CN105125446B - 具有舒敏抗敏功效的沉香提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有舒敏抗敏功效的沉香提取物及其制备方法与应用，包括以下步骤：（1）将沉香粉碎后，于乙醇溶液中加热提取；（2）冷却，过滤，取滤液备用；（3）步骤（2）中的滤液浓缩得到沉香提取物浸膏；（4）步骤（3）中的沉香提取物浸膏与多元醇混合溶解，过滤，得到滤液，即为具有舒敏抗敏功效的沉香提取物。本发明提供的制备沉香提取物的方法，操作简便，适合大规模生产，所得产品纯度较高。本发明提供的沉香提取物具有抑制透明质酸酶活性、清除自由基、抗炎抗敏、增强皮肤屏障功能等多种功效。本提取物提取方式绿色环保，健康安全，抑制组胺等过敏介质的释放，可作为抗敏活性成分，广泛应用于面膜等各种化妆品之中。

Description

具有舒敏抗敏功效的沉香提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有舒敏抗敏功效的沉香提取物及其制备方法与应用。

背景技术

过敏反应是人体对抗原产生的超常或病理反应。在过敏反应过程中，过敏原(抗原)起着直接作用，是过敏反应的外因；而机体免疫能力低下，大量自由基对细胞的氧化破坏是过敏反应的内因。皮肤过敏是比较常见的皮肤问题，随着化妆品和其他化学制品使用的增加，环境问题，现代社会生活节奏加快、压力增大等，具有敏感性皮肤的人越来越多。再加上部分人群护肤品使用不当等原因，往往也易引起皮肤过敏，出现瘙痒、脱屑、红肿等过敏症状的发生。预防皮肤过敏，除了要远离过敏原，减少刺激，还应该清除自由基，增强皮肤屏障功能，抑制组胺等过敏介质的释放，使皮肤保持健康的状态。

沉香是一种常用的中药，为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg或沉香A.agallocha Roxb.的含有树脂的干燥木材，前者主要产于我国，后者主要产于马来西亚、印度尼西亚和越南等国。现代药理研究表明，沉香具有镇静、抗心律失常、抑制中枢神经系统、抑菌抗炎等作用。

对沉香的综合利用主要集中在药品保健品方面，将沉香应用于化妆品方面，尤其是作为舒敏抗敏活性成分，至今鲜有报道。

目前“纯天然，零添加，零刺激”是各大化妆品公司追求的目标。从天然植物中开发含有抗敏止痒修复功效的活性物质，添加到日常所用的护肤品中，研制出天然舒敏抗敏化妆品，已成为化妆品行业重点研究内容之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有舒敏抗敏功效的沉香提取物及其制备方法与应用。

本发明为实现上述目的采用以下技术方案：

一种具有舒敏抗敏功效的沉香提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将沉香粉碎后，于乙醇溶液中加热提取；

(2)冷却，过滤，取滤液备用；

(3)步骤(2)中的滤液浓缩得到沉香提取物浸膏；

(4)步骤(3)中的沉香提取物浸膏与多元醇混合溶解，过滤，得到滤液，即为具有舒敏抗敏功效的沉香提取物。

步骤(1)中：

沉香粉粹的粒径为20～60目，将沉香粉碎至合适粒径，使沉香与乙醇的反应更加充分，有利于提高沉香有效活性成分的浸提效果。

所述沉香与乙醇溶液的质量比例为1:10～30，优选比例为1:20，所述乙醇溶液的质体积分数为60～95％，优选体积分数为80～95％。当采用沉香与乙醇溶液的质量比例为1:10～30、所述乙醇溶液的质体积分数为60～95％时，本发明的沉香中具有舒敏抗敏的有效活性成分可以得到较大范围的提取，试验效果较好。并且当采用沉香与乙醇溶液的质量比例为1:20、所述乙醇溶液的质体积分数为60～95％时，沉香中具有舒敏抗敏的有效活性成分可以得到最大范围的提取，而且经过试验证明采用此条件得到的沉香提取物对透明质酸酶活性抑制、清除超氧阴离子自由基、清除羟基自由基、紫外吸收效果清除DPPH自由基以及抑制KU812细胞中组胺释放量的效果最好。

本发明采用加热回流提取，回流温度为50-80℃，优选60-70℃；回流时间为60-180min，优选120-180min。采用乙醇溶液在50-80℃回流提取60-180min，不仅能有效分离出沉香中具有舒敏抗敏的活性成分，还能尽量减少回流时间的延长所带来的能源浪费。并且当采用乙醇溶液在60-70℃回流提取120-180min，沉香中具有舒敏抗敏的有效活性成分可以得到最大范围的提取，而且经过试验证明采用此条件得到的沉香提取物对透明质酸酶活性抑制、清除超氧阴离子自由基、清除羟基自由基、紫外吸收效果清除DPPH自由基以及抑制KU812细胞中组胺释放量的效果最好。

步骤(2)中：

所述冷却步骤的终温度为20-50℃，优选30-40℃。所述过滤的步骤包括：首先采用离心，然后采用精滤。冷却后的溶液进行离心，离心速度为4000rpm-5000rpm，离心的时间为10min-20min，离心后取上清液，将上清液进行精滤，所用介质可选滤布或滤板，优选滤板；过滤时为了提高过滤精度，可添加助滤剂，助滤剂优选硅藻土。上述条件的选择可使得到的沉香提取物中活性成分较高，提取活性成分的效果最好。

步骤(3)中：

所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩压力为0.04-0.1MPa，优选0.06-0.08MPa；减压浓缩温度为40-60℃，优选45-55℃；减压浓缩终点为浸膏无明显乙醇味。采用合适的减压浓缩压力0.04-0.1MPa、40-60℃，减压蒸馏合理的控制真空度和温度，选择性的将不需要的馏分蒸馏，尽可能保留沉香提取物中的有效活性成分。并且，采用减压浓缩压力0.06-0.08MPa、45-55℃，最大程度的去除本发明不希望保留的成分，最大程度的保留沉香提取物的有效活性成分，经过试验证明采用此条件得到的沉香提取物对透明质酸酶活性抑制、清除超氧阴离子自由基、清除羟基自由基、紫外吸收效果清除DPPH自由基以及抑制KU812细胞中组胺释放量的效果最好。

步骤(4)中：

所述多元醇为丙二醇、甘油、丁二醇的一种或多种，优选丁二醇，本发明的沉香提取物浸膏通过与特定多元醇的溶解，使沉香提取物中的活性成分溶解在多元醇中，并且丙二醇、甘油、丁二醇可直接应用在化妆品中，经过申请人的大量实验验证与分析，丙二醇、甘油和丁二醇比常规化妆品添加剂溶解和浸提的效果要好，大幅度提高了浸提活性成分的功效。尤其当选用丁二醇作为溶剂时，提取活性成分的效果最好。

沉香提取物浸膏与多元醇的质量比例为1：50-100，优选1：100；浸膏溶解温度为20-50℃，优选20-30℃；过滤介质精度为0.2-10μm，优选0.2-0.8μm。本发明中沉香提取物浸膏与多元醇的质量比例为1：50-100、过滤介质精度为0.2-10μm，通过合适比例多元醇浸提以及介质过滤后，得到了深黄色的液体，符合化妆品原料的基本要求，沉香里面的活性成分也溶解在多元醇中。并且，当沉香提取物浸膏与多元醇的质量比例为1：100、过滤介质精度为0.2-0.8μm，经过试验证明采用此条件得到的沉香提取物对透明质酸酶活性抑制、清除超氧阴离子自由基、清除羟基自由基、紫外吸收效果清除DPPH自由基以及抑制KU812细胞中组胺释放量的效果最好。

通过上述具有舒敏抗敏功效的沉香提取物的制备方法得到的沉香提取物，所述沉香提取物在制备化妆品中的应用，所述化妆品是具有舒敏抗敏功效的化妆品，所述化妆品为面膜精华液、洗面奶、面霜、眼霜或其他类型的化妆品。

沉香在制备具有舒敏抗敏功效化妆品中的应用。

具体的应用方法为：将沉香提取物的添加在化妆品介质中得到具有舒敏抗敏功效的化妆品，所述沉香提取物的质量占化妆品介质的质量的1～2％。

所述面膜精华液，包含以下重量份的原料：聚乙烯醇12～16份，羟甲基纤维素1～3份，海藻酸钠0.5～1.5份，胶原蛋白1～3份，沉香提取物1～3份，尼泊金甲酯0.1～0.3份，甘油3～8份，三乙胺醇0.3～0.5份，水60～80份。

进一步，所述面膜精华液还包括乙醇2～4份，香精0.4～0.7份。经过大量试验验证及分析，上述重量份的原料组成的面膜精华液的舒敏抗敏效果优异。

所述水优选去离子水。

所述面膜精华液的制备方法，包括以下步骤：

1)称取设定量的聚乙烯醇、羟甲基纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、沉香提取物、尼泊金甲酯和水，在容器中混合均匀，加热至40～60℃，搅拌使其溶解；

2)向步骤1)中的溶液加入设定量的甘油和三乙胺醇，搅拌均匀即得面膜精华液。

进一步，采用所述面膜精华液将无纺布或者天丝面膜浸润后，制成面膜，装袋，密封后备用。

步骤1)中，所述温度优选为50℃。不仅将各个原料快速溶解，并能最大程度保留活性成分。

优选的，所述面膜精华液，包含以下重量份的原料：

聚乙烯醇14份，羟甲基纤维素2份，海藻酸钠1份，胶原蛋白2份，沉香提取物2份，尼泊金甲酯0.2份，甘油5份，乙醇3份，三乙胺醇0.4份，香精0.5份，去离子水69.9份。所述面膜精华液的制备方法，包括以下步骤：

①称取设定量的聚乙烯醇、羟甲基纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、沉香提取物、尼泊金甲酯和水，在容器中混合均匀，加热至40～60℃，搅拌使其溶解；

②向步骤①中的溶液加入设定量的甘油、乙醇、三乙胺醇和香精，搅拌均匀即得面膜精华液。

进一步，采用所述面膜精华液将无纺布或者天丝面膜浸润后，制成面膜，装袋，密封后备用。

步骤①中，所述温度优选为50℃。不仅将各个原料快速溶解，并能最大程度保留活性成分。

经过大量试验验证及分析，上述重量份的原料组成的面膜精华液的舒敏抗敏效果最好。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的制备沉香提取物的方法，操作简便，适合大规模生产，所得产品纯度较高，经过试验验证，所得沉香提取物中活性成分提取率较高。利用少量的沉香提取物制备的化妆品(面膜等)，抗敏功效明显，安全性高。

本发明通过多元醇浸提过滤后，得到了深黄色的液体，符合化妆品原料的基本要求，里面的活性成分也溶解在多元醇中。

(2)本发明提供的沉香提取物具有抑制透明质酸酶活性、清除自由基、抗炎抗敏、增强皮肤屏障功能、抑制细胞内组胺的释放等多种功效。本提取物提取方式绿色环保，健康安全，抑制组胺等过敏介质的释放，可作为抗敏活性成分，广泛应用于面膜等各种化妆品之中。特别作为一种面膜，能在一定程度上保护表皮细胞膜结构完整性及屏障功能，不但不会引起皮肤过敏刺激，而且还可以提高皮肤的耐受性，并有修复受损肌肤减轻过敏症状的功效。

(3)本发明的面膜精华液以及面膜，贴敷后，不仅舒敏抗敏，沉香又起一定的安神助眠作用，所以实用性更高，特别适合晚上使用。配方中增稠剂、防腐剂、保湿剂等成分配伍科学、合理，能起到协同增效的作用。

聚乙烯醇作为本发明的面膜精华液中的一种安全性成膜剂和增稠剂，在本发明的面膜化妆品中，为12～16重量份，优选14重量份，当聚乙烯醇的配合量小于12重量份时，在涂布时容易滴落，另外，覆膜形成性不充分，难剥离；当配合量大于16重量份时，由于粘度变高，因此使用时难涂布，因时间延长而胶凝化使贮存稳定性变坏。当其重量份为14时，其使用性能最高。

羟甲基纤维素作为与聚乙烯醇相配合使用的水溶性增粘剂，该成分防止面膜化妆品的滴落，提高对肌肤的涂布容易度，而且显著提高各种原料成分的分散稳定性。从使用性、分散稳定性的提高效果来看，本发明的面膜精华液中选择1～3重量份，优选2重量份。

海藻酸钠，一种天然多糖，具有浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力，与羟甲基纤维素不同，它具有羧基，是β-D-甘露糖醛酸的醛基以苷键形成的高聚糖醛酸，亲水性强，在冷水和温水中都能溶解，形成非常粘稠的均匀的溶液，形成的面膜精华液具有其他类似物难于获得的柔软性、均一性及其他优良特性，在成膜性能上用以弥补羟甲基纤维素的不足，另外，三乙醇胺通过与海藻酸钠的羧基中和，形成稳定的高分子结构，达到增稠和保湿的应用效果。三乙醇胺与高分子多糖的羧基形成的胶体相稳定性好，产品质量稳定，可容外加成分比重高。从稳定性、溶解性和粘性的效果来看，本发明的面膜精华液中选择海藻酸钠0.5～1.5重量份，优选1重量份，选择三乙醇胺0.3～0.5重量份，优选0.4重量份。

胶原蛋白对皮肤的渗透性强，可透过角质层与皮肤上皮细胞结合，参与和改善皮肤细胞的代谢，使皮肤中的胶原蛋白活性加强；它能保持角质层水分及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增强血液循环，达到滋润皮肤的目的。皮肤的光泽取决于含水量，胶原蛋白良好的保水能力使皮肤水润亮泽，散发健康的光彩。当胶原蛋白被皮肤吸收后，填充在皮肤真皮之间，增加皮肤紧密度，产生皮肤张力，缩小毛孔，使皮肤紧绷而富有弹性。活性胶原蛋白能直接渗入肌肤底层，且与周围组织的亲和性好，可协助细胞制造成胶原蛋白，促使皮肤细胞正常成长；同时，活性胶原蛋白本身还具有消炎和更新肌肤的作用。从滋养、亮肤、紧肤、防皱、修复和营养作用效果来看，选择胶原蛋白1～3重量份，优选2重量份。

尼泊金甲酯作为本发明面膜精华液的防腐剂，属酚类防腐剂，对各种霉菌、酵母菌、细菌有效。但具有一定的致敏性，但是添加本发明中额沉香提取物，能大大减缓刺激源对皮肤所造成的刺激，涂抹含有沉香提取物的面膜精华液后，能在一定程度上保护表皮细胞膜结构完整性及屏障功能，不但不会引起皮肤过敏刺激，而且还可以提高皮肤的耐受性，并有修复受损肌肤减轻过敏症状的功效。

本发明根据需要添加了保湿剂甘油，还可添加乙醇和香精，使面膜精华液的使用性能更加优异。

附图说明

图1为本发明提供的沉香提取物的生产工艺流程图；

图2为本发明提供的沉香提取物对透明质酸酶活性抑制实验图；

图3为本发明提供的沉香提取物清除超氧阴离子自由基实验图；

图4为本发明提供的沉香提取物清除羟自由基实验图；

图5为本发明提供的沉香提取物紫外吸收效果清除DPPH·自由基实验图。

图6和图7为本发明提供的含有沉香提取物的面膜精华液的斑贴实验效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

本发明提供的沉香提取物的基本生产工艺流程图如图1所示，实施例如下：

实施例1沉香提取物的制备

按料液比1:20投料，即在圆底烧瓶中添加50g沉香粉末与1000mL体积分数为95％的乙醇溶液，所述沉香粉末的粒径为40目，瓶口连接搅拌装置和冷凝回流装置；65℃加热回流提取180min；停止加热，冷却到35℃，5000rpm离心10min，取上清液过滤板精滤，硅藻土助滤；取滤液，45-55℃、0.07MPa减压浓缩至料液无明显乙醇气味，得到沉香提取物浸膏；按料液比1:100加入沉香浸膏和1,3-丁二醇，25℃搅拌溶解30min，0.8μm直板过滤；测定pH值、固含量、总糖，测定结果为：pH值为7.0，固含量为60％，总糖为20mg/mL；90℃保温30min，灭菌，冷却至35℃，得到产品沉香提取物。

实施例2沉香提取物的制备

本发明提供的沉香提取物的生产工艺流程图如图1所示，具体过程如下：

按料液比1:10投料，即在圆底烧瓶中添加50g沉香粉末与500mL体积分数为60％的乙醇溶液，所述沉香粉末的粒径为20目，瓶口连接搅拌装置和冷凝回流装置；50℃加热回流提取180min；停止加热，冷却到30℃，4000rpm离心20min，取上清液过滤板精滤，硅藻土助滤；取滤液，40-45℃、0.04MPa减压浓缩至料液无明显乙醇气味，得到沉香提取物浸膏；按料液比1:50加入沉香浸膏和丙二醇，20℃搅拌溶解30min，0.2μm直板过滤；测定pH值、固含量、总糖，测定结果为：pH值为6.0，固含量为40％，总糖为10mg/mL；90℃保温30min，灭菌，冷却至30℃，得到产品沉香提取物。

实施例3沉香提取物的制备

按料液比1:30投料，即在圆底烧瓶中添加50g沉香粉末与1500mL体积分数为80％的乙醇溶液，所述沉香粉末的粒径为60目，瓶口连接搅拌装置和冷凝回流装置；70℃加热回流提取150min；停止加热，冷却到40℃，4500rpm离心15min，取上清液过滤板精滤，硅藻土助滤；取滤液，45-55℃、0.1MPa减压浓缩至料液无明显乙醇气味，得到沉香提取物浸膏；按料液比1:80加入沉香浸膏和甘油，30℃搅拌溶解30min，10μm直板过滤；测定pH值、固含量、总糖，测定结果为：pH值为8.0，固含量为50％，总糖为15mg/mL；90℃保温30min，灭菌，冷却至40℃，得到产品沉香提取物。

实施例4沉香提取物的制备

按料液比1:25投料，即在圆底烧瓶中添加50g沉香粉末与750mL体积分数为90％的乙醇溶液，所述沉香粉末的粒径为30目，瓶口连接搅拌装置和冷凝回流装置；80℃加热回流提取60min；停止加热，冷却到40℃，5000rpm离心10min，取上清液过滤布精滤，硅藻土助滤；取滤液，55-60℃减压浓缩至料液无明显乙醇气味，得到沉香提取物浸膏；按料液比1:80加入沉香浸膏和1,3-丁二醇，30℃搅拌溶解30min，0.4μm直板过滤；测定pH值、固含量、总糖，测定结果为：pH值为6.5，固含量为55％，总糖为18mg/mL；90℃保温30min，灭菌，冷却至38℃，得到产品。

实施例5面膜精华液

一种面膜精华液，是由以下重量份的原料组成：聚乙烯醇14份，羟甲基纤维素2份，海藻酸钠1份，胶原蛋白2份，实施例1中的沉香提取物2份，尼泊金甲酯0.2份，甘油5份，乙醇3份，三乙胺醇0.4份，香精0.5份，去离子水69.9份。

所述面膜精华液的制备方法为，包括以下步骤：

1)称取设定量的聚乙烯醇、羟甲基纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、沉香提取物、尼泊金甲酯和水，在容器中混合均匀，加热至50℃，搅拌使其溶解；

2)向步骤1)中的溶液加入设定量的甘油、乙醇、三乙胺醇和香精，搅拌均匀即得面膜精华液。

进一步，采用所述面膜精华液将无纺布浸润后，制成面膜，装袋，密封后备用。

实施例6面膜精华液

一种面膜精华液，是由以下重量份的原料组成：聚乙烯醇12份，羟甲基纤维素1份，海藻酸钠0.5份，胶原蛋白1份，实施例2中的沉香提取物1份，尼泊金甲酯0.1份，甘油3份，乙醇2份，三乙胺醇0.3份，香精0.4份，去离子水60份。

所述面膜精华液的制备方法为，包括以下步骤：

1)称取设定量的聚乙烯醇、羟甲基纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、沉香提取物、尼泊金甲酯和水，在容器中混合均匀，加热至40℃，搅拌使其溶解；

2)向步骤1)中的溶液加入设定量的甘油、乙醇、三乙胺醇和香精，搅拌均匀即得面膜精华液。

进一步，采用所述面膜精华液将天丝面膜浸润后，制成面膜，装袋，密封后备用。

实施例7面膜精华液

一种面膜精华液，是由以下重量份的原料组成：聚乙烯醇16份，羟甲基纤维素3份，海藻酸钠1.5份，胶原蛋白3份，实施例1中的沉香提取物3份，尼泊金甲酯0.3份，甘油8份，乙醇4份，三乙胺醇0.5份，香精0.7份，去离子水80份。

所述面膜精华液的制备方法为，包括以下步骤：

1)称取设定量的聚乙烯醇、羟甲基纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、沉香提取物、尼泊金甲酯和水，在容器中混合均匀，加热至60℃，搅拌使其溶解；

2)向步骤1)中的溶液加入设定量的甘油、乙醇、三乙胺醇和香精，搅拌均匀即得面膜精华液。

实施例8沉香提取物的功效实验

1、抑制透明质酸酶活性实验

研究表明透明质酸酶与炎症、过敏密切相关，能够酶解体内的透明质酸，使其变为低分子量的酸性刺激源，诱导机体产生敏感症状。本方法采用透明质酸酶体外抑制实验测定沉香提取物对透明质酸酶活性抑制效果，实验浓度分别采用1.0％、2.0％、5.0％、8.0％、10.0％(沉香提取物在体系中的质量百分比)。

实验所需溶液的配制：

醋酸缓冲溶液：量取1.155mL冰乙酸稀释至100mL混匀，取其中4.8mL为A溶液；称取2.72g乙酸钠结晶，加水溶解定容至100mL混匀，取其中45.2mL为B溶液；混合A、B溶液，以水定容至100mL，混匀。

透明质酸酶溶液：称取10mg透明质酸酶于烧杯中，加入4mL醋酸缓冲溶液。

透明质酸钠溶液：称取5mg透明质酸钠于烧杯中，加入10mL醋酸缓冲溶液。

埃尔利希试剂(Ehrlich reagent)：称取0.8g对-二甲氨基苯甲醛，溶于15mL浓盐酸和15mL无水乙醇中。

乙酰丙酮溶液：取3.5mL乙酰丙酮，溶于50mL 1.0mol/L的碳酸钠溶液中，此溶液在用前配制。

实验步骤：

取0.25mmol/L的CaCl₂溶液0.1mL和透明质酸酶溶液0.5mL，37℃保温培养20min；加入不同浓度实施例1制备的沉香提取物0.5mL，继续37℃保温培养20min；加入0.5mL透明质酸钠液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1mL 0.4mol/L NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min，立即用冰水冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL，并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置显色20min，用分光光度计测定其吸光度值。

样品对透明质酸酶抑制率的计算公式：

透明质酸酶抑制率(％)＝[(A₁-A₂)-(B₁-B₂)]/(A₁-A₂)×100％

其中，A₁为参比溶液吸光值，用去离子水代替实施例1所得试样；A₂为参比空白溶液吸光值，用去离子水代替实施例1所得试样，用醋酸缓冲溶液代替透明质酸酶和透明质酸钠溶液；B₁为试样溶液吸光值；B₂为试样空白溶液吸光值，用醋酸缓冲溶液代替透明质酸酶和透明质酸钠溶液。

实验时，先对试样进行450-700nm范围的波长扫描，确定最大吸收波长，在最大吸收波长处进行测定。

实施例1中得到的沉香提取物，其透明质酸酶抑制率结果见图2。如图2所示，随着沉香提取物浓度的增加，其对透明质酸酶活性的抑制效果逐渐增强。说明实施例1得到的沉香提取物能够有效抑制透明质酸酶活性，从而起到良好的抗敏作用。

2、清除自由基实验

生物体中的自由基主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基等。过多的自由基会导致人体正常细胞和组织的损坏，从而出现一系列不适症状。

实验采用1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％五个浓度梯度(沉香提取物体系中的质量百分比)，分别测定其对超氧阴离子自由基(·O₂)、羟自由基(·OH)清除率，沉香提取物稀释成不同的浓度，测定DPPH·自由基(DPPH·)的清除率。

1)清除超氧阴离子自由基实验

取0.05mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，于25℃水浴中放置20min，分别加入1mL不同浓度的实施例1制备的沉香提取物溶液和25mmol/L的邻苯三酚溶液0.4mL，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L的HCl溶液1.0mL终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，在299nm处测定吸光值，计算清除率。空白对照组以1mL试样溶剂代替样品，每个处理均做三个重复。

样品对超氧阴离子自由基清除率的计算公式：

超氧阴离子自由基清除率(％)＝(A₁-A₂)/A₁×100％

其中A₁为空白的平均吸光度，A₂为沉香提取物的平均吸光度。

实施例1中得到的沉香提取物，其超氧阴离子自由基清除率结果见图3。如图3所示，随着沉香提取物浓度的增加，其对超氧阴离子自由基的清除作用逐渐增强。这表明实施例1得到的沉香提取物对超氧阴离子自由基有较强的清除效果。

2)清除羟自由基实验

羟基自由基由Fenton反应产生，·OH氧化水杨酸产生对510nm有特征吸收的2,3-二羟基苯甲酸，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定·OH的清除率。在25mL比色管中加入2mmol/L FeSO₄和1mmol/L H₂O₂各3mL，摇匀，再加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度A₁。然后分别加入不同浓度的实施例1制备的沉香提取物1mL，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度A₂。

样品对羟自由基清除率的计算公式：

羟自由基清除率(％)＝(A₁-A₂)/A₁×100％

实施例1中得到的沉香提取物，其羟自由基清除率结果见图4。如图4所示，随着沉香提取物浓度的增加，其对羟自由基的清除作用逐渐增强。说明实施例1得到的沉香提取物对羟自由基有很好的清除效果。

3)清除DPPH·自由基实验

准确称取20mg DPPH·，用无水乙醇定容至250mL，得到浓度为20mmol/L的DPPH·溶液，将上述实施例1制备的沉香提取物分别用去离子水稀释成不同浓度的测试液。取2mL测试液和2mL 20mmol/L DPPH·溶液混匀，反应30min，测定517nm波长下吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替。

样品对DPPH·自由基清除率的计算公式：

DPPH·自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₃)/A₂]×100％

其中，A₁为2mL DPPH·溶液与2mL不同浓度的沉香提取物组成的混合液的吸光度；A₃为2mL不同浓度的沉香提取物与2mL无水乙醇组成的混合液的吸光度；A₂为2mL DPPH·溶液与2mL无水乙醇组成的混合液的吸光度。

实施例1中得到的沉香提取物，其DPPH·自由基清除率结果见图5。如图5所示，随着沉香提取物浓度的增加，其对DPPH·自由基的清除作用逐渐增强。说明实施例1得到的沉香提取物对DPPH·自由基有很好的清除效果。

3、沉香提取物抑制KU812细胞中组胺释放量

外周血嗜碱性(KU812)细胞常被用作研究过敏反应的效应细胞，其与人体肥大细胞具有很大的相似性，适合用于建立人类肥大细胞激活和脱颗粒模型。采用KU812细胞组胺释放模型，考查提取物对KU812细胞组胺释放的影响，以期探讨沉香提取物抗I型超敏反应的作用机理。

样品配制及处理：以DMSO配制沉香提取物溶液，母液浓度为50mg·mL^-1，用时以含10％胎牛血清培养基稀释，高、中、低浓度为1000μg·mL^-1、500μg·mL^-1、250μg·mL^-1。

细胞培养及模型建立：用含10％胎牛血清的IMDM培养基进行稀释细胞，将细胞密度调整为2.2×10⁶个/mL，然后将得到的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种量为180μL。分为模型对照组、沉香提取物高、中、低剂量组、空白对照组、每组设6个复孔，37℃、5％CO₂培养箱培养静置10min，受试样品组分别加入相应浓度剂量的沉香提取物溶液20μL(终浓度分别为100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1)，空白对照组和模型对照组分别加入20μL培养液，置培养箱中预温孵，2h后除细胞空白对照组外，各组细胞加入刺激剂40nM巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)、1μm钙离子载体A23187，PMA和A23187使用DMSO配制。空白对照组加入同体积含等浓度DMSO培养基。

指标检测：2h后离心分离细胞，收集细胞上清液，测定上清液中组胺含量，方法按组胺ELISA检测试剂盒说明书进行。实验结果见下表1，表1为本发明提供的沉香提取物抑制KU812细胞中组胺释放量。

表1 沉香提取物对组胺释放的影响

注：空白对照组比较，**p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01

从表1中数据可以看出，经PMA和A23187联合诱导后，模型对照组组胺含量明显升高，与空白对照组比较有显著性差异(**p<0.01)。使用沉香提取物后，组胺含量明显降低，高、中、低剂量组均较模型组有显著性差异(**p<0.01，*p<0.05)，抑制率分别达到47.45％、39.90％和33.69％。这表明沉香提取物能有效的抑制组胺释放量，具有一定的抗敏功效。

实施例9

斑贴实验(Patch Test)是筛选和确定皮炎湿疹患者的致敏原一个简单、可靠的方法。

选取志愿者40人，年龄构成和性别随机确定，符合2007《化妆品卫生规范》纳入、排除标准；选取上背部脊椎两侧皮肤为受试部位，皮肤分为两部分，一部分为空白对照，一部分涂抹实施例5中的面膜精华液；然后将加有斑试物的斑试器胶带自下向上贴牢；斑贴试验时间为48h；贴敷后48h后，去除斑试器，30min后观察受试部位，记录试验结果。详细操作步骤和结果判断参照斑贴试验诊断试剂盒说明书(日常生活系列BY-02)。

实验结果：

从图6和图7中可以看出，涂抹含有沉香提取物的面膜液后，能大大减缓刺激源对皮肤所造成的刺激，其中檀香油、薄荷油、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、羊毛脂、丙二醇、夸特-15、山梨酸、布罗波尔对皮肤的致敏率接近零，远小于空白对照的致敏率，对硫柳汞、三氯生、十二烷基硫酸钠和尼泊金酯的致敏率有减少趋势，致敏率分别减少25％，26.67％，33.37％和31.77％。这表明涂抹含有沉香提取物的面膜液后，能在一定程度上保护表皮细胞膜结构完整性及屏障功能，不但不会引起皮肤过敏刺激，而且还可以提高皮肤的耐受性，并有修复受损肌肤减轻过敏症状的功效。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种具有舒敏抗敏功效的沉香提取物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）将沉香粉碎后，于乙醇溶液中加热提取；

所述沉香与乙醇溶液的质量比例为1:10~30，所述乙醇溶液的质量体积分数为80~95%；（2）冷却，过滤，取滤液备用；

（3）步骤（2）中的滤液浓缩得到沉香提取物浸膏；

（4）步骤（3）中的沉香提取物浸膏与多元醇混合溶解，过滤，得到滤液，即为具有舒敏抗敏功效的沉香提取物；

其中，所述多元醇为丙二醇、甘油、丁二醇的一种或多种。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述冷却步骤的终温度为20-50 ℃，冷却后的溶液进行离心，离心速度为4000rpm-5000rpm，离心时间为10min-20min，离心后取上清液，将上清液进行精滤，所用介质选择滤布或滤板。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩压力为0.04-0.1 MPa，减压浓缩温度为40-60 ℃。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（4）中，沉香提取物浸膏与多元醇的质量比例为1：50-100，浸膏溶解温度为20-50 ℃，过滤介质精度为0.2-10μm。

5.权利要求1~4中任一项所述的制备方法得到的沉香提取物。

6.权利要求5所述的沉香提取物在制备具有舒敏抗敏功效化妆品中的应用，其特征是：所述应用方法为：所述沉香提取物是通过清除自由基或者抑制细胞中组胺释放量来起到抗敏舒敏功效的。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是：所述的化妆品为面膜精华液、洗面奶、面霜或眼霜。

8.一种面膜精华液，其特征是，包含以下重量份的原料：聚乙烯醇12~16份，羟甲基纤维素1~3份，海藻酸钠0.5~1.5份，胶原蛋白1~3份，权利要求5所述的沉香提取物1~3份，尼泊金甲酯0.1~0.3份，甘油3~8份，三乙胺醇0.3~0.5份，水60~80份。

9.权利要求8所述的面膜精华液的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

1）称取设定量的聚乙烯醇、羟甲基纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、沉香提取物、尼泊金甲酯和水，在容器中混合均匀，加热至40~60℃，搅拌使其溶解；

2）向步骤1）中的溶液加入设定量的甘油和三乙胺醇，搅拌均匀即得面膜精华液。