TWI687405B - 一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途 - Google Patents

一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI687405B
TWI687405B TW105108065A TW105108065A TWI687405B TW I687405 B TWI687405 B TW I687405B TW 105108065 A TW105108065 A TW 105108065A TW 105108065 A TW105108065 A TW 105108065A TW I687405 B TWI687405 B TW I687405B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
layer
ester compound
phorbol ester
sub
division
Prior art date
Application number
TW105108065A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201733970A (zh
Inventor
張芳榮
陳炳宏
徐雪瑩
吳永昌
謝震
謝慧萍
Original Assignee
慧穎應用生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 慧穎應用生物科技有限公司 filed Critical 慧穎應用生物科技有限公司
Priority to TW105108065A priority Critical patent/TWI687405B/zh
Priority to CN201610160728.XA priority patent/CN107198724B/zh
Priority to US15/180,088 priority patent/US10335445B2/en
Publication of TW201733970A publication Critical patent/TW201733970A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI687405B publication Critical patent/TWI687405B/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/83—Thymelaeaceae (Mezereum family), e.g. leatherwood or false ohelo
    • A61K36/835—Aquilaria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/231—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having one or two double bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/58—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by liquid-liquid treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
    • C07C69/22—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen having three or more carbon atoms in the acid moiety
    • C07C69/33—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen having three or more carbon atoms in the acid moiety esterified with hydroxy compounds having more than three hydroxy groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/52—Esters of acyclic unsaturated carboxylic acids having the esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/533—Monocarboxylic acid esters having only one carbon-to-carbon double bond
    • C07C69/58—Esters of straight chain acids with eighteen carbon atoms in the acid moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/52—Esters of acyclic unsaturated carboxylic acids having the esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/587—Monocarboxylic acid esters having at least two carbon-to-carbon double bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/732—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids of unsaturated hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/738—Esters of keto-carboxylic acids or aldehydo-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/40—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing four condensed rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途，係指一種由沉香樹籽經萃取、分離純化後之萃取物具有抗過敏之活性，而可應用於製備抗過敏藥物之用途。

Description

一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途
本發明係為一種沉香樹(Aquilaria malaccensis)籽萃取物之製備方法，及該萃取物應用於抗過敏之用途。
由於全球環境隨工業的發展使污染隨之增加，且因土地開發之因素，造成綠地、森林(如：巴西之雨林)大幅減少，使環境氣候改變，造成罹患過敏性疾病之患者逐年增加，其罹病年齡層也有下降之趨勢；而過敏性疾病係免疫系統接觸環境中部分對一般人影響不大的過敏原因子後，所引發的一系列超敏反應現象；而人體對於某些因子過度反應的現象，包含過敏性鼻炎、食物過敏、蕁麻疹、異位性皮膚炎、哮喘與全身型過敏性反應等，症狀可能有紅眼、引起搔癢的皮疹、流鼻水、呼吸困難與腫脹等。
而過敏反應中由免疫球蛋白E(IgE)為媒介的過敏，是一種常見的免疫系統失調的反應，其會與過敏原結合，並釋放組織胺等引起發炎的化學物質，過敏的治療包含有避開已知的過敏原和使用皮質類固醇與抗組織胺藥；當嚴重過敏時，則會於靜脈注射腎上腺素，藉以抑制細胞之過敏反應，特別的是，在IgE媒介的過敏反應中，例如過敏性鼻炎、急性氣喘和異位性濕疹，肥大細胞之去顆粒(β-葡萄糖醛酸酶與組織胺的釋放)扮演著關鍵的角色；在體外過敏反應試驗中，活化的肥大細胞(RBL-2H3細胞) 會釋出β-葡萄糖醛酸酶與組織胺。雖然目前過敏症狀可以治療，但可用的藥物在長期使用的情況下會容易引起不良反應，而因天然物不僅容易取得且成份組成較合成藥物安全，因此尋找有活性的天然物作為治療過敏的替代藥物，實為目前業界所欲解決之課題。
就以沉香樹(Aquilaria malaccensis)而言，其係屬於瑞香科植物，為珍貴的芳香樹脂來源，該樹脂作用為植物的防禦機制，用來抵禦病原體的入侵，其可作為強心劑、驅風、平喘、壯陽藥和澀補之用，而且對治療腹瀉、痢疾、痛風、風濕、癱瘓以及寄生蟲有效，亦對治療皮膚病有益；另外，沉香亦被發現具有抗憂鬱、抗神經發炎、鎮痛、抗發炎、抗氧化、抗菌等活性，而在體內試驗中亦具有降血糖以及緩瀉效果。
尤其，沉香樹的莖與樹幹之酒精萃取物具有強心的作用、對人類表皮癌細胞與P-388淋巴白血球細胞的試管內實驗具有細胞毒殺效果；而其水萃物則顯示具有抗錐蟲、抗菌以及體內體外抗過敏之功效；過去曾由沉香(A.malaccensis)樹幹分離出一個佛波酯化合物，名為12-O-(2Z,4E,6E)-deca-2,4,6-trienoylphorbol-13-acetate，被認為具有刺激性、促炎性和促癌性者，惟其並未針對其抗過敏之活性深入研究，故該化合物抗過敏之活性並不可知。
另外，由於利用沉香樹之莖與樹幹作萃取，且因沉香樹之生長速度較為緩慢，其並無法大量、有效率提供莖、樹幹來萃取者；有鑑於此，本發明人等遂以可較易取得且不影響沉香樹生長之沉香樹(Aquilaria malaccensis)籽來試驗研究，使其可提供治療過敏替代藥物之天然物，終於構思出本案且確已得相關研究成果，而完成本發明。
本發明之主要目的，即在於提供一種可有效製備可抗過敏藥物之沉香樹籽萃取物及其製備方法。
本發明之次一目的，即在於提供一種將沉香樹籽萃取物應用於抗過敏之用途。
為達到上述目的，本發明包含有如下步驟：(a)將沉香樹(Aquilaria malaccensis)籽經陰乾、磨粉後以90%乙醇萃取3次，並經減壓濃縮抽乾後獲得乙醇萃取物(EtOH)；(b)以水(water)及乙酸乙酯(EtOAc)對乙醇萃取物(EtOH)進行3次等比例之液液層析進行，以獲得乙酸乙酯劃分層(EtOAc layer)及水層(H2O later)；(c)以正己烷(n-hex)和90%甲醇水溶液(MeOH)對乙酸乙酯劃分層(EtOAc layer)進行液液層析，以獲得正己烷劃分層(n-hex layer)與甲醇劃分層(MeOH layer)；(d)將甲醇劃分層(MeOH layer)以矽膠管柱層析，藉由正己烷(n-hex)：二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)以6：3：1、6：4：1、6：6：1、6：8：1、6：10：1、6：10：2之比例所組成之冲提液進行梯度冲提，從而獲得6個劃分層AM1、AM2、AM3、AM4、AM5、AM6；(e)將AM4劃分層以1：1比例之二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)之葡聚醣凝膠LH-20(Sephadex LH-20)管柱進行分離，從而獲得8個次劃分層AM4-1、AM4-2、AM4-3、AM4-4、AM4-5、AM4-6、AM4-7、AM4-8； (f)將AM4-3次劃分層經由矽膠管柱層析，以1：10至4：1比例的乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出15個子劃分層AM4-3-1、AM4-3-2、AM4-3-3、AM4-3-4、AM4-3-5、AM4-3-6、AM4-3-7、AM4-3-8、AM4-3-9、AM4-3-10、AM4-3-11、AM4-3-12、AM4-3-13、AM4-3-14及AM4-3-15；(g)將AM4-4次劃分層經由矽膠管柱層析以1：15~4：1比例之乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出12個子劃分層AM4-4-1、AM4-4-2、AM4-4-3、AM4-4-4、AM4-4-5、AM4-4-6、AM4-4-7、AM4-4-8、AM4-4-9、AM4-4-10、AM4-4-11、AM4-4-12；藉由上述之步驟，即可由AM4-4-9子劃分層獲得一新佛波酯化合物I，其如下式(I)之結構，
Figure 105108065-A0101-12-0004-3
 而由上述AM4-3-6子劃分層及AM4-4-3子劃分層獲得一新佛波酯化合物Ⅱ，其結構如下式(Ⅱ)：
Figure 105108065-A0101-12-0004-4
 再，由上述AM4-3-13子劃分層獲得一新佛波酯化合物Ⅲ，其結構如下式(Ⅲ)：
Figure 105108065-A0101-12-0005-5
 另，由上述AM4-3-13子劃分層獲得一新佛波酯化合物Ⅳ，其結構如下式(Ⅳ)：
Figure 105108065-A0101-12-0005-6
 再，由上述AM4-4-7子劃分層及AM4-4-8子劃分層可獲得已知佛波酯化合物V及佛波酯化合物Ⅵ，該佛波酯化合物V之結構如下式(V)，該佛波酯化合物Ⅵ之結構如下式(Ⅵ)：
Figure 105108065-A0101-12-0005-7
Figure 105108065-A0101-12-0006-8
 故，藉由上述結構之佛波酯化合物，即可用以製備抗過敏藥物，以應用於抗過敏用途。
第1圖係本發明之流程圖。
第2圖係本發明AM4-3次劃分層分離以獲得15個子劃分層之流程圖。
第3圖係本發明AM4-4次劃分層分離以獲得12個子劃分層之流程圖。
第4圖係乙醇萃取物(EtOH)、甲醇劃分層(MeOH)、AM4劃分層以及AM4-4次劃分層之核磁共振光譜的氫譜比較圖。
第5圖係本發明佛波酯化合物I之核磁共振之氫譜。
第6圖係本發明佛波酯化合物I之核磁共振之碳譜。
第7圖係本發明佛波酯化合物Ⅱ之核磁共振之氫譜。
第8圖係本發明佛波酯化合物Ⅱ之核磁共振之碳譜。
第9圖係本發明佛波酯化合物Ⅲ之核磁共振之氫譜。
第10圖係本發明佛波酯化合物Ⅲ之核磁共振之碳譜。
第11圖係本發明佛波酯化合物Ⅳ之核磁共振之氫譜。
第12圖係本發明佛波酯化合物Ⅳ之核磁共振之碳譜。
第13圖係本發明佛波酯化合物V之核磁共振之氫譜。
第14圖係本發明佛波酯化合物V之核磁共振之碳譜。
第15圖係本發明佛波酯化合物Ⅵ之核磁共振之氫譜。
第16圖係本發明之抗過敏活性實驗結果表。
第17圖係本發明之抑制率實驗結果表。
第18圖係本發明之細胞毒性篩選實驗結果表。
第19圖係本發明之去顆粒活性試驗結果。
有關本發明為達到目的所運用之技術手段及其方法，茲謹再配合第1~3圖所示之流程圖、第4~15圖所示之核磁共振分析圖，及第16~19圖之實驗結果表，詳細說明如下：如第1~3圖所示之流程圖，其係用以製備沉香樹(Aquilaria malaccensis)籽萃取物之製備方法，詳細說明如下：
(a)將沉香樹(Aquilaria malaccensis)籽經陰乾、磨粉後以90%乙醇萃取3次，並經減壓濃縮抽乾後獲得乙醇萃取物(EtOH)；取陰乾、磨粉後之沉香樹籽462公克，在室溫下以5公升之90%乙醇萃取3次，並經由減壓濃縮抽乾後獲得27.7公克之乙醇萃取物(EtOH)。
(b)以水及乙酸乙酯(EtOAc)對乙醇萃取物(EtOH)進行3次等比例之液液層析進行，以獲得乙酸乙酯劃分層(EtOAc layer)及水層(H2O later)；以1公升的水和乙酸乙酯(EtOAc)對乙醇萃取物(EtOH)進行3次等比例的液液層析，並獲得25.6公克之乙酸乙酯劃分層(EtOAc layer)及水層(H2O later)。
(c)以正己烷(n-hex)和90%甲醇水溶液(MeOH)對乙酸乙酯劃分層(EtOAc layer)進行液液層析，以獲得正己烷劃分層(n-hex layer)與甲醇劃分層(MeOH layer)；以正己烷(n-hex)和90%甲醇水溶液(MeOH)對25.6公克之乙酸乙酯劃分層(EtOAc layer)進行液液層析，以劃分獲得7.1公克之正己烷劃分層(n-hex layer)和16.2公克之甲醇劃分層(MeOH layer)；又，該水層(H2O later)可分離純化出正丁醇劃分層(n-butanol layer)及水劃分層(water layer)。
(d)將甲醇劃分層(MeOH layer)以矽膠管柱層析，藉由正己烷(n-hex)：二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)以6：3：1、6：4：1、6：6：1、6：8：1、6：10：1、6：10：2之比例所組成之冲提液進行梯度冲提，從而獲得6個劃分層AM1、AM2、AM3、AM4、AM5、AM6；將甲醇劃分層(MeOH layer)經由矽膠管柱層析(23cm×4cm,silica gel 60,0.063-0.200mm,Merck)，藉由正己烷(n-hex)：二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)以6：3：1、6：4：1、6：6：1、6：8：1、6：10：1、6：10：2之比例所組成之冲提液進行梯度冲提，從而獲得2917毫克之AM1劃分層、1320毫克之AM2劃分層、6834毫克之AM3劃分層、3212.2毫克之AM4劃分層、1703毫克之AM5劃分層及97.9毫克之AM6劃分層。
(e)將AM4劃分層以1：1比例之二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)之葡聚醣凝膠LH-20(Sephadex LH-20)管柱進行分離，從而獲得8個次劃分層AM4-1、AM4-2、AM4-3、AM4-4、AM4-5、AM4-6、AM4-7、AM4-8；將上述步驟中AM4劃分層以1：1比例之二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)之葡聚醣凝膠LH-20(Sephadex LH-20)管柱進行分離，從而獲得 688毫克之AM4-1次劃分層、688毫克之AM4-2次劃分層、762毫克之AM4-3次劃分層、173.7毫克之AM4-4次劃分層、609毫克之AM4-5次劃分層、253.5毫克之AM4-6次劃分層、80毫克之AM4-7次劃分層及80毫克之AM4-8次劃分層；其中該AM4-3及AM4-4次劃分層含有豐富的佛波酯。
(f)將AM4-3次劃分層經由矽膠管柱層析，以1：10至4：1比例的乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出15個子劃分層AM4-3-1、AM4-3-2、AM4-3-3、AM4-3-4、AM4-3-5、AM4-3-6、AM4-3-7、AM4-3-8、AM4-3-9、AM4-3-10、AM4-3-11、AM4-3-12、AM4-3-13、AM4-3-14及AM4-3-15；將上述步驟(e)中762毫克之AM4-3次劃分層矽膠管柱層析(17cm×4cm,Geduran Si 60,0.040-0.063mm,Merck)，以1：10至4：1比例的乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出3.4毫克之AM4-3-1子劃分層、25.3毫克之AM4-3-2子劃分層、345.6毫克之AM4-3-3子劃分層、49.2毫克之AM4-3-4子劃分層、16.4毫克之AM4-3-5子劃分層、39.5毫克之AM4-3-6子劃分層、8.4毫克之AM4-3-7子劃分層、3.8毫克之AM4-3-8子劃分層、42.7毫克之AM4-3-9子劃分層、23毫克之AM4-3-10子劃分層、42.5毫克之AM4-3-11子劃分層、43.5毫克之AM4-3-12子劃分層、23.5毫克之AM4-3-13子劃分層、7.9毫克之AM4-3-14子劃分層及38.3毫克之AM4-3-15子劃分層(如第2圖所示)，且該4-3-13子劃分層中含有豐富的佛波酯。
(g)將AM4-4次劃分層經由矽膠管柱層析以1：15~4：1比例之乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出12個子劃分層AM4-4-1、AM4-4-2、AM4-4-3、AM4-4-4、AM4-4-5、AM4-4-6、AM4-4-7、AM4-4-8、AM4-4-9、AM4-4-10、AM4-4-11、AM4-4-12；將上述步驟(e)中 173.7毫克之AM4-4次劃分層經由矽膠管柱層析(30cm×1.5cm,Geduran Si 60,0.040-0.063mm,Merck)以1：15~4：1比例之乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出2.2毫克之AM4-4-1子劃分層、16.3毫克之AM4-4-2子劃分層、3.5毫克之AM4-4-3子劃分層、5.7毫克之AM4-4-4子劃分層、7.7毫克之AM4-4-5子劃分層、11.5毫克之AM4-4-6子劃分層、37.6毫克之AM4-4-7子劃分層、6.8毫克之AM4-4-8子劃分層、43.9毫克之AM4-4-9子劃分層、3.3毫克之AM4-4-10子劃分層、3.5毫克之AM4-4-11子劃分層及23.5毫克之AM4-4-12子劃分層(如第3圖所示)，且該4-4-7及4-4-9子劃分層中含有豐富的佛波酯。
(h)取得AM4-4-9子劃分層中之萃取物，獲得佛波酯化合物I(12-O-(2Z,4E,6E)-tetradeca-2,4,6-trienoylphorbol-13-acetate)；取得上述AM4-4-9子劃分層中之萃取物，而其含有43.9毫克的新佛波酯化合物I(12-O-(2Z,4E,6E)-tetradeca-2,4,6-trienoylphorbol-13-acetate)，其分子式為C36H50O8，其結構如下式(I)：
Figure 105108065-A0101-12-0010-9
(i)取得AM4-3-6子劃分層及AM4-4-3子劃分層中之萃取物，從而獲得新佛波酯化合物Ⅱ；將AM4-4-3子劃分層中之萃取物，而其共含有8.8毫克新佛波酯化合物Ⅱ(12-deoxy-13-O-acetoylphorbol-20-octadec -9-enoate)，其分子式為C40H62O7，其結構如下式(Ⅱ)：
Figure 105108065-A0101-12-0011-10
(j)取得AM4-3-13子劃分層中之萃取物，其含有新佛波酯化合物Ⅲ及新佛波酯化合物Ⅳ；取得23.5毫克AM4-3-13子劃分層中之萃取物，而其含有0.7毫克新佛波酯化合物Ⅲ(12-O-(2E,4E)-6-oxohexa-2,4-dienoylphorbol-13-acetate)及0.9毫克之新佛波酯化合物Ⅳ(12-O-(2E,4E)-6,7-dihydroxytetradeca-2,4-dienoylphorbol-13-acetate)，該新佛波酯化合物Ⅲ分子式為C28H34O9，其結構如下式(Ⅲ)；而該新佛波酯化合物Ⅳ分子式為C36H52O10，其結構如下式(Ⅳ)：
Figure 105108065-A0101-12-0011-11
Figure 105108065-A0101-12-0011-12
(k)取得AM4-4-7子劃分層及AM4-4-8子劃分層中之萃取 物，從而獲得已知的佛波酯化合物V(12-deoxyphorbol 13-decanoate)與佛波酯化合物Ⅵ(12-deoxyphorbol 13-octanoate)；取得AM4-4-7子劃分層與AM4-4-8子劃分層中之萃取物，而其內共含有8.5毫克已知的佛波酯化合物V與1.4毫克已知的佛波酯化合物Ⅵ，該佛波酯化合物V分子式為C30H46O6，其結構如下式(V)，而該佛波酯化合物Ⅵ分子式為C28H42O6，其結構如下式(Ⅵ)：
Figure 105108065-A0101-12-0012-13
Figure 105108065-A0101-12-0012-14
又，請參閱第4圖所示之核磁共振光譜的氫譜比較圖，其可看出乙醇萃取物(EtOH)、甲醇劃分層(MeOH)、AM4劃分層以及AM4-4次劃分層確實均含有佛波酯化合物，且發現抗過敏的活性與佛波酯化合物訊號的增加成正比例關係。
有關上述佛波酯化合物I(12-O-(2Z,4E,6E)-tetradeca-2,4,6-trienoylphorbol-13-acetate)，經分析後，其分子量為HRESIMS m/z 633.33980 [M+Na]+(calcd for C36H50O8Na,633.33979)；旋光度為[α]D 25：-3.75±1.97(c 0.0667,CHCl3)；其紫外光譜為UV(MeOH)λmax(log ε)：303(2.78),233(2.75)nm；其紅外光譜IR(neat)νmax：3413,2965,2922,1710,1615,1377,1258,1092,802cm-1；其核磁共振氫譜如第5圖所示，其核磁共振碳譜則如第6圖所示。
有關上述佛波酯化合物Ⅱ(12-deoxy-13-O-acetoylphorbol-20-octadec-9-enoate)，經分析後，其分子量為HRESIMS m/z 677.43884[M+Na]+(calcd for C40H62O7Na,677.43878)；旋光度為[α]D 25：+2.91±0.49(c 0.3333,CHCl3)；紫外光譜為UV(MeOH)λmax(log ε)：285(2.78),250(2.83)nm；紅外光譜為IR(neat)ν max：3409,2922,2855,1717,1375,1332,1152,1021cm-1；其核磁共振氫譜如第7圖所示，其核磁共振碳譜則如第8圖所示。
有關上述佛波酯化合物Ⅲ(12-O-(2E,4E)-6-oxohexa-2,4-dienoylphorbol-13-acetate)，經分析後，其分子量為HRESIMS m/z 537.20959[M+Na]+(calcd for C28H34O9Na,537.20950)；旋光度為[α]D 25：+4.20±0.82(c 0.1667,CHCl3)；紫外光譜為UV(MeOH)λmax(log ε)：295(2.80),249(2.84)nm；紅外光譜為IR(neat)ν max：3413,2925,2855,2360,2339,1625,1597,1261,1184,755cm-1；其核磁共振氫譜如第9圖所示，其核磁共振碳譜則如第10圖所示。
有關上述佛波酯化合物Ⅳ(12-O-(2E,4E)-6,7-dihydroxytetradeca-2,4-dienoylphorbol-13-acetate)，經分析後，其分子量為HRESIMS m/z 667.34515[M+Na]+(calcd for C36H52O10Na,667.34527)；旋光度為[α]D 25：+10.44±1.45(c 0.1667,CHCl3)；紫外光譜為UV(MeOH)λmax(log ε)：289 (2.79),249(2.83)nm；紅外光譜為IR(neat)ν max：3392,2925,2851,1710,1632,1455,1375,1261,1024,802,755cm-1；其核磁共振氫譜如第11圖所示，其核磁共振碳譜則如第12圖所示。
有關上述佛波酯化合物V(12-deoxyphorbol 13-decanoate)，經分析後，其分子量為HRESIMS m/z 525.31921[M+Na]+(calcd for C30H46O6Na,525.31921)；旋光度為[α]D 25：+8.55±0.63(c 0.200,CHCl3)；紫外光譜為UV(MeOH)λmax(log ε)：325(0.14),249(1.31)nm；紅外光譜為IR(neat)ν max：3392,2925,2356,1710,1629,1335,1155cm-1；其核磁共振氫譜如第13圖所示，其核磁共振碳譜則如第14圖所示。
有關上述佛波酯化合物Ⅵ(12-deoxyphorbol 13-octanoate)，經分析後，其分子量為475[M+H]+(calcd for C28H43O6)；旋光度為[α]D 25：+4.75±1.27(c 0.200,CHCl3)；紫外光譜為UV(MeOH)λmax(log ε)：311(0.01),250(2.85)nm；紅外光譜IR(neat)ν max：3377,2922,2858,1710,1625,1332,1018cm-1；其核磁共振氫譜如第15圖所示。
另，在本說明書和申請專利範圍中，提供的化學式名稱應涵蓋其所有光學異構物和立體異構物，因此，所有此等異構物均包括在本發明範圍內。
而為研究試驗本發明沉香樹籽萃取物抗過敏之效率及活性分析，本發明係進行下列實驗：細胞培養：本發明取得由黏膜肥大細胞分離出來的大鼠嗜鹼性細胞株(RBL-2H3)。細胞生長於添加了10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素的Dulbecco改良式Eagle(DMEM)培養基的10 公分細胞培養皿中，在培養箱中設37℃、空氣含5%二氧化碳之條件下培養。
樣品準備：將經上述沉香樹籽萃取物製備方法所製備出之沉香樹籽萃取物，如：乙醇萃取物(EtOH)、正丁醇劃分層(BuOH)、水劃分層(Water)、乙酸乙酯劃分層(EtOAc)、正己烷劃分層(Hexane)、甲醇劃分層(MeOH)及經分離之AM4劃分層、AM4-4次劃分層、AM4-4-7子劃分層、AM4-4-8子劃分層及AM4-4-9子劃分層等物質作為樣品；而其中該AM4-4-9子劃分層之物質即屬新佛波酯化合物I。
細胞存活率試驗：細胞存活率試驗是以顯色劑噻唑藍(MTT，四甲基偶氮唑鹽(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)來測量樣品對RBL-2H3肥大細胞造成的潛在毒性作用，簡而言之，在96孔微量盤中接種RBL-2H3肥大細胞(2×104細胞/孔)靜置過夜後，添加不同濃度的樣品(10-100μg/mL)並靜置24小時。在每孔加入80μL噻唑藍溶液(0.5mg/mL)一小時後，以80μL二甲基亞碸沖洗掉甲瓚(formazan)結晶，將微量盤分析儀(Multiskan Ascent,Thermo Scientific)設定在595nm波長，測量吸光度。各樣品的細胞存活率是實驗組(添加樣品細胞)除以對照值(無添加樣品細胞)的百分比來計算。對二甲基亞碸最大的耐受劑量為0.5%，且所有實驗至少重複二次以上；藉此，即可得如第16圖所示之抗過敏活性結果表。
以卡西霉素A23187或抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶去顆粒試驗：以卡西霉素A23187和抗原誘導RBL-2H3肥大細胞去顆粒的程度，是由β-葡萄糖醛酸酶釋放試驗，經由下列方式改良的方法來測定：接種 RBL-2H3肥大細胞(2×104cells/well)在96孔微量盤和RBL-2H3肥大細胞(3×104cells/well)在48孔微量盤中，分別供給卡西霉素A23187誘導實驗和抗原誘導實驗所用，在細胞中加入各種濃度的樣品，靜置20小時；使用迪皮質醇(10nM)作為正對照組。在抗原誘導實驗中，細胞首先以抗-二硝基苯酚IgE單克隆抗體(anti-dinitrophenol IgE,anti-DMP IgE)(5μg/mL)被動高敏至少2小時，將細胞以預熱的台羅德氏緩衝液(135mM氯化鈉，5mM氯化鉀，1.8mM氯化鈣，1.0mM氯化鎂，5.6mM葡萄糖，20mM 4-羥乙基呱嗪乙磺酸，pH 7.4)徹底沖洗後，各別以台羅德氏緩衝液配製的鈣離子載體A23187(卡西霉素，1μM)或抗原二硝基苯-胎牛血清共軛物(100ng/mL)刺激一小時。為測量β-葡萄糖醛酸酶釋放的總量，將未受刺激的細胞以0.5%的Triton X-100溶液裂解，或者不進行處理使細胞自發性的釋放β-葡萄糖醛酸酶；分裝上清液(50μL)與等量的1μM聚氮-乙醯葡萄糖胺(抗原)配製於0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH 4.5)中，用作釋放β-葡萄糖醛酸酶的基底。在37℃下培養1小時後，加入100μL的終止緩衝液(0.1M Na2/NaHCO3,pH 10.0)猝滅反應。將微量盤分析儀(Multiskan Ascent,Thermo Scientific)設定在405nm波長，測量吸光度；β-葡萄糖醛酸酶釋放的抑制百分比是實驗組除以對照值(未處理細胞)的百分比來計算；對二甲基亞碸最大的耐受劑量為0.5%，且所有實驗重複三次；藉此，即可得如第16圖所示之抗過敏活性結果表。
β-葡萄糖醛酸酶之酵素活性影響：為測試樣品是否可能直接影響酵素活性，因此進行以下試驗，將含有細胞懸浮液(2×106cells)的台羅德氏緩衝液(2mL)以超音波震盪5分鐘後進行離心，將上清液以8mL 台羅德氏緩衝液稀釋成酵素溶液；取該酵素溶液(45μL)和樣品溶液(5μL)於96孔微量盤中，依照前述方式(Materials and Methods 3.6)測量酵素活性，所有實驗重複三次以上；藉此，即可得如第16圖所示之抗過敏活性結果表。
樣品誘導之β-葡萄糖醛酸酶直接去顆粒試驗：在RBL-2H3肥大細胞中，由樣品引發的β-葡萄糖醛酸酶的釋放量是以改良過的β-葡萄糖醛酸酶釋放實驗來決定；簡單地說，將RBL-2H3肥大細胞(4×104cells/well)接種於48孔微量盤中，加入樣品後靜置10小時。將台羅德氏緩衝液加入5.6mM葡萄糖、2mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和2mM谷氨酸以製備樣品和細胞所用。50μL的上清液轉移至96孔微量盤，依照前述方式(Materials and Methods 3.6)測量β-葡萄糖醛酸酶的釋放量，卡西霉素A23187(1μM)做為正對照組，所有實驗進行重複三次以上；藉此，即可得如第16圖所示之抗過敏活性結果表。
人類嗜中性粒細胞之備製：從健康成年志願者(20~30歲)的靜脈血液，以Ficoll-Hypaque聚蔗糖泛影葡胺分層液密度梯度離心法、低滲裂解紅血球以及葡聚醣沉澱等標準方法，分離出人類嗜中性粒細胞；純化的嗜中性粒細胞，經過台盼蘭排除法測定後，仍有超過98%嗜中性粒細胞存活可用，將細胞懸浮於pH 7.4的無鈣離子Hank’s緩衝鹽溶液(HBSS)中，保持在4℃的情況下備用。
抑制超氧陰離子生成試驗與彈性蛋白酶釋放之抑制試驗：嗜中性粒細胞超氧陰離子的生成，是以超氧化物歧化酶(SOD)抑制細胞色素還原法來測定，而嗜苯胺藍顆粒的去顆粒反應則是經由彈性蛋白酶釋放測定方法來測定；藉此，即可得如第17圖所示之抑制率結果表。
細胞毒殺試驗：細胞毒殺試驗是依據過去文獻的方法來進行的，將人類肝癌細胞株HepG2(1×104cells)、人類肺癌細胞株A549(5×103cells)以及人類乳腺癌細胞株MDA-MB231(1×104cells)等三種癌細胞株接種於96孔微量盤中，各別加入濃度20μg/mL的沉香樹籽樣品；靜置72小時後，將培養盤去除培養基並在每個孔中加入100μL噻唑藍顯色劑溶液(0.5mg/mL)，並在37℃下培養一小時；以二甲基亞碸(100μL)沖洗掉甲瓚(formazan)結晶，將微量盤分析儀(Multiskan Ascent,Thermo Scientific)設定在595nm波長，測量吸光度；阿黴素作為正對造組；藉此，即可得如第18圖所示之細胞毒性篩選結果。
藉由上述實驗之試驗結果，可得如第16圖所示之卡西霉素A23187與抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶釋放實驗(抗過敏活性)試驗結果，及第17圖所示抗過敏活性試驗(在人類嗜中性粒細胞fMLP/CB誘導超氧陰離子之產生與彈性蛋白酶之釋放的抑制作用)結果；另外，在佛波酯豐集之AM4劃分層和佛波酯化合物I對無添加刺激劑之肥大細胞RBL-2H3的去顆粒活性試驗中，在肥大細胞RBL-2H3中，施予AM4(10μg/mL)和佛波酯化合物I(10μg/mL)後靜置10小時，以添加葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)和谷氨酸的台羅德氏緩衝液作為培養基，卡西霉素A23187(1μM)作為陽性控制組，則可得如第19圖所示之去顆粒活性試驗結果。
接著，由第16圖所示之沉香樹籽萃取物、劃分層以及佛波酯化合物I之抗過敏活性結果可知，其沉香樹籽之乙醇萃取物(EtOH)於以卡西霉素A23187與抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶釋放實驗(抗過敏作用分析)中，結果分別為IC50值：0.92和3.9μg/Ml；而為闡明實驗樣品的抗過 敏活性是來自於抑制β-葡萄糖醛酸酶的釋放，而不是來自於直接抑制β-葡萄糖醛酸酶活性所造成的假陽性結果，其係分離出β-葡萄糖醛酸酶並與活性樣品進行測試，結果顯示沒有樣品會抑制β-葡萄糖醛酸酶的酵素活性；而因該甲醇劃分層(MeOH)具有最佳的抗過敏活性(以卡西霉素A23187與抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶釋放實驗中，結果分別為IC50值：0.0089和0.069μg/mL)，因此，進一步將該劃分層以矽膠管柱層析進行分離，得到六個劃分層AM1~AM6；其中，AM4劃分層在肥大細胞中以卡西霉素A23187誘導β-葡萄糖醛酸酶的抑制結果為IC50值：0.0034μg/mL，而以抗原誘導之誘導β-葡萄糖醛酸酶的抑制結果為IC50值：0.0065μg/Ml，因此該AM4劃分層具有最顯著的抗過敏活性。
而由第17圖所示之抗發炎試驗結果可知，沉香樹籽之乙醇萃取物(EtOH)對於超氧陰離子的產生與彈性蛋白酶的釋放分別有90.1%和85.3%的抑制效果；而除了沉香樹籽萃取物的水劃分層以外，其餘的劃分層均具有顯著的抗過敏和抗發炎活性。
而由第18圖可知，在對人類肝癌細胞株HepG2、人類肺癌細胞株A549以及人類乳腺癌細胞株MDA-MB231等進行細胞毒殺試驗中，僅有一些沉香樹籽萃取的劃分層，在濃度為20μg/mL時具有細胞毒殺活性，正丁醇劃分層(BuOH)對人類肺癌細胞株A549具有57.1%的毒殺效果，前述之AM4劃分層對人類肺癌細胞株A549和人類乳腺癌細胞株MDA-MB231各別具有56.5%和79.3%的致死率，而另一個AM6劃分層對人類乳腺癌細胞株MDA-MB231具有56.0%的毒殺效果；同時，由於沉香樹籽對於RBL-2H3肥大細胞的弱毒性，使得具抗過敏活性的AM4劃分層之治療 指數達到28000(如第16圖所示)。為了進一步排除AM4劃分層直接造成肥大細胞活化的可能性，針對AM4劃分層本身引發肥大細胞去顆粒(β-葡萄糖醛酸酶釋放)的能力進行研究，結果顯示，與控制組相比之下，AM4劃分層的施予不會引起顯著的去顆粒作用，即AM4劃分層的施予不會導致β-葡萄糖醛酸酶釋放(如第16圖所示)。
特別的是，由第16圖可知，該AM4-4次劃分層(其對以卡西霉素A23187與抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶釋放之抑制結果，IC50值分別為4.8×10-5μg/mL和6.8×10-4μg/mL，而治療指數分別為1477328和103776)分離出活性最佳的AM4-4-8子劃分層(其對以卡西霉素A23187與抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶釋放之抑制結果，IC50值分別為7.6×10-6μg/mL和8.0×10-5μg/mL，而治療指數分別為9645374和9645374)以及一個新的佛波酯化合物I，其對以卡西霉素A23187與抗原誘導之β-葡萄糖醛酸酶釋放之抑制結果，IC50值分別為0.0017μM和0.011μM，而治療指數分別為71538和10550。
因此，由上述試驗可知，本發明之新佛波酯化合物I確具有可有效抑制過敏之活性，實可應用於製備抗過敏藥物之用途；同理，該含有佛波酯化合物I之AM4-4-9子劃分層則同樣具有抑制過敏之活性，亦可應用於製備抗過敏藥物之用途，因此，同樣含有豐富佛波酯之AM4-3-13、AM4-4-3及AM4-4-7子劃分層則亦同樣具有抑制過敏之活性；綜上而言，本發明沉香樹籽之萃取物及劃分層可製備抗過敏用途之藥物，且具有顯著之抑制效果，實可應用於抗過敏之用途；尤其，本發明係利用沉香樹籽來製備佛波酯化合物，其不僅有別於習用以沉香樹莖幹之來製備抗發炎藥物之 技術手段，且取得方便、簡單，亦不致影響沉香樹之生長，實可為具高度新穎性與進步性之發明；另本發明經由對沉香樹籽萃取後並獲得四種新佛波酯化合物，實為難能可貴之發明。
故，本發明確具有顯著之新穎性與進步性，且其確為未曾有過，誠已符合發明專利要件，爰依法提出專利申請，並祈賜專利為禱，至感德便。
以上所述，僅為本發明用以說明之可行實施例，因此並不能以其限制本發明之保護範圍，舉凡熟習此技藝者依本發明說明書及申請專利範圍所為之均等變化或修飾，皆應仍屬本發明所涵蓋之保護範圍。
Figure 105108065-A0101-11-0002-1
Figure 105108065-A0101-11-0003-2

Claims (11)

  1. 一種應用於抗過敏藥物之沉香樹籽萃取物之製備方法，包含有如下之步驟：(a)將沉香樹(Aquilaria malaccensis)籽經陰乾、磨粉後以90%乙醇萃取3次，並經減壓濃縮抽乾後獲得乙醇萃取物；(b)以水及乙酸乙酯對乙醇萃取物進行3次等比例之液液層析進行，以獲得乙酸乙酯劃分層；(c)以正己烷和90%甲醇水溶液對乙酸乙酯層液液層析，以獲得正己烷劃分層與甲醇劃分層；(d)將甲醇劃分層以矽膠管柱層析，藉由正己烷：二氯甲烷：甲醇以6：3：1、6：4：1、6：6：1、6：8：1、6：10：1、6：10：2之比例所組成之冲提液進行梯度冲提，從而獲得6個劃分層AM1、AM2、AM3、AM4、AM5、AM6；(e)將AM4劃分層以1：1比例之二氯甲烷：甲醇之葡聚醣凝膠LH-20管柱進行分離，從而獲得8個次劃分層AM4-1、AM4-2、AM4-3、AM4-4、AM4-5、AM4-6、AM4-7、AM4-8；(f)將AM4-3次劃分層經由矽膠管柱層析，以1：10至4：1比例的乙酸乙酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出15個子劃分層AM4-3-1、AM4-3-2、AM4-3-3、AM4-3-4、AM4-3-5、AM4-3-6、AM4-3-7、AM4-3-8、AM4-3-9、AM4-3-10、AM4-3-11、AM4-3-12、AM4-3-13、AM4-3-14及AM4-3-15；(g)將AM4-4次劃分層經由管柱層析以1：15~4：1比例之乙酸乙 酯：正己烷進行梯度冲堤，從而分離出12個子劃分層AM4-4-1、AM4-4-2、AM4-4-3、AM4-4-4、AM4-4-5、AM4-4-6、AM4-4-7、AM4-4-8、AM4-4-9、AM4-4-10、AM4-4-11、AM4-4-12；藉由上述步驟，俾提供一種可獲得豐富佛波酯之劃分層及萃取物之製備方法。
  2. 一種佛波酯化合物I，係取自上述請求項第1項之製備方法中AM4-4-9子劃分層中之化合物，其名為12-O-(2Z,4E,6E)-tetradeca-2,4,6-trienoylphorbol-13-acetate，其結構特徵如下式(I)：
    Figure 105108065-A0101-13-0002-15
  3. 一種佛波酯化合物Ⅱ，其名為12-deoxy-13-O-acetoylphorbol-20-octadec-9-enoate係取自上述請求項第1項之製備方法中AM4-4-3子劃分層中之化合物，其結構特徵如下式(Ⅱ)：
    Figure 105108065-A0101-13-0002-16
  4. 一種佛波酯化合物Ⅲ，其名為12-O-(2E,4E)-6-oxohexa-2,4-dienoylphorbol-13-acetate，係取自上述請求項第1項之製備方法中AM4-4-3子劃分層 中之化合物，其結構特徵如下式(Ⅲ)：
    Figure 105108065-A0305-02-0027-1
  5. 一種佛波酯化合物Ⅳ，其名為12-O-(2E,4E)-6,7-dihydroxytetradeca-2,4-dienoylphorbol-13-acetate，係取自上述請求項第1項之製備方法中AM4-4-3子劃分層中之化合物，其結構特徵如下式(Ⅳ)：
    Figure 105108065-A0305-02-0027-2
  6. 一種如請求項第2項之佛波酯化合物I之用途，其可用以製備抑制細胞產生過敏反應之藥物。
  7. 一種如請求項第3項之佛波酯化合物Ⅱ之用途，其可用以製備抑制細胞產生過敏反應之藥物。
  8. 一種如請求項第4項之佛波酯化合物Ⅲ之用途，其可用以製備抑制細胞產生過敏反應之藥物。
  9. 一種如請求項第5項之佛波酯化合物Ⅳ之用途，其可用以製備抑制細胞產生過敏反應之藥物。
  10. 一種可用於製備抗過敏藥物之佛波酯化合物V，其結構如下式(V)：
    Figure 105108065-A0305-02-0028-3
  11. 一種可用於製備抗過敏藥物之佛波酯化合物Ⅵ，其結構如下式(Ⅵ)：
    Figure 105108065-A0305-02-0028-4
TW105108065A 2016-03-16 2016-03-16 一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途 TWI687405B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW105108065A TWI687405B (zh) 2016-03-16 2016-03-16 一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途
CN201610160728.XA CN107198724B (zh) 2016-03-16 2016-03-21 一种沉香树籽萃取物、制备方法及其应用于抗过敏的用途
US15/180,088 US10335445B2 (en) 2016-03-16 2016-06-13 Compositions and methods of antiallergic phorbol ester and phorbol derivatives as the main active ingredients from the seeds of aquilaria malaccensis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW105108065A TWI687405B (zh) 2016-03-16 2016-03-16 一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201733970A TW201733970A (zh) 2017-10-01
TWI687405B true TWI687405B (zh) 2020-03-11

Family

ID=59847937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105108065A TWI687405B (zh) 2016-03-16 2016-03-16 一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10335445B2 (zh)
CN (1) CN107198724B (zh)
TW (1) TWI687405B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI731607B (zh) * 2020-03-04 2021-06-21 謝慧萍 沉香樹子萃取物製備皮膚抗發炎組成物之用途
CN113498816A (zh) * 2021-06-10 2021-10-15 海口楠脂香业有限公司 一种沉香茶粉及其制备方法、用途
CN115025014B (zh) * 2022-05-25 2023-03-14 中国科学院昆明植物研究所 具有促胶原蛋白分泌和抗氧化活性的土沉香花提取物和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001082927A1 (fr) * 2000-05-02 2001-11-08 Lead Chemical Co., Ltd Compositions antivirales contenant des derives du phorbol en tant que principal ingredient actif
WO2005123103A1 (en) * 2004-06-12 2005-12-29 Signum Biosciences, Inc. Topical compositions and methods for epithelial-related conditions
US8168238B2 (en) * 2009-12-29 2012-05-01 Taipei Medical University Extracts of Aquilaria hulls and use thereof in the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CN107198724B (zh) 2021-05-04
US20170266250A1 (en) 2017-09-21
US10335445B2 (en) 2019-07-02
CN107198724A (zh) 2017-09-26
TW201733970A (zh) 2017-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ukwubile et al. GC–MS analysis of bioactive compounds from Melastomastrum capitatum (Vahl) Fern. leaf methanol extract: An anticancer plant
Saleem et al. Anti–inflammatory activity of the leaf extacts of Gendarussa vulgaris Nees
Jung et al. Antiallergic effects of Scutellaria baicalensis on inflammation in vivo and in vitro
TWI687405B (zh) 一種沉香樹籽萃取物、製備方法及其應用於抗過敏之用途
Manjamalai et al. Antifungal, anti-inflammatory and GCMS analysis of methanolic extract of Plectranthus amboinicus leaf
Singh et al. Pharmacological activity of Abies pindrow
Manika et al. Extraction efficacy, stability assessment and seasonal variation of bioactive ‘gymnemagenin’in Gymnema sylvestre
Alam et al. In vitro pharmacological activities of methanol extract of Acmella oleracea leaves: A variety grown in Dhaka, Bangladesh
CN107746421B (zh) 化合物dictyopterisin f及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN105712844A (zh) 杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制备方法和应用
Zearah et al. Antibacterial activity of the glycosidic extract from Citrus laurantifoia L. fruits
Husein et al. Isolation and antifungal evaluation of Rumex cyprius Murb extracts
EP3897683B1 (en) Cosmetic, pharmaceutical and nutraceutical use of an extract derived from cannabis sativa cell cultures
Heroor et al. Sterols possess immunomodulatory property: Activity guided isolation and in vitro screening of phytoconstituents of Pongamia glabra and Ficus glomerata
Bapat et al. Phytochemical investigations and antimicrobial and anticancer activities of Homonoia riparia Lour
KR101021975B1 (ko) 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물
CN106349021B (zh) 一种吉祥草中的化合物及其制备与应用
Khudoyan et al. CHEMICAL COMPOSITION AND BIOACTIVITY OF EXTRACTS FROM LEAVES AND BRANCHES OF ARMENIAN $ PISTACIA $$ ATLANTICA $$ DESF. $
Jeeb et al. Bioactivity-guided isolation of two sesquiterpenes with potential anti-fungal activity from Citrullus colocynthis L.(Schard)
CN108314618A (zh) 倍半萜类化合物及提取方法和抗阿尔兹海默症的医药用途
CN113893214B (zh) 喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用
CN101301286B (zh) 巴西苏木红素在制备治疗缺糖缺氧脑组织丙二醛生成过多所引起疾病的药物中的应用
KR20130045631A (ko) 시링가레시놀을 포함하는 면역성 질환 개선용 조성물
UTTU et al. ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF A PENTACYCLIC TRITERPENE FROM THE STEM BARK OF GLOSSONEMA BOVEANUM (DECNE.), A TRADITIONAL MEDICINAL PLANT
Sabir et al. Biological Activity of Ziziphus Spina-Christi with Special Reference to Its Antimicrobial Activity