JPH08509705A

JPH08509705A - Ｒｘｒレチノイドレセプター作働剤活性を有する化合物による腫瘍の処置

Info

Publication number: JPH08509705A
Application number: JP6520298A
Authority: JP
Inventors: デイヴィーズ、ピーター・エイ・ジェイ; チャンドララトナ、ロシャンサ・エイ
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 1996-10-15
Also published as: AU678823B2; EP0688213A1; EP1159961A2; DE69429427D1; CN1080117C; DE69429427T2; US5399586A; ATE210440T1; EP0909560A2; AU6401494A; WO1994020093A1; EP0688213B1; CN1122105A; CA2157798A1; EP1159961A3; EP0909560A3

Abstract

(57)【要約】ＲＸＲレチノイドレセプター部位の作働剤として作用するレチノイド様化合物は、細胞培養物中の腫瘍細胞のアポプトシスを誘導し、ヒトを包含する哺乳動物の腫瘍を処置する薬剤として使用する。ＲＸＲレセプター特異的作働剤である化合物も、ＲＡＲおよびＲＸＲの両方に対する作働剤（汎作働剤）である化合物も、アポプトシスを誘導するが、ＲＸＲ作働剤化合物が、ＲＡＲ作働剤活性に伴う望ましくない副作用を示さないので、薬物として好ましい。ＲＸＲ作働剤化合物を、全身的、局所的、または病巣内投与に適した薬剤組成物として、腫瘍を有する哺乳動物に投与する。薬剤組成物中の活性成分であるＲＸＲ作働剤化合物の濃度は、約０.００１〜５重量％であって、該組成物により、活性成分を、１日当たり約０.１〜１００mg／kg患者体重の量で投与する。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＸＲレチノイドレセプター作働剤活性を有する化合物による腫瘍処置１．発明の分野本発明は、ＲＸＲレチノイドレセプター部位において作働剤様活性を示す化合物を投与することによって、腫瘍細胞のアポプトシスを誘導する方法に関する。本発明はとりわけ、ＲＸＲ作働剤化合物によって、哺乳動物の腫瘍を処置する方法に関する。２．従来技術の簡単な説明レチノイド様活性を有する化合物は当分野でよく知られており、米国および他の国の多くの特許、並びに科学文献に記載されている。当分野では一般に、レチノイド様活性は、ヒトを包含する哺乳動物を処置するため、多くの疾病および病態の徴候および症状、例えば、皮膚病、アクネ、ダリエー病、乾癬、魚鱗癬、湿疹およびアトピー性皮膚炎を治療または軽減するため、悪性過剰増殖性疾患（例えば上皮癌、乳癌、前立腺癌、頭部および頚部癌、および骨髄性白血病）を治療および予防するため、アテローム性動脈硬化症および再発狭窄症（新内膜過剰増殖による）を治療および予防するため、他の非悪性過剰増殖性疾患（例えば子宮内膜過形成、良性前立腺肥大、増殖性硝子体網膜症および形成異常）を治療および予防するため、自己免疫疾患および免疫性疾患（例えば紅斑性狼蒼）を処置するため、慢性炎症性疾患（例えば肺線維症）を処置するため、脂質代謝および輸送に関与する疾患（例えば脂血症）を治療および予防するため、創傷治癒を促進するため、ドライアイ症候群を処置するため、並びに日光による皮膚損傷を治療および予防するために有用であることが知られ、認識されている。しかし、従来技術において開発されたレチノイド様活性化合物に欠点が無いわけではない。そのような従来の化合物の中には、皮膚適用（皮膚症状の処置のための重要な適用法である）によって激しい剌激を生じるものや、経口投与によって粘膜皮膚毒性を起こすものがある。従来のレチノイド様活性化合物の多くは、催奇性であり、他にも副作用を有する。レチノイド様活性を有する特定の化合物または化合物群については、多くの従来の特許および文献に記載されているが、本願の譲受人に譲渡されているいくつかの同時係属出願および最近発行された特許も、レチノイド様活性を有する化合物、および／またはヒトを包含する哺乳動物をレチノイド様化合物で処置する方法に関する。従来技術において、比較的最近になって、生体系においてレチノイド細胞応答経路が一つよりも多いこと、および生体系において天然レチノイドホルモンに対し、少なくとも二つの主要なレセプターファミリーが存在することが認識された。従来技術におけるこの比較的新しい知見は、次の文献に記載されている：ディ・ジェイ・マンゲルスドルフ（D．J．Mangelsdorf）ら、「ヌクレアー・レセプター・ザット・アイデンティファイズ・ア・ノーべル・レチノイック・アシッド・レスポンス・パスウェイ（Nuclear receptor that identifies a novel retinoic acid response pathway）」、ネイチャー（Nature）、第３４５巻、１９９０年５月１７日、第２２４〜２２９頁；およびジェイ・エヌ・ロットマン（J．N．Rottman）ら、ア・レチノイック・アシッドーレスポンシブ・エレメント・イン・ザ・アピロプロテイン・ＡＩ・ジーン・ディスティンギッシーズ・ビトウィーン・トゥー・ディファレント・レチノイック・アシッド・レスポンス・パスウェイズ（A Retinoic Acid-responsive Element in the Apilopro tein AI Gene Distinguishes between Two Different Retinoic Acid Response Pathways）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mole cular and Cellular Biology）、１９９１年７月、第３８１４〜３８２０頁。以下の文献も、レチノイン酸レセプターに関する：エム・ペトコビッチ（M．P etkovich）ら、「ア・ヒューマン・レチノイック・アシッド・レセプター・フィッチ・ビロングズ・トゥー・ザ・ファミリー・オブ・ヌクレアー・レセプター（ A human netinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptor）」、ネイチャー、第３３０巻、１９８７年１２月３日、第４４４〜４５０頁；ヴィ・ジガー（V．Giguere）ら、「アイデンティフィケーション・オブ・ア・レセプター・フォー・ザ・モルフォゲン・レチノイック・アシッド（identification of a receptor for the morphogen retinoic acid）」、ネイチャー、第３３０巻、１９８７年１２月１７日、第６２４〜６２９頁；エヌ・ブランド（N．Brand）ら、「アイデンティフィケーション・オブ・ア・セカンド・ヒューマン・レチノイック・アシッド・レセプター（Identifica tion of a second human retinoic acid receptor）」、ネイチャー、第３３２巻、１９８８年４月２８日、第８５０〜８５３頁；エイ・クラスト（A．K rast）ら、「ア・サード・ヒューマン・レチノイック・アシッド・レセプター， hＲＡＲ（Athird human retinoic acid receptor，hＲＡＲ）」、プロシーデイングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc．Na t’l．Acad.Sci．）、米国、第８６巻、１９８９年７月、第５３１０〜５３１４頁；ディ・ジェイ・マンゲルスドルフら、「キャラクタライゼーション・オブ・スリー・ＲＸＲ・ジーンズ・ザット・メディエート・ジ・アクション・オブ・９ −シス−レチノイック・アシッド（Characterization of three ＲＸＲ gen es that mediate the action of ９−cis−retiroic acid）」、ジーンズ・アンド・デベロプメント（Genes ＆ Development）、第６巻、１９９２年、第３２９〜３４４頁。主要な二つのレチノイドレセプターファミリーは、当分野において、ＲＡＲ（レチノイン酸レセプター）およびＲＸＲ（レチノイドＸレセプター）と称され、それら二つのファミリーはいずれも、サブタイプを有することが知られている。サブタイプは、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲのように、ギリシャ文字で示される。ディ・ジェイ・マンゲルスドルフらの前記文献には、レチノイド様化合物（レチノイン酸類似体）のいくつかは、ＲＸＲレセプターよりも、ＲＡＲレセプターをより強く活性化すると記載されている。発明の概要ＲＸＲレチノイドレセプター部位の作働剤として作用するレチノイド様化合物は、細胞培養物中の腫瘍細胞のアポプトシスを誘導し、それ故、ヒトを包含する哺乳動物において腫瘍のアポプトシスをもたらす薬物として適当であることが、本発明により、わかった。特に、ＲＸＲ特異的作働剤（すなわち、ＲＡＲレセプター部位に対しては活性でない）であるレチノイド様化合物が、腫瘍のアポプトシスを誘導することが、本発明によってわかった。ＲＡＲおよびＲＸＲの両方に対する作働剤であるレチノイド様化合物（「汎作働剤（pan agonist）」化合物と称する）も、アポプトシスを誘導する。ＲＡＲレセプター部位に特異的なレチノイド様化合物（ＲＸＲレセプターにおいては活性でない）が、腫瘍細胞系においてアポプトシスを誘導することは示されておらず、それ故、ＲＡＲ特異的化合物は、本発明の処置方法に使用し得ない。ＲＸＲ作働剤化合物は、本発明に従って、全身的もしくは局所的投与、または病巣内投与に適した薬剤組成物として、腫瘍を持つ哺乳動物に投与する。薬剤組成物中の活性成分であるＲＸＲ作働剤化合物の濃度範囲は、約０.００１〜５重量％であって、１日当たり活性成分を約０.１〜１００mg／kg患者体重投与するような濃度範囲である。ＲＸＲレセプター作働剤としての化合物の活性は、後に詳述する従来のアッセイ「カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイ」において測定し得る。図面の簡単な説明第１図は、ＲＡＲαレセプターに対して試験化合物（ＡＧＮ１９１７０１、化合物１）、および比較化合物トランスレチノイン酸を用いて行った、カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイにおいて得られたデータおよびＥＣ₅₀の算出を示すグラフである。第２図は、ＲＸＲαレセプターに対して試験化合物（ＡＧＮ１９１７０１、化合物１）、および比較化合物ＡＧＮ１９１４４０（化合物２）を用いて行った、カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイにおいて得られたデータおよびＥＣ₅₀の算出を示すグラフである。第３図は、ＲＡＲαレセプターに対して試験化合物（ＡＧＮ１９１６５９、化合物３）、および比較化合物トランスレチノイン酸を用いて行った、カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイにおいて得られたデータおよびＥＣ₅₀の算出を示すグラフである。第４図は、ＲＸＲαレセプターに対して試験化合物（ＡＧＮ１９１６５９、化合物３）、および比較化合物ＡＧＮ１９１４４０（化合物２）を用いて行った、カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイにおいて得られたデータおよびＥＣ₅₀の算出を示すグラフである。第５図は、化合物１（ＡＧＮ１９１７０１）で処理したＨＬ−６０cdm−１細胞から得たＤＮＡ「ラダー（ladder）」の写真である。第６図は、本発明によるＲＸＲ作働剤化合物ではなく、「溶媒」で処理した「対照」細胞の写真である。第７図は、化合物１で４時間処理した細胞の写真である。第８図は、化合物１で４８時間処理した細胞の写真である。第９図は、化合物１で６日間処理した細胞の写真である。発明の詳細な説明本発明の薬剤組成物および処置方法に使用する化合物は、ＲＸＲレセプター部位の作働剤である。本発明の処置方法に従って使用する化合物は、好ましくは、ＲＸＲレセプターに特異的である。ＲＡＲおよびＲＸＲの両方のレセプター部位に作用する汎作働剤レチノイド様化合物の使用も、本発明の範囲に含まれるが、ＲＡＲ作働剤活性には通例望ましくない副作用が伴うので、汎作働剤の使用は好ましさが劣る。ＲＸＲおよびＲＡＲレセプター部位の作働剤としての試験化合物の活性を測定する、前記カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイは実質的に、フェイグナー，ピー・エル（Feigner P．L．）およびホルム，エム（Holm M ．）、（１９８９）フォーカス（Focus）、１１−２に記載のように行う。このアッセイについて、まずその原理を説明し、次いで実際の手順を示す。このアッセイに関連して、レチノイン酸レセプターは、ステロイド／チロイドレセプタースーパーファミリーの一員であり、レセプター間で交換し得るドメインを有することが知られている。すなわち、エストロゲンＤＮＡ結合ドメインを有するキメラレチノイドレセプター、およびエストロゲン応答性エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素のプラスミドを作製し、特定の培養細菌中で増殖する。そのようなプラスミドはそれぞれ、キメラＲＡＲα 、ＲＡＲβ、ＲＡＲ、ＲＸＲαレセプタータンパク質、およびクロラムフェニコールアセチルＡトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素タンパク質をコードする。そのようなプラスミドを有する細菌は、「ヌクレアー・レチノイック・アシッド・レセプターズ：クローニング、アナリシス、アンド・ファンクション（Nuclear R etinoic Acid Receptors：Cloning, Analysis, and Function）」、エム・プファール（M．Pfahl）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、１８９、第２５６〜２７０頁（１９９０）に記載の手順に従って得られる（該文献を引用により本発明の一部とする）。細菌からＤＮＡプラスミドを分離する方法も、「超コイルプラスミドの分離」の項で、実際の手順を詳述する。前記試験方法によると、キメラＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲまたはＲＸＲαレセプタータンパク質の一つをコードするＤＮＡプラスミドを、ヒーラ細胞の培養物にトランスフェクトする。この目的のために、「カチオン性リポソーム仲介トランスフェクションアッセイ」として後に詳述するアッセイの第１日目に、ヒーラ細胞を培地中で培養する。トランスフェクションアッセイの第２日目に行うトランスフェクション操作においては、キメラＲＡＲαまたはＲＡＲβなどをコードするプラスミドに加えて、ＣＡＴ酵素をコードするＤＮＡプラスミドをも、各細胞培養物に加える。特に前述のエム・プファールらの文献に関連して、既知であり、また当業者が容易に理解できる通り、このアッセイにおけるキメラレチノイドレセプターは、特定の作働剤分子（例えばレチノイン酸および類似体）を認識および結合するリガンド結合ドメインを有する。そのようなキメラタンパク質レセプター（エム・プファールらの文献に従って作製したもの）は、ＣＡＴ酵素をコードするＤＮＡプラスミドに結合した「エストロゲン応答性エレメント」（ＤＮＡフラグメント）に結合し得るＤＮＡ結合ドメインをも有する。この相互作用の性質とは、ＲＡＲα、ＲＡＲβなどのレセプターのリガンド結合ドメインに作働剤（例えばレチノイン酸または類似体）が結合した場合に限り、該レセプターがそのＤＮＡ結合ドメインを介して、エストロゲン応答性エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＲＥ−ＣＡＴ；ＣＡＴ酵素生産のためのｍＲＮＡの転写を開始し得る）のエストロゲン応答性エレメントに結合するというものである。換言すれば、このアッセイにおいては、各レチノイドレセプターのリガンド結合部位に適当な作働剤リガンドが結合した場合にのみ、複数の相互作用を経て、ヒーラ細胞がＣＡＴ酵素を生産する。エストロゲン応答性エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＲＥ−ＣＡＴ）は、リッセル，ジー・ユー（Ryssel G．U．）ら、セル（Cell）、第４６巻、第１０５３〜１０６１頁（１９８６）に記載の方法によって得られる（該文献を引用により本発明の一部とする）。この方法自体は、当分野でよく知られている。エストロゲン応答性エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＲＥ−ＣＡＴ）を細菌から分離取得する方法は、「超コイルプラスミドの分離」の項において詳述する。前記のものに加えて、リポフェクチン（lipofectin；ＬＦ）も、各細胞培養物に加える。リポフェクチンを加える目的は、プラスミドの細胞膜通過を促進することである。本発明の方法において使用したリポフェクチンは、市販されている。当業者が充分理解する通り、ＲＡＲαまたはＲＡＲβなどのキメラレセプターをコードする各ＤＮＡプラスミドのトランスフェクションの結果として、およびＥＲＡ−ＣＡＴ（前記のように、ＣＡＴ酵素をコードする）のトランスフェクションの結果として、アッセイにおいて培養したヒーラ細胞に前記プラスミドが取り込まれる。レチノイドレセプタープラスミドは、転写（m−ＲＮＡへの）を受け、次いで対応するキメラレセプタータンパク質に翻訳される。すなわち、このようにして得られるヒーラ細胞培養物は、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲまたはＲＸＲαキメラレセプタータンパク質を生産する。ＥＲＡ−ＣＡＴのトランスフェクションの結果として、このアッセイの細胞培養物は、ＣＡＴ酵素を生産する遺伝情報をも有する。しかし、前述のように、適当な作働剤化合物が細胞内のＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲまたはＲＸＲαキメラレセプタータンパク質に結合し、それを活性化し、その活性化作働剤−レセプター複合体がＥＲＥ−ＣＡＴのエストロゲン応答性エレメントに結合しなければ、このアッセイにおいて、ＣＡＴ酵素生産の遺伝情報は転写されず、細胞はＣＡＴ酵素を生産しない。アッセイの第３日目には、適当な比較化合物および試験化合物（作働剤または作働剤である可能性のある化合物）を、ヒーラ細胞培養物に、好ましくは種々の濃度で加える。加えた試験化合物が作働剤であれば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲまたはＲＸＲαキメラレセプタータンパク質に結合し、その結果、ＣＡＴ酵素をコードする遺伝情報が細胞内で転写され、それによって細胞がＣＡＴ酵素を生産する。後述のアッセイ手順の第４日目に細胞を溶解し、溶解物の部分試料のＣＡＴ酵素活性を測定する。これは、溶解物を、クロラムフェニコール、およびトリチウムでラベルしたアセチルＣoＡと共にインキュベートすることによって行う。最終的な測定としては、ＣＡＴ酵素による酵素反応によって生成したトリチウムラベルアセチルクロラムフェニコールを、シンチレーションカウンターで測定する。比較化合物は、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲレセプターを使用するアッセイにおいては、レチノイン酸（全てトランス）であり、ＲＸＲαキメラレセプターを使用するアッセイにおいては、４−（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロー３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）−プロペン−１− イル］安息香酸（ＡＧＮ１９１４４０；本発明において化合物２とも称する）である。このアッセイによって得たデータは、次のように表わし、評価する。各試験化合物および各ＲＡＲレセプターサブタイプに関して、シンチレーションカウンターで測定した「カウント／分」（cpm）を、試験化合物濃度に対してプロット（y軸）したグラフ（または数学的にグラフと等価なもの）を作製する。レチノイン酸に関しても、同様のグラフ（または数学的等価物）を作製する。比較化合物のレチノイン酸に関して同じアッセイにおいて同じレセプターに対して測定した最高cpm数（最高ＣＡＴ酵素活性）の２分の１（５０％）を提供する試験化合物濃度を、試験化合物のＥＣ₅₀と定義する。これを、第１図および第３図のグラフに示す。ＲＸＲαレセプターに対するアッセイのデータを表し、評価するために、同様のグラフ（または数学的等価物）を、試験化合物および比較化合物ＡＧＮ１９１４４０（化合物２）に関して作製した。この比較化合物は、ＲＸＲαレセプター部位に対する既知の作働剤である。ＡＧＮ１９１４４０に関して同じアッセイにおいて同じレセプターに対して測定した最高cpm（カウント／分；ＣＡＴ酵素活性）の２分の１（５０％）を提供する試験化合物濃度が、ＥＣ₅₀である。このグラフを第２図および第４図に示す。超コイルプラスミドの分離大量ＩＬ調製ＤＮＡの分離１．細胞を氷上に１５分間置く。２５０mlナルジーン（nalgene）管内で、ＪＡ１４ローター、ベックマン（Beckman）Ｊ２−２１Ｍ遠心機を用いて７krpmで、４℃で１０分間遠心沈澱して、細菌細胞（大腸菌）を採る。上清は除去する。２．各細胞ペレットに、液Ｉ（１.０ml）を加え、混合してペレットを再懸濁させる。この細胞（１.０ml）をボトルからボトルへと移す。これを５０mlオークリッジ管に移す。液Ｉ（４ml）を用いて、ボトルを洗い、再度ボトルから次のボトルへと移す。これも、オークリッジ管に移す。ピペットを用いて、液Ｉで全容積を１６mlとし、混合する。８mlをもう一つのオークリッジ管に移す。室温で５分間置く。液Ｉ：５０mＭグルコース、２５mＭトリス−Ｃl（pＨ８）、１０mＭＥＤＴＡ（pＨ８）３．各管に、新たに調製した液II（１８ml）を加える。管を数回反転することにより、内容物を穏やかに混合する。氷上に１０分間置く。この時間後、液は透明で、凝集物は無いはずである。（凝集物があれば、先の細胞再懸濁が充分でなかったのである。）液II：１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.２Ｎ−ＮaＯＨ（４ml １０％ＳＤＳ、０.８ml １０Ｎ−ＮaＯＨ、３５.２ml水）４．氷冷液III（１２mlまたは適量）を加える。管を素速く数回反転することにより、内容物を混合する。白色綿状沈澱が生じるはずである。氷上に１０分間置く。液III：５Ｍ酢酸カリウム（６０ml）に、氷酢酸（１１.５ml）および水（２８ .５ml）を加えることにより調製５．ベックマンＪ２−２１Ｍ遠心機、ＪＡ２０ローター（１７krpm）により、４ ℃で３０分間遠心する。６．オークリッジ管から上清（約１２ml）をピペットで採り、６本のベークドコレックス（Corex）管に入れる。０.６倍容積のイソプロパノール（７.２ml）を加え、反転により混合し、室温で１５分間置いて、ＤＮＡを沈澱させる。７．ベックマン遠心機を、ＪＡ２０ローターを１４krpmで回転させることにより、２０℃で１５分間作動させる。８．Ｊ２−２１Ｍ遠心機、ＪＡ２０ローター（１０.５krpm）により、２０℃ で３０分間、ＤＮＡをペレット化する（コレックス管用アダプターを使用する）。９．上清を注ぎ出し、管内を、減圧フラスコでパスツールピペットによって乾燥する。 10．減圧デシケーター内で１０分間乾燥する（より長時間乾燥すると、ペレットを溶解し難くなる）。ＣsＣl密度勾配中で遠心により平衡化することによるプラスミドＤＮＡの精製 11．各コレックス管にＴＥ［１０mＭトリス−Ｃl（pＨ８）、１mＭＥＤＴＡ（pＨ８）］（１ml）を加えることにより、ペレットを溶解する。管を３７℃の水浴に入れて、ペレットの速やかな溶解を促進する（１５〜３０分間）。 12．同様のバッチの液を一つの管に移す。ＴＥで容積を８.５mlとする。 13．ＲＮアーゼ（ＤＮアーゼ不含有）［２Ｕ／μl、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル（Boehringer Mannheim Biochemica1；ＢＭＢ）］（１００μl）を加える。 14．１０mg／ml臭化エチジウム（４００μl）を加える。 15．ＣsＣl（９.０g）を加え、パスツールピペットを用いて混合する。 16．液を、２本の１３×５１mmベックマン・ポリアロマー・クイックシール遠心管に入れる。 17．ベックマン超遠心機、ＶＴi６５.２ローター（５０krpm）を用いて、２０ ℃で１２時間遠心する。 18．超遠心後、２つのＤＮＡのバンドが見られるはずである。上方のバンドは、線状細菌ＤＮＡおよび切断環状プラスミドＤＮＡから成る。下方のバンドは、閉環状プラスミドＤＮＡから成る。２１ゲージ針に取り付けた３mlシリンジで、管から下方のＣsＣl分別ＤＮＡのみを回収する（管の側面に針を挿入し、１．５〜２mlを採る）。 19．第２のＣsＣl遠心の準備（９ml−第１ＣsＣlバンド容積）−ＣsＣl g数（９ml−第１バンド容積−１００μl １０mg／ml臭化エチジウム−５０μlＲＮアーゼ）−ml ＴＥ（ｐＨ８.０）第１バンド、ＴＥ、ＣsＣl、ＲＮアーゼおよびＥtＢrを合する。 20．液を、２本のクイックシール管に入れる。 21．超遠心機、ＶＴi６５.２ローターを用いて、２０℃で、５０krpmで１２時間、または６０krpmで４時間遠心する。 22．ＣsＣl分別ＤＮＡ（下方のバンドのみ）を２回採り、５mlファルコン（Fa lcon）スナップ管に入れる（工程１８と同様）。臭化エチジウムの抽出 23．加湿下に、等体積のイソアミルアルコールを加え、混合し、ベックマンＴＪ−６遠心機（１５００rpm）を用いて室温で３分間遠心する。 24．下部の水相を新しい管に入れる。これを３〜４回、または水相が透明になる（ピンク色が無くなる）まで繰り返す。 25．透明水相を、スペクトラ／ポル（Spectra／Por）３透析管mwco３５００に移す。（透析管をクランプ留めする前に、管の底に結び目を作っておく。）液をパスツールピペットで加える。透析管の上部をクランプ留めする。ゴムバンドを用いて、管をＴＥ［２８ml １Ｍトリス−Ｃl（pＨ８）、５.６ml ０.５００ＭＥＤＴＡ（pＨ８）］（２.８l）中に吊す。透析管は常に、手袋を用いて注意深く扱う。 26．ＴＥ（pＨ８）（２.８l）を複数回交換して（１×２〜４時間、一晩、および１×２〜４時間、翌日）、水相の透析を行う。 27．組織培養フード内で、透析したＤＮＡを、滅菌ミクロ遠心管に移す。管にラベルを付し、−２０℃で貯蔵する。カチオン性リポソーム仲介トランスフェクション引用：フェルグナー，ピー・エル、およびホルム，エム（１９８９）フォーカス１１、２全般に滅菌法を用いる。ヒーラ細胞またはＣＶ−１細胞を、Ｔ−１２５培養フラスコ内で培養する。細胞を週２回、通例月曜および金曜に継代する（細胞０.５mlを培地１５mlに入れる）。第１日：細胞の接種１．Ｔ−１６２cm²培養フラスコの細胞をトリプシン処理し、採取する。細胞数を血球計数器で数える。細胞数は通例、１２ウェルプレート１６枚用に充分である。２．細胞数に応じて、培地（Ｄ−ＭＥＭ低グルコース、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２mＭＧlu）で細胞を希釈して、６００００細胞／ウェルの濃度とする。細胞計算例：４００００細胞／ウェルおよび２００ウェル必要とする（Ｘ）細胞／mlを有するナルジ（Nalge）２５０mlフィルターユニットレシーバーを用いて、全部で＃m lの細胞を培地に入れ、最終容積２００mlとする。ピペット処理により、よく混合する。３．滅菌１２.５mlコンピチップ（セッティング４）を用いて、ウェル毎に細胞（１.０ml）を加える。プレートを前後に揺る（回転しない）。加湿５％ＣＯ₂ 環境中で、３７℃で一晩インキュベートする。細胞は、トランスフェクションまでに約４０％集密する。トランスフェクション：第２日：ＤＮＡ／リポフェクチン複合体の調製１．５０mlポリスチレン管を用いて、リポフェクチン（ＬＦ）およびＤＮＡを個別に準備する。２μgＬＦ／ウェル、５００ngＥＲＥ−ＣＡＴＤＮＡ／ウェル、１００ngＥＲ／ＲＡＲＤＮＡ／ウェルとするのに必要なＬＦおよびＤＮＡの容積を算出する。実験に必要な全容積を算出する。（ＤＮＡ濃度はプラスミド調製毎に異なり、下記計算によって調節する必要があり得る。）ＤＮＡ（調製日） μl／ウェル＃ウェルＤＮＡ容積 Opti−Mem容積 α β γ ＸＣＡＴＬＰロット＃ μl／ウェル＃ウェル μlＬＦ Opti−Mem容積ＬＦおよびＤＮＡをOpti−Mem培地で個別に希釈して、２５μl×＃ウェルの容積とする：Opti−Mem１容積＝（２５μl×＃ウェル）−ＤＮＡまたはＬＦの全容積。２．希釈したＬＦを、希釈したＤＮＡに加え、管を穏やかに回転する。室温で１０分間静置する。３．ウェルから培地を吸引し、Opti−Meml（０.５ml）で２回洗う（滅菌１２. ５mlコンビチップ、セッティング２）。４．ＤＮＡ／ＬＦ複合体をOpti−Mem（４５０μl×＃ウェル）に加える。管を反転して、混合する。１２.５mlコンビチップ（セッティング２）を用いて、５００μlずつウェルに入れる。プレートを前後に揺って混合する（回転しない）。５．加湿５％ＣＯ₂インキュベーター内で、細胞を３７℃で６時間インキュベートする。６．６時間後、培地（Ｄ−ＭＥＭ低グルコース、２０％ＦＢＳ（活性炭処理したもの）、２mＭＧlu）（０.５ml）を各ウェルに加える。１２.５コンビチップ（セッティング２）を用いて行い、インキュベーターに戻す。第３日：薬物添加１．トランスフェクション開始から１８時間後、滅菌０.５mlコンビチップ（セッティング１）を用いて、レチノイド（３サンプル、１０μl）を加え、加湿５％ＣＯ₂環境中で、３７℃で２０〜２４時間インキュベートする。薬物希釈：例：レチノイドをアセトンに溶解して５mＭの濃度とし、ＥtＯＨで更に希釈して１mＭとする。レチノイドが溶解しなければ、管を高温水に５秒間入れ、次いで激しく混合する。実験毎に、異なる希釈式を使用し得る。１logオーダー毎に２つの濃度を設ける場合は、次のような３.１６倍希釈を使用する：ラベルを付した滅菌１２×７５mm管（ファルコン２０６３）に、１００％ＥtＯＨ（１０８０μl）を加える。１mＭ溶液（５００μl）を次の管に入れる（３１６μＭ）。混合し、次の管への移動を繰り返して行く。レチノイドのいくつか（特にＲＡおよび１３−シスＲＡ）は、光感受性であり、赤色光または非常に弱い光の下で使用すべきである。使用した化合物の量を記す。例：第４日：混合相ＣＡＴアッセイ１．１２mmウェル内で、細胞を、０.５０ml １×ＰＢＳ（Ｃａ／Ｍg不含有）で１回洗う。２．５mlコンビピペット（セッティング１）を用いて、氷冷１％トリトン、１ mＭトリス−Ｃl（pＨ７.８）、２mＭＥＤＴＡ（pＨ８）、ＤＮアーゼＩ（１００μl）を加える。次のように調製したもの：３．氷上に６０分間置く。ときどき攪拌する。４．タイタートレック・マルチチャンネルピペット（チップをチャンネル＃１、＃３、＃６に付けたもの）を用いて、一度に３ウェルから、溶解物５０μlを９６Ｕ底ウェル［コスター（Coster）］に移す。（未使用溶解物の）プレートを、−２０℃で保存する。５．１.２５mlコンビピペット（セッティング１）を用いて、プレミックス（５０μl）を各ウェルに加え、プレートを穏やかに揺り、３７℃で２時間インキュベートする。６．タイタートレック・マルチチャンネルピペットを用いて、７Ｍ尿素（１００μl）を各反応ウェルに加えて、反応を停止する。一度に６サンプル行う。［尿素−マリンクロット・エイアール（Mallincrokt ＡＲ）］７．タイタートレック・マルチチャンネルピペットを用いて、反応混合物（２００μl）を、５mlプラスチックシンチレーションバイアル［リサーチ・プロダクツ・インターナショナル（Research Products International）＃１２５５１４］に移す。一度に３反応行う。（尿素−マリンクロット・エイアール）８．０.８％ＰＰＯ／トルエン（３.２gＰＰＯ／４lトルエン）（１ml）を加える。５秒間激しく混合し、１５分間、相を分離させる。２.０分間cpmをカウントする（ベックマンＬＳ３８０１）。［トルエンーマリンクロット・シンチル・エイアール（Mallinckrodt Scintill AR）］（ＰＰＯ＝２,５−ジフェニルオキサゾール−ＲＰＩロット＃Ａ３０７１）第１表に、本発明の二つの例示化合物のＲＡＲおよびＲＸＲ作働剤活性を比較して示す。化合物１（ＡＧＮ１９１７０１）は、２−［（Ｅ）−２−（５,６,７ ,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］チオフェン−４−カルボン酸である。化合物２（ＡＧＮ１９１４４０）は、ＲＸＲ作働剤活性測定用の比較化合物であって、４−［（Ｅ）−２−（５, ６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］安息香酸である。化合物３（ＡＧＮ１９１６５９）は、２−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−５−チオフェンカルボン酸である。本発明の例示化合物の活性を、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲレセプター部位の各々に対して示す。第１表に挙げる化合物の構造式は、後に示す。化合物４（ＡＧＮ１９１１８３）は、４−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−５,５,８,８−テトラメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］安息香酸である。この化合物（化合物４）は、本発明の範囲に含まれない。この化合物のレセプターデータは、比較のために挙げる。この化合物は、特異的ＲＡＲ作働剤であり、ＲＸＲレセプター部位において不活性であることがわかる。本発明によると、ＲＸＲ作働剤化合物で処理した腫瘍細胞のアポプトシスを評価するアッセイにおいて、化合物４は活性ではない。アポプトシスの現象は、生物科学の分野でよく知られており、プログラムされた細胞死であると言うことができる。知られているように、アポプトシスは、「壊死」と対照的である。壊死は、毒性物質または他の外的作用により、細胞が死滅する現象である。アポプトシスは、「自然な」プログラムされた細胞死である。生命を脅かす可能性のある増殖悪性腫瘍においてさえ、多数の細胞がアポプトシスにより自然死することが知られている。しかし、通常の増殖悪性腫瘍（有効な化学療法または他の処置を受けていないもの）においては、異常な細胞分裂によって生成する新しい細胞の数が、アポプトシスによって死滅する細胞の数を上廻り、その結果、腫瘍は全体として大きくなる。腫瘍においてアポプトシスによる死滅速度が細胞分裂速度よりも大きければ、腫瘍は全体として縮小または消滅し得る。本発明により、ヒト骨髄性白血病（ＨＬ６０cdm１−１）細胞系の表現型を用いたアッセイにおいて、ＲＸＲ作働剤化合物によるアポプトシス細胞死誘導活性を示す。そのアッセイにおいて、ヒト骨髄性白血病（ＨＬ−６０cdm１−１）細胞を培養し、ＲＸＲ作働剤化合物、例えば化合物１（ＡＧＮ１９１７０１）または化合物３（ＡＧＮ１９１６５９）を培養物に加える。ＲＡＲ特異的化合物４（ＡＧＮ１９１１８３）を比較のために培養物に加え、「対照」培養物はエタノールで処理する。このアッセイにより、ＲＡＲ特異的化合物４（ＡＧＮ１９１１８３）や、エタノールではなく、ＲＸＲ作働剤化合物が、顕著に細胞のアポプトシス細胞死を誘導することがわかった。細胞死のアポプトシス性は、形態変化（核濃縮および断片化）、膜のブレブ（bleb）形成、および細胞の断片化の観察によって、並びに処理した細胞のＤＮＡフラグメントに特徴的なラダリング（laddering）によって確認した。このアッセイを、以下詳細に説明する。ＲＸＲ作働剤化合物（ＡＧＮ１９１７０１）による、ヒト骨髄性白血病（ＨＬ −６０）細胞のアポプトシス誘導を示すアッセイアッセイ１培地（ＲＰＭＩ−１６４０；ウシインシュリン５mg／l）ヒトトランスフェリン５mg／lおよび亜セレン酸ナトリウム５μg／lを含有）（３ml）を入れた６ウェル組織培養プレート（ファルコン）に、ＨＬ−６０cdm−１細胞を、１×１０⁺ ⁵ 細胞／mlの密度でプレートした。この細胞に、ＡＧＮ１９１７０１（化合物１）もしくはＡＧＮ１９１１８３（化合物４）の１mＭ原液、またはエタノールを３μl加えた後、暗所で３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ₂）内で、７２時間、細胞を培養した。インキュベーションの終了後、細胞のサンプルを採って血球計数器でカウントし、第２のサンプル（５０μl）は、サイトスピン遠心機を用いて顕微鏡スライドに沈降させた。沈降した細胞を風乾し、無水メタノールで固定し、ディフクイック（Diffquick）試薬キットを用いて染色し、パーマウント（Permount）に載せ、ブライトフィールド光学顕微鏡で観察した。細胞のカウントは、次の通りであった。対照５.１×１０⁺⁵／ml ＡＧＮ１９１１８３（１μＭ）４.６×１０⁵／ml ＡＧＮ１９１７０１（１μＭ）０.７×１０⁵／ml 顕微鏡スライドを観察したところ、対照とＡＧＮ１９１１８３（化合物４）処理細胞との間に、違いは無かった。ＡＧＮ１９１７０１処理細胞においては、顕著な細胞死が見られ、殆んど全ての細胞が死滅していた。アッセイ２培地（ＲＰＭＩ−１６４０；ウシインシュリン５mg／l、ヒトトランスフェリン５mg／l、および亜セレン酸ナトリウム５μg／lを含有）（８ml）を入れたＴ− ２５組織培養フラスコに、ＨＬ−６０cdm−１細胞を、２×１０⁵細胞／mlの密度でプレートした。ＡＧＮ１９１７０１（化合物１）を最終濃度１μＭで加え（１ mＭ原液８μl）、暗所で３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ₂）内で、４８時間、細胞を培養した。フラスコから培地および細胞を採り、細胞をペレット化し（１１００rpm／７分間、ベックマン・デスクトップ遠心機）、ペレットをリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）で１回洗った後、ペレット化細胞を、２０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.４）、０.４mＭＥＤＴＡ、０.４％トリトン（Triton）Ｘ− １００を含有する溶液（２００μl）を加えることによって溶解した。溶解物をミクロ遠心機（microfuge）で５分間遠心し（１４０００rpm）、上清を０.５ＭＮaＣlおよび５０％イソプロパノールの最終濃度に調節した。溶液を−２０℃ で一晩沈殿させ、生成した沈殿をミクロ遠心機でペレット化した（１０分間、１４０００rpm）。ペレットを７０％エタノールで１回洗い、トリス−ＥＤＴＡ（１０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.４）、０.４mＭＥＤＴＡ）（５０μl）に再懸濁し、ゲル誘導緩衝剤と混合した。サンプルを、１kＢ標準ＤＮＡラダー［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー（Bethesda Research Laboratory）］と並べて、１％アガロースゲル内で１時間、電気泳動に付した。ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム染色後、ＵＶランプ下の観察および写真によって行った。アポプトシス細胞死を起こした細胞に特徴的なＤＮＡ断片化（「ラダリング」）のパターンを検出した。アッセイ３培地（ＲＰＭＩ−１６４０；ウシインシュリン５mg／l）ヒトトランスフェリン５mg／lおよび亜セレン酸ナトリウム５μg／lを含有）（３ml）を入れた６ウェル組織培養プレート（ファルコン）に、ＨＬ−６０cdm−１細胞を、１×１０⁵ 細胞／mlの密度でプレートした。ウェルに、エタノール（３μl）またはＡＧＮ１９１７０１（化合物１；エタノール中、１mＭ）の原液（３μl）を加えた。暗所で３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ₂）内で、４時間、４８時間または６日間、細胞を培養した。その後、細胞のサンプル（５０μl）を、サイトスピン遠心機を用いて顕微鏡スライドに沈降させた。沈降した細胞を風乾し、無水メタノールで固定し、ディフクイック試薬キットを用いて染色し、パーマウントに載せ、ブライトフィールド光学顕微鏡で観察した。対照細胞は、多数の未分化の骨髄性白血病芽細胞であることがわかった。ＡＧＮ１９１７０１（化合物１）を４時間作用させた細胞には、核濃縮、および核と細胞質との濃色化が見られ、細胞質に拡大部分（大きいブレブ）が生じていた。４８時間処理した場合は、多くの細胞が死滅しており、多くの濃色化核断片が培地中に遊離、または縮小細胞残遺物中に存在していた。未分化の芽細胞の残留数は少ない。６日間処理した場合は、同様の濃色化核残遺物が検出されることに加えて、分散多核融合細胞（「巨細胞」）が培養物中に散在する。この細胞死滅形態変化パターンは、アポプトシスを起こした細胞の変化によく一致する。第５〜９図に、上記アッセイの結果を示す。第５図は、上記アッセイにおいて、化合物１（ＡＧＮ１９１７０１）で４８時間処理した細胞から得たＤＮＡ「ラダー」の写真である。第６図は、上記アッセイにおいて、ＲＸＲ作働剤化合物ではなく、「溶媒」で処理した「対照」細胞の写真である。第７図は、化合物１で４時間処理した細胞の写真である。第８図は、化合物１で４８時間処理した細胞の写真である。第９図は、化合物１で６日間処理した細胞の写真である。本発明により、「汎作働剤」化合物３（ＡＧＮ１９１６５９）で処理した場合も、同様の結果が得られる。写真からわかるように、ＲＸＲ作働剤で処理すると、非常に多くの細胞においてアポプトシス細胞死が起こる。本発明の方法において化合物３のような化合物を使用することは、ＲＸＲ特異的作働剤（例えば化合物１）の使用よりも、いくぶん好ましさが劣る。これは、ＲＡＲ作働剤活性には、ＲＸＲ特異的薬物には無い副作用が伴うことが知られているからである。製剤および処置方法本発明の処置方法において使用する化合物は、症状、器官特異的処置の必要性、投与量などを考慮して、全身的に、または局所的に投与し得る。ある種の悪性腫瘍の処置においては、局所投与を行い得る。通常の局所用製剤、例えば溶液、懸濁液、ゲル、軟膏などのいずれを使用してもよい。このような局所投与用製剤の調製は、薬剤の分野における文献、例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル．サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）、第１７版、マック・パブリッシング社（Mack Publishing Company；イーストン、ペンシルベニア）に詳細に説明されている。局所投与するには、化合物を粉末またはスプレー（とりわけエアロゾル形のもの）として投与することもできる。本発明の新規処置方法においては、多くの場合、全身的投与に適した薬剤組成物として、活性成分であるＲＸＲ作働剤化合物を投与する。薬剤を全身的に投与する場合には、散剤、丸剤、錠剤など、またはシロップ剤もしくはエリクシル剤の形態に調製して、経口投与することができる。静脈内、腹腔内または病巣内投与を行うには、化合物を、注射によって投与し得る溶液または懸濁液に調製し得る。坐剤の形、または皮下徐放性製剤もしくは筋肉内注射剤の形に調製することが有用てある場合もある。処置濃度は、特定の症状を軽減するか、または病状の進行を遅延させる濃度である。処置濃度は症状によって様々であり、処置しようとする症状の重さ、および処置に対する患者の感受性によっても異なり得る。従って、通常の試験によって、場合に応じて処置濃度を決定することが最もよい。本発明による悪性腫瘍の処置においては通例、０.００１〜５重量％、好ましくは約０.０１〜１％の濃度の製剤が有効であると考えられる。全身的に投与する場合は、０.０１〜１００、好ましくは約０.１〜１０mg／kg体重／日の量が、多くの場合有効であり得る。一般的な態様定義以下の説明は、本発明による悪性腫瘍の新規処置方法に使用するＲＸＲ作働剤化合物を例示するものである。本明細書中に挙げる化合物の化学的説明において、いずれの化学用語も、有機化学分野で一般的な意義を有する。すなわち、アルキルとは、直鎖アルキル、分枝鎖アルキルおよびシクロアルキルとして知られる全ての基を包含する。アルケニルとは、１個またはそれ以上の不飽和部分を有する直鎖アルケニル、分枝鎖アルケニルおよびシクロアルケニル基を包含する。低級アルキルは、上記の広範なアルキル基のうち、炭素数１〜６のものを意味する（分枝鎖およびシクロアルキル基の場合は、炭素数は３〜６である）。同様に、低級アルケニルは、直鎖アルケニルの場合は炭素数２〜６、分枝鎖およびシクロアルケニル基の場合は、炭素数３〜６のものと定義する。本発明において「エステル」とは、有機化学における古典的なエステルの定義に含まれるすべての化合物を包含する。本発明の例示カルボン酸の好ましいエステルは、炭素数１０もしくはそれ以下の飽和脂肪族アルコール、または炭素数５〜１０の環式もしくは飽和脂肪族環式アルコールと共に形成する。特に好ましくは、炭素数１〜１０の脂肪族アルコールと共に形成する。第一級アルコールである本発明の化合物（式１中、Ｂが−ＣＨ₂ＯＨ）からエステルを誘導する場合は、エステルとは、式：−ＣＨ₂ＯＯＣＲ₁₁（Ｒ₁₁は、置換または不置換脂肪族、芳香族または脂肪族−芳香族基であり、好ましくは脂肪族部分の炭素数１〜６である）で示される化合物を包含する。特に好ましい脂肪族エステルは、低級アルキル酸またはアルコールから誘導したものである。フェニルまたは低級アルキルフェニルエステルも好ましい。アミドとは、有機化学における古典的なアミドの意義を有する。アミドには、不置換アミド並びに脂肪族および芳香族モノ−よびジ置換アミドが含まれる。好ましいアミドは、炭素数１０もしくはそれ以下の飽和脂肪族基または炭素数５〜１０の環式もしくは飽和脂肪族−環式基から誘導するモノ−およびジ−置換アミドである。特に好ましいアミドは、低級アルキルアミンから誘導するアミドである。フェニルまたは低級アルキルフェニルアミンから誘導するモノ−およびジ− 置換アミドも好ましい。不置換アミドも好ましい。アセタールおよびケタールは、基−ＣＨ（ＯＲ₁₂）₂、−ＣＨＯＲ₁₃Ｏ、−ＣＲ₇（ＯＲ₁₂）₂および−ＣＲ₇ＯＲ₁₃Ｏを有し、Ｒ₇は炭素数１〜５のアルキル、シクロアルキルまたはアルケニル基であり、Ｒ₁₂は低級アルキルであり、Ｒ₁₃は炭素数２〜５の２価アルキル基である。薬学的に許容し得る塩は、塩を形成し得る官能基（例えば酸またはアミン基）を有するなら、本発明の処置方法に使用するいずれの化合物に対しても調製し得る。薬学的に許容し得る塩は、親化合物の活性を保持しており、被投与体および環境に対して有害または不都合な作用を及ぼさない塩である。このような塩は、有機または無機の酸または塩基から誘導し得る。このような塩は、一価または多価イオンから生成し得る。酸基に対して特に好ましいものは、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのような無機イオンである。有機アミン塩は、例えばモノ−、ジ−およびトリ−アルキルアミンまたはエタノールアミンのようなアミンから得られ、特にアンモニウム塩である。カフェイン、トロメタミンなどの分子から塩を生成することもできる。酸付加塩を形成し得るほど充分に塩基性の窒素が存在する場合は、いずれの無機もしくは有機酸またはアルキル化剤（例えばヨウ化メチル）と酸付加塩を形成してもよい。塩酸、硫酸またはリン酸のような無機酸との塩が好ましい。多くの単純な有機酸、例えば一塩基性、二塩基性または三塩基性酸のいずれかを使用することもできる。本発明の処置方法に従って使用する例示化合物は二重結合を有するので、トランスおよびシス（ＥおよびＺ）異性体が存在し得る。更に、本発明の処置方法において使用する化合物のいくつかは１個またはそれ以上のキラル中心を有し得、それ故、エナンチオマーおよびジアステレオマーの形態で存在し得る。化学名または構造によって特定しない限り、そのような個々の異性体、並びにシスおよびトランス異性体の混合物、ジアステレオマーの混合物、およびエナンチオマー（光学異性体）のラセミ混合物のいずれも、本発明の範囲に包含される。構造式中、二重結合に関してトランス（Ｅ）配置の置換基は、二重結合に関して反対方向に向いた結合で示し、二重結合に関してシス（Ｚ）配置の置換基は、二重結合に関して同方向を向いた結合で示す。本発明の薬剤組成物および処置方法において使用するＲＸＲ作働剤化合物の例の一般構造を、下記一般式１によって示す。［式中、Ｒ₁は低級アルキル、Ｃl，ＢrまたはＩであり；Ｒ₂はＨ、低級アルキル、Ｃl、ＢrまたはＩであり；Ｒ₃は低級アルキル、Ｃl、Ｂr、Ｉ、ＯＲ₁₁、ＳＲ₁₁、ＯＣＯＲ₁₁、ＳＣＯＲ₁ ₁ 、ＮＨ₂、ＮＨＲ₁₁、Ｎ（Ｒ₁₁）₂、ＮＨＣＯＲ₁₁またはＮＲ₁₁−ＣＯＲ₁₁であり；Ｒ₅はそれぞれＨ、低級アルキル、Ｃl、Ｂr、Ｉ、低級アルコキシまたは低級チオアルコキシ（炭素数１〜６）であり；Ｒ₆はそれぞれ、Ｈまたは低級アルキルであり；Ａは（ＣＨ₂）n（nは０〜５）、炭素数３〜６の低級分枝鎖アルキル、炭素数３〜６のシクロアルキル、炭素数２〜６／二重結合数１または２のアルケニル、炭素数２〜６／三重結合数１または２のアルキニルであり；Ｂは水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容し得るその塩、ＣＯＯＲ₈、ＣＯＮＲ₉Ｒ₁₀、−ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＯＲ₁₁、ＣＨ₂ＯＣＯＲ₁₁、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ₁₂ ）₂、ＣＨＯＲ₁₃Ｏ、−ＣＯＲ₇、ＣＲ₇（ＯＲ₁₂）₂、またはＣＲ₇ＯＲ₁₃Ｏであり、Ｒ₇は炭素数１〜５のアルキル、シクロアルキルまたはアルケニルであり、Ｒ₈は炭素数１〜１０のアルキル、炭素数５〜１０のシクロアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₉およびＲ₁₀はそれぞれ水素、炭素数１〜１０のアルキル、炭素数５〜１０のシクロアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₁₁は炭素数１〜１０のアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₁₂は低級アルキルであり、Ｒ₁₃は炭素数２〜５の２価アルキルである。］本発明の薬剤組成物および処置方法において使用する化合物においては、Ｒ₁ は、好ましくは低級アルキル、より好ましくはメチルである。Ｒ₂は好ましくはＨまたは低級アルキル、より好ましくはＨである。Ｒ₃は好ましくは低級アルキル、より好ましくはメチルである。Ｒ₅は好ましくはＨまたは低級アルキル、より好ましくはＨである。Ｒ₆は好ましくは低級アルキル、より好ましくはメチルである。 −Ａ−Ｂ−に関しては、本発明において使用する化合物において、−Ａ−Ｂ− は好ましくは（ＣＨ₂）n−ＣＯＯＲ₈、または（ＣＨ₂）n−ＣＯＮＲ₉Ｒ₁₀（Ｒ₈ 、Ｒ₉およびＲ₁₀は前記と同意義）、より好ましくはnは０で、ＢはＣＯＯＲ₈である。最も好ましくは、ＢはＣＯＯＨである。本発明の処置方法において好ましい化合物二例を、化合物１（ＡＧＮ１９１７０１）および化合物３（ＡＧＮ１９１６５９）と称し、その構造式を既に示した。本発明による化合物の合成方法本発明の薬剤組成物および処置方法において使用し得る前記化合物は、種々の化学合成経路によって合成し得る。本発明を説明するために、以下に反応式を挙げる。当業者は、本明細書中に記載の条件は、特定の態様であって、一般化し得ることを容易に認識するであろう。反応式１には、式１の化合物の合成法を説明する。反応式１によると、所望の置換基Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₆（式１に関して定義した通り）を有する式２の５,６, ７,８−テトラヒドロナフチル化合物を、フリーデル・クラフツ様条件下にＲ₁ＣＯＣl（Ｒ₁は式１に関して定義した通り）のような試薬と反応させて、テトラヒドロナフタレン核の２位にケトン基Ｒ₁−ＣＯ−を導入する。Ｒ₁がメチルの場合、フリーデル・クラフツ型反応に用いる試薬は通例、塩化アセチルである。次いで、得られた式３のケトンを、還元（例えば水素化ホウ素ナトリウムによる）して、対応する式４のアルコールを得る。式４のアルコールを、適当な試薬（例えば三臭化リンおよびトリフェニルホスフィン）で処理することにより、対応するホスホニウム塩（例えばトリフェニルホスホニウムブロミド）に変換する。式５のホスホニウム塩はヴィッティッヒ試薬であるので、これをヴィッティッヒ条件（塩基、例えばn−ブチルリチウム）下に式６のブロモチオフェンアルデヒドと反応させて、式７の化合物を得る。式７の化合物のチオフェン部分のブロモ基を、n−ブチルリチウムおよび二酸化炭素との反応により、カルボキシル基に変換して、式８のカルボン酸化合物を得る。それを、本明細書中に記載のように、更に別の同族体および誘導体に変換し得る。反応式１の合成経路は、本発明の化合物１（ＡＧＮ１９１７０１）および化合物３（ＡＧＮ１９１６５９）の合成経路として好ましい。式１の化合物を導く他の合成経路を、反応式２に示す。反応式２によると、式３のケトン化合物を、式９のホスホネート試薬とのヴィッティッヒ・ホルナー型反応に付す。式９のホスホネート試薬はエステル（ＣＯＯＲ₈）置換基を有するが、そのようなホスホネート試薬は一般にＡ−Ｂ官能基（式１に関して定義した通り）を有し得ると理解すべきである。ヴィッティッヒ・ホルナー型反応は通例、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような溶媒中で、強塩基、例えばＮaＣＨ₂ＳＯＣＨ₃（ジメシルナトリウム）の存在下に行う。反応式２の合成経路は、式９の芳香族試薬を適当に選択すると、化合物２（ＡＧＮ１９１４４０）（ＲＸＲレセプター活性アッセイにおいて使用する比較化合物である）の合成経路として好ましい。式８および式１０の化合物は、特にＣＯＯＲ₈基に関して、更なる変換に付すことができる。式８および式１０とは異なるＡ−Ｂ官能基を有する式８および式１０類似の化合物（および更に拡張して本発明に従って使用するすべての化合物）の合成に関して、以下のようなよく知られた文献記載の一般原理および合成法を更に参照し得る。カルボン酸は通例、塩化水素または塩化チオニルのような酸触媒の存在下に、適当なアルコール溶液中で酸を還流することによってエステル化する。また、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下に、カルボン酸を適当なアルコールと縮合させてもよい。エステルは、常套の方法で回収および精製する。アセタールおよびケタールは、マーチ（March）、「アドバンスド・オーガニック・ケミストリー（Advanced Organic Chemistry）」、第２版、マッグロー−ヒル・ブック社（McGraw-Hill Book Company）、８１０頁に記載の方法により容易に得られる。アルコール、アルデヒドおよびケトンは、例えばマッコーミー（McOmie）、プレナン・パブリシング・プレス（Plenum Publ ishing Press）、１９７３およびプロテクティング・グループス（Protecting Groups）、グリーン（Greene）編、ジョン・ワイリー．アンド・サンズ（John Wiley ＆ Sons）、１９８１に記載されているような既知の方法で、それぞれエーテルおよびエステル、アセタールまたはケタールを形成することによって保護し得る。反応式１および反応式２に示すヴィッティッヒ反応、ヴィッティッヒ・ホルナー反応、または同様のカップリング反応の前にnの値を高めるためには（そのような式６および／または式９に相当する必要な試薬が市販されていない場合）、カルボン酸を、アルント−アイシュテルト反応条件下に連続的に処理することによるか、または他の同族体化方法により同族体化する。カルボン酸ではない誘導体を適当な手段により同族体化してもよい。次いで、同族体化した酸を、前記のような方法でエステル化し得る。Ｂが酸基または他の基である式１の化合物を、前記のようなアルントーアイシュテルト法または他の方法による同族体化に付すことによっても、Ａが（ＣＨ₂ ）nでnが１〜５の化合物を得ることができる。Ａが二重結合を１個またはそれ以上有するアルケニル基である式１の化合物は、例えば、式３のケトンとカップリングするホスホネート中間体に必要な数の二重結合を組み込むことによって合成し得る。Ａが不飽和炭素鎖であるそのような化合物は通例、有機化学分野においてよく知られた合成経路によって、例えばヴィッティッヒ反応などの反応によって、またはα−ハローアリールアルキルカルボン酸、エステルもしくはカルボキシアルデヒドからハロゲンを脱離して二重結合を導入することによって得ることができる。Ａが三重（アセチレン）結合を有する式１の化合物は、対応するホスホネート中間体を用いて合成し得る。そのような中間体は、当分野でよく知られた反応、例えば対応する芳香族−メチルケトンと強塩基（例えばリチウムジイソプロピルアミド）との反応によって得ることができる。式１の化合物から誘導する酸および塩は、対応するエステルから容易に得られる。アルカリ金属塩基で塩基性ケン化することにより、酸が得られる。例えば、好ましくは不活性ガス雰囲気中、室温で、約３モル過剰の塩基（例えば水酸化カリウム）と共に、エステルをアルカノールのような極性溶媒に溶解し得る。この溶液を１５〜２０時間攪拌し、冷却し、酸性化し、常套の方法で加水分解物を回収する。アミドは、対応するエステルまたはカルボン酸から、当業者既知の適当ないずれのアミド化方法で生成してもよい。このような化合物を調製する一方法においては、酸を酸クロリドに変換し、次いで水酸化アンモニウムまたは適当なアミンで処理する。例えば、酸を塩基のアルコール溶液、例えばＫＯＨ（約１０モル％過剰）エタノール溶液で、室温で約３０分間処理する。溶媒を除去し、残渣をジエチルエーテルのような有機溶媒に溶解し、ジアルキルホルムアミドで処理し、次いで１０倍過剰の塩化オキサリルで処理する。これらは、すべて約−１０〜＋１０℃の中程度の低温で行う。得られた溶液を低温で１〜４時間、好ましくは２時間攪拌する。溶媒除去によって得られた残渣を不活性溶媒（例えばベンゼン）に溶解し、約０℃に冷却し、濃水酸化アンモニウムで処理する。この混合物を低温で１〜４時間攪拌する。生成物を従来の方法で回収する。アルコールは、対応する酸を塩化チオニルまたは他の手段によって酸クロリドに変換し［ジェイ・マーチ、「アドバンスド・オーガニック・ケミストリー」、第２版、マッグロー−ヒル・ブック社］、次いで酸クロリドを水素化ホウ素ナトリウムで還元する［マーチ、前掲書、１１２４頁］ことによって得られる。また、低温において、エステルを水素化リチウムアルミニウムで還元してもよい。これらのアルコールを、ウィリアムソン反応条件下に適当なハロゲン化アルキルでアルキル化することによって、対応するエーテルが得られる［マーチ、前掲書、３５７頁］。これらのアルコールを、酸触媒またはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下に適当な酸と反応させることによって、エステルに変換し得る。アルデヒドは、穏やかな酸化剤、例えば塩化メチレン中のピリジニウムジクロメート［コレイ、イー・ジェイ（Corey，E．J.）、シュミット、ジー（Schmidt, G.）、テトラヘドロン・レターズ（Tet．Lett.）、３９９、１９７９］または塩化メチレン中のジメチルスルホキシド／塩化オキサリル［オムラ、ケイ（Omura, K.）、スワーン、ディ（Swern，D．）、テトラヘドロン（Tetrahedron）、１９７８、３４、１６５１］を用いて、対応する１級アルコールから調製することができる。ケトンは、適当なアルデヒドを、アルキルグリニヤール試薬または同様の試薬で処理し、次いで酸化することによって調製し得る。アセタールまたはケタールは、マーチ、前掲書、８１０頁に記載の方法により、対応するアルデヒドまたはケトンから得られる。反応式１および反応式２に関して更に説明すると、当業者は容易に認識するであろうが、それらの反応式中に示すヴィッティッヒ反応およびヴィッティッヒ・ホルナー反応を更に変更を加えて、本発明において使用する化合物を得ることも可能である。例えば、反応式１に示すヴィッティッヒ反応を行うのに、ケト基を有するテトラヒドロナフタレン誘導体（式５に相当）、およびトリフェニルホスホニウム基を有する複素環化合物（式６に相当）を使用することができる。反応式２に示すヴィッティッヒ・ホルナー反応を行うのに、ジアルキルホスホネート基を有するテトラヒドロナフタレン誘導体（式３に相当）、およびケトまたはアルデヒド基を有する複素環化合物（式９に相当）を使用することができる。実施例メチル［３,５,５,８,８−ペンタメチル（５,６,７,８−テトラヒドロナフタレン）−２−イル］ケトン（化合物１０）アルゴン雰囲気中、０℃で、塩化メチレン中の塩化アルミニウム６.７１g（５０.３ミリモル）の懸濁液に、塩化メチレン中の塩化アセチル３.９５g（３.５８ ml、５０.３ミリモル）および３,５,５,８,８−ペンタメチル−５,６,７,８−テトラヒドロナフタレン１０.２１g（４１．９ミリモル）の溶液を加えた。得られた混合物を攪拌しながら、３時間にわたって室温に昇温した。混合物を０℃に再冷却し、１Ｎ−ＨＣlを滴下した。次いで、混合物を水に溶解し、塩化メチレンで３回抽出した。有機相を１Ｎ−ＨＣl、水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、象牙色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ１.２８（６Ｈ、s）、１.３０（６Ｈ、s）、１.６９（４Ｈ、s）、２.４９（３Ｈ、s）、２.５７（３Ｈ、s）、７.１５（１Ｈ、s）、７.６７（１Ｈ、s）。（±）−１−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）エタノール（化合物１１）０℃で、メタノール中のメチル［３,５,５,８,８−ペンタメチル−５,６,７, ８−テトラヒドロナフタレン−２−イル］ケトン（化合物１０）４.１７g（１７ .１ミリモル）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム０.７７g（２０.４ミリモル）を少しずつ加え、得られた懸濁液を０℃で４時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた固体を水に溶解し、１Ｎ−ＨＣlで酸性化し、エーテルで３回抽出した。エーテル抽出物を水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、白色固体として標記化合物（単一の異性体）を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）: δ１.２８（１２Ｈ、m）、１.４７（３Ｈ、d、J＝６. ５Ｈｚ）、１.６７（４Ｈ，s）、２.４９（３Ｈ、s）、５.０８（１Ｈ、m）、７ .１０（１Ｈ、s）、７.４５（１Ｈ）s）。［（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン −２−イル）エタン−１−イル］トリフェニルホスホニウムブロミド（化合物１２）アルゴン雰囲気中、０℃で、エーテルおよびヘキサン中の（±）−１−（５, ６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）エタノール（化合物１１）３.８７g（１５.７ミリモル）の溶液に、三臭化リン４２.４g（１４.９ml、１５７ミリモル）を加え、得られた混合物を２時間攪拌した。次いで、水を３０分間にわたって滴下し、相を分離した。水相をエーテルで３回抽出した。エーテル相を水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣をベンゼンに溶解した。トリフェニルホスフィンを加え、混合物を室温で２４時間攪拌した。次いで、混合物を減圧濃縮し、得られた固体をアセトニトリル、酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶して、白色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ０.６１（３Ｈ、s）、０.８９（３Ｈ、s）、１.２７（６Ｈ、s）、１.６２（４Ｈ、m）、１.８５（６Ｈ、d）、２.０４（３Ｈ、dd）、５.１９（２Ｈ、m）、６.６２（１Ｈ、d）、７.０２（１Ｈ、s）、７.４３（６Ｈ、m）、７.６８（６Ｈ、m）、７.８７（３Ｈ、m）。２−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−４−ブロモチオフェン（化合物１３）アルゴン雰囲気中、−７８℃で、テトラヒドロフラン１１ml中の１−（３,５, ５,８,８−ペンタメチル−５,６,７,８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）エタン−１−イルトリフェニルホスホニウムブロミド（化合物１２）０.５６g（０.９８ミリモル）の溶液に、n-ＢuＬi（０.４１g、０.６１ml、０.９８ミリモル、ヘキサン中１.６Ｍ）を滴下した。得られた懸濁液を室温に昇温した後、テトラヒドロフラン２ml中の４−ブロモ−２−チオフェンカルボアルデヒド０.２８g（１.４７ミリモル）の溶液を滴下し、得られた混合物を室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた固体を水に溶解し、１Ｎ−ＨＣlで酸性化し、エーテルで３回抽出した。エーテル抽出物を水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（Ｓi Ｏ₂、０.５％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、白色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ１.２７（６Ｈ、s）、１.２９（６Ｈ、s）、１.６８（４Ｈ、s）、２.２６（６Ｈ）m、６.４５（１Ｈ、s）、６.７５（１Ｈ、s）、６.９５（１Ｈ、s）、７.０７（１Ｈ、s）、７.１１（１Ｈ、s）、７.１７（１Ｈ、s）。２−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］チオフェン−４−カルボン酸（化合物１）アルゴン雰囲気中、−１００℃で攪拌しながら、テトラヒドロフラン１５ml中の２−［２−（Ｅ）−５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−４−ブロモチオフェン（化合物１３）５００mg（１.２４ミリモル）の溶液に、n−ＢuＬi（０.５２７g、０ .７７５ml、１.２４ミリモル、ヘキサン中１.６Ｍ）を加えた。反応混合物を２分間攪拌し、二酸化炭素で２０分間パージした。次いで、反応混合物を室温に昇温し、酸性化し、エーテルで抽出した。エーテル抽出物を水、塩水で洗い、Ｍg ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、エーテルで洗った。水相を１Ｎ−ＨＣlで酸性化し、エーテルで抽出した。エーテル相を水および塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、白色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（d⁶−ＤＭSＯ）：δ１.２３（１２Ｈ、s）、１.６２（４Ｈ、s）、２. ２１（３Ｈ、s）、２.２３（３Ｈ、s）、６.５６（１Ｈ、s）、７.０７（１Ｈ、 s）、７.１３（１Ｈ、s）、７.４５（２Ｈ、s）、８.２４（２Ｈ、s）。２−［（Ｅ）−（２）−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−５−ブロモチオフェン（化合物１４）アルゴン雰囲気中、−７８℃で、テトラヒドロフラン６０ml中の［（５,６,７ ,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）エタン−１−イル］トリフェニルホスホニウムブロミド（化合物１２）３.００g（５. ２６ミリモル）の溶液に、n-ＢuＬi（２.２４g、３.２９ml、５.２６ミリモル、ヘキサン中１.６Ｍ）を滴下した。得られた懸濁液を室温に昇温した後、テトラヒドロフラン１０ml中の５−ブロモ−２−チオフェンカルボアルデヒド１.０１g （０.６３ml、５.２６ミリモル）の溶液を滴下し、得られた混合物を室温で２０時間攪拌し、次いで、１時間還流した。混合物を１Ｎ−ＨＣlで酸性化し、エーテルで３回抽出した。エーテル抽出物を水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳiＯ₂、２％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、白色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ１.２８（１２Ｈ、s）、１.６７（４Ｈ、s）、２.２４（６Ｈ、２xs）、６.４５（１Ｈ、s）、６.７５（１Ｈ、d、Ｊ＝３.９Ｈz）、６.９９（１Ｈ、d）Ｊ＝３.８Ｈz）、７.０７（１Ｈ、s）、７.０９（１Ｈ、s）。２−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−５−チオフェンカルボン酸（化合物３）アルゴン雰囲気中、−７８℃で、エーテル中の２−［（Ｅ）−２−（５,６,７ ,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−５−ブロモチオフェン（化合物１４）０.２３０g（０.５７ミリモル）の溶液に、ｔ−ＢuＬi（０.６７ml、１.１４ミリモル、ヘキサン中１.７Ｍ）を滴下した。得られた混合物を１.５時間攪拌し、二酸化炭素でパージし、１６時間にわたって室温に昇温した。混合物を１Ｎ−ＨＣlで酸性化し、エーテルで抽出した。エーテル相を水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去して青色固体を得、それをエーテル／ヘキサンから再結晶して、薄青色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（d⁶−ＤＭＳＯ）：δ１.２１（１２Ｈ、s）、１.６０（４Ｈ、s）、２ .１９（３Ｈ、s）、２.２４（３Ｈ、s）、６.４５（１Ｈ、s）、６.６１（１Ｈ、s）、６.９９（１Ｈ、d、Ｊ＝３.８Ｈz）、７.０６（１Ｈ、s）、７.１２（１Ｈ、s）、７.１８（１Ｈ、d、Ｊ＝３.８Ｈz）、７.６７（１Ｈ、d、Ｊ＝３.８Ｈ z）。エチル２−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８− ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］−５−チオフェンカルボキシレート（化合物１５）塩化メチレン１０ml中の、５−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ −３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］ −２−チオフェンカルボン酸（化合物３）０.０３g（０.６５５ミリモル）／Ｅt ＯＨ、１,３−ジシクロヘキシルカルボジイミド０.０９９g（０.４８ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン５.３mg（０.０４４ミリモル）の懸濁液を、室温で１６時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を水、塩水で洗った。有機相を合し、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳiＯ₂、５％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、透明油状物として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ１.２７（１２Ｈ、s）、１.３９（３Ｈ、t、Ｊ＝７. ２Ｈz）、１.６８（４Ｈ、s）、２.２７（３Ｈ、s）、２.３４（３Ｈ、s）、４. ３７（２Ｈ、q、Ｊ＝７．Ｈz）、６.５７（１Ｈ、s）、７.００（１Ｈ、d、Ｊ＝３.８Ｈz）、７.０９（１Ｈ、s）、７.１１（１Ｈ、s）、７.７４（１Ｈ、d、Ｊ＝３.８Ｈz）。４−カルボエトキシ−ベンジルブロミド（化合物１６）塩化メチレン１００ml中の１,３−ジシクロヘキシルカルボジイミド［アルドリッチ（Aldrich）］１６.０９g（７８ミリモル）の溶液に、塩化メチレン１００ml中の４−カルボキシベンジルブロミド１５.４g（７１ミリモル）の懸濁液、次いで無水エタノール４.９g（１０６.５ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン０.８１g（７.１ミリモル）を攪拌しながら加えた。反応混合物に更に５０mlの塩化メチレンを加え、２時間加熱還流した。混合物を室温に冷却し、生成した白色沈澱を濾去した。濾液を水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥し、減圧濃縮して、無色油状物（静置すると結晶化）として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ１.３９（３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz）、４.３８（２Ｈ、q、Ｊ＝７.２Ｈz）、４.５０（２Ｈ、s）、７.４５（２Ｈ、d、Ｊ＝７.７Ｈz ）、８.０３（２Ｈ）d、Ｊ＝７.７Ｈz）。エチル［４−（ジエトキシホスフィニル）メチル］ベンゾエート（化合物１７）アルゴン導入管とドライアイスで冷却したトラップとを取り付けたフラスコに、４−カルボエトキシベンジルブロミド（化合物１６）１１.８g（４８ミリモル）および新たに蒸留した亜リン酸トリエチル１２.０g（７２ミリモル）の混合物を入れた。アルゴン気流を反応混合物に攪拌しながら連続的に通し、混合物をエチルブロミドの生成を止むまで１２０〜℃で３時間加熱した。残渣を減圧蒸留により精製して、無色油状物（bp=１７０°／０.３５mm）として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）：δ１.２３（６Ｈ、t、Ｊ＝７.１Ｈz）、１.３９（３Ｈ、t、Ｊ＝６.９Ｈz）、３.２１（２Ｈ、d、Ｊ＝２２.１Ｈz）、４.０２（４Ｈ） m）、４.３７（２Ｈ、q、Ｊ＝７.５Ｈz）、７.３８（２Ｈ、d、Ｊ＝７.９Ｈz）、８.００（２Ｈ、d、Ｊ＝７.９Ｈz）。エチル４−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８− ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］ベンゾエート（化合物１８）アルゴン雰囲気中、０℃で、テトラヒドロフラン２５ml中のメチル［３,５,５ ,８,８−ペンタメチル（５,６,７,８−テトラヒドロナフタレン）−２−イル］ケトン（化合物１０）５.０g（２１.５ミリモル）およびエチル［４−（ジエトキシホスフィニル）メチル］ベンゾエート（化合物１７）３.３９g（１１.３ミリモル）の溶液を、テトラヒドロフラン２５ml中の水素化ナトリウム０.５２g（２１.５ミリモル）の懸濁液に、カニューレから加えた。得られた懸濁液を室温に昇温し、１６時間攪拌した。得られたスラッジを、水および１Ｎ−ＨＣlに溶解し、エーテルで抽出した。エーテル相を、水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳiＯ₂、１％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して異性体混合物を得、それをＨＰＬＣ（０. ５％酢酸エチル／ヘキサン）により分離して、白色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（ＣＤＣl₃）: δ１.３０（１２Ｈ、s）、１.３８（３Ｈ、t、Ｊ＝７. ０Ｈz）、１.６９（４Ｈ、s）、２.２１（３Ｈ、s）、２.３０（３Ｈ、s）、４. ３９（２Ｈ、q、Ｊ＝７.１Ｈz）、６.４２（１Ｈ、s）、７.１２（２Ｈ、overl ．s）、７.４３（２Ｈ、d、Ｊ＝８.３Ｈz）、８.０５（２Ｈ、d、Ｊ＝８.３Ｈz ）。４−［（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］安息香酸（化合物２）エタノール中の水酸化カリウムの溶液を、エチル４−［（Ｅ）−２−（５,６, ７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］ベンゾエート（化合物１８）９５mg（０.２５ミリモル）に加え、得られた混合物を室温で攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた固体を水に溶解し、１Ｎ−ＨＣlで酸性化し、エーテルで３回抽出した。エーテル抽出物を水、塩水で洗い、ＭgＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧除去して、橙色固体として標記化合物を得た。ＰＭＲ（d⁶−ＤＭＳＯ）：δ１.２３（１２Ｈ、s）、１.６２（４Ｈ、s）、２ .１５（３Ｈ、s）、２.２３（３Ｈ、s）、６.３７（１Ｈ、s）、７.０８（１Ｈ、s）、７.１３（１Ｈ、s）、７.５１（２Ｈ、d、Ｊ＝８.３Ｈz）、７.９４（２Ｈ、d、Ｊ＝８.３Ｈz）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｄ 333/24 9455−4ＣＣ０７Ｄ 333/24 333/38 9455−4Ｃ 333/38 333/40 9455−4Ｃ 333/40 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チャンドララトナ、ロシャンサ・エイアメリカ合衆国92691カリフォルニア州ミッション・ヴィージョ、エンプレサ25841 番

Claims

【特許請求の範囲】１．レチノイド様活性を有し、ＲＸＲレチノイドレセプター作働剤である活性化合物の有効量を含有する薬剤組成物を、腫瘍を有するヒトを包含する哺乳動物に、腫瘍細胞のアポプトシスを誘導し、それにより腫瘍を処置する目的で投与する方法。２．活性化合物は、ＲＡＲレチノイドレセプターよりもＲＸＲレチノイドレセプターに選択的な作働剤である請求項１記載の方法。３．活性化合物は、ＲＡＲレチノイドレセプターと比較してＲＸＲレチノイドレセプターに特異的な作働剤である請求項１記載の方法。４．哺乳動物に、１日当たり約０.０１〜１００mg／kg体重の活性化合物を投与する請求項１記載の方法。５．哺乳動物に、１日当たり約０.１〜１０mg／kg体重の活性化合物を全身的に投与する請求項４記載の方法。６．活性化合物は下記式で示される請求項１記載の方法：［式中、Ｒ₁は低級アルキル、Ｃl、ＢrまたはＩであり；Ｒ₂はＨ、低級アルキル、Ｃl、ＢrまたはＩであり；Ｒ₃は低級アルキル、Ｃl、Ｂr、Ｉ、ＯＲ₁₁、ＳＲ₁₁、ＯＣＯＲ₁₁、ＳＣＯＲ₁ ₁ 、ＮＨ₂、ＮＨＲ₁₁、Ｎ(Ｒ₁₁)₂、ＮＨＣＯＲ₁₁またはＮＲ₁₁−ＣＯＲ₁₁であり；Ｒ₅はそれぞれＨ、低級アルキル、Ｃl、Ｂr、Ｉ、低級アルコキシまたは低級チオアルコキシ（炭素数１〜６）であり；Ｒ₆はそれぞれ、Ｈまたは低級アルキルであり；Ａは（ＣＨ₂）n（nは０〜５）、炭素数３〜６の低級分枝鎖アルキル、炭素数３〜６のシクロアルキル、炭素数２〜６／二重結合数１または２のアルケニル、炭素数２〜６／三重結合数１または２のアルキニルであり；Ｂは水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容し得るその塩、ＣＯＯＲ₈、ＣＯＮＲ₉Ｒ₁₀、−ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＯＲ₁₁、ＣＨ₂ＯＣＯＲ₁₁、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ₁₂ ）₂、ＣＨＯＲ₁₃Ｏ、−ＣＯＲ₇、ＣＲ₇（ＯＲ₁₂）₂、またはＣＲ₇ＯＲ₁₃Ｏであり、Ｒ₇は炭素数１〜５のアルキル、シクロアルキルまたはアルケニルであり、Ｒ₈は炭素数１〜１０のアルキル、炭素数５〜１０のシクロアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₉およびＲ₁₀はそれぞれ水素、炭素数１〜１０のアルキル、炭素数５〜１０のシクロアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₁₁は炭素数１〜１０のアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₁₂は低級アルキルであり、Ｒ₁₃は炭素数２〜５の２価アルキルである。］。７．活性化合物の式において、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₆はメチルであり、Ｒ_RおよびＲ₅は水素であり、−Ａ−ＢはＣＯＯＲ₈である請求項６記載の方法。８．Ｒ₈は水素である請求項７記載の方法。９．ＣＯＯＲ₈基はチオフェン環の４位に存在する請求項８記載の方法。１０．ＣＯＯＲ₈基はチオフェン環の５位に存在する請求項８記載の方法。１１．レチノイド様生物学的活性を有する活性化合物の有効量を含有する薬剤組成物を、腫瘍を有するヒトを包含する哺乳動物に、腫瘍細胞のアポプトシスを誘導し、それにより腫瘍を処置する目的で投与する方法であって、該化合物は、ＲＸＲレセプターへの結合を４−（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ− ３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］安息香酸と比較するアッセイにおいて示されるように［該アッセイにおいて、前記活性化合物も、４−（Ｅ）−２−（５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８, ８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］安息香酸も、ＲＸＲレセプターの作働剤として作用する］、ＲＸＲレチノイドレセプター作働剤であるという生物学的性質を有する方法。１２．哺乳動物に、１日当たり約０.０１〜１００mg／kg体重の活性化合物を全身的に投与する請求項１１記載の方法。１３．哺乳動物に、１日当たり約０.１〜１０mg／kg体重の活性化合物を全身的に投与する請求項１２記載の方法。１４．活性化合物は、ＲＡＲレセプターに対する結合をトランスレチノイン酸と比較するアッセイにおいて、ＲＡＲレセプター作働剤として顕著な活性を示さないという生物学的性質をも有する請求項１２記載の方法。１５．腫瘍を有する哺乳動物において腫瘍細胞のアポプトシスを誘導するのに適当な薬剤組成物であって、薬学的に許容し得る賦形剤、およびＲＸＲレチノイドレセプター作働剤であるという生物学的性質を有する活性化合物を含有する薬剤組成物。１６．活性化合物の濃度は、約０.００１〜５重量％である請求項１５記載の薬剤組成物。１７．活性化合物は、ＲＡＲレチノイドレセプターと比較してＲＸＲレチノイドレセプターに特異的な作働剤である請求項１５記載の薬剤組成物。１８．活性化合物は下記式で示される請求項１５記載の薬剤組成物：［式中、Ｒ₁は低級アルキル、Ｃl、ＢrまたはＩであり；Ｒ₂はＨ、低級アルキル、Ｃl、ＢrまたはＩであり；Ｒ₃は低級アルキル、Ｃl、Ｂr、Ｉ、ＯＲ₁₁、ＳＲ₁₁、ＯＣＯＲ₁₁、ＳＣＯＲ₁ ₁ 、ＮＨ₂、ＮＨＲ₁₁、Ｎ（Ｒ₁₁）₂、ＮＨＣＯＲ₁₁またはＮＲ₁₁−ＣＯＲ₁₁であり；Ｒ₅はそれぞれＨ、低級アルキルＣl，Ｂr，Ｉ低級アルコキシまたは低級チオアルコキシ（炭素数１〜６）であり；Ｒ₆はそれぞれ、Ｈまたは低級アルキルであり；Ａは（ＣＨ₂）n（nは０〜５）、炭素数３〜６の低級分枝鎖アルキル、炭素数３〜６のシクロアルキル、炭素数２〜６／二重結合数１または２のアルケニル、炭素数２〜６／三重結合数１または２のアルキニルであり；Ｂは水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容し得るその塩、ＣＯＯＲ₈、ＣＯＮＲ₉Ｒ₁₀、−ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＯＲ₁₁、ＣＨ₂ＯＣＯＲ₁₁、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ₁₂ ）₂、ＣＨＯＲ₁₃Ｏ、−ＣＯＲ₇、ＣＲ₇（ＯＲ₁₂）₂、またはＣＲ₇ＯＲ₁₃Ｏであり、Ｒ₇は炭素数１〜５のアルキル、シクロアルキルまたはアルケニルであり、Ｒ₈は炭素数１〜１０のアルキル、炭素数５〜１０のシクロアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₉およびＲ₁₀はそれぞれ水素、炭素数１〜１０のアルキル、炭素数５〜１０のシクロアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₁₁は炭素数１〜１０のアルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ₁₂は低級アルキルであり、Ｒ₁₃は炭素数２〜５の２価アルキルである。］。１９．活性化合物の式において、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₈はメチルであり、Ｒ₂およびＲ₅は水素であり、−Ａ−ＢはＣＯＯＲ₈である請求項１８記載の薬剤組成物。２０．Ｒ₈は水素である請求項１９記載の薬剤組成物。２１．ＣＯＯＲ₈基はチオフェン環の４位に存在する請求項２０記載の薬剤組成物。２２．ＣＯＯＲ₈基はチオフェン環の５位に存在する請求項２０記載の薬剤組成物。