ES2482890B1 - Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte renovable derivado de un residuo agroalimentario - Google Patents

Abstract

Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte renovable derivado de un residuo agroalimentario.#Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte, caracterizado porque comprende: a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico de un residuo agroalimentario que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, e b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior. Preferiblemente, la enzima es lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEO ID N° 1) y el residuo agroalimentario es cáscara de arroz. Así como el soporte obtenido en la etapa a), la enzima inmovilizada obtenida en la etapa b) y su uso para obtener biodiesel.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte renovable derivado de un residuo agroalimentario

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SECTOR TÉCNICO

La presente invención se sitúa dentro del campo de la biotecnología, ya que se refiere a una enzima inmovilizada en un soporte renovable y sus usos, entre otros, en el campo de la química-fina y biocatálisis. Así, las enzimas inmovilizadas en soportes renovables obtenidos 10 a partir de residuos agroalimentarios de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en la síntesis enantiomérica de compuestos químicos de alto valor añadido, entre otras, para la industria farmacéutica, o como biocatalizadores en biotransformaciones tal como, por ejemplo, la síntesis de biodiesel.

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Adicionalmente, la presente invención también se puede situar en el sector del reciclado ya que utiliza material de desecho de la industria agroalimentaria, preferiblemente cáscara de arroz, para obtener el soporte renovable donde se inmoviliza la enzima.

ESTADO DE LA TÉCNICA 20

Las enzimas son moléculas de gran interés por sus numerosas aplicaciones industriales en campos tan diversos como la alimentación, por ejemplo, en la obtención de productos deslactosados, edulcorantes, zumos, jarabes de glucosa, piensos animales, etc.; en la obtención de biocombustibles, por ejemplo, bioetanol de primera y segunda generación, 25 biodiesel; detergentes; fármacos tal como, por ejemplo, antibióticos semisintéticos, compuestos enantioméricamente puros; polímeros; ingredientes funcionales, por ejemplo, prebióticos, grasas enriquecidas con ácidos grasos poliinsaturados; o en medicina, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades genéticas o análisis clínicos.

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En particular, las lipasas son enzimas de la familia de las hidrolasas, capaces de hidrolizar triglicéridos en diglicéridos, monoglicéridos, ácidos grasos y glicerol, actuando sobre los enlaces éster carboxílicos de los triglicéridos. Son importantes en el cuerpo humano pues facilitan la absorción de grasas. Las lipasas suponen más de la cuarta parte del total de las enzimas utilizadas en biotransformaciones, siendo su elevado coste de producción, su único 35 inconveniente para su uso industrial. En la industria se usan para fabricar jabones y detergentes por hidrólisis de sebo, para producción de leche infantil por estructuración o modificación de lípidos, en la industria quesera, para hidrolizar la grasa de la leche. También pueden resolver mezclas racémicas mediante estrategias de hidrólisis, esterificación o transesterificación, dando lugar a un solo enantiómero de la mezcla (enantioselectividad), lo 40 que se usa por ejemplo en la industria farmacéutica para la producción de fármacos quirales (A.-L. Groussin, S. Antoniotti, Valuable chemicals by the enzymatic modification of molecules of natural origin: Terpenoids, steroids, phenolics and related. Bioresource Technology 115 (2012) 237-243).

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La inmovilización de enzimas es interesante porque permite reusar los biocatalizadores, y puede ayudar a aumentar su resistencia contra la inactivación. En el desarrollo de enzimas inmovilizadas se han de tener en cuenta varias propiedades importantes para sus aplicaciones industriales, como son la fuerza mecánica, la estabilidad química y física, el carácter hidrofóbico/hidrofílico, la cantidad de enzima inmovilizada y el coste. 50

Actualmente, y como alternativa al método covencional de catálisis básica, se está investigando la producción de biodiesel mediante el empleo de enzimas, principalmente

lipasas, inmovilizadas para catalizar reacciones de transesterificación, esterificación e interesterificación. En particular, N. Digze et al. describe la producción de biodiesel por transesterificación de aceite de girasol, soja y residuos de cocina utilizando una lipasa inmovilizada en un polímero microporoso obtenido a partir de estireno, divinilbenceno y poliglutaraldehido (N. Digze et al. Biodiesel production from sunflower, soybean, and waste 5 cooking oils by transesterification using lipasa immobilized onto a novel microporous polymer. Biosource Technology, 100 (2009), 1983-1991). Por otro lado, N.W. Li et al. describe la utilización de lipasa de Penicillium exapansum inmovilizada en resina D4020 en la transesterificación de aceite de maíz (N.W. Li et al. Immobilization Chinese Journal of Catalysis, Vol 8(4), 2007). 10

Por otro lado, en la patente EP 444092 B1 (Particulate immobilized lipase preparation, method for production thereof and use thereof, de Novo Norkisk) se describen partículas de una lipasa microbiana, en particular lipasas derivadas de cepas de especies Humicola, Candida antarctica o Rhizomucor miehei, inmovilizada en un soporte macroporoso, donde 15 dicho soporte consiste en al menos 65 % de silica o silicatos, más del 90 % de las partículas tienen un tamaño de partícula entre 100 y 1000 μm, más del 80 % de los poros de las partículas muestra un diámetro entre 10 y 45 veces el diámetro de los glóbulos de lipasa, y donde el contenido de agua de las partículas de lipasa inmovilizadas se encuentra entre 1 y 20 %. En este documento también se describe el procedimiento de inmovilización de las 20 lipasas y su uso en la interesterificación de grasas, la hidrólisis de grasas y la síntesis de glicéridos u otros esteres de ácidos graso.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

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En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte, caracterizado porque comprende:

a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico de un residuo agroalimentario que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión 30 alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, e

b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior.

El procedimiento de la presente invención utiliza residuos agroalimentarios como material de partida para la obtención del soporte renovable donde se inmoviliza la enzima, lo que 35 supone una disminución significativa en el coste de producción de la mencionada enzima inmovilizada. De esta forma, el procedimiento tal como se describe en esta solicitud de patente permite extender el uso de enzimas, en particular lipasas, en el mercado a gran escala. Adicionalmente, el procedimiento de la presente invención revaloriza el residuo agroalimentario utilizado como material de partida, lo que redunda en un mayor beneficio 40 económico y medioambiental.

La inmovilización de la enzima tiene lugar principalmente por interacciones de la cadena polipeptídica con el soporte mediante, por ejemplo, puentes de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Por lo tanto, en principio cualquier proteína y, por ende cualquier enzima, es 45 susceptible de ser adsorbida en el soporte renovable obtenido en la etapa a) del procedimiento de la presente invención.

Para que el procedimiento de inmovilización resulte efectivo, el residuo agroalimentario se ha de someter a tratamiento térmico, es decir, se ha de calentar el residuo agroalimentario 50 que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, preferiblemente a una temperatura igual o superior a 500ºC.

Tras el tratamiento térmico el soporte renovable posee, en comparación con el material sin dicho tratamiento térmico, una mayor homogeneidad y una mayor estabilidad mecánica y química (S.F. D’Souza, S.S. Godbole J. Biochem. Biophys. Methods 52 (2002) 59–62).

En una realización preferida, la etapa a) del procedimiento de obtención de una enzima 5 inmovilizada de la presente invención comprende calentar el residuo agroalimentario entre 500 y 700 ºC. En una realización aún más preferida, el calentamiento tiene lugar al aire, a una velocidad de 5ºC /min.

En otra realización aún más preferida, una vez alcanzada la temperatura final entre 500 y 10 700 ºC se mantiene durante un tiempo entre 2 y 4 horas.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada tal como se describe en esta solicitud de patente, donde la enzima es una lipasa. Preferiblemente, una lipasa del hongo Rhizopus oryzae o Candida 15 antárctica, en ambos casos dicha lipasa puede ser nativa o recombinante.

En una realización aún más preferida, la lipasa inmovilizada en el procedimiento de la presente invención es la lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1). Esta enzima puede expresarse en un microorganismo tal como, por ejemplo, Pichia pastoris, 20 Saccharomyces cerivisiae o Aspergillus niger. Preferiblemente, la lipasa inmovilizada es una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) expresada en la levadura Pichia pastoris.

En otra realización preferida, el residuo agroalimentario utilizado como material de partida en 25 la etapa a) del procedimiento de la invención comprende entre 40% y 45 % en peso de un átomo seleccionado del grupo que consiste en silicio, potasio, magnesio y una mezcla de los anteriores. Preferiblemente, el residuo agroalimentario comprende 41% en peso de silicio.

En una realización aún más preferida, el soporte renovable obtenido en etapa a) del 30 procedimiento de la presente invención comprende un 41 % en peso de silicio, presenta estructura amorfa, y tamaño de partícula medio inferior o igual a 200 micras.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada tal como se describe en esta solicitud de patente, donde el 35 residuo agroalimentario utilizado para obtener el soporte renovable es cáscara de arroz. Cascaras de arroz de diferentes procedencias permiten preparar soportes renovables de composiciones similares.

En una realización aún más preferida, el procedimiento de obtención de la enzima 40 inmovilizada en un soporte tal como se describe en esta solicitud de patente comprende:

a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico entre 500 y 700 ºC de cáscara de arroz, preferiblemente con un contenido en silicio de 41% en peso, e

b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior. Aún más preferiblemente, la enzima inmovilizada en la etapa b) es la lipasa recombinante del hongo 45 Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1).

En otra realización preferida, la etapa b) de inmovilización de la enzima, preferiblemente lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1), en el soporte renovable tal como se describe en esta solicitud de patente comprende: 50

b1) obtener una disolución de la enzima en tampón fosfato 0,01 y 0,5 M a pH entre 4,5 y 8,5,

b2) mezclar la disolución de la enzima preparada en la etapa b1) con el soporte renovable,

b3) agitar la suspensión entre 4 y 25 ºC a no más de 100 rpm hasta que la cantidad de enzima soportada varíe menos de 2% entre dos medidas consecutivas,

b4) filtrar y lavar la enzima inmovilizada con el tampón fosfato utilizado en la etapa b1).

Preferiblemente la etapa b3) de agitación tiene lugar en un agitador de rodillo u orbital. 5

En una realización aún más preferida, la etapa b) de inmovilización de la enzima en el soporte renovable tal como se describe en esta solicitud de patente comprende:

b1) obtener una disolución de lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) en tampón fosfato 0,1 M a pH 6.5, 10

b2) mezclar la disolución de la enzima preparada en la etapa b1) con el soporte renovable obtenido por tratamiento térmico entre 500-700 ºC de cáscara de arroz,

b3) agitar la suspensión entre 4 y 25 ºC a no más de 100 rpm, durante máximo 24 horas,

b4) filtrar y lavar la enzima inmovilizada con el tampón fosfato utilizado en la etapa b1).

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En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un soporte renovable caracterizado porque comprende entre 40 y 45 % en peso de silicio, preferiblemente 41% en peso, presenta estructura amorfa, mesoporosa, y un tamaño de partícula medio inferior o igual a 200 micras.

20

En una realización preferida, el soporte renovable tal como se describe en el párrafo anterior se obtiene por tratamiento térmico entre 500 y 700 ºC de cáscara de arroz.

En un tercer aspecto, la presente invención también se refiere a una enzima inmovilizada en un soporte renovable, donde el soporte renovable comprende entre 40 y 45 % en peso de 25 silicio, preferiblemente 41% en peso, presenta estructura amorfa, mesoporosa, y un tamaño de partícula medio inferior o igual a 200 micras.

En una realización preferida, este soporte renovable se obtiene por tratamiento térmico entre 500 y 700 ºC de cáscara de arroz. 30

En otra realización preferida, la presente invención también se refiere a la enzima inmovilizada del párrafo anterior, donde la enzima es una lipasa tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferiblemente, lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1). 35

En un cuarto aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un residuo agroalimentario, preferiblemente cáscara de arroz, para obtener el soporte renovable que comprende entre 40 y 45 % en peso de silicio, preferiblemente 41% en peso, presenta estructura amorfa, mesoporosa, y un tamaño de partícula medio inferior o igual a 200 40 micras.

En una realización preferida, este soporte renovable se obtiene por tratamiento térmico entre 500 y 700 ºC de cáscara de arroz.

45

El uso de materiales baratos derivados de residuos agroindustriales como soportes para enzimas resulta de interés, ya que permite abaratar los costes del procedimiento de obtención de dicha enzima inmovilizada, y, a su vez de aquellas biotransformaciones donde se utilicen dichos enzimas.

50

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de la enzima inmovilizada en el soporte renovable tal como se describe en el tercer aspecto de la presente invención, para

sintetizar biodiesel. En particular, mediante la transesterificación de triglicéricos con un alcohol tal como etanol o metanol.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso de la enzima inmovilizada en el soporte renovable del párrafo anterior, donde dicha enzima es una lipasa 5 tal como se describe en esta solicitud de patente. Mas preferiblemente, la lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1).

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método de obtención de biodiesel que comprende: 10

i) obtener una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) inmovilizada en un soporte renovable tal como se describe en esta solicitud de patente, y

ii) poner en contacto la lipasa inmovilizada obtenida en la etapa anterior con un triglicérido en presencia de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol y etanol para obtener biodiesel. 15

El triglicérido puede contener ácidos grasos saturados o insaturados de distinta longitud de cadena; la reacción puede llevarse a cabo a una temperatura entre 30 y 60°C; el tiempo de reacción es dependiente de la cantidad de enzima inmovilizada añadida, pudiendo estar comprendido típicamente entre 2 y 48 horas. 20

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Determinación de la máxima capacidad de adsorción del soporte RH26 sobre la lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) 25

Figura 2: Cromatograma HPLC típico obtenido en la reacción test de transesterificación de trilaurina con etanol. Picos: (1) 1-monolaurina; (2) ácido láurico; (3) laurato de etilo; (4) 1,2-dilaurina; (5) trilaurina

30

Figura 3a: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con metanol como se describe en el ejemplo 3, utilizando ROL-RH26 como biocatalizador.

Figura 3b: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con etanol como se describe en el ejemplo 3, utilizando ROL-RH26 como biocatalizador. 35

Figura 4a: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con metanol como se describe en el ejemplo 4, utilizando Novozym 435 como biocatalizador.

Figura 4b: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con etanol como se describe en 40 el ejemplo 4, utilizando Novozym 435 como biocatalizador.

Figura 5a: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con metanol como se describe en el ejemplo 4, utilizando Lipozyme TL IM como biocatalizador.

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Figura 5b: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con etanol como se describe en el ejemplo 4, utilizando Lipozyme TL IM como biocatalizador.

Figura 6a: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con metanol como se describe en el ejemplo 4, utilizando Lipozyme RM IM como biocatalizador. 50

Figura 6b: Seguimiento de la transesterificación de trilaurina con etanol como se describe en el ejemplo 4, utilizando Lipozyme RM IM como biocatalizador.

En las figuras 3a a 6b se indica con (♦) ácido láurico, (■) laurato de etilo, (▲) 1-monolaurina, (x) 1,2-dilaurina y (ж) trilaurina.

EJEMPLOS:

5

Ejemplo 1: Obtención de un soporte renovable a partir de cáscara de arroz

La cáscara de arroz procedente del Levante español se sometió a tratamiento térmico en aire con velocidad de subida de la temperatura hasta la final de 5º/min y enfriamiento libre a diferentes temperaturas entre 500-700 ºC, durante periodos de tiempo variables entre 2 y 4 10 horas. En particular se utilizaron las condiciones descritas en la tabla 1.

Tabla 1

Soporte enzimático

Temperatura (ºC) Horas

RH45

500 4

RH47

700 4

RH26

600 2

Las siglas utilizadas para identificar los diferentes soportes obtenidos hacen referencia a la 15 temperatura y tiempo utilizados para obtenerlos. Así, los soportes se han identificado como RHXY, donde RH indica cascara de arroz, el primer digito (X) son las horas de tratamiento térmico y el segundo (Y) corresponde a la temperatura (5: 500ºC, 6: 600ºC, 7: 700ºC).

Los soportes preparados tal como se ha indicado anteriormente se caracterizaron mediante 20 ICP para estudio de su composición, porosimetría de mercurio para conocer su textura, análisis TG-ATD de la descomposición de moléculas sonda para conocer sus características acido-base (acético para la basicidad y hexilamina para la acidez), difracción de rayos X para conocer su estructura cristalina y espectroscopia FTIR para estudiar los grupos superficiales, análisis textural con adsorción-desorción de nitrógeno y porosimetría 25 de intrusión de mercurio.

Los resultados obtenidos muestran que los soportes preparados a partir de cáscara de arroz (RH47, RH45, RH26) contienen 41% p/p de silicio, 2% p/p de potasio, 1% p/p de calcio y 0,5% p/p de magnesio y su estudio por difracción de rayos X indica que poseen estructura 30 amorfa, característica de su composición principalmente silícea (A. Samadi-Maybodi, E. Atashbozorg. Quantitative and qualitative studies of silica in different rice samples grown in north of Iran using UV–vis, XRD and IR spectroscopy techniques, Talanta 70 (2006) 756–760).

35

El estudio por espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) muestra como principales bandas las situadas 1100-1200 cm-1 y a 400-600 cm-1, correspondientes a los enlaces metal-oxígeno que indican la estructura de óxido de los materiales tratados en las condiciones indicadas, más concretamente a 1114–1060 cm−1 correspondiente a la vibración asimétrica de grupos Si–O, la banda a 850–800 cm−1 debida a la vibración simétrica de 40 grupos Si–O, la presente a 1130–1000 cm−1 relacionada con la vibración asimétrica de grupos Si–O–Si y la banda de OH- superficiales centrada a 3300-3500 cm-1, que disminuye al aumentar la temperatura de tratamiento, debido a la perdida de estos grupos en forma de agua y algunas bandas cercanas a 2100cm-1 correspondientes a pequeñas cantidades de materia orgánica que contiene grupos tipo C=O y que disminuyen a medida que el 45 tratamiento se hace a mayor temperatura y/o mayor tiempo, debido a su descomposición (F.L. Galeener, Phys. Rev. B, 8 (1993), 4292–4297).

El estudio de la textura de los soportes mediante porosimetría de mercurio indica que con el incremento de la temperatura de tratamiento hay una sinterización del sólido que causa una pérdida de área superficial siendo de 68 m2/g para RH45, 32m2/g para RH26, a 13m2/g para RH47, un aumento de densidad del material de 2,0g/cc para RH45, 2,1g/cc para RH26 a 2,4 g/cc para RH47 y una disminución de los volúmenes de mesoporos de 0,175cc/g para 5 RH45, 0,11cc/g para RH26 a 0,077cc/g para RH47 y que los tamaños de partícula de los soportes son similares e inferiores a 200 micras para los tres soportes preparados.

La basicidad y acidez de los sólidos se midió utilizando análisis termogravimétrico acoplado a espectrometría de masas de ácido acético para determinar basicidad y hexilamina para 10 determinar acidez. En los soportes se observa la presencia de grupos de fuerza acida y básica baja, debidos principalmente a la presencia de cationes alcalinos y alcalinoterreos y a los OH presentes en la estructura silicea, que también se aprecian por FTIR y las cantidades tanto de centros ácidos como básicos disminuyen al aumentar la temperatura de tratamiento, como es de esperar debido a la sinterización del material con la temperatura, 15 siendo el orden de acidez y basicidad encontrado: RH45 > RH26 > RH47.

Ejemplo 2: Inmovilización de una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae en los soportes obtenidos en el ejemplo 1

20

La enzima utilizada fue una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) expresada en la levadura Pichia pastoris, proporcionada por la Universidad Autónoma de Barcelona, recibida en forma sólida. La muestra había sido diafiltrada del caldo de cultivo por un corte de 10 kDa y posteriormente liofilizada. Con ella se preparó una disolución enzimática (stock) de 20 mg/ml con buffer de fosfato sódico 100 mM y pH 6,5, se incubó con 25 agitación durante 1 hora a 4 ºC y posteriormente se centrifugó para eliminar posibles restos sólidos (C. Arnau, R. Ramon, C. Casas, F. Valero. Optimization of the heterologous production of a Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris system using mixed substrates on controlled fed-batch bioprocess.Enzyme and Microbial Technology 46 (2010) 494-500).

30

Las medidas de actividad enzimática, tanto de sobrenadantes, control y disolución stock se realizaron en el lector de placas Versamax, utilizando p-nitrofenil propionato 10 mM (pNPP) como sustrato de la reacción, en modo cinético, con una longitud de onda de 405 nm, 30º C y 2 minutos. Para determinar la actividad enzimática, ya que el lector proporciona datos de mU/min, se utilizó un coeficiente de extinción (ε) para el p-nitrofenol apropiado a la longitud 35 de onda y al pH de trabajo, ε = 16780 M-1 cm-1.

La determinación de la concentración de proteínas se realizó mediante el método Bradford utilizando el reactivo y el procedimiento de Bio-Rad. El ensayo se basa en la capacidad de cambio de color del colorante Comassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes 40 concentraciones de proteínas. La unión del colorante con la proteína provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. La forma naranja se convierte en azul cuando el colorante se una a la proteína a 595 nm de longitud de onda. Para la realización de las curvas de calibrado se utilizó una disolución 50 µ g/ml de BSA (albúmina de suero bovino) como patrón. 45

El proceso de inmovilización y de medición de la actividad del sobrenadante se alargó hasta que se empezó a observar que la actividad ya no variaba significativamente, se filtró, lavó y secó el biocatalizador con P2O5. Una vez seco se determinó la actividad enzimática de los tres biocatalizadores a 30º C usando un pH-stato de Mettler Toledo (modelo DL-50) a 50 pH=8,0 usando NaOH 0,1 N como valorante. Se utilizaron 19 ml de tampón Tris-HCl 1 mM, pH 8,0 como medio de reacción, 0,6 ml de acetonitrilo y 0,4 ml de tripropionina como sustrato de reacción. Se realizó también una prueba en blanco para medir la hidrólisis

espontánea, hidrólisis en ausencia de enzima, solo el triglicérido con el medio de reacción. Esta técnica consiste en la adición controlada de una disolución básica para mantener el pH en un sistema donde se está produciendo una reacción que hace variar el pH. En estas condiciones, la tasa de valoración es proporcional a la velocidad de reacción, y por tanto a la producción de ácido. 5

Los experimentos de inmovilización sobre los soportes identificados como RHXY durante las primeras horas de experimento muestran que a medida que aumenta el tiempo de inmovilización, el porcentaje de enzima adsorbida en el sólido va creciendo y las medidas a partir de las 24 horas proporcionan unos resultados bastantes parecidos entre sí. Fijándonos 10 en los resultados numéricos, y teniendo en cuenta los datos obtenidos a partir de la determinación de concentración de proteínas, el material RH45 es el que mejor funciona como adsorbente enzimático, seguido del RH26.

Tabla 2: Enzima inmovilizada tras 24 horas de inmovilización 15

Soporte enzimático

Enzima inmovilizada (%)

RH45

60

RH47

46

RH26

57

Posteriormente se determinó la actividad catalítica sobre tripropionina de las enzimas inmovilizadas según se describe anteriormente. Los resultados obtenidos se incluyen en la tabla 3. Se realizaron varias medidas con cantidades de biocatalizador entre 20 y 100 mg, y 20 se obtuvieron los valores medios normalizados por unidad de peso de biocatalizador. El material que proporciona una mayor actividad catalítica es ROL-RH26, a pesar de que no es el que proporcionaba una mayor adsorción de enzima. Ello puede deberse a las propiedades texturales del material. No obstante, el parámetro “actividad catalítica” es preferente con relación al parámetro “capacidad de adsorción de enzima”, por lo que el 25 material RH26 fue elegido para los estudios posteriores.

Tabla 3

Biocatalizador

Actividad catalítica (U/g)

ROL-RH45

393,5

ROL-RH47

671,5

ROL-RH26

737,2

30

Ejemplo 3: Determinación de la máxima capacidad de adsorción del soporte RH26

A continuación se realizó el estudio de máxima capacidad de adsorción del material RH26 variando la relación en peso enzima soporte. Para ello se preparó una disolución stock de enzima formada por 100 mg de sólido por mililitro de tampón fosfato, y se utilizaron seis 35 volúmenes distintos de dicha disolución, en el rango 0,25 a 5 ml. El volumen final se mantuvo constante en todos los experimentos (10 ml), así como la cantidad de soporte RH26 (300 mg) de sólido. El estudio de la actividad catalítica de los biocatalizadores obtenidos se realizó en el pH-stat con tripropionina, mostrándose los resultados en la Figura 1. El estudio demostró que a partir de 3 ml de disolución stock se observaba saturación del 40

soporte de inmovilización. La actividad máxima de la enzima inmovilizada alcanzaba valores de alrededor de 1400 U/g.

Ejemplo 4: Transesterificación (reacción test de formación de biodiesel)

5

Estudiamos una reacción test de síntesis de biodiésel mediante transesterificación de los triglicéridos con un alcohol. En particular, se estudió la transesterificación de trilaurina con metanol y etanol.

10

trilaurina

Las reacciones de trilaurina con metanol o etanol dan como producto principal laurato de metilo o etilo, respectivamente, y como secundarios los mono y diglicéridos y el ácido graso 15 correspondiente debido a la hidrólisis del triglicérido.

Las reacciones de transesterificacion se llevaron a cabo con concentraciones de trilaurina de 50 mM y una proporción molar trilaurina: alcohol (etanol o metanol) 1:4, utilizando 2-metil-2-butanol (2M2B) como disolvente, 20 mg/ml de biocatalizador, enzima inmovilizada ROL-20 RH26 obtenida tal como se describe en el ejemplo 2. La reacción se llevó a cabo a 45º C y agitación a 300 rpm. El seguimiento de la reacción se hizo por cromatografía de capa fina (TLC), que permite obtener datos cualitativos y por HPLC que permite cuantificar. Para TLC se empleó como eluyente una disolución de hexano, etil acetato y ácido acético glacial (90:10:1) y como revelador una disolución de EtOH, agua, ácido acético glacial y un azul de 25 Comassie como colorante (20:80:0,5:0,03). Para realizar la identificación de patrones, se prepararon disoluciones 50 mM de cada uno de los compuestos de interés, la trilaurina se disolvió en 2-metil-2-butanol (2M2B) y los derivados de ácido láurico se disolvieron con EtOH, inyectándose 1 μl en placas. La separación del ácido láurico y sus derivados es bastante buena y se observan con facilidad. El aparato de análisis HPLC está compuesto 30 por una bomba cuaternaria Waters E600, un inyector y un detector de fotodiodos Varian ProStar y un detector de índice de refracción Waters 2410, con un a columna Cosmosil C18 de 4,6 x 150 mm y con un tamaño medio de partícula de 4,4 μm, a una temperatura de la columna de 40 ºC y la fase móvil formada por metanol y agua, adificados con 0,1% v/v de ácido acético y proporción metanol:agua variable. El tiempo de análisis de cada ensayo fue 35 de entre 25 y 30 minutos. Se muestra un cromatograma típico de la reacción de obtención de laurato de etilo en la figura 2.

La trilaurina es un compuesto apolar debido a sus cadenas hidrocarbonadas de lauril. La columna que se utilizó es una C18, que tiene cadenas de 18 carbonos, por tanto también es 40 apolar, por lo que la trilaurina tiene mucha afinidad con la columna y se retiene mucho. Conforme disminuyen las cadenas de lauril y aumentan los OH, aumenta la polaridad del compuesto, dilaurina, monolaurina o glicerol, y se arrastra más fácilmente por el metanol, que es polar. El método de análisis se basó en un gradiente de tiempo, variando la composición y flujo de la fase móvil, hasta usar solo metanol. 45

El perfil de la reacción de obtención de laurato de metilo y laurato de etilo con el biocatalizador ROL-RH26 se muestran respectivamente en las figuras 3a y 3b.

Ejemplo 5: Comparación de la lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) inmovilizada en el soporte RH26 (denominada ROL-RH26) con lipasas comerciales 5

En primer lugar se comparó la actividad hidrolítica sobre tripropionina de la lipasa ROL-RH26 comparada con varias lipasas comerciales. Se realizaron varias medidas con cantidades de biocatalizador entre 20 y 100 mg, y se obtuvieron los valores medios normalizados por unidad de peso de biocatalizador. Los resultados se recogen en la Tabla 10 4. Cabe destacar que la lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1) inmovilizada el soporte RH26 obtenida tal como se describe en el ejemplo 2, presenta una actividad superior a la de la lipasa de C. antarctica B sobre Lewatit (Novozym 435) y ligeramente inferior a la granulada de T. lanuginosus (Lipozyme TL-IM), dos de las lipasas más empleadas en biocatálisis y también de las más caras. 15

Tabla 4

ROL-RH26 Novozyme 435 Lipozyme TL-IM Lipozyme RM-IM

U/g

1347,2 1321,5 1444,5 95,4

Asimismo, se estudiaron las tres lipasas comerciales en la reacción test de formación de 20 biodiesel tal como se describe en el ejemplo 4. Las reacciones de transesterificación de trilaurina con metanol y etanol dan como producto principal laurato de metilo y de etilo, respectivamente, y compuestos secundarios como acilgliceroles (monolaurina y dilaurina), y el ácido graso correspondiente debido a la hidrólisis del triglicérido. Los resultados se compararon con los obtenidos con ROL-RH26. 25

Al utilizar la enzima ROL inmovilizada en RH26, la trilaurina prácticamente se consume tras 24 horas de reacción (Figuras 3a y 3b), aunque la formación de etil laurato no llega al nivel de la enzima Novozym 435 (Figuras 4a y 4b). En este caso, también hay una importante presencia de ácido láurico debido a la hidrólisis producida por el agua contenida en la 30 enzima.

Cuando se emplea Novozym 435, la trilaurina desaparece a partir de las 24 horas de reacción (Figuras 4a y 4b). El producto de interés es el que tiene mayor presencia, seguido del ácido láurico, lo que da una idea de que la enzima puede contener una cantidad 35 importante de agua. Se observa como la concentración de 1,2-dilaurina desciende a las 24 horas de reacción. Esto es debido a que cuando se consume todo la trilaurina en la reacción, el etanol pasará a interactuar con el diglicérido (ver figura 4b).

En el caso de la Lipozyme TL-IM, la formación de etil laurato es algo más lenta, aunque 40 también se llega a consumir prácticamente todo el triglicerido. La formación de ácido es menor, dado que esta enzima contiene menor cantidad de agua en su estructura (ver figura 5b).

Cuando se utiliza Lipozyme RM-IM, la formación de etil laurato no es tan importante como 45 en los casos anteriores, debido a que la reacción transcurre de una forma más lenta pues a las 24 horas de reacción todavía hay bastante trilaurina sin reaccionar (ver figura 6b).

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte, caracterizado porque comprende:

   a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico de un residuo agroalimentario que 5 comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, e

   b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior.
2. 2. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según la reivindicación 1, donde 10 el tratamiento térmico de la etapa a) comprende calentar el residuo agroalimentario entre 500 y 700 ºC
3. 3. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la enzima es una lipasa. 15
4. 4. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según la reivindicación 3, donde la lipasa es una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1).
5. 5. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según una cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 4, donde el residuo agroalimentario es cáscara de arroz.
6. 6. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la etapa de inmovilización comprende:

   25

   b1) obtener una disolución de la enzima en tampón fosfato 0,01 y 0,5 M a pH entre 4,5 y 8,5,

   b2) mezclar la disolución de la enzima preparada en la etapa b1) con el soporte renovable,

   b3) agitar la suspensión entre 4 y 25 ºC a no más de 100 rpm, hasta que la cantidad de enzima soportada varíe menos de 2 % entre dos medidas consecutivas,

   b4) filtrar y lavar la enzima inmovilizada con el tampón fosfato utilizado en la etapa b1). 30
7. 7. Soporte renovable caracterizado porque comprende entre 40 y 45 % en peso de silicio, presenta estructura amorfa, mesoporosa, y un tamaño de partícula medio inferior o igual a 200 micras.

   35
8. 8. Soporte renovable según la reivindicación 7, obtenido por tratamiento térmico entre 500 y 700 ºC de cáscara de arroz.
9. 9. Enzima inmovilizada en un soporte renovable, caracterizada porque el soporte renovable se describe tal como se indica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8. 40
10. 10. Enzima inmovilizada en un soporte renovable según la reivindicación 9, donde la enzima es lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID Nº 1).
11. 11. Uso de un residuo agroalimentario para obtener el soporte renovable tal como se 45 describe en una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.
12. 12. Uso de un residuo agroalimentario según la reivindicación 11, donde dicho residuo es cáscara de arroz.

    50
13. 13. Método de obtención de biodiesel que comprende:

    i) obtener una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ Nº 1) inmovilizada en un soporte renovable tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, y

    ii) poner en contacto la lipasa inmovilizada obtenida en la etapa anterior con un triglicérido en presencia de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol y etanol para obtener biodiesel.