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Abstract

Sistema de inmovilización de lipasas sobre un soporte de polipropileno microporoso con una relación lipasa/soporte determinada, con el cual se llevan a cabo eficazmente reacciones enzimáticas de interés, como por ejemplo la producción de ciertos lípidos estructurados beneficiosos para la salud, consiguiendo eliminar el fenómeno de acilmigración y aumentar el rendimiento de producción de los triglicéridos de interés.

Description

Procedimiento de inmovilización de lipasas.
Sector de la técnica
La presente invención se encuadra en el sector técnico de sistemas de inmovilización de lipasas sobre soportes, de extendida aplicación en diversas reacciones enzimáticas.
Estado de la técnica
El empleo de lipasas aporta muchas ventajas en muchos procesos biotecnológicos. A pesar de ello, el uso de estos catalizadores no se ha generalizado en los procesos a escala industrial debido a que muchas lipasas no son suficientemente estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte, muchas lipasas son muy solubles en agua, lo que dificulta su separación de los sustratos y productos para poder reutilizarlas. Además, en las aplicaciones industriales es imprescindible para la economía del proceso utilizar la lipasa repetidas veces. Con la inmovilización de estas enzimas se han podido superar estos inconvenientes y permitir recuperarlas con facilidad en los procesos discontinuos y utilizarlas en procesos continuos haciendo el proceso biotecnológico económicamente rentable.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas se pueden destacar:
\bullet
\vtcortauna El aumento de la estabilidad de la enzima (estabilidad mecánica, térmica, etc.).
\bullet
\vtcortauna La posibilidad de emplearlas tanto en medios acuosos como orgánicos.
\bullet
\vtcortauna La facilitación de la reutilización de la enzima, por lo que disminuyen los costes del proceso.
\bullet
\vtcortauna La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización podrían ser:
\bullet
\vtcortauna La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
\bullet
\vtcortauna La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte, donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
\bullet
\vtcortauna Suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización.
\bullet
\vtcortauna El biocatalizador final es más caro que la enzima nativa.
\bullet
\vtcortauna Algunos soportes catalizan fenómenos de acilmigración.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las reacciones catalizadas por lipasas de mayor interés actual es la producción de lípidos estructurados MLM (con ácidos grasos de cadena media en las posiciones 1 y 3, y ácidos grasos de cadena larga en la posición 2) beneficiosos para la salud. Para este fin se suelen utilizar lipasas 1,3-específicas inmovilizadas sobre diversos soportes.
Se ha comprobado que los soportes iónicos pueden catalizar fenómenos de acilmigración (paso de los ácidos grasos de cadena larga de la posición 2 a la 1 o a la 3.), disminuyendo considerablemente el rendimiento de producción de los lípidos estructurados de interés.
Por ejemplo, en diversos ensayos realizados con Lipozyme IM (enzima 1,3-específica) inmovilizada sobre una resina de intercambio fónico se comprobó el efecto del fenómeno de acilmigración (Camacho y col., 2002; González Moreno y col., 2004).
Por tanto, existe la necesidad de encontrar un sistema de inmovilización lipasa/soporte adecuado que proporcione alta actividad y elevada estabilidad a las enzimas empleadas, y que a su vez evite el fenómeno de acilmigración, con el fin de obtener un alto rendimiento de producción de lípidos estructurados de interés.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un sistema de inmovilización de lipasas sobre un soporte de polipropileno microporoso con una relación lipasa/soporte determinada. Con este sistema se llevan a cabo eficazmente reacciones enzimáticas de interés, como por ejemplo la producción de ciertos lípidos estructurados beneficiosos para la salud.
Lo novedoso de la invención radica en la adecuada combinación lipasa-soporte, que proporciona una excelente actividad y estabilidad a la enzima inmovilizada. De esta manera se consiguen mejorar los procedimientos descritos hasta la fecha, resolviéndose los problemas planteados en el estado de la técnica: se elimina el fenómeno de acilmigración y aumenta el rendimiento de producción de los triglicéridos de interés.
El método de inmovilización de la presente invención se refiere a un sistema formado por las lipasas 1,3-específicas procedentes de Rhizopus oryzae (Lipasa D) y Rhizopus delemar (Lipasa Rd) inmovilizadas sobre un soporte de polipropileno microporoso, en una relación lipasa/soporte, en peso, está comprendida entre 1:1 y 1:2, preferentemente 1:1,5. Se ha comprobado la actividad de dichas lipasas inmovilizadas en reacciones de hidrólisis, alcoholisis y acidolisis, partiendo de aceite de pescado como sustrato de origen.
En una realización particular de la invención se hicieron ensayos de inmovilización con las lipasas Rd (Rhizopus delemar), D (Rhizopus oryzae) y AK (Pseudomonas florecens) sobre diferentes soportes (Celite y Accurel) y con distintas relaciones lipasa/soporte. Se comprobó así la actividad y estabilidad de las enzimas. Estos ensayos se aplicaron a reacciones de hidrólisis, alcoholisis y acidolisis, con aceite de pescado como sustrato.
En otra realización particular de la invención se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones de hidrólisis partiendo de aceite de hígado de bacalao y agua.
En otra realización particular de la invención se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones de alcoholisis partiendo de aceite de hígado de bacalao y etanol.
En otra realización particular de la invención se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones de acidolisis partiendo de aceites de pescado (atún e hígado de bacalao) y ácido caprílico.
En otra realización particular de la invención se comprobó la eficacia del sistema de inmovilización en reacciones de acidolisis en tanque agitado y en lecho empacado.
Las ventajas prácticas de este nuevo método de inmovilización de lipasas son:
-
\vtcortauna mayor actividad de las lipasas en reacciones de acidólisis, alcoholisis e hidrólisis
-
\vtcortauna resultados extrapolables tanto en tanque agitado como en lecho fijo
-
\vtcortauna obtención de mayores rendimientos de producción de los glicéridos MLM de interés en la reacción de acidólisis
-
\vtcortauna buena estabilidad de las lipasas en las condiciones de operación y almacenamiento
-
\vtcortauna eliminación del fenómeno de acil-migración que se produce con otras combinaciones lipasa-soporte.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada
Se comprobó que las lipasas de Rhizopus oryzae (Lipasa D) y Rhizopus delemar (Lipasa Rd) inmovilizadas sobre un soporte de propileno microporoso, en una relación lipasa/soporte 1:1,5 proporcionaban unos mejores resultados de actividad y estabilidad que otras combinaciones realizadas con otros soportes, lipasas o relaciones lipasa/soporte.
A continuación, a título explicativo pero no limitativo, se detallan los siguientes ejemplos que ilustran la presente invención.
Ejemplo 1 Preparación de las lipasas inmovilizadas sobre Accurel MP1000
Este método consiste en lavar el soporte (Accurel MP1000) con agua (Milli-Q) hasta que el pH sea igual a 6 y a continuación secarlo en una estufa a 80ºC durante una noche. Por otra parte se prepara una disolución tampón fosfato (pH =6).
1 g de lipasa y 1,5 g de Accurel MP1000 se suspenden en 25 ml de esta disolución fosfato y se agita a 150 rpm y 5ºC durante 8 h. A continuación se añaden 5 ml de etanol y se filtra a vacío con una placa de vidrio con porosidad número 4. La torta (lipasa inmovilizada) se lava en el Büchner 3 veces con disolución tampón y se deja secar a temperatura ambiente durante 48 h. Finalmente se almacena a 5ºC.
Este protocolo está basado en el método de Soumanou y cols. (1998) de inmovilización de lipasas, con la diferencia de que en este caso el soporte utilizado es Celite 545 AW.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Eficacia y estabilidad de las lipasas inmovilizadas
Para encontrar la mejor combinación lipasa-soporte se hicieron ensayos de acidolisis combinando tres tipos de lipasas 1,3-específicas, dos soportes y dos relaciones lipasa/soporte. La determinación se realizó a partir de experimentos de acidolisis en un reactor de lecho empacado partiendo de aceite de hígado de bacalao y ácido caprílico.
Lipasas: de Rhizopus oryzae (Lipasa D), Rhizopus delemar (Lipasa Rd) y Pseudomonas florecens (lipasa AK)
Soportes: Celite 545 AW (tierra de diatomeas) y Accurel MP1000 (polipropileno microporoso).
Relaciones lipasa/soporte: 1:1,5 y 1:4.
Los mejores rendimientos se obtuvieron con las lipasas D y Rd inmovilizadas sobre el soporte Accurel MP1000, con la relación lipasa/soporte de 1:1,5.
Los resultados de este estudio se muestran en la tabla 1. Considerando como parámetro de interés la fracción molar de ácido caprílico incorporada a los lípidos estructurados finales (FM %), los mejores resultados se obtienen con las lipasas D y Rd sobre Accurel MP1000 con una relación lipasa-soporte de 1:1,5.
La estabilidad de las lipasas inmovilizadas en las condiciones de operación (30ºC) se determinó llevando a cabo experimentos de acidolisis en modo continuo durante 5 días. En ese periodo no se observó una disminución en la actividad enzimática. Este resultado queda reflejado en la figura 1.
También se determinó la estabilidad de las enzimas inmovilizadas en las condiciones de almacenamiento (5ºC). En este caso la actividad se determinó en modo discontinuo analizando muestras puntuales cada 5 meses. La actividad de las lipasas permaneció constante durante ese periodo de tiempo, tal y como se muestra en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Aplicación del sistema lipasa-soporte en reacciones de hidrólisis, alcoholisis y acidolisis
A continuación se describen resultados de ensayos realizados en los que se prueba la eficacia del sistema lipasa-soporte objeto de la invención en diversas reacciones partiendo de aceite de hígado de bacalao, ácido caprílico (AC) y etanol.
Las lipasas Rd (Rhizopus delemar), D (Rhizopus oryzae) y AK (Pseudomonas florecens) se inmovilizaron sobre Celite y Accurel EP100 (polipropileno microporoso) en varias relaciones soporte/lipasa y se buscó la mejor lipasa, el mejor soporte y la mejor relación soporte/lipasa mediante medidas de actividad de hidrólisis, alcoholisis y acidolisis. Los resultados de estos estudios se muestran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3.1.
Hidrólisis
El mayor grado de hidrólisis (98,7%) se obtuvo con la lipasa Rd inmovilizada sobre Accurel EP100 con la relación lipasa/soporte 1:1,5 (p/p). También se obtuvo un buen resultado (53,3%) con la lipasa D en las mismas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3.2.
Alcoholisis en tanque agitado (entre aceite de hígado de bacalao y etanol)
Los dos mejores resultados fueron:
-
\vtcortauna Lipasa Rd-Accurel EP100-1:1,5: rendimiento en monoglicéridos 77,4%
-
\vtcortauna Lipasa D-Accurel EP100-1:1,5: rendimiento en monoglicéridos 77,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras almacenar lotes de esta lipasa cinco meses se realizaron medidas de actividad:
-
\vtcortauna Lipasa Rd-Accurel EP100-1:1,5: rendimiento en monoglicéridos 65.5%
\newpage
-
\vtcortauna Lipasa D- Accurel EP100-1:1,5: rendimiento en monoglicéridos 48.8%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó una disminución de la actividad tras este periodo de almacenaje.
Se comprobó la reproducibilidad del método de inmovilización ya que enzimas inmovilizadas de la misma manera en dos lotes distintos daban actividades idénticas
-
\vtcortauna Lipasa Rd-Accurel EP100-1:1,5: rendimiento en monoglicéridos 71.4 y 65.5%
-
\vtcortauna Lipasa D-Accurel EP100-1:1,5: rendimiento en monoglicéridos 65.7 y 67.2%
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3.3.
Acidolisis en tanque agitado
Los dos mejores resultados fueron:
-
\vtcortauna Lipasa Rd/Accurel EP100-1,5: 34,2% de AC incorporado
-
\vtcortauna Lipasa D/Accurel EP100-1,5: 23,1% de AC incorporado.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras almacenar lotes de esta lipasa cinco meses se realizaron medidas de actividad:
-
\vtcortauna Lipasa Rd-Accurel EP100-1,5: 44% de AC incorporado
-
\vtcortauna Lipasa D-Accurel EP100-1,5: 45,6% de AC incorporado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para validar la reproducibilidad del método de inmovilización se comprobó que enzimas inmovilizadas de la misma manera en dos Zotes distintos daban actividades idénticas
-
\vtcortauna Lipasa Rd-Accurel EP100-1,5: 47.6 y 47% de AC incorporado
-
\vtcortauna Lipasa D-Accurel EP100-1,5: 48,6 y 48.1% de AC incorporado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3.4.
Acidolisis en lecho fijo (col. 6,6 x 250 mm) en continuo
-
\vtcortauna Las dos lipasas mantuvieron su actividad constante durante 4,5 días de uso continuado (en las condiciones de operación). Actividades medias: 54.3% de AC incorporado (D) y 50.6% de AC incorporado (Rd)
-
\vtcortauna Las dos lipasas mantuvieronsu actividad durante 3 semanas (D) y 4 semanas (Rd) tras utilizarlas, almacenarlas y volverlas a utilizar una vez por semana. Actividades medias: 47.9% de AC incorporado (D) y 48.3% de AC incorporado (Rd).
-
\vtcortauna Tras el almacenamiento y sucesivas reutilizaciones anteriores la lipasa se volvió a poner en un lecho empacado y a utilizarse de manera continua: durante 4-3 días mantuvieron su actividad prácticamente constante en valores medios en tomo a 42.8% de AC incorporado (D) y 47.4% de AC incorporado (Rd).
\vskip1.000000\baselineskip
Comparando estos resultados con los de la primera utilización recién inmovilizada se observan disminuciones de actividad del 21 % y del 6%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Acidolisis en lecho empacado
Se comprobó la eficacia del sistema de lipasas inmovilizadas en la reacción de acidolisis de aceite de atún (rico en ácidos grasos de cadena larga, 20% DHA) y ácido caprílico (ácido graso de cadena media) en presencia de un disolvente orgánico en un reactor de lecho empacado.
En este sistema las lipasas inmovilizadas se empacaron en una columna de vidrio (1,5 cm de diámetro interno x 25 cm de longitud) cubierta por una película de aluminio para evitar la oxidación fotoinducida. El lecho enzimático queda entre dos discos perforados, lo que permite ajustar el volumen del lecho al volumen de las lipasas empacadas.
Tanto la mezcla inicial de sustratos como la columna se encamisaron para mantener una temperatura de reacción a 30ºC.
El objetivo principal del ensayo fue la obtención de lípidos estructurados MLM con ácido caprílico en las posiciones 1 y 3 de la molécula de glicerol y ácido docosahexanoico (DHA) en la posición 2 manteniendo la estabilidad de las lipasas empleadas.
Aplicando las condiciones óptimas lipasa/soporte objeto de la invención a la acidolisis partiendo de aceite de atún y ácido caprílico, y empleando una adecuada relación molar ácido caprílico/aceite de pescado/disolvente, se obtuvieron elevados rendimientos en la producción de triglicéridos MLM.
Como mejor resultado destacamos la producción de lípidos estructurados con un 58,9% de ácido caprílico y un 13,2% de DHA.
Como consecuencia de la especificidad 1,3 de las lipasas empleadas, era de suponer que el ácido caprílico ocupara principalmente las posiciones 1 y 3 de los lípidos estructurados obtenidos, mientras que el DHA u otros ácidos grasos de cadena larga se posicionaran en la 2. De esta manera se demostraría que el fenómeno de acilmigración no tiene lugar en el sistema de lipasas inmovilizadas.
Aplicando las mejores condiciones lipasa-soporte y analizando lípidos estructurados con un 45% de ácido caprílico y un 19,5% de DHA se obtuvo que el ácido caprílico representaba el 61,4 % del total de ácidos grasos, lo que suponía que el 91% del ácido caprílico incorporado se unía a las posiciones 1 y 3. Los ácidos grasos que encontramos en la posición 2 fueron en un 37,4% de cadena larga, representando el DHA el 24,9% de este total.
El análisis posicional demostró que la mayoría de lípidos estructurados obtenidos tenían una estructura MLM, con ácido caprílico en las posiciones 1 y 3, y DHA en la posición 2, lo que demostraba el buen funcionamiento del sistema de inmovilización de lipasas y la ausencia de la acilmigración.
La importancia de emplear un soporte de polipropileno microporoso radica en que al no poseer grupos iónicos en su superficie se minimiza el efecto de la acilmigración aumentando así el rendimiento de la producción de los lípidos estructurados de interés. Sin embargo, otros soportes como resinas de intercambio fónico catalizan las reacciones de acilmigración, disminuyendo la efectividad de la síntesis de los triglicéridos deseados.
Descripción de las figuras y tablas
La tabla 1 se refiere a la influencia de la lipasa, del soporte y de la relación másica lipasa/soporte en la fracción molar de ácido caprílico incorporada a los triglicéridos iniciales del aceite de hígado de bacalao (FM). Cuanto mayor sea FM, mejor será el funcionamiento de la lipasa inmovilizada.
La figura 1 representa la estabilidad de las lipasas D y Rd inmovilizadas en Accurel MP1000 (ratio molar lipasa/soporte 1:1,5) bajo las condiciones de operación. En esta figura se muestra la influencia del tiempo de reacción en la fracción de ácido caprílico incorporada a los triglicéridos. Los ensayos se hicieron en el reactor de lecho empacado en modo continuo durante 5 días.
La figura 2 muestra la estabilidad de las lipasas D y Rd inmovilizadas en Accurel MP1000 bajo condiciones de almacenamiento (5ºC). En esta figura se muestra la influencia del tiempo de almacenamiento en la fracción molar de ácido caprílico incorporada a los triglicéridos. Los ensayos se realizaron en el reactor de lecho empacado durante una hora en modo discontinuo.

Claims (5)

1. Sistema de inmovilización de lipasas, caracterizado porque para esta inmovilización se emplea un soporte de polipropileno microporoso con el que se llevan a cabo eficazmente reacciones enzimáticas de interés, en particular la producción de ciertos lípidos estructurados beneficiosos para la salud.
2. Sistema de inmovilización de lipasas, según la reivindicación 1, caracterizado porque las lipasas a inmovilizar son lipasa D (de Rhizopus oryzae) o lipasa Rd (de Rhizopus delemar).
3. Sistema de inmovilización de lipasas, según la reivindicación 1, caracterizado porque el que el soporte empleado es Accurel.
4. Sistema de inmovilización de lipasas, según la reivindicación 1, caracterizado porque la relación lipasa/soporte, en peso, está comprendida entre 1:1 y 1:2, preferentemente 1:1,5.
5. Sistema de inmovilización de lipasas, según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas lipasas son inmovilizadas en reacciones de hidrólisis, alcoholisis y acidolisis, partiendo de un sustrato lipídico, preferentemente, aceite de pescado como sustrato.
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