JPH08511679A - 細胞培養から移植体を作成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞、特に軟骨細胞を生体外で生成するために、担体構造、特にポリマー繊維層からなる三次元担体構造に細胞を収容する。担体構造の形状は後で使用する移植体の形状に相当する。次に、担体構造に栄養液を長時間にわたり潅流することによって細胞を互いに結合する細胞間基質を担休構造の内部に少なくとも部分的に形成する。最後に、少なくとも部分的に形成された細胞間基質を有する担体構造を移植する。移植体の形状は担体構造が吸収される時でも細胞間基質によって維持される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養から移植体を作成する方法 本発明は細胞培養から移植体を作成する方法、特に軟骨細胞を用いて移植体を 作成する方法に関するものである。 本発明では吸収可能な担体構造を細胞で被い、次いで移植する。 除去した人体固有の組織、例えば軟骨組織を補充・再生する場合ための従来の 方法は主として次の２つである： １．必要な組織を死体から取り出し、保存し、移植する。この場合には免疫反応 が起こることがある。 ２．除去した組織の補充のために自家組織を用いることもできる。この自家組織 は患者の外から見えない別の部位から採取し、除去した組織の場所へ移植する。 この場合には免疫反応の恐れはない。 これら２つの方法の決定的な欠点は材料の量が少な過ぎることで、益々増大す る移植件数のニーズに組織の補充がしばしば追いつかず、不完全にしか行われな いことである。 そこで考えられた第３の方法は、常法によって分離して増殖した細胞を吸収可 能な材料からなるポリマー繊維束の上に被着し、この繊維束を移植する方法であ る。これに関してはC．A．ヴァカンティ達（C.A.Vacanti et al）の「形成・再 構成外科学、Plastic and Reconstructive Surgery」、第８巻、第５号、1991年 11月、第753〜759頁を参照されたい。この方法では、繊維束を重ね合わせかつ並 列して積層することによって移植体をいわば三次元に形成することができる。ポ リ マー材料は移植後に吸収されるとともに、個々の細胞の間に細胞間基質が特にコ ラーゲンからなる細胞間基質が構成されるので、最終的には周囲組織と一体化し た完全に機能し得る組織構造ができる。しかし、この方法はまだ試験段階にあり 、動物では実証されているが、人間医学ではまだ適用されていない。 上記方法は所望の移植体の形成が困難である。その理由は繊維材料の吸収時に 重なり合い且つ並列して配置された繊維束の形状安定性が予想されないためであ る。また、大きな移植体では移植体の内部に置かれた細胞へ栄養を送るのが困難 であろう。 本発明が解決しようとする課題は、細胞組織、特に軟骨組織を移植に好都合な 配列で利用する方法を開発することにある。この場合、移植体は移植状態で良好 な成形能と形状維持とを有し、移植体の各細胞の栄養を確実に保証しなければな らない。 本発明の課題は請求の範囲の請求項１の特徴部分に記載の方法で解決される。 発明は、連続した内面で且つ小さな体積を有する材料、例えばポリマー繊維層 で所望の移植形状を有する形状安定な三次元の担体構造を予備成形し、得られた 担体構造の内部空洞に細胞を入れ、細胞を収容する担体構造に栄養液を流すとい う基本的着想に基づいている。 細胞間基質が少なくとも部分的に形成された三次元担体構造全体は直ちに移植 することができる。 本発明では、三次元担体構造によって吸収時でも細胞および細胞間基質の形状 安定性が維持され、移植後も移植体の所 望形状が確実に保持される。 本発明では、潅流によって担体構造の内部に置かれた細胞に栄養液を十分に供 給でき、しかも、細胞間基質が少なくとも部分的に構成されたときでもこの供給 を引き続き維持することができる。本発明の担体構造の構造と、必要に応じて行 われる適当な調製によって担体構造への栄養液の進入・浸透を実質的に拡散だけ で行うことができる。これは生体内の状況にも相当する。また、担体構造に収容 された細胞への拡散による栄養供給は実質的に拡散のみが可能な材料で全担体構 造を被覆することによって可能になる。このような材料の例はアガロースである 。 拡散による担体構造の細胞への栄養供給によって、細胞生成物、特に細胞間基 質の構成に必要なコラーゲンおよびプロテオグリカンが細胞連結体から洗い流さ れてしまうのを防止することができる。担体構造への栄養液の潅流を間欠的に行 うことによって必要因子の拘束すなわち保持を一層改善できかつ促進できる。細 胞生成物は潅流休止時にその場に保持され、細胞との結合を形成する。潅流段階 で不要な細胞生成物を担体構造および基質から洗い流すこともできる。 本発明の上記以外の構成は従属請求項の記載から明らかであろ。 以下、添付図面を用いて本発明で使用する装置と、本発明実施例とを詳細に説 明する。 なお、下記説明では軟骨組織の生体外生成のみを説明するが、これ以外の細胞 組織も同様に取り扱うことができるということは明らかである。 移植のために、患者自身の軟骨細胞を常法により培養基で 増殖する。 吸収可能かつ形状安定なポリマー繊維層で担体構造を作成する。その形状はそ の後の移植体の形状に相当する。適当な繊維層材料の例はポリグリコールまたは ポリラクチドである。これによって大きな連続する内面を有し且つ材料の体積が 極めて小さい繊維層が作成される。 次に、担体構造の連続する内面を付着因子、例えばポリＬリシンで被覆または 湿潤する。この湿潤処理は例えば担体構造をポリリシン液に浸漬した後に凍結乾 燥することによって行われる。付着因子は担体構造のほぼ全ての内面を被覆する 。 細胞培養に十分な数の細胞が認められたら、その細胞を培養基と共に懸濁液に して、適当に調製した三次元担体構造に充填する。懸濁液の粘度を増すために、 吸収可能な増粘物質、例えばアガロースをこの懸濁液に加えることができる。 次に、例えば担体構造を２％アガロース溶液に浸漬して細胞を収容した担体構 造をアガロースで被覆する。続いて、例えば約４℃の冷水浴に浸漬して担体構造 を寒冷ショックに曝す。その際、被覆のアガロースが（場合によっては懸濁液に 添加したアガロースも）固化する。この処置によってその後の取扱いが容易にな る。 こうして調製された担体構造が添付図面に１で示されている。この担体構造１ を潅流装置２に入れる。この潅流装置２は潅流室４を内設したハウジング３から なり、担体構造１は潅流室４に入れる。ハウジング３には栄養液供給管５が接続 されている。栄養液は先ず混合室６に入り、ここで流れが均一化された後に潅流 室４に入る。潅流室４には流出室７が接続し、ここから流出管８が受液容器９へ 通じている。潅流室 ４のハウジング３はカバー10で覆われ、ヒータ11によって37℃の平均体温に相当 する一定温度に保持される。 潅流室４を別のアガロースで少なくとも部分的に充填することができる。 潅流室４に栄養液例えばＨＡＭＳＦ12の名称で市販される液が通される。この 栄養液はポンプ12、例えば蠕動ポンプによって送られる。ポンプ12は供給管５に 配設され、栄養液を貯蔵容器13から吸引する。この貯蔵容器13は例えば温度４℃ の水浴14中にある。蠕動ポンプ12の単位時間当たりの輸送量は極めて小さい。こ の場合、軟骨組織の生成のために毎時約１ミリリットルに調整されている。この 量で数個の担体構造１（図面には潅流室４の中に３個の担体構造）が十分に栄養 される。なお、この担体構造１は最大で親指爪の大きさの横断面を有している。 蠕動ポンプ12はタイマ-15によって間欠的に制御される。間欠の間隔は担体構 造１と潅流室４の大きさとに応じて調整することができる。実際にはポンピング および休止インターバルは分または時間単位の範囲内であろう。ポンピングおよ び休止インターバルが各々約30分の時に好結果を得た。 潅流装置２自体は公知のものである。この潅流装置２はメンブレン膜に付着す る細胞培養を連続的条件で行うのにも使用される。従って、従来のペトリ皿に代 わる役目をする。この場合、細胞培養が被着された膜はスリットを通して潅流室 に入れることができる。 潅流装置２に通された栄養液はアガロースの被覆を通って担体構造１に拡散す るので、その中に収容された細胞が栄養される。栄養液の流れとインターバル制 御は、細胞間基質の 形成のために必要な細胞生成物が洗い流されないで、その場所にとどまるように 調整されている。時がたつにつれて細胞間基質のコラーゲン繊維が細胞の間に形 成されて細胞が互いに結合される。この長く続く過程の間に、担体構造とアガロ ースとが少なくとも部分的に溶解することができる。こうして形成された細胞間 基質の形状は所定形状の移植体でもその後も維持される。 一般に、約10日ないし数週間で細胞間基質が十分に形成される。その段階で担 体構造１を潅流室４から取り出して移植する。時とともに基質が形成を続け、担 体構造は吸収される。 この方法で実際に細胞間基質が生体外で形成されることが確認された。このこ とは出願人の知る限り従来観察されていないことである。 なお、いわゆる組織形態形成因子を担体構造の繊維層に付加することもできる 。このような形態形成因子は細胞形成および細胞間基質の形成、さらには軟骨形 成を刺激する。このような因子は潅流室での細胞間基質の形成時に担体構造に入 れるか、移植の後に担体構造に入れることができる。巧妙な解決策は、組織形態 形成因子を繊維層材料に直接に結合するか、抗体に結合し、抗体が付加されたハ プテンを担体構造の繊維層材料に備えることである。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９４年８月１５日 【補正内容】 請求の範囲 １．吸収可能な担休構造に細胞を被着した後に、担体構造と共に細胞を移植する 細胞培養物、特に軟骨細胞の培養物から移植体を作成する方法において、 移植体の所望形状に応じて予備成形した連続した内面と小さな体積とを有する ほぼ形状安定な三次元の担体構造を用い、 この担体構造の内部空洞内に細胞を入れ、 栄養液が材料を通って担体構造の内部へ流れることができるように選択した材 料の外被で細胞を収容する担体構造を被覆し、 細胞を収容した担体構造に栄養液を潅流、貫流して、少なくとも細胞が互いに 結合した細胞間基質が少なくとも部分的に形成し、 その後に担体構造を移植する ことを特徴とする方法。 ２．栄養液が実担体構造の内部へ質的に拡散できるような外被の材料を選択する 請求項１に記載の方法。 ３．細胞間基質の構成に必要な細胞生成物、特に、コラーゲンおよびプロテオグ リカンが外被によって担体構造の内部に抑留されるように外被の材料を選択する 請求項１または２に記載の方法。 ４．外被の材料がアガロースである請求項１または２に記載の方法。 ５．担体構造がポリマー繊維、特にポリグリコールまたはポリラクチドの繊維層 である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 ６．細胞を担体構造に入れる前に、担体構造に付着因子、特にポリＬリシンを付 ける請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 ７．凍結乾燥で付着因子を坦体構造の表面に被着する請求項６に記載の方法。 ８．栄養液が担体構造に拡散するように担体構造の内部空洞を設計しかつ大きさ を定めた請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 ９．潅流段階で各休止期間が続くようにして、細胞を収容した担体構造を間欠的 に貫流する請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 10．細胞を収容した担体構造を潅流室に入れて潅流する請求項１〜９のいずれか 一項に記載の方法。 11．細胞を培養基と共に懸濁液として担体構造に入れ、その際、懸濁液に増粘物 質、特に、アガロースをさらに添加する請求項１〜10のいずれか一項に記載の方 法。 12．細胞形成と細胞間基質の形成を促進する組織形態形成因子を担体構造に付加 する請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。 13．担体構造の材料、特に、被着したハプテンに付加した抗体に組織形態形成因 子を結合する請求項12に記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．吸収可能な担体構造に細胞を被着した後に、担体構造と共に細胞を移植する 細胞培養物、特に軟骨細胞の培養物から移植体を作成する方法において、 移植体の所望形状に応じて予備成形した連続した内面と小さな体積とを有する ほぼ形状安定な三次元の担体構造を用い、 この担体構造の内部空洞内に細胞を入れ、 細胞を収容した担体構造に栄養液を潅流、貫流して、少なくとも細胞が互いに 結合した細胞間基質が少なくとも部分的に形成し、 その後に担体構造を移植する ことを特徴とする方法。 ２．担体構造がポリマー繊維、特にポリグリコールまたはポリラクチドの繊維層 である請求項１に記載の方法。 ３．細胞を担体構造に入れる前に、担体構造に付着因子、特にポリＬリシンを付 ける請求項１または２に記載の方法。 ４．凍結乾燥で付着因子を担体構造の表面に被着する請求項３に記載の方法。 ５．栄養液が担体構造に拡散するように担体構造の内部空洞を設計しかつ大きさ を定めた請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 ６．栄養液が貫通して拡散することができる材料、特にアガロースで細胞を収容 する担体構造を被覆する請求項５に記載の方法。 ７．潅流段階で各休止期間が続くようにして、細胞を収容した担体構造を間欠的 に貫流する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 ８．細胞を収容した担体構造を潅流室に入れて潅流する請求項１〜７のいずれか １つに記載の方法。 ９．細胞を培養基と共に懸濁液として担体構造に入れ、その際、懸濁液に増粘物 質、特に、アガロースをさらに添加する請求項１〜８のいずれか一項に記載の方 法。 10．細胞形成と細胞間基質の形成を促進する組織形態形成因子を担体構造に付加 する請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 11．担体構造の材料、特に、被着したハプテンに付加した抗体に組織形態形成因 子を結合する請求項10に記載の方法。