DE69429427T2

DE69429427T2 - Behandlung von tumoren mit verbindungen mit einer rxr-retinoid agonistische wirkung

Info

Publication number: DE69429427T2
Application number: DE69429427T
Authority: DE
Inventors: Roshantha A. Chandraratna; Peter A.J. Davies
Original assignee: Allergan Inc; University of Texas System
Current assignee: Allergan Inc; University of Texas System
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2014-03-11
Also published as: EP1159961A2; ATE210440T1; AU6401494A; EP1159961A3; JPH08509705A; US5399586A; EP0688213A1; EP0909560A3; DE69429427D1; CN1080117C; AU678823B2; CA2157798A1; CN1122105A; EP0688213B1; EP0909560A2; WO1994020093A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Medikamenten zur Induktion der Apoptose bzw. des Zelltods in Tumorzellen, wobei die Medikamente Verbindungen mit agonistenartiger Aktivität an RXR Retinoidrezeptor-Stellen enthalten.

2. Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Verbindungen, die eine retinoidartige Aktivität bzw. Wirksamkeit aufweisen, sind in der Technik wohlbekannt und sind in zahlreichen US und außeramerikanischen sowie auch wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben. Beispiele derartiger Veröffentlichungen sind die EP-A-253 302, WO-A- 93/211 46 (veröffentlicht nach dem Prioritätstag dieser Anmeldung) und Dermatologica 175 (1), 1987, 93-99. Es ist im allgemeinen bekannt und in der Technik akzeptiert, daß eine retinoidartige Aktivität zur Behandlung von Tieren der Spezies Säugetier, einschließlich Menschen, zur Heilung oder Linderung der Symptome und Zustände bzw. Leiden zahlreicher Krankheiten und Leiden wie beispielsweise Dermatosen, Akne, Darierkrankheit, Psoriasis, Ichthyosis, Ekzem und atopische Dermatitis und zur Behandlung und Vorbeugung von malignen hyperproliferativen Erkrankungen, wie beispielsweise Epithelialkrebs bzw. Krebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Kopf- und Halskrebs und myeloische Leukämien, zur Rückbildung bzw. Umkehr und Vermeidung der Atheriosklerose und Restinosis, die sich aus einer neointimalen Hyperproliferation ergibt, zur Behandlung und Verbeugung von anderen nicht malignen hyperproliferativen Erkrankungen, wie beispielsweise endometrialer Hyperplasie, benigner Prostatahypertrophie, proliferativer vitrealer Retinopatie und Dyspiasien, zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und immunologischen Störungen (beispielsweise Lupus Erythematosus), zur Behandlung von chronischen entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise Lungenfibrose, zur Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen, die mit dem Lipidstoffwechsel und Transport verbunden sind, wie beispielsweise Dyslipidämien, zur Förderung der Wundheilung, zur Behandlung des trockenen Auge- Syndroms und zur Rückbildung und Verhinderung der Wirkungen der Sonnenschädigung der Haut brauchbar sind.
Die im Stand der Technik entwickelten Verbindungen mit retinoidartigen Eigenschaften sind jedoch nicht ohne Nachteile. Mehrere dieser Verbindungen im Stand der Technik verursachen ernsthafte Reizungen bzw. Irritationen, wenn sie auf die Haut aufgebracht werden (was eine bedeutende Applikationsart zur Behandlung von Hautleiden darstellt) und verursachen eine Schleimhaut-Toxizität, ebenso, wenn sie oral verabreicht werden. Viele der Verbindungen im Stand der Technik mit einer retinoidartigen Aktivität sind teratogen und haben noch andere Nebenwirkungen.
Zusätzlich zu zahlreichen Patenten und Veröffentlichungen im Stand der Technik, die spezifische Verbindungen oder Klassen von Verbindungen mit einer retinoidartigen Aktivität beschreiben, betreffen mehrere gleichzeitig anhängige Anmeldungen und kürzlich erteilte Patente, die auf den Anmelder der vorliegenden Anmeldung laufen, weitere Verbindungen mit einer retinoidartigen Aktivität und/oder Verfahren zur Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen, mit retinoidartigen Verbindungen.
Relativ kurz zurückliegend wurde im Stand der Technik erkannt, daß es mehr als nur einen zellulären Retinoid- Reaktionsweg in biologischen Systemen gibt und daß zumindest zwei Hauptfamilien von Rezeptoren in biologischen Systemen für natürlich vorkommende Retinoid-Hormone existieren. Diese vor relativ kurzer Zeit erfolgten Entwicklungen im Stand der Technik sind in den Artikeln: D. J. Mangelsdorf et al. "Nuclear receptor that identifies a novel retinoic acid response pathway", Nature Band 345, 17. Mai 1990, Seiten 224- 229; und J. N. Rottmann et al., A Retinoic Acid-responsive Element in the Apoliprotein Al Gene Distinguishes between Two Different Retinoic Acid Response Pathways, Molecular and Cellular Biology, Juli 1991, Seiten 3814-3820. Die folgenden zusätzlichen Literaturstellen betreffen Retinoidsäure- Rezeptoren. M. Petkovich et al "A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptor", Natur, Band 330, 3. Dezember 1987, Seiten 444-450; V. Giguere et al "identification of a receptor for the morphogen retinoic acid", Nature, Band 330, 17. Dezember 1987, Seiten 624-629; N. Brand et al "Identification of a second human retinoic acid receptor", Nature, Band 332, 28. April 1988, Seiten 850-853 A. Krast et al. "A third human retinoic acid receptor, hRAR", Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA, Band 86, Juli 1989, Seiten 5310-5314; D. J. Mangelsdorf et al. "Characterization of three RXR genes that mediate the action of 9-cis-retinoic acid", Genes & DevelUpMent, Band 6, 1992, Seiten 329-344.
Die beiden Hauptfamilien von Retinoidrezeptoren werden als RAR (Retinoic Acid Receptor = Retinsäurerezeptor = RAR) und RXR (Retinoid X Receptor) im Stand der Technik bezeichnet, und es ist bekannt, daß jede dieser beiden Familien Subtypen aufweist, die durch Buchstaben des griechischen. Alphabetes bezeichnet werden, wie beispielsweise RARα, RARβ und RAR. Der oben erwähnte Artikel von D. J. Mangelsdorf et al stellt fest, daß einige retinoidartige Verbindungen (Retinsäureanaloge) die RAR-Rezeptoren stärker als die RXR- Rezeptoren aktivierten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es hat sich gemäß der vorliegenden Erfindung, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert, herausgestellt, daß retinoidartige Verbindungen, die als Agonisten der RXR- Rezeptorstellen dienen, die Apoptose von Tumorzellen in Zellkulturen induzieren und deswegen zur Verwendung als Arzneistoffe geeignet sind, die die Apoptose von Tumoren in Säugetieren, einschließlich Menschen, mit sich bringen. Es hat sich insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung herausgestellt, daß retinoidartige Verbindungen, die RXRspezifische Agonisten sind (und daher auf RAR-Rezeptorstellen nicht aktiv sind), die Apoptose in Tumoren induzieren. Retinoidartige Verbindung, die sowohl RAR- als auch RXR- Agonisten sind, induzieren ebenfalls die Apoptose, und derartige Verbindungen werden als "Panagonisten"-Verbindungen bezeichnet. Retinoidartige Verbindungen, die für RAR- Rezeptorstellen (nicht aktiv an den RXR-Rezeptoren) spezifisch sind, haben sich bisher nicht als Apoptose in Tumorzell-Linien verursachend herausgestellt und deswegen können RAR spezifische Verbindungen nicht im Verfahren zur Behandlung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die RXR-Agonistenverbindungen werden Säugetieren, die an Tumoren leiden, in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die zur systemischen oder topischen Verabreichung oder zur intraläsionalen Verabreichnung geeignet sind. Der Bereich einer Konzentration des aktiven Inhaltsstoffs, nämlich der RXR-Agonistenverbindung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen, ist ungefähr zwischen 0,001 und 5 Gewichtsprozent und derartig, daß die Zusammensetzung ungefähr 0,1 mg bis 100 mg des aktiven Inhaltsstoffes pro kg Körpergewicht des Patienten pro Tag der Behandlung abgibt.
Die Fähigkeit einer Verbindung, als ein Agonist für die RXR- Rezeptoren zu fungieren, kann in einem Assay-Verfahren nach dem Stand der Technik bestimmt werden, das "Cationic Liposome Mediated Transfection Assay" genannt wird, und das nachstehend ausführlich beschrieben wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER Fig. IN DEN ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Daten und die Berechnung von EC&sub5;&sub0; darstellt, erzielt im kationischen Liposom-vermittelten Transfektionsassay bzw. Cationic Liposome Mediated Transfection Assay bezüglich des RARα- Rezeptors, mit einer Testverbindung (AGN 191701, Verbindung 1) und unter Bezugnahme auf die Verbindung Transretinsäure.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Daten und die Berechnung von EC&sub5;&sub0; darstellt, erzielt im Cationic Liposome Mediated Transfection Assay bezüglich des RXRα- Rezeptors mit einer Testverbindung (AGN 191701, Verbindung 1), und unter Bezugnahme auf die Verbindung AGN 191440 (Verbindung 2).
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die die Daten und die Berechnung von EC&sub5;&sub0; darstellt, erzielt im Cationic Liposome Mediated Transfection Assay bezüglich des RARα- Rezeptors mit einer Testverbindung (AGN 191659, Verbindung 3) und mit der Referenzverbindung Transretinsäure.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Daten und die Berechnung von EC&sub5;&sub0; darstellt, erzielt im Cationic Liposome Mediated Transfection Assay bezüglich des RXRα- Rezeptors mit einer Testverbindung (AGN 191659, Verbindung 3) und mit der Referenzverbindung AGN 191440 (Verbindung 2).
Fig. 5 ist eine Fotographie einer DNA-"Leiter", die aus HL- 60 cdm-1-Zellen erzielt wurde, die mit Verbindung 1 (AGN 191701) behandelt wurden.
Fig. 6 ist Fotographie von "Kontroll"-Zellen, die mit "Medium", jedoch nicht mit einer RXR-Agonistenverbindung gemäß der vorliegenden Verbindung behandelt wurden.
Fig. 7 ist eine fotographische Darstellung von Zellen, die 4 Stunden lang mit Verbindung 1 behandelt wurden.
Fig. 8 ist eine fotographische Darstellung von Zellen, die 48 Stunden lang mit Verbindung 1 behandelt wurden.
Fig. 9 ist eine fotographische Darstellung von Zellen, die 6 Tage lang mit Verbindung 1 behandelt wurden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Verbindungen, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Agonisten von RXR-Rezeptorstellen. Die Verbindungen sind vorzugsweise zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung für RXR- Rezeptoren spezifisch. Die Verwendung von panagonistischen retinoidartigen Verbindungen, die sowohl an RAR als auch RXR-Rezeptorstellen funktionieren, liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, obwohl die Verwendung von Panagonisten-Verbindungen weniger bevorzugt wird, weil die RAR-Agonisten-Aktivität üblicherweise mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden ist. Der oben erwähnte Cationic Liposome Mediated Transfection Assay, durch den die Aktivität einer Testverbindung als ein potentieller Agonist der RXR und RAR-Rezeptorstellen bestimmt wird, wird im wesentlichen wie von Feigner P. L. und Holm M. (1989), Focus 11--2, beschrieben, durchgeführt und ist nachstehend zuerst in Grundzügen und danach in Form von speziellen Anweisungen, wie der Assay durchzuführen ist, beschrieben.
In Verbindung mit diesem Assay ist es bekannt, daß Retinsäure-Rezeptoren ein Mitglied der Steroid/Thyroid- bzw. /Schilddrüsen Rezeptorsuperfamilie sind und daß diese Domänen enthalten, die innerhalb individueller Rezeptoren austauschbar sind. Somit werden Plasmide für chimäre Retinoidrezeptoren, die eine Östrogen-DNA-Bindungsdomäne und ein Östrogen-Reaktionselement Chloramphenicolacetyltransferase Enzym enthalten, konstruiert und in speziell kultivierten Bakterien gezüchtet. Diese Plasmide kodieren jeweils für chimäre RARα, RARβ, RAR, RXRα Rezeptorproteine und für das Chloramphenicolacetyl-A-transferase (CAT) Enzymprotein. Die Bakterien mit diesen Plasmiden sind gemäß des im Artikel mit dem Titel "Nuclear Retinoic Acid Receptors: Cloning, Analysis, and Function" M. Pfahl et al. Methods in Enzymology 189, Seiten 256-270 (1990) beschriebenen Verfahren erhältlich, das hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen ist. Das ausführliche Verfahren, wie die DNA-Plasmide aus den jeweiligen Bakterien zu isolieren sind, ist ebenfalls nachstehend ausführlich dargestellt, in Form von spezifischen Anweisungen unter dem Titel "Isolierung eines supercoiled bzw. superspiralisierten Plasmids".
Somit wird gemäß des Testverfahrens ein DNA-Plasmid, das für eines der chimären RARα, RARβ, RAR oder RXRα Rezeptorproteine kodiert, in Kulturen von HeLa-Zellen transfiziert. Zu diesem Zwecke werden HeLa-Zellen in einem Medium während des ersten Tages des Assays gezüchtet, der nachstehend als das "Cationic Liposome Mediated Transfection Assay" ausführlich beschrieben wird. Im Transfektionsverfahren, das während des zweiten Tages des Transfektionsassays durchgeführt wird, wird das DNA-Plasmid, das für das CAT-Enzym kodiert, ebenfalls wieder der Zellkultur zusätzlich zu dem jeweiligen chimären RARα RARβ etc. kodierenden Plasmid zugesetzt. Wie bekannt ist und wie für den Fachmann leicht verständlich ist, schließen insbesondere im Hinblick auf den oben erwähnten Artikel von M. Pfahl et al. chimäre Retinoid-Rezeptoren, die in dieses Assay involviert sind, eine Ligandenbindungsdomäne ein, die spezifische Agonisten-Moleküle erkennt und spezifisch bindet, wie beispielsweise Retinsäure und Analoga. Diese chimären Proteinrezeptoren (die gemäß der Lehren des Artikels von M. Pfahl et al. konstruiert wurden), enthalten ebenfalls eine DNA-Bindungsdomäne, die dazu in der Lage ist, an das "Östrogen-Reaktionselement" (ein DNA-Fragment) zu binden, das an dem DNA-Plasmid, das für das CAT-Enzym kodiert, gebunden ist. Die Art der Wechselwirkung ist derartig, caß nur, wenn ein Agonist (beispielsweise Retinsäure oder Analoga) an die Ligandenbindungsdomäne des jeweiligen RARα, RARβ etc. Rezeptors gebunden werden, nur dann der Rezeptcr durch sein DNA-Bindungsdomänen-Reaktionselement an das Östrogen- Reaktionselement-Chloramphenicolacetyl Transferase-Konstrukt (ERE-CAT) gebunden wird, das dazu in der Lage ist, die Transkription von messenger RNA für das CAT-Enzym zu starten. In anderen Worten wird durch multiple Wechselwirkungen ein CAT-Enzym durch die HeLa-Zelle in diesem Assay nur hergestellt, wenn ein geeigneter Agonisten-Ligand an die Ligandenbindungsstelle des jeweiligen Retinoid-Rezeptors bindet.
Das Östrogen-Reaktions-Element-Chloramphenicolacetyl-Transferase-Konstrukt (ERE-CAT) selbst wird gemäß des im Artikel von Ryssel G.U. et al. Cell, Band 46, Seiten 1053-1061 (1986) beschriebenen Verfahren gewonnen, der durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist. Diese Verfahren ist in der Technik per se wohl bekannt. Das spezielle detaillierte Verfahren, wie das Östrogen-Reaktionselement-Chloramphenicolacetyl-Transferase-Konstrukt (ERE-CAT) aus Baktieren zu isclieren und zu gewinnen ist, ist im Verfahren mit dem Titel "Isolierung von supercoiled Plasmiden" beschrieben.
Zusätzlich zu dem Vorhergehenden wird Lipofectin (LF) jeder Zellkultur zugesetzt. Der Zweck des Lipofectins ist es, den Transport der Plasmide durch die Zellmembran zu erleichtern. Das Lipofectin, das in dem Verfahren verwendet wird, ist im Handel erhältlich.
Wie es für den Fachmann wohl verständlich sein wird, werden als Ergebnis der Transfektion mit dem entsprechenden DNA- Plasmid, das für RARα oder RARβ etc. chimäre Rezeptoren kodiert und als Ergebnis der Transfektion mit dem ERA-CAT (das für CAT-Enzym, wie oben beschrieben, kodiert) die vorher erwähnten Plasmide in die HeLa-Zellen, die in dem Assay kultiviert werden, inkorporiert. Die Retinoid-Rezeptor- Plasmide durchlaufen eine Transkription (zu mRNA) und eine anschließende Translation in das entsprechende chimäre Rezeptorprotein. Deswegen stellen die in dieser Weise gewonnenen Hela-Zellen das jeweilige chimäre RARα, RARβ, RAR oder RXRα- Rezeptorprotein her. Als Folge der Transfektion mit dem ERA-CAT enthalten die Zellkulturen dieses Assays ebenfalls die genetische Information zur Herstellung des CAT- Enzyms. Jedoch, wie oben beschrieben, wird die letztere genetische Information nicht transkribiert und das CAT-Enzym wird nicht durch die jeweiligen Zellkulturen des Assays hergestellt, bis eine geeignete Agonistenverbindung an das jeweilige chimäre RARα, RARβ, RAR oder RXRα- Rezeptorprotein in der Zelle bindet und aktiviert und dieser aktivierte Agonisten-Rezeptorkomplex bindet an das Östrogen Reaktions- Element des ERE-CAT-Konstruktes.
Das Assay-Verfahren wird am dritten Tag des Assays durch Zusatz einer geeigneten Referenzverbindung und der Testverbindung (Agonist oder voraussichtlicher Agonist) zur jeweiligen HeLa-Zellkultur, vorzugsweise in variierenden Konzentrationen, fortgeführt. Als Folge des Zusatzes bindet die Testverbindung, wenn sie ein Agonist ist, an das jeweilige chimäre RARα, RARβ, RAR oder RXRα- Rezeptorprotein und folglich wird die genetische Information, die für das CAT-Enzym kodiert, in der Zelle transkribiert, und dadurch das CAT-Enzym durch die Zelle hergestellt.
Nach der Lyse der Zelle, die am vierten Tage des nachstehend erwähnten Assay-Verfahrens durchgeführt wird, wird die Aktivität des CAT-Enzyms in Teilmengen des Lysates gemessen. Dies wird durchgeführt, indem das Lysat mit Chloramphenicol und Tritium markiertem Acetylcoenzym A inkubiert wird. Als Endmessung wird die Menge an Tritium markiertem. Acetyl Chloramphenicol gemessen, die in der enzymatischen Reaktion gebildet wird, die das CAT-Enzym einschließt, und zwar in einem Scintillationszähler.
Die Referenzverbindung ist Retinsäure (all trans) für die Assays, die die RARα, RARβ und RAR-Rezeptoren einschließen und 4-(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8- pentamethylnaphthalen-2-yl)-propen-1-yl] Benzoesäure (AGN 191440, in dieser Anmeldung ebenfalls bezeichnet als Verbindung 2) für den chimären RXRα-Rezeptor. Die in dem Assay gewonnenen Daten werden ausgewertet und wie folgt ausgedrückt. Für jede Testverbindung und für jede Subspezies der RAR-Rezeptoren wird eine graphische Darstellung (oder das mathematische Äquivalent einer graphischen Darstellung) hergestellt, wobei die "Zähler pro Minute" (Counts per minute = cpm), die in den Scintillationszähler-Messungen gewonnen werden, (auf der y Achse) gegen die Konzentration der Testverbindung aufgetragen werden. Eine ähnliche graphische Darstellung (oder das mathematische Äquivalent) wird für Retinsäure hergestellt. Der EC&sub5;&sub0; der Testverbindung ist als diejenige Konzentration der Testverbindung definiert, die ¹/&sub2; (50%) der maximalen cpm-Anzahl (maximale CAT-Enzymaktivität) bereitstellt, erzielt in demselben Rezeptor im selben Assay mit der Referenzverbindung Retinsäure. Dies wird in den graphischen Darstellungen der Fig. 1 und 3 veranschaulicht.
Um die im Assay für den RXRα-Rezeptor gewonnenen Daten zu evaluieren und auszudrücken, wird derselbe Typ von graphischer Darstellung (oder dessen mathematischen Äquivalent) für die Testverbindung hergestellt und ebenfalls für die Referenzverbindung AGN 191440, Verbindung 2. Diese Referenzverbindung ist ein bekannter Agonist der RXRα- Rezeptorstelle. EC&sub5;&sub0; ist diejenige Konzentration der Testverbindung, die die Hälfte (50%) der Zähler pro Minute (CAT Enzymaktivität) der maximalen cpm's ergibt, die mit AGN 191440 an demselben Rezeptor im selben Assay erzielt werden. Eine graphische Darstellung, die das vorhergehende darstellt, wird in Fig. 2 und in Fig. 4 gezeigt.

ISOLIERUNG EINES SUPERCOILED BZW. SUPERSPIRALISIERTEN PLASMIDES

11 Präparation im großem Maßstab

DNA Isolierung

1. Anordnen von Zellen auf Eis für 15 Minuten. Ernten der bakteriellen Zellen (E. coli) durch Zentrifugieren in 250 ml Nalgene-Röhrchen bei 7k UpM, 10 Minuten bei 4ºC unter Verwendung eines JA14 Rotors, Beckman J2-21 M-Zentrifuge. Verwerfen des Überstandes.
2. Jedem Zellpellet werden 1,0 ml Lösung I zugesetzt, gewirbelt, um das Pellet zu resuspendieren. 1,0 ml der Zellen werden von einer Flasche auf die andere übertragen. Dies wird auf ein 50 ml-Oakridge-Rohr übertragen. Danach werden 4 ml Lösung I verwendet und die Flaschen wiederum gewaschen, indem es von einer Flasche zur nächsten übertragen wird. Übertragung desselben ebenfalls in die Oakridge-Röhre. Unter Verwendung einer Pipette wird das Gesamtvolumen mit Lösung I auf 16 ml gebracht und die Lösung wird gemischt. 8 ml werden auf ein zweites Oakridge-Röhrchen übertragen. Dieses wird bei Raumtemperatur für 5 Minuten aufbewahrt.

Lösung I

50 mM Glukose, 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8

3. Jedem Röhrchen werden 18 ml frisch zubereitete Lösung II zugesetzt. Der Inhalt wird vorsichtig durch mehrmaliges Umdrehen der Röhrchen gemischt. Diese werden 10 Minuten lang auf Eis aufbewahrt. Nach dieser Zeit sollte die Flüssigkeit klar ohne Aggregate sein. (Wenn Klumpen entstehen, sind die Zellen vorher nicht gut genug resuspendiert worden).

Lösung II

1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,2 N NaOH (4 ml 10% SDS, 0,8 ml 10 N NaOH, 35,2 ml Wasser)

4. 12 ml (oder soviel es angezeigt ist) eiskalte Lösung III wird zugesetzt. Der Inhalt der Röhrchen wird durch mehrmaliges schnelles Umdrehen vermischt. Ein weißes flockenartiges Präzipitat sollte auftreten. Aufbewahren auf Eis für 10 Minuten.

LÖSUNG III

wird wie folgt hergestellt: zu 60 ml 5M Kaliumacetat werden 11,5 ml Eisessig und 28,5 ml Wasser zugesetzt.
5. Zentrifugieren bei 4ºC in einer Beckmann J2-21M Zentrifuge, JA20 Rotor, 17k UpM, 30 Minuten lang.
6. Pipettieren von ungefähr 12 ml des Überstandes aus den Oakridge-Röhrchen in 6 ausgeheizte Corex-Röhrchen. Zusatz von 0,6 Volumina Isopropanol (7,2 ml), Mischen durch Umdrehen und Aufbewahren bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um die DNA auszufällen.
7. Erwärmen der Beckmann-Zentrifuge durch Zentrifugieren eines JA20-Rotors bei 14k UpM für 15 Minuten bei 20ºC.
8. Pelletieren der DNA bei 20ºC in der J2-21M Zentrifuge, JA20 Rotor, bei 10,5 K UpM für 30 Minuten (Verwenden von Adaptern für die Corex-Röhrchen).
9. Weggießen des Überstandes, Trocknen innerhalb des Röhrchens mit einer Pasteur-Pipette auf einem Vakuumkolben.
10. Trocknen im Vakuum-Desiccator für 10 Minuten (ein längeres Trocknen würde es schwer machen, das Pellet zu lösen).
Reinigen der Plasmid-DNA durch Zentrifugation bis zum Äquilibrium in Cscl-Dichtegradienten
11. Lösen des Pellets durch Zusatz von 1 ml TE (10 mM Tris-Cl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) zu jedem Corex-Röhrchen. Anordnen der Röhrchen in einem 37ºC warmen Wasserbad, um die Pellets schneller zu lösen (15-30 Minuten)
12. Übertragung von Flüssigkeit aus jedem Ansatz zu jedem Röhrchen. Bringen des Volumens auf 8,5 ml mit TE.
13. Zusatz von 100 ul RNase, DNase frei (2U/ul, Quelle Boehringer Mannheim Biochemical (BMB)).
14. Zusatz von 400 ul von 10 mg/ml Ethidiumbromid.
15. Zusatz von 9,0 g CsCl und Mischen unter Verwendung einer Pasteurpipette.
16. Zusatz einer Lösung zu zwei 13 · 51 mir Beckman Polyallomer-Schnellverschluß-Zentrifugenröhrchen.
17. Zentrifugieren bei 50 k UpM für 12 Stunden in einer Beckmann Ultrazentrifuge, VTi65,2 Rotor, 20ºC.
18. Nach der Ultrazentrifugation sollten zwei DNA-Banden sichtbar sein. Die obere Bande besteht aus linearer bakterieller DNA und nicked ringförmiger Plasmid-DNA. Die untere Bande besteht aus geschlossener ringförmiger Plasmid-DNA. Nur die untere CsCl-Banden DNA wird aus dem Röhrchen mit einer 3-ml Spritze entfernt, die an eine Nadel Größe 21 angepaßt ist (die Nadel wird in die Seite des Röhrchens eingefügt und ein 1,5-2 ml wird entfernt).
19. Präparation für die zweite CsCl-Zentrifugation:
(9 ml - vol. 1. CsCl-Bande)-Anzahl g CsCL
(9 ml - vol. 1. Bande - 100 ul 10 mg/ml
Ethidiumbromid - 50 ul RNase) - ml TE pH 8,0
Kombinieren der ersten Bande Te, CsCl, RNase und EtBr.
20. Zusatz von Lösung zu 2 Schnellverschluß-Röhrchen.
21. Zentrifugieren bei 50 k für 12 Stunden oder 60 k UpM für 4 Stunden in einer Ultrazentrifuge, VTi65,2 Rotor, 20ºC.
22. Zweimaliges Entfernen von CsCl-Banden DNA (nur untere Bande) zu einem 5 ml Falcon Snap-Rchrchen (wie in Schritt 18).

Extraktion von Ethidiumbromid

23. Unter einem Rauchabzug Zusetzen von gleichen Volumina Isoamylalkohol, Wirbeln, Zentrifugieren bei Raumtemperatur bei 1500 UpM in Beckman-TJ-6 Zentrifugen für 3 Minuten.
24. Übertragen der unteren wässrigen Schicht auf ein frisches Röhrchen. Wiederholen 3-4 Mal, bis die wässrige Schicht klar ist (keine Pinkfärbung).
25. Übertragen der klaren wässrigen Schicht auf Spektra/Por 3 Dialyse-Röhrchen, mwco 3500. (Binden eines Knotens in den unteren Teil der Röhre vor Klemmen des Dialyse-Röhrchens). Zusetzen von Flüssigkeit unter Verwendung einer Pasteurpipette. Abklemmen des Oberteils der Dialyse-Röhrchen. Unter Verwendung eines Kunststoffbandes Suspendieren eines Röhrchens in 2,8 L TE (28 ml 1 M Tris-Cl, pH 8, 5,6 ml 0,500M EDTA, pH 8). Immer vorsichtiges Handhaben des Dialyse-Röhrchens mit Handschuhen.
26. Diaylsieren der wäßrigen Phase gegen mehrmalige Wechsel von 2,8 L TE pH 8 (1 · 2-4 Stunden, über Nacht und ein 1 · 2-4 Stunden den nächsten Tag).
27. In der Gewebskultur Abzugs-Übertragung der dialysierten DNA in sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Markieren der Röhrchen und Aufbewahren bei -20ºC.

KATIONISCHE LIPOSOMEN-VERMITTELTE TRANSFEKTION

Referenz: Felgner, P.L., und Holm, M. (1989) Focus 11,2 Während des gesamten Verfahrens Steriltechnik anwenden. Züchten von Hela oder CV-1 Zellen in T-125 Kulturkolben. Die Zellen werden zweimal pro Woche, üblicherweise am Montag und Freitag passiert (0,5 ml Zellen in 15 ml Medium)

TAG 1: AUSPLATTIEREN DER ZELLEN

1. Trypsinisieren und Sammeln der Zellen aus T-162 cm² Kulturkolben. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Üblicherweise ist diese Zellmenge ausreichend für sechzehn 12-Wellplatten.
2. Auf Grundlage der Zellzahl Verdünnen der Zellen in Medium (D-MEM glukosearm bzw. mit geringem Glukoseanteil, 10% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM Glu) zu einer Konzentration von 60.000 Zellen pro Well bzw. Vertiefung.

Beispiel Zellberechnung:

erwünscht 40.000 Zellen/Well und 200 Zellen haben (x) Zellen/ml
deswegen, 40.000 Zellen/Well · 200 Wells - Gesamtanzahl ml Zellen
(X) Zellen/ml
benötigt
Unter Verwendung einer Nalge 250 ml Filtereinheit-Receiver Zusatz von insgesamt Anzahl ml Zellen zu Medium und Bringen des Endvolumens auf 200 ml. Gutes Mischen durch Pipettieren.
3. Zusetzen von 1,0 ml Zellen pro Well unter Verwendung einer sterilen 12,5 ml Kombitip (Einstellung 4). Schütteln der Platten nach vorn und hinten (nicht wirbeln). Inkubieren bei 37ºC in einer befeuchteten 5% CO&sub2; Umgebung über Nacht. Die Zellen sind zu ungefähr 40% vor der Transfektion konfluent.

Transfektion: TAG 2 PRÄPARATION DES DNA/LIPOFECTIN KOMPLEXES

1. Unter Verwendung von 50 ml Polystyrol-Röhrchen Herstellen bzw. Präparieren von Lipofectin (LF) und DNA separat. Bestimmen des Volumens von LF und der DNA, die für 2 ug LF/Well, 500 ng ERE-CAT DNA /well, 100 ng ER/RAR DNA pro Well erforderlich sind. Bestimmen des Gesamtvolumens, das für das Experiment erforderlich ist. (Die DNA Konzentration wird zwischen jeder Plasmidpräparation variieren und die nachfolgenden Berechnungen müssen dementsprechend angepaßt werden).

DNA (Präparationsdatum) ul/well #Wells Vol DNA Vol Opti-Mem

a
b
t
X
CAT

LF Chargennummer ul/Well Anzahl/Wells ul LF Vol Opti-Mem

Man verdünne LF und DNA in Opti-Mem Medien auf ein Volumen von 25 ul · Anzahl Wells: Vol Opti-Mem 1 = (25 ul · Anzahl Wells) - Gesamtvolumen DNA oder LF.
2. Zusetzen des verdünnten LF zur verdünnten DNA und sanftes Wirbeln des Röhrchens. Setzenlassen bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
3. Absaugen des Mediums aus den Wells und Waschen 2X unter Verwendung von 0,5 ml Opti-Mem I (sterile 12,5 ml Kombitip), Einstellung 2.
4. Zusetzen des DNA/LF Komplexes zum Volumen von Opti- Mem: (450 ul · Anzahl Wells). Auf den Kopfstellen des Röhrchens zum Mischen. Verwendung einer sterilen 12,5 ml Kombitip (Einstellung 2) und Zusatz von 500 ul zu jedem Well. Schütteln der Platten nach vorne und hinten um zu mischen, nicht zu wirbeln.
5. Inkubieren der Zellen für 6 Stunden bei 37ºC in einem angefeuchteten 5% CO&sub2; Inkubator.
6. Nach 6 Stunden Zusatz von 0,5 ml Medium zu jedem Well (D-MEM glukosearm, 20% FBS Kohle-behandelt, 2 mM Glu). Verwendung der 12,5 Kombityp Einstellung 2 und Wiederanordnen im Inkubator.

TAG 3: ARZNEISTOFFZUSATZ

1. 18 Stunden nach dem Start der Transfektion Zusetzen von Retinoiden dreifach (10 ul) unter Verwendung einer sterilen 0,5 ml Kombitip (Einstellung 1) und Inkubieren für 20-24 Stunden bei 37ºC in einer angefeuchteten 5% CO&sub2; Umgebung. ARZNEISTOFFVERDÜNNUNGEN
ACETON
Molek. Gew. (g/mol) 0.005 mol/l l
Beispiel: Retinoide werden in Aceton zu einer Konzentration von 5 mM gelöst und weiter in EtOH auf 1 mM verdünnt. Wenn die Retinoide nicht in Lösung gehen, Anordnen des Röhrchens in heißem Wasser für 5 Sekunden, gefolgt von 5 Sekunden heftigem Wirbeln. Jedes Experiment kann ein unterschiedliches Lösungsschema haben. Für zwei Konzentrationen pro Reihenfolge der Größe Verwendung einer 3,16-fachen Verdünnung wie folgt: Zusetzen von 1080 ul 100% EtOH zu markierten sterilen 12 · 75 mm Röhrchen (Falcon 2063). Unter Verwendung der 1 mM Lösung Übertragung von 500 ul auf das nächste Röhrchen. (316 uM). Wirbeln und Wiederholen des Transfers auf das nächste Röhrchen in der Reihe ... Einige Retinoide sind lichtempfindlich, insbesondere RA und 13-cis RA und sollten mit einem roten oder stark gedimmten Licht verwendet werden. Protokollieren der verwendeten Menge an Verbindung. Beispiel

TAG 4 CAT-ASSAY DER GEMISCHTEN PHASE

1. Waschen der Zellen in 12 mm Wells einmal mit 0,50 ml 1 X PBS (kein Ca/Mg).
2. Unter Verwendung einer 5 ml Kombipipette (Einstellung 1) Zusetzen von 100 ul von eiskaltem 1% Triton, 1 mM Tris-Cl pH 7,8, 2 mM EDTA pH 8, DNase I. Hergestellt wie folgt:

LYSEPUFFER (HYPOTONISCHER PUFFER)

2,0 mg DNase I (Sigma)
4,925 ml Wasser
50,0 ul 100% Triton X-100 (BMB Chargennr.
5,0 ul 1 M Tris-Cl pH 7,8
20,0 ul 0,5 M EDTA pH 8
5,0 ml
3. Anordnen auf Eis für 60 Minuten. Gelegentliches Umrühren.
4. Transfer von 50 ul Lysat aus 3 Wells zu einem Zeitpunkt unter Verwendung einer Titertrek Multichannel Pipette mit Spitzen, die an Kanäle #1, #3, #6 bis 96 eines U-Bodenwells angepaßt sind (Costar). Anordnen (unverwendetes Lysat) der Platten bei -20ºC.
5. Unter Verwendung einer 1,25 ml Kombipipette (Einstellung 1) Zusetzen von 50 ul Vormischung pro Well, vorsichtiges Schütteln der Platten und Inkubieren bei 37 ºC für 2 Stunden.
Vol. pro Blindversuch Vol pro Reaktion X ...? (#? Assays) = Gesamtvolumen
47,0 27,0 ul Puffer I (250 mM Tris-Cl pH 7,8, 5 mM EDTA (Datum:
1,5 1,5 ul 1 mM HCl
*** 20,0 ul 5 mM Chloramphenicol (frisch in Puffer I herstellen) Chargen#
0,75 0,75 ul 4 mM Acetyl CoA in Wasser (frisch herstellen) Sigma Chargen#
0,80 0,80 ul 3H-Acetyl CoA (New England Nuclear) #NET-290L, 200 mCi/mmol)
6. Unter Verwendung einer Titertrek Multichannel Pipette Zusetzen von 100 ul 7 M Urea zu jeder Reaktionswell, um die Reaktion zu stoppen. Sechs zu einem Zeitpunkt durchführen (Urea-Mallincrokt AR)
7. Verwendung einer Titertrek Multichannel Pipette um 200 ul Reaktionsgemisch in ein 5 ml Kunststoff- Szintillationsvial zu übertragen (Research Products International #125514). Drei zu einem Zeitpunkt durchführen. (Urea-Mallincrokt AR)
8. Zusetzen von 1 ml 0,8% PPO/Toluol (3,2 g PPO/4 L Toluol). Kräftiges Wirbeln für 5 Sekunden und Ermöglichen der Phasentrennung für 15 Minuten. Zählen des cpm für 2,0 Minuten-Beckman LS 3801.

(Toluol-Mallincrokt SzintillAR)

(PPO = 2,5 Diphenyloxazol-RPI Chargennr. A3071. Tabelle 1 veranschaulicht die vergleichende RAR und RXR Agonistenaktivität zweier spezieller beispielhafter Verbindungen gemäß der Erfindung. Verbindung 1 (AGN 191701) ist 2-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8- pentamethylnaphthalen-2-yl)propen-1-yl]thiophen-4- carbonsäure. Verbindung 2 (AGN 191440) ist die Referenzverbindung zur Messung der RXR Agonistenaktivität, diese Verbindung ist 4-(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8- pentamethylnaphthalen-2-yl)propen-1-yl]benzoesäure. Verbindung 3 (AGN 191659) ist 2-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro- 3,5,5,8-pentamethylnaphthalen-2-yl)propen-1-yl]-5- thiophencarbonsäure. Die Aktivität der beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung ist für die jeweiligen RARα, RARβ und RAR-Rezeptorstellen getrennt angegeben. Die Struktur jeder in Tabelle 1 angegebenen Verbindung ist in der Beschreibung unten dargestellt. Verbindung 4 (AGN 191183) ist 4-(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalen-2- yl)propen-I-yl]benzoesäure. Diese Verbindung (Verbindung 4) fällt nicht in den Umfang der Erfindung. Rezeptordaten für diese Verbindung sind zu Vergleichszwecken angegeben, um zu zeigen, daß diese Verbindung ein spezieller RAR-Agonist und nicht an RXR Rezeptorstellen aktiv ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist Verbindung 4 nicht in dem Assay aktiv, in dem ein apoptotischer Tod von Tumorzellen nach Behandlung mit RXR Agonistenverbindungen gezeigt wird. TABELLE 1
Das Phänomen der Apoptosis bzw. des Zelltodes ist in der biologischen Wissenschaft wohlbekannt und kann als programmierter Tod von Zellen beschrieben werden. Wie bekannt ist, wird Apoptose mit der "Nekrose" kontrastiert, einem Phänomen, wenn Zellen als Folge einer Abtötung durch ein toxisches Material oder eine andere äußerliche Wirkung sterben. Somit ist die Apoptose ein "natürlicher" programmierter Tod von Zellen. Entlang dieser Linien ist allgemein bekannt, daß sogar in einem wachsenden malignen Tumor, der möglicherweise eine Lebensbedrohung für den Wirt darstellt, eine große Anzahl von Zellen natürlicher Weise durch Apoptose sterben. Jedoch übertrifft in einem normal wachsenden malignen Tumor (nicht beeinträchtigt durch eine erfolgreiche Chemotherapie oder eine andere Behandlung) die Anzahl neuer Zellen, die durch unkontrollierte Zellteilung gebildet wurden, die Anzahl der Zellen, die durch Apoptose sterben, so daß der Tumor eine Nettozunahme an Gewicht erfährt. Wenn die Geschwindigkeit des Todes durch Apoptose im Tumor die Geschwindigkeit der Zellteilung übertrifft, würde der Tumor schrumpfen oder insgesamt verschwinden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Fähigkeit von RXR Agonistenverbindungen, den apoptotischen Zelltod zu induzieren, in einem Assay unter Beweis gestellt, der den Phänotyp einer Linie von menschlichen myeloischen Leukämie (HL-60 cdml-1) Zellen benutzt.
In diesem Assay werden menschliche myeloische Leukämiezellen (HL-60 cdml-1) in Kulturen gezüchtet und eine BÄR Agonistenverbindung, wie beispielsweise Verbindung 1 (AGN 191701) oder Verbindung 3 (AGN 191659) wird der Kultur zugesetzt. Die RAR spezifische Verbindung 4 (AGN 191183) wird zur Kontrolle Parallelkulturen zugesetzt, wohingegen andere "Kontroll"-Kulturen mit Ethanol behandelt werden. Die Assays zeigten, daß die RXR Agonistenverbindungen (jedoch nicht die RAR spezifische Verbindung 4 (AGN 191183) noch Eethanol einen signifikanten apoptotischen Zelltod induzierten. Die apoptotische Natur des Zelltodes wurde durch beobachtete morphologische Veränderungen (Kernpyknosis und Fragmentierung), Membran-Blasenbildung und zelluläre Fragmentierung und durch die charakteristische Anordnung von DNA-Fragmenten in den behandelten Zellen demonstriert.
Eine ausführliche Beschreibung der Assays ist nachstehend bereitgestellt.

Assays, die die Induktion der Apoptose in menschlichen Myeloid-Leukämie (HL-60) Zellen durch RXR Agonistenverbindungen demonstrieren (AGN 191701)

Assay 1

HL-60 cdm-1-Zellen wurden in 6-Well-Gewebskulturplatten (Falcon) in 3 ml Medien (RPMI-1640, das Rinderinsulin 5 mg/L, menschliches Transferrin 5 mg/L und Na-Selenit 5 ug/L in einer Dichte von 1 · 10&spplus;&sup5; Zellen/ml enthielt) ausplattiert. Drei ul einer 1 mM Stammlösung von AGN 191701 (Verbindung 1) oder 1 mM von AGN 191183 (Verbindung 4) oder Ethanol wurden den Zellen hinzugesetzt und dann wurden die Zellen in einem befeuchteten Inkubator (5% CO&sub2;) in der Dunkelheit 72 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet. Am Ende der Inkubation bzw. der Bebrütung wurden Teilmengen der Zellen zum Zählen in eine Hämocytometer-Kammer entnommen und eine zweite Teilmenge (50 ul) wurde auf eine Mikroskopobjektträger sedimentiert, unter Verwendung einer Cytospin-Zentrifuge. Die sedimentierten Zellen wurden luftgetrocknet, in absolutem Methanol fixiert, mit einem Diff-Quick-Reagenz-Kit angefärbt, in Permount befestigt und durch Hellfeld-Lichtmikroskopie visualisiert.
Die Zellzählungen waren wie folgt:
Kontrolle 5,1 · 10&spplus;&sup5;/ml
AGN 191183 (1 uM) 4,6 · 10&sup5;/ml
AGN 191701 (1 uM) 0,7 · 10&sup5;/ml
Die Inspektion der Mikroskop-Objektträger zeigte keinen Unterschied zwischen der Kontrolle und den AGN 191183 (Verbindung 4) behandelten Zellen. Die AGN 191701 behandelten Zellen zeigten einen umfassenden Zelltod, beinahe alle Zellen starben.

Assay 2

HL-60 cdm-1-Zellen wurden in einem T-25 Gewebskulturkolben in 5 ml Medien (RPMI-1640, enthaltend Rinderinsulin 5 mg/L, menschliches Transferrin 5 mg/L und Na-Selenit 5 ug/L) in einer Dichte von 2 · 10&sup5; Zellen/ml angeordnet. ACM 191701 (Verbindung 1) wurde in einer Endkonzentration von 1 uM (8 ul einer 1 mM Stammlösung) zugesetzt und die Zellen wurden in einem angefeuchteten Inkubator (5% CO&sub2;) in der Dunkelheit für 48 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Medien und Zellen wurden aus dem Kolben entfernt, die Zellen wurden pelletiert (1100 UpM/7 min mit einer Beckman Tischzentrifuge), das Pellet wurde einmal mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und darauf wurden die pelletierten Zellen durch Zusatz von 200 ul einer Lösung lysiert, die 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,4 mM EDTA, 0,4% Triton X-100, enthielt. Das Lysat wurde 5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugiert (14.000 UpM) und der Überstand auf eine Endkonzentration von 0,5 M NaCl und 50% Isopropanol eingestellt. Die Lösung ließ man über Nacht bei -20ºC präzipitieren und das Präzipitat, das sich bildete, wurde in einer Mikrofuge pelletiert (10 Minuten, 14.000 UpM). Das Pellet wurde einmal in 70% Ethanol gewaschen, es wurde in 50 ul Tris EDTA (10 mM Tris HCl pH 7,4, 0,4 mM EDTA) resuspendiert und mit Gel-Beladungs-Puffer gemischt. Die Probe wurde eine Stunde lang in einem 1% Agarosegel zusammen mit einer 1 kE Standard DNA-Leiter einer Elektrophorese unterworfen (Bethesda Research Laboratory).
DNA wurde durch Ethidiumbromidfärbung gefolgt durch Visualisierung und Photographie unter einer UV-Lampe nachgewiesen.
Die Inspektion der DNA zeigte ein Muster einer DNA- Fragmentierung ("Leiterbildung" bzw. laddering), das für Zellen charakteristisch ist, die einen apoptotischen Zelltod durchmachen.

Assay 3

HL-60 cdm-1-Zellen wurden in einer 6-Well-Gewebskulturplatte (Falcon) in 3 ml Medien (RPMI-1640, enthaltend Rinderinsulin 5 mg/L, menschliches Transferrin 5 mg/L und Na-Selenit 5 ug/L) in einer Dichte von 1 · 10&sup5; Zellen/ml ausplattiert. Duplikatwells empfingen entweder Ethanol (3 ul) oder 3 ul einer Stammlösung von AGN 191701 (Verbindung 1, 1 mM in Ethanol). Die Zellen wurden in einem angefeuchteten Inkubator (5% CO&sub2;) in der Dunkelheit für entweder 4 Stunden, 48 Stunden oder 6 Tagen bei 37ºC gezüchtet. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde eine Teilmenge der Zellen (50 ul) unter Verwendung einer Cytospin-Zentrifuge auf einen Mikroskop- Objektträger sedimentiert.
Die sedimentierten Zellen wurden luftgetrocknet, in absolutem Methanol fixiert, mit einem Diffquick Reagenz Kit angefärbt, in Permount befestigt und durch Hellfeld-Lichtmikroskopie visualisiert.
Eine Inspektion der Zellen zeigte, daß die Kontrollzellen zahlreiche undifferenzierte plastische Myeloid-Leukämiezellen sind. Zellen, die für vier Stunden gegenüber AGN 191701 (Verbindung 1) ausgesetzt wurden, zeigten eine Kernpyknosis und eine Kern- ebenso wie eine zytoplasmatische Hyperchromie mit der Ausbildung von cytoplasmatischen Ausdehnungen (große Blasen). Zum Zeitpunkt 48 Stunden existierte eine umfassender Zelltod mit zahlreichen hyperchromatischen Kernfragmenten entweder frei im Medium oder enthalten in den geschrumpften Zellüberbleibseln. Es existierte eine kleine Restpopulation plastischer undifferenzierter Zellen. Nach 6 Tagen wurden dieselben hyperchromatischen Kernüberbleibsel nachgewiesen. Es existierten jedoch zusätzlich scattered multinucleated syncitial cells ("Gigantenzellen"), die in der Kultur vorlagen. Das Muster der morphologischen Veränderungen in den sterbenden Zellen ist insgesamt mit den Veränderungen, die in Zellen beschrieben wurden, die einen apoptotischen Zelltod durchmachen, konsistent.
Fig. 5-9 zeigen die Ergebnisse der oben beschriebenen Assays. Insbesondere ist Fig. 5 eine Photographie einer DNA- Leiter, die von Zellen gewonnen wurde, die mit Verbindung 1 (AGN 191701) 48 Stunden lang in dem oben beschriebenen Assay behandelt wurden. Fig. 6 ist eine Photographie von "Kontroll-Zellen", das heißt von Zellen, die in den gerade beschriebenen Assays mit "Medium" behandelt wurden, jedoch nicht mit einer RXR-Agonistenverbindung. Fig. 7 ist eine Photographie von Zellen, die 4 Stunden lang mit Verbindung 1 behandelt wurden. Fig. 8 ist eine Photographie von Zellen, die 48 Stunden lang mit Verbindung 1 behandelt wurden und Fig. 9 ist eine Photographie von Zellen, die 6 Tage lang mit Verbindung 1 behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn die Behandlung mit dem "Panagonisten" Verbindung 3 (AGN 191659) gemäß der Erfindung durchgeführt wird.
Wie in den Photographien ersichtlich ist, induziert die Behandlung mit den RXR-Agonisten einen Zelltod in einer hochsignifikanten Anzahl von Zellen. Die Verwendung einer Verbindung wie beispielsweise Verbindung 3 in den Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird ein wenig weniger bevorzugt als die Verwendung eines RXR spezifischen Agonisten (wie Verbindung 1) weil eine RAR Agonistenaktivität bekannterweise mit Nebenwirkungen verbunden ist, die durch RXR spezifische Arzneistoffe vermieden werden.

Zubereitungen und Behandlungsverfahren

Die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen können systematisch oder topisch verabreicht werden, abhängig von derartigen Erwägungen wie dem zu behandelnden Leiden, dem Bedarf einer ortsspezifischen Behandlung, der Menge des Arzneistoffs, die verabreicht werden soll und ähnlichen Erwägungen.
Bei der Behandlung von bestimmten malignen Erkrankungen können topische Verabreichungen verwendet werden. Jede übliche topische Formulierung wie beispielsweise eine Lösung, Suspension, Gel, Salbe oder Creme oder dergleichen kann verwendet werden. Die Herstellung derartiger tcpischer Zubereitungen sind in der Wissenschaft pharmazeutischer Zubereitungen gut beschrieben, wie beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Science, Ausgabe 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, beispielhaft beschrieben. Für eine topische Anwendung können diese Verbindungen ebenfalls als Pulver oder Spray, insbesondere in Aerosolform verabreicht werden.
In den meisten Anwendungen der vorliegenden Erfindung werden die RXR-Agonistenverbindungen als aktive Inhaltsstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die zur systemischen Verabreichung angepaßt sind. Wie bekannt ist, kann ein Arzneistoff, wenn er systemisch verabreicht werden soll, als Pulver, Pille, Tablette oder dergleichen, oder als Sirup oder Elixir zur Verabreichung konfektioniert werden. Zur intravenösen, intraperitonealen oder intraläsionalen Verabreichung wird die Verbindung als Lösung oder Suspension hergestellt, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, diese Verbindungen in Suppositorien-Form oder als Zubereitung mit verlängerter Freisetzung zur Deponierung unter der Haut oder zu intramuskulären Injektion zuzubereiten.
Eine therapeutische Konzentration wird diejenige Konzentration sein, die die Reduktion des speziellen Leidens bewirkt oder dessen Ausdehnung verlangsamt. Eine gegebene therapeutische Konzentration wird von Leiden zu Leiden variieren und kann in bestimmten Fällen mit dem Schweregrad des zu behandelnden Leidens variieren und mit der Empfänglichkeit des Patienten gegenüber der Behandlung. Demgemäß wird eine vorgegebene therapeutische Konzentration am besten zum gegebenen Zeitpunkt und Ort durch Routineexperimente bestimmt werden. Es wird jedoch angenommen, daß in der Behandlung von malignen Erkrankungen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Zubereitung, die zwischen 0,001 und 5 Gew-% vorzugsweise 0,01 bis 1% enthält, üblicherweise eine therapeutische wirksame Konzentration ergeben wird. Wenn systemisch verabreicht wird, wird eine Menge zwischen 0,01 und 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, jedoch vorzugsweise 0,1 bis 10 mg/kg in den meisten Fällen ein therapeutisches Ergebnis bewirken.

Allgemeine Ausführungsformen

Definitionen

Die nachfolgende Beschreibung stellt Beispiele der RXR- Agonistenverbindungen bereit, die bei der Behandlung von malignen Erkrankungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In der chemischen Beschreibung der beispielhaften Verbindungen, die hier bereitgestellt wird, weisen alle chemischen Begriffe die Bedeutung auf, die ihnen normalerweise vom Fachmann auf dem Gebiet der organischen Chemie zugeordnet wird. Somit betrifft der Begriff Alkyl und deckt jede und alle Gruppen ab, die als normales bzw. unverzweigtes Alkyl, verzweigtkettiges Alkyl und Cycloalkyl bekannt sind. Der Begriff Alkenyl betrifft und deckt unverzweigte bzw. normale Alkenyl-, verzweigtkettige Alkenyl und Cycloalkenylgruppen mit mehr als einer oder mehreren ungesättigten Stellen ab. Niederalkyl bedeutet die oben definierte breite Definition von Alkylgruppen von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und, falls anwendbar, von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen für verzweigtkettige Cycloalkyl-Gruppen. Niederes Alkenyl ist in ähnlicher Weise mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen für normales Alkenyl und 3 bis 6 Kohlenstoffatomen für verzweigtkettige- und Cycloalkenyl- Gruppen definiert.
Der Begriff "Ester" wie hierin verwendet, betrifft und deckt jede Verbindung ab, die in die Definition dieses Begriffes fällt, wie er klassischerweise in der organischen Chemie verwendet wird. Bevorzugte Ester der beispielhaften Carbonsäuren innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung werden mit gesättigten aliphatischen Alkoholen von zehn oder weniger Kohlenstoffatomen oder den zyklischen oder gesättigten aliphatischen zyklischen Alkoholen von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen gebildet und besonders bevorzugte Ester werden mit aliphatischen Alkoholen mit 1-10 Kohlenstoffatomen gebildet. Wenn der Ester aus Verbindungen abgeleitet wird, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, die primäre Alkohole sind (B in den Formeln 1 ist -CH&sub2;OH) deckt dieser Begriff Verbindungen der Formel -CH&sub2;OOCR&sub1;&sub1; ab, wobei R&sub1;&sub1; irgendeine substituierte oder nichtsubstituierte aliphatische, aromatische oder aliphatisch-aromatische Gruppe ist, vorzugsweise mit 1-6 Kohlenstoffatomen im aliphatischen Anteil. Besonders bevorzugte aliphatische Ester sind diejenigen, die aus niederen Alkylsäuren oder Alkoholen abgeleitet sind. Ebenfalls bevorzugt sind die Phenyl- oder niederen Alkylphenylester.
Amid weist die Bedeutung auf, wie er diesem Begriff klassischerweise in der organischen Chemie zugeordnet wird. In diesem Falle schließt er nichtsubstituierte Amide und alle aliphatischen und aromatischen mono- und disubstituierten Amide ein. Bevorzugte Amide sind die mono- und disubstituierten Amide, die aus den gesättigten aliphatischen Radikalen von 10 oder weniger Kohlenstoffatomen oder den zyklischen oder gesättigten aliphatisch-zyklischen Radikalen von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind. Besonders bevorzugte Amide sind diejenigen, die von niederen Alkylamiden abgeleitet sind. Ebenfalls bevorzugt sind mono- und disubstituierte Amide, die von den Phenyl- oder niederen Alkylphenylaminen abgeleitet sind. Nichtsubstituierte Amide werden ebenfalls bevorzugt.
Acetale und Ketale schließen die Radikale der Formeln - CH(OR&sub1;&sub2;)&sub2;, -CHOR&sub1;&sub3;O, -CR&sub7;(OR&sub1;&sub2;)&sub2; und -CR&sub7;OR&sub1;&sub3;O ein, wobei R&sub7;, eine Alkyl, Cycloalkyl oder Alkenylgruppe ist, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, R&sub1;&sub2; niederes Alkyl ist und R&sub1;&sub3; ein zweiwertiges Alkylradikal von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist.
Ein pharmazeutisch akzeptables Salz kann für jede Verbindung hergestellt werden, die im Behandlungsverfahren dieser Erfindung verwendet wird, wenn die Verbindung eine Funktionalität aufweist, die zur Bildung eines derartigen Salzes in der Lage ist, beispielsweise eine Säure oder eine Amino-Funktionalität. Ein pharmazeutisch akzeptables Salz kann jedes Salz sein, das die Aktivität der Stamm- bzw. Elternverbindung aufrechterhält und keine schädlichen oder abträglichen Wirkungen auf den Patienten, dem es verabreicht wird, und im Kontext in dem es verabreicht wird, ausübt.
Ein derartiges Salz kann aus irgendeiner organischen oder anorganischen Säure oder Base abgeleitet sein. Das Salz kann ein- oder mehrwertiges Ion sein. Von speziellem Interesse, wo die Säurefunktion betroffen ist, sind die anorganischen Ionen Natrium, Kalium, Kalzium und Magnesium. Organische Aminosalze können mit Aminen, insbesondere Aminosalzen wie beispielsweise Mono-, Di- und Trialkylaminen oder Ethanolaminen hergestellt werden. Salze können ebenfalls mit Koffein, Tromethamin und ähnlichen Molekülen gebildet werden. Wenn ein Stickstoff existiert, der ausreichend basisch ist, um zur Bildung von sauren Additionssalzen bzw. Säureadditionssalzen in der Lage zu sein, kann derartiges mit irgendeiner anorganischen oder organischen Säure oder einem Alkylierungsmittel wie beispielsweise Methyliodid gebildet werden. Bevorzugte Salze sind diejenigen, die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure gebildet werden. Irgendeine von mehreren einfachen organischen Säuren wie beispielsweise Mono-, Di- oder Trisäuren können ebenfalls verwendet werden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen enthalten eine Doppelbindung und weisen deswegen Trans- und Cis (E und Z) Isomere auf. Zusätzlich können einige der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen eine oder mehrere Chiralitätszentren enthalten und deswegen in enantiomeren und diasteromeren Formen existieren. Soweit nichts anderes durch chemische Nomenklatur oder Struktur angegeben ist, soll der Umfang der vorliegenden Erfindung alle derartigen Isomere per se abdecken, ebenso wie Gemische von Cis und Trans Isomeren, Gemische von Diastereomeren und razemische Gemische von Enantiomeren (optische Isomere). In den Strukturformeln ist eine trans (E) Konfiguration von Substituenten um eine Doppelbindung herum durch Bindungen angezeigt, die um eine Doppelbindung herum in entgegengesetzte Richtungen zeigen, wohingegen eine Cis (Z) Konfiguration von Substituenten um eine Doppelbindung herum durch Bindungen angezeigt wird, die in dieselbe Richtung um eine Doppelbindung herum zeigen.
Die allgemeinen Strukturen der RXR-Agonistenverbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind durch die allgemeine Formel 1 nachstehend dargestellt. Formel 1
Die Symbole sind wie folgt definiert:
R&sub1; ist ein niederes Alkyl, Cl, Br oder I;
R&sub2; ist H-, niederes Alkyl, Cl, Br oder I;
R&sub3; ist niederes Alkyl, Cl, Br oder I, OR&sub1;&sub1;, SR&sub1;&sub1;, OCOR&sub1;&sub1;, SCOR&sub1;&sub1;, NH&sub2;, NHR&sub1;&sub1;, N(R&sub1;&sub1;)&sub2;. NHCOR&sub1;&sub1; oder NR&sub1;&sub1;-COR&sub1;&sub1;; wobei R&sub5;-Gruppen unabhängig H, ein niederes Alkyl, Cl, Br, I, niederes Alkoxy oder niederes Thioalkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind; wobei die R&sub6;-Gruppen unabhängig H oder niederes Alkyl sind;
A (CH&sub2;)n ist, wobei 0-5 ist;
B COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon, COOR&sub8; oder CONR&sub9;R&sub1;&sub0; ist, wobei R&sub8; eine Aklylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkylgruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder R&sub8; Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist und R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkylgrupoe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist.
Bevorzugte Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, bei denen R&sub1; ein niederes Alkyl, noch mehr bevorzugt ein Methyl repräsentiert. R&sub2; ist vorzugsweise H oder niederes Alkyl, bevorzugter H. R&sub3; ist vorzugsweise niederes Alkyl, bevorzugter Methyl. R&sub5; ist vorzugsweise H oder niederes Alkyl, bevorzugter H. R&sub6; ist vorzugsweise niederes Alkyl, bevorzugter Methyl.
Bezüglich der Gruppe -A-B- weisen bevorzugte, in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindungen eine Gruppe - A-B- auf, die eine (CH&sub2;)n-COOR&sub8;-Gruppe oder eine (-CH&sub2;)n- CONR&sub9;R&sub1;&sub0;-Gruppe (R&sub8;, R&sub9; und R&sub1;&sub0; wie oben definiert) aufweist, wobei n Null ist und wobei die B-Gruppe COOR&sub8; ist. Am meisten bevorzugt ist B COOH.
Zwei spezielle Beispiele von bevorzugten Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wurden oben durch ihre jeweiligen Strukturformeln dargestellt, bezeichnet als Verbindung 1 (AGN 191701) und Verbindung 3 (AGN 191659).

Syntheseverfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die oben als allgemeine und spezielle Beispiele zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung dargelegten Verbindungen können durch mehrere unterschiedliche chemische Synthesewege hergestellt werden. Um die Erfindung zu veranschaulichen, sind die nachfolgenden Syntheseschemata vorgesehen. Der Synthesechemiker wird leicht verstehen, daß die hier dargestellten Bedingungen spezielle Ausführungsformen sind, die innerhalb der Fähigkeiten des praktizierenden organischen Synthesechemikers verallgemeinert werden können. Reaktionsschema 1
Reaktionsschema 1 veranschaulicht ein Syntheseverfahren zur Gewinnung der Verbindungen von Formel 1. Gemäß dieses Syntheseschemas wird eine 5,6,7,8-tetrahydronaphtylverbindung von Formel 2, die die erwünschten R&sub3;, R&sub5; und R&sub6;-Substituenten aufweist (wie sie in Verbindung mit Formel definiert sind) unter Friedel Crafts-artigen Bedingungen mit einem Reagenz wie beispielsweise R&sub1;COCl (R&sub1; ist wie in Verbindung mit Formel 1 definiert) zu Reaktion gebracht, um die R&sub1;-CO- Ketonfunktion in die 2-Position des Tetrahydronaphtalen- Ringes einzuführen. Wenn R&sub1; Methyl ist, dann ist das Reagenz in der Friedel Crafts-artigen Reaktion typischerweise Acetylchlorid. Das sich ergebende Keton aus Formel 3 wird dann reduziert (beispielsweise mit Natriumborhydrid) zum entsprechenden Alkohol der Formel 4. Der Alkohol von Formel 4 wird durch Behandlung mit den geeigneten Reagenzien, wie beispielsweise Phosphortribromid und Triphenylphosphin, zum entsprechenden Phosphoniumsalz umgewandelt (beispielsweise Triphenylphosphoniumbromid). Das Phosphoniumsalz aus Formel 5 ist ein Wittig-Reagenz, das mit einem Bromthiophenaldehyd von Formel 6 zur Reaktion gebracht wird und zwar unter Wittig- Bedingungen (eine Base wie beispielsweise n-Butyllithium), um Verbindungen der Formel 7 bereitzustellen. Die Bromgruppe des Thiophen-Bestandteils der Verbindung von Formel 7 wird durch Reaktion mit n-Butyllithium und Einfangen von Kohlendioxid zu einer Carboxylgruppe umgewandelt, um die Carbonsäureverbindungen der Formel 8 zu gewinnen, die weiter zu weiteren Homologen und Derivaten, wie hierin beschrieben, umgewandelt werden können. Die Synthesefolge von Reaktionsschema 1 ist der zur Herstellung von Verbindung 1 (AGN 191701) und Verbindung 3 (AGN 191659) gemäß der Erfindung bevorzugte Syntheseweg.
Ein alternativer Syntheseweg, der zu Verbindungen der Formel 1 führt, ist unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 2 beschrieben. Reaktionsschema 2
Gemäß Reaktionsschema 2 wird die Ketonverbindung von Formel 3 einer Reaktion von Wittig-Horner-Typ mit einem Phosphonat- Reagenz der Formel 9 unterworfen. Das Phosphonat-Reagenz von Formel 9 trägt einen Ester (COOR&sub8;)-Substituenten, es sollte jedoch klar sein, daß ein analoges Phosphonat-Reagenz, allgemein gesprochen, die A-B-Funktionalität tragen kann, wie eine derartige Funktionalität in Verbindung mit Formel 1 definiert ist. Die Reaktion vom Wittig Horner-Typ wird typischerweise in Gegenwart einer starken Base wie beispielsweise NaCH&sub2;SOCH&sub3;(Dimsyl-Natrium) in einem Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran (THF) durchgeführt. Das Syntheseverfahren von Reaktionsschema 2 wird unter geeigneter Selektion des aromatischen Reagenz des von Formel 9 repräsentierten Typs als Syntheseweg zur Gewinnung von Verbindung 2 (AGN 191440) bevorzugt, die die im RXR- Rezeptoraktivitäts-Assay verwendete Referenzverbindung darstellt.
Die Verbindungen von Formel 8 und Formel 10 können weiteren Transformationen unterworfen werden, insbesondere soweit es die Synthese-Transformation der COOR&sub8;-Gruppe anbetrifft. Soweit die Zubereitungen der Verbindungen betroffen ist, die zu den Verbindungen von Formel 8 und von Formel 10 analog sind, sich jedoch davon in der Funktionalität der A-B-Gruppe unterscheiden (und durch Ausdehnung der Prinzipien auf jede und alle Verbindungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden) werden die nachfolgenden weiteren wohlbekannten und veröffentlichten allgemeinen Prinzipien und Synthese- Methodologien erwähnt.
Carbonsäuren werden typischerweise verestert, indem die Säure in einer Lösung des geeigneten Alkohols in Gegenwart eines sauren Katalysators wie beispielsweise Hydrogenchlorid bzw. Salzsäure oder Thionylchlorid unter Rückflußkühlung erhitzt wird. Alternativ kann die Carbonsäure mit dem geeigneten Alkohol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin kondensiert werden. Der Ester wird wiedergewonnen und durch herkömmliche Mittel gereinigt. Acetale und Ketale können in einfacher Weise durch das in March "Advanced Organic Chemistry" 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company, S. 810) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Alkohole, Aldehyde und Ketone können alle durch Bildung von jeweils Ethern und Estern, Acetalen oder Ketalen durch bekannte Verfahren wie sie beispielsweise in McOmie, Plenum Publishing Press 1973 und Protecting Grcups, Herausgeber Greene, John Wiley & Sons, 1881, beschrieben sind, geschützt werden.
Um den Wert von n zu erhöhen, bevor die Wittig-Reaktion, die Wittig Horner-Reaktion oder analoge Kopplungsreaktionen nach Reaktionsschema 1 und Reaktionsschema 2 beeinflußt werden (wobei die notwendigen Reagenzien, die Formel 6 und/oder Formel 9 entsprechen, nicht aus kommerziellen Quellen verfügbar sind), werden die Carbonsäuren einer Homologisierung durch sukzessive Behandlung unter Arndt- Eistert Bedingungen oder anderen Homologisierungs-Verfahren unterworfen. Alternativ können Derivate, die keine Carbonsäuren sind, ebenfalls durch geeignete Verfahren homologisiert werden. Die homologisierten Säuren können dann durch das allgemeine, im vorhergehenden Absatz beschriebene Verfahren, verestert werden.
Ein alternatives Mittel zur Herstellung von Verbindungen, bei denen A (CH&sub2;)n (n ist 1-5) ist, besteht darin, die Verbindungen von Formel 1, bei denen B eine Säure oder eine andere Funktion ist, einer Homologisierung unter Verwendung des oben erwähnten Arndt-Eistertverfahrens oder anderen Homologisierungsverfahren zu unterwerfen.
Die Verbindungen der Formel 1, bei denen A eine Alkenylgruppe mit einer oder mehreren Verbindungen ist, kann beispielsweise hergestellt werden, indem die notwendige Anzahl von Doppelbindungen in das Zwischenprodukt eingebaut wird, das als Phosphonat mit dem Keton von Formel 3 verbunden wird. Allgemein gesprochen können derartige Verbindungen, bei denen A eine ungesättigte Kohlenstoffkette ist, durch Syntheseschemen erzielt werden, die dem praktizierenden organischen Chemiker wohlbekannt sind; beispielsweise durch Wittig- und dergleichen Reaktionen oder durch Einführung einer Doppelbindung durch Elimination von Halogen aus einer Alphahaloarylalkyl-Carbonsäure, einem Ester oder einem Carboxaldehyd. Die Verbindungen der Formel 1 bei denen die A- Gruppe eine dreifach (Acetylen)-Bindung aufweist, kann durch Verwendung der entsprechenden Phosphonat-Zwischenprodukte hergestellt werden. Ein derartiges Intermediat bzw. Zwischenprodukt kann durch Reaktionen gewonnen werden, die in der Technik wohlbekannt sind, beispielsweise durch Reaktion eines entsprechenden aromatischen Methylketons mit einer starken Base wie beispielsweise Lithiumdiisopropylamid.
Die Säuren und Salze, die aus den Verbindungen der Formel 1 abgeleitet werden, sind aus den entsprechenden Estern leicht erhältlich. Eine basische Verseifung mit einer Alkalimetallbase wird die Säure ergeben. Beispielsweise kann ein Ester in einem polaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem Alkanol, bevorzugt unter einer Inertatmosphäre bei Raumtemperatur gelöst werden, mit einem ungefähr dreimolaren Überschuß an Base, beispielsweise Kaliumhydroxid. Die Lösung wird für eine ausgedehnte Zeitspanne zwischen 15 und 20 Stunden gerührt, abgekühlt, angesäuert und das Hydrolysat durch herkömmliche Mittel wieder gewonnen.
Das Amid kann durch irgendein geeignetes Amidierungsmittel gebildet werden, das in der Technik bekannt ist, aus den entsprechenden Estern oder Carbonsäuren. Ein Weg, derartige Verbindungen herzustellen, liegt darin, eine Säure zu einem Säurechlorid umzuwandeln und dann diese Verbindung mit Ammoniumhydroxid oder einem geeigneten Amin zu behandeln. Beispielsweise wird die Säure mit einer Lösung einer alkoholischen Base wie beispielsweise ethanolischer KOH (in ungefähr 10% molarem Überschuß) bei Raumtemperatur für ungefähr 30 Minuten behandelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rest in einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Diethylether aufgenommen, mit einem Dialkylformamid behandelt und dann mit einem 10fachen Überschuß an Oxalylchlorid. Dies wird alles bei einer gemäßigt reduzierten Temperatur zwischen ungefähr -10 Grad und +10 Grad C bewirkt. Die zuletzt erwähnte Lösung wird dann bei der reduzierten Temperatur für 1-4 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, gerührt. Eine Entfernung des Lösungsmittels stellt einen Rest bereit, der in einem inerten organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Benzol aufgenommen wird, auf ungefähr 0ºC abgekühlt und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid behandelt wird. Das sich ergebende Gemisch wird bei einer reduzierten Temperatur für 1-4 Stunden gerührt. Das Produkt wird durch herkömmliche Mittel wiedergewonnen.
Alkohole werden durch Umwandlung der entsprechenden Säuren zum Säurechlorid mit Thionylchlorid oder anderen Mitteln hergestellt (J. March, "Advanced Organic Chemistry", 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company), wobei dann las Säurechlorid mit Natriumborhydrid reduziert wird (March, ibid., S. 1124), was die entsprechenden Alkohole liefert. Alternativ können Ester mit Lithiumaluminiumhydrid bei reduzierten Temperaturen reduziert werden. Ein Alkylieren dieser Alkohole mit geeigneten Alkylhalogeniden unter Williamson Reaktionsbedingungen (March, ibid. S. 357) liefert die entsprechenden Ether. Diese Alkohole können zu Estern umgewandelt werden, indem sie mit geeigneten Säuren in Gegenwart von sauren Katalysatoren oder Dicyclohexylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin zur Reaktion gebracht werden.
Aldehyde können aus den entsprechenden primären Alkoholen unter Verwendung von milden oxidierenden Mitteln, beispielsweise Pyridiniumdichromat in Methylenchlorid hergestellt werden (Corey, E.J., Schmidt, G., Tet. Lett., 399, 1979) oder Dimethylsulfoxid/Oxalylchlorid in Methylenchlorid (Omura, K., Swern, D., Tetrahedron. 1978, 34, 1651).
Ketone können aus einem geeigneten Aldehyd hergestellt werden, indem das Aldehyd mit einem Alkyl-Grignard-Reagenz oder einem ähnlichen Reagenz gefolgt von Oxidation behandelt werden.
Acetale oder Ketale können aus dem entsprechenden Aldehyd oder Keton durch das in March, ibid., S. 810, beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Unter Bezug auf Reaktionsschema 1 und Reaktionsschema 2 wird der Fachmann auf dem Gebiet leicht erkennen, daß weitere Variationen der dort beschriebenen Wittig und Wittig-Horner- Reaktionen möglich sind, um Verbindungen zu gewinnen, deren Verwendung innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt. Beispielsweise kann die in Reaktionsschema 1 dargestellte Wittig-Reaktion mit Reagenzien durchgeführt werden, bei denen ein Tetrahydronaphtalenderivat, analog zu Formel 5 eine Ketogruppe trägt und bei denen eine heteroaromatische Verbindung, die zu Formel 6 analog ist, die Triphenylphosphoniumkomponente trägt. Die Wittig Horner - Reaktion von Reaktionsschema 2 kann mit Reagenzien durchgeführt werden, bei denen ein Tetrahydronaphtalen- Derivat analog zur Formel 3 eine Dialkylphosphonat-Komponente trägt und bei denen eine heteroaromatische Verbindung analog zur Formel 9 eine Keto- oder Aldehydfunktion trägt.

Spezielle Beispiele

Methyl[3,5,5,8,8-pentamethyl(5,6,7,8-tetrahydronapthalen)-2- yl]keton (Verbindung 10)

Eine Suspension von 6,71 g (50,3 mmol) Aluminiumchlorid in Methylenchlorid wurden bei 0ºC unter Argon einer Lösung von 3,95 g (3,58 ml, 50,3 mmol) Acetylchlorid und 10,21 g (41,9 mmol) 3,5,5,8,8-pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydronapthalen in Methylenchlorid zugesetzt. Das sich ergebende Gemisch ließ man auf Raumtemperatur über eine Zeitspanne von 3 Stunden unter Rühren erwärmen. Das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt und 1 N NCl wurde tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wurde dann in Wasser aufgenommen und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Schichten wurden mit 1 N HCl, Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Rest unter Verwendung einer Flash-Chromatography gereinigt, um die Titelverbindung als einen elfenbeinfarbenen Feststoff zu liefern.
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.28 (6H, s), 1.30 (6H, s), 1.69 (4H, s), 2.49 (3H, s), 2.57 (3H, s), 7.15 (1H, s), 7.67 (1H, s).

(±)-1-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2- yl)ethanol (Verbindung 11)

Eine Lösung von 4,17 g (17,1 mmol) Methyl[3,5,5,8,8- pentamethyl(5,6,7,8-tetrahydronaphtalen-2-yl]keton (Verbindung 10) in Methanol wurde bei 0ºC portionsweise 0,77 g (20,4 mmol) Natriumborhydrid zugesetzt und die sich ergebende Suspension wurde bei 0ºC für 4 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Reststoff in Wasser aufgenommen, unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert und dreimal mit Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Rest unter Verwendung einer Flash-Chromatographie (SiO&sub2;, 10% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um ein einzelnes Isomer zu liefern: Die Titelverbindung als einen weißen Feststoff.
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.28 (12H, m), 1.47 (3H, d, J = 6.5 Hz), 1.67 (4H, s), 2.49 (3H, s), 5.08 (1H, m), 7.10 (1H, s), 7.45 (1H, s).

[(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2- yl)ethan-1-yl]triphenylphosphoniumbromid (Verbindung 12)

Eine Lösung von 3,87 g (15,7 mmol) von (±)-1-(5,6,7,8- tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2-yl)ethanol (Verbindung 11) in Ether und Hexanen bei 0ºC unter Argon wurden 42,4 g (14,9 ml, 157 mmol) Phosphortribromid zugesetzt und das sich ergebende Gemisch 2 Stunden lang gerührt. Das Wasser wurde dann tropfenweise über eine Zeitspanne von 30 Minuten zugesetzt und die Schichten getrennt. Die wäßrige Schicht wurde dreimal mit Ether extrahiert. Die Etherschichten wurden mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Rest in Benzol aufgenommen. Triphenylphosphin wurde zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde dann im Vakuum konzentriert und der sich ergebende Feststoff aus Acetonitril und Ethylacetat und Hexanen umkristallisiert, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu liefern.
PMR (CDCl&sub3;): δ 0.61 (3H, s), 0.89 (3H, s), 1.27 (6H, s), 1.62 (4H, m), 1.85 (6H, d), 2.04 (3H, dd), 5.19 (2H, m), 6.62 (1H, d), 7.02 (1H, s), 7.43 (6H, m), 7.68 (6H, m), 7.87 (3H, m).

2-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethyl2- naphtalen-2-yl)propen-1-yl]-4-bromthiophen (Verbindung 13)

Einer Lösung von 0,56 g (0,98 mmol) von 1-(3,5,5,8,8- pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphtalen-2-yl)ethan-I-yl- triphenylphosphoniumbromid (Verbindung 12) in 11 ml Tetrahydrofuran wurden bei -78ºC unter Argon tropfenweise 0,41 g (0,61 ml, 0,98 mmol, 1,6 M in Hexan) n-BuLi zugesetzt. Die sich ergebende Suspension ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und dann wurde eine Lösung von 0,28 g (1,47 mmol) 4- Brom-2-thiophencarboxaldehyd in 2 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugesetzt und das sich ergebende Gemisch 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Feststoff in Wasser aufgenommen, unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert und dreimal mit Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Rest unter Verwendung einer Flash-Chromatographie (SiO&sub2;, 0,5% Ethylacetat in Hexanen) gereinigt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben.
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.27 (6H, s), 1.29 (6H, s), 1.68 (4H, s), 2.26 (6H, m), 6.45 (1H, s), 6.75 (1H, s), 6.95 (1H, s), 7.07 (1H, s), 7.11 (1H, s), 7.17 (1H, s).

2-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphtalen- 2-yl)propen-1-yl]thiophen-4-carbonsäure (Verbindung 1)

Einer Lösung von 500 mg (1,24 mmol) von 2[-2-(E)-5,6,7,8- tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2-yl)propen-1-yl]- 4-bromthiopen (Verbindung 13) in 15 ml Tetrahydrofuran, das unter Argon bei -100ºC gerührt wurde, wurden 0,527 g (0,775 ml, 1,24 mmol, 1,6 M in Hexan) n-BuLi zugesetzt. Die Reaktion wurde für 2 Minuten gerührt und mit Kohlendioxid 20 Minuten durchspült. Das Reaktionsgemisch bzw. die Reaktion ließ man dann auf Raumtemperatur erwärmen, es wurde angesäuert und unter Verwendung von Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Rest in wässriger 2 N Natriumhydroxid aufgenommen und mit Ether gewaschen. Die sich ergebende wäßrige Schicht wurde unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert und mit Ether extrahiert. Die Etherschicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das sich ergebende Material durch Flash-Chromatographie (10% Ethylacetat in Hexanen) gereinigt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu liefern.
PMR (d&sup6; -DMSO): δ 1.23 (12H, s), 1.62 (4H, s), 2.21 (3H, s), 2.23 (3H, s), 6.56 (1H, s), 7.07 (1H, s), 7.13 (1H, s), 7.45 (2H, s), 8.24 (2H, s).

2-[(E)-(2)-((5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8- pentamethylnaphtalen-2-yl)-propen-1-yl]-5-bromthiophen (Verbindung 14)

Einer Lösung von 3,00 g (5,26 mmol) von [(5,6,7,8-tetrahydro- 3,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2-yl)ethan-1- yl]triphenylphosphoniumbromid (Verbindung 12) in 60 ml Tetrahydrofuran bei -78ºC unter Argon wurde tropfenweise 2,24 g (3,29 ml, 5,26 mmol, 1,6 M in Hexan) von n-BuLi zugesetzt. Die sich ergebende Suspension ließ man auf Raumtemperatur erwärmen, wobei eine Lösung von 1,01 g (0,63 ml, 5,26 mmol) von 5-Brom-2-thiophencarboxaldehyd in 10 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugesetzt wurde und das sich ergebende Gemisch 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann eine Stunde lang unter Rückflußkühlung erhitzt wurde. Das Gemisch wurde unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert, dreimal mit Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Rest unter Verwendung einer Flash- Chromatographie (SiO&sub2;, 2% Ethylacetat in Hexanen) gereinigt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu liefern.
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.28 (12H, s), 1.67 (4H, s), 2.24 (6H, 2 x s), 6.45 (1H, s), 6.75 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.99 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.07 (1H, s), 7.09 (1H, s).

2-[(E)-2-((5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8-pentamethylnaphtalen-2- yl]-5-thiophencarbonsäure (Verbindung 3)

Einer Lösung von 0,230 g (0,57 mmol) von 2-[(E)-2-((5,6,7,8- tetrahydro-3,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2-yl)propen-I-yl]-5- bromothiophen (Verbindung 14) in Ether wurden tropfenweise 0,67 ml (1,14 mmol, 1,7 M in Hexanen) t-BuLi unter Argon bei -78ºC zugesetzt. Das sich ergebende Gemisch wurde 1,5 Stunden lang gerührt, mit Kohlendioxid durchspült und über eine Zeitspanne von 16 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert und mit Ether extrahiert. Die Etherschicht wurde dann mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen blauen Feststoff zu liefern, der unter Verwendung von Ether in Hexanen umkristallisiert wurde, um die Titelverbindung als einen hellblauen Feststoff zu liefern.
PMR (d&sup6; -DMSO): δ 1.21 (12H, s), 1.60 (4H, s), 2.19 (3H, s), 2.24 (3H, s), 6.45 (1H, s), 6.61 (1H, s), 6.99 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.06 (1H, s), 7.12 (1H, s), 7.18 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.67 (1H, d, J = 3.8 Hz).

Ethyl 2-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8- pentamethylnaphtalen-2-yl)propen-1-yl]-5-thiophencarboxylat (Verbindung 15)

Eine Suspension von 0,161 g (0,437 mmol) von 5-[(E)-2- (5,6,7,8-tetrahydro-3,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2-yl)propen- I-yl]-2-thiophencarbonsäure (Verbindung 3, 0,03 g, 0,655 mmol) in EtOH, 0,099 g (0,48 mmol) 1,3- dicyclohexylcarbodiimid und 5,3 mg (0,044 mmol) 4- Dimethylaminopyridin in 10 ml Methylenchlorid wurden bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organischen Schichten wurden kombiniert und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest unter Verwendung einer Flash- Chromatographie (SiO&sub2;, 5% Ethylacetat in Hexanen) gereinigt, um die Titelverbindung als ein klares Öl zu liefern.
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.27 (12H, s), 1.39 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.68 (4H, s), 2.27 (3H, s), 2.34 (3H, s), 4.37 (2H, q, J = 7. Hz), 6.57 (1H, s), 7.00 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.09 (1H, s), 7.11 (1H, s), 7.74 (1H, d, J = 3.8 Hz).

4-Carboethoxybenzylbromid (Verbindung 16)

Einer gerührten Lösung von 16,09 g (78 mmol) 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid (Aldrich) in 100 ml Methylenchlorid wurde eine Suspension von 15,4 g (71 mmol) 4- Carboxybenzylbromid in 100 ml Methylenchlorid zugesetzt und darauf 4,9 g (106,5 mmol) absoluter Ethanol und. 0,81 g (7,1 mmol) 4-Dimethylaminopyridin. Weitere 50 ml mit Methylenchlorid wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt und das Gemisch unter Rückflußkühlung 2 Stunden lang erhitzt. Man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen und das sich ergebende weiße Präzipitat wurde durch Filtration entfernt. Das Hydrat wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und dann im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als ein farbloses Öl zu liefern, das beim Stehenlassen kristallisierte.
PMR (CDCl&sub3;); δ 1.39 (3H, t, J - 7.2 Hz), 4.38 (2H, q, J - 7.2 Hz), 4.50 (2H, s), 7.45 (2H, d, J - 7.7 Hz), 8.03 (2H, d, - 7.7 Hz).

Ethyl[4-(diethoxyphosphinyl)methyl]benzoat (Verbindung 17)

Ein Gemisch von 11,8 g (48 mmol) 4-Carboxybenzylbromid (Verbindung 16) und 12,0 g (72 mmol) frisch destilliertem Triethylphosphit wurden in einem Kolben angeordnet, der mit einem Argoneinlaß und einer Trockeneis-gekühlten Kühlfalle ausgestattet war. Ein kontinuierlicher Argonstrom wurde über das gerührte Reaktionsgemisch geleitet und das Gemisch bei 120ºC 3 Stunden lang erhitzt, zu diesem Zeitpunkt wurde kein weiteres Ethylbromid mehr gebildet. Der Rest wurde durch Vakuumdestillation gereinigt, um die Titelverbindung als ein farbloses Öl zu liefern, Siedepunkt = 170º/0,35 mm).
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.23 (6H, t, J - 7.1 Hz), 1.39 (3H, t, J - 6.9 Hz), 3.21 (2H, d, J - 22.1 Hz), 4.02 (4H, m), 4.37 (2H, q, J - 7.5 Hz), 7.38 (2H, d, J - 7.9 Hz), 8.00 (2H, d, J - 7.9 Hz).

Ethyl 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8- pentamethylnaphtalen-2-yl)propen-1-yl]benzoat (Verbindung 18)

Eine Lösung von 5,0 g (21,5 mmol) Methyl[3,5,5,8,8,- pentamethyl(5,6,7,8-tetrahydronaphtalen)-2-yl]keton (Verbindung 10) und 3,39 g (11,3 mmol) Ethyl[4- (diethoxyphosphinyl)methyl]benzoat (Verbindung 17) in 25 ml Tetrahydrofuran wurde über eine Kanüle einer Suspension von 0,52 g (21,5 mmol) Natriumhydrid in 25 ml Tetrahydrofuran bei 0ºC unter Argon zugesetzt. Die sich ergebende Suspension ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und wurde für 16 Stunden gerührt. Der sich ergebende Schlamm wurde in Wasser und 1 N HCl aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die Etherschichten wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest unter Verwendung von Flash-Chromatographie (SiO&sub2;, 1% Ethylacetat in Hexanen) gereinigt, um ein Gemisch von Isomeren zu liefern, das unter Verwendung von HPLC (0,5% Ethylacetat in Hexanen) getrennt wurde, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu liefern.
PMR (CDCl&sub3;): δ 1.30 (12H, s), 1.38 (3H, t, J = 1.0 Hz), 1.69 (4H, s), 2.21 (3H, s), 2.30 (3H, s), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.42 (1H, s), 7.12 (2H, überl. s), 7.43 (231, d, J = 8.3 Hz), 8.05 (2H, d, J = 8.3 Hz).

4-(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphtalen-2- yl)propen-1-yl]benzoesäure (Verbindung 2)

Eine Lösung von Kaliumhydroxid in Ethanol wurde zu 95 mg (0,25 mmol) Ethyl 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8,- pentamethylnaphtalen)-2-yl)propen-1-yl]benzonat (Verbindung 18) zugesetzt und das sich ergebende Gemisch bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der sich ergebende Feststoff in Wasser aufgenommen, unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert und dreimal mit Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung als einen orangen Feststoff zu liefern.
PMR (d&sup6; -DMSO): δ 1.23 (12H, s), 1.62 (4H, s), 2.15 (3H, s), 2.23 (3H, s), 6.37 (1H, s), 7.08 (1H, s), 7.13 (1H, s), 7.51 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.94 (2H, d, J = 8.3 Hz).

Claims

1. Verwendung einer Verbindung, die eine retinoidartige Aktivität aufweist, und ein Agonist der RXR-Retinoid-Rezeptoren ist, zur Herstellung eines Medikaments zum Induzieren eines apoptotischen Todes von Tumorzellen in einem Wirts-Säugetier, beispielsweise einem Menschen, um dadurch den Tumor zu behandeln; wobei die Verbindung die Formel

aufweist, bei der

R&sub1; C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Cl, Br oder I ist;

R&sub2; H, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Cl, Br oder I ist

R&sub3; C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Cl, Br, I, OR&sub1;&sub1;, SR&sub1;&sub1;, OCOR&sub1;&sub1;, SCOR&sub1;&sub1;, NH&sub2;, NHR&sub1;&sub1;, N(R&sub1;&sub1;)&sub2;, NHCOR&sub1;&sub1; oder NR&sub1;&sub1;-COR&sub1;&sub1; ist;

die R&sub5;-Gruppen unabhängig H, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Cl, Br, I, C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxy oder C&sub1;&submin;&sub6; Thioalkoxy sind;

die R&sub6;-Gruppen unabhängig H oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl sind;

A (CH&sub2;)n ist, wobei n 0-5 ist; und

B Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon, COOR&sub8; oder CONR&sub9;R&sub1;&sub0; ist;

wobei R&sub8; eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cylcoalkylgruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder R&sub8; Phenyl oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkylphenyl ist und R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Cycloalkylgruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder Phenyl oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylphenyl sind.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der in der Formel der Verbindung R&sub1;, R&sub3; und R&sub6; Methyl sind, R&sub2; und R&sub5; Wasserstoff sind und die Gruppe -A-B COOR&sub8; repräsentiert.

3. Verwendung nach Anspruch 1, bei der -A-B COOH repräsentiert.

4. Verwendung nach Anspruch 3, bei der die COOH-Gruppe in der 4-Position des Thiophen-Rings vorliegt.

5. Verwendung nach Anspruch 3, bei der die COOH-Gruppe in der 5-Position des Thiophen-Rings vorliegt.

6. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Verbindung ein selektiver Agonist der RXR-Retinoid- Rezeptoren in Bevorzugung vor RAR Retinoid-Rezeptoren ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Verbindung ein spezifischer Agonist der RXR- Retinoid-Rezeptoren ist, wenn er mit RAR-Retinoid-Rezeptoren verglichen wird.

8. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Medikament zur systemischen Verabreichung vorgesehen ist.