【発明の詳細な説明】
固定化リパーゼ
トリグリセリドその他のエステルの生産、並びにこれらの化合物の加水分解、
特に遊離脂肪酸と遊離アルコール又はグリセロールの生産を目的とした、トリグ
リセリド、ジグリセリド、モノグリセリド又は遊離脂肪酸アルキルエステルの酵
素変換は長年にわたって公知である。
例えば、英国特許第1,577,933号には、トリグリセリド混合物間でのエステル
交換又はトリグリセリドと遊離脂肪酸の反応によるトリグリセリドの製造方法が
開示されている。使用することのできる酵素は、ランダム化酵素群；1,3-特異的
酵素群；Δ9-シス特異的酵素のような部位特異的酵素群などである。これらの酵
素は担体材料に担持することができ、そうすることで、連続式プロセスの適用が
可能になると同時に酵素活性が増大する。
米国特許第4,629,742号及び欧州特許第322,213号によれば、酵素（好ましくは
リパーゼ）を特定の細孔径（すなわち、５０μm以上）の疎水性担体材料に担持
すると、特に酵素活性に関しての、改良を成し遂げることができる。しかし、こ
の酵素固定化法では、最善の結果を達成しようとすれば、極性有機溶媒による疎
水性担体の予備処理が必要とされる。
欧州特許第424,130号によれば、疎水性担体をアルコールで予備処理し、次に
、リパーゼの吸着に先立って非リパーゼタンパク質の吸着処理を行うと、酵素安
定性をさらに改善することができる。
本発明者らは、このような溶媒による予備処理を回避し得るか否かについての
知見を得るための研究を行った。この研究のもう一つの目的は、如何なる予備処
理も行わず、リパーゼ酵素をもっと簡略化された方法で固定化できるか否か、そ
れにより反応カラム自体の中でインシトゥ（in situ）固定化を行うことができ
るか否かについての知見を得ることであった。
こうした研究の結果、本発明を完成するに至った。本発明には、リパーゼを固
定化するための新規方法が包含されるが、当該方法は、従来技術の生成物と同等
の酵素活性を有する新規固定化リパーゼ酵素組成物を与える。
したがって、本発明は、第一に、平均細孔径０.０５〜５μmの乾燥多孔質粒状
疎水性担体材料に固定化されたリパーゼ酵素を製造するための方法にして、上記
疎水性担体とリパーゼの水溶液との接触を、少なくとも１つの脂肪酸部分を含ん
だ好ましくはＨＬＢ（親水親油バランス）値が８以上の非イオン性界面活性剤に
上記担体を接触させた後で或いは上記リパーゼとの接触の際に同時に或いは上記
界面活性剤と担体との接触の前に、行い、しかる後に担持されたリパーゼを洗浄
し、洗浄した材料を乾燥することを特徴とする方法に関する。
ここで強調しておくが、界面活性剤は水相に完全に溶解することもあれば（透
明溶液を形成する）、或いは水相中で安定な分散液を形成することもある（曇り
をおびた又は半透明の分散液を形成する）。このことは、Porter'ｓ Handbook o
f Surfactants 1991（Blackie編）の４２頁に開示されている。
米国特許第4,539,294号から、長鎖陽イオン性界面活性剤をリパーゼの固定化
に使用できることが知られている。担体として、Accurel（登録商標）のような
疎水性担体が挙げられている。しかし、この方法では極性有機溶媒中の界面活性
剤の溶液を使用しなければならない。
本発明の方法では、担体をリパーゼ酵素の水溶液と接触させるが、この接触を
どの段階で実施するにしても所要の担持量及び酵素活性を達成するためには非イ
オン性界面活性剤を使用する必要がある。
最も簡単な方法は、この接触をリパーゼ酵素の接触と同時に行うという方法で
あり、リパーゼ水溶液が上記界面活性剤も含んでいるるような方法が好ましい。
このようにすると、上記疎水性担体材料の充填されたカラムに、こうした溶液を
他の反応体（トリグリセリドなど）の不在下で流すことによって、カラム内で固
定化を引き起こすことができるので、分離した予備処理工程を除くことができる
。
驚くべきことに、酵素の担体への添加によって得られる添加担持酵素がエステ
ル化活性を示すのは、当該固定化プロセスに少なくとも１つの脂肪酸部分を含ん
でいるような非イオン性界面活性剤を使用した場合に限って起こることが判明し
た。非イオン性エーテル系界面活性剤や陰イオン性又は陽イオン性の界面活性剤
を用いた場合には、担持量ゼロ又はほとんどエステル化活性をもたない担持固定
化酵素を与える。
上記プロセスに利用することのできるリパーゼは公知の如何なるリパーゼであ
ってもよく、脂肪酸とアルコールのエステル化に特異的なリパーゼ、例えばCand
ida Antarcticaβのリパーゼなど、1,3-特異的リパーゼ又はランダム化エステル
交換リパーゼ、例えばHumicola種のリパーゼなど、或いは部分グリセリドの加水
分解又は合成に特異的なリパーゼ、例えばAmano Gリパーゼなど、或いはエステ
ル又はトリグリセリドの加水分解に特異的なリパーゼ、例えばCandida rugosaの
リパーゼなどだけでなく、Δ9特異的リパーゼを使用することもできる。これら
のリパーゼの具体例は上記引用文献に記載されている。
疎水性担体材料は、米国特許第4,629,742号、欧州特許第322,213号又は欧州特
許第424,130号に記載された疎水性担体のいずれであってもよい。これらの担体
は、したがって、脂肪族オレフィン系重合体、酸化重合体、これらの重合体のブ
レンドから選択することもできるし、疎水性とするための予備処理を施した無機
担体であってもよい。このような予備処理には好ましくは有機ケイ素化合物によ
るシラン化処理が含まれるが、無機材料は好ましくはシリカ、アルミナ、ガラス
又はセラミックスである。
しかし、好ましい担体は、ポリスチレン、スチレンの共重合体、ポリエチレン
、ポリプロピレン又は（メタ）アクリレート系コポリマーでできたものである。
上記非イオン性界面活性剤は好ましくはＨＬＢが８以上のもの、好ましくは８
〜２０のものである。当該界面活性剤は、当該界面活性剤の親水性部分として、
糖類（単糖類、二糖類及び多糖類）、ポリオール（例えば、ソルビタンやソルビ
トールなど）又はポリエチレングリコールから形成することができる。当該非イ
オン性界面活性剤の残りの部分は脂肪酸部分でなければならない。その具体例は
、炭素数８〜２２の飽和直鎖脂肪酸である。非常に好適な非イオン性界面活性剤
はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、特にTween 20（登録商標）
のようなラウリン酸由来のものである。
水溶液中のリパーゼ濃度は決定的な重要性を有しておらず、飽和濃度以下の濃
度であれば如何なる濃度であってもよいが、固定化リパーゼ中の酵素濃度が、担
体材料の重量を基準にして、１〜２０重量％となるような酵素濃度のものを使用
するのが好ましい。かかるリパーゼ濃度を用いると、担持量（KLU/gで表す）が
１〜１５００KLU/g、特に２０〜１００KLU/gのものを得ることができる。
水溶液中の界面活性剤濃度は、酵素の担体への効率的な担持を確保するに十分
なものであるべきである。非常に良好な結果は、界面活性剤濃度が０.０１重量
％以上、好ましくは０.０１〜１０重量％、最も好ましくは０.１〜５重量％の水
溶液を使用した場合に得られた。１０重量％を超える界面活性剤を使用すること
もできたが、有利な効果は得られなかった。上述の通り、この界面活性剤溶液は
溶解リパーゼ酵素を含んでいてもよく、リパーゼ酵素はその飽和濃度以下の量で
存在していてもよい。
接触時間は広い範囲で変えることができる。しかし、好適には、１〜７２時間
の範囲の接触時間を用いる。
リパーゼの固定化は幾つもの異なるやり方で遂行することができる。好適には
、担体とリパーゼ酵素及び／又は界面活性剤の間の接触は、回分プロセスとして
、固定床式連続プロセスとして、流動床式連続プロセスとして、或いは連続撹拌
槽内で実施されるが、接触はリパーゼ溶液の連続的移動のもとで実施される。
固定化に使用される疎水性担体の水分含量は決定的な重要性をもたず、通常は
非常に低いが、最良の結果は疎水性担体の水分含量が１重量％未満のときに得ら
れることが判明した。
上述の方法を用いると、新規固定化リパーゼ酵素が生成する。かかる新規担持
酵素においては、少量の上記非イオン性界面活性剤が常に存在している。かかる
新規固定化リパーゼ酵素も本発明の一部をなす。
したがって、本発明は、また、平均細孔径０.０５〜５μmの乾燥多孔質粒状疎
水性材料に固定化されたリパーゼ酵素にして、当該固定化担持酵素材料が、少な
くとも１つの脂肪酸部分を含んだ好ましくはＨＬＢ値が８.０以上、最も好まし
くは８〜２０の非イオン性界面活性剤を含んでおり、しかも好ましくは１０重量
％未満の水分含量を有することを特徴とする固定化リパーゼ酵素に関する。
上記界面活性剤は非イオン性のものであり、好ましい界面活性剤はポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル類（Tween（登録商標）系界面活性剤）、特
にラウリン酸由来のTween 20（登録商標）である。ただし、ポリグリセロール脂
肪酸エステル類も適している。
固定化リパーゼ酵素中の酵素濃度は好ましくは１〜２０重量％である（このよ
うなリパーゼ濃度は、１〜１５００KLU/gの酵素担持量によって得ることができ
る）。
リパーゼ酵素は先行技術で公知の如何なるリパーゼであってもよいが、固定化
リパーゼ酵素材料として好ましいのは、酵素を、１）脂肪酸とアルコールのエス
テル化に特異的なリパーゼ、好ましくはCandida Antarcticaβのリパーゼ、２）
1,3-特異的リパーゼ又はランダム化エステル交換リパーゼ、好ましくはRhizomuc
or miehei及びHumicola種のリパーゼ、３）部分グリセリドの加水分解に特異的
なリパーゼ、好ましくはAmano Gリパーゼ、及び４）エステル又はトリグリセリ
ドの加水分解に特異的なリパーゼ、好ましくはCandida rugosaのリパーゼ、から
選択したときである。
担体材料は先行技術で公知の疎水性担体から選択される。しかし、固定化リパ
ーゼ酵素材料から選択される担体としては好ましいのは、疎水性担体が
脂肪族オレフィン系重合体、
スチレンの単独重合体又は共重合体、
酸化重合体、
これらの重合体のブレンド、
予備処理を施した無機担体疎水性、好ましくはシラン化処理されたシリ
カ、アルミナ、ガラス又はセラミックスなどの無機担体
から選択されるときである。
最良の固定化リパーゼ酵素は、担体材料がスチレンの共重合体又は単独重合体
、ポリエチレン又はポリプロピレン重合体であるときに得られる。
担体の疎水性についての定義は米国特許第4,629,742号にみられるが、その定
義は本発明においても当てはまるものとみなすべきである。実際問題として、こ
の定義は疎水性担体材料を水と接触させたときに水をほとんど吸着しないことを
意味する。
本発明の固定化リパーゼ酵素はどんな酵素変換プロセスにも適用でき、例えば
トリグリセリドやジグリセリドやエステルの加水分解だけでなく、脂肪酸やジグ
リセリドやトリグリセリドのエステル化又はエステル交換にも適用し得る。これ
らのプロセスは、当該プロセスに本発明の固定化リパーゼを使用することを前提
条件として、本発明の一部をなす。実施例
Ｉ．Tween 20を用いたCandida Antarcticaβの固定化
Ａ）Tween 20存在下での固定化
０.５ｇのAccurel EP100（Accurelは登録商標）をフラスコに入れTween 20（
０.６５ｇ）とCandida Antarcticaβリパーゼ（６１mg）を含んだリン酸緩衝液
（１００ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。溶液の活性を測定することで、こ
の固定化プロセスをモニターした。溶液中のすべてのリパーゼがAccurel（登録
商標）に吸着した。１６時間後に、この生体触媒を洗浄して乾燥した。
Ｂ）Tween 20での予備湿潤
０.５ｇのAccurel EP100（Accurelは登録商標）をフラスコに入れ、Tween 20
（０.６５ｇ）を含んだリン酸緩衝液（３０ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。
２０分後に、Candida Antarcticaβリパーゼ（６１.５mg）を含んだリン酸緩衝
液（１００ml）を加えて、固定化プロセスを実施した。溶液中のすべてのリパー
ゼが吸着した。この生体触媒を洗浄して乾燥した。
II．活性測定
エステル化活性（標準的なオレイン酸オクチル合成）を測定し、米国特許第4,
629,742号の記載にしたがって担体のエタノール湿潤法で調製した対照触媒と比
較した。
担持量は、欧州特許第３２２２１３号に記載の通り、酵素溶液からのリパーゼ
活性の損失から算定した。
III．各種非イオン性界面活性剤の対比
Accurel EP100（１.０ｇ）をフラスコに入れ、界面活性剤（０.２５ｇ）とHum
icolaリパーゼ（０.４ml，４００００LU，Lipolase 100T）を含んだリン酸緩衝
液（５０ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。１６時間後に、上澄溶液中のリパ
ーゼ活性を測定することでリパーゼの吸着量を求めた。蒸留水で繰り返し洗浄（
４×３００ml）した後、真空下室温で触媒を乾燥して、オレイン酸オクチル合成
アッセイ法でそのエステル化活性を求めた。１．エステル系
２．比較例；エーテル系非イオン性界面活性剤
比較例IV
Accurel EP100（１.０ｇ）をフラスコに入れ、界面活性剤（０.２５ｇ）とHum
icolaリパーゼ（０.４ml，４００００LU，Lipolase 100T）を含んだリン酸緩衝
液（５０ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。１６時間後に、上澄溶液中のリパ
ーゼ活性を測定することでリパーゼの吸着量を求めた。蒸留水で繰り返し洗浄（
４×３００ml）した後、真空下室温で触媒を乾燥して、オレイン酸オクチル合成
アッセイ法でそのエステル化活性を求めた。１．陰イオン性界面活性剤
２．陽イオン性界面活性剤
緩衝液としてTris/HCl（０.０１Ｍ，ｐＨ７）を使用した点を除いては、上記
の手順を繰り返した。
実施例Ｖ
Accurel EP100（１.０ｇ）をフラスコに入れ、Tween 20（０.５ｇ）とリパー
ゼ（下記の表を参照）を含んだリン酸緩衝液（１００ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）
を加えた。１６時間後に、上澄溶液中のリパーゼ活性を測定することでリパーゼ
の吸着量を求めた。蒸留水で繰り返し洗浄（４×３００ml）した後、真空下室温
で触媒を乾燥して、オレイン酸オクチル合成アッセイ法でそのエステル化活性を
求めた。
これらのリパーゼはすべてNovo-Nordisk社製であった。実施例VI 非イオン性界面活性剤，同時固定化 Ｃ．界面活性剤濃度 方法
Accurel EP100（１.０ｇ）をフラスコに入れ、Tween 20（下記の表を参照）と
Humicolaリパーゼ（０.４５ml，４３０００LU，Lipolase 100T）を含んだリン酸
緩衝液（５０ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。１６時間後に、上澄溶液中の
リパーゼ活性を測定することでリパーゼの吸着量を求めた。蒸留水で繰り返し洗
浄（４×３００ml）した後、真空下室温で触媒を乾燥して、オレイン酸オクチル
合成アッセイ法でそのエステル化活性を求めた。
実施例VII 非イオン性界面活性剤，同時固定化 Ｄ．担体の種類 方法
担体（１.０ｇ）をフラスコに入れ、Tween 20（０.２５ｇ）とHumicolaリパー
ゼ（０.４５ml，４３０００LU，Lipolase 100T）を含んだリン酸緩衝液（５０ml
，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。１６時間後に、上澄溶液中のリパーゼ活性を
測定することでリパーゼの吸着量を求めた。蒸留水で繰り返し洗浄
（４×３００ml）した後、真空下室温で触媒を乾燥して、オレイン酸オクチル合
成アッセイ法でそのエステル化活性を求めた。
実施例VIII 界面活性剤の種類，予備湿潤処理 方法
Accurel EP100（２.０ｇ）をフラスコに入れ、界面活性剤（０.５ｇ）を含ん
だリン酸緩衝液（１００ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。１６時間穏やかに
撹拌した後、濾過により担体を分離して蒸留水（１０００ml）で洗浄した。湿潤
担体をフラスコに入れ、これに、Humicolaリパーゼ（Lipolase 100T,１８０KLU
）を含んだリン酸緩衝液（２００ml，０.０１Ｍ，ｐＨ７）を加えた。上澄溶液
中のリパーゼ活性を測定することでリパーゼの吸着量を求めた。１６時間後に、
上記触媒を蒸留水で繰り返し洗浄（４×３００ml）した後、真空下室温で触媒を
乾燥した。
触媒の活性はオレイン酸オクチルアッセイ法で求めた。１．エステル系
２．エーテル系
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９５年４月２１日
【補正内容】
明細書
固定化リパーゼ
トリグリセリドその他のエステルの生産、並びにこれらの化合物の加水分解、
特に遊離脂肪酸と遊離アルコール又はグリセロールの生産を目的とした、トリグ
リセリド、ジグリセリド、モノグリセリド又は遊離脂肪酸アルキルエステルの酵
素変換は長年にわたって公知である。
例えば、英国特許第1,577,933号には、トリグリセリド混合物間でのエステル
交換又はトリグリセリドと遊離脂肪酸の反応によるトリグリセリドの製造方法が
開示されている。使用することのできる酵素は、ランダム化酵素群；1,3-特異的
酵素群；Δ9-シス特異的酵素のような部位特異的酵素群などである。これらの酵
素は担体材料に担持することができ、そうすることで、連続式プロセスの適用が
可能になると同時に酵素活性が増大する。
米国特許第4,629,742号及び欧州特許第322,213号によれば、酵素（好ましくは
リパーゼ）を特定の細孔径（すなわち、５０μm以上）の疎水性担体材料に担持
すると、特に酵素活性に関しての、改良を成し遂げることができる。しかし、こ
の酵素固定化法では、最善の結果を達成しようとすれば、極性有機溶媒による疎
水性担体の予備処理が必要とされる。
欧州特許第424,130号によれば、疎水性担体をアルコールで予備処理し、次に
、リパーゼの吸着に先立って非リパーゼタンパク質の吸着処理を行うと、酵素安
定性をさらに改善することができる。
欧州特許第514,694号には、リパーゼを担体に固定化するに際して、リパーゼ
の周囲にミセルを形成するために界面活性剤をリパーゼ溶液に添加することが開
示されている。界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。しかし、界
面活性剤については何等の限定もされていない。
本発明者らは、このような溶媒による予備処理を回避し得るか否かについての
知見を得るための研究を行った。この研究のもう一つの目的は、如何なる予備処
理も行わず、リパーゼ酵素をもっと簡略化された方法で固定化できるか否か、そ
れにより反応カラム自体の中でインシトゥ（in situ）固定化を行うことができ
るか否かについての知見を得ることであった。
こうした研究の結果、本発明を完成するに至った。本発明には、リパーゼを固
定化するための新規方法が包含されるが、当該方法は、従来技術の生成物と同等
の酵素活性を有する新規固定化リパーゼ酵素組成物を与える。
したがって、本発明は、第一に、平均細孔径０.０５〜５μmの乾燥多孔質粒状
疎水性担体材料に固定化されたリパーゼ酵素を製造するための方法にして、上記
疎水性担体とリパーゼの水溶液との接触を、少なくとも１つの脂肪酸部分を含ん
だＨＬＢ（親水親油バランス）値が８以上の非イオン性界面活性剤に上記担体を
接触させた後で或いは上記リパーゼとの接触の際に同時に或いは上記界面活性剤
と担体との接触の前に、行い、しかる後に担持されたリパーゼを洗浄し、洗浄し
た材料を乾燥することを特徴とする方法に関する。
ここで強調しておくが、界面活性剤は水相に完全に溶解することもあれば（透
明溶液を形成する）、或いは水相中で安定な分散液を形成することもある（曇り
をおびた又は半透明の分散液を形成する）。このことは、Porter's Handbook of
Surfactants 1991（Blackie編）の４２頁に開示されている。
米国特許第4,539,294号から、長鎖陽イオン性界面活性剤をリパーゼの固定化
に使用できることが知られている。担体として、Accurel（登録商標）のような
疎水性担体が挙げられている。しかし、この方法では極性有機溶媒中の界面活性
剤の溶液を使用しなければならない。
本発明の方法では、担体をリパーゼ酵素の水溶液と接触させるが、この接触を
どの段階で実施するにしても所要の担持量及び酵素活性を達成するためには非イ
オン性界面活性剤を使用する必要がある。
最も簡単な方法は、この接触をリパーゼ酵素の接触と同時に行うという方法で
あり、リパーゼ水溶液が上記界面活性剤も含んでいるるような方法が好ましい。
このようにすると、上記疎水性担体材料の充填されたカラムに、こうした溶液を
他の反応体（トリグリセリドなど）の不在下で流すことによって、カラム内で固
定化を引き起こすことができるので、分離した予備処理工程を除くことができる
。
驚くべきことに、酵素の担体への添加によって得られる添加担持酵素がエステ
ル化活性を示すのは、当該固定化プロセスに、少なくとも１つの脂肪酸部分を含
んでいてＨＬＢ値が８.０以上の非イオン性界面活性剤を使用した場合に限って
起こることが判明した。非イオン性エーテル系界面活性剤や陰イオン性又は陽イ
オン性の界面活性剤を用いた場合には、担持量ゼロ又はほとんどエステル化活性
をもたない担持固定化酵素を与える。
上記プロセスに利用することのできるリパーゼは公知の如何なるリパーゼであ
ってもよく、脂肪酸とアルコールのエステル化に特異的なリパーゼ、例えばCand
ida Antarcticaβのリパーゼなど、1,3-特異的リパーゼ又はランダム化エステル
交換リパーゼ、例えばHumicola種のリパーゼなど、或いは部分グリセリドの加水
分解又は合成に特異的なリパーゼ、例えばAmano Gリパーゼなど、或いはエステ
ル又はトリグリセリドの加水分解に特異的なリパーゼ、例えばCandida rugosaの
リパーゼなどだけでなく、Δ9特異的リパーゼを使用することもできる。これら
のリパーゼの具体例は上記引用文献に記載されている。
疎水性担体材料は、米国特許第4,629,742号、欧州特許第322,213号又は欧州特
許第424,130号に記載された疎水性担体のいずれであってもよい。これらの担体
は、したがって、脂肪族オレフィン系重合体、酸化重合体、これらの重合体のブ
レンドから選択することもできるし、疎水性とするための予備処理を施した無機
担体であってもよい。このような予備処理には好ましくは有機ケイ素化合物によ
るシラン化処理が含まれるが、無機材料は好ましくはシリカ、アルミナ、ガラス
又はセラミックスである。
しかし、好ましい担体は、ポリスチレン、スチレンの共重合体、ポリエチレン
、ポリプロピレン又は（メタ）アクリレート系コポリマーでできたものである。
上記非イオン性界面活性剤はＨＬＢが８以上であり、好ましくは８〜２０であ
る。当該界面活性剤は、当該界面活性剤の親水性部分として、糖類（単糖類、二
糖類及び多糖類）、ポリオール（例えば、ソルビタンやソルビトールなど）又は
ポリエチレングリコールから形成することができる。当該非イオン性界面活性剤
の残りの部分は脂肪酸部分でなければならない。その具体例は、炭素数８〜２２
の飽和直鎖脂肪酸である。非常に好適な非イオン性界面活性剤はポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル類、特にTween 20（登録商標）のようなラウ
リン酸由来のものである。
水溶液中のリパーゼ濃度は決定的な重要性を有しておらず、飽和濃度以下の濃
度であれば如何なる濃度であってもよいが、固定化リパーゼ中の酵素濃度が、担
体材料の重量を基準にして、１〜２０重量％となるような酵素濃度のものを使用
するのが好ましい。かかるリパーゼ濃度を用いると、担持量（KLU/gで表す）が
１〜１５００KLU/g、特に２０〜１００KLU/gのものを得ることができる。
水溶液中の界面活性剤濃度は、酵素の担体への効率的な担持を確保するに十分
なものであるべきである。非常に良好な結果は、界面活性剤濃度が０.０１重量
％以上、好ましくは０.０１〜１０重量％、最も好ましくは０.１〜５重量％の水
溶液を使用した場合に得られた。１０重量％を超える界面活性剤を使用すること
もできたが、有利な効果は得られなかった。上述の通り、この界面活性剤溶液は
溶解リパーゼ酵素を含んでいてもよく、リパーゼ酵素はその飽和濃度以下の量で
存在していてもよい。
接触時間は広い範囲で変えることができる。しかし、好適には、１〜７２時間
の範囲の接触時間を用いる。
リパーゼの固定化は幾つもの異なるやり方で遂行することができる。好適には
、担体とリパーゼ酵素及び／又は界面活性剤の間の接触は、回分プロセスとして
、固定床式連続プロセスとして、流動床式連続プロセスとして、或いは連続撹拌
槽内で実施されるが、接触はリパーゼ溶液の連続的移動のもとで実施される。
固定化に使用される疎水性担体の水分含量は決定的な重要性をもたず、通常は
非常に低いが、最良の結果は疎水性担体の水分含量が１重量％未満のときに得ら
れることが判明した。
上述の方法を用いると、新規固定化リパーゼ酵素が生成する。かかる新規担持
酵素においては、少量の上記非イオン性界面活性剤が常に存在している。かかる
新規固定化リパーゼ酵素も本発明の一部をなす。
したがって、本発明は、また、平均細孔径０.０５〜５μmの乾燥多孔質粒状疎
水性材料に固定化されたリパーゼ酵素にして、当該固定化担持酵素材料が、少な
くとも１つの脂肪酸部分を含んでいてＨＬＢ値が８.０以上（最も好ましくは
８〜２０）の非イオン性界面活性剤を含んでおり、しかも好ましくは１０重量％
未満の水分含量を有することを特徴とする固定化リパーゼ酵素に関する。
上記界面活性剤は非イオン性のものであり、好ましい界面活性剤はポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル類（Tween（登録商標）系界面活性剤）、特
にラウリン酸由来のTween 20（登録商標）である。ただし、ポリグリセロール脂
肪酸エステル類も適している。
固定化リパーゼ酵素中の酵素濃度は好ましくは１〜２０重量％である（このよ
うなリパーゼ濃度は、１〜１５００KLU/gの酵素担持量によって得ることができ
る）。
リパーゼ酵素は先行技術で公知の如何なるリパーゼであってもよいが、固定化
リパーゼ酵素材料として好ましいのは、酵素を、１）脂肪酸とアルコールのエス
テル化に特異的なリパーゼ、好ましくはCandida Antarcticaβのリパーゼ、２）
1,3-特異的リパーゼ又はランダム化エステル交換リパーゼ、好ましくはRhizomuc
or miehei及びHumicola種のリパーゼ、３）部分グリセリドの加水分解に特異的
なリパーゼ、好ましくはAmano Gリパーゼ、及び４）エステル又はトリグリセリ
ドの加水分解に特異的なリパーゼ、好ましくはCandida rugosaのリパーゼ、から
選択したときである。
担体材料は先行技術で公知の疎水性担体から選択される。しかし、固定化リパ
ーゼ酵素材料から選択される担体としては好ましいのは、疎水性担体が
脂肪族オレフィン系重合体、
スチレンの単独重合体又は共重合体、
酸化重合体、
これらの重合体のブレンド、
予備処理を施した無機担体疎水性、好ましくはシラン化処理されたシリ
カ、アルミナ、ガラス又はセラミックスなどの無機担体
から選択されるときである。
最良の固定化リパーゼ酵素は、担体材料がスチレンの共重合体又は単独重合体
、ポリエチレン又はポリプロピレン重合体であるときに得られる。
担体の疎水性についての定義は米国特許第4,629,742号にみられるが、その
定義は本発明においても当てはまるものとみなすべきである。実際問題として、
この定義は疎水性担体材料を水と接触させたときに水をほとんど吸着しないこと
を意味する。
本発明の固定化リパーゼ酵素はどんな酵素変換プロセスにも適用でき、例えば
トリグリセリドやジグリセリドやエステルの加水分解だけでなく、脂肪酸やジグ
リセリドやトリグリセリドのエステル化又はエステル交換にも適用し得る。これ
らのプロセスは、当該プロセスに本発明の固定化リパーゼを使用することを前提
条件として、本発明の一部をなす。
請求の範囲
１．平均細孔径０.０５〜５μmの疎水性多孔質乾燥粒状材料に固定化されたリ
パーゼ酵素にして、当該固定化担持酵素材料が、少なくとも１つの脂肪酸部分を
含んだＨＬＢ値が８以上の非イオン性界面活性剤を０.０００１〜５重量％含ん
でおり、固定化リパーゼが好ましくは１０重量％未満の水分含量を有することを
特徴とする固定化リパーゼ酵素材料。
２．請求項１記載の固定化リパーゼ酵素材料において、上記界面活性剤がポリ
オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又はポリグリセロール脂肪酸エステル
であることを特徴とする固定化リパーゼ酵素材料。
３．請求項１又は請求項２記載の固定化リパーゼ酵素材料において、酵素濃度
が担体材料の重量を基準にして１〜２０重量％であることを特徴とする固定化リ
パーゼ酵素材料。
４．請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の固定化リパーゼ酵素材料にお
いて、上記酵素が、１）脂肪酸とアルコールのエステル化に特異的な酵素、好ま
しくはCandida Antarcticaβの酵素、２）1,3-特異的又はランダム化エステル交
換酵素、好ましくはRhizomucor miehei及びHumicola種の酵素、３）部分グリセ
リドの加水分解に特異的な酵素、好ましくはAmano G、及び４）エステル又はト
リグリセリドの加水分解に特異的な酵素、好ましくはCandida rugosaの酵素、か
ら選択されることを特徴とする固定化リパーゼ酵素材料。
５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の固定化リパーゼ酵素材料にお
いて、上記疎水性担体が
脂肪族オレフィン系重合体、
スチレンの単独重合体又は共重合体、
酸化重合体、
これらの重合体のブレンド、
予備処理を施した無機担体疎水性、好ましくはシラン化処理されたシラ
ン化処理されたシリカ、アルミナ、ガラス又はセラミックスなどの無機担体、
から選択されることを特徴とする固定化リパーゼ酵素材料。
６．請求項５項記載の固定化リパーゼ酵素材料において、上記脂肪族オレフィ
ン系重合体がポリエチレン又はポリプロピレンであることを特徴とする固定化リ
パーゼ酵素材料。
７．平均細孔径０.０５〜５μmの乾燥多孔質粒状疎水性担体材料に固定化され
たリパーゼ酵素を製造するための方法にして、上記疎水性担体とリパーゼの水溶
液との接触を、少なくとも１つの脂肪酸部分を含んだＨＬＢ値が８以上の非イオ
ン性界面活性剤に上記担体を接触させた後で或いは上記リパーゼとの接触の際に
同時に或いは上記界面活性剤と担体との接触の前に、行い、しかる後に担持され
たリパーゼを洗浄し、洗浄した材料を乾燥することを特徴とする方法。
８．請求項７記載の方法において、リパーゼ濃度が飽和濃度以下のリパーゼの
水溶液を使用することを特徴とする方法。
９．請求項７記載の方法において、任意成分として溶解リパーゼをその飽和濃
度以下の量で含んでいる界面活性剤濃度０.０１〜１０重量％の界面活性剤の水
溶液に上記疎水性担体を接触させることを特徴とする方法。
１０．請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法において、上記リパーゼ
水溶液と担体材料との接触時間が１〜７２時間であることを特徴とする方法。
１１．請求項７記載の方法において、上記担体とリパーゼ酵素及び／又は界面活
性剤との間の接触が、回分プロセスとして、固定床式連続プロセスとして、流動
床式連続プロセスとして又は連続撹拌槽内で実施され、当該接触がリパーゼ溶液
の連続的移動のもとで実施されることを特徴とする方法。
１２．請求項７記載の方法において、水分含量１重量％未満の疎水性担体材料を
使用することを特徴とする方法。
１３．トリグリセリド又はジグリセリド又はエステルの加水分解或いは脂肪酸又
はジグリセリド又はトリグリセリドのエステル化又はエステル交換の方法にして
、上記変換を請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の固定化担持リパーゼ
酵素の存在下で実施することを特徴とする方法。
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
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ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ
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