PT800503E - Novos compostos retinoides trienoicos e metodos - Google Patents

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Alex M Nadzan
Marcus F Boehm
Youssef L Bennani
Lin Zhang
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Description

84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ DESCR1CÃQ "Novos compostos retinóides trienóicos e métodos" Âmbito do Invento O presente invento refere-se a compostos possuindo actividade sobre receptores de ácido retinóico e receptores de retinóides X, e à utilização terapêutica dos referidos compostos.
Antecedentes do Invento 0 metabolito da vitamina A, ácido retinóico, é desde há muito reconhecido como induzindo um largo espectro de efeitos biológicos. Além disso, foi sintetizada uma diversidade de análogos estruturais do ácido retinóico que também se verificou serem bioactivos. Alguns, tais como Retin-A® e Accutane®, mostraram utilidade como agentes terapêuticos para o tratamento de diversas condições patológicas. Além disso, verificou-se que os retinóides sintéticos imitam muitas das acções farmacológicas do ácido retinóico.
Os profissionais médicos ficaram muito interessados nas aplicações terapêuticas dos retinóides. De entre as suas utilizações aprovadas pela FDA encontra-se o tratamento de formas graves de acne e de psoríase. Também existe um grande conjunto de evidências de que estes compostos possam ser utilizados para deter e, até certo ponto, reverter os efeitos de lesão cutânea que surgem a partir da exposição prolongada ao sol. Existe outra evidência de que estes compostos possam ser úteis no tratamento e na prevenção de uma diversidade de condições cancerosas e pré-cancerosas, tais como melanoma, cancro cervical, algumas formas de leucemia, leucoplasia oral e carcinomas de células basais e escamosas. Os retinóides também mostraram uma capacidade de serem eficazes no tratamento e na prevenção de doenças do olho, do sistema cardiovascular, do sistema imunitário, da pele, dos aparelhos respiratório e digestivo, e como agentes para facilitar a cicatrização de feridas e para modular a morte celular programada (apoptose).
Uma perspectiva importante do mecanismo molecular da transdução do sinal do ácido retinóico foi alcançada em 1 988, quando foi demonstrado que um membro da super-família de receptores intracelulares de esteróides/hormona
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 2 tiroideia efectuava a transdução de um sinal do ácido retinóico. Evans, Science, 240:889-95 (1988); Giguere eta/., Nature, 330: 624-29 (1987); Petkovich et ai, Nature, 330: 444-50 (1987). Sabe-se actualmente que os retinóides regulam a actividade de duas sub-famílias distintas de receptores intracelulares; os Receptores de Ácido Retinóico (RAR) e os Receptores de Retinóides X (RXR), incluindo as suas isoformas, RARa, β, y e RXRa, β, y. A este respeito, um ligando de baixo peso molecular endógeno, o qual modula a actividade transcripcional dos RAR, é o ácido todo-frans-retinóico (ATRA), enquanto que um ligando endógeno para os RXR é o ácido 9-c/s-retinóico (9-c/s). Heyman et ai, Cell, 68:397-406 (1992) e Levin et ai, Nature, 355: 359-61 (1992).
Embora quer os RAR quer os RXR respondam ao ATRA in vivo, por causa da conversão in vivo de algum do ATRA em 9-c/s, os receptores diferem em alguns aspectos importantes. Primeiro, os RAR e os RXR são significativamente divergentes na estrutura primária (por ex., os domínios de ligação do ligando do RARa e do RXRa apenas apresentam 27% de identidade de aminoácidos). Estas diferenças estruturais encontram-se reflectidas nos diferentes graus relativos de capacidade de resposta dos RAR e dos RXR a diversos metabolitos da vitamina A e a retinóides sintéticos. Além disso, são observados padrões de distribuição nos tecidos nitidamente diferentes para os RAR e para os RXR. Por exemplo, ao contrário dos RAR, os quais não se encontram expressos em níveis elevados nos tecidos viscerais, verificou-se que o ARNm do RXRa é o mais abundante no fígado, rim, pulmão, músculo e intestino. Finalmente, os RAR e os RXR apresentam diferente especificidade para o gene alvo. Por exemplo, foram recentemente identificados elementos de resposta nos genes para a proteína de ligação retiniana celular tipo II (CRBPII) e para a Apolipoproteína AI, os quais conferem capacidade de resposta ao RXR, mas não ao RAR. Mais, também se verificou recentemente que os RAR reprimem a activação mediada pelos RXR através do elemento de resposta CRBPII do RXR (Manglesdorf et ai, Cell, 66: 555-61 (1991)). Estes dados indicam que as duas vias de resposta do ácido retinóico não são simplesmente redundantes, mas que em vez disso manifestam uma interacção complexa.
Considerando a natureza relacionada, mas claramente distinta destes receptores, retinóides que sejam mais selectivos para a sub-família dos RAR ou para a sub-família dos RXR seriam de grande valor para controlar selectivamente
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ processos mediados por uma ou mais das isoformas de RAR ou de RXR, e proporcionariam a capacidade para o controlo independente dos processos fisiológicos mediados pelos RAR ou pelos RXR. Além disso, retinóides pan-agonistas que activem uma ou mais isoformas tanto dos RAR como dos RXR também seriam valiosos para o controlo de processos mediados por ambas estas sub-famílias de receptores de retinóides. Ademais, os retinóides, os quais preferencialmente afectam uma ou mais mas não todas as isoformas dos receptores, também oferecem a possibilidade de perfis de eficácia terapêutica aumentados e de efeitos colaterais reduzidos quando utilizados para aplicações terapêuticas.
Diversos compostos polieno foram descritos como sendo úteis no tratamento de condições inflamatórias, psoríase, reacções alérgicas, e para utilização como ecrãs solares em preparações cosméticas. Ver, por ex.. as Patentes dos E.U.A. Números 4 534 979, 4 193 931 e 5 320 833. Além disso, trienodiolatos de ácidos hexadienóicos mostraram ser úteis na síntese de ácidos retinóicos e nor-retinóicos. Ver, M. J. Aurell et al., 49, Tetrahedron, 6089 (1993). No entanto, não foi atribuída qualquer actividade retinóide a estes compostos.
Mais, a US-A-3 882 157 descreve fenil-heptadienoatos os quais são mencionados como sendo intermediários para a preparação de insecticidas. Os compostos conhecidos deste documento foram excluídos do âmbito da reivindicação 1 do produto presente através de uma excepção na reivindicação. 0 pedido de patente europeia EP-A-0 679 628, o qual é um documento de acordo com os Art. 54(3) e (4) do EPC, descreve compostos polieno bem como as composições farmacêuticas e cosméticas que os compreendem. Estas composições também são utilizadas no tratamento de doenças da pele. No entanto, os compostos descritos neste documento diferem dos compostos do presente invento porque o anel fenilo neles contido é não substituído nas posições 3 e 6 do anel (correspondendo aos resíduos presentes R1 e R4).
Sumário do Invento O presente invento proporciona novos compostos trienóicos que apresentam actividade selectiva sobre os RAR e os RXR ou actividade pan-agonista sobre uma ou mais de cada uma das isoformas de RAR e de RXR. O presente invento
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 4 também proporciona compostos retinóides marcados, composições farmacêuticas incorporando estes novos compostos trienóicos e a utilização terapêutica dos referidos compostos e composições farmacêuticas.
Estas e várias outras vantagens e características de novidade, as quais caracterizam o invento, são salientadas em particular nas reivindicações aqui anexadas e que formam uma parte do mesmo. No entanto, para uma melhor compreensão do invento, das suas vantagens, e dos objectivos obtidos pala sua utilização, deverá ser efectuada referência à matéria descritiva acompanhante, na qual se encontram ilustradas e descritas as concretizações preferidas do invento.
Definições
De acordo com o presente invento e tal como aqui utilizados, os termos seguintes são definidos com os significados seguintes, excepto se explicitamente estabelecido de outro modo. O termo alquilo refere-se a estruturas de cadeia linear, de cadeia ramificada ou cíclicas que são saturadas. Estas estruturas também podem ser não saturadas resultando desse modo estruturas alcenilo e alcinilo. Também são possíveis combinações das mesmas. O termo arilo refere-se a um anel aromático de seis elementos facultativamente substituído. O termo heteroarilo refere-se a um anel heterocíclico de cinco membros ou de seis membros facultativamente substituído, contendo um ou mais heteroátomos seleccionados a partir do grupo constituído por oxigénio, azoto e enxofre.
Os termos retinóide ou retinóides referem-se a compostos que se ligam e/ou activam um ou mais receptores de retinóides, desse modo afectando a actividade transcripcional de um gene alvo ao qual o receptor activado e o complexo do composto se ligam. O termo pan-agonista refere-se a um retinóide que activa pelo menos um membro tanto da sub-família RAR (isto é, RARa, RARp, ou RARy) como da
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 5 sub-família RXR (isto é, RXRcc, RXRp, ou RXRy). Preferencialmente os referidos retinóides pan-agonistas activam todos os membros de ambas as sub-famílias RAR e RXR de receptores de retinóides.
Tal como aqui utilizados, marcadores isotópicos ou radiomarcadores referem-se a substituintes marcados com deutério, trítio, carbono 13 e/ou carbono 14, incluindo, mas não se encontrando limitados a 14CH3, I3CH3, CD3, C3H3, e 13CD3.
Descricão retalhada de Concretizações do Invento
De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, foram desenvolvidos novos compostos trienóicos apresentando as fórmulas.
OU
00 em que: R1, R2 e R4, cada um independentemente, são hidrogénio, arilo, heteroarilo, CF3 ou um alquilo, alcenilo, alcinilo, fluoroalquilo ou perfluoroalquilo C2-C6, facultativamente substituídos com 14CH3, 13CH3, CD3, C3H3, e/ou 13CD3, desde que, no entanto, R' e R4 nos compostos de fórmula geral (I) não possam ser ambos hidrogénio; R3 e R5, cada um independentemente, são hidrogénio, CF3, um alquilo, alcenilo ou alcinilo C^Cg, um fluoroalquilo ou perfluoroalquilo C, a C3, ou OR6, onde R6 é hidrogénio, CF3, um alquilo, alcenilo ou alcinilo CVCj, ou um fluoroalquilo ou perfluoroalquilo C, a C2, desde que, no entanto, R1 e R5 não possam ser CF3 ou alquilo, alcenilo, alcinilo, fluoroalquilo ou perfluoroalquilo, quando R3 é CF3 ou alquilo, alcenilo, alcinilo, fluoroalquilo ou perfluoroalquilo; R7 é um alquilo, alcenilo ou alcinilo CrC4, facultativamente substituídos com 14CH3, 13CH3, CD3, C3H3, e/ou 13CD3 ou CH2OR8, onde R8 representa hidrogénio, um alquilo, alcenilo ou alcinilo C^-Cg, um cicloalquilo C3-C7 saturado ou não saturado facultativamente substituído com um alquilo, alcenilo ou
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 7 alcinilo CrC4, F, Cl, Br, I, OH, CF3, OR6, NR6, onde R6 tem a definição dada acima; R9 é um alquilo, alcenilo ou alcinilo C,-^; R10 a R15, cada um independentemente, são hidrogénio, um alquilo, alcenilo ou alcinilo C^Cg ou CF3; X é COOR16, CONHR17, ou CONR17R18, onde R16 representa hidrogénio ou um alquilo, alcenilo ou alcinilo CrC6, e onde R17 e R18, cada um independentemente, representam um alquilo, alcenilo ou alcinilo C^Cg, ou um arilo ou heteroarilo facultativamente substituídos com OH, F, Br, Cl ou I, desde que, no entanto, R17 e R18 não possam ser ambos um arilo ou heteroarilo; Y é C, O, S ou N, desde que, quando Y é O, então R14 e R15 não existam, e quando Y é N, então R14 e R15 não possam ser CF3, e quando Y é S, então R14 e R15 possam independentemente ou em conjunto representar O, ou possam estar ambos ausentes; W é N ou CR16, onde R16 tem a mesma definição dada acima; R19 é um arilo ou heteroarilo facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, F, Cl, Br, I ou um alquilo, alcenilo ou alcinilo C,-Cs, em que X tem a mesma definição dada acima; n é 0, 1 ou 2; as linhas tracejadas designam ligações duplas facultativas; as linhas onduladas representam ligações carbono-carbono quer nas configurações cis quer trans, desde que, no entanto, quando R1, R2, R4 e R5 são todos hidrogénio, então R3 não possa ser arilo; e desde que no máximo três de entre R1, R2, R3, R4 e R5 possam ser hidrogénio, quando não existe qualquer ligação dupla adjacente a R7. 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 8
Preferencialmente, R1, R2 e R4 independentemente representam alquilos, alcenilos, alcinilos, fluoroalquilos ou perfluoroalquilos ramificados C3-C6, mais preferencialmente R2 e R4 independentemente representam alquilos, alcenilos, alcinilos, fluoroalquilos ou perfluoroalquilos ramificados C3-C6, enquanto R1, R3 e R5 são todos hidrogénio, e o mais preferencialmente R2 e R4 são seleccionados a partir do grupo constituído por isopropilo, t-butilo e CF3, enquanto R1, R3 e R5 são todos hidrogénio.
Os compostos do presente invento também incluem todos os sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como ésteres, amidas e prodrogas. Preferencialmente, os referidos sais, ésteres e amidas, serão formados nas posições R16, R17 e/ou R18. Tal como utilizado nesta descrição, sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se encontram limitados a: piridina, amónio, piperazina, dietilamina, nicotinamida, fórmico, ureia, sódio, potássio, cálcio, magnésio, zinco, lítio, cinâmico, metilamino, metanossulfónico, pícrico, tartárico, trietilamino, dimetilamino, e tris(hidroximetil)aminometano. Sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais são bem conhecidos dos peritos na arte.
Os compostos do presente invento exibem actividade retinóide e são particularmente úteis no tratamento de doenças relacionadas com a pele, incluindo, sem limitação, queratose actínica, queratose arsenical, acne inflamatório e não inflamatório, psoríase, ictiose e outras desordens da queratinização e hiperproliferativas da pele, eczema, dermatite atópica, doença de Darriers, líquen plano, prevenção e reversão da lesão por glucocorticóides (atrofia por esteróides), como um antimicrobiano tópico, como agentes da pigmentação cutânea e para tratar e reverter os efeitos da idade e da foto-lesão na pele. Os compostos também são úteis para a prevenção e tratamento de condições cancerosas e pré-cancerosas, incluindo, doenças hiperproliferativas pré-malignas e malignas tais como cancros da mama, pele, próstata, cervical, do útero, do cólon, da bexiga, do esófago, do estômago, do pulmão, da laringe, da cavidade oral, do sangue e do sistema linfático, metaplasias, displasias, neoplasias, leucoplaquias e papilomas das membranas mucosas e no tratamento do sarcoma de Kaposi. Além disso, os compostos presentes podem ser utilizados como agentes para tratar doenças do olho, incluindo, sem limitação, vitreo-retinopatia proliferativa (PVR), descolamento da retina, secura ocular e outras corneopatias, bem como no tratamento e prevenção de diversas doenças
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 9 cardiovasculares, incluindo, sem limitação, doenças associadas com o metabolismo dos lípidos tais como dislipidémias, prevenção da estenose recidiva e como um agente para aumentar o nível de activador do plasminogénio tissular (TPA) circulante.
Outras utilizações para os compostos do presente invento incluem a prevenção e o tratamento de condições e doenças associadas com o vírus do papiloma humano (HPV), incluindo verrugas e verrugas genitais, diversas doenças inflamatórias tais como fibrose pulmonar, ileíte, colite e doença de Krohn, doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), função pituitária inadequada, incluindo produção insuficiente de hormona de crescimento, modulação da apoptose, incluindo quer a indução da apoptose quer a inibição da apoptose activada por células T, restauração do crescimento capilar, incluindo terapias de combinação com os compostos presentes e outros agentes como o Minoxidil®, doenças associadas com o sistema imunitário, incluindo a utilização dos compostos presentes como imunossupressores e imunoestimulantes, modulação da rejeição de transplantes de órgãos e facilitação da cicatrização de feridas, incluindo modulação da quelose. Deverá também ser compreendido pelos peritos na arte que os compostos retinóides do presente invento se mostrarão úteis em qualquer terapia na qual retinóides, incluindo retinóides selectivos para RAR, retinóides selectivos para RXR, e retinóides pan-agonistas, encontrem aplicação.
Ademais, será compreendido pelos peritos na arte que os compostos do presente invento, incluindo composições e formulações farmacêuticas contendo estes compostos, podem ser utilizados numa ampla variedade de terapias de combinação a fim de tratar as condições e doenças descritas acima. Assim, os compostos do presente invento podem ser utilizados em combinação com outras terapias, incluindo, sem limitação, agentes quimoterapêuticos tais como agentes citostáticos e citotóxicos, modificadores imunológicos tais como interferões, interleucinas, hormonas de crescimento e outras citóquinas, terapias hormonais, cirurgia e terapia por radiação.
Compostos representativos do presente invento incluem, sem limitação, (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo; (2£,4£,6Z)-7-{3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo; ácido 10 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Ζ)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; (2£,4£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4-dienoato de etilo; ácido (2£,4£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4-dienóico; (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienoato de etilo; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico; (2£,4£,6£)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo; (2£,4£,6Z)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo; ácido (2£,4£,6£)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-nnetil-hexa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-trifluorometilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-ditrifluorometilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-isopropilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-isopropilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butil-4-metoxifenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butil-4-metoxíf 6011)0013-2,4,6-10600100; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-(3,4-dietilfenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-3-metil-7-(3,4-dietilfenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butil-4-etoxifenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-(3,4-di-t-butilfenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-ciclo-hexil-7-(3,5-di-t-butilfenil)-hepta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butilfenil)nona-2,4,6-trienóico; e ácido (2£,4£,6Z)-3-metil-7-(3,4-dietil-6-metilfenil)nona-2,4,6-trienóico.
Os compostos do presente invento podem ser obtidos pelos peritos na arte por síntese química de rotina, por ex., por modificação dos compostos descritos ou por uma abordagem sintética total. A este respeito, a síntese dos compostos do presente invento segue técnicas e esquemas de síntese de retinóides bem estabelecidas tal como descritas em Μ. I. Dawson e W.H. Okamura, "Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids", Capítulos 3, 8, 14 e 16, CRC Press, Inc., Florida (1990); Μ. I. Dawson e P. D. Hobbs, The Synthetic Chemistry of Retinoids, no Capítulo 2: "The Retinoids, Biology, Chemistry and Medicine", Μ. B. Sporn et a!., Ed. (2a edição), Raven Press, Nova Iorque, pág. 5-178 (1994) e R. S. H. Liu e A. E. Asato, "Photochemistry and Synthesis of Stereoisomers of Vitamin A", 40 Tetrahedron, 1931 (1984), cujas descrições são aqui incorporadas por referência. A sequência de passos nos métodos gerais de síntese dos compostos do presente invento encontram-se representados abaixo. Além disso, esquemas sintéticos mais detalhados e ilustrativos para 11 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ compostos específicos do presente invento serão encontrados nos Exemplos aqui incluídos. Método Geral 1
R1 O
R4 A
(CH2CH20)«PCCH2CN NaH
Ditai
,CN
„.CHO / CC-jEí
No Método Geral 1, os compostos do presente invento podem ser preparados por tratamento de uma arilcetona A com um fosfonato, tal como dietilcianometilfosfonato, a fim de originar o nitrilo B, seguido por redução de B (onde as ligações simples ou duplas facultativas são ilustradas com linhas tracejadas) na presença de um agente redutor, tal como hidreto de di-isobutilalumínio (Dibal) a fim de proporcionar o aldeído C. Os isómeros cis e trans do aldeído C podem ser separados nesta etapa por meio de cromatografia em camada fina (TLC), ou de outros processos conhecidos dos peritos na arte. Estes aldeídos C separados são de seguida tratados com um fosfonato, tal como trietil-3-alquil-4-fosfonocrotonato, a fim de originar os ésteres de trienoato D, os quais por sua vez podem ser saponificados sob condições básicas a fim de originar o ácido carboxílico E.
Alternativamente, utilizando o Método Geral 2, representado abaixo, o isómero cis do aldeído C pode ser preparado a partir do alcino F. Especificamente, o arilalcino F é preparado a partir da arilacetofenona A por
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 12 tratamento com um agente de fosforilação, tal como CIPO(EtO)2, na presença de uma base forte, tal como di-isopropilamida de lítio (LDA). O arilalcino F é de seguida tratado com uma fonte de nitrilo adequada, tal como PhOCN, na presença de uma base, tal como nBuLi, a fim de originar o nitrilo G, o qual é de seguida submetido a metilação redutora a fim de produzir exclusivamente o isómero cis do nitrilo B. O nitrilo B é de seguida reduzido ao aldeído C correspondente e homologado da mesma forma tal como descrita no Método Geral 1 acima a fim de produzir os compostos D e E. Método Geral 2
PhOCN nBuLi
Outros análogos de compostos do presente invento podem ser preparados por meio do Método Geral 3, primeiro por redução da ligação dupla do nitrilo B (onde as ligações simples ou duplas facultativas são ilustradas com linhas tracejadas) a fim de originar o nitrilo I. Em seguida o nitrilo I é reduzido na presença de Dibal a fim de produzir o aldeído J, o qual por sua vez é tratado com um fosfonato, tal como trietil-3-alquil-4-fosfonocrotonato, a fim de originar o éster de dienoato K. A saponificação do éster de dienoato K por meio de uma base, tal como KOH/MeOH, origina o ácido dienóico L. 13 34 395 !ΞΡ Ο 800 503/ΡΤ Método Geral 3
Homólogos radiomarcados dos compostos do presente invento podem ser preparados pelo Método Geral 4 representado abaixo. Especificamente, o composto A é oxidado no éster de metilo B, o qual é de seguida reduzido com uma fonte de hidreto de trítio, tal como LiAI3H4, no álcool C. A oxidação do álcool tritiado C no aldeído D, seguida por condensação com o ileto de trietilfosfonocrotonato origina o éster tritiado E. O éster E pode de seguida ser saponificado a fim de originar o ácido marcado com trítio final F com rendimento elevado e com actividade específica elevada (> 20 Ci/mmol). Esta metodologia é descrita com detalhe em Boehm et a/., "Synthesis of High Specific Activity [ 3H]-9-c/s-Retinoic Acid and Its Application for Identifying Retinoids with Unusual Binding Properties", 37 J. Med. Chem.. 408-414 (1994), cuja descrição é aqui incorporada por referência.
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 14 Método Geral 4: Preparação de Homólogos Radiomarcados
Será compreendido pelos peritos na arte que podem ser efectuadas certas modificações aos métodos descritos acima, que permanecem dentro do âmbito do presente invento. Por exemplo, os compostos do presente invento também podem ser produzidos sob a forma das amidas ou ésteres correspondentes, fosforanos apropriados podem substituir os fosfonatos, e agentes redutores outros que não LiAI3H4 podem ser utilizados na síntese delineada acima. Ademais, será compreendido que podem ser empregues outros marcadores isotópicos, incluindo 13CH3, ,3CD3 e similares. Estes marcadores podem ser introduzidos utilizando o MeLi marcado apropriado (por ex., 13CH3Li) tal como representado no Esquema 1. Em seguida, o resto da síntese é tal como representada no Esquema 1.
Num outro aspecto, os compostos retinóides, os seus sais ou ésteres hidrolizáveis farmaceuticamente aceitáveis do presente invento são combinados numa mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável a fim de proporcionar composições farmacêuticas úteis para o tratamento das condições ou desordens biológicas aqui anotadas em espécies de mamíferos, e mais preferencialmente, em doentes humanos. O transportador particular empregue nestas composições farmacêuticas pode assumir uma ampla variedade de
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 15 formas dependendo do tipo de administração desejada, por ex., endovenosa, oral, tópica, por supositório ou parentérica.
Na preparação das composições sob formas de dosagem líquida oral (por ex., suspensões, elixires e soluções), podem ser empregues meios farmacêuticos típicos, tais como agua, glicóis, óleos, álcoois, agentes saborizantes, conservantes, agentes corantes e seus similares. De modo semelhante, aquando da preparação das formas de dosagem sólida oral (por ex., pós, comprimidos e cápsulas), serão empregues transportadores tais como amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e seus similares. Dada a sua facilidade de administração, os comprimidos e as cápsulas representam a forma de dosagem oral mais vantajosa para as composições farmacêuticas do presente invento.
Para administração parentérica, o transportador compreenderá tipicamente água estéril, embora outros ingredientes que auxiliam a solubilização ou servem como conservantes também possam ser incluídos. Mais, também podem ser preparadas suspensões injectáveis, sendo neste caso empregues transportadores líquidos apropriados, agentes de suspensão e seus similares.
Para administração tópica, os compostos do presente invento podem ser formulados utilizando bases molhantes suaves, tais como unguentos ou cremes. Exemplos de bases de unguento adequadas incluem vaselina, vaselina mais silicones voláteis, lanolina, e água em emulsões oleosas tais com Eucerin™ (Beiersdorf). Exemplos de bases de creme adequadas são Creme Nivea™ (Beiersdorf), creme frio (USP) Purpose Cream™ (Johnson & Johnson), unguento hidrofílico (USP), e Lubriderm™ (Warner-Lambert).
As composições farmacêuticas e os compostos do presente invento serão geralmente administrados sob a forma de uma unidade de dosagem (por ex., comprimido, cápsula, etc.) desde cerca de 1 Lig/kg de peso corporal até 500 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente desde cerca de 10 μg/kg a 250 mg/kg, e o mais preferencialmente desde cerca de 20 pg/kg a 100 mg/kg. Tal como reconhecido pelos peritos na arte, a quantidade particular de composição farmacêutica de acordo com o presente invento administrada a um doente
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 16 dependerá de um certo número de factores, incluindo, sem limitação, a actividade biológica desejada, o estado do doente, e a tolerância para a droga.
Os compostos deste invento também apresentam utilidade quando marcados e utilizados em ensaios para a determinação da presença de RAR e de RXR. São particularmente úteis dada a sua capacidade para selectivamente se ligarem a membros das sub-famílias de RAR e de RXR e podem consequentemente ser utilizados a fim de determinar a presença de isoformas de RAR e de RXR na presença de outros receptores de retinóides ou de receptores intracelulares relacionados.
Assim, o presente invento também proporciona compostos marcados isotopicamente e radiomarcados, e métodos para a sua síntese, incluindo homólogos marcados com deutério, trítío, carbono 13 e carbono 14. Num aspecto preferido, os compostos marcados do presente invento exibem uma actividade específica de pelo menos 15 Ci/mmol, e mais preferencialmente de pelo menos 25 Ci/mmol, e o mais preferencialmente de pelo menos 40 Ci/mmol. Os referidos compostos marcados também se mostram úteis na identificação de metabolitos do composto em estudos de metabolismo animal.
Dada a especificidade selectiva dos compostos deste invento para os receptores de retinóides, estes compostos também podem ser utilizados para purificar amostras de RAR e RXR in vitro. A referida purificação pode ser levada a cabo por mistura de amostras contendo receptores de retinóides com um ou mais dos compostos do presente invento, de modo que o composto (ligando) se liga ao receptor, e em seguida separação da combinação de ligando ligado/receptor por técnicas de separação as quais são conhecidas pelos peritos na arte. Estas técnicas incluem separação em coluna, filtração, centrifugação, "rotulagem" e separação física, e formação de complexos com anticorpos, entre outras.
Os compostos do presente invento também incluem racematos, estereoisómeros individuais e suas misturas. Estes isómeros são de seguida isolados por técnicas de resolução Standard, incluindo cristalização fraccionada e cromatografia em coluna quiral.
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Os compostos e composições farmacêuticas do presente invento podem ser vantajosamente utilizados no tratamento das doenças e condições aqui descritas. A este respeito, os compostos e composições mostrar-se-ão particularmente úteis no tratamento de doenças e condições relacionadas com a pele, tais como acne, psoríase, e foto-lesão, condições cancerosas e pré-cancerosas, doenças do olho, doenças cardiovasculares, doenças inflamatórias e neurodegenerativas, doenças associadas com o vírus do papiloma humano, função pituitária inadequada, modulação da apoptose, doenças do sistema imunitário, cicatrização de feridas e restauração do crescimento capilar.
Mais, os compostos e composições farmacêuticas do presente invento possuem um certo número de vantagens sobre os compostos retinóides anteriormente identificados. Por exemplo, os compostos são activadores extremamente potentes dos RAR e dos RXR tal como demonstrado no ensaio de cotransfecção aqui adicionalmente descrito, preferencialmente exibindo 50% da activação máxima (isto é, EC50) de um ou mais dos receptores de retinóides numa concentração inferior a 100 nM, mais preferencialmente numa concentração inferior a 50 nM, mais preferencialmente ainda numa concentração inferior a 20 nM, e o mais preferencialmente numa concentração inferior a 10 nM. Da mesma forma, os compostos selectivos para RAR e RXR do presente invento activam preferencialmente uma sub-família de receptores de retinóides a um nível de potência pelo menos 2 vezes superior, preferencialmente pelo menos 5 vezes superior, mais preferencialmente pelo menos 10 vezes superior, e o mais preferencialmente a um nível de potência pelo menos 100 vezes superior do que as outras sub-famílias de receptores de retinóides. Além disso, os compostos do presente invento também são mais fáceis de sintetizar, proporcionam maior estabilidade e biodisponibilidade, e parecem ser menos teratogénicos em comparação com o ácido todo-trans retinóico e o ácido 9-c/s retinóico, compostos conhecidos activos sobre os RAR e RXR, respectivamente. O invento será adicionalmente ilustrado por referência aos Exemplos seguintes não limitativos. 18 34 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ EXEMPLOS 1-2 Ácido (2Ε, 4Ε, efJ-V-O^-di-t-butilfeniD-S-metilocta^^.e-trienóico (9) e ácido (2Ε, 4Ε, 6Z)-7-(3,5-di-t-butílfenil)-3-metilocta-2f4,6-trienóico (10), preparados de acordo com o Esquema 1 ilustrado e descrito abaixo.
Esquema 1
MeU (2 eq.) THF. -7Í-TA rendimento de 76%
j· ,CN (CKCrtâtzFOCHC.V ' NaH. THF. TA V1 I 1 XTs. 1 Cibal, ' CHfii,. -73° rendimento de 96% rendimento de 62% 9 trans 4 cis CCjEt
ri-cuU. iHF •7SaC - TA rendimento de 80% (cTOj^ocHCc:-^ CHCQEí
rendimento de 93% 7 trans 8 cis 5N KOH, MeOH refluxo
i 9 trans 10 ds S trans 8 cis 3.5-Di-t-butilacetofenona (2). A 20 g (85,5 mmol) de ácido 3,5-di-terc-butilbenzóico 1 em 100 ml de THF seco a -78°C, foram adicionados 94,0 ml (188,0 mmol) de uma solução 2N de MeU em éter. A mistura reaccional foi lentamente aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante um período adicional de 30 minutos, sendo de seguida vertida para NH4CI aquoso saturado (200 ml). 0 produto orgânico foi extractado com hexanos (2 x 100 ml), seco (MgSOJ, filtrado, concentrado e purificado por cromatografia (Si02, 2 EtOAc -hexanos) a fim de originar 15 g (64,7 mmol) da cetona 2 (rendimento de 75,7%); TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,8; 1H-NMR (CDCI3) Ô 1,39 (s, 18H, 6(CH3)), 2,61 (s, 3H, CH3), 7,64 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H), 7,80 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H). 3-(3.5-Di-t-butilfenil)but-2-enitrilo (3) (trans) e (4) (cis). A 2,43 g (13,7 mmol) de fosfonato de dietilcianometilo em 10 ml de THF seco, foram adicionados 440 19 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ mg (10,96 mmol) de NaH (60% em óleo mineral). A reacção foi agitada durante 30 min., seguida pela adição de 1,59 g (6,85 mmol) da cetona 2 em 5 ml de THF seco. Após agitação durante 1 2 h, a mistura foi extinta com NH4CI aquoso saturado (50 ml) e os produtos foram extractados com éter (2 x 50 ml). Os extractos em éter foram lavados (água, depois salmoura), secos (MgS04), filtrados, concentrados e purificados por TLC preparativa (Si02, EtOAc a 2,5% -hexanos) a fim de originar 1,1 g (4,4 mmol) do isómero trans 3 e 1 04 mg (0,4 mmol) do isómero cis 4 (rendimento combinado de 70%). Isómero trans 3: TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) R, 0,9; ’Η-NMR (CDCI3) δ 1,32 (s, 18H, 6(CH3)), 2,49 (s, 3H, CH3), 5,59 (s, 1H, =CH), 7,25 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7.50 (d, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). Isómero cis 4: TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,8; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,42 (s, 18H, 6(CH3)), 2,31 (s, 3H, CH3), 5,34 (s, 1 H, = CH), 7,39 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,49 (d, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)but-2-enal (5) (isómero trans). A 736 mg (2,89 mmol) de 3 em 5 ml de CH2CI2 a -78°C, foram adicionados 2,31 ml (3,47 mmol) de uma solução 1,5 M de DIBAL em tolueno. Após agitação durante 15 min. a -78°C, a mistura reaccional foi extinta com 10 ml de uma solução aquosa saturada de sal de Rochelle. O produto foi extractado com éter (2 x 20 ml), lavado (água, depois salmoura), seco (MgS04), filtrado, concentrado e purificado por cromatografia (Si02, EtOAc a 3% - hexanos) a fim de originar 462,3 mg (1,80 mmol) de 5 (rendimento de 62%); TLC (10% de EtOAc - 90% de hexanos) Rf 0,5; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 2,59 (s, 3H, CH3), 6.50 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, =CH), 7,39 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,51 (d, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H), 10,18 (d, J = 8,0 Hz, 1H, CHO). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)but-2-enal (6) (isómero cis). O isómero cis 6 foi preparado a partir do isómero cis correspondente 4 utilizando o mesmo método tal como descrito para 5: TLC (10% de EtOAc - 90% de hexanos) Rf 0,55; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 2,34 (s, 3H, CH3), 6,12 (d, J = 8,0 Hz, 1H, = CH), 7,10 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,46 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H), 9,45 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, CHO). (2E. 4£, 6£)-7-(3r5-Di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (7), A 790 mg (3,0 mmol) de trietil-3-metil-4-fosfonocrotonato em 8 ml de THF seco a -78°C, foram adicionados 1,2 ml de uma solução 2,5 M de nBuLi em hexanos.
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 20
Após agitação durante 15 min., a solução contendo o ileto de trietilfosfonocrotonato foi adicionada a 258 mg (1,0 mmol) do isómero trans 5 em 8 ml de THF seco a -78°C. A mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente (TA), extinta com NH4CI aquoso saturado (20 ml) e os produtos foram extractados com éter (2 x 50 ml). Os extractos em éter foram lavados (água, depois salmoura), secos (MgSOJ, filtrados, concentrados e purificados por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 5% - hexanos) a fim de originar 294 mg (0,8 mmol) do isómero Ε,Ε,Ε de 7 (rendimento de 49%): TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,78; Ή-NMR (CDCI3) δ 1,30 (t, J = 7,7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 2,28 (s, 3H, CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 4,17 (m, 2H, CH2CH3), 5,82 (s, 1H, =CH), 6,40 (d, J = 1 5 Hz, 1H, =CH), 6,54 (d, J = 15 Hz, 1H, = CH), 7,04 (m, 1H, =CH), 7,21 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,39 (d, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H). (2E, 4£~, 6Z)-7-(3,5-Di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4.6-trienoato de etilo (8). O isómero 2E, 4E, 6Z 8 foi preparado da mesma maneira que o isómero 2E, 4E, 6E 7, excepto que foi utilizado 6 no lugar do 5: TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,82; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,27 (t, J = 7,7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 2,17 (s, 3H, CH3), 2,22 (s, 3H, CH3), 4,15 (m, 2H, CH2CH3), 5,74 (s, 1 H, = CH), 6,26 (dd, J = 8 Hz, 2H, =CH), 6,80 (m, 1H, =CH), 7,10 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,37 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). Ácido (2£~, 4£, 65)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2.4,6-trienóico (9). A 180 mg (0,49 mmol) do 2E, 4E, 6£-éster de etilo 7 em 5 ml de MeOH, foi adicionado 1 ml de uma solução aquosa 5N de NaOH. A mistura foi aquecida em refluxo durante 10 min., arrefecida até à temperatura ambiente (TA), acidificada com solução aquosa de HCI a 20%, e os orgânicos foram extractados com éter (2x10 ml). A camada em éter foi lavada (H20, salmoura), seca (MgS04), filtrada e concentrada. A purificação por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 20% - hexanos) originou 157 mg (0,46 mmol) do isómero 2E, 4E, 6E de 9 (rendimento de 93%); TLC (10% de MeOH - 90% de CHCI3) Rf 0,6; pf 1 96-1 98°C; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,35 (s, 18H, 6(CH3)), 2,29 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 5,84 (s, 1H, =CH), 6,41 (d, J = 15 Hz, 1H, =CH), 6,54 (d, J = 15 Hz, 1H, =CH), 7,08 (m, 1H, =CH), 7,32 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,39 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H).
21 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ Ácido (2£, 4£, 6Z)-7-(3.5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2.4.6-trienóico (10), Ο isómero 2Ε, 4Ε, 6Ζ 10 foi preparado da mesma maneira que 9, excepto que foi utilizado 8 no lugar de 7: TLC (10% de MeOH - 90% de CHCI3) R, 0,57; pf 221-222°C; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 2,18 (s, 3H, CH3), 2,23 (s, 3H, CH3), 5,77 (s, 1 H, =CH), 6,27 (m, 2H, = CH), 6,84 (m, 1H, =CH), 7,10 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,37 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H). EXEMPLO 3 Ácido (2£, 4£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4-dienóico (14), preparado de acordo com o Esquema 2 ilustrado e descrito abaixo.
Esquema 2
^CN 10% Póc ri2. EtOAc ! 39%
i
Dibaí, C,S2C/3 -73 3 c
rendimento de 62% 11 (Γ CC->£í
13 12
14 (ETO)2pCCH2CCHf= CHC0;êt_
rbBuU, THF
•78 °C- TA rendimento de 80% 3-(3,5-Di-t-butilfenil)butanitrilo (11). A 300 mg (1,18 mmol) de 3-(3,5-di-t-butilfenil)-but-2-enitrilo 3 em 5 ml de EtOAc, foram adicionados 20 mg (quantidade catalítica) de Pd a 10%/C. A mistura foi colocada sob vácuo durante 0,5 min., seguida pela adição de gás H2. Após agitação durante 2 h sob o gás H2, a solução foi filtrada através de celite, a celite foi lavada com EtOAc (3 x 5 ml) e a solução foi concentrada a fim de originar 300 mg (1,17 mmol) do produto reduzido 11 (rendimento de 99%): TLC (5% de EtOAc - 95% de
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ hexanos) Rf 0,8; Ή-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 18Η, 6(CH3)), 1,50 (d, 3H, CH3), 2,60 (m, 2H, CH2), 3,15 (m, 1H, CH), 7,05 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,33 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)butanal (12). A 300 mg (1,17 mmol) do nitrilo 11 em 5 ml de CH2CI2 a -78°C, foram adicionados 0,93 ml (1,4 mmol) de uma solução 1,5 M de DIBAL em tolueno. A mistura reaccional foi agitada durante 5 min., extinta com NH4CI aquoso saturado (10 ml), extractada com éter (2 x 20 ml), seca (MgS04), filtrada, concentrada e purificada por cromatografia (Si02, EtOAc a 5% - hexanos) a fim de originar 188 mg (0,72 mmol) do aldeído desejado 12 (rendimento de 62%): TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,8; ^-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,35 (d, 3H, CH3), 2,70 (m, 2H, CH2), 3,36 (m, 1 H, CH), 7,06 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,28 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H), 9,70 (t, 1 H, CHO). (2E, 4£)-7-(3,5-Di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4-dienoato de etilo (13). O composto 13 foi preparado a partir do 12 duma maneira semelhante à descrita para o composto 7: TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,88; ^-NMR (CDCI3) δ 1,30 (m, 6H, CH2CH3 + CH3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 2,20 (s, 3H, CH3), 2,40 (m, 2H, CH2), 2,85 (m, 1H, CH), 4,14 (m, 2H, CH2CH3), 5,62 (s, 1 H, = CH), 6,03 (m, 2H, =CH), 7,00 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,24 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H). Ácido 12E, 4£)-7-(3.5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2.4-dienóico (14). O composto 14 foi preparado a partir do 13 duma maneira semelhante à descrita para o composto 9: TLC (10% de MeOH - 90% de CHCI3) Rf 0,5; pf 127-128°C; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,28 (d, J = 8 Hz, 3H, CH3), 1,32 (s, 18H, 6(CH3)), 2,23 (s, 3H, CH3), 2,46 (m, 2H, CH2), 2,86 (m, 1H, CH), 5,69 (s, 1H, =CH>, 6,10 (m, 2H, = CH), 7,01 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,26 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H). 23 84 395 ΙΕΡ Ο 800 503/ΡΤ EXEMPLO 4 Ácido (2Ε, 4Ε, 6Z)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (-jq), preparação alternativa do Composto (10) de acordo com o Esquema 3 ilustrado s descrito abaixo.
Esquema 3 1. LDA, TrIF, -73-0 3C 2. ClPC(EiQ) ?. -73°C-TA 2. LDA TrIF, -73 aC-TA 4. H20, rendimento de 69%
1. nôuU, THF. -73 C 2. PhCCN. -73 3C-TA rendimento de 92% 15
Cul, CH2U, THF 0-73 3C rendimento de 95%
CN
rendimento de 62%
-78 3 C
CHC ho2c \
EtO,C
5iV KOH, ΜθΟΗ refluxo rendimento de 91% rE70;2^0CH2CCHj=
CHCO^B
n-ãuLi, THF -78 °C - TA rendimento de 80%
1.3-Di-t-butil-5-etinilbenzeno (15). A 9,86 ml (24,7 mmol) de uma solução 2,5 N de LDA em THF a -78°C, foram adicionados 4,75 g (20,47 mmol) da cetona 2 (dos Exemplos 1-2) em 3 ml de THF seco. Após agitação durante 30 min., foram adicionados 2,96 ml (20,47 mmol) de cloreto de dietilfosfonilo e a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente (TA) durante 1 h. A
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 24 mistura reaccional foi novamente arrefecida até -78°C seguida pela adição de 19,7 ml (49,2 mmol) de uma solução 2,5 N de LDA em THF e aquecida até à TA. Foi adicionada água (50 ml) e a mistura foi extractada com hexanos (2 x 40 ml). O extracto orgânico combinado foi lavado (água, depois salmoura), seco (MgSOJ, filtrado, concentrado e purificado por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 2% - hexanos) a fim de originar 3,02 g (14,1 mmol) do composto 15 (rendimento de 69%): TLC (hexanos) R, 0,9; Ή-NMR (CDCI3) δ 1,31 (s, 18H, 6(CH3)), 3,02 (s, 1H, C=CH), 7,35 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,42 (t, J=1 Hz, 1H, Ar-H). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)propinitrilo (16). A 1,67 g (7,80 mmol) do propino 15 em 25 ml de THF seco a -78°C, foram adicionados 3,75 ml (9,38 mmol) de nBuLi (2,5 M em hexanos). Após agitação durante 15 min., foram adicionados 1,12 g (9,41 mmol) de PhOCN e a mistura reaccional foi aquecida até à TA. A mistura foi extinta pela adição de 25 ml de NaOH aquoso 6 N, extractada (EtOAc, 2 x 25 ml), lavada (água, depois salmoura), seca (MgSOJ, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 5% - hexano) a fim de originar 1,71 g (7,16 mmol) de 16 sob a forma de um sólido branco (rendimento de 92%): TLC (hexanos) Rf 0,4; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,32 (s, 18H, 6(CH3)), 7,45 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,58 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)but-2-enitrilo (4) (isómero cis). Um balão de fundo redondo de 250 ml seco à chama foi carregado com 3,27 g (17,17 mmol) de iodeto de cobre anidro e 25 ml de THF seco. A mistura foi arrefecida até 0°C, seguida pela adição lenta de 24,5 ml (34,3 mmol) de MeLi (1,4 M em éter). Depois da solução se tornar límpida e incolor, foi arrefecida até -78°C e uma solução de 1,71 g (7,16 mmol) de 16 em 10 ml de THF seco foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada a -78°C durante 45 min., e extinta com 40 ml de uma mistura a 1:1 de MeOH e solução aquosa saturada de NH4CI. 0 produto foi extractado com EtOAc (2 x 40 ml), lavado (NaOH a 2%, seguido por NH4CI sat., depois água, depois salmoura), seco (MgS04), filtrado, concentrado e purificado através de uma almofada de gel de sílica curta a fim de originar 1,64 g (6,80 mmol) do isómero cis 4 (rendimento de 95%): TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,8; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,42 (s, 18H, 6(CH3)), 2,31 (s, 3H, CH3), 5,34 (s, 1 H, =CH), 7,39 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,49 (d, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H).
34 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 25 A restante síntese dos Compostos 6, 8 e do produto final 10 foi executada tal como descrito nos Exemplos 1-2 acima. EXEMPLOS 5-6 Ácido (2£, 4E, 6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico (27) e ácido (2E, 4E, 6Z)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico (28), preparados de acordo com o Esquema 4 ilustrado e descrito abaixo.
Esquema 4
1
UAIHs, THF -78°C-TA rendimento de 94% QH MnOy CHfi!} ^ TA, rendimento de 95%
PrMgCI, éter Ή o°Ç-TA rendimento de 98% 17 18
(CtyCHfltfOCtjÇN NaH. THF__ TA, refluxo rendimento de 75% 20
.CN
• -J 19 -78° C. rendimento de 83% 21 trans 22 cis /CQ,Et r
.CCfcH I
I
24CIS SNKOH.MeOH refluxo rendimento de 80%
27 trans 28 ds
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 26
Álcool 3,5-di-t-butilbenzilo (17). A 10,0 g (42,7 mmol) do ácido 1 em 20 ml de THF seco a 0°C, foram adicionados 42,7 ml (42,7 mmol) de LAH (1,0 M em THF). A mistura reaccional foi aquecida até 50°C e agitada durante15 minutos. Depois do arrefecimento da mistura reaccional até à TA, foi adicionado HCI aquoso a 20% até a solução se tornar límpida. A solução foi extractada com EtOAc (2 x 50 ml), e o extracto de EtOAc combinado foi lavado (água, depois salmoura), seco (MgSOJ, filtrado e concentrado a fim de originar 8,8 g (40,0 mmol) de 17 (rendimento de 94%): O produto foi utilizado directamente no passo seguinte. TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) Rf 0,4; ^-NMR (CDCI3) δ 1,33 (s, 18H, 6(CH3)), 4,68 (s, 2H, CH2), 7,22 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,38 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). 3,5-Di-t-butilbenzaldeído (18), A 8,8 g (40,0 mmol) do álcool 17 em 20 ml de CH2CI2, foram adicionados 50,0 g (575 mmol) de Mn02. A mistura reaccional foi vigorosamente agitada durante 8 h e filtrada através de uma almofada constituída por uma camada superior de celite e uma camada inferior de sílica. 0 filtro foi repetidamente lavado com alíquotas de 50 ml de CH2CI2 até não eluir mais produto a partir do filtro. Os compostos resultantes 18 (8,3 g (38,1 mmol)) foi determinado como sendo puro por 'H-NMR e foi utilizado directamente no passo seguinte (rendimento de 95%): TLC (20% de EtOAc -80% de hexanos) Rf 0,6; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 7,72 (m, 3H, Ar-H), 10,01 (s, 1H, CHO). 1 -(3,5-Di-t-butilfenil)butan-1 -ol (19). A 2,0 g (9,17 mmol) do aldeído 18 em 10 ml de éter seco a 0°C, foram adicionados 5,5 ml (11,0 mmol) de cloreto de propilmagnésio (2,0 M em éter). A mistura reaccional foi aquecida até à TA e extinta com água (50 ml), extractada (éter, 2 x 50 ml), lavada (água, depois salmoura), seca (MgSOJ, filtrada e concentrada a fim de originar 2,37 g (9,05 mmol) do álcool 19 (puro por Ή-NMR), o qual foi utilizado directamente no passo seguinte (rendimento de 98%): TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) Rf 0,5; 1H-NMR (CDCI3) δ 0.96 (t, 3H, CH2CH3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,66 (m, 2H, CH2), 1,84 (m, 1H, CH), 4,66 (m, 1H, CHOH), 7,18 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,34 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H). 1 -(3,5-Di-t-butilfenil)butan-1 -ona (20). A 2,37 g (9,05 mmol) do álcool 19 em 18 ml de CH2CI2, foram adicionados 7,86 g (90,45 mmol) de Mn02. A mistura
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ reaccional foi agitada durante 3 h, de seguida filtrada (almofada de celite sobre gel de sílica) e a almofada foi repetidamente lavada com alíquotas de 20 ml de CH2CI2. Após concentração, a cetona 20 foi purificada por cromatografia (Si02, EtOAc a 3% - hexanos) a fim de originar 941 mg (3,62 mmol) de 20 (rendimento de 40%): TLC (10% de EtOAc - 90% de hexanos) R; 0,7; ’Η-ΝΜΠ (CDCI3) δ 1,01 (t, 3H, CH2CH3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,78 (m, 2H, CH2CH3), 2,96 (t, J = 7 Hz, 2H, CW2CH2CH3), 7,63 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H), 7,83 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)-hex-2-enitrilo (21) (trans) e (22) (cis). A 661 mg (3,73 mmol) de dietilcianometilfosfonato em 5 ml de THF seco, foram adicionados 127 mg (3,17 mmol) de hidreto de sódio (dispersão a 60% em óleo mineral). A mistura foi agitada durante 5 min., seguida pela adição de 484 mg (1,87 mmol) da cetona 20 em 2 ml de THF seco. A reacção foi aquecida ao refluxo durante 30 min., arrefecida até à TA, extinta com NHâCI aquoso saturado (15 ml), extractada com éter (2 x 15 ml), lavada (água, depois salmoura), seca (MgS04), filtrada e concentrada. A purificação por cromatografia (TLC preparativa, Si02, EtOAc a 10% - hexanos) originou 329 mg (1,16 mmol) do isómero trans 21 e 70,5 mg (0,25 mmol) do isómero cis 22 (rendimento combinado de 75%). Isómero trans 21: TLC (10% de EtOAc - 90% de hexanos) Rf 0,8; 'H-NMR (CDCI3) δ 0,97 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,33 (s, 18H, 6<CH3)), 1,54 (m, 2H, CH2C^2CH3), 2,88 (t, J = 7Hz, 2H, Ctf2CH2CH3), 5,50 (s, 1 H, = CH), 7,23 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,50 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H). Isómero cis 22: TLC (10% de EtOAc - 90% de hexanos) R, 0,9; ’Η-ΝΜΡ (CDCI3) δ 0,93 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,48 (m, 2H, CH2CA/2CH3), 2,57 (t, J = 7 Hz, 2H, CW2CH2CH3), 5,32 (s, 1H, =CH), 7,28 (d, J = 2 Hz, 2H, Ar-H), 7,45 (t, J = 2 Hz, 1H, Ar-H). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)-hex-2-enal (23) (trans). A 1 66 mg (0,59 mmol) do nitrilo 21 em 4 ml de CH2CI2 a -78°C, foram adicionados 0,59 ml (0,88 mmol) de DIBAL (1,5 M em tolueno). A mistura reaccional foi agitada durante 10 min. e extinta com 10 ml de uma solução aquosa saturada de sal de Rochelle. O produto foi extractado com éter (2 x 20 ml), lavado (água, depois salmoura), seco (MgS04), filtrado, concentrado e purificado por cromatografia (TLC preparativa, Si02, EtOAc a 3% - hexanos) a fim de originar 141 mg (0,49 mmol) de 23 sob a forma de um óleo (rendimento de 83%): TLC (10% de
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EtOAc - 90% de hexanos) Rf 0,7; 1,H-NMR (CDCI3) δ 0,97 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2Ctf3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,57 (m, 2H, CH2Ctf2CH3), 3,03 (t, J = 7 Hz, 2H, CH2CH2CH3), 6,32 (d, J = 8 Hz, 1H, =CH), 7,33 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,48 (ΐ, J = 1 Hz, 1 H, Ar-H), 10,15 (d, J = 8 Hz, 1H, CHO). 3-(3,5-Di-t-butilfenil)-hex-2-enal (24) (cis). O composto 24 foi preparado da mesma maneira que o 23, excepto utilizando o isómero cis 22 em vez de 21: TLC (10% de EtOAc - 90% de hexanos) R. 0,8; 1H-NMR (CDCI3) δ 0,94 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2Ctf3), 1,34 (s, 9H, CH3), 1,35 (s, 9H, CH3), 1,51 (m, 2H, CH2C/y2CH3), 2,58 {t, J = 7 Hz, 2H, Ctf2CH2CH3), 6,10 (d, J = 8 Hz, 1H, =CH), 7,04 (d, J = 2 Hz, 2H, Ar-H), 7,43 (t, J = 2 Hz, 1H, Ar-H), 9,42 (d, J = 8 Hz, 1H, CHO). (2£, 4£, 6£)-7-(3.5-Di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienoato de etilo (25). A 391 mg (1,48 mmol) de trietil-3-metil-4-fosfonocrotonato em 5 ml de THF seco a -78°C, foram adicionados 0,59 ml (1,48 mmol) de uma solução 2,5 M de nBuLi em hexanos e 2,5 ml de DMPU. Após agitação durante 15 min., a solução contendo o ileto de trietilfosfonocrotonato foi adicionada a 141 mg (0,49 mmol) de 23 em 5 ml de THF seco a -78°C. A mistura reaccional foi aquecida até à TA, extinta com NH,CI aquoso saturado (20 ml) e os produtos foram extractados com éter (2 x 25 ml). Os extractos em éter foram lavados (água, depois salmoura), secos (MgSOJ, filtrados, concentrados e purificados por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 5% - hexanos) a fim de originar 171 mg (0,43 mmol) do isómero todo-trans 25 (rendimento de 88%): TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,5; ^-NMR (CDCI3) δ 0,94 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,29 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2Ctf3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,52 (m, 2H, CH2CW2CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 2,70 (t, J = 7 Hz, 2H, Ctf2CH2CH3), 4,18 (m, 2H, CH2CH3), 5,80 (s, 1H, =CH), 6,42 (d, J = 15 Hz, 2H, =CH), 6,47 (d, J = 1 5 Hz, 1 H, = CH), 7,03 (m, 1H, =CH), 7,27 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,36 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). {2E. 4E, 6£)-7-(3,5-Di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4.6-trienoato de etilo (26). O composto 26 foi preparado da mesma maneira que o 25, excepto utilizando o isómero cis 24 em vez de 23: TLC (5% de EtOAc - 95% de hexanos) Rf 0,5; 1H-NMR (CDCI3) δ 0,94 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CW3), 1,29 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,33 (s, 18H, 6(CH3)), 1,44 (m, 2H, CH2CH2CH3), 2,15 (s, 3H, CH3),
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2,48 (t, J = 7 Hz, 2Η, Ctf2CH2CH3), 4,16 (m, 2Η, -COCH2CH3), 5,73 (s, 1H, = CH), 6,22 (d, J = 11 Hz, 1H, =CH), 6,26 (d, J = 1 1 Hz, 1H, =CH), 6,74 (dd, J = 1 1 Hz, 1 H, = CH), 7,26 (d, J = 2 Hz, 2H, Ar-H), 7,34 (t, J = 2 Hz, 1H, Ar-H). Ácido (2£, 4E, 6£)-7-(3.5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2.4,6-trienóico (27). A 171 mg (0,44 mmol) de 25 em 5 ml de MeOH, foi adicionado 1 ml de uma solução aquosa 5N de NaOH, A mistura foi aquecida em refluxo durante 10 min., arrefecida até à TA, acidificada com solução aquosa de HCI a 20%, e os orgânicos foram extractados com éter (2 x 10 ml). A camada em éter foi lavada (água, depois salmoura), seca (MgSOJ, filtrada e concentrada. A purificação por cromatografia (TLC preparativa, Si02, EtOAc a 20% - hexanos) originou 28 mg (0,08 mmol) do isómero todo-fra/?s de 27 (rendimento de 80%): TLC (10% de MeOH - 90% de CHCI3) Rf 0,8; pf 143-144°C; ^-NMR (CDCI3) Ô 0,94 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2C//3), 1,34 (s, 18H, 6(CH3)), 1,52 (m, 2H, CH2C/y2CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,71 (t, J = 7 Hz, 2H, CH2CH2CH3), 5,84 (s, 1H, =CH), 6,41 (d, J = 1 5 Hz, 1H, = CH), 6,47 (d, J = 15 Hz, 1 H, =CH), 7,08 (m, 1 H, =CH), 7,26 (d, J = 1 Hz, 2H, Ar-H), 7,37 (t, J = 1 Hz, 1H, Ar-H). Ácido (2E, 4E. gZ)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico (28). O composto 28 foi preparado da mesma maneira que o 27, excepto utilizando o isómero cis 26 em vez de 25: TLC (10% de MeOH - 90% de CHCI3) Rf 0,8; pf 166-169°C; ’Η-NMR (CDCI3) δ 0,89 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,31 (s, 9H, CH3), 1,32 (s, 9H, CH3), 1,42 (m, 2H, CH2CW2CH3), 2,15 (s, 3H, CH3), 2,49 (t, J = 7 Hz, 2H, CH2CH2CH3), 5,76 (s, 1H, =CH), 6,23 (d, J = 11 Hz, 1H, =CH), 6,28 (d, J = 15 Hz, 1H, =CH), 6,78 (dd, J = 15 Hz, 1H, =CH), 7,04 (s, 2H, Ar-H), 7,35 (s, 1 H, Ar-H). 30 34 395 ΞΡ Ο 800 503/ΡΤ EXEMPLOS 7-8 Ácido (2£, 4£, 6£)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2í4,6-trienóico (39) β ácido (2£, 4£, 6Z)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienóico (40), preparados tal como ilustrado e descrito no Esquema 5 abaixo.
Esquema 5
AcCI, BF 3 O Et 2 , o i| T DCE. calor roK 58% i 29 30
rlCQQEt, ? 1. HCI-MeOH
Na, TA -'NiY^ calor. 93% -- ct^oh
89% '"Τ' 2 H,, Pd/C 31 EtOAc, 85%
32 (CH^CH^FOCHyCN A ifC* ΩΙ£ΑΙ- CH2 C!2 NaH. TrIF, ΤΑ -78° C -- ii 93 %
I I σ' 83 % 33 trans 34 cis 35 trans 36 cis
3.5-Di-t-butil-2-hidroxi-acetofenona (30). A 10 g (48,5 mmol) de 2,5-di-t-butilfenol 29 e 4,56 g (58,16 mmol) de cloreto de acetilo em 60 ml de dicloroetano, foram adicionados 11,9 ml (97,0 mmol) de BF3*OEt2, e a mistura foi aquecida em refluxo durante 10 min. A reacção foi arrefecida e vertida para
34 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 31 gelo - HCI aquoso a 20% a 1:1, agitada e extractada (2 x 100 ml de EtOAc). O extracto orgânico foi lavado (água, depois salmoura), seco (MgSOJ, concentrado e purificado (cromatografia em Si02, EtOAc a 5% - hexanos) a fim de originar 7,0 g (28,22 mmol) de 30 sob a forma de um óleo (rendimento de 58%): TLC (EtOAc a 5% - hexano) Rf 0,1; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,32 (s, 9H, CH3), 1,42 (s, 9H, 3(CH3)), 2,68 (s, 3H, CH3), 7,55 (m, 2H, Ar-H). 6.8- Di-t-butil-2-hidroxicroman-4-ona (31), A 1,8 g (78,26 mmol) de sódio metálico num balão de fundo redondo de 500 ml seco à chama, foram adicionados gota a gota 7,5 g (30,24 mmol) de fenol 30 em 120 ml de formato de etilo. Uma vez a adição concluída, a mistura foi agitada a 40°C durante 1 h, de seguida arrefecida até à TA e vertida para HCI aquoso 1N. Quando a mistura se tornou transparente, os orgânicos foram extractados (2 x 150 ml de EtOAc), lavados (água, depois salmoura), secos (MgSOJ e concentrados a fim de originar 7,4 g (26,81 mmol) de 31 sob a forma de um óleo (rendimento aproximado, 89%). Este produto foi utilizado directamente no passo seguinte: TLC (EtOAc a 20% - hex) Rf 0,4; Ή-NMR (CDCI3) δ 1,30 (s, 9H, 3(CH3)), 1,42 (s, 9H, 3CH3), 2,87 (dd, J = 1 6,0, 5,5 Hz, 1H, CH2), 3,01 (dd, J = 16,0, 3,1 Hz, 1 H, CH2), 5,87 (dd, J = 5,5, 3,3 Hz, 1 H, C//OH), 7,58 (d, J = 2,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,79 (d, J = 2,5 Hz, 1H, Ar-H). 47/-6,8-Di-t-butilbenzopiran-4-ona (não representado). A 7,4 g (26,81 mmol) de 30 em 20 ml de MeOH, foram adicionados 8 ml de HCI aquoso a 20%, e a mistura foi aquecida em refluxo durante 20 min.. Após arrefecimento até à TA, foi adicionada água (30 ml) e os produtos foram extractados (2 x 30 ml de EtOAc), lavados (água, depois salmoura), secos (MgS04), e concentrados a fim de originar cerca de 6,0 g (25,00 mmol) de 4/7-6,8-di-t-butilbenzopiran-4-ona sob a forma de um óleo, o qual depois de repousar durante algumas horas, solidificou (rendimento aproximado, 93%). Este produto foi utilizado directamente no passo seguinte: TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,37 (s, 9H, 3CH3), 1,49 (s, 9H, 3CH3), 6,35 (d, J = 5,6 Hz, 1H, CH = CH), 7,70 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,91 (d, J = 5,6 Hz, 1H, CH = CH), 8,10 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, Ar-H). 6.8- Di-t-butilcroman-4-ona (32). A 1,0 g (3,87 mmol) de 4/7-6,8-di-t-butilbenzopiran-4-ona em 8 ml de EtOAc, foram adicionados 200 mg de Pd a
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 10% / C. A mistura foi desgaseificada, seguida pela adição de gás H2 e agitada sob uma atmosfera de gás H2 durante 2 h à TA. Após filtração (celite), o produto foi concentrado e purificado (cromatografia em Si02, EtOAc a 5% -hexanos) a fim de originar 857 mg (3,29 mmol) de 32 sob a forma de um sólido branco (rendimento de 85%): TLC (EtOAc a 5% - hex) R, 0,7; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,32 (s, 9H, CH3), 1,42 (s, 9H, CH3), 2,78 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,52 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 7,53 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,81 (d, J = 2,4Hz, 1H, Ar-H). (5.8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)acetonitrilo (33) (trans) e (34) (cis). A 891 mg (5,03 mmol) de fosfonato de cianometilo em 6 ml de THF seco, foram adicionados 188 mg (4,69 mmol) de NaH (60% em óleo), e a mistura foi agitada durante 20 min. A esta solução foram adicionados 436 mg (1,80 mmol) de 32 em 2 ml de THF seco, e a reacção foi aquecida ao refluxo durante 2 h. Após arrefecimento até à TA, a reacção foi extinta com NH4CI saturado (10 ml) e extractada (2 x 10 ml de EtOAc), lavada (água, depois salmoura), seca (MgSOJ, concentrada e purificada (cromatografia em Si02, EtOAc a 5% -hexano) a fim de originar 358 mg (1,32 mmol) do isómero trans 33 e 95 mg (0,35 mmol) do isómero cis 34 (rendimento combinado de 93%). Isómero trans 33: TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,30 (s, 9H, 3CH3), 1,36 (s, 9H, 3CH3), 3,00 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,27 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,73 (s, 1H, =CH-CN), 7,35 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,41 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H). Isómero cis 34: TLC (EtOAc a 5% - hexano) Rf 0,4; ^-NMR (CDCI3) δ 1,34 (s, 9H, 3CH3), 1,39 (s, 9H, 3CH3), 2,76 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,29 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,11 (s, 1H, =CA/-CN), 7,42 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar-H), 8,28 (d, J = 2 Hz, 1 H, Ar-H). (6,8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)acetaldeído (35) (trans). A 100 mg (0,36 mmol) do nitrilo 33 em 5 ml de hexano a -78°C, foram adicionados 0,35 ml (0,53 mmol) de uma solução 1,5 M de DIBAL em tolueno. A mistura foi agitada durante 5 min., seguida pela adição de 10 ml de solução aquosa saturada de sal de Rochelle e aquecida até à TA. A solução foi extractada (2 x 10 ml de EtOAc), lavada (água, depois salmoura), seca (MgSOJ, filtrada e concentrada a fim de originar 86 mg (0,30 mmol) do aldeído 35 relativamente puro (rendimento de 83%): TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; ’Η-NMR (CDCI3) δ 1,32 (s, 9H, 3CH3), 1,41 (s, 9H, 3CH3), 3,27 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,30 (t. 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ J = 6,0 Hz, 2Η, CH2), 6,57 (d, J = 8Hz, 1 Η, = C7/-CH0), 7,41 (d, J = 2,4Hz, 1H, Ar-H), 7,51 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 10,14 (d, J = 8 Hz, 1H, CHO). (6,8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)acetaldeído (36) (c/s). O composto 36 foi preparado da mesma maneira que o 35, excepto utilizando o isómero cis 34 em vez de 33: TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,4; ’Η-NMR (CDCI3) δ 1,30 (s, 9H, 3CH3), 1,38 (s, 9H, 3CH3), 2,80 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 4,42 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 5,95 (d, J = 8 Hz, 1H, =CH), 7,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,44 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, Ar-H), 10,00 (d, J = 8 Hz, 1H, CHO). (2£, 4£, 6£)-6-(6.8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2.4.6-trienoato de etilo (37). A 238 mg (0,902 mmol) de trietil-3-metil-4-fosfonocrotonato em 3 ml de THF seco a -78°C, foram adicionados 0,36 ml (0,90 mmol) de uma solução 2,5 M de nBuLi em hexanos e 3 ml de DMPU. Após agitação durante 1 5 min., a solução contendo o ileto de trietilfosfonocrotonato foi transferida para 86 mg (0,30 mmol) de 35 em 4 ml de THF-DMPU a 1:1 a -78°C. A mistura reaccional foi aquecida até à TA, extinta com NH4CI aquoso saturado (20 ml), e os produtos foram extractados com EtOAc (2 x 20 ml). Os extractos foram lavados (água, depois salmoura), secos (MgSOJ, filtrados, concentrados e purificados por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 5% - hexanos) a fim de originar 85,3 mg (0,22 mmol) do isómero 2£, 4£, 6£ de 37 (rendimento de 73%) e 5,6 mg (0,014 mmol) do isómero 2Z, 4£, 6£ (rendimento de 5%). Composto 37: TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,30 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,33 (s, 9H, 3CH3), 1,37 (s, 9H, 3CH3), 2,37 (s, 3H, CH3), 2,88 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,17 (q, 2H, CH2), 4,23 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,81 (s, 1H, = CH), 6,43 (d, J = 15Hz, 1H, =CH), 6,73 (d, J = 15 Hz, 1H, = CH), 6,96 (m, 1H, =CH), 7,25 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, Ar-H). (2£, 4£, 6Z)-6-(6.8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo (38). O composto 38 foi preparado da mesma maneira que o 37, excepto utilizando o isómero cis 36 em vez de 35, Composto 36: TLC (EtOAc a 5% -hex) Rf 0,5; ’Η-NMR (CDCI3) δ 1,30 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CHJ, 1,30 (s, 9H, 3CH3), 1,38 (s, 9H, 3CH3), 2,32 (s, 3H, CH3), 2,66 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,16 (m, 2H, CH2), 4,35 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,80 (s, 1H, =CH), 6,08 (d,
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ Λ Λ .Ό J = 6,0 Hz, 2Η, CH2), 6,57 (d, J = 8Hz, 1 Η, = C/V-CHO), 7,41 (d, J = 2,4Hz, 1H, Ar-H), 7,51 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 10,14 (d, J = 8 Hz, 1H, CHO). (g,8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)acetaldeído (36) (c/s). O composto 36 foi preparado da mesma maneira que o 35, excepto utilizando o isómero c/s 34 em vez de 33: TLC (EtOAc a 5% - hex) R. 0,4; ^-NMR (CDCI3) δ 1,30 (s, 9H, 3CH3), 1,38 (s, 9H, 3CH3), 2,80 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 4,42 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 5,95 (d, J = 8 Hz, 1H, =CH), 7,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,44 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, Ar-H), 10,00 (d, J = 8 Hz, 1H, CHO). (2£, 4£, 6E)-6-(6,8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo (37). A 238 mg (0,902 mmol) de trietil-3-metil-4-fosfonocrotonato em 3 ml de THF seco a -78°C, foram adicionados 0,36 ml (0,90 mmol) de uma solução 2,5 M de nBuLi em hexanos e 3 ml de DMPU. Após agitação durante 15 min., a solução contendo o ileto de trietilfosfonocrotonato foi transferida para 86 mg (0,30 mmol) de 35 em 4 ml de THF-DMPU a 1:1 a -78°C. A mistura reaccional foi aquecida até à TA, extinta com NH4CI aquoso saturado (20 ml), e os produtos foram extractados com EtOAc (2 x 20 ml). Os extractos foram lavados (água, depois salmoura), secos (MgSOJ, filtrados, concentrados e purificados por cromatografia em coluna (Si02, EtOAc a 5% - hexanos) a fim de originar 85,3 mg (0,22 mmol) do isómero 2£, 4£, 6£ de 37 (rendimento de 73%) e 5,6 mg (0,014 mmol) do isómero 2Z, 4£, 6£ (rendimento de 5%). Composto 37: TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; 'Ή-NMR (CDCI3) δ 1,30 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,33 (s, 9H, 3CH3), 1,37 (s, 9H, 3CH3), 2,37 (s, 3H, CH3), 2,88 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,17 (q, 2H, CH2), 4,23 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,81 (s, 1 H, = CH), 6,43 (d, J = 1 5 Hz, 1 H, =CH), 6,73 (d, J = 1 5 Hz, 1H, = CH), 6,96 (m, 1H, =CH), 7,25 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (d, J = 2,4 Hz, 1 H, Ar-H). (2£, 4£, 6Z)-6-(6.8-Di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo (38). O composto 38 foi preparado da mesma maneira que o 37, excepto utilizando o isómero c/s 36 em vez de 35, Composto 36: TLC (EtOAc a 5% -hex) Rf 0,5; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,30 (t, J = 7 Hz, 3H, CH2CH3), 1,30 (s, 9H, 3CH3), 1,38 (s, 9H, 3CH3), 2,32 (s, 3H, CH3), 2,66 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,16 (m, 2H, CH2), 4,35 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,80 (s, 1H, =CH), 6,08 (d,
r
84 395
EP 0 800 503/PT J = 11 Hz, 1H, = CH), 6,36 (d, J=15 Hz, 1H, =CH), 7,27 (d, J = 2Hz, 1H, Ar-H), 7,29 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar-H), 7,28 (dd, J = 1 5, 11 Hz, 1H, Ar-H). Ácido (2E. 4E. 6£)-6-(6.8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienóico (39) . A 85,3 mg (0,22 mmol) do éster 37 em 6 ml de THF-MeOH a 1:1, foram adicionados 3 ml de uma solução aquosa 5N de KOH. A solução foi aquecida ao refluxo durante 10 min., arrefecida até à TA, acidificada (HCI aquoso a 20%) e extractada (2 x 6 ml de EtOAc). Os extractos foram combinados, lavados (água, depois salmoura), secos (MgSOJ, filtrados e concentrados. A purificação por TLC preparativa (MeOH a 5% - CHCI3), seguida por cristalização (EtOAc -hexano, 1:4) originou 74,5 mg (0,20 mmol) do ácido 39 sob a forma de um sólido amarelo claro (rendimento de 94%): TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; pf 237-239°C; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,33 (s, 9H, 3CH3), 1,38 (s, 9H, 3CH3), 2,37 (s, 3H, CH3), 2,89 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,23 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,86 (s, 1 H, =CH), 6,43 (d, J = 1 5 Hz, 1H, =CH), 6,74 (d, J = 11 Hz, 1H, =CH), 6,97 (dd, J = 11, 15 Hz, 1 H, =CH), 7,25 (d, J = 2,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (d, J = 2,3 Hz, 1 H, Ar H).
Ácido (2£, 4E. 6Z)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2.4.6-trienóicQ (40) . O composto 40 foi preparado da mesma maneira que o 39, excepto utilizando o isómero cis 37 em vez de 36, Composto 37: TLC (EtOAc a 5% -hex) R, 0,5; pf 233-235°C; Ή-NMR (CDCI3) δ 1,32 (s, 9H, 3CH3), 1,37 (s, 9H, 3CH3), 2,33 (s, 3H, CH3), 2,68 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 4,35 (t, J = 6,0 Hz, 2H, CH2), 5,83 (s, 1H, = CH), 6,10 (d, J = 11 Hz, 1H, =CH), 6,39 (d, J = 15 Hz, 1 H, = CH), 7,26 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar-H), 7,30 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar H), 7,35 (dd, J = 11, 15 Hz, 1 H, = CH). EXEMPLO 9 Ácido (2E, 4£, 6£)-7-{3,5-di-trifluorometilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (41), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,5-di-trifluorometilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (EtOAc a 5% - hexano) Rf 0,5; pf 225-227°C; Ή-NMR (CDCI3) δ 2,30 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 5,90 (s, 1H, =CH), 6,52 (d, J = 15 Hz, 1H, =CH), 6,66 (d, J = 1 2 Hz, 1H, =CH), 7,03 (m, 1 H, =CH), 7,78 (s, 1H, Ar-H), 7,78 (s, 1 H, Ar-H).
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 35 EXEMPLO 10 Ácido (2Ε, 4Ε, 6£)-7-(3,5-di-isopropilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (42), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,5-di-isopropilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (EtOAc a 5% - hexano) Rf 0,5; pf 157-160°C; ’Η-NMR (CDCI3) δ 1,28 (d, J = 8 Hz, 12H, CH3), 2,27 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,90 (p, J = 8 Hz, 2H, CH), 5,83 (s, 1H, = CH), 6,42 (d, J = 1 5 Hz, 1 H, =CH), 6,60 (d, J = 15 Hz, 1 H, = CH), 7,02 (s, 1 H, Ar-H), 7,08 (m, 1 H, =CH). 7,45 (s, 2H, Ar-H). EXEMPLO 11 Ácido (2E, 4E, 6Z)-7-(3,5-di-isopropilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (43), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 10, excepto utilizando a 3,5-di-isopropilacetofenona no primeiro passo em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (EtOAc a 5% - hex) R< 0,5; pf 177-179°C; ’H-NMR (CDCI3) δ 1,25 (d, J = 7 Hz, 12H, CH3), 2,18 (s, 3H, CH3), 2,21 (s, 3H, CH3), 2,90 (p, J = 7 Hz, 2H, CH), 5,77 (s, 1H, =CH), 6,25 (d, J = 11 Hz, 1H, =CH), 6,27 (d, J = 1 5 Hz, 1H, =CH), 6,85 (dd, J = 11, 15 Hz, 1H, Ar-H), 6,94 (d, J = 2 Hz, 2H, Ar-H), 7,02 (Ig, H, Ar-H). EXEMPLO 13 Ácido (2E, 4E, 6£)-7-(3,5-di-t-butil-4-metoxifenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (45), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,5-di-t-butil-4-metoxiacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (EtOAc a 5% - hex) Rf 0,5; pf 244-246°C; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,30 (s, 9H, 3CH3), 1,42 (s, 9H, 3CH3), 2,27 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 3,67 (s, 3H, 0CH3), 5,83 (s, 1H, =CH), 6,34 (d, J = 15 Hz, 1H, = CH), 6,35 (d, J = 1 5 Hz, 1H, =CH), 7,00 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar-H), 7,06 (m, 1 H, = CH). 7,27 (d, J = 2 Hz, 1 H, Ar-H), 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 36
EXEMPLO 14 Ácido (2Ε, 4Ε, 6Z)-7-(3,5-di-trifluorometilfenil)-3-metilocta-2,4,6'trienóico (46), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 10, excepto utilizando a 3,5-di-trifluorometilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona. TLC (EtOAc a 5% - hex) Rt 0,5; pf 225-227°C; 1H-NMR (CDCI3) δ 2,15 (s, 3H, CH3), 2,24 (s, 3H, CH3), 5,82 (s, 1H, CH = ), 6,36 (d, J = 15 Hz, 1 H, CH=0, 6,39 (d, J = 9.7 Hz, 1 H, CH = ), 6,53 (dd, J = 1 5, 9,7 Hz, 1H, CH = ), 7,70 (s, 2H, Ar-CH), 7,83 (s, 1H, Ar-CH). EXEMPLO 15 Ácido (2E, 4E, 6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butil-4-metoxifenil)octa-2,4,6-trienóico (47), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,5-di-t-butil-4-metoxiacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (50% de EtOAc - 50% de hexanos) Rf 0,5; pf 213-21 6°C; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,45 (s, 18H, 6(CH3)), 2,25 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 3,70 (s, 3H, 0CH3), 5,84 (s, 1H, =CH), 6,41 (d, J = 15 Hz, 1H, = CH), 6,52 (d, J = 11,2 Hz, 1H, =CH). 7,08 (m, 1H, =CH). 7,35 (s, 2H, Ar-H). EXEMPLO 16 Ácido (2E, 4E, 6£)-3-metil-7-(3,4-dietilfenil)octa-2,4,6-trienóico (48), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,4-dietilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) Rf 0,3; pf 153-155°C; Ή-NMR (CDCI3) δ 1,45 (dd, J = 1 4,1 Hz, 7,5 Hz, 6H, 2CH3), 2,25 (s, 3H, CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 2,66 (m, 4H, 2CH2), 5,83 (s, 1 H, =CH), 6,40 (d, J = 15 Hz, 1H, =CH), 6,59 (d, J = 11,2 Hz, 1 H, = CH), 7,07 (m, 1H, =CH). 7,14 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,27 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-CH), 7,28 (s, 1H, Ar-CH). 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 37
EXEMPLO 17 Ácido (2£, 4£, 6Z)-3-metil-7-(3,4-dietilfenil)octa-2,4,6-trienóico (49), preparado de acordo com o Esquema 1. 0 composto 49 foi preparado duma maneira semelhante à do 10, excepto por ter sido utilizada a 3,4-dietilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) R, 0,32; ^-NMR (CDCI3) δ 1,23 (dd, J = 14,1 Hz, 7,5 Hz, 6H, 2CH3), 2,18 (s, 6H, 2CH3), 2,67 (m, 4H, 2CH2), 5,76 (s, 1H, = CH), 6,23 (d, J = 11,8 Hz, 1H, =CH), 6,28 (d, J = 1 5 Hz, 1 H, = CH), 6,83 (m, 1H, = CH). 7,04 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,06 (s, 1 H, Ar-CH). 7,17 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-CH). EXEMPLO 18 Ácido (2E, 4£, 6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butil-4-etoxifenil)octa-2,4,6-trienóico (50), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,5-di-t-butil-4-etoxiacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (50% de EtOAc - 50% de hexanos) R« 0,5; pf 236-239°C; 1H-NMR (CDCI3) δ 1,41 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3), 1,44 (s, 18H, 6(CH3)), 2,26 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 3,77 (q, J = 7 Hz, 2H, OCH2CH3), 5,84 (s, 1 H, = CH), 6,41 (d, J = 1 5 Hz, 1H, =CH), 6,51 (d, J = 1 1,2 Hz, 1H, =CH), 7,08 (m, 1 H, = CH). 7,35 (s, 2H, Ar-H). EXEMPLO 19 Ácido (2£, 4E, 6£)-3-metil-7-(3,4-di-t-butilfenil)octa-2,4,6-trienóico (51), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,4-di-t-butilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) Rf 0,3; pf 195-199°C; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,56 (s, 9H, 3CH3), 1,58 (s, 9H, 3CH3), 2,26 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 5,84 (s, 1 H, = CH), 6,41 (d, J = 15 Hz, 1H, =CH), 6,59 (d, J = 11 Hz, 1H, = CH), 7,08 (m, 1H, =CH). 7,23 (dd, J = 8,5, 2,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,57 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, Ar-H), 7,72 (d, J = 2,3 Hz, 1H, Ar-H).
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ EXEMPLO 20 Ácido (2Ε, 4Ε, 6£)-3-metil-7-ciclo-hexil-7-(3,5-di-t-butilfenil)-hepta-2,4,6- trienóico (52), preparado de acordo com o Esquema 4.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 27, excepto utilizando a 3,4-di-t-butilfenilciclo-hexilcetona em vez da 3,5-di-t-butilbutan-1-ona: TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) Rf 0,3; Ή-NMR <CDCI3) δ 1,35 (s, 9H), 1,9-1,1 (m, m, 8H), 2,40 (s, 3H), 2,85 (m, 1H), 5,81 (s, 1H), 6,08 (d, 1H, J = 11,3 Hz), 6,30 (d, 1H, J = 15,8 Hz), 7,02 (s, 2H, Ar-H), 7,14 (dd, 1H, J = 1 5,2, 15,2 Hz), 7,33 (s, 1H, Ar-H). EXEMPLO 21 Ácido (2E, 4E, 6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butilfenil)nona-2,4,6-trienóico (53), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 9, excepto utilizando a 3,5-di-t-butil-4-metoxiacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (50% de EtOAc - 50% de hexanos) Rf 0,5; pf 213-21 6°C; 'H-NMR (CDCI3) δ 1,45 (s, 18H, 6(CH3)), 2,25 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 3,70 (s, 3H, 0CH3), 5,84 (s, 1H, =CH), 6,41 (d, J = 15 Hz, 1H, = CH), 6,52 (d, J = 1 1,2 Hz, 1H, =CH), 7,08 (m, 1H, =CH), 7,35 (s, 2H, Ar-H). EXEMPLO 22 Ácido (2E, 4E, 6Z)-3-metil-7-(3,4-dietil-6-metilfenil)nona-2,4,6-trienóico (54), preparado de acordo com o Esquema 1.
Este composto foi sintetizado duma maneira análoga à do 10, excepto por ter sido utilizada a 3,4-dietil-6-metilacetofenona em vez da 3,5-di-t-butilacetofenona: TLC (20% de EtOAc - 80% de hexanos) Rf 0,3; ^-NMR (CDCI3) δ 1,22 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3), 1,24 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3), 2,08 (s, 3H, CH3), 2,09 (s, 3H, CH3), 2,17 (s, 3H, CH3), 2,60 (m, 4H, 2(CH2)), 5,73 (s, 1 H, =CH), 6,25 (m, 3H, 3( = CH)), 6,81 (s, 1H, Ar-H). 7,01 (s, 1 H, Ar-H). 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 39
EXEMPLO 23 Ácido (2Ε, 4Ε, 6£)-7-{3f5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (69), preparado de acordo com o Esquema 6 ilustrado e descrito abaixo.
Esquema 6
OH R1 2 OH
ZHi.THF
R‘ HC’'y'V''OH
1. FCC/Calite: DCM
CHR1 OH r -R' y r3 R- ο'τΥρ ‘R'1 R“ THF 3R",’':''T R3 R4 2. MaMgBr, THF. 55 56 -73°C NaH, Ti- R: oh CHC" f* <' - 1 ;i * JR i R” R4 1. n-3uU: THF (SC)2F(C)CH2H=CHFh R1 CT3S . X TSSiCi FCC/Calite: DCM 9H?' 2. n-3uLs: THF , I !l 3R' V" R4 3R'V R** 2. Mei 59 53 60 4. H-,
: 1. NaSri^ MeCH : 2. MnCy.CCM HO- ... I 3R^ ^R3 R1 C TBCPSiO^.. BCFSICi: !mia.; \ :i - 3 DCM. CMF (cat.) R' >' R“ — 4 1. (ElChP(C)CH-,CM R1 *&ί·.™:ρΐ) TSDPSp.;».^ l 61 62 3R V "R3 R4 2. Dicat-H. DCM: -73°Cpasso 2 ' x=Cl^:S3 * X=CHO: 64
67 66 1 n-3uU. THF. QMPU (BOkPtO^FliCÍCH^CHCOzE! 2
3u4NF; THF 40 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ
TsNHNH,; ΕίΟΗ. riCi(cat.)
Nacn'rii, AcQH ou NaCN8nh\, MeCH KCH, 30 H, 7C°C (n=1, 2. 2) 3.
R5
69 5-ferc-Butil-1.3-benzenodimetanol (56). Uma solução de ácido 5-ferc-butil-1,3-benzenodicarboxílico (55) 20,0 g (89,9 mmol) em THF (200 ml) foi arrefecida até 0°C, e uma solução do complexo borano-THF em THF (190 ml) foi lentamente adicionada por meio de um funil de adição ao longo de 20 minutos com agitação vigorosa. A mistura foi aquecida até à TA e agitada durante um período adicional de 90 min.. Uma mistura de água-THF (1;1; 200 ml) foi lentamente adicionada, seguida por 200 ml adicionais de água. A mistura foi extractada com acetato de etilo. A camada aquosa foi extractada com EtOAc (2 x 100 ml), e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 100 ml), salmoura (2 x 100 ml), e secas sobre MgS04. O solvente foi evaporado a fim de originar o diol puro com rendimento de 98%: 1H-NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,32 (s, 2H); 7,19 (s, 1H,); 4,69 (s, 4H); 1,75 (s lg; 2H); 1,33 (s, 9H). 5-ferc-Butil-1,3-tereftaldeído. 5-ferc-Butil-1,3-benzenodimetanol (56) (20,0 g; 103 mmol) foi adicionado sob agitação vigorosa a uma mistura de clorocromato de piridínio (66,0 g; 306 mmol) e celite (130 g) em diclorometano (DCM) (500 ml). A mistura foi agitada durante 3 h à TA até a reacção estar completa (TLC). A mistura reaccional foi filtrada sobre uma almofada curta de gel de sílica (2" x 4") e eluída com DCM (11). O solvente foi evaporado a fim de originar 18,7 g; rendimento de 94% do dialdeído desejado: ’Η-NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 10,11 (s, 2H); 8,18 (s, 3H,); 1,41 (s, 9H).
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 41 (R, S)-5-fe/~c-Butil-1,3-benzeno-r2r2'-dietanol1 (57). Uma solução de 5-íerc-butil-1,3-tereftaldeído (18,7 g; 96,4 mmol) em THF (400 ml) foi arrefecida até -78°C, e foi lentamente adicionada uma solução de brometo de metilmagnésio (80,0 ml de uma solução 3M), e a mistura reaccional foi aquecida até à TA. Após agitação durante 60 min., a solução foi extinta com uma solução sat. de NH4CI (100 ml), seguida por HCI (1N, 50 ml) e extracção com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água (2 x 100 ml), salmoura (2 x 100 ml), e seca sobre MgS04. O solvente foi evaporado. 0 resíduo em bruto foi dissolvido em EtOAc quente (30 ml) e foi adicionado pentano (200 ml). A solução límpida foi arrefecida num refrigerador a -4°C durante 3 h. O sólido branco obtido foi filtrado e enxaguado com pentano frio. 0 sólido foi seco sob vácuo a fim de originar 15,3 g; (rendimento de 70%) do composto desejado: ’Η-ΝΜΡ (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,32 (s, 2H); 7,2 (s, 1 H); 4,92 (m, 2H); 1,82 (d, 2H, J = 2,5 Hz); 1,52 (d, 6H, J = 6,5 Hz); 1,35 (s, 9H). (R, SI-S-ferc-Butil-l ,3-fenil-r2-etanol. 2'-etano-reAC-butildimetilsililéter1 (58). Hidreto de sódio (2,75 g de uma mistura contendo 60% de óleo mineral) foi enxaguado com hexanos (2x10 ml), suspenso em THF (200 ml) e 5-te/r-butil-1,3-benzeno-2,2'-dietanol (12,69 g; 57 mmol) foi adicionado com agitação vigorosa. A mistura foi agitada durante 45 min. à TA originando uma pasta branca, sendo de seguida adicionado cloreto de ferc-butildimetilsililo (8,61 g, 57 mmol) de uma só vez. A mistura reaccional foi agitada durante 2 h, e foi adicionada água (25 ml). A mistura foi extractada com EtOAc (350 ml). A camada orgânica foi lavada com uma solução sat. de NH4CI (100 ml), água (2 x 100 ml), salmoura (2 x 100 ml), e seca sobre MgS04. O solvente foi evaporado e o resíduo purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica a fim de originar o produto mono-sililado desejado (14,45 g; rendimento de 75%) sob a forma de um óleo (foram recuperados 2,14 g do material de partida): ’Η-ΝΜΡ (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,32 (s, 1 H); 7,28 (s, 1H); 7,12 (2s, 1H); 4,92 (m, 2H); 1,85 (s, 1H); 1,5 (d, 3H, J = 6,5 Hz); 1,43 (d, 3H, J = 6,5 Hz); 1,35 (s, 9H); 0,9 (s, 9H); 0,05 (s, 6H). (R.Sl-S-tEtil^-ferc-butildimetilsililéterl-S-fe/r-butilacetofenona (59).
Clorocromato de piridínio (15,0 g; 69 mmol) e celite (30 g) foram misturados em DCM (500 ml), enquanto 5-íe/-c-butil-1,3-benzeno-(2-etanol,2'-etano-fe/'c-butildimetilsililéter) (14,45 g; 44 mmol) em DCM (100 ml) foi adicionado com 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 42
agitação vigorosa. Após 3 h à TA, a mistura foi filtrada sobre uma almofada curta de gel de sílica (2" x 4") e eluída com DCM (500 I). 0 solvente foi evaporado a fim de originar a cetona desejada (14,4 g; rendimento de 99%). Ή NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,89 (s, 1H); 7,73 (s, 1 H); 7,65 (s, 1H); 4,94 (q, 1 H, J = 6,3 Hz); 2,63 (s, 3H); 1,45 (d, 3H, J = 6,3 Hz); 1,37 (s, 9H); 0,96 (s, 9H); 0,12 (s, 3H); 0,05 (s, 3H). 5-te/-ç-Butil-1 -(2-etanol)-3-(2-[2-metilpropan-1 -alDbenzeno (60). Um balão de fundo redondo com três tubuladuras seco à chama, foi carregado com THF (90 ml) e arrefecido até -78°C. /7-BuLi (12,0 ml de uma solução 2M; 24 mmol) foi lentamente adicionado e a mistura foi agitada durante 10 min. Adicionou-se uma solução de N-benzilidenodietilaminometilfosfonato (6,14 g; 24 mmol) em THF (15 ml), e a mistura resultante foi agitada durante 60 min. a -78°C. Uma solução de 5-ferc-butil-3-(etano-2-íe/'c-butildimetilsililéter)acetofenona (7,0 g, 20,9 mmol) em THF (15 ml) foi adicionada à solução anterior, e a mistura foi aquecida até à temp. ambiente (TA), agitada durante 30 min., em seguida mantida em refluxo durante 2 h. A mistura foi arrefecida até à TA, e o solvente foi evaporado. Éter dietílico (400 ml) foi adicionado e a solução foi lavada com cloreto de sódio (200 ml). A camada aquosa foi extractada com éter (200 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (200 ml) e secas sobre MgS04. 0 solvente foi evaporado a fim de originar um resíduo amarelo, o qual foi seco sob alto vácuo (1 mm Hg) durante 1 hora. THF (90 ml) foi adicionado a este resíduo e arrefecido até -78°C. n-BuLi (12,0 ml de uma solução 2 M; 24 mmol) foi lentamente adicionado e a solução intensamente corada foi agitada durante 60 min. Foi adicionado iodeto de metilo (6,52 ml) e a mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 4 h. A mistura reaccional foi extinta com HCI (3N; 100 ml) e a solução bifásica foi agitada durante 16 h à TA. Foi adicionado EtOAc (300 ml) e a camada orgânica foi separada e lavada com água (2 x 100 ml), salmoura (2 x 100 ml), e seca sobre MgS04. O solvente foi evaporado a fim de originar um resíduo, o qual foi purificado por s.g.c. a fim de originar 3,3 g do aldeído desejado com rendimento de 65%: Ή NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 9,5 (s, 1H); 7,33 (s, 1H); 7,17 (s, 1H); 7,11 (s, 1H); 4,91 (m, 1H); 1,80 (d, 1H, J = 3,4Hz); 1,5 (d, 3H, J = 6,3 Hz); 1,47 (s, 3H); 1,32 (s, 9H). 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 43
5-ferc-Butil-3-(2-metilpropan-1 -oPacetofenona (61). Uma solução de 5-terc-butil-1-(2-etanol)-3-(2-[2-metilpropan-1-al])benzeno (1,77 g, 7,53 mmol) em MeOH (50 ml) foi arrefecida até 0°C e NaBH4 (300 mg, 7,93 mmol) foi adicionado em porções. A mistura reaccional foi aquecida até à TA, e agitada durante 30 min. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi retomado em EtOAc (50 ml) e lavado com HCI (10%, 3x10 ml), água (3 x 20 ml) e salmoura (3 x 20 ml). A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e evaporada até à secura a fim de originar 1,76 g do diol desejado; rendimento de 99%. Este diol (1,65 g; 6,78 mmol) foi dissolvido em DCM (20 ml) e Mn02 (18,7 g; 0,17 mmol) foi adicionado de uma só vez. A mistura reaccional foi vigorosamente agitada durante 4 h, de seguida filtrada sobre uma almofada curta de celite. O solvente foi evaporado a fim de produzir 1,63 g (rendimento de 97%) da cetona desejada: ηΗ NMR (CDCI3; 400 MHz) Ô (ppm): 7,85 (s, 1H); 7,8 (s, 1H); 7,63 (s, 1H); 3,64 (d, 2H, J = 4,5 Hz); 2,6 (s, 3H); 1,38 (s, 6H); 1,35 (s, 9H). 5-fe/'c-Butil-3-(2-r2-metilpropan-1 -terc-butildifenilsililéterDacetofenona (62). A uma solução de 5-fe/'c-butil-3-(2-metilpropan-1-oDacetofenona (1,63 g, 6,96 mmol) em DCM (30 ml) foi adicionado imidazolo (500 mg; 7,35 mmol), uma gota de DMF e cloreto de terc-butildifenilsiiilo (2,01 g; 7,33 mmol). A mistura foi agitada durante toda a noite à TA, e extinta com excesso de NH4CI sat. Foi adicionado DCM (50 ml) e a camada orgânica foi lavada com água (3 x 20 ml) e salmoura (3 x 20 ml). A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e evaporada até à secura a fim de originar um resíduo, o qual foi purificado por s.g.c. a fim de produzir 2,77 g do éter desejado (rendimento de 83%): Ή NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,85 (s, 1H); 7,76 (s, 1H); 7,63 (1H); 7,48-7,25 (mm, 10H); 3,62 (s, 2H); 2,56 (s, 3H); 1,38 (s, 6H); 1,33 (s, 9H); 0,94 (s, 9H). 5-ferc-Butil-3-(2-r2-metilpropan-1 -fe/r-butildifenilsililéterP-l -(2Ε)-3-Γ2-butenitrilol-benzeno (63). A uma solução de dietilcianometilfosfonato (1,7 g, 9,55 mmol) em THF (30 ml) a 0°C foi adicionado λ-BuLí (4,64 ml de uma solução 2,0M em hexanos). A solução foi agitada durante 10 min., após o que foi adicionada uma solução de 5-íerc-butil-3-(2-[2,2'-dimetilpropan-ferc-butildifenilsililéter])acetofenona em THF (10 ml). A mistura reaccional foi agitada durante 30 min. e extinta com uma solução sat. de NH4CI. Foi adicionado EtOAc (50 ml) e a camada orgânica foi lavada com água (3 x 20 ml) e salmoura (3 x 20 ml). A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e evaporada até à secura
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 44 a fim de originar um resíduo, o qual foi purificado por s.g.c. a fim de produzir o nitrilo desejado sob a forma de uma mistura trans:c'\s (~4:1 por ’H NMR). A s.g.c. originou 1,70 g do isómero trans desejado, rendimento de 63%: Ή NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,85 (s, 1H); 7,48-7,22 (mm, 13H, ArH); 5,5 (s, 1 H); 3,59 (s, 2H); 2,43 (s, 3H); 1,35 (s, 6H); 1,27 (s, 9H); 0,94 (s, 9H). 5-ferc-Butil-3-(2-r2-metilpropan-1 -fe/-c-butildifenilsililéter])-1 -(2E)-3-í2-butenal1-benzeno (64). Uma solução de 5-ferc-butil-3-(2-[2-metilpropan-1 -terc-butildifenilsililéter])-1 -(3-[3-metil-2-propenitrilo]benzeno (1,7 g; 3,42 mmol) em DCM anidro (20 ml) foi arrefecida até -78°C e Dibal (3,5 ml de uma solução 1M em tolueno) foi adicionada gota a gota. A mistura reaccional foi agitada a -78°C durante 60 min., extinta com excesso de sal de Rochelle, em seguida deixada aquecer até à TA. Foi adicionado EtOAc (50 ml) e a mistura foi lavada com água (3 x 20 ml) e salmoura (3 x 20 ml). A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e evaporada até à secura a fim de originar um resíduo, o qual foi purificado por s.g.c. a fim de produzir 1,25 g do aldeído desejado (rendimento de 74%): 1H NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 10,17 (d, 1H, J = 8 Hz); 7,48-7,22 (mm, 13H, ArH); 6,36 (d, 1H, J = 8 Hz); 3,60 (s, 2H); 2,54 (s, 3H); 1,37 (s, 6H); 1,32 (s, 9H); 0,94 (s, 9H). (2£,4£,6£)-7-(5-ferc-butil-3-(2-(2-metilpropan-1 -ol)1-1 '-benzeno)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (66). Uma solução de 3-etoxicarbonil-2-metilprop-2-enilfosfonato de dietilo (1,20 g; 4,52 mmol) em THF anidro (20,0 ml) foi arrefecida até 0°C e foi adicionada com DMPU anidro (3,5 ml) e n-BuLi em hexanos (2,15 ml de uma solução 2,0M, 4,50 mmol). A mistura foi agitada a esta temperatura durante 20 min., de seguida arrefecida até -78°C. Uma solução de 5-ferc-butil-3-(2-[2-metilpropano-1 -ferc-butildifenilsililéter])-1 -(3-[3-metil-2-propenal]benzeno (1,25 g, 2,52 mmol) em THF (10,0 ml) foi lentamente adicionada e a mistura reaccional foi agitada a -78°C durante um período adicional de 60 min. A mistura foi deixada aquecer até 23°C durante 1 h com agitação. Foi adicionada uma solução sat. de cloreto de amónio (5 ml) e a mistura foi extractada utilizando EtOAc (3x10 ml). A camada orgânica foi lavada com água (2 x 25 ml) e salmoura (50 ml), seca sobre MgS04 e concentrada. O resíduo foi purificado numa coluna de s.g.c. curta a fim de originar 1,35 g (rendimento de 86%) do éster desejado (65). 0 éter silílico anterior (1,05 g, 1,68 mmol) foi dissolvido em THF (20 ml) e foi adicionado
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 45 fluoreto de tetrabutilamónio (17 ml de uma solução 1M em THF). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 12 h, e foi adicionado EtOAc (50 ml), seguido por lavagem com água (2 x 20 ml), e salmoura (20 ml). A camada orgânica foi separada, seca sobre MgS04 e evaporada até à secura. O resíduo foi purificado por s.g.c. a fim de produzir 479 mg (rendimento de 80%) do álcool desejado: Ή NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,9 (d, 1H, J = 16 Hz, 2:isómero cis;~ 15%); 7,34 (s, 2H),; 7,29 (s, 1H); 7,03 (dd, 1H, J = 16 Hz); 6,53 (d, 1H, J = 12 Hz); 6,38 (d, 1H, J = 16 Hz); 5,72 (s, 1H); 5,68 (s, 1H, 2:isómero cis; "15%); 4,15 (q, 2H, J = 6,7 Hz); 3,62 (s, 2H); 2,38 (s, 3H); 2,28 (s, 3H); 1,6 (s Ig, 1H); 1,37 (s, 6H); 1,33 (s, 9H); 1,26 (t, 3H, J = 6,7 Hz). (2£,4Ε6£)-7-(5-^6/τ-6υΐ'ιΙ-3-ί2-(2^θΐΐΙΡΓ0Ρ3η-1 -al)1-1 '-fenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (67), A uma mistura sob agitação vigorosa de clorocromato de piridínio (350 mg; 1,39 mmol) e celite (750 mg) em DCM (20 ml) foi adicionada uma solução de (2£,4£,6£)-7-(5-fe/'c-butil-3-[2-(2-metilpropan-1-ol)]-1 '-fenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (330 mg; 0,889 mmol) em DCM (10 ml). A mistura foi agitada durante 3 h à TA e filtrada sobre uma almofada curta de gel de sílica. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por s.g.c. a fim de produzir 290 mg do aldeído desejado (rendimento de 87%): 1H NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 9,5 (s, 1H); 7,9 (d, 1H, J=16 Hz, 2:isómero c/s;" 15%); 7,34 (s, 2H),; 7,29 (s, 1H); 7,03 (dd, 1H, J = 16 Hz); 6,53 (d, 1H, J = 12 Hz); 6,38 (d, 1H, J = 1 6 Hz); 5,79 (s, 1H); 5,68 (s, 1H, 2:isómero cis; ~15%); 4,15 (q, 2H, J = 6,7 Hz); 3,62 (s, 2H); 2,38 (s, 3H); 2,28 (s, 3H); 1,37 (s, 6H); 1,33 (s, 9H); 1,26 (t, 3H, J = 6,7 Hz). p-Toluenossulfonil-hidrazona de (2EAE.QE)-l-[5-terc-bui\\-3-\2-(2-rr\eti\OTooan-'\ -al)1-1'-fenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (68). A uma solução de (2£,4£,6£)-7-(5-íe/'c-butil-3-[2-(2-metilpropanal)]-1 '-fenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (250 mg; 0,67 mmol) em etanol (5 ml) foi adicionada p-toluenossulfonil-hidrazida (137 mg; 0,73 mmol) e "10 ml de HCI conc. A mistura foi aquecida a 40-45°C durante 15 min. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por s.g.c. a fim de produzir 330 mg (rendimento de 89%): Ή NMR (CDCI3; 400 MHz) δ (ppm): 7,82 (d, 2H, J = 7,4 Hz); 7,5 (2s, 2H); 7,3 (d, 2H, J = 7,4 Hz); 7,18 (s, 1H); 7,05 (s, 1H); 7,0 (dd, 1H, J = 16 Hz); 6,45 (d, 1 H, J = 1 2 Hz); 6,38 (d, 1 H, J = 12 Hz); 5,82 (s, 1 H); 4,2 (q, 2H, J = 6,7 Hz);
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 46 3,62 (s, 2H); 2,42 (s, 3H); 2,38 (s, 3H); 2,28 (s, 3H); 1,37 (s, 6H); 1,33 (s, 9H), 1,26 (t, 3H, J = 6,7 Hz). Ácido (2E4E,6^-7-(3,5-di-ferc-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico (69)**. A uma solução de p-toluenossulfonil-hidrazona de (2£,4£,6£)-7-(5-ferc-butil-3-[2-(2-metilpropan-1 -al)]-1 '-fenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo (68) (80 mg) em ácido acético (2,0 ml) foi adicionado boro-hidreto de sódio* (80 mg) em pequenas porções. A mistura foi aquecida a 50°C durante 1h, arrefecida até à TA e adicionada a gelo; deixou-se aquecer até à temperatura ambiente e extractou-se com EtOAc (3 x 10 ml). A camada orgânica foi lavada com água (3 x 10 ml), NaHC03 (2x10 ml), água (3x10 ml), salmoura (3x10 ml), seca sobre MgS04 e evaporada. O resíduo foi purificado por s.g.c. a fim de originar o éster desejado. Este éster (20 mg) foi dissolvido em EtOH, foi adicionado KOH 1M (1 ml), e a mistura foi aquecida em refluxo durante 3 h. A mistura reaccional foi arrefecida até à TA, neutralizada com HCI (10%) e extractada com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água (3x10 ml), salmoura (3 x 10 ml), seca sobre MgS04 e evaporada a fim de produzir o ácido desejado.
Os peritos na arte reconhecerão que o protocolo anterior pode ser adaptado a fim de utilizar NaBnH4 (n = 1, 2, 3) marcado e radiomarcado a fim de produzir os compostos marcados (por ex., marcados com trítio) representados no Esquema 6.
Ademais, os peritos na arte reconhecerão que o mesmo composto marcado com deutério e trítio (69) pode ser obtido a partir da hidrazona (68) com aquecimento durante 8 h em metanol na presença de NaCNBnH3 (n = 1, 2, 3) e ZnCI2, seguido por saponificação (KOH, EtOH). Numa outra concretização alternativa, o aldeído (67) é reduzido com NaBnH4 (N = 1, 2, 3) radiomarcado, e o álcool resultante é de seguida oxidado no aldeído tritiado correspondente. A conversão do referido aldeído na sua tosil-hidrazona , seguida pela redução com cianoboro-hidreto de sódio e ZnCI2 em metanol, e saponificação, produz o ácido correspondente (Ver 68 a 69 do Esquema 6).
Avaliação da actividade da sub-família de receptores de retinóides
Utilizando o ensaio "cis-trans" ou de "cotransfecção" descrito por Evans et a/., Science. 240: 889-95 (13 de Maio de 1988), cuja descrição é aqui incorporada por referência, os compostos retinóides do presente invento foram 47 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ testados e verificou-se que possuem forte actividade específica quer como agonistas selectivos do RAR, quer como agonistas selectivos do RXR, quer como activadores pan-agonistas de ambos os receptores RAR e RXR. Este ensaio é descrito com maior detalhe nas Patentes dos E.U.A. Nos. 4 981 784 e 5 071 773, cujas descrições são aqui incorporadas por referência. O ensaio de cotransfecção proporciona um método para a identificação de agonistas funcionais que imitam, ou de antagonistas que inibem, o efeito de hormonas nativas, e para a quantificação da sua actividade para proteínas responsivas a IR. A este respeito, o ensaio de cotransfecção imita um sistema in vivo no laboratório. Notavelmente, a actividade no ensaio de cotransfecção correlaciona-se muito bem com a actividade in vivo conhecida, de modo que o ensaio de cotransfecção funciona como uma previsão qualitativa e quantitativa da farmacologia in vivo de um composto testado. Ver, por ex.. T. Berger et al., 41 J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 773 (1992), cuja descrição é aqui incorporada por referência.
No ensaio de cotransfecção, um ADNc clonado para um IR (por ex., RARa, RARp, RXRy) sob o controlo de um promotor constitutivo (por ex., o promotor SV 40) é introduzido por transfecção (um processo para induzir as células a aceitarem genes estranhos) numa célula de fundo substancialmente desprovida de IR endógenos. Este gene introduzido dirige as células receptoras a produzirem a proteína IR com interesse. Também é introduzido nas mesmas células um segundo gene (cotransfectado) em conjunto com o gene IR. Este segundo gene, compreendendo o ADNc para uma proteína repórter, tal como a luciferase de pirilampo (LUC), é controlado por um promotor responsivo à hormona apropriado contendo um elemento responsivo à hormona (HRE). Este plasmídeo repórter funciona como um repórter para a actividade de transcrição-modulação do IR alvo. Assim, o repórter actua como um substituto para os produtos (ARNm, depois proteína) normalmente expressos por um gene sob o controlo do receptor alvo e da sua hormona nativa. 0 ensaio de cotransfecção pode detectar pequenas moléculas agonistas ou antagonistas dos IR alvo. A exposição das células transfectadas a um composto ligando agonista aumenta a actividade repórter nas células transfectadas. Esta actividade pode ser convenientemente medida, por ex., pelo aumento da produção de luciferase, o qual reflecte aumentos mediados por IR e
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 48 dependentes do composto na transcrição repórter. A fim de detectar antagonistas, o ensaio de cotransfecção é levado a cabo na presença de uma concentração constante de um agonista do IR alvo (por ex,, ácido todo-trans retinóico para o RARa) que se sabe induzir um sinal repórter definido. 0 aumento das concentrações de um suspeito antagonista diminuirá o sinal repórter (por ex., a produção de luciferase). O ensaio de cotransfecção é, por conseguinte, útil na detecção quer de agonistas quer de antagonistas de IR específicos. Mais, determina não apenas se um composto interage com um IR particular, mas também se esta interacção imita (é agonista) ou bloqueia (antagoniza) os efeitos das moléculas reguladoras nativas sobre a expressão do gene alvo, bem como a especificidade e a intensidade desta interacção. A actividade dos compostos retinóides do presente invento foi avaliada utilizando o ensaio de cotransfecção de acordo com o seguinte Exemplo 23 ilustrativo. EXEMPLO 24
Ensaio de cotransfecção Células CV-1 (fibroblastos de rim de macaco verde Africano) foram cultivadas na presença de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com resina de carvão a 10% - soro de bovino fetal fraccionado, sendo de seguida transferidas para placas de microtitulação de 96 poços um dia antes da transfecção. A fim de determinar a actividade agonista para o RAR e/ou o RXR dos compostos do presente invento, as células CV-1 foram transfectadas de modo transiente por coprecipitação com fosfato de cálcio de acordo com o processo de Berger et a!., 41 J. Steroid Biochem. Mol. Bioi. 773 (1992), com os seguintes plasmídeos de expressão de receptor: pRShRARa, Giguere et ai, 330 Nature. 624 (1987); pRShRARp e pRShRARy, Ishikawa et a/., 4 Mol. Endocrin.. 837 (1990); pRShRXRa, Mangelsdorf et a!., 345 Nature. 224 (1990); e pRSmRXRp e pRSmRXRy, Mangelsdorf et al., 6 Genes & Deve!.. 329 (1992), cujas descrições são aqui incorporadas por referência. Cada um destes plasmídeos de expressão de receptor foi cotransfectado numa concentração de 5 ng/poço, em conjunto com um plasmídeo repórter basal a 100 ng/poço, o
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 49 plasmídeo de controlo interno pRS-p-Gal a 50 ng/poço e ADN de carga, pGEM a 45 ng/poço. O plasmídeo repórter basal D-MTV-LUC (Hollenberg e Evans, 55 Cell. 899 (1988), cuja descrição é aqui incorporada por referência) contendo duas cópias do elemento de resposta palindrómico TRE descrito em Umesono et ai, 336 Nature, 262 (1988), cuja descrição é aqui incorporada por referência, foi utilizado em transfecções para os RAR, e o plasmídeo repórter CRBPIIFKLUC, o qual contém um RXRE (elemento de resposta do receptor de retinóides X, tal como descrito em Mangelsdorf et ai, 66 Cell, 555 (1991), cuja descrição é aqui incorporada por referência), foi utilizado em transfecções para os RXR. Cada um destes plasmídeos repórter contem o ADNc para a luciferase de pirilampo (LUC) sob um promotor constitutivo contendo o elemento de resposta RAR ou RXR apropriado. Tal como anteriormente salientado, o pRS-p-Gal, que codifica a expressão constitutiva da β-galactosidadase (β-Gal) de E.coli, foi incluído como um controlo interno para avaliação da eficiência da transfecção e da toxicidade do composto.
Seis horas após a transfecção, o meio foi removido e as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Meios contendo compostos do presente invento em concentrações variando desde 10'12 até 10'5 M foram adicionados às células. De forma semelhante, os compostos de referência, ácido todo-trans retinóico (ATRA) (Sigma Chemical), um composto selectivo para os RAR conhecido, e ácido 9-c/s retinóico (9-cis) (sintetizado tal como descrito em Heyman et ai, Cell, 68: 397-406 (1992)), um composto com conhecida actividade sobre os RXR, foram adicionados em concentrações semelhantes a fim de proporcionar um ponto de referência para a análise da actividade dos compostos do presente invento. A pureza de retinóides foi determinada como sendo superior a 99% por cromatografia líquida de elevado rendimento de fase inversa. Os retinóides foram dissolvidos em dimetilsulfóxido para utilização nos ensaios de activação da transcrição. Foram utilizadas três a quatro réplicas para cada amostra.
Após 40 horas, as células foram lavadas com PBS, lisadas com um tampão baseado em Triton X-100 e analisadas quanto às actividades da LUC e 50 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ da β-Gal utilizando um luminómetro ou espectrofotómetro, respectivamente. Para cada réplica, foi calculada a resposta normalizada (RN) como: resposta de LUC / taxa de β-Gal onde taxa de β-Gal = β-Gal·! x1 0"5/tempo de incubação da β-Gal.
Foram calculados a média e o erro padrão da média (SEM) da RN. Os dados foram representados como a resposta do composto comparada com os compostos de referência ao longo da gama da curva de dose-resposta. Para os compostos agonistas do presente invento, foi quantificada a concentração eficaz que produziu 50% da resposta máxima (ECS0). A potência (nM) dos compostos retinóides seleccionados do presente invento seleccionados encontra-se representada na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Potência (nM) de compostos retinóides seleccionados do presente invento sobre RARa, β, y e RXRa, β, y, em comparação com o composto retinóide activo sobre o RAR conhecido, ácido todo-frans retinóico (ATRA), e o composto retinóide activo sobre o RXR conhecido, ácido 9-c/s retinóico (9-c/s), e em comparação com os compostos comparativos para exemplo A, B, Ce D. _* RARa RAR6 RARy RXRa ΡΧΗβ RXRy N° do Pot Pot Pot Pot Pot Pot Composto nM nM nM nM nM nM 9 4 1 < 1 na na na 10 59 23 16 127 48 56 28 na Na na 20 104 50 39 5 3 3 na na na 41 3 1 4 2007 266 2183 43 65 22 16 27 27 19 47 na 1 1 na na na 54 na 130 320 58 28 78 ATRA 436 78 19 1015 1211 961 9-c/s 220 29 50 195 128 124 A na 1484 na na na na B na Na na na na na C na Na na na na na D na Na na na na na na = não activo (potência >10 000 e/ou eficácia <20%)
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 51
Tal como pode ser observado na Tabela 1, os Compostos 9, 39, 41 e 47 são compostos activos sobre os RAR extremamente potentes, com o Composto 9 exibindo actividade sub-nanomolar sobre o RARy e o Composto 47 exibindo selectividade sobre RARp e RARv. Na realidade, estes Compostos são 10 a mais de 100 vezes mais potentes sobre os RAR do que o composto activo sobre o RAR conhecido ATRA. Da mesma maneira, o Composto 28 é um composto activo sobre o RXR muito potente e selectivo. Mais, os Compostos 10 e 43 pan-agonistas exibem um perfil de potência superior àquele do composto pan-agonista activo sobre o RXR conhecido, ácido 9-c/s retinóico. Embora a eficácia não se encontre exposta na Tabela 1, os compostos que exibem uma eficácia inferior a 20 por cento são considerados como sendo inactivos como activadores retinóides (potência definida como >10 000), mesmo se os compostos exibem potência marginal. A este respeito, excepto para o composto comparativo A sobre o RARβ, todos os compostos comparativos para exemplo exibem eficácias inferiores a 20 por cento. A actividade retinóide dos compostos do presente invento para os receptores RAR e/ou RXR não é manifestada por outros compostos estruturalmente semelhantes conhecidos. Tal como adicionalmente representado na Tabela 1, os compostos comparativos para exemplo que parecem estruturalmente semelhantes aos compostos do presente invento, tais como o ácido (2E, 4E, 6E)-3-metil-7-(3,4-dimetoxifenil)octa-2,4,6-trienóico (A) e o ácido (2E, 4E, 6£)-3-metil-7-(4-metoxifenil)octa-2,4,6-trienóico (B) descritos em M.J. Aurell et a/., 49 Tetrahedron, 6089 (1993) (Esquema 2, compostos d e e), o ácido (2E, ΑΈ, 6£)-2-metil-7-(2,3,4-trimetil-4-metoxifenil)hepta-2,4,6-trienóico (C) exposto na patente dos E.U.A. N°. 4 534 979 (Exemplo 17), e o ácido (2E, 4£, 6£)-3-metoxi-7-(4-t-butilfeníl)octa-2,4(6-trÍenóico (D) exposto na patente dos E.U.A. N°. 5 320 833 (Composto 80), não apresentam nenhuma, ou virtualmente nenhuma, actividade sobre os RAR e os RXR. EXEMPLO 25
Para além dos dados de cotransfecção do Exemplo 15, a ligação de compostos do presente invento seleccionados aos receptores RAR e RXR também foi investigada de acordo com a metodologia descrita em M. F. Boehm et a/., "Synthesis and Structure-Activity Relationships of Novel Retinoid X Receptor Selective Retinoids", 37 J. Med. Chem., 2930 (1994); M. F. Boehm et
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 52 ai., "Synthesis of High Specific Activity [3H]-9-c/s Retinoic Acid and Its Application for Identifying Retinoids with Unusual Binding Properties", 37 J. Med. Chem., 408 (1994), e E. A. Allegretto et a!., "Characterization and Comparison of Hormone-Binding and Transactivation Properties of Retinoic Acid and Retinoid X Receptors Expressed in Mammalian Cells and Yeast", 268 J. Bioi. Chem., 22625 (1993), cujas descrições são aqui incorporadas por referência. A ligação não específica foi definida como a ligação persistente na presença de 500 nM do composto não marcado apropriado. No final do período de incubação, separou-se o ligando livre do ligado. A quantidade de retinóides tritiados ligados foi determinada por contagem de cintilação líquida de uma alíquota (700 ml) do fluido sobrenadante ou da pelete de hidroxilapatite.
Após correcção para a ligação não específica, foram determinados os valores da IC50. O valor IC50 é definido como a concentração de ligando competitivo necessária para reduzir a ligação específica em 50%. O valor da IC50 foi determinado graficamente a partir da representação log-logit dos dados. Os valores da K, foram determinados pela aplicação da equação de Cheng-Prussof aos valores da IC50, à concentração do ligando marcado e ao Kd do ligando marcado.
Os resultados da actividade de ligação (Kd em nM) de compostos retinóides do presente invento seleccionados, e dos compostos de referência ATRA e 9-c/s RA, encontram-se representados na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2: Ligação (Kd em nM) de compostos retinóides do presente invento seleccionados sobre proteínas de RARa, β, γ e RXRa, β, γ, em comparação com o composto retinóide activo sobre o RAR conhecido, ácido todo-trans retinóico (ATRA), e o composto retinóide activo sobre o RXR conhecido, ácido 9-c/s retinóico (9-c/'s). _ RARa ΡΑΠβ RARy RXRa ΡΧΡβ RXRy N° do Composto Ligação Kd(nM) Ligação Kd(nM) Ligação Kd(nM) Ligação Kd(nM) Ligação Kd(nM) Ligação Kd(nM) 9 1 2 4 270 924 496 10 59 75 121 4 4 9 ATRA 15 17 17 53 306 306 9-c/s 93 97 148 8 15 14 53 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ
Tal como pode ser observado na Tabela 2, os Compostos 9 e 10 do presente invento mostram ligação igual ou superior à do composto activo sobre o RAR conhecido ATRA, e à do composto activo sobre o RXR conhecido 9-cis. Em comparação, todos os compostos comparativos para exemplo do Exemplo 24 não mostram absolutamente qualquer ligação sobre qualquer dos receptores de retinóides, com a excepção do composto comparativo do exemplo A, o qual mostra ligação fraca de 312 nM sobre o RARa. EXEMPLO 26
Ainda outra medição reconhecida da actividade retinóide dos compostos do presente invento é o ensaio da ornitina-descarboxilase, tal como originalmente descrito por Verma e Boutwell, 37 Câncer Research. 2196 (1977), cuja descrição é aqui incorporada por referência. No trabalho original de Verma & Boutwell utilizando ácido retinóico, foi determinado que a actividade da ornitina-descarboxilase (ODC) aumenta em relação com a biossíntese de poliamina. Por sua vez, tinha sido anteriormente determinado que o aumento da biossíntese de poliamina está correlacionado com a proliferação celular. Assim, se a actividade da ODC puder ser inibida, a hiperproliferação celular pode ser modulada. Embora todas as causas de actividade da ODC aumentada ainda sejam desconhecidas, sabe-se que o 1 2-0-tetradecanoilforbor-1 3-acetato (TPA) induz a actividade da ODC. Notavelmente, o ácido retinóico inibe esta indução da ODC pelo TPA.
Um ensaio da ODC seguindo essencialmente os procedimentos expostos em 35 Câncer Research1662(1975), cuja descrição é aqui incorporada por referência, foi utilizado para demonstrar a inibição da indução pelo TPA da ODC pelos compostos do presente invento. Os resultados deste ensaio em Compostos de Exemplo seleccionados, e nos compostos de referência ATRA e ácido (E)-4-[2-(5,6,7,8-tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1 -propenil]-benzóico (TTNPB), compostos activos sobre o RAR conhecidos, encontram-se representados na Tabela 3. Todos os valores encontram-se expressos como a concentração dos compostos indicados em nM necessária para inibir a indução pelo TPA da ODC em 80 por cento, isto é, o ICS0 em nM. 54 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ
Tabela 3: Concentração inibitória necessária para inibir 80% da indução pelo TPA da ODC (ODC IC80) em nM máxima observada para os Compostos 7, 8, 9 e 10, e para os compostos de referência ATRA e TTNPB._
Composto ODC IC30 (nM) 7 4,73 8 152 9 0,93 10 6,62 ATRA 1,40 TTNPB 0,09
Os compostos 7 e 8, os quais são os ésteres dos Compostos 9 e 10, respectivamente, foram incluídos a fim de mostrar que os referidos análogos éster exibem actividade retinóide. Embora não estando ligado a uma teoria de operação, crê-se que os referidos ésteres podem operar como prodrogas in vivo, possivelmente devido a clivagem do éster na forma de ácido activa dos compostos do presente invento. EXEMPLO 27
Foi investigada a influência in vitro de compostos do presente invento seleccionados sobre linhas de células cancerosas reconhecidas, RPMI 8226, ME 180 e AML-193, obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockeville, MD). A RPMI 8226 é uma linha de células hematopoiéticas humanas obtidas a partir do sangue periférico de um doente com mieloma múltiplo, e como tal é um modelo reconhecido para mielomas múltiplos e doenças malignas relacionadas. Y. Matsuoka, G. E. Moore, Y. Yagi e D. Pressman, "Prodution of free light chains of immunoglobulin by a hematopoietic cell line derived from a patient with multiple myeloma", 125 Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 1246 (1967), cuja descrição é aqui incorporada por referência. Estas células assemelham-se às células linfoblastóides de outras linhas de células de linfócitos humanos e segregam cadeias leves de imunoglobulina do tipo λ. As células RPMI 8226 foram cultivadas em meio RPMI (Gibco) suplementado com 10% de soro de bovino fetal, glutamina e antibióticos. As células foram mantidas como culturas em suspensão crescidas a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5% em ar. As células foram diluídas até uma concentração de 1 x 105/ml duas vezes por semana.
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 55 Α ΜΕ 180 é uma linha de células de carcinoma epidermóide humano derivada a partir do cérvix, e como tal é um modelo reconhecido para carcinomas de células escamosas e doenças malignas relacionadas. J.A. Sykes, J. Whitescarver, P. Jernstrom, J. F. Nolan e P. Byatt, "Some properties of a new epithelial cell line of human origin", 45 MH-Adenoviridae J. Natl. Câncer Inst., 107 (1970), cuja descrição é aqui incorporada por referência. O tumor era um carcinoma de células escamosas altamente invasivo com agrupamentos de células irregulares e sem queratinização significativa. As células ME 180 foram crescidas em meio de McCoy 5a (Gibco) suplementado com 10% de soro de bovino fetal, glutamina e antibióticos. As células foram mantidas como culturas em monocamada cultivadas a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5% em ar. A linha de células AML-193 foi estabelecida a partir de blastócitos de um doente com leucemia e foi classificada como Leucemia Monocítica Aguda M5, e como tal é um modelo reconhecido para leucemias e doenças malignas relacionadas. G. Rovera et a!., 139 J. Immunol., 3348 (1987), cuja descrição é aqui incorporada por referência. Mais de 75% destas células são positivas por imunofluorescência para o antigénio mielomonocítico CS15. As células foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado por Iscove com 5 pg/ml de transferrina, 5pg/ml de insulina e 2 ng/ml de rh GM-CSF. As células foram mantidas como culturas em suspensão crescidas a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5% em ar. As células foram diluídas até uma concentração de 1 x 105/ml duas vezes por semana.
Incorporação de 3H-Timidina A medição do nível de timidina radiomarcada incorporada nas linhas de células acima identificadas proporciona uma medição directa das propriedades anti-proliferativas dos compostos do presente invento O método utilizado para determinação da incorporação da timidina radiomarcada foi adaptado a partir do procedimento descrito por S. Shrivastav et al., "An in vitro assay procedure to test chemotherapeutic drugs on cells from human solid tumors", 40 Câncer Res., 4438 (1980), cuja descrição é aqui incorporada por referência. As células RPMI 8226 ou AML-193 foram plaqueadas numa placa de microtitulação de 96 poços de fundo redondo (Costar) com uma densidade de 1 000 células/poço. A poços apropriados, foram adicionados os compostos retinóides em teste na 56 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ concentração final indicada para um volume final de 150 μΙ/poço. As placas foram incubadas durante 96 horas a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5% em ar. Subsequentemente, 1 uCi de [5'-3H]-timidina (Amersham, Reino Unido, 43 Ci/mmol de actividade específica) em 25 μΙ de meio de cultura foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas durante um período adicional de seis horas. As culturas foram posteriormente processadas como descrito abaixo. Células ME 180, colhidas por tripsinização foram plaqueadas numa placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano (Costar) com uma densidade de 2 000 células/poço. As culturas foram tratadas como descrito acima para RPMI 8226 com as seguintes excepções. Após incubação, o sobrenadante foi cuidadosamente removido, e as células foram lavadas com uma solução 0,5 mM de timidina em solução salina tamponada com fosfato. As células ME 180 foram sumariamente tratadas com 50 μΙ de tripsina a 2,5% a fim de desalojar as células da placa. Ambas as linhas de células foram de seguida processadas como se segue: o ADN celular foi precipitado com ácido tricloroacético a 10% para matrizes de filtro de fibra de vidro utilizando um segador de células de poços múltiplos SKATRON (Skatron Instruments, Sterling VA). A radioactividade incorporada no ADN, como uma medição directa do crescimento celular, foi medida por contagem de cintilação líquida. Foi determinada a média de desintegrações por minuto da timidina incorporada a partir de poços em triplicados. A IC50 (concentração em nM necessária para inibir 50% da incorporação de timidina máxima observada) para os Compostos 9 e 10 do presente invento, e para os compostos de referência ATRA e TTNPB, encontra-se representada abaixo nas Tabelas 4, 5 e 6 para as linhas de células RPMI 8226, ME 180 e AML-193, respectivamente.
Viabilidade
Os compostos do presente invento seleccionados também foram avaliados a fim de determinar a sua citotoxicidade sobre as linhas de células acima identificadas. O processo utilizado foi idêntico, apenas com ligeiras modificações, ao do ensaio descrito em T. Mosmann, "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", 65 J. Immunol. Meth., 55 (1983), cuja descrição é aqui incorporada por referência. As células RPMI 8226 ou AML-193 foram plaqueadas numa
84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 57 placa de microtitulação de 96 poços de fundo redondo (Costar) com uma densidade de 1 000 células/poço. A poços apropriados, foram adicionados os compostos retinóides em teste na concentração final indicada para um volume final de 1 50 μΙ/poço. As placas foram incubadas durante 96 horas a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5% em ar. Subsequentemente, 1 5 μΙ de um corante de tetrazólio esterilizado por filtração em solução salina tamponada com fosfato (Promega, Madison, Wl) foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas durante um período adicional de quatro horas. As manipulações subsequentes das culturas foram tal como descrito abaixo. Células ME 180, colhidas por tripsinização foram plaqueadas numa placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano (Costar) com uma densidade de 2 000 células/poço. As culturas foram tratadas tal como descrito acima para RPMI8226.
Após a incubação de quatro horas, 100 μΙ de uma solução de interrupção/ solubilização foram adicionados a cada poço (Promega, Madison, Wl). As placas foram deixadas em repouso durante toda a noite a 37°C na atmosfera humidificada. A absorvância a um comprimento de onda de 570-600 nm foi registada para cada poço utilizando um leitor de placas de ELISA de Biomek (Beckman Instruments). A IC50 (concentração em nM necessária para inibir 50% da função mitocondrial, e em última análise, a viabilidade das células) para os Compostos 9 e 10 do presente invento, e para os compostos de referência ATRA e TTNPB, também se encontra representada abaixo nas Tabelas 4, 5 e 6 para as linhas de células RPMI 8226, ME 180 e AML-193, respectivamente.
Tabela 4: Concentração inibitória necessária para inibir 50% da timidina radiomarcada (TdR IC50) em nM máxima observada, e concentração inibitória necessária para inibir 50% da função mitocondrial (MTS IC50) em nM, para os Compostos 9 e 10, e para os compostos de referência ATRA e TTNPB, na linha de células RP Ml 8226. Composto TdR IC50 (nM) MTS IC50 (nM) 9 0,3 253 10 60 570 ATRA 102 756 TTNPB 0,2 10
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Tabela 5: Concentração inibitória necessária para inibir 50% da timidina radiomarcada (TdR IC50) em nM máxima observada, e concentração inibitória necessária para inibir 50% da função mitocondrial (MTS IC50) em nM, para os compostos 9 e 10, e para os compostos de referência ATRA e TTNPB, na linha de células ME 180.
Composto TdR IC50 (nM) MTS IC50 (nM) 9 0,1 1,3 10 62 370 ATRA 253 890 TTNPB 0,4 187
Tabela 6: Concentração inibitória necessária para inibir 50% da timidina radiomarcada (TdR IC50) em nM máxima observada, e concentração inibitória necessária para inibir 50% da função mitocondrial (MTS IC50) em nM, para os compostos 9 e 10, e para os compostos de referência ATRA e TTNPB, na linha de células AML-193.
Composto TdR IC50 (nM) MTS IC50 (nM) 9 0,1 1000 10 0,01 1000 ATRA 197 1000 TTNPB 0,1 1000 EXEMPLO 28
Os exemplos seguintes proporcionam formulações de composições farmacológicas ilustrativas:
As cápsulas de gelatina dura são preparadas utilizando os seguintes ingredientes:
Quantidade (ma/cápsula) Composto 9 140 Amido, seco 100 Estearato de magnésio 10 Total 250 mg
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Os ingredientes acima são misturados e colocados dentro de cápsulas de gelatina dura em quantidades de 250 mg.
Um comprimido é preparado utilizando os ingredientes abaixo:
Quantidade (mq/comprimido)
Composto 9 140 Celulose microcristalina 200 Dióxido de silício vaporizado 10 Ácido esteárico 10 Total 360
Os componentes são combinados e submetidos a compressão sob a forma de comprimidos, cada um pesando 360 mg.
Comprimidos, cada um contendo 60 mg de ingrediente activo, são preparados como se segue:
Quantidade (mq/comprimido)
Composto 9 60
Amido 45
Celulose, microcristalina 35
Polivinilpirrolidona (PVP) 4 (como uma solução a 10% em água)
Amido carboximetilsódico 4,5 (SCMS)
Estearato de magnésio 0,5
Talco 1,0
Total 150 mg O ingrediente activo, amido, e celulose são passados através de um crivo de malha N°. 45 dos E.U.A. e cuidadosamente misturados. A solução de PVP é misturada com o p,ó resultante, o qual é de seguida passado através de um crivo de malha N°. 14 dos E.U.A. Os grânulos assim produzidos são secos a 50°C e passados através de um crivo de malha N°. 18 dos E.U.A. O SCMS, o estearato de magnésio, e o talco, previamente passados através de um crivo de malha N°. 60 dos E.U.A., são de seguida adicionados aos grânulos os quais, após mistura,
60 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ são submetidos a compressão numa máquina para comprimidos a fim de produzir comprimidos, cada um pesando 150 mg.
Supositórios, cada um contendo 225 mg de ingrediente activo, podem ser preparados como se segue: 225 mg 2 000 mg
Composto 9
Glicéridos de ácidos gordos saturados
Total 2 225 mg O ingrediente activo é passado através de um crivo de malha N°. 60 dos E.U.A. e suspenso nos glicéridos de ácidos gordos saturados previamente fundidos utilizando o mínimo calor necessário. A mistura é de seguida vertida para dentro de um molde para supositório com capacidade de 2 g normal e deixada arrefecer.
Uma formulação endovenosa pode ser preparada como se segue:
Composto 9 100 mg
Solução salina isotónica 1 000 ml
Glicerol 100 ml O composto é dissolvido no glicerol e em seguida a solução é lentamente diluída com solução salina isotónica. A solução dos ingredientes acima é de seguida administrada, a um doente, por via endovenosa a uma taxa de 1 ml por minuto.
Embora, de acordo com os estatutos de patentes, tenham sido proporcionadas a descrição das concretizações e as condições de processamento preferidas, o âmbito do invento não se encontra limitado às mesmas ou pelas mesmas.
Por conseguinte, para uma compreensão do âmbito do presente invento, é feita referência às reivindicações seguintes.
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Claims (42)

  1. 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 1/10
    REIVINDICAÇÕES 1. Composto com as fórmulas:
    (D (Π) m
    00 em que: R1, R2 e R4, cada um independentemente, são hidrogénio, arilo, heteroarilo, CF3 ou um alquilo, alcenilo, alcinilo, fluoroalquilo ou perfluoroalquilo C2-C6, facultativamente substituído com 14CH3, 13CH3, CD3, C3H3, e/ou 13CD3, desde que, no entanto, R1 e R4 nos compostos de fórmula geral (I) não possam ser ambos hidrogénio; R3 e R5, cada um independentemente, são hidrogénio, CF3, um alquilo, alcenilo ou alcinilo CrC3, um fluoroalquilo ou perfluoroalquilo C, a C3, ou OR6, onde R6 é hidrogénio, CF3, um alquilo, alcenilo ou alcinilo C,-C2, ou um fluoroalquilo ou perfluoroalquilo C, a C2, desde que, no entanto, R1 e R5 não possam ser CF3 ou alquilo, alcenilo, alcinilo, fluoroalquilo ou perfluoroalquilo, quando R3 é CF3 ou alquilo, alcenilo, alcinilo, fluoroalquilo ou perfluoroalquilo; R7 é um alquilo, alcenilo ou alcinilo CrC4, facultativamente substituído com 14CH3, 13CH3, CD3, C3H3, e/ou 13CD3 ou CH2OR8, onde R8 representa
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 3/10 hidrogénio, um alquilo, alcenilo ou alcinilo C:-C6, um cicloalquilo C3-C7 saturado ou não saturado facultativamente substituído com um alquilo, alcenilo ou alcinilo C.,-C4, F, Cl, Br, I, OH, CF3, OR6, NR6, onde R6 tem a definição dada acima; R9 é um alquilo, alcenilo ou alcinilo C,-C4; R10 a R15, cada um independentemente, são hidrogénio, um alquilo, alcenilo ou alcinilo C^Cg ou CF3; X é COOR16, CONHR17, ou CONR17R18, onde R16 representa hidrogénio ou um alquilo, alcenilo ou alcinilo CrC6, e onde R17 e R18, cada um independentemente, representam um alquilo, alcenilo ou alcinilo C^Cg, ou um arilo ou heteroarilo facultativamente substituído com OH, F, Br, Cl ou I, desde que, no entanto, R17 e R18 não possam ser ambos um arilo ou heteroarilo; Y é C, O, S ou N, desde que, quando Y é O, então R14 e R15 não existam, e quando Y é N, então R14 e R15 não possam ser CF3, e quando Y é S, então R14 e R15 possam independentemente ou em conjunto representar O, ou possam estar ambos ausentes; W é N ou CR16, onde R16 tem a mesma definição dada acima; R19 é um arilo ou heteroarilo facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo composto por hidrogénio, F, Cl, Br, I ou um alquilo, alcenilo ou alcinilo C,-C6, em que X tem a mesma definição dada acima; n é 0, 1ou 2; as linhas tracejadas designam ligações duplas facultativas; as linhas onduladas representam ligações carbono-carbono nas configurações cis ou trans, desde que, no entanto, quando R1, R2, R4 e R5 são todos hidrogénio, então R3 não possa ser arilo; e desde que no máximo três de entre R1, R2, R3, R4 e R5 possam ser hidrogénio, quando não existe qualquer ligação dupla adjacente a R7.
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R\ R2 e R4 independentemente representam alquilos, alcenilos, alcinilos, fluoroalquilos ou perfluoroalquilos ramificados C3-C6.
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R2 e R4 independentemente representam alquilos, alcenilos, alcinilos, fluoroalquilos ou perfluoroalquilos ramificados C3-C6, e R\ R3 e R5 são todos hidrogénio.
  4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R2 e R4 independentemente representam isopropilo, t-butilo ou CF3, e R', R3 e R5 são todos hidrogénio.
  5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1, seleccionado a partir do grupo constituído por (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenii)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo; (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienoato de etilo; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; (2£,4£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metilocta-2,4-dienoato de etilo; ácido (2£,4£)-7-{3,5-di-t-butilfeniI)-3-metilocta-2,4-dienóico; (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienoato de etilo; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-t-butilfenil)-3-metildeca-2,4,6-trienóico; (2£,4£,6£)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo; (2£,4£,6Z)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienoato de etilo; ácido (2£,4£,6£)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-6-(6,8-di-t-butilcroman-4-ilideno)-3-metil-hexa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-trifluorometilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-trifluorometilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£(6£)-7-(3,5-di-isopropilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-7-(3,5-di-isopropilfenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-7-(3,5-di-t-butil-4-metoxifenil)-3-metilocta-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6£)-3-metil-7-(3,4-dietilfenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£,4£,6Z)-3-metil-7-(3,4-dietilfenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£, 4£, 6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-butil-4-etoxifenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£, 4£, 6£}-3-metil-7-(3,4-di-t-butilfenil)octa-2,4,6-trienóico; ácido (2£, 4£, 6£)-3-metil-7-ciclo-hexil-7-(3,5-di-t-butilfenil)-hepta-2,4,6-trienóico; ácido {2£, 4£, 6£)-3-metil-7-(3,5-di-t-
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 5/10 butilfenil)nona-2,4,6-trienóico; e ácido (2Ε, Α-Ε, 6Z)-3-metil-7-(3,4-dietil-6- metilfenil)nona-2,4,6-trienóico.
  6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto compreende um composto retinóide.
  7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe 50% da potência de activação máxima de um ou mais receptores de retinóides numa concentração inferior a 100 nM.
  8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe 50% da potência de activação máxima de um ou mais receptores de retinóides numa concentração inferior a 50 nM.
  9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe 50% da potência de activação máxima de um ou mais receptores de retinóides numa concentração inferior a 20 nM.
  10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe 50% da potência de activação máxima de um ou mais receptores de retinóides numa concentração inferior a 10 nM.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe actividade como um agonista selectivo para o RAR
  12. 12. Composto de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é um activador pelo menos duas vezes mais potente do RAR do que do RXR.
  13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é um activador pelo menos cinco vezes mais potente do RAR do que do RXR.
  14. 14. Composto de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é um activador pelo menos dez vezes mais potente do RAR do que do RXR.
  15. 15. Composto de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é um activador pelo menos cem vezes mais potente do RAR do que do RXR.
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 6/10
  16. 16. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe actividade como um agonista selectivo para o RXR
  17. 17. Composto de acordo com a reivindicação 16, em que o composto é um activador pelo menos duas vezes mais potente do RXR do que do RAR.
  18. 18. Composto de acordo com a reivindicação 16, em que o composto é um activador pelo menos cinco vezes mais potente do RXR do que do RAR.
  19. 19. Composto de acordo com a reivindicação 16, em que o composto é um activador pelo menos dez vezes mais potente do RXR do que do RAR.
  20. 20. Composto de acordo com a reivindicação 16, em que o composto é um activador pelo menos cem vezes mais potente do RXR do que do RAR.
  21. 21. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o composto exibe actividade pan-agonista quer como activador do RAR quer como activador do RXR.
  22. 22. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é administrado a um doente na forma de uma unidade de dosagem de cerca de 1 pg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal.
  23. 23. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é administrado a um doente na forma de uma unidade de dosagem de cerca de 10 pg/kg de peso corporal a 250 mg/kg de peso corporal.
  24. 24. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é administrado a um doente como uma unidade de dosagem desde cerca de 20 pg/kg de peso corporal até 100 mg/kg de peso corporal.
  25. 25. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é eficaz no tratamento de doenças e condições relacionadas com a pele, de condições cancerosas e pré-cancerosas, de doenças do olho, de doenças cardiovasculares, de doenças inflamatórias, de doençâs neurodegenerativas, de doenças envolvendo a modulação da apoptose, de doenças do sistema
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 7/10 imunitário, da função pituitária inadequada, de doenças envolvendo o vírus do papiloma humano, na cicatrização de feridas ou na restauração do crescimento capilar.
  26. 26. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  27. 27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que a composição é formulada para administração oral, tópica, endovenosa, por supositório ou parentérica.
  28. 28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que o composto é administrado a um doente na forma de uma unidade de dosagem de cerca de 1 pg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal.
  29. 29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que o composto é administrado a um doente na forma de uma unidade de dosagem de cerca de 10 ,ug/kg de peso corporal a 250 mg/kg de peso corporal.
  30. 30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que o composto é administrado a um doente forma de uma unidade de dosagem de cerca de 20 pg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal.
  31. 31. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que a composição é eficaz no tratamento de doenças e condições relacionadas com a pele, de condições cancerosas e pré-cancerosas, de doenças do olho, de doenças cardiovasculares, de doenças inflamatórias, de doenças neurodegenerativas, de doenças envolvendo a modulação da apoptose, de doenças do sistema imunitário, da função pituitária inadequada, de doenças envolvendo o vírus do papiloma humano, na cicatrização de feridas ou na restauração do crescimento capilar.
  32. 32. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 para preparar uma droga destinada a afectar a actividade do RAR e/ou do RXR pela administração in vivo da droga.
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 8/10
  33. 33. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 6 para preparar uma droga destinada à modulação de processos mediados pelos receptores RAR e/ou RXR pela administração a um doente de uma quantidade eficaz do composto.
  34. 34. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 6 para preparar uma droga destinada ao tratamento de um doente necessitando de terapia retinóide pela administração ao doente de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do composto.
  35. 35. Utilização de acordo com a reivindicação 34, em que o composto é eficaz no tratamento de doenças e condições relacionadas com a pele, de condições cancerosas e pré-cancerosas, de doenças do olho, de doenças cardiovasculares, de doenças inflamatórias, de doenças neurodegenerativas, de doenças envolvendo a modulação da apoptose, de doenças do sistema imunitário, da função pituitária inadequada, de doenças envolvendo o vírus do papiloma humano, na cicatrização de feridas ou na restauração do crescimento capilar.
  36. 36. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26 para preparar uma droga destinada ao tratamento de um doente necessitando de terapia retinóide pela administração ao doente de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição.
  37. 37. Utilização de acordo com a reivindicação 36, em que a composição é eficaz no tratamento de doenças e condições relacionadas com a pele, de condições cancerosas e pré-cancerosas, de doenças do olho, de doenças cardiovasculares, de doenças inflamatórias, de doenças neurodegenerativas, de doenças envolvendo a modulação da apoptose, de doenças do sistema imunitário, da função pituitária inadequada, de doenças envolvendo o vírus do papiloma humano, na cicatrização de feridas ou na restauração do crescimento capilar.
  38. 38. Método para determinação da presença de um ou mais receptores RAR e/ou RXR numa amostra compreendendo a combinação de um composto de acordo com a reivindicação 1 com uma amostra contendo um ou mais
    84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 9/10
    receptores de retinóides desconhecidos, e determinação de se os referidos compostos se ligam a um receptor na amostra.
  39. 39. Complexo ligando-receptor de retinóides formado pela ligação de um composto de acordo com a reivindicação 1 a um receptor RAR e/ou RXR.
  40. 40. Método de purificação de receptores de retinóides compreendendo a combinação de um composto de acordo com a reivindicação 1 com uma amostra contendo receptores RAR e/ou RXR, permitindo que o referido composto se ligue aos referidos receptores, e a separação a partir da combinação ligada do referido composto e dos referidos receptores RAR e/ou RXR.
  41. 41. Método de preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1 marcado com trítio, estrutura I, compreendendo: (a) acoplamento de um trienoatoaldeído de fórmula:
    com uma arilsulfonil-hidrazida a fim de produzir a correspondente hidrazona; e (b) redução da hidrazona com um triteto a fim de produzir o correspondente trienoato marcado com trítio, em que R' e R2 a R10 têm as definições dadas na reivindicação 1.
  42. 42. Método de acordo com a reivindicação 41, compreendendo adicionalmente a saponificação do trienoato marcado com trítio a fim de produzir o correspondente ácido trienóico de fórmula: 84 395 ΕΡ Ο 800 503/ΡΤ 10/10
    em que, R1 Lisboa, e R2 a R10 têm as definições dadas na reivindicação 1. -7 ‘Μ 2090. Por LIGAND PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL -
    ANTÔNIO iOAO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Roa das Flores, 74 - 4«* 1SQQ LISBOA
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