ES2330814B1 - Procedimiento de inmovilizacion de lipasas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de inmovilización de lipasas.
Sistema de inmovilización de lipasas sobre un
soporte de polipropileno microporoso con una relación
lipasa/soporte determinada, con el cual se llevan a cabo
eficazmente reacciones enzimáticas de interés, como por ejemplo la
producción de ciertos lípidos estructurados beneficiosos para la
salud, consiguiendo eliminar el fenómeno de acilmigración y
aumentar el rendimiento de producción de los triglicéridos de
interés.
Description
Procedimiento de inmovilización de lipasas.
La presente invención se encuadra en el sector
técnico de sistemas de inmovilización de lipasas sobre soportes, de
extendida aplicación en diversas reacciones enzimáticas.
El empleo de lipasas aporta muchas ventajas en
muchos procesos biotecnológicos. A pesar de ello, el uso de estos
catalizadores no se ha generalizado en los procesos a escala
industrial debido a que muchas lipasas no son suficientemente
estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte, muchas
lipasas son muy solubles en agua, lo que dificulta su separación de
los sustratos y productos para poder reutilizarlas. Además, en las
aplicaciones industriales es imprescindible para la economía del
proceso utilizar la lipasa repetidas veces. Con la inmovilización
de estas enzimas se han podido superar estos inconvenientes y
permitir recuperarlas con facilidad en los procesos discontinuos y
utilizarlas en procesos continuos haciendo el proceso
biotecnológico económicamente rentable.
Como ventajas del empleo de enzimas
inmovilizadas se pueden destacar:
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Los principales inconvenientes del proceso de
inmovilización podrían ser:
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Una de las reacciones catalizadas por lipasas de
mayor interés actual es la producción de lípidos estructurados MLM
(con ácidos grasos de cadena media en las posiciones 1 y 3, y
ácidos grasos de cadena larga en la posición 2) beneficiosos para
la salud. Para este fin se suelen utilizar lipasas
1,3-específicas inmovilizadas sobre diversos
soportes.
Se ha comprobado que los soportes iónicos pueden
catalizar fenómenos de acilmigración (paso de los ácidos grasos de
cadena larga de la posición 2 a la 1 o a la 3.), disminuyendo
considerablemente el rendimiento de producción de los lípidos
estructurados de interés.
Por ejemplo, en diversos ensayos realizados con
Lipozyme IM (enzima 1,3-específica) inmovilizada
sobre una resina de intercambio fónico se comprobó el efecto del
fenómeno de acilmigración (Camacho y col., 2002; González Moreno y
col., 2004).
Por tanto, existe la necesidad de encontrar un
sistema de inmovilización lipasa/soporte adecuado que proporcione
alta actividad y elevada estabilidad a las enzimas empleadas, y que
a su vez evite el fenómeno de acilmigración, con el fin de obtener
un alto rendimiento de producción de lípidos estructurados de
interés.
La presente invención se refiere a un sistema de
inmovilización de lipasas sobre un soporte de polipropileno
microporoso con una relación lipasa/soporte determinada. Con este
sistema se llevan a cabo eficazmente reacciones enzimáticas de
interés, como por ejemplo la producción de ciertos lípidos
estructurados beneficiosos para la salud.
Lo novedoso de la invención radica en la
adecuada combinación lipasa-soporte, que
proporciona una excelente actividad y estabilidad a la enzima
inmovilizada. De esta manera se consiguen mejorar los
procedimientos descritos hasta la fecha, resolviéndose los problemas
planteados en el estado de la técnica: se elimina el fenómeno de
acilmigración y aumenta el rendimiento de producción de los
triglicéridos de interés.
El método de inmovilización de la presente
invención se refiere a un sistema formado por las lipasas
1,3-específicas procedentes de Rhizopus
oryzae (Lipasa D) y Rhizopus delemar (Lipasa Rd)
inmovilizadas sobre un soporte de polipropileno microporoso, en una
relación lipasa/soporte, en peso, está comprendida entre 1:1 y 1:2,
preferentemente 1:1,5. Se ha comprobado la actividad de dichas
lipasas inmovilizadas en reacciones de hidrólisis, alcoholisis y
acidolisis, partiendo de aceite de pescado como sustrato de
origen.
En una realización particular de la invención se
hicieron ensayos de inmovilización con las lipasas Rd (Rhizopus
delemar), D (Rhizopus oryzae) y AK (Pseudomonas
florecens) sobre diferentes soportes (Celite y Accurel) y con
distintas relaciones lipasa/soporte. Se comprobó así la actividad y
estabilidad de las enzimas. Estos ensayos se aplicaron a reacciones
de hidrólisis, alcoholisis y acidolisis, con aceite de pescado como
sustrato.
En otra realización particular de la invención
se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones
de hidrólisis partiendo de aceite de hígado de bacalao y agua.
En otra realización particular de la invención
se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones
de alcoholisis partiendo de aceite de hígado de bacalao y
etanol.
En otra realización particular de la invención
se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones
de acidolisis partiendo de aceites de pescado (atún e hígado de
bacalao) y ácido caprílico.
En otra realización particular de la invención
se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones
de acidolisis en tanque agitado y en lecho empacado.
Las ventajas prácticas de este nuevo método de
inmovilización de lipasas son:
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Se comprobó que las lipasas de Rhizopus
oryzae (Lipasa D) y Rhizopus delemar (Lipasa Rd)
inmovilizadas sobre un soporte de propileno microporoso, en una
relación lipasa/soporte 1:1,5 proporcionaban unos mejores
resultados de actividad y estabilidad que otras combinaciones
realizadas con otros soportes, lipasas o relaciones
lipasa/soporte.
A continuación, a título explicativo pero no
limitativo, se detallan los siguientes ejemplos que ilustran la
presente invención.
Este método consiste en lavar el soporte
(Accurel MP1000) con agua (Milli-Q) hasta que el pH
sea igual a 6 y a continuación secarlo en una estufa a 80ºC durante
una noche. Por otra parte se prepara una disolución tampón fosfato
(pH =6).
1 g de lipasa y 1,5 g de Accurel MP1000 se
suspenden en 25 ml de esta disolución fosfato y se agita a 150 rpm
y 5ºC durante 8 h. A continuación se añaden 5 ml de etanol y se
filtra a vacío con una placa de vidrio con porosidad número 4. La
torta (lipasa inmovilizada) se lava en el Büchner 3 veces con
disolución tampón y se deja secar a temperatura ambiente durante 48
h. Finalmente se almacena a 5ºC.
Este protocolo está basado en el método de
Soumanou y cols. (1998) de inmovilización de lipasas, con la
diferencia de que en este caso el soporte utilizado es Celite 545
AW.
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Para encontrar la mejor combinación
lipasa-soporte se hicieron ensayos de acidolisis
combinando tres tipos de lipasas 1,3-específicas,
dos soportes y dos relaciones lipasa/soporte. La determinación se
realizó a partir de experimentos de acidolisis en un reactor de
lecho empacado partiendo de aceite de hígado de bacalao y ácido
caprílico.
Lipasas: de Rhizopus oryzae (Lipasa D),
Rhizopus delemar (Lipasa Rd) y Pseudomonas florecens
(lipasa AK)
Soportes: Celite 545 AW (tierra de diatomeas) y
Accurel MP1000 (polipropileno microporoso).
Relaciones lipasa/soporte: 1:1,5 y 1:4.
Los mejores rendimientos se obtuvieron con las
lipasas D y Rd inmovilizadas sobre el soporte Accurel MP1000, con
la relación lipasa/soporte de 1:1,5.
Los resultados de este estudio se muestran en la
tabla 1. Considerando como parámetro de interés la fracción molar
de ácido caprílico incorporada a los lípidos estructurados finales
(FM %), los mejores resultados se obtienen con las lipasas D y Rd
sobre Accurel MP1000 con una relación
lipasa-soporte de 1:1,5.
La estabilidad de las lipasas inmovilizadas en
las condiciones de operación (30ºC) se determinó llevando a cabo
experimentos de acidolisis en modo continuo durante 5 días. En ese
periodo no se observó una disminución en la actividad enzimática.
Este resultado queda reflejado en la figura 1.
También se determinó la estabilidad de las
enzimas inmovilizadas en las condiciones de almacenamiento (5ºC).
En este caso la actividad se determinó en modo discontinuo
analizando muestras puntuales cada 5 meses. La actividad de las
lipasas permaneció constante durante ese periodo de tiempo, tal y
como se muestra en la figura 2.
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A continuación se describen resultados de
ensayos realizados en los que se prueba la eficacia del sistema
lipasa-soporte objeto de la invención en diversas
reacciones partiendo de aceite de hígado de bacalao, ácido caprílico
(AC) y etanol.
Las lipasas Rd (Rhizopus delemar), D
(Rhizopus oryzae) y AK (Pseudomonas florecens) se
inmovilizaron sobre Celite y Accurel EP100 (polipropileno
microporoso) en varias relaciones soporte/lipasa y se buscó la
mejor lipasa, el mejor soporte y la mejor relación soporte/lipasa
mediante medidas de actividad de hidrólisis, alcoholisis y
acidolisis. Los resultados de estos estudios se muestran a
continuación:
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Ejemplo
3.1.
El mayor grado de hidrólisis (98,7%) se obtuvo
con la lipasa Rd inmovilizada sobre Accurel EP100 con la relación
lipasa/soporte 1:1,5 (p/p). También se obtuvo un buen resultado
(53,3%) con la lipasa D en las mismas condiciones.
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Ejemplo
3.2.
Los dos mejores resultados fueron:
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Tras almacenar lotes de esta lipasa cinco meses
se realizaron medidas de actividad:
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Se observó una disminución de la actividad tras
este periodo de almacenaje.
Se comprobó la reproducibilidad del método de
inmovilización ya que enzimas inmovilizadas de la misma manera en
dos lotes distintos daban actividades idénticas
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Ejemplo
3.3.
Los dos mejores resultados fueron:
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Tras almacenar lotes de esta lipasa cinco meses
se realizaron medidas de actividad:
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Para validar la reproducibilidad del método de
inmovilización se comprobó que enzimas inmovilizadas de la misma
manera en dos Zotes distintos daban actividades idénticas
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Ejemplo
3.4.
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Comparando estos resultados con los de la
primera utilización recién inmovilizada se observan disminuciones
de actividad del 21% y del 6%.
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Se comprobó la eficacia del sistema de lipasas
inmovilizadas en la reacción de acidolisis de aceite de atún (rico
en ácidos grasos de cadena larga, 20% DHA) y ácido caprílico (ácido
graso de cadena media) en presencia de un disolvente orgánico en un
reactor de lecho empacado.
En este sistema las lipasas inmovilizadas se
empacaron en una columna de vidrio (1,5 cm de diámetro interno x 25
cm de longitud) cubierta por una película de aluminio para evitar
la oxidación fotoinducida. El lecho enzimático queda entre dos
discos perforados, lo que permite ajustar el volumen del lecho al
volumen de las lipasas empacadas.
Tanto la mezcla inicial de sustratos como la
columna se encamisaron para mantener una temperatura de reacción a
30ºC.
El objetivo principal del ensayo fue la
obtención de lípidos estructurados MLM con ácido caprílico en las
posiciones 1 y 3 de la molécula de glicerol y ácido docosahexanoico
(DHA) en la posición 2 manteniendo la estabilidad de las lipasas
empleadas.
Aplicando las condiciones óptimas lipasa/soporte
objeto de la invención a la acidolisis partiendo de aceite de atún
y ácido caprílico, y empleando una adecuada relación molar ácido
caprílico/aceite de pescado/disolvente, se obtuvieron elevados
rendimientos en la producción de triglicéridos MLM.
Como mejor resultado destacamos la producción de
lípidos estructurados con un 58,9% de ácido caprílico y un 13,2% de
DHA.
Como consecuencia de la especificidad 1,3 de las
lipasas empleadas, era de suponer que el ácido caprílico ocupara
principalmente las posiciones 1 y 3 de los lípidos estructurados
obtenidos, mientras que el DHA u otros ácidos grasos de cadena
larga se posicionaran en la 2. De esta manera se demostraría que el
fenómeno de acilmigración no tiene lugar en el sistema de lipasas
inmovilizadas.
Aplicando las mejores condiciones
lipasa-soporte y analizando lípidos estructurados
con un 45% de ácido caprílico y un 19,5% de DHA se obtuvo que el
ácido caprílico representaba el 61,4% del total de ácidos grasos, lo
que suponía que el 91% del ácido caprílico incorporado se unía a
las posiciones 1 y 3. Los ácidos grasos que encontramos en la
posición 2 fueron en un 37,4% de cadena larga, representando el DHA
el 24,9% de este total.
El análisis posicional demostró que la mayoría
de lípidos estructurados obtenidos tenían una estructura MLM, con
ácido caprílico en las posiciones 1 y 3, y DHA en la posición 2, lo
que demostraba el buen funcionamiento del sistema de inmovilización
de lipasas y la ausencia de la acilmigración.
La importancia de emplear un soporte de
polipropileno microporoso radica en que al no poseer grupos iónicos
en su superficie se minimiza el efecto de la acilmigración
aumentando así el rendimiento de la producción de los lípidos
estructurados de interés. Sin embargo, otros soportes como resinas
de intercambio fónico catalizan las reacciones de acilmigración,
disminuyendo la efectividad de la síntesis de los triglicéridos
deseados.
La tabla 1 se refiere a la influencia de la
lipasa, del soporte y de la relación másica lipasa/soporte en la
fracción molar de ácido caprílico incorporada a los triglicéridos
iniciales del aceite de hígado de bacalao (FM). Cuanto mayor sea
FM, mejor será el funcionamiento de la lipasa inmovilizada.
La figura 1 representa la estabilidad de las
lipasas D y Rd inmovilizadas en Accurel MP1000 (ratio molar
lipasa/soporte 1:1,5) bajo las condiciones de operación. En esta
figura se muestra la influencia del tiempo de reacción en la
fracción de ácido caprílico incorporada a los triglicéridos. Los
ensayos se hicieron en el reactor de lecho empacado en modo continuo
durante 5 días.
La figura 2 muestra la estabilidad de las
lipasas D y Rd inmovilizadas en Accurel MP1000 bajo condiciones de
almacenamiento (5ºC). En esta figura se muestra la influencia del
tiempo de almacenamiento en la fracción molar de ácido caprílico
incorporada a los triglicéridos. Los ensayos se realizaron en el
reactor de lecho empacado durante una hora en modo discontinuo.
Claims (5)
1. Sistema de inmovilización de lipasas,
caracterizado porque para esta inmovilización se emplea un
soporte de polipropileno microporoso con el que se llevan a cabo
eficazmente reacciones enzimáticas de interés, en particular la
producción de ciertos lípidos estructurados beneficiosos para la
salud.
2. Sistema de inmovilización de lipasas, según
la reivindicación 1, caracterizado porque las lipasas a
inmovilizar son lipasa D (de Rhizopus oryzae) o lipasa Rd
(de Rhizopus delemar).
3. Sistema de inmovilización de lipasas, según
la reivindicación 1, caracterizado porque el que el soporte
empleado es Accurel.
4. Sistema de inmovilización de lipasas, según
la reivindicación 1, caracterizado porque la relación
lipasa/soporte, en peso, está comprendida entre 1:1 y 1:2,
preferentemente 1:1,5.
5. Sistema de inmovilización de lipasas, según
la reivindicación 1, caracterizado porque dichas lipasas
inmovilizadas se utilizan en reacciones de hidrólisis, alcoholisis
y acidólisis, partiendo de un sustrato lipídico, preferentemente,
aceite de pescado como sustrato.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700673A ES2330814B1 (es) | 2007-02-27 | 2007-02-27 | Procedimiento de inmovilizacion de lipasas. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700673A ES2330814B1 (es) | 2007-02-27 | 2007-02-27 | Procedimiento de inmovilizacion de lipasas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330814A1 ES2330814A1 (es) | 2009-12-15 |
| ES2330814B1 true ES2330814B1 (es) | 2010-09-30 |
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ID=41360224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| ES200700673A Expired - Fee Related ES2330814B1 (es) | 2007-02-27 | 2007-02-27 | Procedimiento de inmovilizacion de lipasas. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2330814B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69407038T2 (de) * | 1993-05-20 | 1998-04-16 | Loders Croklaan Bv | Verfahren zur herstellung immobilisierter lipasen |
| DE19931847A1 (de) * | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Basf Ag | Immobilisierte Lipase |
-
2007
- 2007-02-27 ES ES200700673A patent/ES2330814B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HITA E., ROBLES A., et.al. "{}Production fo structured triacylglycerols (STAG)rich in docosahexaenoic acid(DHA)in position 2 by acidolysis of tuna oil catalyzed by lipases"{}. Process Biochemistry, Vol. 42, 7 de octubre de 2006, páginas 415-422 [en línea], [recuperado el 23.10.2009]. Recuperado en internet <URL:http://www.sciencedirect.com/ science?\_ob=ArticleURL&\_udi=B6THB4M2GGWN1&\_user=6409497 &\_rdoc=1&\_fmt=&\_orig=search&\_sort=d&\_docanchor=&view= c&\_acct=C000069789&\_version=1&\_urlVersion=0&\_userid=6409497&md5 =2f537ddc8081b69e400a703b06ff6c67> <DOI:10.1016/j.procbio.2006.09.023>, todo el documento. * |
| SHIMADA Y., et.al."{}Production of structured lipid containing docosahexaenoic and caprylic acids using immobilized Rhizopus delemar lipase"{}.Journal of Fermentation and Bioengineering 25.04.1996 Vol. 81, N$^{o}$ 4, páginas 299-303, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2330814A1 (es) | 2009-12-15 |
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Date of ref document: 20091215 Kind code of ref document: A1 |
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Effective date: 20180912 |