物質とを放出する
分離細胞培養方法であった。また我々は、ＩｇＡ腎炎の
動物モデル方法を建立した。我々は分離した活性化腎膈
細胞の抑制、急性毒性試験及びＩｇＡ腎炎の動物モデル
からＩｇＡ腎炎を治療できる特定留分（ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ）及び一つの活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄ）を探し出した。
方法を建立し、これは人類の腎膈細胞は活性化後に、細
胞酵素と、腎基底膜を障害しうる化学物質とを放出する
分離細胞培養方法であった。また我々は、ＩｇＡ腎炎の
動物モデル方法を建立した。我々は分離した活性化腎膈
細胞の抑制、急性毒性試験及びＩｇＡ腎炎の動物モデル
からＩｇＡ腎炎を治療できる特定留分（ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ）及び一つの活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄ）を探し出した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は以下を課題と
する： （１）冬虫夏草の被子体に形成される特定留分（ｆｒａ
ｃｔｉｏｎ）及び一活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐ
ｏｕｎｄ）を用い、（ａ）活性化した腎膈細胞の増殖抑
制を行い、（ｂ）ＩｇＡ腎炎動物の腎組織の病理学変化
及び血尿／蛋白尿を改善すること。 （２）この活性留分及び特定の活性成分の分離方法を得
ること。
する： （１）冬虫夏草の被子体に形成される特定留分（ｆｒａ
ｃｔｉｏｎ）及び一活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐ
ｏｕｎｄ）を用い、（ａ）活性化した腎膈細胞の増殖抑
制を行い、（ｂ）ＩｇＡ腎炎動物の腎組織の病理学変化
及び血尿／蛋白尿を改善すること。 （２）この活性留分及び特定の活性成分の分離方法を得
ること。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、冬虫夏
草の被子体部分を４５−５０℃の暗所で加熱乾燥し、粉
砕後、２０倍のメタノール（ｗ／ｖ）に２４時間浸漬
し、抽出液を減圧濃縮した後、粗抽出物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより分離し、１：１のｎ−ヘ
キサン／酢酸メチルですすぎ、酢酸メチルによる留出部
分（Ｆ−２層）部分を分離し、比較的大規模の分離フロ
ーチャートでは、メタノール抽出物（或いはＦ−２層）
を細分画を行うｎ−ヘキサンと酢酸メチル混合液ですす
ぎ、酢酸メチルを漸次増やす方式を採り、１：２（ｖ／
ｖ）の留出部分（Ｃ−１１）を得、Ｆ−２とＣ−１１層
は明らかに「人類の腎膈細胞活性化を抑制する」生物活
性を有し、この２組の「活性留分」をいずれも４℃で少
なくとも３か月保存し、上述の活性を保存し、「活性留
分」中より「活性成分」を得ようとする時には、シリカ
ゲル薄層カラムクロマトグラフィーでＣ−１１層の不純
物を除去し、その展開液はｎ−ヘキサン／酢酸メチル
（１：１ ｖ／ｖ）を用い、且つ２回展開し、Ｒｆ＝
０．５−０．７範囲（Ｔ−４区帯）を回収し、後続の半
設備級逆相式高効率液相分析によりさらにＴ−４層に対
して純化を進行するのに有利とし、そのうち、逆相式ク
ロマトグラフィーのすすぎ液はメタノール、カラム固定
相は、Ｃ１８（８×２５０−ｍｍ，５−μｍ）型とし、
すすぎ液の流速は２ｍｌ／ｍｉｎ，紫外スペクトル測定
器の波長は２５４ｎｍに設定し、「活性指標成分（Ｈ１
−Ａ）」は完全に純化される、以上を特徴とする。
草の被子体部分を４５−５０℃の暗所で加熱乾燥し、粉
砕後、２０倍のメタノール（ｗ／ｖ）に２４時間浸漬
し、抽出液を減圧濃縮した後、粗抽出物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより分離し、１：１のｎ−ヘ
キサン／酢酸メチルですすぎ、酢酸メチルによる留出部
分（Ｆ−２層）部分を分離し、比較的大規模の分離フロ
ーチャートでは、メタノール抽出物（或いはＦ−２層）
を細分画を行うｎ−ヘキサンと酢酸メチル混合液ですす
ぎ、酢酸メチルを漸次増やす方式を採り、１：２（ｖ／
ｖ）の留出部分（Ｃ−１１）を得、Ｆ−２とＣ−１１層
は明らかに「人類の腎膈細胞活性化を抑制する」生物活
性を有し、この２組の「活性留分」をいずれも４℃で少
なくとも３か月保存し、上述の活性を保存し、「活性留
分」中より「活性成分」を得ようとする時には、シリカ
ゲル薄層カラムクロマトグラフィーでＣ−１１層の不純
物を除去し、その展開液はｎ−ヘキサン／酢酸メチル
（１：１ ｖ／ｖ）を用い、且つ２回展開し、Ｒｆ＝
０．５−０．７範囲（Ｔ−４区帯）を回収し、後続の半
設備級逆相式高効率液相分析によりさらにＴ−４層に対
して純化を進行するのに有利とし、そのうち、逆相式ク
ロマトグラフィーのすすぎ液はメタノール、カラム固定
相は、Ｃ１８（８×２５０−ｍｍ，５−μｍ）型とし、
すすぎ液の流速は２ｍｌ／ｍｉｎ，紫外スペクトル測定
器の波長は２５４ｎｍに設定し、「活性指標成分（Ｈ１
−Ａ）」は完全に純化される、以上を特徴とする。
【０００９】上記冬虫夏草の活性留分とその中の活性成
分の分離方法において、冬虫夏草の菌株コード（ＣＳ−
１）を以下の成分の液相培養基中に接種する： 葡萄糖 ２％ ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ） ０．５％ 麦芽抽出物 ２％ ポテトデクストロースブロス ２４ｇ／ｌ （Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ） ２６±１．０℃下で静置培養（培養期間３０日）し、そ
の被子体を収集し、４５−５０℃で加熱乾燥する。得ら
れた乾燥物を粉砕研磨の後、２０倍体積のメタノールで
２４時間抽出し、粗抽出物を減圧濃縮（ＶＧＨ−ＣＧ−
１−ＭＸ）し、ＶＧＨ−ＣＧ−１−ＭＸは、逆相式高効
率液相クロマトグラフィーを採用し、Ｈ１−Ａの活性指
標成分を含有する「活性留分」と活性成分を析出する。
分の分離方法において、冬虫夏草の菌株コード（ＣＳ−
１）を以下の成分の液相培養基中に接種する： 葡萄糖 ２％ ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ） ０．５％ 麦芽抽出物 ２％ ポテトデクストロースブロス ２４ｇ／ｌ （Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ） ２６±１．０℃下で静置培養（培養期間３０日）し、そ
の被子体を収集し、４５−５０℃で加熱乾燥する。得ら
れた乾燥物を粉砕研磨の後、２０倍体積のメタノールで
２４時間抽出し、粗抽出物を減圧濃縮（ＶＧＨ−ＣＧ−
１−ＭＸ）し、ＶＧＨ−ＣＧ−１−ＭＸは、逆相式高効
率液相クロマトグラフィーを採用し、Ｈ１−Ａの活性指
標成分を含有する「活性留分」と活性成分を析出する。
【００１０】冬虫夏草より分離した「活性留分」Ｆ−２
は、計算によると、Ｆ−２中から純化して得られる活性
天然物Ｈ１−Ａ成分のＧ１５０（Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ５０）（５０％増殖抑制）は４０マイク
ロモルであり、これから算出するＨ１−Ａ治療剤量は約
４０ミリグラムである。
は、計算によると、Ｆ−２中から純化して得られる活性
天然物Ｈ１−Ａ成分のＧ１５０（Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ５０）（５０％増殖抑制）は４０マイク
ロモルであり、これから算出するＨ１−Ａ治療剤量は約
４０ミリグラムである。
【００１１】
【作用】本発明の冬虫夏草より分離した「活性留分」Ｆ
−２は、体外において活性化した腎膈細胞の増生を抑制
することができ、もって後続の腎障害を形成するステッ
プの進行を阻止し、体内においてはＩｇＡ腎炎の悪化を
阻止して血尿／蛋白尿を改善し、且つＦ−２は急性毒性
を発生せず、さらにはＩｇＡ免疫複合体が誘発する肝肥
大現象を改善し、計算によると、Ｆ−２中から純化して
得られる活性天然物Ｈ１−Ａ成分のＧ１（Ｇｒｏｗｔｈ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）（５０％増殖抑制）は４０μ
Ｍであり、これから算出するＨ１−Ａは約４０ミリグラ
ムにもなり、人類のＩｇＡ腎炎の治療において有効であ
る。
−２は、体外において活性化した腎膈細胞の増生を抑制
することができ、もって後続の腎障害を形成するステッ
プの進行を阻止し、体内においてはＩｇＡ腎炎の悪化を
阻止して血尿／蛋白尿を改善し、且つＦ−２は急性毒性
を発生せず、さらにはＩｇＡ免疫複合体が誘発する肝肥
大現象を改善し、計算によると、Ｆ−２中から純化して
得られる活性天然物Ｈ１−Ａ成分のＧ１（Ｇｒｏｗｔｈ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）（５０％増殖抑制）は４０μ
Ｍであり、これから算出するＨ１−Ａは約４０ミリグラ
ムにもなり、人類のＩｇＡ腎炎の治療において有効であ
る。
【００１２】
【実施例】本発明の探究の重点は以下２項である： 第１項： いかにして冬虫夏草の被子体から「活性留
分」及び一種の「活性成分（Ｈ１−Ａ）」を分離するか 第２項： 「活性留分」及び「活性成分」を得る方法の
フローチャートを確立すること。
分」及び一種の「活性成分（Ｈ１−Ａ）」を分離するか 第２項： 「活性留分」及び「活性成分」を得る方法の
フローチャートを確立すること。
【００１３】並びに、この「活性留分」及び「活性成
分」を人類の腎膈細胞増生の抑制に運用し、将来は臨床
に応用できるものとし、もってＩｇＡ腎炎組織の病理学
変化及び血尿／蛋白尿を改善することを目的とする。
分」を人類の腎膈細胞増生の抑制に運用し、将来は臨床
に応用できるものとし、もってＩｇＡ腎炎組織の病理学
変化及び血尿／蛋白尿を改善することを目的とする。
【００１４】ＩｇＡ腎炎は臨床上は、陣発性血尿（巨観
性或いは顕微性）及び血尿／蛋白尿で表現される。Ｉｇ
Ａ腎炎は往々にして慢性病と表現され、急性悪化する外
は病状は無症状で進行する。国外のデータによると、フ
ランス、イタリア及びスペインにおいて、発病後２０年
で２０％から３０％の病人の病状が進行して腎不全とな
る。非常に不幸なことには、今日までこの疾病の進行を
完全に阻止する治療方法はない。どのようにＩｇＡ腎炎
が形成されるかも不明である。ただ、Ｉ Ａ腎炎の腎臓
切片上に大量のＩｇＡ腎炎及び第３補体（Ｃ３）が腎膈
部に堆積しているのが見られ、これはＩｇＡ免疫複合体
が腎膈部に堆積、異なる経路により補体を活性化するこ
とにより腎障害をもたらす可能性を示す。
性或いは顕微性）及び血尿／蛋白尿で表現される。Ｉｇ
Ａ腎炎は往々にして慢性病と表現され、急性悪化する外
は病状は無症状で進行する。国外のデータによると、フ
ランス、イタリア及びスペインにおいて、発病後２０年
で２０％から３０％の病人の病状が進行して腎不全とな
る。非常に不幸なことには、今日までこの疾病の進行を
完全に阻止する治療方法はない。どのようにＩｇＡ腎炎
が形成されるかも不明である。ただ、Ｉ Ａ腎炎の腎臓
切片上に大量のＩｇＡ腎炎及び第３補体（Ｃ３）が腎膈
部に堆積しているのが見られ、これはＩｇＡ免疫複合体
が腎膈部に堆積、異なる経路により補体を活性化するこ
とにより腎障害をもたらす可能性を示す。
【００１５】これらの腎病性ＩｇＡ免疫複合体がいかに
して腎糸球障害を引き起こすか。これは簡単に述べる
と：もともと休止状態の腎膈細胞が、腎病性免疫複合体
の刺激の後、活性化する。活性化した腎膈細胞は第１介
白質（ＩＬ−１）、第６介白質（ＩＬ−６）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ α）を放出し、腎膈細胞を増殖、分化さ
せ、各種の生長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）
を放出する。この生長因子には、血小板生長因子（ＰＤ
ＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミンググロウスフ
ァクター−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ−；ＴＧＦ−β）等が含まれる。これ
らの細胞酵素及び生長因子の作用はオータコイド（ａｕ
ｔｏｃｏｉｄｓ）のようであり、腎膈を増生させて悪性
循環を呈する。かつ腎膈細胞の、酸素、過酸化水素、血
小板活性化因子（ＰＡＦ）、前立腺素Ｅ２（ＰＧ
Ｅ２）、トロンボクサンＢ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎ
Ｂ２；ＴＸＢ２）、及びニュートラルプロテイナーゼ
（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等の放出を
促進し、これによりマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）の増
生、糸球体硬化を形成し、腎基底膜の障害を引き起こ
す。
して腎糸球障害を引き起こすか。これは簡単に述べる
と：もともと休止状態の腎膈細胞が、腎病性免疫複合体
の刺激の後、活性化する。活性化した腎膈細胞は第１介
白質（ＩＬ−１）、第６介白質（ＩＬ−６）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ α）を放出し、腎膈細胞を増殖、分化さ
せ、各種の生長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）
を放出する。この生長因子には、血小板生長因子（ＰＤ
ＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミンググロウスフ
ァクター−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ−；ＴＧＦ−β）等が含まれる。これ
らの細胞酵素及び生長因子の作用はオータコイド（ａｕ
ｔｏｃｏｉｄｓ）のようであり、腎膈を増生させて悪性
循環を呈する。かつ腎膈細胞の、酸素、過酸化水素、血
小板活性化因子（ＰＡＦ）、前立腺素Ｅ２（ＰＧ
Ｅ２）、トロンボクサンＢ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎ
Ｂ２；ＴＸＢ２）、及びニュートラルプロテイナーゼ
（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等の放出を
促進し、これによりマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）の増
生、糸球体硬化を形成し、腎基底膜の障害を引き起こ
す。
【００１６】以上より、治療上は、ＩｇＡ合成の阻止或
いはＩｇＡ免疫複合体のところから着手するのが望まし
く思われる。しかし、今日の免疫学の技術はそこまで到
達していない。そのため、一歩退いて、特殊な分離方法
で自然物中から抽出され、活性化した腎膈細胞を抑制し
て腎膈細胞のそれ以上の増殖と細胞酵素及び生長因子の
放出とを阻む、薬物構造から着手する。
いはＩｇＡ免疫複合体のところから着手するのが望まし
く思われる。しかし、今日の免疫学の技術はそこまで到
達していない。そのため、一歩退いて、特殊な分離方法
で自然物中から抽出され、活性化した腎膈細胞を抑制し
て腎膈細胞のそれ以上の増殖と細胞酵素及び生長因子の
放出とを阻む、薬物構造から着手する。
【００１７】活性化した腎膈細胞は、抑制されてそれ以
上増殖せず、そのためその後の細胞酵素、生長因子放出
のステップが遮断される。このため、我々は、活性化し
た腎膈細胞の増殖の抑制をもって治療薬を探す体外選択
方法とする。我々の実験室では、腎脳細胞を活性化は、
〔３Ｈ〕−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ の方法でＤＮＡ合成することを指標とする。そ
のため、我々は、培養した人類の腎隔細胞に、第１介白
質（ＩＬ−１）、第６介白質（ＩＬ−６）を加えて活性
化し、冬虫夏草の「活性成分」を加えて〔３Ｈ〕−ｔｈ
ｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを減らし、
これを、分離体から活性化した腎膈細胞を選択し、増殖
を抑制する薬物モデルとなす。
上増殖せず、そのためその後の細胞酵素、生長因子放出
のステップが遮断される。このため、我々は、活性化し
た腎膈細胞の増殖の抑制をもって治療薬を探す体外選択
方法とする。我々の実験室では、腎脳細胞を活性化は、
〔３Ｈ〕−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ の方法でＤＮＡ合成することを指標とする。そ
のため、我々は、培養した人類の腎隔細胞に、第１介白
質（ＩＬ−１）、第６介白質（ＩＬ−６）を加えて活性
化し、冬虫夏草の「活性成分」を加えて〔３Ｈ〕−ｔｈ
ｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを減らし、
これを、分離体から活性化した腎膈細胞を選択し、増殖
を抑制する薬物モデルとなす。
【００１８】体内の選択系統（ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｃｒ
ｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）：動物モデルは特異性
（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を備えていなければなら
ず、腎組織の損傷を形成でき、対応する人類疾病と非常
に相似した特性を有するものでなければならない。以上
を考慮し、本発明の実験は、Ｒｉｆａｉ Ａ等が建立し
たＩｇＡ腎炎モデルを採用し、使用する抗原はＲ３６Ａ
とし、これは一種の肺炎連鎖球菌を純化して得た一種の
Ｃ−ポリサッカライド（Ｃ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅ）である。使用する抗原は、Ｒ３６ＡのＩｇＡ単株
抗体に対抗し、この種のハウスマウス骨髄瘤細胞株：Ｔ
ＥＰＣ−１５融合瘤（ｈｙｄｒｉｄｏｍａ）細胞株は、
抗ホスホリルコリン（ＰＣ）（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃ
ｈｏｌｉｎｅ（ＰＣ））のＩｇＡ単株抗体を生産（分
泌）し、この単株抗体は非常に特異的にＰＣと結合す
る。上述の抗原と抗体が結合して一体となり、すなわち
ＩｇＡ免疫複合体を形成する。実験上は、ハウスマウス
の腹腔に抗原（Ｒ３６Ａ）を注射し、尾に抗体（抗Ｒ３
６ＡのＩｇＡ単株抗体）を静脈注射する。これによりハ
ウスマウスの血管内にＩｇＡ免疫複合体を形成すること
ができ、血液循環を経て腎臓に至らせ、腎膈部に堆積さ
せる。これにより血尿／蛋白尿を誘発する。このハウス
マウスの腎臓より取り出した腎臓組織の切片の組織学検
査を行い、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ−Ｅｏｓｉｎ（Ｈ
Ｅ）で染色して人類のＩｇＡ腎炎と同じ変化、即ち腎膈
細胞増殖、腎膈の造成が見られた。また凍らせた切片を
蛍光染色したところ、人類のＩｇＡ腎炎と同じ変化、即
ちＩｇＡ及び腎膈部における堆積が見られた。
ｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）：動物モデルは特異性
（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を備えていなければなら
ず、腎組織の損傷を形成でき、対応する人類疾病と非常
に相似した特性を有するものでなければならない。以上
を考慮し、本発明の実験は、Ｒｉｆａｉ Ａ等が建立し
たＩｇＡ腎炎モデルを採用し、使用する抗原はＲ３６Ａ
とし、これは一種の肺炎連鎖球菌を純化して得た一種の
Ｃ−ポリサッカライド（Ｃ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅ）である。使用する抗原は、Ｒ３６ＡのＩｇＡ単株
抗体に対抗し、この種のハウスマウス骨髄瘤細胞株：Ｔ
ＥＰＣ−１５融合瘤（ｈｙｄｒｉｄｏｍａ）細胞株は、
抗ホスホリルコリン（ＰＣ）（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃ
ｈｏｌｉｎｅ（ＰＣ））のＩｇＡ単株抗体を生産（分
泌）し、この単株抗体は非常に特異的にＰＣと結合す
る。上述の抗原と抗体が結合して一体となり、すなわち
ＩｇＡ免疫複合体を形成する。実験上は、ハウスマウス
の腹腔に抗原（Ｒ３６Ａ）を注射し、尾に抗体（抗Ｒ３
６ＡのＩｇＡ単株抗体）を静脈注射する。これによりハ
ウスマウスの血管内にＩｇＡ免疫複合体を形成すること
ができ、血液循環を経て腎臓に至らせ、腎膈部に堆積さ
せる。これにより血尿／蛋白尿を誘発する。このハウス
マウスの腎臓より取り出した腎臓組織の切片の組織学検
査を行い、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ−Ｅｏｓｉｎ（Ｈ
Ｅ）で染色して人類のＩｇＡ腎炎と同じ変化、即ち腎膈
細胞増殖、腎膈の造成が見られた。また凍らせた切片を
蛍光染色したところ、人類のＩｇＡ腎炎と同じ変化、即
ちＩｇＡ及び腎膈部における堆積が見られた。
【００１９】毒性：冬虫夏草をハウスマウスの腹腔に注
射したところ、そのＬＤ５０値は２１．７±２．６ｇ／
ｋｇであり、静脈注射のＬＤ５０値は２４．５±２．２
ｇ／ｋｇであった。また口服最大耐受量は２５２．５−
３００ｇ／ｋｇであった。これは静脈注射、腹腔注射、
或いは灌胃のいずれの方法を採用しても、毒性が非常に
低いことを示す。本発明で行った急性毒性試験の方法
は、２％の「活性留分」を含む飼料をＩＣＲハウスマウ
スに５日間食べさせた後、急性毒性の有無を検査した。
射したところ、そのＬＤ５０値は２１．７±２．６ｇ／
ｋｇであり、静脈注射のＬＤ５０値は２４．５±２．２
ｇ／ｋｇであった。また口服最大耐受量は２５２．５−
３００ｇ／ｋｇであった。これは静脈注射、腹腔注射、
或いは灌胃のいずれの方法を採用しても、毒性が非常に
低いことを示す。本発明で行った急性毒性試験の方法
は、２％の「活性留分」を含む飼料をＩＣＲハウスマウ
スに５日間食べさせた後、急性毒性の有無を検査した。
【００２０】故に、冬虫夏草は薬理作用が広く、且つ毒
性が非常に少ない薬物であることが分かり、一方、過去
の研究により既知の［ＩｇＡ腎炎」は一種の免疫機制の
誘発する腎炎であって且つ現在は治療できる特殊な薬物
がなかった。そのため我々は冬虫夏草を研究対象とし、
並びに「体外培養の活性化した人類の腎膈細胞の造成を
抑制」し、「体内に誘発されるハウスマウスに発生する
ＩｇＡ腎炎を改善」する方法を選び、分離体に対して活
性化した腎膈細胞の増生を抑制でき、体内においてはＩ
ｇＡ腎炎の発生及び／或いは悪化を阻止するのに有効な
「活性留分」及び「活性成分」を冬虫夏草中に探し求
め、もってＩｇＡ腎炎の治療に用いることを期する。
性が非常に少ない薬物であることが分かり、一方、過去
の研究により既知の［ＩｇＡ腎炎」は一種の免疫機制の
誘発する腎炎であって且つ現在は治療できる特殊な薬物
がなかった。そのため我々は冬虫夏草を研究対象とし、
並びに「体外培養の活性化した人類の腎膈細胞の造成を
抑制」し、「体内に誘発されるハウスマウスに発生する
ＩｇＡ腎炎を改善」する方法を選び、分離体に対して活
性化した腎膈細胞の増生を抑制でき、体内においてはＩ
ｇＡ腎炎の発生及び／或いは悪化を阻止するのに有効な
「活性留分」及び「活性成分」を冬虫夏草中に探し求
め、もってＩｇＡ腎炎の治療に用いることを期する。
【００２１】「活性留分」及び「活性成分」を得る方法
に関する説明は、以下に述べる： 第１項：図１に示すように、本発明の冬虫夏草子実体よ
り「活性留分」及び「活性成分（Ｈ１−Ａ）」を抽出す
る方法では、まず冬虫夏草製品を乾燥箱にて加熱乾燥
（３５−６０℃）或いは送風乾燥する。これは冬虫夏草
製品の含水量が非常に高く、乾燥処理により後続の抽出
時に比較的多い極性物質も共に出てこれがシリカゲルク
ロマトグラフィーによる純化の表現に影響を与えるのを
防ぐためである。乾燥品は全て研磨機或いは粉砕機で研
磨或いは粉砕し、抽出の効率を高める。冬虫夏草の含有
する活性成分（本明細書でいう活性化した腎膈細胞を抑
制し、腎機能を改善するもの）は、比較的低極性の範囲
に属し、メタノール（或いはその他の低い炭素数のアル
コール類）、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチ
ル、クロロホルム、塩化メチレンを用いて抽出するとい
ずれも完全に抽出できる。もし活性成分の回収率が高
く、併せて非極性不純物の抽出が少ないという要素を考
慮するならば、メタノールと酢酸エチルの使用が最も適
当である。本実施例においてはメタノールを使用し、そ
の抽出のプロセスは、図１のフローチャートに示した。
本発明のクロマトグラフィーは、図２及び図３を参照す
る。これは２種の範囲に分けられる： （ａ）小規模の冬虫夏草検体中からその含有する生物活
性及び一種の活性成分を検出する方法。 （ｂ）大規模の冬虫夏草中から活性指標によりクロマト
グラフィーフローチャートを建立し、もって「活性留
分」及び一種の「活性成分」を得る方法。 上記（ａ）のいわゆる「小規模クロマトグラフィー」：
これは、僅かな冬虫夏草メタノール抽出液を逆相式カラ
ム（このカラムは先行して活性化する）を経て、メタノ
ールによりすすぐと活性留分と活性成分は吸着されない
が、少なからぬ非常に低極性の不純物を除去することが
できる。すすぎ液に対しては選択試験を進行するか、或
いは逆相式高効率クロマトグラフィーで活性成分（Ｈ１
−Ａ）に対して定量を進行する。濃縮物は並びに活性第
１ふるい分けを進行することができる。もし酢酸エチル
で冬虫夏草を抽出する場合、抽出液をまず適当に濃縮
後、等比例のｎ−ヘキサン（或いは石油エーテル）を加
え、混合液をガラス綿などで濾過し、その後、小型シリ
カゲルカラムを通過してカラムを酢酸エチル／ｎ−ヘキ
サン（１：１ ｖ／ｖ）ですすぎ、すすぎ液を濃縮後、
前述の高効率液相クロマトグラフィーを進行するか或い
は活性測定を行う。上記（ｂ）のいわゆる「大規模クロ
マトグラフィー」：冬虫夏草の宿主は幼虫期の昆虫と
し、故に製品には極めて多くの低極性代謝物が堆積し、
比較的多い低極性不純物による非常に大きな干渉が形成
される。故に、純化フローチャートには２段式のシリカ
ゲルクロマトグラフィー（すなわち重複して２回の（正
相）或いはシリカゲルクロマトグラフィーを進行）を導
入し、第１階クロマトグラフィーは活性留分と、活性成
分の極性より低い極性を有するその他の大量の一群の不
純物とを分ける。後者を、ｎ−ヘキサンに低比例の酢酸
エチルを混合（例えば、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
４：１）する方式ですすぎ、その後、迅速に移動相の極
性を引き上げ、１種の活性成分だけ含むのではない「活
性留分」を留出する。このステップで、高低両端の不純
物を除去し、活性増幅が非常に高い活性留分を得ること
ができ、これを病理動物実験に用いる。また、大幅に第
２回シリカゲルクロマトグラフィーの規模を減少する。
冬虫夏草の成分特性により、前期クロマトグラフィーは
極性大分画とみることができ、後者は各特定活性留分と
活性成分に対する細分画とみることができ、重複するも
のではない。もし、被子体からの抽出液にクロマトグラ
フィーによる純化を進行する場合は、ただ前述の第２段
階の過程を進行すればよい。これは、被子体の含有する
低極性不純物は子実体製品より大幅に少ないためであ
る。その実施方式は、以下の実施例で述べる：冬虫夏草
の子実体部分を４５−５０℃の暗所で加熱乾燥し、粉砕
後、２０倍のメタノール（ｗ／ｖ）に浸漬し、抽出液を
減圧濃縮した後、粗抽出物をシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより分離し、１：１のｎ−ヘキサン／酢酸
メチルですすぎ、酢酸メチルによる留出部分（Ｆ−２
層）部分を分離する。比較的大規模の分離フローチャー
トでは、メタノール抽出物（或いはＦ−２層）を細分画
を行うｎ−ヘキサンと酢酸メチル混合液ですすぎ、酢酸
メチルを漸次増やす方式を採り、１：２（ｖ／ｖ）の留
出部分（Ｃ−１１）を得る。Ｆ−２とＣ−１１層は明ら
かに「人類の腎膈細胞活性化を抑制する」生物活性を有
する。この２組の「活性留分」をいずれも４℃で少なく
とも３か月保存し、上述の活性を保有する。「活性留
分］中より［活性成分」を得ようとする時には、Ｃ−１
１層をシリカゲル薄層カラムクロマトグラフィーにより
不純物を除去する。その展開液はｎ−ヘキサン／酢酸メ
チル（１：１ ｖ／ｖ）を用い、２回展開し、Ｒｆ＝
０．５−０．７範囲（Ｔ−４区帯）を回収する。この過
程は前述のシリカゲルクロマトグラフィーの分離機制と
同じではあるが、更にＣ−１１層の全ての不純物を除去
することができ、後続の半設備級逆相式高効率液相分析
によりさらにＴ−４層に対して純化を進行するのに有利
である。そのうち、逆相式クロマトグラフィーのすすぎ
液はメタノール、カラム固定相は、Ｃ１８（８×２５０
−ｍｍ，５−μｍ）型とし、すすぎ液の流速は２ｍｌ／
ｍｉｎ，紫外スペクトル測定器の波長設定は２５４ｎｍ
とし、「活性指標成分（Ｈ１−Ａ）」を完全に純化する
ことができる。「活性留分」及び活性成分（Ｈ１−Ａ）
純化のフローチャートは図１に示される。活性留分Ｔ−
４の逆相液相クロマトグラフ及び完全純化のＨ１−Ａ純
度は図２、３に示される。被子体培養及び「活性指標成
分」形成の鑑定方法は、以下に述べる：冬虫夏草の菌株
コード（ＣＳ−１）を以下の成分の液相培養基中に接種
する： 葡萄糖 ２％ ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ） ０．５％ 麦芽抽出物 ２％ ポテトデクストロースブロス ２４ｇ／ｌ （Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ） ２６±１．０℃下で静置培養（培養期間３０日）し、そ
の被子体を収集し、４５−５０℃で加熱乾燥する。得ら
れた乾燥物を粉砕研磨の後、２０倍体積のメタノールで
２４時間抽出し、粗抽出物を減圧濃縮（ＶＧＨ−ＣＧ−
１−ＭＸ）する。このＶＧＨ−ＣＧ−１−ＭＸは、逆相
式高効率液相クロマトグラフィーを採用し、Ｈ１−Ａの
活性指標成分を含有することを実証する（図４に示
す）。総合すると、第１項の内容は、半人工的に培養し
た冬虫夏草の液相菌糸から「活性留分」と「活性成分」
を獲得し鑑定する方法である。
に関する説明は、以下に述べる： 第１項：図１に示すように、本発明の冬虫夏草子実体よ
り「活性留分」及び「活性成分（Ｈ１−Ａ）」を抽出す
る方法では、まず冬虫夏草製品を乾燥箱にて加熱乾燥
（３５−６０℃）或いは送風乾燥する。これは冬虫夏草
製品の含水量が非常に高く、乾燥処理により後続の抽出
時に比較的多い極性物質も共に出てこれがシリカゲルク
ロマトグラフィーによる純化の表現に影響を与えるのを
防ぐためである。乾燥品は全て研磨機或いは粉砕機で研
磨或いは粉砕し、抽出の効率を高める。冬虫夏草の含有
する活性成分（本明細書でいう活性化した腎膈細胞を抑
制し、腎機能を改善するもの）は、比較的低極性の範囲
に属し、メタノール（或いはその他の低い炭素数のアル
コール類）、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチ
ル、クロロホルム、塩化メチレンを用いて抽出するとい
ずれも完全に抽出できる。もし活性成分の回収率が高
く、併せて非極性不純物の抽出が少ないという要素を考
慮するならば、メタノールと酢酸エチルの使用が最も適
当である。本実施例においてはメタノールを使用し、そ
の抽出のプロセスは、図１のフローチャートに示した。
本発明のクロマトグラフィーは、図２及び図３を参照す
る。これは２種の範囲に分けられる： （ａ）小規模の冬虫夏草検体中からその含有する生物活
性及び一種の活性成分を検出する方法。 （ｂ）大規模の冬虫夏草中から活性指標によりクロマト
グラフィーフローチャートを建立し、もって「活性留
分」及び一種の「活性成分」を得る方法。 上記（ａ）のいわゆる「小規模クロマトグラフィー」：
これは、僅かな冬虫夏草メタノール抽出液を逆相式カラ
ム（このカラムは先行して活性化する）を経て、メタノ
ールによりすすぐと活性留分と活性成分は吸着されない
が、少なからぬ非常に低極性の不純物を除去することが
できる。すすぎ液に対しては選択試験を進行するか、或
いは逆相式高効率クロマトグラフィーで活性成分（Ｈ１
−Ａ）に対して定量を進行する。濃縮物は並びに活性第
１ふるい分けを進行することができる。もし酢酸エチル
で冬虫夏草を抽出する場合、抽出液をまず適当に濃縮
後、等比例のｎ−ヘキサン（或いは石油エーテル）を加
え、混合液をガラス綿などで濾過し、その後、小型シリ
カゲルカラムを通過してカラムを酢酸エチル／ｎ−ヘキ
サン（１：１ ｖ／ｖ）ですすぎ、すすぎ液を濃縮後、
前述の高効率液相クロマトグラフィーを進行するか或い
は活性測定を行う。上記（ｂ）のいわゆる「大規模クロ
マトグラフィー」：冬虫夏草の宿主は幼虫期の昆虫と
し、故に製品には極めて多くの低極性代謝物が堆積し、
比較的多い低極性不純物による非常に大きな干渉が形成
される。故に、純化フローチャートには２段式のシリカ
ゲルクロマトグラフィー（すなわち重複して２回の（正
相）或いはシリカゲルクロマトグラフィーを進行）を導
入し、第１階クロマトグラフィーは活性留分と、活性成
分の極性より低い極性を有するその他の大量の一群の不
純物とを分ける。後者を、ｎ−ヘキサンに低比例の酢酸
エチルを混合（例えば、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
４：１）する方式ですすぎ、その後、迅速に移動相の極
性を引き上げ、１種の活性成分だけ含むのではない「活
性留分」を留出する。このステップで、高低両端の不純
物を除去し、活性増幅が非常に高い活性留分を得ること
ができ、これを病理動物実験に用いる。また、大幅に第
２回シリカゲルクロマトグラフィーの規模を減少する。
冬虫夏草の成分特性により、前期クロマトグラフィーは
極性大分画とみることができ、後者は各特定活性留分と
活性成分に対する細分画とみることができ、重複するも
のではない。もし、被子体からの抽出液にクロマトグラ
フィーによる純化を進行する場合は、ただ前述の第２段
階の過程を進行すればよい。これは、被子体の含有する
低極性不純物は子実体製品より大幅に少ないためであ
る。その実施方式は、以下の実施例で述べる：冬虫夏草
の子実体部分を４５−５０℃の暗所で加熱乾燥し、粉砕
後、２０倍のメタノール（ｗ／ｖ）に浸漬し、抽出液を
減圧濃縮した後、粗抽出物をシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより分離し、１：１のｎ−ヘキサン／酢酸
メチルですすぎ、酢酸メチルによる留出部分（Ｆ−２
層）部分を分離する。比較的大規模の分離フローチャー
トでは、メタノール抽出物（或いはＦ−２層）を細分画
を行うｎ−ヘキサンと酢酸メチル混合液ですすぎ、酢酸
メチルを漸次増やす方式を採り、１：２（ｖ／ｖ）の留
出部分（Ｃ−１１）を得る。Ｆ−２とＣ−１１層は明ら
かに「人類の腎膈細胞活性化を抑制する」生物活性を有
する。この２組の「活性留分」をいずれも４℃で少なく
とも３か月保存し、上述の活性を保有する。「活性留
分］中より［活性成分」を得ようとする時には、Ｃ−１
１層をシリカゲル薄層カラムクロマトグラフィーにより
不純物を除去する。その展開液はｎ−ヘキサン／酢酸メ
チル（１：１ ｖ／ｖ）を用い、２回展開し、Ｒｆ＝
０．５−０．７範囲（Ｔ−４区帯）を回収する。この過
程は前述のシリカゲルクロマトグラフィーの分離機制と
同じではあるが、更にＣ−１１層の全ての不純物を除去
することができ、後続の半設備級逆相式高効率液相分析
によりさらにＴ−４層に対して純化を進行するのに有利
である。そのうち、逆相式クロマトグラフィーのすすぎ
液はメタノール、カラム固定相は、Ｃ１８（８×２５０
−ｍｍ，５−μｍ）型とし、すすぎ液の流速は２ｍｌ／
ｍｉｎ，紫外スペクトル測定器の波長設定は２５４ｎｍ
とし、「活性指標成分（Ｈ１−Ａ）」を完全に純化する
ことができる。「活性留分」及び活性成分（Ｈ１−Ａ）
純化のフローチャートは図１に示される。活性留分Ｔ−
４の逆相液相クロマトグラフ及び完全純化のＨ１−Ａ純
度は図２、３に示される。被子体培養及び「活性指標成
分」形成の鑑定方法は、以下に述べる：冬虫夏草の菌株
コード（ＣＳ−１）を以下の成分の液相培養基中に接種
する： 葡萄糖 ２％ ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ） ０．５％ 麦芽抽出物 ２％ ポテトデクストロースブロス ２４ｇ／ｌ （Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ） ２６±１．０℃下で静置培養（培養期間３０日）し、そ
の被子体を収集し、４５−５０℃で加熱乾燥する。得ら
れた乾燥物を粉砕研磨の後、２０倍体積のメタノールで
２４時間抽出し、粗抽出物を減圧濃縮（ＶＧＨ−ＣＧ−
１−ＭＸ）する。このＶＧＨ−ＣＧ−１−ＭＸは、逆相
式高効率液相クロマトグラフィーを採用し、Ｈ１−Ａの
活性指標成分を含有することを実証する（図４に示
す）。総合すると、第１項の内容は、半人工的に培養し
た冬虫夏草の液相菌糸から「活性留分」と「活性成分」
を獲得し鑑定する方法である。
【００２２】第２項： 「活性留分」と「活性成分（Ｈ１−Ａ）」 ａ．「活性留分」：メタノール抽出後純化して活性成分
（Ｈ１−Ａ）を分離するフローチャートにおいて、各ク
ロマトグラフの留分（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）中で分離体
活性表現の最も強いものには、Ｆ−２、Ｃ−１１、Ｔ−
４が含まれる。 ｂ．「活性成分」：これはＨ１−Ａを指す（スペクトル
データと構造、及び水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）グ
ラフは、図５、図６を参照願いたい）。また、上述の
「活性留分」の応用潜在力を確認し、明らかに有毒でな
くまた変質しない物質であることを示すために、Ｆ−２
分画段階でマウスに毒性試験とアメス試験（Ａｍｅｓ
ｔｅｓｔ）を行ったところ、共に無毒性で突然変異性が
ないことが明らかになった。
（Ｈ１−Ａ）を分離するフローチャートにおいて、各ク
ロマトグラフの留分（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）中で分離体
活性表現の最も強いものには、Ｆ−２、Ｃ−１１、Ｔ−
４が含まれる。 ｂ．「活性成分」：これはＨ１−Ａを指す（スペクトル
データと構造、及び水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）グ
ラフは、図５、図６を参照願いたい）。また、上述の
「活性留分」の応用潜在力を確認し、明らかに有毒でな
くまた変質しない物質であることを示すために、Ｆ−２
分画段階でマウスに毒性試験とアメス試験（Ａｍｅｓ
ｔｅｓｔ）を行ったところ、共に無毒性で突然変異性が
ないことが明らかになった。
【００２３】第３項：本発明の採用する測定方式には分
離体測定方式と活体測定方式の二つがある。そのうちの
一つは、分離体を利用して活性化した人類の腎膈細胞
（Ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ）を抑制するモデルで
あり、冬虫夏草の「活性留分」或いは「活性成分」で処
理して第１介白質（ＩＬ−１）及び第６介白質（ＩＬ−
６）が導く活性化が抑制される程度を測定して活性指標
とし、腎膈細胞活性化程度は、アイソトープで表示する
３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅがＤＮＡに転化する効率を根
拠とする以下の（表１から表５参照）
離体測定方式と活体測定方式の二つがある。そのうちの
一つは、分離体を利用して活性化した人類の腎膈細胞
（Ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ）を抑制するモデルで
あり、冬虫夏草の「活性留分」或いは「活性成分」で処
理して第１介白質（ＩＬ−１）及び第６介白質（ＩＬ−
６）が導く活性化が抑制される程度を測定して活性指標
とし、腎膈細胞活性化程度は、アイソトープで表示する
３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅがＤＮＡに転化する効率を根
拠とする以下の（表１から表５参照）
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００２４】第４項：急性毒性測定：２％のＣＳ−Ｆ−
２を含む及び含まない飼料をＩＣＲハウスマウス各６匹
に５日間与える。その結果は、以下の表６に示すよう
に、ＩｇＡ免疫複合体によりＩｇＡ腎炎を誘発した対照
組は肝臓肥大現象（平均肝臓重量／体重の比は７．１２
±０．１２）を引き起こし、２％のＦ−２を餌とした
後、明らかに肝腫現象が改善された（平均肝臓重量／体
重の比は６．７５±０．０９）。その他の肝機能は両組
共に正常範囲内であった（表６参照）。
２を含む及び含まない飼料をＩＣＲハウスマウス各６匹
に５日間与える。その結果は、以下の表６に示すよう
に、ＩｇＡ免疫複合体によりＩｇＡ腎炎を誘発した対照
組は肝臓肥大現象（平均肝臓重量／体重の比は７．１２
±０．１２）を引き起こし、２％のＦ−２を餌とした
後、明らかに肝腫現象が改善された（平均肝臓重量／体
重の比は６．７５±０．０９）。その他の肝機能は両組
共に正常範囲内であった（表６参照）。
【表６】
【００２５】第５項：生きた動物モデルを使用する方法
では、腹腔にハウスマウス抗原（Ｒ３６Ａ）と尾に抗原
（α−Ｒ３６Ａ−ＩｇＡ ｍＡｂ）を静脈注射する方法
を採り、ＩｇＡ腎炎の類似症状を発生させ、動物に血尿
と蛋白尿の現象を起こし、病理学検査でもＩｇＡ腎炎病
変を示した。冬虫夏草の「活性留分」（例えばＦ−２）
は０．５％と１％の比例で飼料中に混合し、もってそれ
が前述の症状及び病理表現を改善する効果を測定し（以
下の表７から表１０参照）、これにより冬虫夏草が実験
性のＩｇＡ腎炎を改善する効果を有することが支持され
た。
では、腹腔にハウスマウス抗原（Ｒ３６Ａ）と尾に抗原
（α−Ｒ３６Ａ−ＩｇＡ ｍＡｂ）を静脈注射する方法
を採り、ＩｇＡ腎炎の類似症状を発生させ、動物に血尿
と蛋白尿の現象を起こし、病理学検査でもＩｇＡ腎炎病
変を示した。冬虫夏草の「活性留分」（例えばＦ−２）
は０．５％と１％の比例で飼料中に混合し、もってそれ
が前述の症状及び病理表現を改善する効果を測定し（以
下の表７から表１０参照）、これにより冬虫夏草が実験
性のＩｇＡ腎炎を改善する効果を有することが支持され
た。
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【００２６】
【発明の効果】以上述べてきたように、本発明の冬虫夏
草より分離した「活性留分」Ｆ−２は、体外において活
性化した腎膈細胞の増生を抑制することができ、もって
後続の腎障害を形成するステップの進行を阻止し、体内
においてはＩｇＡ腎炎の悪化を阻止して血尿／蛋白尿を
改善し、且つＦ−２は急性毒性を発生せず、さらにはＩ
ｇＡ免疫複合体が誘発する肝肥大現象を改善し、計算に
よると、Ｆ−２中から純化して得られる活性天然物Ｈ１
−Ａ成分のＧ１（Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ）（５０％増殖抑制）は４０μＭであり、これから算
出するＨ１−Ａは約４０ミリグラムにもなり、人類のＩ
ｇＡ腎炎の治療において有効である。且つ本発明のこの
種の冬虫夏草活性留分及び分離方法は過去のいかなる公
開刊行物上にも見られるものではなく、特許請求の規定
に合致するものである。
草より分離した「活性留分」Ｆ−２は、体外において活
性化した腎膈細胞の増生を抑制することができ、もって
後続の腎障害を形成するステップの進行を阻止し、体内
においてはＩｇＡ腎炎の悪化を阻止して血尿／蛋白尿を
改善し、且つＦ−２は急性毒性を発生せず、さらにはＩ
ｇＡ免疫複合体が誘発する肝肥大現象を改善し、計算に
よると、Ｆ−２中から純化して得られる活性天然物Ｈ１
−Ａ成分のＧ１（Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ）（５０％増殖抑制）は４０μＭであり、これから算
出するＨ１−Ａは約４０ミリグラムにもなり、人類のＩ
ｇＡ腎炎の治療において有効である。且つ本発明のこの
種の冬虫夏草活性留分及び分離方法は過去のいかなる公
開刊行物上にも見られるものではなく、特許請求の規定
に合致するものである。
【図１】本発明の冬虫夏草より活性留分及び活性成分
（Ｈ１−Ａ）を抽出するフローチャートである。
（Ｈ１−Ａ）を抽出するフローチャートである。
【図２】本発明の活性留分（コード番号ＣＳ−Ｆ２−Ｃ
１１−Ｔ４）の逆相層クロマトグラフィーである。
１１−Ｔ４）の逆相層クロマトグラフィーである。
【図３】本発明の完全純化の活性成分（Ｈ１−Ａ）の逆
相クロマトグラフィーである。
相クロマトグラフィーである。
【図４】本発明の冬虫夏草液層培養被子体の逆相クロマ
トグラフィーである。
トグラフィーである。
【図５】本発明の活性成分（Ｈ１−Ａ）の化学構造及び
スペクトルデータである。
スペクトルデータである。
【図６】本発明の活性成分（Ｈ１−Ａ）の水素核磁気共
鳴グラフである。
鳴グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (4)
- 【請求項１】 冬虫夏草の被子体部分を４５−５０℃の
暗所で加熱乾燥し、粉砕後、２０倍のメタノール（ｗ／
ｖ）に２４時間浸漬し、抽出液を減圧濃縮した後、粗抽
出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離
し、１：１のｎ−ヘキサン／酢酸メチルですすぎ、酢酸
メチルによる留出部分（Ｆ−２層）部分を分離し、比較
的大規模の分離フローチャートでは、メタノール抽出物
（或いはＦ−２層）を細分画を行うｎ−ヘキサンと酢酸
メチル混合液ですすぎ、酢酸メチルを漸次増やす方式を
採り、１：２（ｖ／ｖ）の留出部分（Ｃ−１１）を得、
Ｆ−２とＣ−１１層は明らかに「人類の腎膈細胞活性化
を抑制する」生物活性を有し、この２組の「活性留分」
をいずれも４℃で少なくとも３か月保存し、上述の活性
を保存し、「活性留分」中より「活性成分」を得ようと
する時には、シリカゲル薄層カラムクロマトグラフィー
でＣ−１１層の不純物を除去し、その展開液はｎ−ヘキ
サン／酢酸メチル（１：１ ｖ／ｖ）を用い、且つ２回
展開し、Ｒｆ＝０．５−０．７範囲（Ｔ−４区帯）を回
収し、後続の半設備級逆相式高効率液相分析によりさら
にＴ−４層に対して純化を進行するのに有利とし、その
うち、逆相式クロマトグラフィーのすすぎ液はメタノー
ル、カラム固定相は、Ｃ１８（８×２５０−ｍｍ，５−
μｍ）型とし、すすぎ液の流速は２ｍｌ／ｍｉｎ，紫外
スペクトル測定器の波長は２５４ｎｍに設定し、「活性
指標成分（Ｈ１−Ａ）」は完全に純化される、以上を特
徴とする、冬虫夏草の活性留分とその中の活性成分の分
離方法。 - 【請求項２】 冬虫夏草の菌株コード（ＣＳ−１）を以
下の成分の液相培養基中に接種する： 葡萄糖 ２％ ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ） ０．５％ 麦芽抽出物 ２％ ポテトデクストロースブロス （Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ） ２６±１．０℃下で静置培養（培養期間３０日）し、そ
の被子体を収集し、４５−５０℃で加熱乾燥する。得ら
れた乾燥物を粉砕研磨の後、２０倍体積のメタノールで
２４時間抽出し、粗抽出物を減圧濃縮（ＶＧＨ−ＣＧ−
１−ＭＸ）し、ＶＧＨ−ＣＧ−１−ＭＸは、逆相式高効
率液相クロマトグラフィーを採用し、Ｈ１−Ａの活性指
標成分を含有する「活性留分」と活性成分を析出する、
請求項１に記載の冬虫夏草の活性留分とその中の活性成
分の分離方法。 - 【請求項３】 冬虫夏草より分離した「活性留分」Ｆ−
２は、計算によると、Ｆ−２中から純化して得られる活
性天然物Ｈ１−Ａ成分のＧ１５０（Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｉｏｎ５０）（５０％増殖抑制）は４０マイ
クロモルであり、これから算出するＨ１−Ａ治療剤量は
約４０ミリグラムである、請求項１に記載の冬虫夏草の
活性留分とその中の活性成分の分離方法。 - 【請求項４】 活性成分の化学構造は、以下の化学構造
式１に示される、請求項１の冬虫夏草の活性留分とその
中の活性成分の分離方法。 【化１】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6246664A JP3039604B2 (ja) | 1994-09-06 | 1994-09-06 | 冬虫夏草の活性留分とその中の活性成分の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6246664A JP3039604B2 (ja) | 1994-09-06 | 1994-09-06 | 冬虫夏草の活性留分とその中の活性成分の分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0881386A true JPH0881386A (ja) | 1996-03-26 |
| JP3039604B2 JP3039604B2 (ja) | 2000-05-08 |
Family
ID=17151783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6246664A Expired - Fee Related JP3039604B2 (ja) | 1994-09-06 | 1994-09-06 | 冬虫夏草の活性留分とその中の活性成分の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3039604B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999043698A1 (fr) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Substance possedant une structure de type steroide, procede de production associe, et agents antitumoraux contenant cette substance |
| CN109406673A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-03-01 | 江西省药明扬海医药科技有限公司 | 一种金水宝胶囊的指纹图谱检测方法 |
-
1994
- 1994-09-06 JP JP6246664A patent/JP3039604B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999043698A1 (fr) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Substance possedant une structure de type steroide, procede de production associe, et agents antitumoraux contenant cette substance |
| US6465447B1 (en) | 1998-02-27 | 2002-10-15 | Hisamitsu Pharmaceuticals Co., Inc. | Substance having steroid-like structure, process for the production thereof and antitumor agents containing the same |
| CN109406673A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-03-01 | 江西省药明扬海医药科技有限公司 | 一种金水宝胶囊的指纹图谱检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3039604B2 (ja) | 2000-05-08 |
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