TWI731607B - 沉香樹子萃取物製備皮膚抗發炎組成物之用途 - Google Patents

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Abstract

一種沉香樹子萃取物製備皮膚抗發炎組成物之用途，其係由複數的沉香樹(Aquilaria malaccensis)子經粉碎後，以90%乙醇進行超音波萃取，每批粉碎後之沉香樹子萃取三次，每天萃取1次，萃取完畢後，藉由減壓濃縮機及真空幫浦移除所有醇水溶劑，使獲得可應用於皮膚抗發炎用途之沉香樹子萃取物。

Description

沉香樹子萃取物製備皮膚抗發炎組成物之用途
本發明係為一種將沉香樹子萃取物用於製備皮膚抗發炎組成物之用途。
由於皮膚是人類身體直接暴露在外部環境中，皮膚不僅作為保護我們身體重要器官的保護層，且可調節水分蒸發、並保護身體免受外部感染；另，皮膚之表皮還可預防人體水分蒸發，表皮從外部依次為：角質層(stratum corneum)、顆粒層(stratum granulosum)、有棘層(stratum spinosum)、和基底層(stratum basale)，健康的人的角質層細胞具有高濃度的天然保濕因子(Natural moisturzing factor，NMF)，因此有效地與水分結合以防止皮膚的水分乾燥。
然而，當皮膚過度暴露於紫外線或污染物會引起皮膚刺激，造成皮膚的細胞會有損傷，尤其角質層很容易因細胞受損而會有皮膚發炎、異位性皮膚炎、牛皮癬，甚至使皮膚細胞產生病變而導致有癌症或腫瘤之情事發生。
本發明之目的，即在於改善上述之缺失，俾提供一種可應用於皮膚抗發炎用途之沉香樹子萃取物。
為達到上述目的，本發明之可用於製備皮膚抗發炎組成物之 沉香樹子萃取物，其係將複數的沉香樹(Aquilaria malaccensis)子分批以逆滲透流動水清洗，每次清洗10分鐘，每一批沉香樹子重複洗滌三次後於室溫下瀝乾，並平鋪於吸水性材質上陰乾兩天；然後，使用粉碎機粉碎該些沉香樹子，並使粉碎後之沉香樹子之粒徑不大於2mm，同時控制粉碎機之粉碎時間，使連續粉碎時間不超過20分鐘，接著將該些粉碎後之沉香樹子分批以90%乙醇進行超音波萃取，每批粉碎後之沉香樹子萃取三次，每天萃取1次，萃取完畢後，藉由減壓濃縮機及真空幫浦移除所有醇水溶劑，使獲得沉香樹子萃取物； 藉此，該沉香樹子萃取物確具有可製備皮膚抗發炎組成物之用途。
圖1係本發明萃取沉香樹子萃取物之步驟流程圖。
圖2係本發明沉香樹子萃取物冷藏與避光儲存一個月後之檢測圖。
圖3係本發明沉香樹子萃取物實驗細胞存活度之試驗圖。
圖4係本發明沉香樹子萃取物細胞型態之顯微鏡觀測圖。
有關本發明為達到目的所運用之技術手段及其構造，茲謹再配合圖1至圖6所示之實施例，詳細說明如下：如1圖所示，將複數的沉香樹(Aquilaria malaccensis)子分批以逆滲透流動水清洗，每次清洗10分鐘，每一批沉香樹子重複洗滌三次後於室溫下瀝乾，並平鋪於吸水性材質上陰乾兩天；然後，使用粉碎機粉碎 該些沉香樹子，並使粉碎後之沉香樹子之粒徑不大於2mm，同時控制粉碎機之粉碎時間，使連續粉碎時間不超過20分鐘，藉以避免因機器過熱改變沉香樹內含之化學成分。接著，將該些粉碎後之沉香樹子分批以90%乙醇進行超音波萃取，每批粉碎後之沉香樹子萃取三次，每天僅萃取1次，萃取完畢後，藉由減壓濃縮機及真空幫浦移除所有醇水溶劑，使得到沉香樹子萃取物(Crude-EtOH)，且該沉香樹子萃取物(Crude-EtOH)之型態為油狀，使形成沉香子油。
承上述，較佳之實施例是，取2.9公斤之沉香樹(Aquilaria malaccensis)子經上述步驟粉碎、瀝乾、陰乾後，以15公升之90%的乙醇進行萃取後，可得102克的沉香樹子萃取物(Crude-EtOH)，亦即得到102克之沉香子油。
接著，將上述之沉香子油以4℃冷藏及避光儲存一個月，該沉香子油之氣味、顏色及酸鹼值測等物理性質並未有變化；同時，透過核磁共振儀的評估，如圖2所示，第一天的1H NMR(CDCl3,400MHz)與一個月後同一檢品均存在佛波酯及脂肪酸之特徵訊號，且於成分之比例上沒有明顯變化，1H NMR呈現穩定吻合的結果。藉此可知，4℃冷藏與避光的環境顯然為適合該沉香子油之儲存方式。
此外，藉由下列實驗之具體實施例，可進一步證明本發明用途之應用範圍，但並不以此限制本發明之範圍。
實驗一：
本實驗係因不論何種本養產品塗抹於皮膚上時，皮膚的角質層為最些接觸該些產品，因此本實驗選用人類皮膚角質株化細胞進行安全 性檢測，評估沉香子油對皮膚細胞是否具細胞毒性。
(1)本實驗採用MTT assay檢測。將皮膚角質細胞(1×104/well)培養在96-well盤，並在37℃及5% CO2培養箱中培養至少24小時，加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反應，於37℃、5% CO2反應4小時後移除培養液，加入100μL的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570nm下測定吸光值(BioTek,SynergyTM2,USA)。
(2)試驗結果如圖3所示，將凍乾的沉香子油，以DMSO溶解配置成10mg/mL備用。HaCaT細胞經過沉香子油處理24小時後，結果顯示1~100μg/mL沉香子油對細胞無明顯毒性且於10-100μg/mL對細胞有明顯增生的現象。
實驗二：
本實驗係利用顯微鏡觀察沉香子油是否會改變皮膚細胞之型態。
(1)將人類皮膚角質株化細胞(1×104/well)培養在96-well盤，並在37℃及5% CO2培養箱中培養至少24小時。加入1μL的沉香子油以及於指定的時間作用，達反應時間後，於顯微鏡(Nikon,TE2000-U,Japan)下觀察細胞型態，並拍照記錄。
(2)試驗結果如圖4所示，利用顯微鏡觀察細胞型態，經過1-100μg/mL沉香子油作用後細胞型態無明顯變化。
實驗三：
本實驗係因促炎性細胞因子(Proinflammatory cytokine)是一 系列可以促進炎症的細胞因子的總稱，比較常見的促炎細胞因子包括TNF-α和IL-1；腫瘤壞死因子TNF-α(tumor necrosis factor-α)是一個發炎因子，發炎反應發生時，其在血清中含量會大幅的增加，此為發炎反應的指標，利用測定TNF-α含量的變化來評估沉香子油是否具有抑制發炎因子的釋放。
(1)Coating buffer(0.2M sodium phosphate buffer)：秤取11.8g之Na2HPO4和16.1g之NaH2PO4，加入適量ddH2O，調整pH值至6.5後再定量至1L。
Assay diluent(PBS+10% FBS)：900mL PBS加入100mL FBS，儲存於2~8℃，其須在配製三天內使用完畢。
Wash buffer(0.05% PBST)：999.5Ml之PBS加入0.5mL之tween-20，儲存於2~8℃，其須在配製三天內使用完畢。
Stop solution：1M H3PO4或2N H2SO4。將3×105/mL細胞數培養在24well，置於在37℃及5% CO2培養箱中培養24小時。加入沉香子油反應30分鐘後，再加入1μg/mL LPS反應。達反應時間後，收集上清液，以1200rpm進行5分鐘離心，然後加到新的1.5ml離心管於-20℃儲存。
(2)本試驗使用BD OptEIATMSet進行細胞內TNF-α含量測定。首先，加入100μL capture Ab(1：250)於96-well中，用保鮮膜密封盤子後於4℃保存至隔夜。接著用wash buffer清洗盤子三次，最後一次將盤子倒置在濾紙上以確定完全移除殘留的液體，再加入200μL之Assay diluent在室溫下反應1小時後，再重複清洗的步驟。然後加入100μL的上清液，密封盤子後於室溫下反應2小時，之後清洗五次，然後加入100μL之working detector(1：500 detection antibody和1：250 enzyme reagent)，密封盤子後於室溫下反應1小時，之後清洗7次，接著加入50μL之substrate solution，並於室溫下反應30分鐘，最後加入50μL的Stop solution於450nm測吸光值(BioTek,SynergyTM2,USA)。
(3)試驗結果：人類皮膚角質株化細胞經過1μg/mL之LPS作用後，測得上清液中TNF-α的含量為20.2pg/mL，而經沉香子油(0.1-100μg/mL)不同濃度作用後，上清液中TNF-α的含量分別為19.3、18.3、16.2、17.2和14.5pg/mL，其顯示沉香子油具有抑制細胞內發炎因子TNF-α釋放能力。
藉由上述實驗可知，本發明之沉香樹子萃取物(即上述之沉香子油)確具有可抑制細胞內發炎因子TNF-α之釋放能力，且作用後細胞型態具有增生之現象，意即本發明之沉香樹子萃取物(即上述之沉香子油)應用於皮膚抗發炎之用途，確實具有明顯之效果。
又，為提升本發明沉香樹子萃取物(即上述之沉香子油)之應用範圍，可將本發明上述實驗中沉香樹子萃取物(即上述之沉香子油)最高作用濃度50~100μg/mL(0.005~0.01%)放大100倍，將有效作用濃度(0.5~1%)之沉香樹子萃取物(即上述之沉香子油)添加油相中可抗氧化之維他命E、可滋潤膚感之橄欖油、玫瑰果油，亦可添加水相添加濟中可保濕嫩膚之玻尿酸、可保濕增稠之三仙膠、可光滑膚感及增稠之海藻膠，以及可提高保存之氯苯甘醚(Chlorphenesin)、…等成分，進而獲得沉香子複合油、沉香子油精華霜、…等產品；因此，本發明之沉香樹子萃取物可使皮膚有效抗發炎，本發明確可用於製備皮膚抗發炎用途之組成物。
由是，從以上所述可知，本發明之沉香樹子萃取物確具有顯著之新穎性與進步性，誠已符合發明專利之要件，爰依法提出專利申請，並祈賜專利為禱，至感德便。
惟以上所述，僅為本發明之可行實施例，該實施例主要僅在於用以舉例說明本發明為達到目的所運用之技術手段及其構造，因此並不能以之限定本發明之保護範圍，舉凡依本發明說明書及申請專利範圍所為之等效變化或修飾，皆應仍屬本發明所涵蓋之保護範圍者。

Claims (6)

  1. 一種沉香樹子萃取物用於製備促進皮膚細胞增生及抗發炎組成物之用途，係投予一有效作用濃度之沉香樹子萃取物至所需個體，其中該沉香樹子萃取物之製備方法係包括：將複數的沉香樹(Aquilaria malaccensis)子分批以逆滲透流動水清洗，每次清洗10分鐘，每一批沉香樹子重複洗滌三次後於室溫下瀝乾，並平鋪於吸水性材質上陰乾兩天；然後，使用粉碎機粉碎該些沉香樹子，並使粉碎後之沉香樹子之粒徑不大於2mm，同時控制粉碎機之粉碎時間，使連續粉碎時間不超過20分鐘，接著將該些粉碎後之沉香樹子分批以90%乙醇進行超音波萃取，每批粉碎後之沉香樹子萃取三次，每天萃取1次，萃取完畢後，藉由減壓濃縮機及真空幫浦移除所有醇水溶劑，使獲得沉香樹子萃取物，而該沉香樹子萃取物之型態為油狀，使形成沉香子油。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該有效作用濃度為50~100μg/mL。
  3. 如請求項1~2任一項所述之用途，其中該皮膚細胞包含皮膚角質株化細胞。
  4. 一種沉香樹子萃取物用於製備促進皮膚細胞增生及抗發炎組成物之用途，係投予一有效作用濃度之沉香樹子萃取物至所需個體，其中該沉香樹子萃取物之製備方法係由下述步驟所組成：將複數的沉香樹(Aquilaria malaccensis)子分批以逆滲透流動水清洗，每次清洗10分鐘，每一批沉香樹子重複洗滌三次後於室溫下瀝乾，並平鋪於吸水性材質上陰乾兩天；然後，使用粉碎機粉碎該些沉香樹子，並使粉碎後之沉香樹子之粒徑不大於2mm，同時控制粉碎機之粉碎時間，使連續粉碎時間不超過20分鐘，接著將該些粉碎後之沉香樹子分批以90%乙醇進行超音波萃取，每批粉碎後之沉香樹子萃取三次，每天萃取1次， 萃取完畢後，藉由減壓濃縮機及真空幫浦移除所有醇水溶劑，使獲得沉香樹子萃取物，而該沉香樹子萃取物之型態為油狀，使形成沉香子油。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該有效作用濃度為50~100μg/mL。
  6. 如請求項4~5任一項所述之用途，其中該皮膚細胞包含皮膚角質株化細胞。
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