DE69829183T2 - Synthese und verwendung von retinoiden mit negativen hormonellen und/oder antagonistischen wirkungen - Google Patents

Synthese und verwendung von retinoiden mit negativen hormonellen und/oder antagonistischen wirkungen Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen mit negativen Retinoidhormon- und/oder Retinoidantagonist-artigen biologischen Aktivitäten. Insbesondere betrifft die Erfindung 4-Aryl-substituierte Benzopyran-Derivate. Diese neuen Verbindungen besitzen Retinoidantagonist-artige Aktivität und sind nützlich zur Behandlung oder Prävention von durch Retinoid und Vitamin A und Vitamin A-Vorläufer induzierte Toxizität in Säugetieren und als Zusatz zur Behandlung von Säugetieren mit Retinoiden zur Prävention oder Linderung ungewollter oder ungewünschter Nebenwirkungen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von negativen Retinoidhormonen zur Erhöhung der biologischen Aktivitäten anderer Retinoide und Steroidhormone und Inhibierung der Grundaktivität von freien Retinolsäurerezeptoren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Verbindungen, die Retinoid-artige Aktivität besitzen, sind allgemein fachbekannt und werden in zahlreichen US- und anderen Patenten und in wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben. Es ist allgemein bekannt und fachlich akzeptiert, daß Retinoid-artige Aktivität nützlich zur Behandlung von Säugetieren ist, einschließlich Menschen, um die Symptome zu heilen oder zu lindern, die mit zahlreichen Krankheiten und Zuständen verbunden sind.
  • Es ist bekannt, daß Retinoide (Vitamin A und seine Derivate) breite Aktivitäten, einschließlich Wirkungen auf die Zellproliferation und -differenzierung, in einer Vielzahl biologischer Systeme besitzen. Diese Aktivität hat Retinoide nützlich in der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten gemacht, einschließlich dermatologischer Störungen und Krebs. Der Stand der Technik hat eine große Anzahl chemischer Verbindungen entwickelt, die Retinoid-artige biologische Aktivität besitzen, und es existiert umfangreiche Patent- und chemische Literatur, die solche Verbindungen beschreibt. Die relevante Patentliteratur schließt die US-PSen 4,980,369, 5,006,550, 5,015,658, 5,045,551, 5,089,509, 5,134,159, 5,162,546, 5,234,926, 5,248,777, 5,264,578, 5,272,156, 5,278,318, 5,324,744, 5,346,895, 5,346,915, 5,348,972, 5,348,975, 5,380,877, 5,399,561, 5,407,937 (überschrieben auf den gleichen Rechtsnachfolger wie die vorliegende Anmeldung) und darin zitierte Patente und Veröffentlichungen ein, die insbesondere Chroman-, Thiochroman- und 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin-Derivate beschreiben oder betreffen, die Retinoid-artige biologische Aktivität besitzen. Zusätzlich sind mehrere Anmeldungen anhängig, die auf den Rechtsnachfolger der folgenden Anmeldung übertragen wurden, und die auf weitere Verbindungen mit Retinoid-artiger Aktivität gerichtet sind.
  • Die US-PSen 4,740,519 (Shroot et al.), 4,826,969 (Maignan et al.), 4,326,055 (Loeliger et al.), 5,130,335 (Chandraratna et al.), 5,037,825 (Klaus et al.), 5,231,113 (Chandraratna et al.), 5,324,840 (Chandraratna), 5,344,959 (Chandraratna), 5,130,335 (Chandraratna et al.), EP-A-0 176 034 (Wuest et al.), EP-A-0 350 846 (Klaus et al.), EP-A-0 176 032 (Frickel et al.), EP-A-0 176 033 (Frickel et al.), EP-A-0 253 302 (Klaus et al.), EP-A-0 303 915 (Bryce et al.), GB-A-2190378 (Klaus et al.), DE-A-3715955 (Klaus et al.), DE-A-3602473 (Wuest et al.) und die Artikel J. Amer. Acad. Derm. 15: 756–764 (1986) (Sporn et al.), Chem. Pharm. Bull. 33: 404–407 (1985) (Shudo et al.), J. Med. Chem. 31: 2182–2192 (1988) (Kagechika et al.), Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids, CRC Press Inc. 1990, S. 334–335, 354 (Dawson et al.) beschreiben oder betreffen Verbindungen, die eine Tetrahydronaphthyl-Einheit einschließen und Retinoid-artige oder verwandte biologische Aktivität besitzen. US-PS 4,391,731 (Boller et al.) beschreibt Tetrahydronaphthalin-Derivate, die nützlich in Flüssigkristallzusammensetzungen sind.
  • Ein Artikel von Kagechika et al., J. Med. Chem. 32: 834 (1989), beschreibt bestimmte 6-(3-Oxo-1-propenyl)-1,2,3,4-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin-Derivate und verwandte Flavon-Verbindungen mit Retinoid-artiger Aktivität. Die Artikel von Shudo et al., Chem. Pharm. Bull. 33: 404 (1985), und von Jetten et al., Cancer Research 47: 3523 (1987), beschreiben oder betreffen weitere 3-Oxo-1-propenyl-Derivate (Chalcon-Verbindungen) und ihre Retinoid-artige oder verwandte biologische Aktivität.
  • Unglücklicherweise verursachen Verbindungen mit Retinoidartiger Aktivität (Retinoide) ebenfalls eine Anzahl ungewünschter Nebenwirkungen bei therapeutischen Dosisniveaus, einschließlich Kopfschmerz, Teratogenese, mukokutane Toxizität, muskoskeletale Toxizität, Dyslipidämien, Hautreizung, Kopfschmerz und Lebertoxizität. Diese Nebenwirkungen beschränken die Akzeptanz und den Nutzen von Retinoiden zur Behandlung von Krankheit.
  • Es ist jetzt allgemeines Fachwissen, daß zwei Haupttypen von Retinoidrezeptoren in Säugetieren (und anderen Organismen) existieren. Die zwei Haupttypen oder -familien von Rezeptoren werden als die RARs bzw. RXRs bezeichnet. Innerhalb jedes Typs gibt es Untertypen: in der RAR-Familie werden die Untertypen als RAR-α, RAR-β und RAR-γ bezeichnet, in RXR sind die Untertypen: RXR-α, RXR-β und RXR-γ. Beide Familien von Rezeptoren sind Transkriptionsfaktoren, die voneinander auf Basis ihrer Ligandenbindungsspezifitäten unterschieden werden können. All-trans-RA (ATRA) bindet und aktiviert eine Klasse von Retinolsäurerezeptoren (RARs), die RAR-α, RAR-β und RAR-γ einschließt. Ein unterschiedlicher Ligand, 9-cis-RA (9C-RA), bindet und aktiviert sowohl die RARs als auch die Mitglieder der Retinoid-X-Rezeptor-(RXR)-Familie.
  • Es ist ebenfalls fachlich etabliert, daß die Verteilung der zwei Retinoidrezeptor-Haupttypen und der verschiedenen Untertypen nicht gleichförmig in den verschiedenen Geweben und Organen von Säugetierorganismen ist. Außerdem ist es allgemein fachlich akzeptiert, daß viele ungewollte Nebenwirkungen von Retinoiden durch einen oder mehrere der RAR-Rezeptoruntertypen vermittelt werden. Entsprechend wird unter Verbindungen mit Agonist-artiger Aktivität an Retinoidrezeptoren die Spezifität oder Selektivität für eine(n) der Haupttypen oder -familien und sogar Spezifität oder Selektivität für einen oder mehrere Untertypen innerhalb einer Familie von Rezeptoren als eine wünschenswerte pharmakologische Eigenschaft betrachtet.
  • Erst vor kurzem wurden auf diesem Gebiet Verbindungen entwickelt, die an RAR-Rezeptoren ohne Auslösen der Reaktion oder Reaktionen binden, die durch Agonisten der gleichen Rezeptoren ausgelöst werden. Die Verbindungen oder Mittel, die an RAR-Rezeptoren ohne Auslösen einer "Retinoid"-Reaktion binden, können deshalb die Aktivität von RAR-Agonisten in biologischen Tests und Systemen blockieren (in geringerem oder höherem Ausmaß). Insbesondere beschreibt in bezug auf die wissenschaftliche und Patentliteratur auf diesem Gebiet WO 94/14777 bestimmte heterocyclische Carbonsäure-Derivate, die an RAR-Retinoidrezeptoren binden und gemäß der Anmeldung nützlich zur Behandlung bestimmter Krankheiten oder Zustände sein sollen, wie z.B. Akne, Psoriasis, rheumatoide Arthritis und virale Infektionen. Eine ähnliche Offenbarung wird im Artikel von Yoshimura et al. gemacht, J. Med. Chem. 38: 3163–3173 (1995). Kaneko et al., Med. Chem. Res. 1: 220–225 (1991); Apfel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7129–7133 Augusty 1992 Cell Biology; Eckhardt et al., Toxicology Letters 70: 299–308 (1994); Keidel et al., Molecular and Cellular Biology 14: 287–298 (1994); und Eyrolles et al., J. Med. Chem. 37: 1508–1517 (1994), beschreiben Verbindungen, die Antagonist-artige Aktivität an einem oder mehreren der RAR-Retinoid-Untertypen besitzen.
  • Zusätzlich zu unerwünschten Nebenwirkungen der Therapie mit Retinoidverbindungen tritt gelegentlich ein ernsthafter medizinischer Zustand auf, der durch eine Vitamin A- oder Vitamin A-Vorläufer-Überdosis verursacht wird, was entweder aus der übermäßigen Einnahme von Vitaminergänzungsmitteln oder dem Verzehr der Leber bestimmter Fische und Tiere resultiert, die hohe Mengen des Vitamins enthalten. Die mit dem Hypervitaminose A-Syndrom beobachteten chronischen oder akuten Toxizitäten schließen Kopfschmerz, Hautablösung, Knochentoxizität, Dyslipidämien etc. ein. In den vergangenen Jahren ist es offensichtlich geworden, daß die mit Vitamin A-Analoga, d.h. Retinoiden, beobachteten Toxizitäten im wesentlichen diejenigen des Hypervitaminose-A-Syndroms wiederholen, was eine gemeinsame biologische Ursache nahelegt, d.h. RAR-Aktivierung. Diese Toxizitäten werden derzeit hauptsächlich durch stützende Maßnahmen und durch Verzichten von weiterem Kontakt mit dem verursachenden Mittel behandelt, seien es Leber, Vitaminergänzungsmittel oder Retinoide. Während sich einige der Toxizitäten im Verlauf der Zeit auflösen, sind andere (z.B. vorzeitiger Epiphysenschluß) permanent.
  • Allgemein gesprochen sind spezifische Gegengifte die beste Behandlung für Vergiftung durch pharmakologische Mittel, aber nur etwa zwei Dutzend Chemikalien oder Klassen von Chemikalien aus den Tausenden, die es gibt, besitzen spezifische bekannte Gegengifte. Ein spezifisches Gegengift würde offensichtlich von Wert in der Behandlung von Hypervitaminose A und Retinoidtoxizität sein. Da zunehmend wirksame Retinoide klinisch verwendet werden, könnte ein spezifisches Gegengift für Retinoidvergiftung tatsächlich lebensrettend sein.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel (1):
    Figure 00060001
    worin R2 H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen, F, Cl, Br, I, CF3, fluorsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen, OH, SH, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffen oder Alkylthio mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist;
    m eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist;
    R3 H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen oder F ist;
    o eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist;
    s eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist;
    R8 H, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen oder Trimethylsilylalkyl, worin die Alkyl-Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffe aufweist, oder eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffen ist oder R8 Phenyl oder Niederalkylphenyl ist;
    R15 unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, COR8, NR8CON(R8)2, OCOR8, OR8, CN, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine fluorsubstituierte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine Alkenyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxy-Gruppe ist, worin die Alkyl-Gruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffe aufweisen;
    r eine ganze Zahl mit einem wert von 0 bis 5 ist und
    die CONH-Gruppe in der 6- oder 7-Position des Benzopyrans ist,
    oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich zur Prävention bestimmter ungewünschter Nebenwirkungen von Retinoiden, die zur Behandlung oder Prävention von bestimmten Krankheiten oder Zuständen verabreicht werden. Für diesen Zweck können die Verbindungen der Erfindung mit Retinoiden gemeinsam verabreicht werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls nützlich in der Behandlung von akuter oder chronischer Toxizität, die aus einer Überdosis oder Vergiftung durch Retinoidwirkstoffe oder Vitamin A resultiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich die Verwendung von RAR-Antagonisten zur Blockierung aller oder einiger RAR-Rezeptororte in biologischen Systemen, einschließlich Säugetieren, zur Prävention oder Verminderung der Wirkung von RAR-Agonisten auf die Rezeptororte. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von RAR-Antagonisten zur (a) Prävention und (b) Behandlung von chronischer oder akuter Retinoidtoxizität (einschließlich durch Vitamin A oder Vitamin A-Vorläufer) und von Nebenwirkungen der Retinoidtherapie.
  • In einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines pathologischen Zustands in einem Säugetier bereitgestellt. Die behandelten Zustände sind mit einer Retinolsäurerezeptor-Aktivität verbunden. Dieses Verfahren beinhaltet das Verabreichen eines Retinoidantagonisten oder negativen Hormons, der/das an einen der folgenden Retinolsäurerezeptor-Untertypen binden kann, an das Säugetier: RARα, RARβ und RARγ. Der Antagonist oder das negative Hormon wird in einer pharmazeutisch wirksamen Menge zur Bereitstellung eines therapeutischen Nutzen gegen den pathologischen Zustand im Säugetier verabreicht.
  • Als Gegengift für akute oder chronische Retinoid- oder Vitamin A-Vergiftung kann der RAR-Antagonist an ein Säugetier enteral, d.h. durch intragastrale Intubation oder als Lebensmittel/Wasser-Gemisch, oder parenteral, z.B. intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, topisch etc., verabreicht werden. Die einzige Anforderung für den Verabreichungsweg ist, daß er die Übertragung des Antagonisten auf das Zielgewebe erlauben muß. Der RAR-Antagonist kann als solcher oder in Kombination mit Exzipienten formuliert werden. Der RAR-Antagonist braucht nicht in Lösung in der Formulierung sein, zum Beispiel im Falle von enteraler Verwendung.
  • Als Zusatz zur Therapie mit Retinoiden und zur Prävention einer oder mehrerer der Nebenwirkungen des Retinoidwirkstoffs, der verabreicht wird, kann der RAR-Antagonist in ähnlicher Weise enteral oder parenteral verabreicht werden. Der RAR-Antagonist und RAR-Agonist brauchen nicht auf dem gleichen Verabreichungsweg verabreicht werden. Der Schlüssel ist, daß ausreichende Mengen des RAR-Antagonisten kontinuierlich im interessierenden Gewebe während des Kontakts mit dem RAR-Agonisten vorhanden sind. Zur Prävention von Retinoidtoxizität ist es am besten, daß der RAR-Antagonist gleichzeitig oder vor der Behandlung mit dem RAR-Agonisten verabreicht wird. In vielen Situationen wird der RAR-Antagonist auf einem anderen Weg als der Agonist verabreicht werden. Zum Beispiel können ungewünschte Hautwirkungen eines enteral verabreichten Retinoids durch einen RAR-Antagonisten verhindert oder gelindert werden, der topisch verabreicht wird.
  • Ein Verfahren zur Potenzierung einer pharmakologischen Aktivität eines Steroidsuperfamilie-Rezeptoragonisten beinhaltet die gleichzeitige Verabreichung an das Säugetier, zusammen mit dem Steroidsuperfamilie-Rezeptoragonisten, einer Zusammensetzung, die eine pharmazeutische wirksame Dosis eines negativen Retinoidhormons umfaßt, um die pharmakologische Aktivität des Steroidsuperfamilie-Rezeptoragonisten zu potenzieren. Die pharmakologische Aktivität ist in einem Reportergen-trans-Aktivierungstest in vitro meßbar, wie zum Beispiel durch Messung der Anti-AP-1-Aktivität. Die zu potenzierende pharmakologische Aktivität kann eine antiproliferative Aktivität sein, wie zum Beispiel Aktivität des Typs, der im Netzhautpigmentepithel meßbar ist. Der Steroidsuperfamilie-Rezeptoragonist kann jeder der folgenden sein: ein Retinoidrezeptoragonist, ein Vitamin D-Rezeptoragonist, ein Glukokortikoidrezeptoragonist, ein Schilddrüsenhormonrezeptoragonist, ein Peroxisomproliferatoraktivierter Rezeptoragonist oder ein Östrogenrezeptoragonist.
  • Der Retinoidrezeptor-Agonist kann ein RAR-Agonist sein, wie zum Beispiel all-trans-Retinolsäure oder 13-cis-Retinolsäure. Der Retinoidrezeptor-Agonist kann ebenfalls ein RXR-Agonist sein. Ein bevorzugter Vitamin D-Rezeptoragonist ist 1,25-Dihydroxyvitamin D3. Ein bevorzugter Glukokortikoidrezeptor-Agonist ist Dexamethason. Ein bevorzugter Schilddrüsenhormonrezeptor-Agonist ist 3,3',5-Triiodthyronin. Das negative Retinoidhormon ist ein RAR-spezifisches negatives Retinoidhormon, das bevorzugt eine Dissoziationskonstante von weniger als oder etwa gleich 30 nM hat. Verweise auf das RAR-spezifische negative Retinoidhormon schließen AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 und AGN 193871 ein. Die Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Dosis eines negativen Retinoidhormons umfaßt, kann zum gleichen Zeitpunkt wie der Steroidsuperfamilie-Agonist koverabreicht werden und vor der Koverabreichung kombiniert werden. Diese können ebenfalls als getrennte Zusammensetzungen koverabreicht werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die chemische Struktur von AGN 193109.
  • 2A–2F sind eine Reihe von Liniendiagrammen, die zeigen, daß AGN 193109 die ATRA-abhängige Transaktivierung an den RARs inhibiert. 2A und 2B stellen die Aktivität am RAR-α-Rezeptor dar; 2C und 2D stellen die Aktivität am RAR-β-Rezeptor dar; 2E und 2F stellen die Aktivität am RAR-γ-Rezeptor dar. In 2A, 2C und 2E stellen offene Kästchen die Retinolsäurebehandlung dar, und gefüllte Kreise stellen die AGN 193109-Behandlung dar. In 2B, 2D und 2F stellen die einzelnen Linien die Luciferase-Aktivität dar, gemessen nach Behandlung mit 10–8 M ATRA und variablen Konzentrationen von AGN 193109.
  • 3A und 3B sind Liniendiagramme, die die Luciferase-Aktivität darstellen, detektiert in CV-1-Zellen, die mit Reporterplasmid ERE-tk-Luc und Expressionsplasmid ER-RAR-α transfiziert und mit ATRA (3A) oder AGN 193109 (3B) bei verschiedenen Konzentrationen stimuliert wurden. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Luciferasebestimmungen dar. Die Ergebnisse der unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von kotransfiziertem ER-RAR-α (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Vertiefung) durchgeführten Transfektionen sind in jeder Figur angegeben.
  • 4A und 4B sind Liniendiagramme, die die Luciferase-Aktivität in CV-1-Zellen darstellen, transfiziert mit Reporterplasmid ERE-tk-Luc und Expressionsplasmid ER-RAR-β und stimuliert mit ATRA (4A) oder AGN 193109 (4B) bei verschiedenen Konzentrationen. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Luciferasebestimmungen dar. Die Ergebnisse der unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von kotransfiziertem ER-RAR-β (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Vertiefung) durchgeführten Transfektionen sind in jeder Figur angegeben.
  • 5A und 5B sind Liniendiagramme, die die Luciferase-Aktivität darstellen, detektiert in CV-1-Zellen, die mit Reporterplasmid ERE-tk-Luc und Expressionsplasmid ER-RAR-γ transfiziert und mit ATRA (3A) oder AGN 193109 (3B) bei verschiedenen Konzentrationen stimuliert wurden. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Luciferasebestimmungen dar. Die Ergebnisse der unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von kotransfiziertem ER-RAR-γ (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Vertiefung) durchgeführten Transfektionen sind in jeder Figur angegeben.
  • 6 zeigt ATRA- und AGN 193109-Dosisreaktionen von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und entweder dem chimären ER-RXR-α-Rezeptor-Expressionsplasmid allein oder in Kombination mit dem RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmid kotransfiziert wurden. Mit ER-RXR-α kotransfizierte Zellen wurden mit ATRA (Kästchen) und AGN 193109 (Rauten) behandelt. Mit der Kombination aus ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 kotransfizierte Zellen wurden mit ATRA (Kreise) oder AGN 193109 (Dreiecke) behandelt.
  • 7 zeigt ein Liniendiagramm, das die Messungen der Luciferase-Aktivität darstellt, aufgezeichnet in Lysaten von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Reporter- und ER-RAR-γ-Expressionskonstrukt transfiziert und dann mit ATRA mit 10–8 M und den Testverbindungen mit den auf der horizontalen Achse angegebenen Konzentrationen behandelt wurden. Die Testverbindungen waren AGN 193109 (Kästchen), AGN 193357 (offene Rauten), AGN 193385 (Kreise), AGN 193389 (Dreiecke), AGN 193840 (schraffierte Kästchen) und AGN 192870 (gefüllte Rauten).
  • 8 zeigt ein Liniendiagramm, das die Messungen der Luciferase-Aktivität darstellt, aufgezeichnet in Lysaten von CV-1-Zellen, die mit den ERE-tk-Luc-Reporter- und RAR-γ-VP-16- und ER-RXR-α-Expressionskonstrukten transfiziert und dann mit den Testverbindungen in den auf der horizontalen Achse angegebenen Konzentrationen behandelt wurden. Die Testverbindungen waren ATRA (offene Kästchen), AGN 193109 (offene Kreise), AGN 193174 (offene Dreiecke), AGN 193199 (schraffierte Kästchen), AGN 193385 (schraffierte Kreise), AGN 193389 (umgedrehte Dreiecke), AGN 193840 (diagonal gefüllte Kästchen) und AGN 193871 (halbgefüllte Rauten).
  • 9A, 9B und 9C skizzieren schematisch einen Mechanismus, durch den AGN 193109 die Wechselwirkung zwischen dem RAR (schattierter Kasten) und negativen Koaktivatorproteinen (–) modulieren können, veranschaulicht im Zusammenhang eines Transaktivierungstests. 9A zeigt, daß negative Koaktivatorproteine und positive Koaktivatorproteine (+) in einem Bindungsgleichgewicht mit dem RAR stehen. In Abwesenheit eines Liganden resultiert eine Transkription des Reportergens auf Basisniveau. Wie in 9B veranschaulicht wird, fördert die Zugabe eines RAR-Agonisten die Assoziation von positiven Koaktivatorproteinen mit dem RAR und führt zu einer aufrequlierten Reportergen-Transkription. Wie in 9C veranschaulicht wird, fördert die Zugabe von AGN 193109 die Assoziation von negativen Koaktivatorproteinen mit dem RAR und verhindert die Reportergen-Transkription.
  • 10 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibierung von TPA-induzierter Str-AP1-CAT-Expression als Funktion der AGN 191183-Konzentration (10–10 bis 10–12 M) zeigt, wobei die AGN 193109-Konzentration konstant auf 10–8 M gehalten wird. Die Ergebnisse aus Versuchen, die mit AGN 191183 allein durchgeführt wurden, sind als schraffierte Balken gezeigt, während gestreifte Balken die Ergebnisse aus der Behandlung mit der Kombination aus AGN 193109 und AGN 191183 darstellen.
  • 11 skizziert schematisch einen Mechanismus, durch den AGN 193109 die Aktivitäten von RARs und anderen Mitgliedern der Kernrezeptorfamilie potenzieren kann. Wie im Diagramm veranschaulicht wird, besitzen eingeführte RARs (offene Rechtecke mit AB-C-DEF-Domänen) eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber RAR-Liganden im Anti-AP1-Test, weil das negative Koaktivatorprotein (ncp), das in beschränkender Zufuhr vorhanden ist, auf RARs abgesondert wird und dadurch zu zwei Populationen führt: RAR + ncp und RAR – ncp. RAR – ncp hat eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Liganden. Nicht-RAR-Kernfaktoren (schattierte Rechtecke mit AB-C-DEF-Domänen) besitzen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber verwandten Liganden, weil ncp auf den RAR durch die Aktivität von AGN 193109 abgesondert wurde. Die modularen Domänen der Kernrezeptoren werden unter Verwendung von Standardnomenklatur als "AB" (ligandenunabhängige Transaktivierungsdomäne), "C" (DNA-Bindungsdomäne) und "DEF" (ligandenregulierte Transaktivierungsdomäne und Dimerisierungsdomäne) bezeichnet.
  • 12 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von AGN 193109 auf die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Dosisreaktion in CV-1-Zellen zeigt, die mit dem MTV-DR3-Luc-Reporterplasmid transfiziert wurden. Transfektanten wurden mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (gefüllte Kästchen), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und 10–8 M AGN 193109 (gefüllte Dreiecke) und 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und 10–7 M AGN 193109 (gefüllte Kreise) behandelt.
  • 13 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung der AGN 193109-Koverabreichung (10 nM) auf die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-vermittelte Inhibierung von TPA-induzierter Str-AP1-CAT-Aktivität zeigt. Gefüllte Balken stellen die Inhibierung von CAT-Aktivität in mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 allein behandelten transfizierten Zellen dar. Leere Balken stellen die Inhibierung von CAT-Aktivität in mit der Kombination aus 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und AGN 193109 behandelten transfizierten Zellen dar.
  • 14 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von AGN 193109 allein und in Kombination mit AGN 191183 auf HeLa-Zellen zeigt, die mit RAR-γ und dem auf RAR reagierenden MTV-TREp-Luc-Reporterkonstrukt transfiziert wurden. Die im Diagramm veranschaulichten Wirkstoffbehandlungen sind: AGN 193109 allein (Kästchen), AGN 193109 in Kombination mit AGN 191183 mit 10–10 M (Rauten) und AGN 193109 in Kombination mit AGN 191183 mit 10–9 M.
  • 15 ist ein Liniendiagramm, das zeigt, daß ECE16-1-Zellen als Reaktion auf EGF (gefüllte Kästchen), aber nicht als Reaktion auf definiertes Medium allein (leere Kreise) wuchsen. Mit AGN 193109 allein behandelte Zellen werden durch die ausgefüllten Dreiecke dargestellt. Die ausgefüllten Kreise stellen Ergebnisse dar, die für Zellen erhalten wurden, die mit 10 nM AGN 191183 und 0–1000 nM AGN 193109 behandelt wurden.
  • 16 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von AGN 193109 allein auf die Proliferation von CaSki-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit der AGN 191183-Retinoidagonisten zeigen. Alle Probengruppen erhielten 20 ng/ml von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) mit Ausnahme der im definierten Medium (DM) allein vermehrten Probe (leere Balken). Gestreifte Balken stellen Proben dar, die in Abwesenheit von AGN 193109 vermehrt wurden. Ausgefüllte Balken stellen Proben dar, die in Gegenwart von 1000 nM AGN 193109 vermehrt wurden. Die im Verfahren verwendeten Konzentrationen von AGN 191183 sind auf der horizontalen Achse gezeigt.
  • 17 ist eine Dosis-Reaktions-Kurve, die zeigt, daß AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von ATRA auf Netzhautpigmentepithel-(RPE)-Zellen potenzierte. Mit ATRA allein behandelte Proben sind durch ausgefüllte Kästchen dargestellt. Mit der Kombination aus ATRA und AGN 193109 (10–7 M) behandelte Proben sind durch ausgefüllte Kreise dargestellt. Die zur Behandlung der verschiedenen Proben verwendete ATRA-Konzentration ist auf der horizontalen Achse angegeben.
  • 18 ist eine Dosis-Reaktions-Kurve, die zeigt, daß sowohl 13-cis-RA als auch ATRA das RPE-Zellwachstum hemmten, und daß AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von 13-cis-RA potenzierte. Die in der Dosisreaktion gezeigten verschiedenen Probenbehandlungen schlossen 13-cis-RA allein (gefüllte Kästchen), 13-cis-RA in Kombination mit AGN 193109 (10–6 M) (gefüllte Kreise), 13-cis-RA in Kombination mit AGN 193109 (10–8 M) (gefüllte Dreiecke) und ATRA (gefüllte Rauten) ein. Die in den Probenbehandlungen verwendeten Konzentrationen von 13-cis-RA und ATRA sind auf der horizontalen Achse gezeigt.
  • 19 ist eine Dosis-Reaktions-Kurve, die zeigt, daß AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Dexamethason in primären RPE-Zellkulturen potenzierte. Die in der Dosisreaktion gezeigten verschiedenen Probenbehandlungen schlossen ATRA (gefüllte Kästchen), Dexamethason allein (gefüllte Kreise), Dexamethason in Kombination mit AGN 193109 (10–8 M) (gefüllte Dreiecke) und Dexamethason in Kombination mit AGN 193109 (10–6 M) (gefüllte Rauten) ein. Die in den Probenbehandlungen verwendeten Konzentrationen von Dexamethason und ATRA sind auf der horizontalen Achse gezeigt.
  • 20 ist eine Dosis-Reaktions-Kurve, die zeigt, daß AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Schilddrüsenhormon (T3) in primären RPE-Zellkulturen potenzierte. Die in der Dosisreaktion gezeigten verschiedenen Probenbehandlungen schlossen ATRA (gefüllte Kästchen), T3 allein (gefüllte Kreise), T3 in Kombination mit AGN 193109 (10–8 M) (gefüllte Dreiecke) und T3 in Kombination mit AGN 193109 (10–6 M) (gefüllte Rauten) ein. Die in den Probenbehandlungen verwendeten Konzentrationen von T3 und ATRA sind auf der horizontalen Achse gezeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein RAR-Antagonist als eine Chemikalie definiert, die an einen oder mehrere der RAR-Untertypen mit einem Kd-wert von weniger als 1 mikromolar (Kd < 1 μM) bindet, die aber keine signifikante Transkriptionsaktivierung der durch den RAR-Untertypen regulierten Gene in einem Rezeptor-Kotransfektionstest verursacht. Herkömmlich sind Antagonisten chemische Mittel, die die Aktivitäten von Agonisten hemmen. Daher wird die Aktivität eines Rezeptorantagonisten herkömmlich aufgrund seiner Fähigkeit zur Inhibierung der Aktivität eines Agonisten gemessen.
  • Ein RAR-Agonist wird als eine Chemikalie definiert, die an einen oder mehrere RAR-Rezeptoruntertypen mit einem Kd-Wert von weniger als 1 mikromolar (Kd < 1 μM) bindet und Transkriptionsaktivierung der durch den RAR-Untertyp regulierten Gene in einem Rezeptor-Kotransfektionstest verursacht. Der Begriff "RAR-Agonist" schließt Chemikalien ein, die andere Rezeptoren zusätzlich zu RARs binden oder aktivieren können, z.B. RXR-Rezeptoren.
  • Wie hier verwendet, ist ein negatives Hormon oder ein inverser Agonist ein Ligand für einen Rezeptor, der den Rezeptor veranlaßt, einen inaktiven Zustand relativ zu einem Basiszustand anzunehmen, der in Abwesenheit jedes Liganden auftritt. Während daher ein Antagonist die Aktivität eines Agonisten hemmen kann, ist ein negatives Hormon ein Ligand, der die Konformation des Rezeptors in Abwesenheit eines Agonisten verändern kann. Das Konzept eines negativen Hormons oder inversen Agonisten wurde von Bond et al. untersucht, Nature 374: 272 (1995). Insbesondere schlugen Bond et al. vor, daß unkomplexierter β2-Adrenozeptor in einem Gleichgewicht zwischen einer inaktiven Konformation und einer spontan aktiven Konformation existiert. Es wird vorgeschlagen, daß Agonisten den Rezeptor in einer aktiven Konformation stabilisieren. Umgekehrt wird angenommen, daß inverse Agonisten eine inaktive Rezeptorkonformation stabilisieren. Während daher ein Antagonist seine Aktivität aufgrund der Hemmung eines Agonisten zeigt, kann ein negatives Hormon zusätzlich seine Aktivität in Abwesenheit eines Agonisten durch Hemmung der spontanen Umwandlung eines unkomplexierten Rezeptors zu einer aktiven Konformation zeigen. Nur eine Untergruppe von Antagonisten wird als negative Hormone wirken. Wie hier offenbart wird, ist AGN 193109 sowohl ein Antagonist als auch ein negatives Hormon. Bis heute wurde nicht gezeigt, daß andere Retinoide negative Hormonaktivität besitzen.
  • Wie hier verwendet, bezeichnet die Koverabreichung (gleichzeitige Verabreichung) von zwei pharmakologisch wirksamen Verbindungen die Übertragung von zwei getrennten chemischen Einheiten, ob in vitro oder in vivo. Die Koverabreichung bezeichnet die gleichzeitige Übertragung von getrennten Mitteln; die gleichzeitige Übertragung einer Mischung von Mitteln; sowie die Übertragung eines Mittels gefolgt von Übertragung des zweiten Mittels. In allen Fällen sollen Mittel, die koverabreicht werden, in Verbindung miteinander wirken.
  • Der Begriff Alkyl bezeichnet und umfaßt jede und alle Gruppen, die als normales Alkyl, verzweigtkettiges Alkyl und Cycloalkyl bekannt sind. Der Begriff Alkenyl bezeichnet und umfaßt normale Alkenyl-, verzweigtkettige Alkenyl- und Cycloalkenyl-Gruppen mit einem oder mehreren Orten der Ungesättigtheit. In ähnlicher Weise bezeichnet der Begriff Alkinyl und umfaßt normale Alkinyl- und verzweigtkettige Alkinyl-Gruppen mit einer oder mehreren Dreifachbindungen.
  • Niederalkyl bezeichnet die oben definierte breite Definition von Alkyl-Gruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffen im Fall von normalem Niederalkyl und nach Bedarf 3 bis 6 Kohlenstoffen für niedere verzweigtkettige und Cycloalkyl-Gruppen. Niederalkenyl wird in ähnlicher Weise mit 2 bis 6 Kohlenstoffen für normale Niederalkenyl-Gruppen und 3 bis 6 Kohlenstoffen für verzweigtkettige und Cycloniederalkenyl-Gruppen definiert. Niederalkinyl wird ebenfalls in ähnlicher Weise mit 2 bis 6 Kohlenstoffen für normale Niederalkinyl- Gruppen und 4 bis 6 Kohlenstoffen für verzweigtkettige Niederalkinyl-Gruppen definiert.
  • Der Begriff "Ester", wie hier verwendet, bezeichnet und umfaßt jede Verbindung, die in die Definition dieses Begriffes fällt, wie er klassisch in der organischen Chemie verwendet wird. Er schließt organische und anorganische Ester ein.
  • Wenn in dieser Anmeldung nichts anderes angegeben ist, stammen bevorzugte Ester aus den gesättigten aliphatischen Alkoholen oder Säuren mit 10 oder weniger Kohlenstoffatomen oder den cyclischen oder gesättigten aliphatischen cyclischen Alkoholen und Säuren mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugte aliphatische Ester sind diejenigen, die aus Niederalkylsäuren und -alkoholen stammen. Ebenfalls bevorzugt sind die Phenyl- oder Niederalkylphenylester.
  • Amid hat die Bedeutung, die diesem Begriff in der organischen Chemie klassisch zugewiesen wird. In diesem Fall schließt er die unsubstituierten Amide und alle aliphatischen und aromatischen mono- und disubstituierten Amide ein. Wenn in dieser Anmeldung nichts anderes angegeben ist, sind bevorzugte Amide die mono- und disubstituierten Amide, die aus den gesättigten aliphatischen Resten mit 10 oder weniger Kohlenstoffatomen oder den cyclischen oder gesättigten aliphatisch-cyclischen Resten mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen stammen. Besonders bevorzugte Amide sind diejenigen, die aus substituierten und unsubstituierten Niederalkylaminen stammen. Ebenfalls bevorzugt sind mono- und disubstituierte Amide, die aus den substituierten und unsubstituierten Phenyl- oder Niederalkylphenylaminen stammen. Unsubstituierte Amide sind ebenfalls bevorzugt.
  • Acetale und Ketale schließen die Reste der Formel -CK ein, worin K (-OR)2 ist. Hier ist R Niederalkyl. Ebenfalls kann K -OR7O- sein, worin R7 Niederalkyl mit 2–5 Kohlenstoffatomen ist, geradkettig oder verzweigt.
  • Ein pharmazeutisch akzeptables Salz kann für beliebige Verbindungen in dieser Verbindung mit einer Funktionalität hergestellt werden, die ein Salz bilden kann, zum Beispiel mit einer Säurefunktionalität. Ein pharmazeutisch akzeptables Salz ist jedes Salz, das die Aktivität der Stammverbindung beibehält und keine nachteilige oder ungünstige Wirkung auf den Patienten, an den es verabreicht wird, und im Zusammenhang ausübt, in dem es verabreicht wird.
  • Pharmazeutisch akzeptable Salze können aus organischen oder anorganischen Basen stammen. Das Salz kann ein ein- oder mehrwertiges Ion sein. von besonderem Interesse sind die anorganischen Ionen Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium. Organische Salze können mit Aminen hergestellt werden, insbesondere Ammoniumsalze, wie z.B. Mono-, Di- und Trialkylamine oder Ethanolamine. Salze können ebenfalls mit Coffein, Tromethamin und ähnlichen Molekülen gebildet werden. wenn es einen Stickstoff gibt, der ausreichend basisch ist, um Säureadditionssalze bilden zu können, dann können solche mit beliebigen anorganischen oder organischen Säuren oder einem Alkylierungsmittel wie Methyliodid gebildet werden. Bevorzugte Salze sind diejenigen, die mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure gebildet werden. Jede einer Anzahl von einfachen organischen Säuren, wie Mono-, Di- oder Trisäure, kann ebenfalls verwendet werden.
  • Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können trans- und cis-Isomere (E und Z) aufweisen. Zusätzlich können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere chirale Zentren enthalten und können deshalb in enantiomeren und diastereomeren Formen existieren. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll alle solche Isomere als solche sowie Mischungen aus cis- und trans-Isomeren, Mischungen aus Diastereomeren sowie racemische Mischungen aus Enantiomeren (optische Isomere) umfassen. In der vorliegenden Anmeldung ist eine Mischung solcher Isomere oder eines der Isomere beabsichtigt, wenn keine spezifische Erwähnung der Konfiguration (cis, trans oder R oder S) einer Verbindung (oder eines asymmetrischen Kohlenstoffs) erfolgt.
  • Aryl-substituierte Benzopyran-Derivate mit Retinoidantagonist-artiger biologischer Aktivität
  • Die an den aromatischen Teil der Benzopyran-Einheit der Verbindungen der Formel (1) gebundene R2-Gruppe ist bevorzugt H, F oder CF3. R3 ist bevorzugt Wasserstoff oder Methyl, noch mehr bevorzugt Wasserstoff.
  • Die vorliegend am meisten bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 1A unter Bezugnahme auf Formel 5c gezeigt.
  • Figure 00210001
    Formel 5c
  • Tabelle 1A
    Figure 00210002
  • Biologische Aktivität, Verabreichungsmodi
  • Wie oben festgestellt wurde, sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Antagonisten für einen oder mehrere RAR-Rezeptoruntertypen. Dies bedeutet, daß die Verbindungen der Erfindung an einen oder mehrere RAR-Rezeptoruntertypen binden, aber nicht die Reaktion auslösen, die durch Agonisten der gleichen Rezeptoren ausgelöst wird. Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Antagonisten für alle drei RAR-Rezeptoruntertypen (RAR-α, RAR-β und RAR-γ), und diese werden als "RAR-Panantagonisten" bezeichnet. Einige andere sind Antagonisten für nur einen oder zwei der RAR-Rezeptoruntertypen. Einige Verbindungen im Umfang der vorliegenden Erfindung sind partielle Agonisten für einen oder zwei RAR-Rezeptoruntertypen und Antagonisten für die verbleibenden Untertypen. Die Verbindungen der Erfindung binden nicht an RXR-Rezeptoren und sind deshalb weder Agonisten noch Antagonisten für RXR.
  • Abhängig vom Ort und der Natur der ungewünschten Nebenwirkungen, die unterdrückt oder gelindert werden sollen, können in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendete Verbindungen Antagonisten für nur einen oder zwei der RAR-Rezeptoruntertypen sein. Einige in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendete Verbindungen können partielle Agonisten für einen oder zwei RAR-Rezeptoruntertypen und Antagonisten für die verbleibenden Untertypen sein. Solche Verbindungen sind allgemein gesprochen in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendbar, falls die antagonistische Wirkung auf denjenigen RAR-Rezeptoruntertyp (oder die Untertypen) besteht, der (die) hauptsächlich verantwortlich für die Überdosisvergiftung oder für die ungewünschte Nebenwirkung oder Nebenwirkungen ist (sind). In diesem Zusammenhang wird festgestellt, daß allgemein gesprochen eine Verbindung als Antagonist für einen gegebenen Rezeptoruntertyp betrachtet wird, falls die Verbindung in den nachfolgend beschriebenen Kotransfektionstests keine signifikante Transkriptionsaktivierung des Rezeptor-regulierten Reportergens verursacht, aber dennoch an den Rezeptor mit einem Kd-Wert von weniger als ca. 1 μM bindet.
  • Ob eine Verbindung ein RAR-Antagonist ist und deshalb in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann in den folgenden Tests untersucht werden.
  • Ein chimärer Transaktivierungstest, der auf Agonist-artige Aktivität in den RAR-α-, RAR-β-, RAR-γ- und RXR-α-Rezeptoruntertypen untersucht, und der auf der von P. L. Feigner und M. Holm veröffentlichten Arbeit beruht, Focus Band 11, Nr. 2 (1989), wird im Detail in WO 94/17796 beschrieben, veröffentlicht am 18. August 1994. Letztere Veröffentlichung ist das PCT-Gegenstück der US-Anmeldung Nr. 08/016,404, eingereicht am 11. Februar 1993, die als US-PS 5,455,265 erteilt wurde. Eine Verbindung sollte keine signifikante Aktivierung eines Reportergens durch einen gegebenen Rezeptoruntertyp (RAR-α, RAR-β oder RAR-γ) in diesem Test verursachen, um sich als RAR-Antagonist mit Nutzen in der vorliegenden Erfindung zu qualifizieren.
  • Ein Holorezeptor-Transaktivierungstest und ein Ligandenbindungstest, die die Antagonist/Agonist-artige Aktivität der Verbindungen der Erfindung bzw. ihre Fähigkeit zur Bindung an die verschiedenen Retinoidrezeptoruntertypen messen, werden in WO 93/11755 (insbesondere auf den Seiten 30–33 und 37–41) beschrieben, veröffentlicht am 24. Juni 1993. Eine Beschreibung des Holorezeptor-Transaktivierungstests wird ebenfalls nachfolgend bereitgestellt.
  • Holorezeptor-Transaktivierungstest
  • CV1-Zellen (5000 Zellen/Vertiefung) wurden mit einem RAR-Reporterplasmid MTV-TREp-LUC (50 ng) neben einem der RAR-Expressionsvektoren (10 ng) in einem automatisierten Format mit 96 Vertiefungen durch das Calciumphosphat-Verfahren von Heyman et al. transfiziert, Cell 68: 397–406. Für RXR-α- und RXR-γ-Transaktivierungstests wurde ein RXR-reaktives Reporterplasmid CRBPII-tk-LUC (50 ng) neben den entsprechenden RXR-Expressionsvektoren (10 ng) im wesentlichen wie von Heyman et al. (siehe oben s.o.) und Allegretto et al. beschrieben verwendet, J. Biol. Chem. 268: 26625–26633. Für RXR-β-Transaktivierungstests wurde ein RXR-reaktives Reporterplasmid CPRE-tk-LUC (50 mg) neben RXR-β-Expressionsvektor (10 mg) wie oben beschrieben verwendet. Diese Reporter enthalten DRI-Elemente aus humanem CRBPII bzw. bestimmte DRI-Elemente aus Promotor (siehe Mangelsdorf et al., The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, S. 319–349, Raven Press Ltd., New York, und Heyman et al., s.o.). Ein β-Galactosidase-Expressionsvektor (50 ng) wurde als interne Kontrolle in den Transfektionen verwendet, um auf Variationen in der Transfektionseffizienz zu normalisieren. Die Zellen wurden in 3-facher Ausführung für 6 Stunden transfiziert, gefolgt von Inkubation mit Retinoiden für 36 Stunden, und die Extrakte wurden auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten getestet. Das ausführliche experimentelle Verfahren für Holorezeptor-Transaktivierungen wurde in Heyman et al. (s.o.) und Allegretto et al. (s.o.) beschrieben. Die in diesem Test erhaltenen Ergebnisse werden als EC50-Werte ausgedrückt, ebenso wie im chimären Rezeptor-Transaktivierungstest. Die Ergebnisse des Ligandenbindungstests werden als Kd-Werte ausgedrückt (siehe Cheng et al., Biochemical Pharmacology 22: 3099–3108).
  • Eine Verbindung sollte keine signifikante Aktivierung eines Reportergens durch einen gegebenen Rezeptoruntertyp (RAR-α, RAR-β oder RAR-γ) im Holorezeptor-Transaktivierungstest verursachen, um sich als RAR-Antagonist mit Nutzen in der vorliegenden Erfindung zu qualifizieren. Letztlich sollte eine Verbindung an wenigstens einen der RAR-Rezeptoruntertypen im Ligandenbindungstest mit einem Kd-Wert von weniger als ca. 1 mikromolar (Kd < 1 μM) binden, um als Antagonist für den gebundenen Rezeptoruntertyp funktionieren zu können, vorausgesetzt der gleiche Rezeptoruntertyp wird nicht signifikant durch die Verbindung aktiviert.
  • Tabelle 5A zeigt die Ergebnisse des Ligandenbindungstests für bestimmte exemplarische Verbindungen der Erfindung.
  • Tabelle 5A Ligandenbindungstest
    Figure 00250001
  • Wie aus den in Tabelle 5A zusammengefaßten Testergebnissen ersichtlich ist, sind die darin angegebenen exemplarischen Verbindungen der Erfindung Antagonisten für die RAR-Rezeptoruntertypen, aber haben keine Affinität für RXR-Rezeptoruntertypen (andere Verbindungen der Erfindung können Antagonisten für einige, aber nicht alle RAR-Rezeptoruntertypen und Agonisten für die verbleibenden RAR-Untertypen sein). Aufgrund dieser Eigenschaft können die Verbindungen der Erfindung zur Blockierung der Aktivität von RAR-Agonisten in biologischen Tests verwendet werden. In Säugetieren, einschließlich Menschen, können die Verbindungen der Erfindung mit RAR-Agonisten koverabreicht werden und mittels der pharmakologischen Selektivität oder ortsspezifischer Übertragung vorzugsweise die ungewünschten Wirkungen von RAR-Agonisten verhindern. Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls zur Behandlung von akuter oder chronischer Vitamin A-Überdosis verwendet werden, die entweder aus der der übermäßigen Einnahme von Vitamin A-Ergänzungsmitteln oder aus dem Verzehr der Leber bestimmter Fische und Tiere resultiert, die hohe Mengen von Vitamin A enthalten. Weiterhin können die Verbindungen der Erfindung ebenfalls zur Behandlung von akuter oder chronischer Toxizität verwendet werden, die durch Retinoidwirkstoffe verursacht wird. Es ist fachbekannt, daß die bei Hypervitaminose A-Syndrom beobachteten Toxizitäten (Kopfschmerz, Hautablösung, Knochentoxizität, Dyslipidämien) ähnlich oder identisch zu Toxizitäten sind, die bei anderen Retinoiden beobachtet werden, was eine gemeinsame biologische Ursache nahelegt, nämlich RAR-Aktivierung. Weil die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die RAR-Aktivierung blockieren, sind sie geeignet zur Behandlung der vorhergehenden Toxizitäten.
  • Die Verbindungen der Erfindung können durch RAR-agonistische Retinoide indizierte Hautreizung im wesentlichen verhindern, wenn die Verbindung der Erfindung topisch auf die Haut koverabreicht wird. In ähnlicher Weise können die Verbindungen der Erfindung topisch auf die Haut verabreicht werden, um Hautreizung bei Patienten oder Tieren zu blockieren, denen RAR-agonistische Verbindungen systemisch verabreicht werden. Die Verbindungen der Erfindung können die Erholung von vorbestehender Retinoidtoxizität beschleunigen, durch koverabreichte Retinoide verursachte Hypertriglyceridämie blockieren und durch einen RAR-Agonisten (Retinoid) induzierte Knochentoxizität blockieren.
  • Allgemein gesprochen können die antagonistischen Verbindungen für therapeutische Anwendungen in Säugetieren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung enteral oder topisch als Gegengift für Vitamin A, Vitamin A-Vorläufer oder Gegengift für Retinoidtoxizität, die aus einer Überdosis oder einem anhaltenden Kontakt resultiert, nachdem die Aufnahme des verursachenden Faktors (Vitamin A-Vorläufer oder anderes Retinoid) abgesetzt wurde, verabreicht werden. Alternativ werden die antagonistischen Verbindungen mit Retinoidwirkstoffen in Übereinstimmung mit der Verbindung in Situationen koverabreicht, in denen das Retinoid einen therapeutischen Nutzen liefert, und wenn der koverabreichte Antagonist eine oder mehrere ungewünschte Nebenwirkungen des Retinoids lindert oder eliminiert. Für diesen Typ der Anwendung kann der Antagonist in einer ortsspezifischen weise verabreicht werden, zum Beispiel als topisch aufgetragene Creme oder Lotion, während das koverabreichte Retinoid enteral gegeben werden kann.
  • Für therapeutische Anwendungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden die antagonistischen Verbindungen in pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet, wie zum Beispiel Tabletten, Pillen, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Cremes, Salbengrundlagen, Gele, Salben, Lotionen und dgl., wobei solche pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und Träger verwendet werden, die als solche fachbekannt sind. Zum Beispiel wird die Herstellung topischer Formulierungen allgemein beschrieben in "Remington's Pharmaceutical Science", Auflage 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Zur topischen Anwendung können die antagonistischen Verbindungen ebenfalls als Puder oder Spray verabreicht werden, insbesondere in Aerosolform. Falls der Wirkstoff systemisch verabreicht werden soll, kann er als Pulver, Pille, Tablette oder dgl. oder als Sirup oder Elixier, das zur oralen Verabreichung geeignet ist, konfektioniert werden. Zur intravenösen oder intraperitonealen Verabreichung wird die antagonistische Verbindung als Lösung oder Suspension zubereitet werden, die durch Injektion verabreicht werden kann. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, die antagonistischen Verbindungen durch Injektion zu formulieren. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, die antagonistischen Verbindungen in Zäpfchenform oder als Formulierung mit verlängerter Freisetzung zur Deponierung unter der Haut oder zur intramuskulären Injektion zu formulieren.
  • Die antagonistischen Verbindungen werden in einer therapeutisch wirksamen Dosis in Übereinstimmung mit der Erfindung verabreicht werden. Eine therapeutische Konzentration wird diejenige Konzentration sein, die eine Reduktion des besonderen Zustands (wie Toxizität aufgrund von Retinoid- oder Vitamin A-Kontakt oder Nebenwirkung von Retinoidwirkstoff) bewirkt oder seine Ausdehnung verlangsamt. Es versteht sich, daß die antagonistischen Verbindungen bei Koverabreichung zur Blockierung der Retinoid-induzierten Toxizität oder Nebenwirkungen in Übereinstimmung mit der Erfindung in einer prophylaktischen Weise verwendet werden, um das Einsetzen eines besonderen Zustands zu verhindern, wie zum Beispiel eine Hautreizung.
  • Eine nützliche therapeutische oder prophylaktische Konzentration wird von Zustand zu Zustand variieren und kann in bestimmten Fällen mit der Schwere des behandelten Zustands und dem Ansprechen des Patienten auf die Behandlung variieren. Entsprechend wird keine einzelne Konzentration einheitlich nützlich sein, sondern wird eine Modifikation in Abhängigkeit von den Einzelheiten der chronischen oder akuten Retinoidtoxizität oder des verwandten behandelten Zustands erfordern. Zu solchen Konzentrationen kann man durch routinemäßiges Experimentieren gelangen. Jedoch wird vorhergesehen, daß eine Formulierung, die zwischen 0,01 und 1,0 mg von antagonistischer Verbindung pro Milliliter Formulierung enthält, eine therapeutisch wirksame Konzentration für die topische Anwendung darstellen wird. Bei systemischer Verabreichung würde man erwarten, daß eine Menge zwischen 0,01 und 5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag ein therapeutisches Ergebnis bewirken würde.
  • Die Basis für den Nutzen von RAR-Antagonist zur Prävention oder Behandlung von RAR-Agonist-induzierter Toxizität ist die kompetitive Hemmung der Aktivität von RAR-Rezeptoren durch RAR-Agonisten. Die Hauptunterscheidung zwischen diesen zwei Anwendungen von RAR-Antagonisten ist die Gegenwart oder Abwesenheit von vorbestehender Retinoidtoxizität. Die meisten der unmittelbar nachfolgend beschriebenen Beispiele betreffen die Verwendung von Retinoiden zur Prävention von Retinoidtoxizität, aber die hier beschriebenen allgemeinen Verfahren sind ebenso auf die Behandlung von vorbestehender Retinoidtoxizität anwendbar.
  • Beschreibung von Experimenten, die die Verwendung von RAR-Antagonisten zur Prävention oder Behandlung von Retinoidtoxizität und/oder Nebenwirkungen von Retinoidwirkstoffen zeigen
  • Beispiel 1: Durch topisch eingesetzten Agonisten induzierte Hautreizung wird mit topisch eingesetztem Antagonisten behandelt
  • Die Verbindung 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalin-2-yl)propen-1-yl]benzoesäure, bezeichnet als AGN 191183, ist im Stand der Technik als wirksamer RAR-Agonist bekannt (siehe zum Beispiel die Beschreibung und 2b aus US-PS 5,324,840). (Die "AGN"-Nummer ist eine zufällig zugeordnete Referenznummer, die durch den betrieblichen Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von Verbindungen verwendet wird).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 192869, ebenfalls als Verbindung 60a bezeichnet) ist eine Verbindung, deren Herstellung nachfolgend beschrieben wird. Diese Verbindung ist ein RAR-Antagonist.
  • Eine durch einen RAR-Agonisten, AGN 191183, topisch verabreicht, induzierte Hautreizung kann durch einen RAR-Antagonisten, AGN 192869, ebenfalls topisch an haarlose Mäuse verabreicht, blockiert werden.
  • Insbesondere wurde die Hautreizung auf einer halbquantitativen Skala durch die tägliche subjektive Auswertung von Hautabblättern und Abrasionen gemessen. Eine einzelne Zahl, die topische Reizungsbewertung, faßt die in einem Tier induzierte Hautreizung im Verlauf eines Experiments zusammen. Die topische Reizungsbewertung wird wie folgt berechnet. Die topische Reizungsbewertung ist die algebraische Summe einer verbunden Abblätterbewertung und einer verbundenen Abrasionsbewertung. Die verbundenen Bewertungen reichen von 0–9 und 0–8 für Abblättern bzw. Abrasionen und berücksichtigen die maximale Schwere, die Zeit des Einsetzens und die beobachtete durchschnittliche Schwere des Abblätterns und der Abrasionen.
  • Die Schwere des Abblätterns wird auf einer Skala mit 5 Punkten bewertet, und die Schwere der Abrasionen wird auf einer Skala mit 4 Punkten bewertet, wobei höhere Bewertungen eine größere Schwere widerspiegeln. Die Komponente der maximalen Schwere der verbundenen Bewertungen wäre die höchste tägliche Schwerebewertung, die einem gegebenen Tier während des Beobachtungsverlaufs zugewiesen wird.
  • Für die Komponente der verbundenen Bewertung für die Zeit des Einsetzens wird eine Bewertung im Bereich von 0 bis 4 wie folgt zugeordnet:
  • Tabelle 6 Zeit bis zum Erscheinen von Abblättern oder Abrasionen der Schwere 2 oder höher
    Figure 00310001
  • Die Komponente der verbundenen Bewertung der durchschnittlichen Schwere ist die Summe der Bewertungen von täglichem Abblättern oder Abrasion geteilt durch die Anzahl von Beobachtungstagen. Der erste Behandlungstag wird nicht gezählt, da die Wirkstoffverbindung noch keine Möglichkeit hatte, zur Zeit der ersten Behandlung zu wirken.
  • Zur Berechnung der verbundenen Abblätter- und Abrasionsbewertungen werden die Bewertungen der durchschnittlichen Schwere und der Zeit des Einsetzens summiert und durch 2 geteilt. Das Ergebnis wird zur Bewertung der maximalen Schwere addiert. Die verbundenen Abblätter- und Abrasionsbewertungen werden dann summiert, um die gesamte topische Reizungsbewertung zu ergeben. Jedes Tier erhält eine topische Reizungsbewertung, und die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung der individuellen Bewertungen einer Gruppe von Tieren ausgedrückt. Werte werden zur nächsten ganzen Zahl gerundet.
  • Weibliche haarlose Mäuse [Crl:SKH1-hrBR] (8–12 Wochen alt, n = 6) wurden topisch für 5 aufeinanderfolgende Tage mit Aceton, AGN 191183, AGN 192869 oder einer Kombination aus AGN 192869 und 191183 behandelt. Die Dosen der jeweiligen Verbindungen sind in Tabelle 7 angegeben. Die Behandlungen werden auf die Rückenhaut in einem Gesamtvolumen von 4 ml/kg (~0,1 ml) aufgetragen. Die Mäuse wurden täglich beobachtet und auf Abblättern und Abrasionen bis zu und einschließlich 3 Tage nach der letzten Behandlung, d.h. Tag 8, bewertet.
  • Tabelle 7 Experimenteller Aufbau und Ergebnisse, Beispiel 1
    Figure 00320001
  • Die topischen Reizungsbewertungen für Beispiel 1 sind in Tabelle 7 angegeben. Weder Aceton (Träger) noch AGN 192869 (Antagonist) bei einer Dosis von 1,5 mg/kg/d (Gruppe F) verursachte eine beobachtbare topische Reizung. AGN 191183, der RAR-Agonist, verursachte eine mäßige topische Reizung bei einer Dosis von 0,025 mg/kg/d. Jedoch wurde die durch AGN 191183 induzierte topische Reizung in einer dosisabhängigen Weise durch AGN 192869 gehemmt, mit einer beinahe vollständigen Aufhebung der Reizung in Gegenwart eines 50-fachen molaren Überschusses von AGN 192869. Dies zeigt, daß ein topischer RAR-Antagonist die durch einen topischen RAR-Agonisten verursachte Hautreizung blockiert. Eine vollständige Blockade von durch RAR-Agonist induzierter Hautreizung kann mit geringeren Molverhältnissen von Antagonist zu Agonist erreicht werden, wenn der RAR-Agonist wirksamer ist, wie zum Beispiel die Verbindung 4-[(5,6- Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, ebenfalls in dieser Anmeldung als Verbindung 60 bezeichnet).
  • Beispiel 2: Durch oral eingesetzten Agonisten induzierte Hautreizung wird mit topisch eingesetztem Antagonisten blockiert
  • Der wirksame RAR-Agonist AGN 191183 (4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalin-2-yl)propen-1-yl]benzoesäure) und der wirksame RAR-Antagonist 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, Verbindung 60) wurden in diesem Beispiel verwendet, und das Körpergewicht der Versuchstiere (Mäuse) wurde als Marker des systemischen RAR-Agonistkontakts verwendet.
  • Gruppen von weiblichen haarlosen Mäusen (8–12 Wochen alt, n = 6) wurden durch intragastrale Intubation mit Maisöl oder AGN 191183 (0,26 mg/kg), suspendiert in Maisöl (5 ml/kg), behandelt. Die Mäuse wurden gleichzeitig auf der Rückenhaut mit Träger (97,6% Aceton/2,4% Dimethylsulfoxid) oder Lösungen von AGN 193109 in Träger (6 ml/kg) topisch behandelt. Spezifische Dosen für die unterschiedlichen Behandlungsgruppen sind in Tabelle 8 angegeben. Die Behandlungen wurden täglich für 4 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die Mäuse wurden gewogen und auf topische Reizung täglich wie in Beispiel 1 beschrieben bis zu und einschließlich 1 Tag nach der letzten Behandlung bewertet. Die prozentuale Körpergewichtsveränderung wird durch Subtrahieren des Körperendgewichts (Tag 5) vom Körperanfangsgewicht (Tag 1), Dividieren durch das Körperanfangsgewicht und Multiplizieren mit 100% berechnet. Topische Reizungsbewertungen werden wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet.
  • Topische Reizungsbewertungen und Gewichtsverlust für die unterschiedlichen Gruppen sind in Tabelle 8 angegeben. Kombinierte Behandlung mit den topischen und oralen Trägern, d.h. Aceton bzw. Maisöl, verursachte keine topische Reizung oder Gewichtsverlust. In ähnlicher Weise führte die kombinierte Behandlung mit dem oralen Träger und dem topischen Antagonisten AGN 193109 zu keiner topischen Reizung oder Gewichtsverlust. Orales AGN 191183 als solches induzierte einen substantiellen Gewichtsverlust und substantielle Hautreizung. Durch AGN 191183 induzierte Hautreizung wurde wesentlich reduziert bei Kombination mit der niedrigeren Dosis von AGN 193109 und vollständig blockiert bei der höheren Dosis von AGN 193109. Durch AGN 191183 induzierter Gewichtsverlust wurde ebenfalls in einer dosisabhängigen Weise durch topisches AGN 193109 blockiert, aber die Blockade war nicht vollständig. Daher blockiert topisches AGN 193109 vorzugsweise die dermale Toxizität von AGN 191183. Vermutlich wurden geringe Mengen von AGN 193109 systemisch absorbiert und blockierten somit partiell den durch AGN 191183 induzierten Gewichtsverlust. Jedoch wäre eine solche Absorption wahrscheinlich noch geringer in einer Art mit weniger durchlässiger Haut, wie zum Beispiel Menschen. Alternativ könnte die Inhibierung der Gewichtsverlusts durch AGN 193109 auf der Linderung der durch AGN 191183 induzierten Hautreizung beruhen.
  • Tabelle 8 Experimenteller Aufbau und Ergebnisse, Beispiel 2
    Figure 00350001
  • Somit zeigt Beispiel 2, daß topisch verabreichte RAR-Antagonisten zur vorzugsweisen Blockierung der Hautreizung verwendet werden können, die durch einen oral verabreichten RAR-Agonisten induziert wird.
  • Beispiel 3: Topisch eingesetzter Antagonist beschleunigt die Erholung von vorbestehender Retinoidtoxizität
  • In diesem Beispiel wird Gewichtsverlust durch topische Behandlung mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 induziert, und dann werden die Versuchstiere topisch mit entweder Träger oder dem RAR-Antagonisten AGN 193109 behandelt.
  • Weibliche haarlose Mäuse (8–12 Wochen alt, n = 5) wurden topisch mit AGN 191183 (0,13 mg/kg/d) in Träger (97,6% Aceton/2,4% DMSO, 4 ml/kg) täglich für 2 Tage behandelt. Gruppen der gleichen Mäuse (n = 5) wurden dann topisch entweder mit Träger oder AGN 193109 in Träger (4 ml/kg) täglich für 3 aufeinanderfolgende Tage, beginnend am Tag 3, behandelt. Die Mäuse wurden an den Tagen 1–5 und am Tag 8 gewogen. Die Körpergewichte werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Mittelwerte wurden statistisch unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests verglichen. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als signifikant betrachtet.
  • Tabelle 9 Ergebnisse, Beispiel 3
    Figure 00360001
  • Der Zeitverlauf der Körpergewichte in Beispiel 3 ist in Tabelle 9 angegeben. Körpergewichte beider Gruppen von Mäusen waren parallel an den Tagen 2 und 3 als Ergebnis der Behandlung mit AGN 191183 an den Tagen 1 und 2 verringert. Körpergewichte in den zwei Gruppen waren nicht signifikant unterschiedlich an den Tagen 1, 2 oder 3. Jedoch erhöhte die Behandlung mit AGN 193109 signifikant das Körpergewicht relativ zur Behandlung mit Träger an den Tagen 4 und 5. Diese Daten zeigten, daß die Erholung von durch AGN 191183 induziertem Körpergewichtsverlust durch anschließende Behandlung mit AGN 193109 beschleunigt wurde. Körpergewichte waren nicht signifikant unterschiedlich zwischen den zwei Gruppen von Mäusen am Tag 8, was zeigt, daß eine vollständige Erholung in beiden Gruppen erreichbar war, vorausgesetzt ausreichend Zeit wurde zugestanden. Somit sind RAR-Antagonisten wirksam in der Linderung von durch RAR-Agonisten induzierter Toxizität, selbst falls die durch RAR-Agonist induzierte Toxizität der Behandlung mit RAR-Antagonist vorangeht, d.h. im Vergiftungsszenario mit RAR-Agonist.
  • Beispiel 4: Oral eingesetzter Antagonist blockiert durch oral koverabreichten Retinoidagonisten induzierte Hypertriglyceridämie
  • 5-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphthalin-2-yl)propen-1-yl]-2-thiophencarbonsäure ist ein bekannter RAR/RXR-Panagonist (siehe US-PS 5,324,840, Spalte 32) und wird als AGN 191659 bezeichnet. Diese Verbindung wurde oral verwendet, um akute Hypertriglyceridämie in Ratten zu induzieren, und AGN 193109 (Verbindung 60) wurde oral koverabreicht, um die durch AGN 191659 induzierte Hypertriglyceridämie zu blockieren.
  • Männliche Fischer-Ratten (6–7 Wochen alt, n = 5) wurden durch intragastrale Intubation mit Maisöl (Träger), AGN 191659, AGN 193109 oder einer Kombination aus AGN 191659 und AGN 193109 behandelt. AGN 191659 und AGN 193109 wurden als feine Suspensionen in Maisöl gegeben. Der experimentelle Aufbau, einschließlich der Dosen, wird in Tabelle 10 angegeben.
  • Blut wurde aus der unteren Hohlvene unter Narkose mit Kohlendioxid entnommen. Serum wurde vom Blut durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit abgetrennt. Gesamtserumtriglyceride (Triglyceride plus Glycerin) wurden mit einem standardmäßigen spektrophotometrischen Endpunkttest gemessen, der als Kit kommerziell erhältlich ist und an ein Plattenformat mit 96 Vertiefungen angepaßt wurde. Serumtriglyceridspiegel werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Mittelwerte wurden statistisch durch einfache Variansanalyse gefolgt vom Dunnett-Test verglichen, falls signifikante Unterschiede festgestellt wurden. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als signifikant betrachtet.
  • Wie in Tabelle 10 gezeigt wird, verursacht AGN 191659 selbst eine signifikante Anhebung von Serumtriglyceriden relativ zur Behandlung mit Träger. AGN 193109 selbst erhöhte Serumtriglyceride nicht signifikant. Bedeutend ist, daß die Kombination aus AGN 193109 und AGN 191659 bei Molverhältnissen von 1:1 und 5:1 Serumtriglyceride auf Spiegel reduzierte, die nicht signifikant unterschiedlich von der Kontrolle waren.
  • Tabelle 10 Experimenteller Aufbau und Ergebnisse, Beispiel 4
    Figure 00380001
  • Beispiel 4 zeigt, daß ein RAR-Antagonist zur Blockierung von Hypertriglyceridämie verwendet werden kann, die durch ein koverabreichtes Retinoid induziert wird.
  • Beispiel 5: Parenteral eingesetzter Antagonist blockiert durch parenteral koverabreichten Retinoidagonisten induzierte Knochentoxizität
  • Beispiel 5 zeigt, daß RAR-Antagonisten die durch einen RAR-Agonisten induzierte Knochentoxizität blockieren können. In diesem Beispiel wird AGN 193109 verwendet, um einen durch einen koverabreichten RAR-Agonisten, AGN 191183, in Meerschweinchen verursachten vorzeitigen Epiphysenschluß zu blockieren.
  • Gruppen von männlichen Hartley-Meerschweinchen (~3 Wochen alt, n = 4) wurden intraperitoneal osmotische Pumpen implantiert, die Träger (20% Dimethylsulfoxid, 80% Polyethylenglykol-300), AGN 191183 (0,06 mg/ml) oder AGN 191183 (0,06 mg/ml) in Kombination mit AGN 193109 (0,34 mg/ml) enthielten. Die osmotischen Pumpen werden vom Hersteller konstruiert, um ca. 5 μl Lösung pro Stunde kontinuierlich für 14 Tage zu übertragen.
  • Die Tiere wurden durch Einatmen von Kohlendioxid 14 Tage nach der Implantation getötet. Das linke Schienbein wurde entfernt und in 10%iges gepuffertes Formalin gegeben. Die Schienbeine wurden durch Kontakt mit einer Ameisensäure/Formalin-Lösung für 3–4 Tage entkalkt, und Paraffinschnitte wurden präpariert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin durch Standardverfahren angefärbt. Die proximale Epiphysenplatte des Schienbeins wurde untersucht und als geschlossen oder nicht geschlossen bewertet. Epiphysenschluß wird für diesen Zweck als jede Unterbrechung der Kontinuität des Knorpels der Epiphysenwachstumsplatte definiert, d.h. Austausch durch Knochen und/oder Fibroblastengewebe.
  • Keines der vier mit Träger behandelten Meerschweinchen zeigte einen Epiphysenschluß am Ende des Experiments. Dies war erwartet, da die proximale Epiphysenplatte des Meerschweinchen-Schienbeins sich normalerweise nicht schließt, bis die Tiere wenigstens 10 Monate alt sind. Alle vier der mit AGN 191183 behandelten Meerschweinchen zeigten einen partiellen oder vollständigen Epiphysenschluß. Jedoch zeigte keines der mit der Kombination aus AGN 191183 und AGN 193109 behandelten Meerschweinchen einen Epiphysenschluß. Deshalb blockiert AGN 193109 bei einem 5-fachen molaren Überschuß vollständig die durch AGN 191183 induzierte Knochentoxizität, wenn diese Verbindungen parenteral koverabreicht wurden.
  • RAR-antagonistische Verbindungen
  • Die Verbindungen 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, Verbindung 60) und 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 192869, Verbindung 60a) sind Referenzbeispiele für RAR-Antagonisten, die in den oben beschriebenen Tierversuchen zur Blockierung von RAR-Rezeptoren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.
  • Syntheseverfahren – Aryl-substituierte Verbindungen
  • Die exemplarischen RAR-antagonistischen Verbindungen der Formel (1) können durch die hier veranschaulichten chemischen Synthesereaktionen hergestellt werden. Der Synthesechemiker wird leicht einsehen, daß die hier dargestellten Bedingungen spezifische Ausführungsformen sind, die für jede und alle durch Formel (1) dargestellten Verbindungen verallgemeinert werden können.
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • (a) MeMgCl/THF/dann H2SO4/H2O/100°C (100%); (b) CH3COCl/AlCl3/CH2Cl2 (54%); (c) NaOCl/NaOH/Dioxan/65°C dann EtOH/H2SO4/Δ (100%); (d) Br2/HOAc (100%); (e) CrO3/HOAc/Ac2O (76%); (f) p-Tolyl-MgBr/THF dann p-TsOH·H2O/Toluol/Δ (25%); (g) NaOH/EtOH/H2O (98%); (h) EDC/DMAP/DMF/2-F-4-H2NC5H3CO2Et (21,63%) oder 2,6-Difluor-4-H2NC6H2CO2Et (22,33%); (i) NaOH/EtOH/H2O (4,86%; 5,70%).
  • Reaktionsschema 6B
  • Reaktionsschema 6B offenbart einen Syntheseweg zu spezifischen bevorzugten Benzopyran-(Chromen)-Verbindungen der Erfindung, worin unter Bezugnahme auf Formel (1) die Z-Gruppe auch CONH ist (Amid-Derivate). In Übereinstimmung mit diesem Schema wird Dihydrocumarin (Verbindung 213) einer Grignard-Reaktion mit Methylmagnesiumchlorid unterworfen, gefolgt von Erwärmen einer tertiären Alkoholzwischenstufe mit Säure, um 2,2-Dimethylchroman (Verbindung 214) zu liefern. Verbindung 214 wird zu 6-Acetyl-2,2-dimethylchroman (Verbindung 215) in einer Friedel-Crafts-Reaktion umgewandelt, und letzteres wird mit NaOCl in Gegenwart von Natriumhydroxid oxidiert und danach verestert, um Ethyl-2,2-dimethylchroman-6-carboxylat (Verbindung 216) zu ergeben. Verbindung 216 wird mit Brom in Eisessig behandelt, um Ethyl-8-brom-2,2-dimethylchroman-6-carboxylat (Verbindung 217) zu ergeben. Verbindung 217 wird mit Chromtrioxid zur Bildung einer Ketonfunktion in der 4-Position des Chromanrings oxidiert und liefert Ethyl-8-brom-2,2-dimethyl-4-chromanon-6-carboxylat (Verbindung 218). Reaktion von Verbindung 218 mit dem aus 4-Bromtoluol hergestellten Grignard-Reagens und anschließendes Erwärmen mit p-TSOH zur Vervollständigung der Dehydratisierung des intermediären tertiären Alkohols liefert Ethyl-8-Brom-2,2-dimethyl-4-tolyl-4(2H)-chroman-6-carboxylat (Verbindung 219). Verseifung von Verbindung 219 mit Base ergibt die entsprechende freie Carbonsäure, 8-Brom-2,2-dimethyl-4-tolyl-4(2H)-chroman-6-carbonsäure (Verbindung 220). Verbindung 220 wird mit Ethyl-2-fluor-4-aminobenzoat und Ethyl-2,6-difluor-4-aminobenzoat in Gegenwart von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) kondensiert, um Ethyl-2-fluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-tolyl-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 221) bzw. Ethyl-2,6-difluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-tolyl-6-chromanyl)carbonyl)amino]benzoat (Verbindung 222) zu liefern. Verseifung von Verbindungen 221 und 222 liefert die entsprechenden freien Carbonsäuren, 2-Fluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-tolyl-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoesäure (Verbindung 204) bzw. 2,6-Difluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-tolyl-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoesäure (Verbindung 205).
  • Spezifische Beispiele
  • 2,2-Dimethylchroman (Verbindung 214)
  • Zu einer Lösung aus Dihydrocumarin (Verbindung 213, 5,0 g, 33,78 mmol) in trockenem THF (50 ml) bei 0°C wurde Methylmagnesiumchlorid (33,7 ml, 3 M Lösung in THF, 0,1 mol) getropft. Die Reaktionsmischung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Extraktion (Et2O), Trocknen (Na2SO4) und Aufkonzentrieren unter reduziertem Druck lieferte ein Diol (6,25 g) als farblosen Feststoff. Das Diol wurde mit 15%igem wäßrigem H2SO4 (50 ml) in Benzol (15 ml) kombiniert und die resultierende Mischung für 2 Stunden auf 105°C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung mit Et2O extrahiert, getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck auf konzentriert, um 6,0 g (100%) der Titelverbindung als hellgelbe Flüssigkeit zu ergeben.
    1H-NMR δ: 7,08 (2H, m), 6,80 (2H, m), 2,79 (2H, t, J = 6,8 Hz), 1,81 (2H, t, J = 6,8 Hz), 1,35 (6H, s).
  • 6-Acetyl-2,2-dimethylchroman (Verbindung 215)
  • Zu einer Lösung aus 2,2-Dimethylchroman (Verbindung 214, 15 g, 19,4 mmol) in trockenem CH2Cl2 (100 ml) wurde Acetylchlorid (1,52 ml, 21,3 mmol) gefolgt von AlCl3 (2,84 g, 21,3 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und dann in Eiswasser gegossen. Extraktion (CH2Cl2), Trocknen (Na2SO4) und Auf konzentrieren unter reduziertem Druck lieferte ein gelbes Öl. Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan 1:9) lieferte 2,15 g (54%) der Titelverbindung als gelben Feststoff.
    1H-NMR δ: 7,73 (2H, m), 6,80 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,9 Hz), 2,54 (3H, s), 1,84 (2H, t, J = 6,9 Hz), 1,36 (6H, s).
    Analyse (C13H16)O2 C, H
  • Ethyl-2,2-dimethylchroman-6-carboxylat (Verbindung 216)
  • Eine Lösung aus 6-Acetyl-2,2-dimethylchroman (Verbindung 215, 2,15 g, 10,5 mmol) und NaOH (2,0 g, 50 mmol) in Dioxan (50 ml) und Bleiche (50 ml, 5,25% NaOCl) wurde für 4 Tage auf 65°C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Na2SO3 hinzugegeben, bis eine Teilmenge dieser Lösung farblos blieb, wenn sie mit einem Tropfen einer Lösung aus I2 in CCl4 behandelt wurde. Die Lösung wurde mit H2SO4 angesäuert (pH 4) und mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan 1:3) lieferte 1,98 g (92%) 2,2-Dimethylchroman-5-carbonsäure als hellbraunen Feststoff.
    1H-NMR δ: 7,78 (2H, m), 6,82 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,7 Hz), 1,85 (2H, t, J = 6,7 Hz), 1,37 (6H s).
  • Zu einer Lösung aus diesem Feststoff (1,64 g, 7,94 mmol) in EtOH (50 ml) wurde H2SO4 (0,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde über Nacht auf 95°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und unter reduziertem Druck auf konzentriert. Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan, 1:5) lieferte 1,91 g (100%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.
    1H-NMR δ: 7,79 (2H, m), 6,79 (2H, d, J = 8,3 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,82 (2H, t, J = 6,7 Hz), 1,84 (2H, t, J = 6,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,36 (6H, s).
    Analyse (C14H18O3·0,25H2O) C, H.
  • Ethyl-8-brom-2,2-dimethylchroman-6-carboxylat (Verbindung 217)
  • Zu einer Lösung aus Ethyl-2,2-dimethylchroman-6-carboxylat (Verbindung 216, 500 mg, 2,14 mmol) in HOAc (4 ml) wurde Br2 (0,11 ml, 2,14 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, und dann wurde ein Luftstrom durch die Reaktionsmischung zur Entfernung des überschüssigen Br2 geleitet. Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck und Säulenchromatographie unter Verwendung des Rückstands (EtOAc:Hexan 1:9) lieferte 741 mg (100%) der Titelverbindung als Öl.
    1H-NMR δ: 8,05 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,73 (1H, d, J = 2,2 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,84 (2H, t, J = 6,7 Hz), 1,85 (2H, t, J = 6,7 Hz), 1,40 (6H, s), 1,38 (3H, t, J = 7,2 Hz).
    Analyse (C14H17BrO3·0,2H2O) C, H.
  • Ethyl-8-Brom-2,2-dimethyl-4-chromanon-6-carboxylat (Verbindung 218)
  • Zu einer Lösung aus HOAc (15 ml) und Ac2O (7,5 ml) bei 0°C wurde CrO3 (1,18 g, 12 mmol) in kleinen Portionen gegeben. Diese Lösung wurde für 15 Minuten gerührt und mit Benzol (10 ml) verdünnt, und eine Lösung aus Ethyl-B-Brom-2,2-dimethylchroman-6-carboxylat (Verbindung 217, 741 mg, 2,38 mmol in Benzol (5 ml) wurde langsam über mehrere Minuten hinzugegeben. Nach Rühren bei 0°C für 4 Stunden wurde die Reaktionsmischung auf Eis gegossen, mit EtOAc extrahiert, die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um ein Öl zu ergeben. Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan, 1:9) liefert 589 mg (76%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.
    1H-NMR δ: 8,5 (1H, d, J = 2,1 Hz), 8,40 (1H, d, J = 2,1 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,80 (2H, s), 1,54 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz);
    Analyse (C14H15BrO4) C, H, N.
  • Ethyl-8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-4(2H)-chroman-6-carboxylat (Verbindung 219)
  • Zu einer Lösung aus Ethyl-8-brom-2,2-dimethyl-4-chromanon-6-carboxylat (Verbindung 218, 589 mg, 1,81 mmol) in THF (20 ml) unter Argongas bei –78°C wurde p-Tolylmagnesiumbromid (2,16 ml, 2,72 mmol, 1 M Lösung in Ether) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Gesättigte NH4Cl-Lösung wurde zur Reaktion bei 0°C gegeben und die resultierende Mischung mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigtem NaCl gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan, 1:3) lieferte 297 mg einer Mischung aus der Titelverbindung und dem intermediären tertiären Alkohol als Öl. Diese Mischung wurde mit p-TsOH (20 mg) in trockenem Toluol (15 ml) vereinigt und für 30 Minuten auf 110°C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und das Produkt (182 mg, 25%) wurde durch Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan 1:3) isoliert.
    1H-NMR δ: 8,1 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,68 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,22 (4H, s), 5,67 (1H, s), 4,29 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,41 (3H, s), 1,56 (6H, s), 1,33 (t, J = 7,1 Hz);
    MS (EI) m/e 402, 400, 387, 385, 359, 357.
    Analyse (C21H21BrO3·0,45H2O) C, H.
  • 8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-4(2H)-chroman-6-carbonsäure (Verbindung 220)
  • Zu einer Lösung aus Ethyl-8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-4(2H)-chroman-6-carboxylat (Verbindung 219, 189 mg, 0,51 mmol) in EtOH (15 ml) und THF (10 ml) wurde 20%iges wäßriges NaOH (2 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h auf 45°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%igem wäßrigem HCl auf pH 4 angesäuert. Extraktion (EtOAc), Trocknen (MgSO4) und Auf konzentrieren unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung (171 mg) (98%) als farblosen Feststoff.
    1H-NMR δ: 8,15 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,21 (m, 4H), 5,69 (s, 1H), 2,42 (s, 3H), 1,58 (s, 6H).
  • Ethyl-2-fluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 221)
  • Zu einer Lösung aus 8-Brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-4(2H)-chroman-6-carbonsäure (Verbindung 220, 100 mg, 0,29 mmol) ind CH2Cl2 (8 ml) wurden DMAP (87 mg, 0,69 mmol), Ethyl-4-amino-2-fluorbenzoat (53 mg, 0,29 mmol) und EDC (72 mg, 0,37 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann zur Trockene auf konzentriert. Säulenchromatographie (EtOAc:Hexan, 1:3) lieferte 98 mg (63%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.
    1H-NMR δ: 7,99 (1H, bs), 7,89 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,88 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,65 (1H, dd, J = 12,8, 2,1 Hz), 7,25 (1H, dd, J = 7,5 Hz, 2,1 Hz), 7,19 (4H, s), 5,70 (1H, s), 4,36 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,38 (3H, s), 1,56 (6H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,2 Hz)
    MS (EI) m/e 537, 537, 524, 526, 357, 355, 312.
    Analyse (C28H25BrFNO4) C, H, N.
  • 2-Fluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoesäure (Verbindung 204)
  • Zu einer Lösung aus Ethyl-2-fluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 221, 135 mg, 0,25 mmol) in EtOH (5 ml) wurde 20%iges wäßriges NaOH (2 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit 10%igem wäßrigem HCl auf pH 4 angesäuert. Das EtOH wurde unter reduziertem Druck entfernt, und Ethylacetat und Wasser wurden zum Rückstand hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit gesättigtem NaHCO3 und gesättigtem wäßrigem NaCl gewaschen und über MgSO4 getrocknet.
  • Aufkonzentrieren unter reduziertem Druck lieferte 110 mg (86%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.
    1H-NMR δ (Aceton-d6): 8,09 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,91 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,68 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,83 (1H, dd, J = 12,8, 2,1 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 7,5 Hz, 2,1 Hz), 7,27 (4H, s), 5,87 (1H, s), 2,37 (3H, s), 1,56 (6H, s);
    MS (EI) m/e 511, 509, 496, 494, 452, 450, 357, 355, 312.
    Analyse (C26H21BrFNO4·0,6H2O) C, H, N.
  • Ethyl-2,6-difluor-4-[[(8-Brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chroman)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 222)
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die Synthese von Ethyl-2-fluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 221) lieferte die Reaktion von 8-Brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-4(2H)-chroman-6-carbonsäure (Verbindung 220, 100 mg, 0,29 mmol) mit Ethyl-2,6-difluor-4-aminobenzoat in Gegenwart von DMAP und EDC in CH2Cl2 53 mg (33%) der Titelverbindung als farbloses Öl.
    1H-NMR δ: 7,87 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,47 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,28 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,19 (4H, m), 5,70 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,41 (3H, s), 1,57 (6H, s), 1,38 (3H, t, J = 7,2 Hz).
    MS (EI) m/e 557, 555, 542, 540, 448, 446.
    Analyse (C28H24BrF2NO4) C, H, N.
  • 2,6-Difluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chroman)carbonyl]amino]benzoesäure (Verbindung 205)
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die Synthese von 2-Fluor-4-[[(8-Brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chromanyl)carbonyl]amino]benzoesäure (Verbindung 204) lieferte die Behandlung von Ethyl-2,6-difluor-4-[[(8-brom-2,2-dimethyl-4-(4-methylphenyl)-6-chroman)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 222, 53 mg, 0,1 mmol) mit wäßrigem NaH in EtOH 35 mg (70%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.
    1H-NMR δ (Aceton-d6): 9,93 (1H, bs), 8,07 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,66 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,54 (2H, d, J = 9,9 Hz), 7,27 (4H, s), 5,88 (1H, s), 2,38 (3H, s), 1,56 (6H, s).
    MS (EI) m/e 514, 512, 485, 483, 470, 468.
    Analyse (C26H20BrF2NO4) C, H, N.
  • Verfahren zur Potenzierung von Kernrezeptoragonisten
  • Übersicht und Einleitung
  • Wir haben festgestellt, daß eine Untergruppe von Retinoidantagonisten, die negative Hormonaktivität aufweisen, zur Potenzierung der biologischen Aktivitäten anderer Retinoide und Hormone der Steroidrezeptorsuperfamilie verwendet werden können. Diese anderen Retinoide und Hormone der Steroidrezeptorsuperfamilie können entweder endogene Hormone oder Pharmazeutika sein. So können zum Beispiel bestimmte Aktivitäten von pharmazeutischen Retinoidagonisten, wenn sie in Kombination mit einem negativen Retinoidhormon verwendet werden, aktiver bei der Ausübung spezifischer biologischer Wirkungen gemacht werden. Vorteilhaft kann dieser Kombinationsansatz zur Wirkstoffverabreichung ungewünschte Nebenwirkungen pharmazeutischer Retinoide minimieren, weil niedrigere Dosierungen der pharmazeutischen Retinoide mit verbesserter Wirksamkeit verwendet werden können.
  • Insbesondere haben wir festgestellt, daß AGN 193109, ein synthetisches Retinoid mit der in 1 gezeigten Struktur, einzigartige und unerwartete pharmakologische Aktivitäten aufweist. AGN 193109 weist eine hohe Affinität für die RAR-Unterklasse von Kernrezeptoren auf, ohne diese Rezeptoren zu aktivieren oder die Transkription von Retinoid-reaktiven Genen zu stimulieren. Stattdessen hemmt AGN 193109 die Aktivierung von RARs durch Retinoidagonisten und verhält sich deshalb als Retinoidantagonist.
  • Zusätzlich haben wir festgestellt, daß negative Retinoidhormone ohne Koverabreichung eines Retinoidagonisten oder Steroidhormons zur Bekämpfung bestimmter Krankheitssymptome verwendet werden können. Insbesondere können die hier offenbarten negativen Retinoidhormone die hochgradige Basistranskription von Genen abregulieren, die auf unkomplexierte RARs ansprechen. Falls zum Beispiel eine unkontrollierte zelluläre Proliferation aus der Aktivität von Genen resultiert, die auf unkomplexierte RARs ansprechen, dann kann diese Genaktivität durch die Verabreichung eines negativen Retinoidhormons reduziert werden, das RARs inaktiviert. Entsprechend kann die zelluläre Proliferation, die von der Aktivität unkomplexierter RARs abhängt, durch das negative Hormon gehemmt werden. Die Inhibierung von unkomplexierten RARs kann nicht durch Verwendung herkömmlicher Antagonisten erreicht werden.
  • Signifikanterweise haben wir festgestellt, daß AGN 193109 sowohl die RAR-Basisaktivität unterdrücken als auch manchmal die Aktivitäten anderer Retinoid- und Hormonagonisten der Steroidrezeptor-Superfamilie potenzieren kann. Im Zusammenhang der Erfindung wird ein Hormonagonist als durch ein negatives Hormon wie AGN 193109 potenziert betrachtet, falls in Gegenwart des negativen Hormons eine reduzierte Konzentration des Agonisten im wesentlichen die gleiche quantitative Reaktion auslöst wie diejenige, die mit dem Agonisten allein erhältlich ist. Die quantitative Reaktion kann zum Beispiel in einem Reportergentest in vitro gemessen werden. So wird ein therapeutisches Retinoid, das eine gewünschte Reaktion bei Verwendung in einer besonderen Dosierung oder Konzentration ausübt, durch AGN 193109 potenziert, falls in Kombination mit AGN 193109 eine geringere Dosierung oder Konzentration des therapeutischen Retinoids verwendet werden kann, um den im wesentlichen gleichen Effekt wie eine höhere Dosierung oder Konzentration des therapeutischen Retinoids zu erzeugen, wenn das therapeutische Retinoid allein verwendet wird. Die Liste von Agonisten, die durch Koverabreichung mit AGN 193109 potenziert werden können, schließt RAR-Agonisten, Vitamin D-Rezeptoragonisten, Glukokortikoidrezeptoragonisten und Schilddrüsenhormonrezeptoragonisten ein. Insbesondere schließen spezifische Agonisten, die durch Koverabreichung potenziert werden können, die folgenden ein: ATRA, 13-cis-Retinolsäure, den synthetischen RAR-Agonisten AGN 191183, 1,25-Dihydroxyvitamin D3, Dexamethason und Schilddrüsenhormon (3,3'5-Triiodthyronin). Ebenfalls offenbart wird hier ein Verfahren, das zur Identifizierung anderer Hormone verwendet werden kann, die durch Koverabreichung mit AGN 193109 potenziert werden können.
  • Somit verhält sich AGN 193109 in einer Weise, die nicht für einen einfachen Retinoidantagonisten vorhergesehen wird, sondern als ein negatives Hormon, das die Aktivitäten verschiedener Mitglieder der Familie von Kernrezeptoren potenzieren kann. Wir offenbaren ebenfalls einen möglichen Mechanismus, der sowohl die negative Hormonaktivität als auch die Fähigkeit von AGN 193109 zur Potenzierung der Aktivitäten anderer Kernrezeptorliganden berücksichtigen kann. Dieser Mechanismus beinhaltet Elemente, von denen bekannt ist, daß sie an Retinoid-abhängigen Signalleitungswegen teilnehmen, und beinhaltet zusätzlich eine neue negative regulatorische Komponente.
  • Die Durchschnittsfachleute werden einsehen, daß RARs, die hochaffine Ziele für die AGN 193109-Bindung sind, Transkriptionsfaktoren sind, die die Expression einer Vielzahl von Retinoid-reaktiven Genen regulieren. cis-regulatorische DNA-Bindungsorte für die RARs wurden in der Nähe von Genen identifiziert, die transkriptionell in einer Retinoid-abhängigen Weise reguliert werden. Die RAR-Bindung an solche DNA-Orte, bekannt als Retinolsäure-Response-Elemente (RAREs), ist gut definiert. Bedeutsam ist, daß die RAREs Heterodimere binden, die aus einem RAR und einem RXR bestehen. Die RXR-Komponente des Heterodimers funktioniert zur Förderung einer hochaffinen Wechselwirkung zwischen dem RAR/RXR-Heterodimer und dem RARE (Mangelsdorf et al., The Retionoid Receptors, "The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine", 2. Auflage, Hrsg. Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York 1994).
  • Wie nachfolgend ausgeführt wird, stimmen unsere Befunde, die die negative Hormonaktivität von AGN 193109 betreffen, mit einem Mechanismus überein, der die Wechselwirkung eines mutmaßlichen negativen Koaktivatorproteins (NCP) mit dem RAR beinhaltet. Gemäß dem vorgeschlagenen Mechanismus wird diese Wechselwirkung durch AGN 193109 stabilisiert.
  • Unsere Ergebnisse zeigten ferner, daß AGN 193109 die intrazelluläre Verfügbarkeit von NCP zur Wechselwirkung mit anderen Kernrezeptoren als RARs modulieren kann, die durch AGN 193109 besetzt werden. Es folgt daraus, daß AGN 193109 transkriptionelle regulatorische Reaktionswege potenzieren kann, die Kernrezeptoren involvieren, die mit den RARs die Fähigkeit zur Bindung des NCP teilen. In dieser Hinsicht weist AGN 193109 die Fähigkeit auf, eine Vielzahl von Kernrezeptor-Reaktionswegen zu modulieren, eine Aktivität, die nicht für einen herkömmlichen Retinoidantagonisten vorhergesagt würde. Entsprechend ist AGN 193109 nützlich als ein Mittel zur Potenzierung der Aktivität von Kernrezeptorliganden, einschließlich sowohl endogener Hormone als auch verschriebener Therapeutika. Diese spezifische Ausführungsform veranschaulicht das allgemeinere Prinzip, daß jedes negative Hormon für einen Kernrezeptor die Aktivität anderer Kernrezeptoren potenzieren wird, die kompetitiv das NCP binden.
  • Obwohl andere Materialien und Methoden, die ähnlich oder äquivalent zu den hier beschriebenen sind, in der Praxis oder Untersuchung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden jetzt die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Allgemeine Verweise auf Verfahren, die zur Durchführung der verschiedenen Nukleinsäuremanipulationen und hier beschriebenen Verfahren verwendet werden können, können gefunden werden in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) und in "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., Hrsg., Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience 1987). Eine Beschreibung der Experimente und Ergebnisse, die zur Schaffung der vorliegenden Erfindung führten, folgt.
  • Beispiel 6 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 jeden von drei RARs mit hoher Affinität band, aber in der Aktivierung der Retinoid-abhängigen Genexpression versagte.
  • Beispiel 6
  • AGN 193109 bindet RARs mit hoher Affinität, aber transaktiviert nicht die Retinoid-abhängige Genexpression
  • Humane RAR-α-, RAR-β- und RAR-γ-Rezeptoren wurden separat als rekombinante Proteine unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems exprimiert, im wesentlichen gemäß dem von Allegretto et al. beschriebenen Verfahren, J. Biol. Chem. 268: 26625 (1993). Die rekombinanten Rezeptorproteine wurden separat zur Bestimmung von AGN 193109-Bindungsaffinitäten eingesetzt, wobei der [3H]-ATRA-Verdrängungstest verwendet wurde, beschrieben von Heyman et al., Cell 68: 397 (1992). Dissoziationskonstanten (Kd) wurden gemäß dem von Cheng et al. beschriebenen Verfahren bestimmt, Biochemical Pharmacology 22: 3099 (1973).
  • AGN 193109 wurde ebenfalls auf seine Fähigkeit zur Transaktivierung von RARs in CV-1-Zellen getestet, die transient mit RAR-Expressionsvektoren und einem Retinoid-reaktiven Reportergenkonstrukt kotransfiziert worden waren. Rezeptorexpressionsvektoren pRShRAR-α (Giguere et al., Nature 330: 624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook et al., Nature 333: 669 (1988)) und pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) wurden separat mit dem ΔMTV-TREp-Luc-Reporterplasmid kotransfiziert. Die Verwendung dieses Luciferase-Reporterplasmids wurde von Heyman et al. offenbart, Cell 68: 397 (1992). Das ΔMTV-TREp-Luc-Plasmid ist im wesentlichen identisch mit dem ΔMTV-TREp-CAT-Reporterkonstrukt, beschrieben von Umesono et al., Nature, 336: 262 (1988), ausgenommen daß das Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)-Reportergen durch eine Polynukleotidsequenz substituiert war, die Leuchtkäferluciferase codiert. Die Transfektion von CV-1-Zellen aus Meerkatze wurde unter Verwendung des Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahrens durchgeführt, beschrieben in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). CV-1-Zellen wurden mit einer Dichte von 4 × 104/Vertiefung in Mehrfachvertiefungsplatten mit 12 Vertiefungen ausplattiert und mit einem Calciumphosphatpräzipitat, das 0,7 μg Reporterplasmid und 0,1 μg Rezeptorplasmid enthielt, gemäß Standardlaborverfahren transient transfiziert. Die Zellen wurden nach 18 Stunden gewaschen, um das Präzipitat zu entfernen, und erneut mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco) gefüttert, das 10% mit Aktivkohle extrahiertem fötalem Rinderserum (Gemini Bio-Products) enthielt. Die Zellen wurden mit Träger allein (Ethanol) oder AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) für 18 Stunden behandelt. Zelllysate wurden in 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA hergestellt. Luciferase-Aktivität wurde wie von de Wet et al. beschrieben, Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987), unter Verwendung von Leuchtkäferluciferin (Analytical Luminescence Laboratory) und eines Plattenluminometers mit 96 Vertiefungen von EG & G Berthold gemessen. Die angegebenen Luciferasewerte stellten den Mittelwert ± Standardabweichung von Bestimmungen in dreifacher Ausführung dar.
  • Die in Tabelle 11 angegebenen Ergebnisse zeigten, daß AGN 193109 jeden aus RAR-α, RAR-β und RAR-γ mit hoher Affinität band, aber nicht die Retinoid-abhängige Genexpression aktivierte. Insbesondere band AGN 193109 jeden der drei Rezeptoren mit Kd-Werten im Bereich von 2 bis 3 nM. Trotz dieser engen Bindung versagte AGN 193109 in der Aktivierung der Genexpression bei Vergleich mit durch ATRA stimulierten Induktionen. Entsprechend war die halbmaximale effektive Konzentration von AGN 193109 (EC50) unmeßbar. Obwohl nicht in der Tabelle dargestellt, stellten wir ebenfalls fest, daß AGN 193109 keine meßbare Affinität für die RXRs hatte.
  • Tabelle 11 AGN 193109-Bindung und -Transaktivierung der RARs
    Figure 00560001
  • Beispiel 7 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 ein Antagonist der ATRA-abhängigen Genexpression ist.
  • Beispiel 7
  • AGN 193109-abhängige Inhibierung der RAR-Transaktivierung durch ATRA
  • Die Fähigkeit von AGN 193109, der durch ATRA-vermittelten RAR-Aktivierung entgegenzuwirken, wurde in CV-1-Zellen untersucht, die durch das Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahren von Sambrook et al. kotransfiziert worden waren (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab Publ., 1989). Eurkaryontische Expressionsvektoren pRShRAR-α (Giguere et al., Nature 330: 624 (1987)), pRShRAR-β (Benbroock et al., Nature 333: 669 (1988)) und pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) wurden mit dem von Hollenberg et al. beschriebenen Δ-MTV-Luc-Reporterplasmid (Cell 55: 899 (1988)) kotransfiziert. Bemerkenswert enthielt das Reporterplasmid zwei Kopien des TRE-Palindrom-Response-Elements. Calciumphosphat-Transfektionen wurden genau wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden mit Träger allein (Ethanol), ATRA (10–9 bis 10–6 M), AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) oder 10–8 M ATRA in Kombination mit AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) für 18 Stunden behandelt. Zelllysate und Messungen der Luciferase-Aktivität wurden ebenfalls wie in Beispiel 6 durchgeführt.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren sind in den 2A bis 2F dargestellt, worin Luciferasewerte den Mittelwert ± Standardabweichung von Bestimmungen in dreifacher Ausführung darstellen. Insbesondere zeigten die in den 2A, 2C und 2C dargestellten Ergebnisse, daß die Stimulation von transfizierten Zellen mit ATRA zu Dosis-Reaktions-Zunahmen der Luciferase-Aktivität führten. Dies bestätigte, daß ATRA jeden der drei RARs im experimentellen System aktiviert und eine Vergleichsbasis zum Nachweis der Aktivität eines Antagonisten lieferte. Die in den 2B, 2D und 2F dargestellten graphischen Ergebnisse zeigten, daß die gleichzeitige Behandlung von transfizierten Zellen mit 10 nM ATRA und zunehmenden Konzentrationen von AGN 193109 zu einer Inhibierung der Luciferase-Aktivität führte. Insbesondere ergaben gleiche Dosen von AGN 193109 und ATRA eine mehr als 50%ige Inhibierung relativ zu ATRA allein für alle drei RAR-Untertypen. Der Vergleich der ATRA-Dosis-Reaktion in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von AGN 193109 zeigte, daß ATRA durch AGN 193109 kompetitiv gehemmt wurde. Bemerkenswert stellt die horizontale Achse auf allen der in 2 gezeigten Diagramme den Logarithmus der Retinoidkonzentration dar. Diese Ergebnisse bewiesen, daß AGN 193109 ein wirksamer RAR-Antagonist war.
  • Als nächstes führten wir Experimente durch, um den der antagonistischen Aktivität von AGN 193109 zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären. Die Durchschnittsfachleute werden einsehen, daß angenommen wird, daß die Kernrezeptoraktivierung eine Konformationsveränderung des Rezeptors beinhaltet, die durch Ligandenbindung induziert wird. Tatsächlich haben die Ergebnisse von Proteaseschutztests bestätigt, daß nukleäre Hormonagonisten und -antagonisten dazu führen, daß Rezeptorproteine unterschiedliche Konformationen annehmen (Keidel et al., Mol. Cell. Biol. 14: 287 (1994); Allan et al., J. Biol. Chem. 267: 19513 (1992)). Wir verwendeten einen solchen Test um zu bestimmen, ob AGN 193109 und ATRA dazu führten, daß RAR-α unterschiedliche Konformationen annimmt. AGN 193583, ein RAR-α-selektiver Antagonist, wurde als Positivkontrolle eingeschlossen, von der bekannt ist, daß sie ein Antagonist-spezifisches Muster von Proteaseempfindlichkeit verleiht.
  • Beispiel 8 beschreibt ein Verfahren, das zu Detektion von Konformationsveränderungen in RAR-α verwendet wurde, die aus einer AGN 193109-Bindung resultierten. Wie nachfolgend dargestellt wird, zeigten die Ergebnisse dieses Verfahrens unerwartet, daß AGN 193109 zu einem Muster der Trypsin-Empfindlichkeit führt, die im wesentlichen identisch mit der durch ATRA, einem RAR-Agonisten, induzierten und ungleich derjenigen war, die durch einen modellmäßigen RAR-Antagonisten induziert wird. Dieser Befund legte nahe, daß AGN 193109 Eigenschaften besitzt, die sich von anderen Retinoidantagonisten unterscheiden.
  • Beispiel 8
  • Proteaseschutzanalyse
  • Ein Plasmid, das mit Vektor pGEM3Z (Pharmacia) konstruiert wurde und die RAR-α-cDNA enthielt (Giguere et al., Nature 330: 624 (1987)), wurde im Zusammenhang mit dem TNT-gekuppelten Retikulozytenlysat in vitro Transkription-Translations-System (Promega) verwendet, um [35S]-Methionin-markiertes RAR-α herzustellen. Eine beschränkte proteolytische Verdauung des markierten Proteins RAR-α wurde gemäß dem von Keidel et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt, Mol. Cell. Biol. 14: 287 (1994). Teilmengen des Retikulozytenlysats, das [35S]-Methionin-markiertes RAR-α enthielt, wurden mit entweder ATRA, AGN 193583 oder AGN 193109 auf Eis für 45 Minuten in einem Gesamtvolumen von 9 μl inkubiert. Die Retinoidendkonzentration für alle Versuche betrug 100 nM für ATRA und AGN 193109 und 1000 nM für AGN 193583. Der Unterschied zwischen den Endkonzentrationen der Retinoide beruhte auf dem etwa 10-fachen Unterschied der relativen Affinitäten von ATRA und AGN 193109 (mit einem Kd-Wert an RAR-α von 2 bzw. 10 nM) und AGN 193583 (mit einem Kd-Wert an RAR-α von ≥ 100 nM). Nach der Ligandenbindung wurde 1 μl von entsprechend konzentriertem Trypsin zur Mischung gegeben, um Endkonzentrationen von 25, 50 oder 100 μg/ml zu ergeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und die Trypsinverdauung durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Die Proben wurden der Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und gemäß Standardverfahren autoradiographiert.
  • Sowohl der Agonist als auch Antagonist führte zu besonderen Mustern der Trypsinempfindlichkeit, die sich von dem Ergebnis unterschieden, das durch Verdauung des unkomplexierten Rezeptors erhalten wurde. Die autoradiographischen Ergebnisse zeigten, daß Trypsinkonzentrationen von 25, 50 und 100 μg/ml das radiomarkierte RAR-α vollständig in 10 Minuten bei Raumtemperatur in Abwesenheit von zugegebenem Retinoid verdauten. Die Vorbindung von ATRA führte zum Auftreten von zwei proteaseresistenten Hauptarten. Vorbindung des RAR-α-selektiven Antagonisten AGN 193583 führte zu einer proteaseresistenten Spezies, die ein geringeres Molekulargewicht als diejenige hatte, die aus der ATRA-Vorbindung resultierte. Dieses Ergebnis zeigte, daß ein Retinoidagonist und -antagonist zu Konformationsveränderungen führte, die aufgrund von veränderten Trypsinempfindlichkeiten detektierbar waren. Überraschend führte die Vorbindung von AGN 193109 zu einem Proteaseschutzmuster, das ununterscheidbar von demjenigen war, das durch Vorbindung von ATRA erzeugt wurde.
  • Die oben dargestellten Ergebnisse bestätigten, daß AGN 193109 den RAR-α band und seine Konformation veränderte. Interessanterweise ähnelte die Natur dieser Konformationsveränderung stärker derjenigen, die aus der Bindung eines Agonisten (ATRA) resultierte, als der Veränderung, die durch eine Antagonistenbindung (AGN 193583) erzeugt wurde. Ersichtlich war der Mechanismus des AGN 193109-abhängigen Antagonismus besonders.
  • Wir erwogen mögliche Mechanismen, die die antagonistische Aktivität von AGN 193109 erklären könnten. Insbesondere verwendeten wir einen standardmäßigen Gel-Shift-Test zur Untersuchung, ob AGN 193109 die RAR/RXR-Heterodimerbildung störte oder die Wechselwirkung zwischen RAR und seinem erkennenden DNA-Bindungsort inhibierte.
  • Beispiel 9 beschreibt einen gelelektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Test, der verwendet wurde um zu zeigen, daß AGN 193109 weder die RAR/RXR-Dimerisierung hemmte noch die Bindung von Dimeren an eine Ziel-DNA hemmte.
  • Beispiel 9
  • Gel-Shift-Analyse
  • In vitro translatiertes RAR-α wurde im wesentlichen wie in Beispiel 8 beschrieben erzeugt, außer daß das 35S-markierte Methionin ausgelassen wurde. In vitro translatiertes RXR-α wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Vektors auf pBluescript(II)(SK)-Basis, der die RXR-α-cDNA enthielt, die von Mangelsdorf et al. beschrieben wurde, Nature 345: 224–229 (1990), als Matrize zur Erzeugung von in-vitro-Transkripten hergestellt. Den markierten RAR-α und RXR-α allein oder in Kombination oder vorgebunden mit AGN 193109 (10–6 M) entweder allein oder in Kombination ließ man mit einer endmarkierten DR-5 RARE doppelsträngigen Sonde mit der Sequenz 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3' (SEQ ID NO: 1) wechselwirken. Die Bindungsmischung wurde an einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch behandelt und gemäß Standardlaborverfahren autoradiographiert. Eine einzelne verzögerte Spezies, die auf dem Autoradiogramm erschien und allen Bahnen auf dem Gel gemeinsam war, stellte einen undefinierten Sonden-bindenden Faktor dar, der im Retikulozytenlysat vorhanden war. Nur die RAR/RXR-Kombination führte zu einer Retinoidrezeptor-spezifischen verzögerten Spezies. Weder RAR allein noch RXR allein band die Sonde, um diese verschobene Spezies zu erzeugen. Die Gegenwart von AGN 193109 verminderte diese Wechselwirkung nicht.
  • Diese Ergebnisse zeigten, daß AGN 193109 weder die Homo- noch die Heterodimerisierungseigenschaften von RAR-α wesentlich veränderte. Ferner inhibierte AGN 193109 nicht die Wechselwirkung von Rezeptordimeren mit einem DNA-Segment, das die erkennende Bindungsstelle enthielt.
  • Angesichts der besonderen Eigenschaften, die AGN 193109 kennzeichneten, schritten wir mit der Untersuchung fort, ob dieser Antagonist zusätzlich die Aktivität von unkomplexierten RARs inhibieren könnte. Das zur Durchführung dieser Bestimmung verwendete Rezeptor/Reporter-System wies vorteilhaft eine hochgradige konstitutive Aktivität in Abwesenheit von zugegebenem Retinoidagonist auf. Insbesondere setzten diese Verfahren das ER-RAR chimäre Rezeptor- und ERE-tk-Luc-Reportersystem ein. Das ERE-tk-Luc-Plasmid schließt die Region –397 bis –87 der Östrogen-reaktiven 5'-flankierenden Region des Xenopus Vitellogenin-A2-Gens ein, beschrieben von Klein-Hitpass et al., Cell 46: 1053–1061 (1986), ligiert stromaufwärts des HSV-Thymidinkinase-Promotors und Luciferase-Reportergens von Plasmid tk-Luc. Die ER-RAR chimären Rezeptoren bestanden aus der Östrogenrezeptor-DNA-Bindungsdomäne, fusioniert an die "D-E-F"-Domäne der RARs. Die Fachleute erkennen an, daß diese "D-E-F"-Domäne unter Bindung von Retionoid funktioniert, um eine Retinoid-induzierbare Transaktivierungsfunktion bereitzustellen und einen Kontaktort für die Heterodimerisierung mit RXR bereitzustellen. Somit war die Luciferaseexpression in diesem Reportersystem abhängig von der Aktivierung des transfizierten chimären Rezeptorkonstrukts.
  • Beispiel 10 beschreibt das zur Demonstration verwendete Verfahren, daß AGN 193109 die unkomplexierten RARs zuordnungsfähige Grundgenaktivität inhibierte. Diese Verfahren wurden in Abwesenheit von zugegebenem Retinoidagonist durchgeführt. Die nachfolgend dargestellten Ergebnisse lieferten den ersten Hinweis, daß AGN 193109 eine negative Hormonaktivität aufwies.
  • Beispiel 10
  • Repression von Grundgenaktivität eines Retinoid-regulierten Reporters in transient kotransfizierten Zellinien
  • CV-1-Zellen wurden mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und entweder ER-RAR-α, ER-RAR-β- oder ER-RAR-γ-Expressionsplasmiden kotransfiziert. Das ERE-tk-Luc-Plasmid enthielt das auf Östrogen reagierende Promotorelement des Xenopus laevis-Vitellogenin-A2-Gens und war im wesentlichen identisch mit dem Reporterplasmid, das von Klein-Hitpass et al. beschrieben wird, Cell 46: 1053 (1986), außer daß das CAT-Reportergen durch eine Polynukleotidsequenz substituiert war, die Luciferase codiert. Die in der Kotransfektion eingesetzen, den chimären ER-RAR-α-, ER-RAR-β- und ER-RAR-γ-Rezeptor codierenden Polynukleotide wurden von Graupner et al. beschrieben, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991). Diese Polynukleotide wurden in den von Ellis et al. beschriebenen pECE-Expressionsvektor ligiert, Cell 45: 721 (1986), und unter der Transkriptionskontrolle des SV-40- Promotors exprimiert. Calciumphosphat-Transfektionen wurden genau wie in Beispiel 6 beschrieben unter Verwendung von 0,5 μg/Vertiefung von Reporterplasmid und entweder 0,05 μg, 0,10 μg oder 0,2 μg/Vertiefung von Rezeptorplasmid durchgeführt. Zellen wurden mit Träger allein (Ethanol), ATRA (10–9 bis 10–6 M) oder AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) für 18 Stunden behandelt. Zelllysate und Messungen der Luciferase-Aktivität wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
  • Die in den 3A, 4A und 5A dargestellten Ergebnisse bestätigten, daß ATRA die Luciferaseexpression in allen Transfektanten stark induzierte. Die Basisniveau-Expression von Luciferase für die drei transfizierten chimären RAR-Isoformen reichte von ca. 7000 bis 40000 relativen Lichteinheiten (rlu) und war etwas von der in der Transfektion verwendeten Menge an Reporterplasmid abhängig. Somit waren die drei chimären Rezeptoren wie erwartet durch ATRA aktivierbar. Insbesondere banden alle drei Rezeptoren ATRA und aktivierten die Transkription des auf dem ERE-tk-Luc-Plasmid beherbergten Luciferase-Reportergens.
  • Die 3B, 4B und 5B stellen die in Abwesenheit von exogenem Retinoidagonisten erhaltenen Dosis-Reaktions-Kurven für AGN 193109 dar. Interessanterweise war ER-RAR-α (3B) im wesentlichen unbeeinflußt durch AGN 193109, während die chimären ER-RAR-β- und ER-RAR-γ-Rezeptoren (4B bzw. 5B) eine auf die AGN 193109-Dosis reagierende Abnahme der Luciferase-Reporteraktivität aufwiesen.
  • Wir untersuchten ferner die negative Hormonaktivität von AGN 193109 durch Untersuchung seiner Fähigkeit, die Genexpression zu unterdrücken, die durch einen chimären RAR-γ-Rezeptor vermittelt wird, der manipuliert worden war, um eine konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne zu besitzen. Insbesondere verwendeten wir einen konstitutiv aktiven chimären RAR-γ-Rezeptor, der an die saure Aktivatordomäne von HSV VP-16 fusioniert war, als RAR-γ-VP-16 bezeichnet, in zwei Arten von Luciferase-Reportersystemen. Das erste bestand aus dem ERE-tk-Luc-Reporter, kotransfiziert mit ER-RARs und ER-RXR-α. Das zweite verwendete den ΔMT-TREp-Luc-Reporter anstelle des ERE-tk-Luc-Reporters.
  • Beispiel 11 beschreibt das Verfahren, das verwendet wurde um zu zeigen, daß AGN 193109 die Aktivität einer Transkriptionsaktivatordomäne eines RAR unterdrücken konnte. Die nachfolgend dargestellten Ergebnisse bewiesen, daß AGN 193109 die RAR-abhängige Genexpression in Abwesenheit eines Agonisten unterdrücken konnte, und bestätigten, daß AGN 193109 negative Hormonaktivität aufwies.
  • Beispiel 11
  • Unterdrückung von RAR-VP-16-Aktivität in transient transfizierten Zellen
  • CV-1-Zellen wurden transient gemäß der in Beispiel 6 beschriebenen Calciumphosphat-Konräzipitationstechnik kotransfiziert, wobei 0,5 μg/Vertiefung des ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmids, 0,1 μg/Vertiefung des chimären ER-RXR-α-Reporterexpressionsplasmids und entweder 0 μg oder 0,1 μg/Vertiefung des RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmids verwendet wurden. Der chimäre Rezeptor ER-RXR-α bestand aus der Hormonbindungsdomäne (Aminosäuren 181 bis 458) von RXR-α (Mangelsdorf et al., Nature 345: 224–229 (1990)), fusioniert an die Östrogenrezeptor-DNA-Bindungsdomäne (Graupner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)), und wurde aus dem Expressionsvektor pECE auf SV-40-Basis, beschrieben von Ellis et al., Cell 45: 721 (1986), exprimiert. RAR-γ-VP-16 ist identisch mit dem VP16RAR-γ1-Expressionsplasmid, das von Nagpal et al. beschrieben wurde, EMBO J. 12: 2349 (1993), dessen Offenbarung hier durch Verweis eingeführt wird, und codiert ein chimäres Protein, in dem die Aktivierungsdomäne des VP-16-Proteins von HSV an den Amino-Terminus von RAR-γ voller Länge fusioniert ist. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und mit DMEM (Gibco-BRL) gefüttert, das 10% FBS (Gemini Bio-Products) enthielt, das mit Aktivkohle extrahiert worden war, um Retinoide zu entfernen. Die Zellen wurden mit einer angemessenen Verdünnung von AGN 193109 oder ATRA in Ethanol als Träger oder mit Ethanol allein für 18 Stunden behandelt, dann mit PBS gespült und unter Verwendung von 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT und 2 mM EDTA lysiert. Luciferase-Aktivität wurde gemäß dem von de Wet et al. beschriebenen Verfahren gemessen, Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987), wobei Leuchtkäferluciferin (Analytical Luminescence Laboratory) und ein Luminometer EG&G Berthold mit 96 Vertiefungen verwendet wurden. Die Luciferase-Werte stellten den Mittelwert ± Standardabweichung von Bestimmungen in dreifacher Ausführung dar.
  • Wie in 6 gezeigt wird, wiesen CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Reporterkonstrukt und dem chimären ER-RAR-α-Expressionsplasmid transfiziert wurden, eine schwache Aktivierung von Luciferase-Aktivität durch ATRA auf, wahrscheinlich aufgrund von Isomerisierung von ATRA zu 9C-RA, dem natürlichen Liganden für die RXRs (Heyman et al., Cell 68: 397 (1992)). Mit der gleichen Mischung aus Reporter und chimären Reporterplasmiden transfizierte Zellen, die aber mit AGN 193109 behandelt wurden, wiesen keine Wirkung auf die Luciferase-Aktivität auf. Da AGN 193109 nicht an die RXRs bindet, wurde dieses letztere Ergebnis erwartet. CV-1-Zellen, die in ähnlicher Weise mit dem ERE-tk-Luc-Reporter transfiziert waren, aber mit Substitution eines chimären ER-RAR-Rezeptorexpressionsplasmids für ER-RXR-α, wiesen eine robuste Induktion von Luciferase-Aktivität nach ATRA-Behandlung auf.
  • Im Gegensatz führte der Einschluß des RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmids mit den ER-RXR-α- und ERE-tk-Luc-Plasmiden in der Transfektionsmischung zu einer signifikanten Zunahme der Luciferase-Basisaktivität gemäß Messung in Abwesenheit von zugegebenem Retinoid. Diese Zunahme der Luciferase-Basisaktivität, die für die ER-RXR-α/RAR-γ-VP-16-Kotransfektanten beobachtet wurde, zeigte bei Vergleich mit den unter Verwendung von Zellen erhaltenen Ergebnissen, die allein mit ER-RXR-α transfiziert waren, daß rekombinante ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Proteine heterodimerisieren konnten. Die Wechselwirkung des Heterodimers mit dem cis-regulatorischen Östrogen-reaktiven Element führte zu einer Ausrichtung der VP-16-Aktivierungsdomäne auf die Promotorregion des ERE-tk-Luc-Reporters. Die Behandlung von derart dreifach transfizierten Zellen mit ATRA führte zu einer mäßigen Zunahme der Luciferase-Aktivität gegenüber dem hohen Basisniveau. Jedoch führte die Behandlung der dreifachen Transfektanten mit AGN 193109 zu einer dosisabhängigen Abnahme der Luciferase-Aktivität. In bedeutender Weise zeigt 6, daß die AGN 193109-Behandlung von Zellen, die mit ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 kotransfiziert waren, zu einer Unterdrückung der Luciferase-Aktivität führte, wobei eine maximale Inhibierung bei ca. 10–8 M AGN 193109 auftrat.
  • Unsere Beobachtung, daß AGN 193109 die konstitutive Transkriptionsaktivierungsfunktion von RAR-γ-VP-16 in Gegenwart eines RXR unterdrückte, wurde durch ein Modell erklärt, in dem die Bindung von AGN 193109 an den RAR eine Konformationsveränderung des RAR induzierte, die eine negative Konformation stabilisiert, die die Bindung eines trans-wirkenden negativen Koaktivatorproteins erleichtert. Wenn der AGN 193109/RAR-Komplex durch das NCP gebunden wird, kann der RAR die Transkription von Genen nicht aufregulieren, die gewöhnlich auf aktivierte RARs reagieren. Unser Modell schlägt ferner vor, daß das intrazelluläre Reservoir von NCP in einer einschränkenden Konzentration in bestimmten Zusammenhängen vorliegt und aufgrund von AGN 193109-stimulierter Komplexierung mit RARs erschöpft werden kann.
  • Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigten zusätzlich, daß selbst bei 10–6 M AGN 193109 die ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Proteine wechselwirken konnten, um Heterodimere zu bilden, die kompetent zur Aktivierung der Transkription des Reportergens sind. Insbesondere ergaben Zellen, die mit ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 transfiziert und mit AGN 193109 mit einer Konzentration (10–8–10–6 M) behandelt wurden, die ausreichend zur Bereitstellung maximaler Inhibierung war, Ablesungen der Luciferase-Aktivität von ca. 16 000 rlu. Umgekehrt wiesen Zellen, die nur mit ER-RXR-α transfiziert und dann mit AGN 193109 bei einer Konzentration von so hoch wie 10–6 M behandelt wurden, Luciferase-Expressionsgrade von nur ca. 8000 rlu auf. Die Tatsache, daß ein höheres Maß an Luciferase-Aktivität in Zellen erhalten wurde, die sowohl ER-RXR-α als auch RAR-γ-VP-16 exprimierten, selbst in Gegenwart von 10–6 M AGN 193109, zeigte die Dauerhaftigkeit einer Wechselwirkung zwischen den zwei rekombinanten Rezeptoren. Die Unterdrückung der RAR-γ-VP-16-Aktivität durch AGN 193109 legte nahe, daß die Modulierung der NCP-Wechselwirkung mit der VP-16-Aktivierung kodominant sein kann. Entsprechend erkannten wir, daß es möglich sein kann, die Expression von Genen zu modulieren, die gewöhnlich nicht durch Retinoide in einer AGN 193109-abhängigen Weise reguliert werden.
  • Kandidaten für AGN 193109-regulierbare Gene schließen diejenigen ein, die durch Transkriptionsfaktorkomplexe aktiviert werden, die aus Nicht-RAR-Faktoren bestehen, die mit RARs assoziieren oder heterodimerisieren, worin der Nicht-RAR-Faktor keinen RAR-Agonisten zur Aktivierung erfordert. Während die Stimulation mit einem RAR-Agonisten im wesentlichen keine Wirkung auf die Expression solcher Gene haben kann, kann die Verabreichung mit AGN 193109 die Bildung von inaktiven Transkriptionskomplexen fördern, die AGN 193109/RAR/NCP umfassen. Entsprechend kann die Zugabe des negativen AGN 193109-Retionoidhormons die Transkription eines ansonsten Retinoid-unempfindlichen Gens abregulieren.
  • Der gleiche Mechanismus kann die Beobachtung erklären, daß AGN 193109 die Aktivität des Gewebetransglutaminase-(TGase)-Gens in HL-60-Zellen unterdrücken kann. Ein Retionoid-Reponse-Element, das aus drei kanonischen Retinoid-Halborten im Abstand von 5 und 7 Basenpaaren besteht, wurde in der Transkriptionskontrollregion dieses Gens identifiziert. Während TGase durch RXR-selektive Agonisten induziert werden kann, reagiert sie nicht auf RAR-selektive Agonisten. Das TGase-Retinoid-Response-Element wird durch ein RAR/RXR-Heterodimer gebunden (Davies et al., im Druck). Interessanterweise kann AGN 193109 die durch RXR-Agonisten induzierte TGase-Aktivität unterdrücken. Diese AGN 193109-vermittelte Unterdrückung kann durch die Fähigkeit dieses negativen Hormons zur Komplexierung von NCPs mit der RAR-Komponente des Heterodimers erklärt werden, wodurch die Aktivität des assoziierten RXR unterdrückt wird.
  • Wir haben ebenfalls Ergebnisse erhalten, die Schlußfolgerungen stützen, die identisch mit den in Beispiel 11 dargestellten sind, indem RAR-γ-VP-16 und Expressionskonstrukte und das ΔMTV-TREp-Luc-Reporterplasmid anstelle der RAR-γ-VP-16- und ER-RXR-α-Expressionskonstrukte in Kombination mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid eingesetzt wurden. Übereinstimmend mit den oben dargestellten Ergebnissen stellten wir fest, daß die RAR-γ-VP-16-Aktivität am ΔMTV-TREp-Luc-Reporter durch AGN 193109 inhibiert wurde. Deshalb unterdrückte AGN 193109 die RAR-γ-VP-16-Aktivität, wenn dieser chimäre Reporter direkt an ein Retinolsäurerezeptor-Response-Element gebunden war anstelle einer indirekten Bindung an ein Östrogen-Response-Element in der Promotorregion des Reporterplasmids. Diese Befunde zeigten, daß ein Test zur Identifizierung von Mitteln mit negativer Hormonaktivität nicht durch die Verwendung eines besonderen Reporterplasmids beschränkt werden braucht. Stattdessen beinhaltet das kritische Merkmal, das durch ein experimentelles System verkörpert wird, das zur Identifizierung von negativen Retionoidhormonen nützlich ist, die Detektion der Fähigkeit einer Verbindung, die Aktivität eines RAR zu unterdrücken, das manipuliert wurde, um eine konstitutive Transkriptionsaktivierungsdomäne zu enthalten.
  • Allgemein können negative Retinoidhormone als die Untergruppe von Retinoidverbindungen identifiziert werden, die innerhalb einer transfekzierten Zelle die Basisniveauexpression eines Reportergens unterdrücken, das transkriptionsmäßig auf die direkte oder indirekte Bindung durch einen Retinoidrezeptor oder einen chimären Rezeptor reagiert, der wenigstens die Domänen des Retinoidrepeztors einschließt, die sich C-terminal zur DNA-Bindungsdomäne dieses Rezeptors befinden. Dieser Ansatz wurde für ein Durchmusterungsverfahren angepaßt, das nützlich zur Identifizierung von negativen Retinoidhormonen ist. In den verschiedenen Ausführungsformen des erfundenen Durchmusterungsverfahrens ist die Struktur des Rezeptors, für den ein negatives Hormon gesucht wird, variabel. Insbesondere kann der Retinoidrezeptor entweder vom RAR- oder RXR-Untertyp sein. Der Rezeptor kann gegebenenfalls manipuliert werden, um eine konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne einzuschließen. Der zur Durchmusterung auf negative Hormone verwendete Retinoidrezeptor enthält gegebenenfalls eine heterologe DNA-Bindungsdomäne als Ersatz für die DNA-Bindungsdomäne, die endogen für den nativen Rezeptor ist. Wenn jedoch ein zweiter Rezeptor im Durchmusterungsverfahren verwendet wird, und wenn der zweite Rezeptor mit dem Retinoidrezeptor dimerisieren kann, für den ein negatives Hormon gesucht wird, dann braucht dieser Retinoidrezeptor keine DNA-Bindungsdomäne erfordern, weil er mit der Transkriptionskontrollregion des Reportergens indirekt durch Dimerisierung mit dem zweiten Rezeptor verbunden werden kann, der selbst an die Transkriptionskontrollregion gebunden ist.
  • In der Durchführung des Durchmusterungsverfahrens wird die Fähigkeit einer Verbindung zur Unterdrückung der Basisexpression eines Reporters typischerweise in einem in-vitro-Test gemessen. Die Basisexpression stellt das Grundlinienniveau der Reporterexpression in transfizierten Zellen unter Bedingungen dar, unter denen kein exogen zugegebener Retinoidagonist vorhanden ist. Gegebenenfalls können Schritte unternommen werden, um endogene Retinoidliganden aus der Umgebung der transfizierten Zellen über Verfahren wie Aktivkohleextraktion des Serums zu entfernen, das zur Kultivierung der Zellen in vitro verwendet wird.
  • Beispiele für Reportergene, die nützlich im Zusammenhang mit dem Durchmusterungsverfahren sind, schließen diejenigen ein, die Luciferase, beta-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase oder Zelloberflächenantigene codieren, die durch immunochemische Mittel detektiert werden können. In der Praxis wird die Natur des Reportergens als nicht kritisch für die Durchführbarkeit des Verfahrens erwartet. Jedoch muß die regulatorische Transkriptionsregion des Reporterkonstrukts ein oder mehrere cis-regulatorische Elemente einschließen, die Ziele für Transfektionsfaktoren sind, für die negative Hormone gesucht werden. Falls man zum Beispiel RAR-negative Hormone zu identifizieren wünscht, dann könnte die regulatorische Transkriptionsregion des Reporterkonstrukts ein cis-regulatorische Element enthalten, das durch ein RAR-haltiges Protein gebunden werden kann. In diesem Beispiel sollte es eine Übereinstimmung zwischen der DNA-Bindungsdomäne des RAR und dem cis-regulatorischen Element der regulatorischen Transkriptionsregion des Reporterkonstrukts geben. Falls somit ein chimäres RAR mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne und einer DNA-Bindungsdomäne, die cis-regulatorische Östrogen-reaktive Elemente binden kann, im Durchmusterungsverfahren eingesetzt wird, dann sollte die regulatorische Transkriptionsregion des Reporterkonstrukts ein Östrogen-reaktives Element enthalten.
  • Beispiele für cis-regulatorische Elemente, die direkt Retinoidrezeptoren (RAREs) binden, die nützlich im Zusammenhang mit dem Reporter-Assay sind, werden von Mangelsdorf et al. offenbart, The Retinoid Receptors, The Retionoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2. Auflage, Hrsg. Sporn et al., Raven Press Ltd., New York (1994), dessen Offenbarung oben durch Verweis eingeführt wurde. Beispiele für cis-regulatorische Elemente, die indirekt chimäre Rezeptoren binden, schließen DNA-Bindungsorte für jedes DNA-Bindungsprotein ein, für das die DNA-Bindungsdomäne des Proteins in einen chimären Rezeptor eingeführt werden kann, der aus dieser DNA-Bindungsdomäne besteht, die an einen Retinoidrezeptor gebunden ist. Spezifische Beispiele für heterologe DNA-Bindungsdomänen, die in chimäre Rezeptoren eingebaut werden können und die heterologe cis-regulatorische Elemente erkennen werden, schließen diejenigen ein, die Östrogen-reaktive Elemente erkennen. Deshalb braucht der Retinoidrezeptor-Anteil eines chimären Rezeptors, der nützlich im Zusammenhang mit dem Durchmusterungsverfahren ist, nicht die DNA-Bindung des Retinoidrezeptors enthalten, sondern muß zumindest die Ligandenbindungsdomäne des Retinoidrezeptors enthalten.
  • Ein weiteres Beispiel für indirekte Retinoidrezeptorbindung an das cis-regulatorische Element schließt die Verwendung eines Proteins ein, das das cis-regulatorische Element binden und mit einem Retinoidrezeptor dimerisieren kann. In diesem Fall assoziiert der Retinoidrezeptor mit dem cis-regulatorischen Element nur durch Assoziation mit dem für die DNA-Bindung verantwortlichen Protein. Ein Beispiel für ein solches System würde die Verwendung eines Fusionsproteins einschließen, das aus einer heterologen DNA-Bindungsdomäne besteht, die an einen RXR fusioniert ist, der zumindest die Domäne des RXR enthält, die für die Dimerisierung mit RARs verantwortlich ist. Gleichzeitig eingeführte RARs können mit einem solchen Fusionsprotein dimerisieren, das an das cis-regulatorische Element gebunden ist. Wir sehen voraus, daß jedes ein cis-regulatorisches Element bindende Protein, das mit RARs dimerisiert, um zu einer indirekten Assoziierung des RAR mit dem cis-regulatorischen Element zu führen, ebenfalls zur Verwendung mit dem negativen Hormon-Durchmusterungsverfahren geeignet sein wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Durchmusterungsverfahrens werden negative Retinoidhormone als diejenigen Retinoide identifiziert, die die Basisexpression eines manipulierten RAR-Transkriptionsfaktors mit erhöhter Basisaktivität unterdrücken. Obwohl es nicht wesentlich zur Durchführung des Durchmusterungsverfahrens ist, schloß der im folgenden Beispiel eingesetzte manipulierte RAR eine konstitutive Transkriptionsaktivierungsdomäne ein. Die Verwendung dieses chimären Rezeptors lieferte vorteilhaft ein Mittel, durch das die Basisexpression eines Reportergens in Abwesenheit von Retinoid erhöht werden konnte. Obwohl wir eine transiente Transfektion in den oben ausführlich dargestellten Verfahren eingesetzt haben, wären auch stabil transfizierte Zellinien, die konstitutiv den chimären Rezeptor exprimieren, nützlich im Zusammenhang mit dem Durchmusterungsverfahren.
  • Wie im folgenden Beispiel offenbart wird, war ein chimärer Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne heterodimerisierbar mit einem zweiten Rezeptor, der manipuliert wurde, um eine DNA-Bindungsdomäne zu enthalten, die spezifisch für ein auf Östrogen reagierendes cis-regulatorische Element ist. In diesem Fall assoziiert der chimäre Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne mit der cis-regulatorischen Region, die die Reportergenexpression kontrolliert, indirekt über Bindung an einen zweiten Rezeptor, der eine DNA-Zielsequenz bindet. Insbesondere wurde der zweite Rezeptor manipuliert, um eine DNA-Bindungsdomäne zu enthalten, die ein auf Östrogen reagierendes Element erkennt. Vorteilhaft reagierte des Reportergen mit einem auf Östrogen reagierenden Element in der Stromaufwärts-Promotorregion nicht auf Retinoidagonisten in Abwesenheit des transfizierten chimären Rezeptors mit der konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne. Entsprechend wurde die gesamte Reportergenaktivität den transfizierten Rezeptoren zugewiesen. Die Kombinationsverwendung aus der DNA-Bindungsdomäne des auf Östrogen reagierenden Elements und dem cis-regulatorischen Element des auf Östrogen reagierenden Elements sollen allein veranschaulichend sein. Die Durchschnittsfachleute werden erkennen, daß andere Kombinationen aus manipulierten Rezeptoren mit Spezifität für nicht-RARE cis-regulatorische Elemente ebenfalls nützlich in der Durchführung des erfundenen Durchmusterungsverfahrens sein werden.
  • Zellen, die im Zusammenhang mit dem Durchmusterungsverfahren nützlich sind, werden eukaryontische Zellen sein, die transfiziert werden können. Die Zellen können tierische Zellen sein, wie humane, Primaten- oder Nagetierzellen. Wir haben sehr gute Ergebnisse unter Verwendung von CV-1-Zellen erreicht, aber erwarten vernünftigerweise, daß andere kultivierte Zellinien ebenfalls erfolgreich verwendet werden könnten. Jedes einer Anzahl herkömmlicher fachbekannter Transfektionsverfahren kann zur Einführung eines Expressionskonstrukts verwendet werden, das den chimären Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne codiert.
  • Die konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne wird aus einer Anzahl von Aminosäuren bestehen, die wahrscheinlich einen insgesamt sauren Charakter haben werden, wie er durch eine negative Ladung unter neutralen pH-Bedingungen dargestellt wird. Zum Beispiel kann die konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne eine Aminosäuresequenz aufweisen, die ebenfalls in viralen Transkriptionsfaktoren gefunden wird. Ein Beispiel für einen viralen Transkriptionsfaktor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne ist das Herpes simplex-Virus 16. Jedoch wären auch andere virale oder synthetische Transkriptionsaktivatordomänen nützlich in der Konstruktion von Expressionskonstrukten, die den chimären Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne codieren.
  • Wie nachfolgend beschrieben wird, haben wir ein verallgemeinertes Durchmusterungsverfahren entwickelt, das nützlich zur Identifizierung von negativen Retinoidhormonen ist. Dieses Durchmusterungsverfahren stellt ein Mittel zur Unterscheidung von einfachen Antagonisten gegenüber negativen Hormonen bereit. Tabelle 12 führt mehrere Retinoidverbindungen auf, die hochwirksame Affinität für RAR-γ aufweisen, jedoch mit Ausnahme von ATRA diesen Rezeptor in einem transienten Kotransfektions-Transaktivierungs-Test nicht aktivierten. Wir haben deshalb diese Verbindungen zur Bestimmung untersucht, welche davon RAR-γ-Antagonisten waren und welche von diesen Antagonisten, falls überhaupt, eine negative Hormonaktivität aufwiesen.
  • Beispiel 12 beschreibt das zur Identifizierung von Retinoidverbindungen, die Antagonisten waren, verwendete Verfahren und die Untergruppe von Antagonisten, die eine negative Hormonaktivität aufwiesen.
  • Beispiel 12
  • Test auf negative Retinoidhormone
  • 4 × 104 CV-1-Zellen wurden durch das Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahren, beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) unter Verwendung von 0,5 μg ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und 0,1 μg ER-RAR-γ (Graupner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) chimärem Expressionsplasmid transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen mit PBS gespült und mit DMEM (Gibco-BRL) gefüttert, das 10% mit Aktivkohle extrahiertes FBS (Gemini Bio-Products) enthielt. Die Zellen wurden mit 10–8 M ATRA in Ethanol oder mit Ethanol allein behandelt. Zusätzlich wurden ATRA-behandelte Zellen mit 10–9, 10–8, 10–7 oder 10–6 M der in Tabelle 12 aufgeführten Verbindungen behandelt. Nach 18 Stunden wurden die Zellen in PBS gespült und in 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT und 2 mM EDTA lysiert. Luciferase-Aktivitäten wurden wie von de Wet et al. beschrieben gemessen, Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987). Tabelle 12
    Figure 00760001
    • a Relative Affinität (Kd) bestimmt durch Konkurrenz der 3H-ATRA-Bindung an Baculovirus-exprimiertes RAR-γ und Anwendung der Cheng-Prussof-Gleichung
    • b EC50 gemessen in CV-1-Zellen, die mit ΔMTV-TREp-Luc und RS-RAR-γ kotransfiziert waren. "kA" bedeutet keine Aktivität.
  • Wie durch die teilweise in 7 und in Tabelle 12 dargestellten Ergebnisse gezeigt wird, waren alle in Tabelle 12 aufgeführten Verbindungen, mit Ausnahme von ATRA, Retinoidantagonisten an RAR-γ.
  • Die in Tabelle 12 identifizierten RAR-γ-Antagonisten wurden als nächstes zur Bestimmung durchmustert, ob sie auch negative Retinoidhormone waren, falls überhaupt. 4 × 104 CV-1-Zellen wurden gemäß dem Calciumphosphat-Verfahren, beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989), unter Verwendung von 0,5 μg ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und 0,1 μg ER-RXR-α (Graupner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) und 0,2 μg RAR-γy-VP-16 (Nagpal et al., EMBO J. 12: 2349 (1993)) chimären Expressionsplasmiden transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen mit PBS gespült und mit DMEM (Gibco-BRL) gefüttert, das 10% mit Aktivkohle extrahiertes FBS (Gemini Bio-Products) enthielt. Die Zellen wurden mit 10–9, 10–8, 10–7 oder 10–6 M von jeder der in Tabelle 12 aufgeführten Verbindungen behandelt. Die Behandlung mit Ethanol als Träger allein diente als Negativkontrolle. Nach 18 Stunden wurden die Zellen in PBS gespült und in 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT und 2 mM EDTA lysiert. Luciferase-Aktivitäten wurden wie zuvor von de Wet et al. gemessen, Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987).
  • Wie in 8 gezeigt ist, konnten die Retinoidantagonisten aus Tabelle 12 in zwei Klassen aufgrund ihrer Wirkung auf die konstitutive Transkriptionsaktivierungsfunktion des RAR-γ-VP-16 chimären Retinoidrezeptor unterteilt werden. Eine Gruppe, die AGN 193174, AGN 193199 und AGN 193840 einschloß, unterdrückte nicht die RAR-γ-VP-16-Aktivität, obwohl sie ATRA-Antagonisten waren. Im Gegensatz wiesen AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 und AGN 193871 eine dosisabhängige Unterdrückung der konstitutiven RAR-γ-VP-16-Aktivität auf. Während die Verbindungen beider Gruppen RAR-γ-Antagonisten waren, wiesen daher nur diejenigen der zweiten Gruppe eine negative Hormonaktivität auf. Dieser Test unterscheidet vorteilhaft negative Retinoidhormone von einfachen Retinoidantagonisten.
  • Die vorhergehenden experimentellen Ergebnisse bewiesen, daß AGN 193109 die Kriterien erfüllt, die ein negatives Hormon definieren. Insbesondere zeigten die in Beispiel 11 dargestellten Ergebnisse, daß AGN 193109 die Fähigkeit hatte, eine inhibitorische Aktivität an den RARs selbst in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Retinoidliganden auszuüben. Als solche besaß diese Verbindung biologische Aktivitäten, die nicht von der Blockade der Wechselwirkung zwischen den RARs und Agonisten wie ATRA und AGN 191183 abhing. Diese Befunde führten uns zu der Schlußfolgerung, daß AGN 193109 die Wechselwirkungen zwischen RARs und NCPs stabilisierte. Wie in 9 schematisch dargestellt wird, existieren NCP/RAR/PCP-Wechselwirkungen in einem Gleichgewichtszustand. Ein Agonist dient zur Erhöhung der PCP-Wechselwirkungen und Verringerung der NCP-Wechselwirkungen, während ein inverser Agonist oder negatives Hormon NCP-Wechselwirkungen stabilisiert und PCP-Wechselwirkungen verringert. Wie zuvor angezeigt wurde, legten unsere experimentellen Ergebnisse nahe, daß die intrazelluläre Verfügbarkeit von NCP für andere Rezeptoren durch AGN 193109-Verabreichung moduliert werden kann. Insbesondere fanden wir, daß AGN 193109 die Komplexierung von NCP mit RARs fördern kann, wodurch das intrazelluläre Reservoir von NCP reduziert wird, das zur Wechselwirkung mit anderen Transkriptionsfaktoren als den RARs verfügbar ist.
  • Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von AGN 193109 auf die Agonisten-vermittelte Inhibierung der AP-1-abhängigen Genexpression. In Endocr. Rev. 14: 651 (1993) offenbarte Pfhal, daß Retinoidagonisten die Genexpression durch einen Mechanismus abregulieren können, der die Inhibierung von AP-1-Aktivität beinhaltet. Wir postulierten, daß AGN 193109 einen von zwei Effekten aufweisen könnte, wenn es in Kombination mit einem Retinoidagonisten in einem Modellsystem verwendet wird, das zur Messung von AP-1-Aktivität entwickelt wurde. Zunächst könnte AGN 193109 merklich der Wirkung des Agonisten entgegengewirkt haben, wodurch die Agonisten-abhängige Inhibierung der AP-1-Aktivität aufgehoben wird. Alternativ könnte AGN 193109 die Aktivität des Agonisten gesteigert haben, wodurch die Agonisten-abhängige Inhibierung der AP-1-Aktivität erhöht wird.
  • Beispiel 13 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoidagonisten potenzierte. Wie nachfolgend offenbart wird, inhibierte der AGN 191183-Retinoidagonist schwach die AP-1-abhängige Genexpression. Die Kombination aus AGN 193109 und dem Retinoidagonisten inhibierte stark die AP-1-abhängige Genexpression. Als solches hatte AGN 193109 im wesentlichen keine Anti-AP-1-Aktivität.
  • Beispiel 13
  • AGN 193109 potenziert die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoidagonisten
  • HeLa-Zellen wurden mit 1 μg des Str-AP1-CAT-Reportergenkonstrukts und 0,2 μg von Plasmid pRS-hRARα, beschrieben von Giguere et al., Nature 33: 624 (1987), unter Verwendung von LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Inc.) transfiziert. Str-AP1-CAT wurde durch Klonieren eines DNA-Fragments, das den Positionen –84 bis +1 des Stromelysin-1-Promotors aus Ratte entspricht (Matrisian et al., Mol. Cell. Biol. 6: 1679 (1986)), zwischen den HindII-BamHI-Orten von pBLCAT3 (Luckow et al., Nucl. Acids Res. 15: 5490 (1987)) hergestellt. Diese Sequenz des Stromelysin-1-Promotors enthält ein AP1-Motiv als einziges Verstärkerelement (Nicholson et al., EMBO J. 9: 4443 (1990)). Die Promotorsequenz wurde durch Verschmelzen von zwei synthetischen Oligonukleotiden mit den folgenden Sequenzen hergestellt: 5'-AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGGGTGACT CTGCAAATACTGCCACTCTATAAAAGTTGGGCTCAGAAAGGTGGACCTCGAGGATCC AG-3' (SEQ ID NO: 2) und 5'-CTGGATCCTCGAGGTCCACCTTTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATTTGCA GAGTCACCCGCAAACTGACTCATAATTGCTTCCATAAGCTTCT-3' (SEQ ID NO: 3). Verfahren, die die Transfektion, Behandlung mit geeigneten Verbindungen und Messung der CAT-Aktivität beinhalten, wurden wie von Nagpal et al. beschrieben durchgeführt, J. Biol. Chem. 270: 923 (1995), dessen Offenbarung hier durch Verweis eingeführt wird.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten an, daß AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität des Retinoidagonisten AGN 191183 potenzierte. Insbesondere inhibierte AGN 191183 im Konzentrationsbereich von 10–12 bis 10–10 M die TPA-induzierte Str-AP1-CRT-Expression nicht. Behandlung mit AGN 193109 im Konzentrationsbereich von 10–10 bis 10–8 M inhibierte die AP-1-vermittelte Reporteraktivität nicht wesentlich. Jedoch zeigten die in 10 dargestellten Ergebnisse an, daß die Stimulierung der Transfektanten mit der Kombination aus AGN 193109 (10–8 M) und AGN 191183 im Konzentrationsbereich von 10–12 bis 10–10 M wesentlich die TPA-induzierte Str-AP1-CAT-Expression um einen Betrag von 12 bis 21% wesentlich inhibierte. Deshalb potenzierte AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität von AGN 191183 unter Bedingungen, bei denen dieser Retinoidagonist gewöhnlich die AP-1-Aktivität nicht hemmte.
  • Wir argumentierten, daß AGN 193109 die Agonisten-vermittelte Unterdrückung von AP-1-Aktivität durch einen Mechanismus potenzierte, der wahrscheinlich eine AGN 193109-abhängige Komplexierung von NCPs an RARs beinhaltete. RARs gehören zu einer Superfamilie von Kernrezeptoren, die ebenfalls Rezeptoren für 1,25-Dihydroxyvitamin D3, Glukokortikoid, Schilddrüsenhormon, Östrogen und Progesteron einschließt. Es war eine vernünftige Annahme, daß die Fähigkeit zur Bindung von NCPs von unterschiedlichen Vertretern der Kernrezeptor-Superfamilie geteilt werden kann. Dies führte uns zur Spekulation, daß AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität eines oder mehrerer der Liganden potenzieren könnte, die mit dieser Superfamilie von Kernrezeptoren wechselwirkt.
  • Die im vorhergehenden Beispiel dargestellten Ergebnisse zeigten deutlich, daß AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoidagonisten potenzierte. Insbesondere verringerte AGN 193109 die Grenzwertdosis, bei der die Anti-AP-1-Aktivität von AGN 191183 detektiert werden konnte. Da AGN 193109 im wesentlichen keine Anti-AP-1-Aktivität als solches hat, war seine Wirkung auf Kernrezeptor-Agonisten synergistisch. Wir stellten ebenfalls fest, daß das negative AGN 193109-Hormon die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3, dem natürlichen Liganden für den Vitamin D3-Rezeptor, potenzierte.
  • Der beobachtete Synergismus zwischen AGN 193109 und AGN 191183 im vorhergehenden Beispiel implizierte notwendigerweise, daß die Anti-AP-1-Aktivität des Retinoidagonisten und die AGN 193109-vermittelte Potenzierung dieser Aktivität aus unterschiedlichen Mechanismen resultieren müssen. Falls die Mechanismen der Wirkung der zwei Mittel identisch wäre, dann folgt, daß die Wirksamkeit der Kombination aus AGN 193109 und dem Agonisten additiv sein würde. Stattdessen wurde gezeigt, daß die Kombination wirksamer als jedes Mittel allein war, eine Wirkung, die man nicht vor diesem Befund vorhergesagt hätte.
  • Signifikanterweise wurde die AGN 193109-vermittelte Potenzierung des RAR-Agonisten unter Verwendung eines ca. 100-fachen molaren Überschusses von AGN 193109 gegenüber derjenigen des Retinoidagonisten durchgeführt. Entsprechend sollte die Mehrheit der RARs durch AGN 193109 gebunden sein, was zu sehr wenigen RARs führt, die zur Agonistenbindung verfügbar sind. Trotz dieser Tatsache war die Population von RARs, die nicht durch AGN 193109 gebunden waren, in der Lage, Retinoidagonisten zu binden und kräftig eine Agonisten-abhängige Reaktion kräftig zu stimulieren, die als Inhibierung der Reportergenexpression meßbar war. Somit legen unsere Daten eine mögliche Heterogenität der RARs nahe, die durch AGN 193109 induziert werden.
  • Die negative Hormonaktivität von AGN 193109, die dessen Fähigkeit zur Förderung der Wechselwirkung von RARs und NCPs zugewiesen wird, lieferte eine Basis zum Verständnis des Synergismus zwischen AGN 193109 und Retinoidagonisten. Unsere Ergebnisse waren vollständig übereinstimmend mit einem Modell, in dem eine AGN 193109-Behandlung von Zellen die Bindung von RARs und NCPs fördert, wodurch die Anzahl von freien NCPs und freien RARs innerhalb der Zelle reduziert wird. Dies führt zur Erzeugung von zwei Populationen von RARs, die funktionell unterschiedlich sind. Die erste Population wird durch RARs dargestellt, die mit NCPs assoziiert sind. Solche AGN 193109/RAR/NCP-Komplexe können nicht durch Retinoidagonisten aktiviert werden. Die zweite Population besteht aus RARs, die nicht durch NCP gebunden sind und zur Wechselwirkung mit Agonisten verfügbar bleiben. Diese letztere Population wird als "RAR*" bezeichnet, um freie RARs in einer Umgebung anzuzeigen, die im wesentlichen von NCP entvölkert ist.
  • Die RAR*s besitzen verringerte Wahrscheinlichkeiten der Assoziierung mit NCP durch Gleichgewichtsbindung und besitzen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Retinoidagonisten, zum Beispiel meßbar als Anti-AP-1-Aktivität. Dies ist so, weil das Reservoir an PCP nicht erschöpft ist, während das intrazelluläre Reservoir an NCP aufgrund der AGN 193109-Verabreichung erschöpft ist. Entsprechend können freie RAR*s einen Retinoidagonisten binden und mit PCP-Faktoren in einer Umgebung wechselwirken, die im wesentlich von NCP entvölkert ist. Die Fähigkeit von AGN 193109 zur Erhöhung der Empfindlichkeit anderer Kernrezeptoren gegenüber ihren jeweiligen Agonisten kann der Fähigkeit dieser unterschiedlichen Kernrezeptoren zugewiesen werden, mit den gleichen NCPs wechselzuwirken, die mit AGN 193109/RAR- Komplexen wechselwirken. Dieses Modell der AGN 193109-vermittelten Modulierung von NCP-Verfügbarkeit für Mitglieder der Kernrezeptorfamilie ist schematisch in 11 dargestellt.
  • Dieses mechanistische Modell führte uns zu der Vorhersage, daß AGN 193109 die Aktivitäten von anderen Kernrezeptorliganden als Retinoidagonisten modulieren könnte. Wie im folgenden Beispiel veranschaulicht wird, bestätigten wir, daß AGN 193109 die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in einem in-vitro-Transaktivierungstest potenzierte.
  • Beispiel 14 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in einem Transaktivierungstest steigerte.
  • Beispiel 14
  • AGN 193109 potenziert die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Aktivität
  • HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des kationischen Liposom-vermittelten Transfektionsverfahrens transfiziert, das beschrieben wird von Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987). 5 × 104 Zellen wurden in Mehrfachvertiefungsplatten mit 12 Vertiefungen ausplattiert und in mit 10% FBS ergänztem DMEM kultiviert. Die Zellen wurden in serumfreien Medium unter Verwendung von 2 μg/Vertiefung von LIPOFECTAMINE-Reagens (Life Technologies, Inc.) mit 0,7 μg des Reporterplasmids MTV-VDRE-Luc, das zwei Kopien des 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Response-Elements 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3' (SEQ ID NO: 4) aus dem Osteopontingen der Maus enthält (Ferrara et al., J. Biol. Chem. 269: 2971 (1994)), ligiert in das Reporterplasmid ΔMTV-Luc (Heyman et al., Cell 68: 397 (1992)), und 0,3 μg des Plasmids pGEM3Z (Pharmacia, Inc.) als Träger-DNA kotransfiziert, um die Endkonzentration von DNA auf 1,0 μg pro Vertiefung zu bringen. Nach sechs Stunden Transfektion wurden die Zellen mit Wachstumsmedium gefüttert, das mit Aktivkohle extrahiertes FBS in einer Endkonzentration von 10% enthielt. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Träger allein (Ethanol) oder AGN 193109 in Ethanol mit einer Endkonzentration von entweder 10–8 oder 10–7 M behandelt. Sechs Stunden später wurde 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Ethanol auf eine Endkonzentration von 10–10 bis 10–7 M hinzugegeben. 18 Stunden nach der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Behandlung wurden die Zellen lysiert und geerntet. Die Luciferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben gemessen. Dieses experimentelle System erlaubte ein zweckmäßiges Verfahren zur Überwachung und Quantifizierung der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-abhängigen Genexpression.
  • Die in 12 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß bei Vergleich mit dem Ergebnis, das unter Verwendung von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 allein erhalten wurde, das mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 zusammen verabreichte AGN 193109 die Dosis-Reaktions-Kurve zur Linken verschob. Dies bestätigte, daß AGN 193109 die Wirksamkeit von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 im In-vitro-Transaktivierungstest potenzierte. Insbesondere veranschaulicht 12 graphisch, daß eine AGN 193109-Konzentration von so niedrig wie 10–100 nM das 1,25-Dihydroxyvitamin D3 ca. 10-fach aktiver machte. Während eine Konzentration von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 von 10–8 M erforderlich war, um eine Luciferase-Expression von ca. 2000 rlu zu erzeugen, war nur 1/10 so viel 1,25-Dihydroxyvitamin D3 erforderlich, um die gleiche Luciferaseleistung zu erzeugen, wenn das Vitamin zusammen mit AGN 193109 bei einer Konzentration von 10–8 bis 10–7 M gleichzeitig verabreicht wurde. Obwohl dies nicht im Diagramm in 12 gezeigt ist, wurden im wesentlichen identische Ergebnisse unter Verwendung von AGN 193109-Konzentrationen von 10–9 M und 10–8 M erhalten. Somit reduziert die Koverabreichung mit AGN 193109 wesentlich die Menge von 1,25-Dihydroxyvitamin D3, die zur Erzeugung einer ähnlichen Wirkung in Abwesenheit des negativen Hormons erforderlich war.
  • Interessanterweise gab es eine gleichzeitige Abnahme der Fähigkeit von AGN 193109 zur Potenzierung der Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3, wenn das obige Verfahren mit Kotransfektion eines Vitamin D-Rezeptor-(VDR)-Expressionsplasmids wiederholt wurde. Wir interpretierten dieses Ergebnis als Hinweis, daß eine Überexpression von VDRs die Fähigkeit von AGN 193109 zur Potenzierung der Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 beeinflussen könnte. Deshalb kann die intrazelluläre Konzentration eines Ligandenrezeptors, die sich in einer gewebespezifischen Weise unterscheiden kann, die Fähigkeit von AGN 193109 zur Potenzierung der Aktivität eines Liganden beeinflussen, der den Rezeptor bindet. Dies stimmte erneut überein mit einem Modell, in dem titrierbare NCPs zur Regulierung der Vitamin D3-Reaktion beitrug, und stützte das oben dargestellte Modell.
  • Wie im folgenden Beispiel veranschaulicht wird, bestätigten wir auch, daß AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 potenzierte. Unser Modell zur Aktivität der AGN 193109-Wirkung erläutert diese Beobachtung durch Hervorrufung, daß NCPs kräftig mit RARs in Gegenwart dieses Wirkstoffs assoziieren. Endogene Vitamin D-Rezeptoren, die in HeLa-Zellen vorhanden sind, wurden wahrscheinlich empfindlicher gegenüber dem 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Liganden gemacht, mit dem Ergebnis der Steigerung der Fähigkeit dieses Liganden zur Inhibierung der Expression aus dem Str-AP1-CAT-Reporter.
  • Beispiel 15 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 potenzierte.
  • Beispiel 15
  • AGN 193109 potenziert die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3
  • HeLa-Zellen wurden mit 1 μg Str-AP1-CAT unter Verwendung von LIPOFECTAMINE gemäß dem von Nagpal et al. beschriebenen Verfahren transfiziert, J. Biol. Chem. 270: 923 (1995). Die transfizierten Zellen wurden mit AGN 193109 allein (10–9 bis 10–7 M), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 allein (10–12 bis 10–7 M) oder 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (10–12 bis 10–7 M) in Gegenwart von 10–8 M AGN 193109 behandelt.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten, daß AGN 193109 die Fähigkeit von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 zur Hemmung von TPA-induzierter AP-1-Aktivität potenzierte. Bei alleiniger Verwendung im Konzentrationsbereich von 10–9 bis 10–7 M besaß AGN 193109 keine nachweisbare Anti-AP-1-Aktivität. Die in 13 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß 1,25-Dihydroxyvitamin D3 die TPA-stimulierte Aktivität nur im Konzentrationsbereich von 10–8 und 10–7 M unterdrückte. Die Analyse der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-vermittelten Repression der TPA-stimulierten CAT-Aktivität in Gegenwart von 10–8 M AGN 193109 zeigte, daß Anti-AP-1-Aktivität bei 10–10 und 10–9 M 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und eine Zunahme der Aktivität bei 10–8 und 10–7 M Dosen im Vergleich zu der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Behandlung allein detektierbar war. Diese AGN 193109-abhängige Modulation der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-vermittelten Anti-AP-1-Aktivität war übereinstimmend mit unserem Modell, in dem die NCP-Komplexierung an RARs das NCP unverfügbar zur Wechselwirkung mit anderen Vertretern der Kernrezeptorfamilie machte. Entsprechend wurden die Rezeptoren empfindlicher für die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Behandlung gemacht.
  • Die der RAR-vermittelten Transaktivierung und Anti-AP-1-Aktivität zugrundeliegenden Mechanismen sind wahrscheinlich verschieden. Diese Schlußfolgerung beruhte auf unserer Beobachtung, daß hohe Dosen von AGN 193109 die Transaktivierung ohne substantielle Inhibierung von Anti-AP-1-Aktivität hemmten. Wir wollten deshalb einen weiteren Hinweis zur Stützung unseres Modells zur RAR*-Bildung gewinnen, die durch AGN 193109-Behandlung vermittelt wird. Um dies zu erreichen, untersuchten wir, ob AGN 193109 die Aktivität des RAR-spezifischen Agonisten AGN 191183 in einem In-vitro-Transaktivierungstest potenzieren konnte.
  • Beispiel 16 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die Aktivität des RAR-spezifischen Agonisten AGN 191183 potenzierte. Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten, daß unter besonderen Umständen AGN 193109 die Wirksamkeit des RAR-spezifischen Retinoids steigerte, und lieferten einen starken Hinweis, daß AGN 193109 die RAR*-Bildung fördert.
  • Beispiel 16
  • Potenzierung der Retionoidwirksamkeit durch AGN 193109-Koverabreichung
  • HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des von Felgner et al. beschriebenen kationischen Liposom-vermittelten Transfektionsverfahrens transfiziert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987). 5 × 104 Zellen wurden in Mehrfachvertiefungsplatten mit 12 Vertiefungen ausplattiert und in mit 10% FBS ergänztem DMEM kultiviert. Die Zellen wurden in serumfreies Medium unter Verwendung von LIPOFECTAMINE-Reagens (2 μg/Vertiefung, Life Technologies, Inc.) mit 0,7 μg des Reporterplasmids MTV-TREp-Luc, das zwei Kopien des TREpal-Response-Elements 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3' (SEQ ID NO: 5) enthält, inseriert in das Reporterplasmid ΔMTV- Luc (Heyman et al., Cell 68: 397 (1992)), und 0,1 μg des RAR-γ-Expressionsplasmids pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) kontransfiziert. Nach 6 Stunden Transfektion wurden die Zellen mit Wachstumsmedium gefüttert, das mit Aktivkohle extrahiertes FBS in einer Endkonzentration von 10% enthielt. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Träger allein (Ethanol) oder AGN 193109 in Ethanol mit einer Endkonzentration von 10–11 bis 10–8 M behandelt. 6 Stunden später wurde AGN 191183 in Ethanol auf eine Endkonzentration von entweder 0, 10–10 oder 10–9 M hinzugegeben. Die Zellen wurden nach 18 Stunden der AGN 191183-Behandlung geerntet, und die Luciferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben gemessen.
  • Vorläufige Experimente zeigten, daß 10–9 M AGN 193109 relativ ineffektiv in der Inhibierung der Reaktion auf 10–8 M AGN 191183 in HeLa-Zellen war. Dies war im Gegensatz zur Fähigkeit von 10–9 M AGN 193109 zur Inhibierung von 10–8 M ATRA in CV-1-Zellen (2).
  • Die in 14 dargestellten Ergebnisse stützten die Vorhersage, daß AGN 193109 die Bildung von RAR* stimuliert. Übereinstimmend mit unserer Charakterisierung der Antagonist- und negativen Hormon-Aktivitäten von AGN 193109 führte die Behandlung mit AGN 193109 zu einer zweiphasigen Dosis-Reaktions-Kurve. Die niedrigsten Dosen von AGN 193109 (10–11 und 10–10 M) führten zu einer Stimulierung der Luciferase-Aktivität gegenüber derjenigen von AGN 191183 allein. Diese Wirkung legt nahe, daß RAR*s durch AGN 193109 erzeugt werden. Überraschenderweise wurde dies ebenfalls für die AGN 193109-Behandlung allein beobachtet, was nahelegt, daß RAR*s auf einen endogenen Liganden reagieren können. AGN 191183 ist ein synthetischer Retinoidagonist und aktiviert wie ATRA die Transkription durch die RARs. Die Substitution von AGN 191183 für ATRA in Beispiel 7 würde qualitativ ähnliche Ergebnisse ergeben (d.h. AGN 193109 würde der Wirkung von 10 nM AGN 191183 entgegenwirken). Beispiel 16 veranschaulicht, daß, obwohl AGN 193109 als ein Antagonist von RAR-Agonisten funktionieren kann, die Dosierungsbedingungen leicht identifiziert werden könnten, mit denen eine AGN 193109-Koverabreichung die durch einen RAR-Agonisten vermittelte Aktivierung potenziert. Es ist wichtig festzustellen, daß die in Beispiel 16 verwendeten Dosen der Verbindungen wesentlich geringer als die Dosen sind, die im in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren eingesetzt wurden. Wir schlugen vor, daß eine AGN 193109-Behandlung zu RAR-Heterogenität, RARs gegenüber RAR*s, führen könnte. Diese offensichtliche Heterogenität (d.h. Fähigkeit zur Potenzierung) scheint unterschiedliche Fenster in der Transaktivierung gegenüber der AP-1-Unterdrückung zu besitzen. Der Grund, daß die Kurven zweiphasig sind, ist der, daß bei zunehmenden Mengen von AGN 193109 proportional weniger RAR zur Bindung des Agonisten verfügbar ist. Dies scheint nicht der Fall für die AP-1-Unterdrückung zu sein, und wir konnten nur spekulieren, daß dieser Unterschied zwei unterschiedliche Mechanismen für die Transaktivierung und AP-1-Unterdrückung durch die gleichen Rezeptorspezies reflektieren muß.
  • Klinische Ergebnisse haben bestätigt, daß einige Retinoide nützlich zur Inhibierung des Wachstums von prämalignen und malignen zervikalen Läsionen sind. Exemplarische Untersuchungen, die diese Schlußfolgerung stützen, wurden von Graham et al., West. J. Med. 145: 192 (1986), von Lippman et al., J. Natl. Cancer Inst. 84: 241 (1992), und von Weiner et al., Invest. New Drugs 4: 241 (1986)) veröffentlicht.
  • Ähnliche Schlußfolgerungen werden durch die Ergebnisse von In-vitro-Untersuchungen gestützt, die kultivierte Zellen zur Quantifizierung der antiproliferativen Wirkungen von verschiedenen Retinoiden verwendeten. Insbesondere setzten Agarwal et al., Cancer Res. 51: 3982 (1991), die ECE16-1-Zellinie ein, um die frühen Stadien von zervikaler Dysplasie zu modulieren, und zeigten, daß Retinolsäure die vom epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) abhängige zelluläre Proliferation hemmen konnte.
  • Beispiel 17 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 der Aktivität des AGN 191183-Retinoidagonisten entgegenwirken kann, der die Proliferation der ECE16-1-Zellinie hemmte.
  • Beispiel 17
  • AGN 193109 wirkt der antiproliferativen Wirkung von Retionoiden in ECE16-1-Zellen entgegen
  • ECE16-1-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro cm2 in komplettes Medium geimpft, das DMEM:F12 (3:1), nichtessentielle Aminosäuren, 5% FBS, 5 μg/ml Transferrin, 2 nM 3,3',5-Triiodthyronin (Schilddrüsenhormon oder "T3"), 0,1 nM Choleratoxin, 2 mM L-Glutamin, 1,8 × 10–4 M Adenin und 10 ng/ml EGF enthielt. Man ließ die Zellen über Nacht an den Platten anhaften und wechselte dann zu definiertem Medium, das DMEM:F12 (3:1), 2 mM L-Glutamin, nichtessentielle Aminosäuren, 0,1% Rinderserumalbumin, 1,8 × 10–4 M Adenin, 5 μg/ml Transferrin, 2 nM T3, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 μg/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Gentamicin enthielt. Definiertes Medium (DM) wurde mit 10 ng/ml EGF ergänzt. EGF-behandelte Zellen erhielten 10 nM des AGN 191183-Retinoidagonisten in Kombination mit entweder 0, 0,1, 1,0, 10, 100 oder 1000 nM AGN 193109 oder 1000 nM AGN 193109 allein. Nach 3 Tagen Behandlung wurden die Zellen wie von Hembree et al. beschrieben geerntet, Cancer Res. 54: 3160 (1994), und die Zellzahlen wurden unter Verwendung eines COULTER-Zählers bestimmt.
  • Die in 15 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß sich ECE16-1-Zellen als Reaktion auf EGF vermehrten, aber nicht im definierten Medium allein. Dies bestätigte die Befunde, die von Adreatta-van Leyen et al., J. Cell. Physio. 160: 265 (1994), und von Hembree et al., Cancer Res. 54: 3160 (1994), veröffentlicht wurden. Die Zugabe von 10 nM AGN 191183 und 0 nM AGN 193109 inhibierte vollständig die EGF-vermittelte Proliferation. Daher war AGN 191183 ein hochwirksames antiproliferatives Retinoid. Die Erhöhung der AGN 193109-Konzentration von 0 auf 10 nM wirkt der AGN 191183-vermittelten Wachstumsinhibierung um etwa 50% entgegen. Ein 10-facher molarer Überschuß von AGN 193109 kehrte die antiproliferative Wirkung von AGN 191183 vollständig um. Die Behandlung von Zellen mit 1000 nM AGN 193109 allein hatte keine Wirkung auf die EGF-vermittelte Proliferationszunahme. Diese Ergebnisse bewiesen, daß AGN 193109 der antiproliferativen Wirkung eines Retinoids entgegenwirkte, aber im wesentlichen keine antiproliferative Aktivität als solches hatte, wenn es zur Behandlung von Zellen verwendet wurde, die zervikales Epithel darstellen, das empfindlich gegenüber Wachstumsinhibierung durch Retinoide wie AGN 191183 ist. Bemerkenswert gab es keinen Beweis, daß AGN 193109 die antiproliferative Aktivität des AGN 191183-Agonisten unter Verwendung des ECE16-1-Modellsystems potenzierte.
  • Im Gegensatz zum durch die ECE16-1-Zellinie dargestellten Modellsystem gibt es andere Beispiele, in denen die mit zervikaler Dysplasie assoziierte zelluläre Proliferation nicht durch Retinoidagonisten gehemmt werden kann. Zum Beispiel beschrieben Agarwal et al., Cancer Res. 54: 2108 (1994), die Verwendung von CaSki-Zellen als ein Modell für Zervixtumore, die nicht auf Retinoidtherapie ansprechen. Wie nachfolgend offenbart wird, hatte die Retinoidbehandlung anstelle der Inhibierung der Zellproliferation im wesentlichen keine Wirkung auf die Wachstumsrate von CaSki-Zellen. Das folgende Beispiel ist auf die Wirkung des negativen AGN 193109-Hormons auf die Proliferationsraten dieser Zellinie gerichtet. Die Ergebnisse bewiesen unerwartet, daß AGN 193109 die Proliferation von Zervixtumorzellen inhibieren kann, die nicht auf die antiproliferativen Wirkungen von Retinoidagonisten ansprechen.
  • Beispiel 18 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 das Wachstum einer Zervixtumorzellinie inhibierte, die nicht auf die antiproliferativen Wirkungen anderer Retinoide wie AGN 191183 ansprach. Signifikanterweise zeigte AGN 193109 antiproliferative Aktivität in Abwesenheit von zugegebenem Retinoid.
  • Beispiel 18
  • AGN 193109 inhibiert die Proliferationsrate der aus Zervixkarzinom stammenden CaSki-Zellinie
  • Wir untersuchten die Wirkung von EGF auf die CaSki-Zellproliferation, entweder allein oder in Kombination mit dem AGN 191183-Retinoidagonisten und/oder dem negativen AGN 193109-Hormon bei einer Konzentration von 10–6 M. Zellproliferationstests wurden wie oben für Untersuchungen beschrieben durchgeführt, die ECE16-1-Zellen beinhalteten. EGF wurde zu den Retinoid-behandelten Kulturen zum Erhalt einer Endkonzentration von 20 ng/ml gegeben. Die Zellen wurden mit AGN 191183 (10–10 bis 10–6 M) in Gegenwart oder Abwesenheit von 10–6 M AGN 193109 für insgesamt 3 Tage behandelt. Das Medium wurde jeden Tag gegen frisches Medium und nach Bedarf gegen jede der zwei Retinoidverbindungen ausgetauscht. Zellzahlen wurden unter Verwendung eines COULTER-Zählers wie oben beschrieben bestimmt.
  • Die in 16 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß CaSki-Zellen substantiell refraktär für die Wirkungen eines Retinoidagonisten waren, und das AGN 193109 eine antiproliferative Aktivität in Abwesenheit von zugegebenem Retinoid aufwies. Die Gegenwart von EGF im Kulturmedium stimulierte das CaSki-Zellwachstum. Diese Schlußfolgerung beruhte auf dem Vergleich des gestreiften Balkens, der kein AGN 191183 darstellt, und dem leeren Balken, der definiertes Wachstumsmedium ("DM") allein darstellt. Die AGN 191183-Behandlung hatte keine antiproliferative Aktivität auf die CaSki-Tumorzellinie. Wir ließen jede schwache Zunahme der zellulären Proliferationsrate unberücksichtigt, die mit dem Retinoidagonisten assoziiert war, weil eine 10000-fache Zunahme der Retinoidagonist-Konzentration mit einer nur ungefähr 20%igen Zunahme der Proliferationsrate verbunden war. Somit hatte der AGN 191183-Agonist im wesentlichen keine Wirkung auf die Proliferationsrate von CaSki-Zellen.
  • Die in 16 dargestellten Ergebnisse zeigten auch, daß AGN 193109 die Proliferation der zervikalen CaSki-Epithelzellinie hemmte. Diese Schlußfolgerung beruhte auf dem Vergleich der Messungen, die als schwarzer Balken "0" AGN 191183 und als gestreifter Balken "0" AGN 191183 erscheinen. Somit konnte AGN 193109 eine biologische Reaktion in Abwesenheit von zugegebenem Retinoidagonisten stimulieren, wenn es zur Behandlung von Zervixtumorzellen verwendet wurde, die nicht durch Retinoidagonisten wie AGN 191183 wachstumsgehemmt wurden.
  • Unser Befund, daß das negative AGN 193109-Hormon die zelluläre Proliferation hemmen konnte, stimmte mit einem Modell überein, in dem unkomplexierter RAR die Expression von Genen vermittelt, die für die Proliferation erforderlich sind. Während ein RAR-Agonist wie AGN 191183 im wesentlichen keine Wirkung hatte oder vielleicht die zelluläre Proliferation schwach förderte, hatte AGN 193109 eine antiproliferative Wirkung. Das negative AGN 193109-Hormon band wahrscheinlich RARs, wodurch die NCP-Assoziation gefördert und das Annehmen einer inaktiven Konformation durch die RARs verursacht wurde. Gemäß unserem Modell unterdrückte dies die Genaktivität, die positiv durch unkomplexierte RARs reguliert wurde. Diese Fähigkeit von AGN 193109 zur Abregulierung der Aktivität von unkomplexierten RARs resultierte wahrscheinlich aus seiner Fähigkeit zur Förderung der Assoziation von RARs und NCPs.
  • Die Durchschnittsfachleute werden einsehen, daß einige Retinoidagonisten zur Kontrolle der unerwünschten Konsequenzen von Zellwachstum nützlich sind, das der Netzhautablösung folgt. Nach Netzhautablösung entdifferenziert, wuchert und wandert das Netzhautpigmentepithel (RPE) in den Unternetzhautraum. Dieser Prozeß kann negativ den Erfolg chirurgischer Operationen beeinträchtigen, die auf die erneute Netzhautanbringung gerichtet sind. Campochiaro et al., Invest. Opthal. & Vis. Sci. 32: 65 (1991), haben gezeigt, daß RAR-Agonisten wie ATRA eine antiproliferative Wirkung auf das Wachstum von primären humanen RPE-Kulturen aufweisen. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß Retinoidagonisten das Auftreten von Netzhautablösung nach chirurgischer Netzhautwiederanheftung verringern (Fekrat et al., Opthalmology 102: 412 (1994)). Wie im folgenden Beispiel offenbart wird, analysierten wir die Fähigkeit des negativen AGN 193109-Hormons zur Unterdrückung des Wachstums im primären humanen RPE-Kulturen.
  • Beispiel 19 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die antiproliferative Wirkung eines Retinoidantagonisten in einer primären Kultur von humanem Netzhautpigmentepithel potenziert.
  • Beispiel 19
  • AGN 193109 potenziert die antiproliferative Aktivität von ATRA
  • Primäre Kulturen von humanem Netzhautpigmentepithel (RPE) wurden gemäß dem von Campochiaro et al. beschriebenen Verfahren eingerichtet, Invest. Opthal. & Vis. Sci. 32: 65 (1991). 5 × 104 Zellen wurden in 16 mm-Vertiefungen von Mehrfachvertiefungsplatten mit 24 Vertiefungen in DMEM (Gibco) ausplattiert, das 5% FBS enthielt. Die Zellen wurden zum Schein mit Ethanolträger allein, ATRA (10–10 bis 10–6 M) in Ethanol, AGN 193109 (10–10 bis 10–6 M) in Ethanol oder ATRA (10–10 bis 10–6 M) und 10–6 M AGN 193109 behandelt. Die Zellen wurden alle zwei Tage für insgesamt 5 Behandlungstage mit frischem Medium gefüttert, das die entsprechenden Konzentrationen dieser Verbindungen enthielt. Die Zellen wurden aus den Platten durch vorsichtige Verdauung mit Trypsin entfernt, und die Zellzahl wurde mit einem elektronischen Zellzähler gezählt.
  • Die in 17 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß AGN 193109 dramatisch die antiproliverative Aktivität von ATRA auf RPE-Zellen potenzierte. Die Behandlung von primären RPE-Zellen mit ATRA führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der RPE-Zellproliferation mit einer ca. 40%igen Abnahme bei 10–6 M ATRA relativ zu Kontrollkulturen. AGN 193109-Behandlung veränderte nicht substantiell die Wachstumsrate der RPE-Zellen bei jeder im Verfahren untersuchten Konzentration. Unerwartet hatte die Kombination aus ATRA (10–11 bis 10–6 M) und 10–6 M AGN 193109 eine stärkere antiproliferative Aktivität als ATRA allein. Somit potenzierte die gleichzeitige Behandlung mit AGN 193109 die antiproliferative Wirkung von ATRA. Insbesondere zeigten die in der Figur gezeigten Ergebnisse, daß die antiproliferative Wirkung von 10–8 M ATRA unter Verwendung von nur 10–10 M ATRA in Kombination mit 10–7 AGN 193109 erhältlich war. Somit steigerte das negative AGN 193109-Hormon vorteilhaft die antiproliferative Aktivität von ATRA um das ca. 100-fache.
  • In einem unabhängigen Experiment zeigte ein Vergleich der antiproliferativen Wirkung von ATRA (10–11 bis 10–6 M) mit derjenigen von ATRA und 10–6 M AGN 193109 erneut die scheinbare Zunahme der Empfindlichkeit von primären RPE-Zellen auf ATRA in Gegenwart von AGN 193109. In diesem System funktionierte AGN 193109 weder als Retinoidantagonist noch wies es eine antiproliferative Wirkung bei alleiniger Verwendung auf. Jedoch potenzierte die gleichzeitige Verabreichung von AGN 193109 die antiproliverative Aktivität des Retinoidagonisten.
  • AGN 193109 wurde auf seine Fähigkeit zur Potenzierung der antiproliferativen Wirkung von 13-cis-Rentinolsäure (13-cis-RA) in primären RPE-Kulturen unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen und Techniken zur Messung der RPE-Zellproliferation untersucht. Bemerkenswert ist 13-cis-RA klinisch signifikant. Insbesondere ist 13-cis-RA nützlich in der Behandlung verschiedener Krankheitszustände, die Akne (Peck et al., N. Engl. J. Med. 300: 329 (1977); Jones et al., Br. J. Dermatol. 108: 333 (1980)) und Schuppenzellkarzinom der Haut und Zervix einschließen, in Kombinationsbehandlung mit Interferon 2α (Lippman et al., J. Natl. Cancer Inst. 84: 241 (1992); Moore et al., Seminars in Hematology 31: 31 (1994)).
  • Die in 18 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß sowohl 13-cis-RA (10–12 bis 10–6 M) als auch ATRA (10–12 bis 10–6 M) wirksam das RPE-Zellwachstum hemmten. Bemerkenswert war das 13-cis-Isomer ca. zwei Größenordnungen weniger wirksam in diesem Test im Vergleich zu ATRA. Ähnlich zu den Ergebnissen, die unter Verwendung der Koverabreichung von AGN 193109 und ATRA erhalten wurden (oben), erhöhte die Koverabreichung von AGN 193109 (entweder 10–8 oder 10–6 M) mit 13-cis-RA (10–12 bis 10–6 M) dramatisch die Wirksamkeit von 13-cis-RA in der Vermittlung der Unterdrückung der RPE-Zellproliferation. Im Gegensatz zur Behandlung mit 13-cis-RA allein steigerte die Koverabreichung von AGN 193109 die Wirksamkeit von 13-cis-RA. Somit potenzierte AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von 13-cis-RA.
  • Als nächste untersuchten wir die Fähigkeit von AGN 193109 zur Potenzierung der Aktivitäten von anderen Kernrezeptorhormonen in primären RPE-Zellkulturen. Dexamethason, ein synthetischer Glukokortikoidrezeptoragonist, ist ein Vertreter einer Klasse von Verbindungen, die klinisch wegen ihrer hochwirksamen entzündungshemmenden und immunsuppressiven Eigenschaften verwendet werden. Schilddrüsenhormon (T3; 3,3',5'-Triiodthyronin) ist ein natürlicher Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonist, der primär zur Hormonersatztherapie in der Behandlung von Hypothyroidismus verwendet wird. Die Verfahren, die in diesen Experimenten verwendet wurden, waren identisch zu denjenigen, die oben für Verfahren unter Einsatz von ATRA und 13-cis-RA beschrieben wurden.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten, daß die Koverabreichung von AGN 193109 und den Kernrezeptoragonisten die antiproliferativen Aktivitäten der Kernrezeptoragonisten potenzierte. Insbesondere zeigten die in 19 dargestellten Ergebnisse, daß die Einzelmittelbehandlung von RPE-Zellen mit entweder Dexamethason (10–11 bis 10–6 M) oder ATRA (10–12 bis 10–6 M) die RPE-Zellproliferation im wesentlichen nicht hemmen konnte. Jedoch unterdrückte die Behandlung von RPE-Zellen mit Dexamethason (10–11 bis 10–6 M) und entweder 10–8 oder 10–6 M AGN 193109 die RPE-Zellproliferation in einem Ausmaß, das etwa der durch Behandlung mit ATRA verursachten Inhibierung entsprach. In ähnlicher Weise zeigten die in 20 dargestellten Ergebnisse, daß AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Schilddrüsenhormon potenzierte. Ähnlich zu den unter Verwendung von Dexamethason erhaltenen Ergebnissen war die Proliferation der RPE-Zellen refraktär für Einzelmittelbehandlung mit Schilddrüsenhormon (10–11 bis 10–6 M). Jedoch hemmte die gleichzeitige Behandlung von RPE-Zellen mit Schilddrüsenhormon (10–11 bis 10–6 M) und AGN 193109 (entweder 10–8 oder 10–6 M) die RPE-Zellproliferation in einer Schilddrüsenhormon-abhängigen Weise. Wir schlußfolgerten, daß AGN 193109 primäre RPE-Kulturen empfindlich für die antiproliferativen Wirkungen dieser Kernrezeptoragonisten machte. Der Mechanismus, durch den AGN 193109 diese Wirkungen vermittelte, beinhaltete wahrscheinlich eine Modulierung von NCP/RAR-Wechselwirkungen.
  • Wir untersuchten zusätzlich die Wirkung von AGN 193109 auf die Expression von Markergenen in anderen experimentellen Systemen, die empfindlich auf Retinoidagonisten waren. Sowohl die MRP8- als auch Stromelysin-Gene sind dafür bekannt, daß sie durch Retinoidagonisten in einer Vielzahl biologischer Systeme inhibiert werden. Zum Beispiel haben Wilkinson et al., J. Cell Sci. 91: 221 (1988), und Madsen et al., J. Invest. Dermatol. 99: 299 (1992), offenbart, daß die MRP8-Genexpression bei Psoriasis erhöht ist. Umgekehrt wurde die MRP8-Genexpression durch den Retinoidagonisten AGN 190168 bei humaner psoriatischer Haut (Nagpal et al., eingereicht 1995), bei humanen Keratinozyten-Raft-Kulturen (Chandraratna et al., J. Invest. Dermatol. 102: 625 (1994)) und bei kultivierten Keratinozyten der Vorhaut des menschlichen Neugeborenen (Thacher et al., J. Invest. Dermatol. 104: 594 (1995)) unterdrückt. Nagpal et al., J. Biol. Chem. 270: 293 (1995), haben offenbart, daß Stromelysin-mRNA-Spiegel durch Retinoidagonisten wie AGN 190168 in kultivierten Keratinozyten der Vorhaut des menschlichen Neugeborenen unterdrückt wurden. Wir analysierten die regulierte Expression dieser Gene im Anschluß an Behandlung von kultivierten Keratinozyten der Vorhaut des menschlichen Neugeborenen mit entweder dem AGN 191183-Retinoidagonisten oder AGN 193109.
  • Beispiel 20 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die MRP-8-Expression in kultivierten Keratinozyten inhibierte.
  • Beispiel 20
  • AGN 193109 inhibiert die MRP-8-Expression in Keratinozyten
  • Primäre Vorhautkeratinozyten wurden gemäß dem von Nagpal et al. beschriebenen Verfahren isoliert, J. Biol. Chem. 270: 923, (1995) und in Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) kultiviert, das von Clonetics erworben wurde. Nach 3 Tagen Behandlung mit AGN 191183 (10–7 M) oder AGN 193109 (10–6 M) wurde die zelluläre Gesamt-RNA aus behandelten und Kontroll-Keratinozyten gemäß Standardverfahren isoliert. Die mRNA wurde zu cDNA revers transkribiert, die dann als Matrize in einem PCR-Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von Primern diente, die spezifisch für das Glyceraldehydphosphatdehydrogenase-(GAPDH)-Haushaltsgen oder MRP-8 waren. Die GAPDH-Primer hatten die Sequenzen 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' (SEQ ID NO: 6) und 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' (SEQ ID NO: 7). Die MRP-8-Primer hatten die Sequenzen 5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3' (SEQ ID NO: 8) und 5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3' (SEQ ID NO: 9). Eine Teilmenge aus der MRP-8-Amplifikationsreaktion (10 μl) wurde nach jedem Durchlauf der PCR-Amplifikation beginnend bei 12 Durchläufen und endend bei 21 Durchläufen entfernt. In ähnlicher Weise wurde eine Teilmenge der GAPDH-Amplifikationsreaktion nach jedem PCR-Durchlauf beginnend bei 15 Durchläufen und endend bei 24 Durchläufen entfernt. Die Proben wurden auf 2% Agarosegelen elektrophoretisch behandelt und die getrennten Amplifikationsprodukte durch Ethidiumbromidanfärbung detektiert. Die Anfärbungsintensität der Amplifikationsprodukte diente als quantitatives Maß für die Menge von Ausgangs-mRNA, die spezifisch für den gegebenen Primersatz ist.
  • Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten, daß sowohl AGN 191183 als auch AGN 193109 unabhängig die MRP-8-Expression in Keratinozyten hemmten. Die Intensität des angefärbten GAPDH-Amplifikationsprodukts war im wesentlichen äquivalent in den Bahnen des Gels, das Ausgangsmaterial darstellte, das aus Kontroll-, mit AGN 191183 und mit AGN 193109 behandelten Keratinozyten isoliert wurde. Schwache Banden, die das GAPDH-Amplifikationsprodukt darstellen, waren zuerst in den Bahnen detektierbar, die den Proben entsprechen, die nach 18 Durchläufen PCR-Amplifikation entfernt wurden. Die äquivalenten Anfärbungsintensitäten unter den verschiedenen Bahnen des Gels zeigten, daß äquivalente Massen von Ausgangsmaterial für alle Proben verwendet wurden. Entsprechend waren Unterschiede in den Intensitäten der angefärbten Banden, die MRP-8-Amplifikationsprodukte darstellen, indikativ für Unterschiede der MRP-8-mRNA-Expression unter den verschiedenen Ausgangsproben. Wie erwartet wurde das MRP-8-amplifizierte Signal in mit AGN 191183 (10–7 M) behandelten Kulturen relativ zu einer unbehandelten Kontrolle inhibiert. Die Behandlung von kultivierten Keratinozyten mit AGN 193109 (10–6 M) unterdrückte ebenfalls die MRP8-Expression gemäß Bewertung durch die geringere Intensität des angefärbten Amplifikationsprodukts.
  • Wie im folgenden Beispiel veranschaulicht wird, inhibierte AGN 193109 auch die Expression eines zweiten Markergens in Keratinozyten. Nagpal et al., J. Biol. Chem. 270: 923 (1995), offenbarten, daß die Stromelysin-mRNA-Expression durch RAR-spezifische Agonisten in kultivierten Keratinozyten der Vorhaut des neugeborenen Menschen abreguliert wurde. Nicholson et al. (EMBO J. 9: 4443 (1990)) offenbarten, daß ein AP-1-Promotorelement eine Rolle in der retinoidabhängigen negativen Regulation des Stromelysin-1-Gens spielte. Daher war es von Interesse zu bestimmen, ob AGN 193109 die Expression dieses Gens verändern konnte.
  • Beispiel 21 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden um zu zeigen, daß AGN 193109 die Stromelysin-1-Genexpression in Abwesenheit eines exogen hinzugegeben Retinoidagonisten hemmte.
  • Beispiel 21
  • AGN 193109 hemmt die Stromelysin-1-Expression in kultivierten Keratinozyten
  • Primäre Vorhaut-Keratinozyten wurden entweder zum Schein oder für 24 Stunden mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 (10–7 M) oder AGN 193109 (10–6 M) behandelt. Gesamt-RNA, hergestellt aus zum Schein behandelten und mit Retinoid behandelten Keratinozyten, wurde revers transkribiert, und die resultierende cDNA wurde unter Verwendung von β-Actin- oder Stromelysin-1-Oligonukleotidprimern genau wie von Nagpal et al. beschrieben PCR-amplifiziert, J. Biol. Chem. 270: 923 (1995)), dessen Offenbarung hier durch Verweis eingeführt wird. Eine Probe (10 μl) aus der PCR-Amplifikationsreaktion wurde nach jedem dritten Durchlauf entfernt, beginnend ab 18 Durchläufen der PCR-Amplifikation. Die Probe wurde elektrophoretisch an einem 2% Agarosegel behandelt und nach Ethidiumbromid-Anfärbung detektiert.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten, daß AGN 193109 die Stromelysin-1-Genexpression in Abwesenheit eines exogen hinzugegebenen Retinoidagonisten hemmte. Insbesondere waren Ethidium-angefärbte Banden, die β-Actin-Amplifikationsprodukte darstellen, leichter in den Agarosegelen nach 18 Durchläufen von PCR detektierbar.
  • Während alle Bandenintensitäten mit zusätzlichen Durchläufen der Amplifikationsreaktion zunahmen, waren angefärbte Banden etwas weniger intensiv in den Banden, die die AGN 191183-behandelten Zellen darstellen. Dies zeigte, daß eine geringfügig geringere Menge von RNA in den Ausgangsproben vorhanden sein mußte, die den mit AGN 191183 behandelten Zellen entsprachen. Die Ergebnisse zeigten auch, daß Stromelysin-1-mRNA in zum Schein behandelten Keratinozyten detektierbar war, beginnend bei 33 Durchläufen der PCR-Amplifikation. Wie erwartet wurde die Stromelysin-1-mRNA-Expression nach Behandlung mit AGN 191183 (10–7 M) inhibiert, gemäß Bewertung durch die schwächere Bandenintensität bei Vergleich mit Proben, die aus zum Schein behandelten Proben stammten. Bei Normalisierung auf die Intensitäten der β-Actin-Amplifikationsprodukte und übereinstimmend mit den in Messungen der MRP-8-Expression erhaltenen Ergebnissen führte die Behandlung von Keratinozyten mit AGN 193109 (10–6 M) zu einer Abregulation der Stromelysin-1-mRNA-Spiegel. Tatsächlich war die durch AGN 193109-Behandlung stimulierte Abregulation ununterscheidbar von der durch Behandlung von Keratinozyten mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 verursachten Abregulation.
  • Wie hier offenbart wird, kann AGN 193109 jeden von drei möglichen Effekten in bezug auf die Modulation der Aktivität eines gleichzeitig verabreichten Agonisten aus der Steroidsuperfamilie aufweisen. Erstens kann AGN 193109 keine Wirkung aufweisen. Zweitens kann AGN 193109 der Wirkung des Agonisten entgegenwirken, was dadurch zu einer Abnahme der Aktivität des Agonisten führt. Schließlich kann AGN 193109 die Aktivität des Agonisten potenzieren, was dadurch zu einer Stimulation des durch den Agonisten erzeugten gemessenen Effekt führt.
  • Verbindungen mit Aktivitäten, die durch AGN 193109 moduliert werden können, schließen Retinoidrezeptoragonisten und Agonisten ein, die an andere Vertreter der Steroidrezeptor-Superfamilie binden. Diese letztere Kategorie von Agonisten schließt Vitamin D-Rezeptoragonisten, Glukokortikoid-Rezeptoragonisten und Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonisten ein. Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptoren, Östrogen-Rezeptor und Orphan-Rezeptoren mit derzeit unbekannten Liganden können ebenfalls durch AGN 193109 potenziert werden. Für den Fall, daß der Agonist aus der Steroidsuperfamilie ein RAR-Agonist ist, kann AGN 193109 entweder der Aktivität des Agonisten entgegenwirken oder sie potenzieren. Für den Fall, daß der Agonist, der in Kombination mit AGN 193109 verwendet wird, eine Verbindung ist, die an einen anderen Kernrezeptor als einen RAR binden kann, wird die Koverabreichung von AGN 193109 entweder keine Wirkung haben oder wird das System für den Agonisten sensibilisieren, so daß die Aktivität des Agonisten potenziert wird.
  • Ein verallgemeinertes exemplarisches Verfahren zur Bestimmung, welche der drei möglichen Aktivitäten AGN 193109 in einem besonderen System haben wird, folgt. Diese Beschreibung veranschaulicht jedes der möglichen Ergebnisse für die AGN 193109-Koverabreichung mit einem Agonisten aus der Steroidrezeptor-Superfamilie. Biologische Systeme, die nützlich zur Bewertung der Fähigkeit von AGN 193109 zur Modulation der Aktivität eines Kernrezeptoragonisten sind, schließen ein (aber sind nicht beschränkt auf): etablierte Gewebekulturzellinien, viral transformierte Zellinien, ex-vivo primäre Kulturzellen und in-vivo Untersuchungen, die lebende Organismen verwenden. Die Messung der biologischen Wirkung von AGN 193109 in solchen Systemen könnte die Bestimmung eines jeden einer Vielzahl biologischer Endpunkte einschließen. Diese Endpunkte schließen ein: Analyse der zellulären Proliferation, Analyse des programmierten Zelltods (Apoptose), Analyse des Differenzierungszustand von Zellen über Genexpressionstests, Analyse der Fähigkeit von Zellen zur Bildung von Tumoren in nackten Mäusen und Analyse der Genexpression nach transienter oder stabiler Einführung von Reportergenkonstrukten.
  • Für illustrative Zwecke wird eine als mRNA "X" bezeichnete mRNA-Spezies aus Gen "X" in primären kultivierten "Y"-Zellen exprimiert, die aus dem Organ "Z" isoliert wurden. Unter Standardkulturbedingungen, worin verschiedene genetische Marker der "Y"-Zellen aufrechterhalten werden, einschließlich der Expression von Gen "X", führt die Zugabe eines Retinoidagonisten zu einer Abnahme der Häufigkeit von "X"-mRNA. Die Analyse der Gen-X-Expression kann über Isolierung von zellulärer mRNA und Messung der Häufigkeit von X-mRNA-Spiegeln über Polymerasekettenreaktion, Ribonukleaseschutz oder RNA-Blotting-Verfahren, wie zum Beispiel Northern-Analysen, bewertet werden. Nach Isolation aus Organ Z werden primäre Y-Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert. Die primären Kulturen werden dann in Gewebekulturplatten zur Expansion der Zellpopulation plattiert. Dieser Schritt erleichtert die Trennung der Zellen in vier Probengruppen, so daß verschiedene Dosen des Retinoidagonisten und von AGN 193109 übertragen werden können. Die erste Gruppe wird eine Kontrolle sein, die nur Träger erhält. Die zweite Gruppe wird den RAR-Agonisten, Retinolsäure, übertragen in Ethanol, in Mengen erhalten, die ausreichend sind, um Endkonzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–6 M bereitzustellen. Es kann sein, daß die niedrigste Dosis empirisch bestimmt werden muß, abhängig von der Empfindlichkeit des Systems. Solche Bestimmungen fallen in den Umfang von Routineexperimenten für einen Durchschnittsfachmann. Die dritte Gruppe wird sowohl den Kernrezeptoragonisten in den gleichen Dosen, die zur Behandlung der Zellen von Gruppe 2 verwendet wurden, als auch eine konstante Dosis von AGN 193109 erhalten. Die Dosis von AGN 193109, die zur Behandlung der Zellen von Gruppe 3 verwendet wird, muß auch empirisch bestimmt werden, aber sollte nahe der Affinitätskonstante (Kd) von AGN 193109 für die RAR-Untertypen sein (d.h. wenigstens 10–8 M). Die vierte Gruppe wird AGN 193109 in Dosen einschließen, die minimal diejenige einschließen, die zur Agonist-Koverabreichung in Gruppe 3 verwendet wurde. Eine Alternative zu diesem Dosierungsschema würde AGN 193109 für den im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Retinoidagonisten austauschen, wie in Gruppe 2 angegeben, und eine konstante Dosis von Retinoidagonist anstelle von AGN 193109, wie in Gruppen 3 und 4 angegeben. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum sollten die Zellen in einer Weise geerntet werden, die geeignet zur Bestimmung des biologischen Endpunkts ist, der als ein Indikator für Agonistenaktivität gemessen wird.
  • Zum Beispiel würde die Analyse der Wirkung von AGN 193109 auf die Retinolsäure-abhängige Regulation der Genexpression den Vergleich der Häufigkeit der mRNA-Spezies X in der mRNA-Ansammlung beinhalten, die aus Zellen geerntet wurde, die gemäß jedem der vier oben beschriebenen Protokolle behandelt wurden. Aus Kontrollzellen stammende RNA wird zur Bestimmung der Basislinienexpression von X-mRNA dienen und wird einen Zustand darstellen, der fehlender Unterdrückung entspricht. Ein Vergleich dieser Niveaus mit demjenigen, das in der mRNA-Ansammlung gemessen wird, die aus mit Retinolsäure behandelten Zellen stammt, wird die Bestimmung der Wirkung dieses Agonisten auf die Genexpression erlauben. Quantifizierte Niveaus der Unterdrückung von spezifischen mRNAs, die aus Retinolsäurebehandlung resultiert, können dann mit mRNA-Häufigkeiten aus Zellen verglichen werden, die parallel mit entweder AGN 193109 allein oder AGN 193109 in Kombination mit Retinolsäure behandelt wurden. Während dieses verallgemeinerte Beispiel eine Analyse der Wirkung von koverabreichtem AGN 193109 auf die Expression eines Gens veranschaulicht, das durch einen Retinoidagonisten unterdrückt wird, könnte das Beispiel alternativ die Analyse der Wirkung von koverabreichtem AGN 193109 auf ein Gen beschrieben haben, das durch einen Retinoidagonisten induziert wurde. Das kritische Merkmal zur Bestimmung, ob sich AGN 193109 als Agonist, negatives Hormon oder ohne Wirkung in einem besonderen System verhalten wird, wird den quantitativen Vergleich der Größe der Wirkung in Gegenwart und Abwesenheit von AGN 193109 beinhalten.
  • Ein Beispiel, in dem AGN 193109 die Aktivität eines koverabreichten Agonisten potenzierte, wäre ein Fall, in dem eine gleichzeitige Behandlung mit AGN 193109 und Retinolsäure zu einem Grad der X-mRNA-Expression führte, die stärker unterdrückt relativ zu dem Niveau ist, das in mit Retinolsäure allein behandelten Zellen gemessen wird. Insbesondere würde ein Vergleich der Dosis-Reaktions-Kurve der biologischen Wirkung (d.h. Unterdrückung von X-mRNA-Häufigkeit), aufgetragen auf der Y-Achse, gegen die Dosis des Agonisten (logarithmischer Maßstab) auf der X-Achse einen Vergleich der Agonist-vermittelten Unterdrückung von X-mRNA-Häufigkeit in Gegenwart und Abwesenheit von gleichzeitiger AGN 193109-Behandlung erlauben. Die Fähigkeit von AGN 193109 zur Sensibilisierung der biologischen Reaktion auf den Agonisten, wodurch die Aktivität des Agonisten potenziert wird, wird durch eine Verschiebung in der Dosis-Reaktions-Kurve nach links angezeigt. Insbesondere würde in Gegenwart von AGN 193109 weniger Agonist erforderlich sein, um die gleiche biologische Wirkung zu erhalten, die unter Verwendung des Agonisten allein erhältlich ist.
  • Ein Beispiel für einen AGN 193109-vermittelten Antagonismus eines koverabreichten Agonisten würde ein Fall sein, in dem die gleichzeitige Behandlung mit AGN 193109 und Retinolsäure zu einem Grad der X-mRNA-Expression führte, der weniger unterdrückt im Vergleich zu demjenigen ist, der in mit Retinolsäure allein behandelten Zellen gemessen wird. Ein Vergleich der Dosis-Reaktions-Kurven der X-mRNA-Unterdrückung gegen die logarithmische Dosis des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit von AGN 193109 wird eine Verschiebung nach rechts in der Dosis-Reaktions-Kurve zeigen. Insbesondere wird in Gegenwart von AGN 193109 mehr Agonist nötig sein, um die gleiche biologische Wirkung zu erhalten, die mit einer Einzelmittelbehandlung mit dem Agonisten allein erhältlich ist.
  • Die obigen Beispiele, worin AGN 193109 entweder einen Antagonismus oder eine Potenzierung vermittelt, beschreiben experimentelle Ergebnisse für die Koverabreichung von AGN 193109 mit einem Retinoidagonisten. Falls jedoch der mit AGN 193109 gleichzeitig verabreichte Agonist ein Agonist ist, der einen anderen Vertreter der Steroidrezeptor-Superfamilie als einen RAR binden und aktivieren kann, dann wird es möglich, daß AGN 193109 anstelle dem Agonisten entgegenzuwirken keine Wirkung auf die Aktivität des Agonisten haben würde. Falls die gleichzeitige Behandlung mit AGN 193109 und mit einem solchen Agonisten zu einem Grad der mRNA-Expression führt, der gleich demjenigen ist, der in mit Agonist allein behandelten Zellen gemessen wird, dann wird die Fähigkeit von AGN 193109 zur Beeinflussung der Verfügbarkeit von NCPs über Förderung von RAR:NCP-Assoziationen in diesem System stumm sein. Dies wäre ein Beispiel, in dem AGN 193109 keine Wirkung auf einen koverabreichten Agonisten hat.
  • Beispiel für Antagonismus
  • Das im obigen verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, das mit einem Retinoidagonisten koverabreicht wird, offenbarte Verfahren wird durch das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren exemplarisch dargestellt. Mit einem der drei Retinolsäurerezeptoren und dem Retinoidagonist-induzierbaren MTV-TREp-Luc-Reporterkonstrukt kotransfizierte CV-1-Zellen wurden entweder mit Ethanol (Kontrolle, Gruppe 1), AGN 193109 in Endkonzentrationen von 10–9 bis 10–6 M (Gruppe 2), AGN 193109 in Endkonzentrationen von 10–9 bis 10–6 M, koverabreicht mit Retinolsäure mit 10–8 M (Gruppe 3), oder Retinolsäure (10–8 M, Gruppe 4) behandelt. Der Vergleich der Luciferaseaktivität von Gruppe 1 mit derjenigen von Gruppe 4 erlaubte die Bestimmung des Retinoidagonist-induzierten Expressionsgrads des Luciferase-Reportergens in Abwesenheit von zugegebenem AGN 193109. Der Vergleich der Luciferase-Reportergenexpression in Zellen der Gruppe 3 mit derjenigen, die in Zellen der Gruppe 4 gemessen wurde, zeigte, daß sich AGN 193109 als ein Antagonist des Retinoidagonisten in diesem System verhielt.
  • Beispiel für Antagonismus
  • Das im verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, das mit einem Retinoidagonisten gleichzeitig verabreicht wurde, offenbarte Verfahren wurde in ähnlicher Weise verwendet, um in Beispiel 17 zu bestimmen, daß AGN 193109 als ein Antagonist einer Retinoidagonist-vermittelten Unterdrückung von EGF-stimulierter zellulärer Proliferation in ECE-16-1-transformierten zervikalen Epithelzellen funktionierte. In diesem Verfahren schlossen Behandlungen von ECE-16-1-Zellen eine Kontrollprobe, behandelt mit EGF allein (Gruppe 1), eine Probe, die mit der Kombination aus EGF und AGN 193109 in einer Endkonzentration von 10–6 M behandelt wurde (Gruppe 2), eine Probe, die mit der Kombination aus EGF und AGN 193109 mit Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M behandelt wurde, koverabreicht mit einer einzelnen Dosis des Retinoidagonisten AGN 191183 mit 10–8 M (Gruppe 3), und eine Probe ein, die mit der Kombination aus EGF und AGN 191183 mit 10–8 M behandelt wurde (Gruppe 4). Nach drei Tagen Behandlung wurden die zellulären Proliferationsraten bestimmt. Die Bestimmung, daß die Zellen stimuliert worden waren, um sich durch EGF zu vermehren, war möglich, weil eine zusätzliche Kontrollbehandlung eingeschlossen wurde, worin Zellen definierten Medium ausgesetzt waren, das kein EGF enthielt. Der Vergleich der Zellzahl in Gruppe 1 mit der Zellzahl in Gruppe 4 erlaubte die Bestimmung, daß der RAR-Agonist AGN 191183 die EGF-stimulierte Proliferation von ECE-16-1-Zellen unterdrückte. Der Vergleich von Gruppe 3 mit Gruppe 4 zeigte, daß AGN 193109 der Aktivität des RAR-Agonisten in diesem System entgegenwirkte.
  • Beispiel für Potenzierung
  • Das im verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, das mit einem Retinoidagonisten gleichzeitig verabreicht wurde, offenbarte Verfahren wurde auch in Beispiel 14 verwendet um zu bestimmen, daß AGN 193109 die Aktivität eines Kernrezeptoragonisten in HeLa-Zellen potenzierte, die mit dem 1,25-Dihydroxyvitamin D3-induzierbaren MTV-VDRE-Luc-Reportergen transfiziert waren. Behandlungen von transfizierten Zellen schlossen Träger allein (Kontrolle, Gruppe 1), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–7 M (Gruppe 2), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–7 M, gleichzeitig verabreicht mit AGN 193109 in einer Endkonzentration von entweder 10–8 oder 10–7 M (Gruppe 3), und AGN 193109 als Einzelmittelbehandlung bei einer Endkonzentration von entweder 10–8 oder 10–7 M (Gruppe 4) ein. Ein Vergleich der in Gruppe 1 (Kontrolle) gemessen Luciferaseaktivität der Zellen mit derjenigen von Zellen der Gruppe 2 erlaubte die Bestimmung, daß die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-stimulierte Luciferaseaktivität dosisabhängig war. Ein Vergleich der in Zellen der Gruppe 4 (AGN 193109-Einzelmittelbehandlung) gemessen Luciferaseaktivität mit derjenigen, die in Zellen der Gruppe 3 gemessen wurde (AGN 193109-Koverabreichung), erlaubte in ähnlicher Weise die Bestimmung der dosisabhängigen 1,25-Dihydroxyvitamin D3-stimulierten Luciferaseaktivität in Gegenwart einer gegebenen Konzentration von AGN 193109. In diesem Fall stellte der Nullwert die Luciferaseaktivität in mit AGN 193109 allein behandelten Zellen (Gruppe 4) dar. Ein solches Dosierungsschema erlaubte den Vergleich der drei 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Dosis-Reaktions-Kurven. Ein Vergleich der Dosis-Reaktions-Kurve von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Abwesenheit von AGN 193109 mit der Kurve, die die Koverabreichung von AGN 193109 (entweder 10–8 oder 10–7 M) darstellte, zeigte die Potenzierung der Agonistenaktivität, wie sie durch eine Verschiebung der halbmaximalen Reaktion nach links widergespiegelt wird.
  • Beispiel für Potenzierung
  • Das im verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, das mit einem Retinoidagonisten koverabreicht wurde, offenbarte Verfahren wurde ferner zur Bestimmung in Beispiel 19 verwendet, das AGN 193109 die antiproliferative Aktivität eines RAR-Agonisten in primären Kulturen von humanen Netzhautpigmentepithelzellen potenzierte. Die Behandlungen von Zellen schlossen ein: Ethanolträger allein (Gruppe 1), Retinolsäure in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M (Gruppe 2), Retinolsäure in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M, koverabreicht mit 10–6 M AGN 193109 (Gruppe 3), und AGN 193109 allein in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M (Gruppe 4). Ein Vergleich der Testergebnisse, die unter Verwendung der Zellen der Gruppen 1 und 2 erhalten wurden, erlaubte die Bestimmung der dosisabhängigen Inhibierung der Proliferation dieser Zellen durch Retinolsäure. In ähnlicher Weise erlaubte ein Vergleich der Ergebnisse, die unter Verwendung der Zellen der Gruppe 3 erhalten wurden, mit denjenigen der Gruppe 1 die Bestimmung der dosisabhängigen Inhibierung der Proliferation dieser Zellen durch Retinolsäure in Gegenwart von gleichzeitig verabreichtem AGN 193109. Gruppe 4 zeigte die Unfähigkeit von AGN 193109 zur wesentlichen Veränderung der Proliferationsrate dieser Zellen bei Verwendung als Einzelbehandlungsmittel. Ein Vergleich der Dosis-Reaktions-Kurven der Retinolsäure-vermittelten Unterdrückung der in den Gruppen 2 und 3 erzeugten zellulären Proliferation lieferte die Basis für die Schlußfolgerung, daß AGN 193109 primäre RPE-Zellen für die antiproliferativen Wirkungen des RAR-Agonisten sensibilisierte, wodurch die Aktivität des RAR-Agonisten potenziert wurde.
  • Wie oben angegeben wurde, zeigten Agarwal et al., Cancer Res. 54: 2108 (1994), daß das CaSki-Zellwachstum anders als das Wachstum von HPV unsterblich gemachten ECE-16-1-Zellen nicht durch Behandlung mit Retinoidagonisten inhibiert wurde. Wie hier offenbart wird, haben wir unerwartet festgestellt, daß das CaSki-Zellwachstum durch AGN 193109 in Abwesenheit eines Retinoidagonisten inhibiert wurde. Das folgende Beispiel veranschaulicht, wie AGN 193109 zur Inhibierung des Wachstums von CaSki-Zelltumoren in vivo verwendet werden kann.
  • Beispiel 22
  • Inhibierung von Tumorwachstum von CaSki-Zellen in nackten Mäusen nach Verabreichung von AGN 193109
  • 1 × 106 CaSki-Zellen werden in jede eine Gruppe von nackten Mäusen injiziert. Die Tumorbildung wird unter Verwendung von Techniken bewertet, die einem Durchschnittsfachmann vertraut sein werden. Nach der Injektion werden die Mäuse statistisch in Kontroll- und Testgruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe erhält ein Plazebo. Der Testgruppe wird AGN 193109 verabreicht. Die Tiere, denen das Plazebo verabreicht wurde, erhalten eine Magensondierung mit Maisöl. Die Testtiere erhalten 20 μmol/kg AGN 193109 in Maisöl täglich für den Behandlungszeitraum. Das Tumorvolumen wird in Kubikmillimeter unter Verwendung von skalierten Schublehren gemessen. Das Tumorvolumen wird als Funktion der Zeit aufgetragen. Mäuse, die AGN 193109 erhalten, weisen Tumore auf, die signifikant in ihrer Wachstumsrate im Vergleich zu Tumoren bei den Kontrollmäusen reduziert sind, gemäß Bewertung nach Tumorgröße und -anzahl über den Untersuchungszeitraum. Dieses Ergebnis liefert einen In-vivo-Beweis, daß AGN 193109 das Wachstum eines fortgeschrittenen Zervixkarzinoms inhibiert, das resistent gegen Therapie ist, die die Verabreichung eines Retinoidagonisten umfaßt.
  • Wie oben gezeigt wurde, sind CaSki-Zellen ein Modell für Zervixtumoren, die nicht auf eine Retinoidagonist-Therapie ansprechen. Jedoch haben wir hier offenbart, daß das CaSki-Zellwachstum durch AGN 193109 in Abwesenheit von Behandlung mit einem Retinoidagonisten inhibiert wurde. Die Fähigkeit von AGN 193109 zur Inhibierung der Proliferation von CaSki-Zellen legte nahe, daß AGN 193109 verwendet werden könnte, um Zervixkarzinome therapeutisch zu behandeln, die unempfindlich gegenüber Retinoidagonist-Therapie sind. Das folgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, das verwendet werden kann, um das therapeutische Potential von AGN 193109 in der Behandlung eines Zervixkarzinoms zu bewerten.
  • Beispiel 23
  • Bewertung des therapeutischen Potentials von AGN 193109 bei Patienten mit Zervixkarzinom
  • Ein Patient mit einem fortgeschrittenen Zervixkarzinom wird zuerst identifiziert. Eine zervikale Biopsie wird gemäß Verfahren erhalten, die einem Durchschnittsfachmann vertraut sein werden. Zellen aus dem explantierten Tumor werden in Gewebekultur gemäß Standardtechniken vermehrt, um ausreichende Zellzahlen bereitzustellen, um eine Unterteilung in drei Probengruppen zu erlauben. Die von Agarwal et al. beschriebenen Kulturbedingungen, Cancer Res. 54: 2108 (1994), werden für diesen Zweck eingesetzt. Die erste Gruppe wird als Kontrolle reserviert und erhält nur Träger (Ethanol). Die zweite Gruppe wird mit dem RAR-Agonisten Retinolsäure in einer Konzentration von 10–10 bis 10–6 M behandelt. Die dritte Gruppe wird mit AGN 193109 in Dosen im Bereich von 10–10 bis 10–6 M behandelt. Die Zellen werden mit frischem Wachstumsmedium täglich gefüttert und mit den oben beschriebenen Retinoiden nach Bedarf für jede Probengruppe versehen. Zellen werden nach drei Tagen unter Verwendung eines elektrischen Zellzählers gezählt. Ein Vergleich der Zellzahl in Kontrollkulturen mit der Zellzahl in mit Retinolsäure behandelten Kulturen zeigt, daß ein RAR-Agonist die Wachstumsrate der kultivierten Zervixkarzinomzellen nicht substantiell inhibiert. Im Gegensatz weisen mit AGN 193109 behandelte Zellen eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl bei Vergleich mit Zellzählungen in der Kontrollgruppe auf. Dieses Ergebnis, wonach eine AGN 193109-Behandlung die kultivierte Zervixkarzinomzellproliferation inhibiert, zeigt, daß AGN 193109 ein nützliches Therapeutikum zur Behandlung von Zervixkarzinompatienten mit metastatischer Krankheit sein wird.
  • Zervixkarzinompatienten, die eine Operation zur Entfernung von primären Tumoren erfahren haben und eine metastatische Erkrankung aufweisen, werden in einer randomisierten klinischen Untersuchung aufgenommen um zu versuchen, den therapeutischen Nutzen von AGN 193109 in dieser Indikation zu zeigen. Die Patienten werden in zwei Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe ist eine Kontrollgruppe, während Mitglieder der zweiten Gruppe mit AGN 193109 behandelt werden. AGN 193109 wird mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten kombiniert, um eine zur systemischen Verabreichung geeignete Zusammensetzung herzustellen, alles gemäß Techniken, die einem Durchschnittsfachmann vertraut sein werden. Der Kontrollgruppe wird eine Placeboformulierung verabreicht, und der experimentellen Gruppe wird die Formulierung verabreicht, die das negative AGN 193109-Hormon enthält. Die Dosierung der Patienten erfolgt bei der maximalen tolerierten Dosis und wird jeden zweiten Tag für einen Zeitraum von drei Monaten bis zu einem Jahr durchgeführt. Das Ergebnis der Untersuchung wird über Messung des krankheitsfreien Überlebens über die Zeit quantifiziert. Individuen, die AGN 193109 erhalten, zeigen eine signifikante Zunahme des krankheitsfreien Überlebens, einschließlich einer überproportionalen Anzahl von Patienten, die eine vollständige Remission ihrer metastatischen Krankheit zeigen. Dieses Ergebnis zeigt, daß AGN 193109 therapeutischen Nutzen zur In-vivo-Behandlung von Zervixkarzinomen besitzt, die nicht auf die antiproliferativen Wirkungen von Retinoidagonisten wie Retinolsäure ansprechen.
  • Wie oben offenbart wurde, potenzierte AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von RAR-Agonisten in primären Kulturen von humanen Netzhautpigmentepithelzellen. Entsprechend wird vernünftigerweise von der Koverabreichung von AGN 193109 mit einem RAR-Agonisten in vivo erwartet, daß sie den therapeutischen Index des Agonisten erhöht, weil eine geringere Menge des RAR-Agonisten erforderlich sein wird, um den gleichen therapeutischen Endpunkt zu erhalten. Zusätzlich wurde gezeigt, daß AGN 193109 primäre Kulturen von humanen Netzhautpigmentepithelzellen für die antiproliferativen Wirkungen von Glukokortikoid- und Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonisten sensibilisiert. Das folgende Kaninchenmodell von PVR wird in zwei getrennten Untersuchungen verwendet, um den erhöhten therapeutischen Index zu zeigen, der durch Koverabreichung von AGN 193109 mit einem RAR-Agonisten (13-cis-Retinolsäure) bzw. einem Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonisten erhalten wird. Bemerkenswert wurde das Kaninchenmodell der erneuten Netzhautablösung, das von Sen et al. veröffentlicht wurde, Arch. Ophthalmol. 160: 1291 (1988), verwendet um zu zeigen, das Retinoidagonisten, die die Proliferation von primären RPE-zellen in vitro inhibieren, auch die Häufigkeit von Netzhautablösung in vivo inhibieren (Araiz et al., Invest. Ophthalmol. 34: 522 (1993)). Deshalb wurde in bezug auf ihre Verwendung als Therapeutika in der Prävention von Netzhautablösung bereits eine Korrelation zwischen den Aktivitäten von Retinoidagonisten in vitro und in vivo entwickelt. Die folgenden Beispiele veranschaulichen, wie AGN 193109 in therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden kann, die auf die Prävention von Netzhausablösung gerichtet sind.
  • Beispiel 24
  • Verwendung von AGN 193109 zur Erhöhung des therapeutischen Potentials von Rezeptoragonisten der Steroidsuperfamilie in der Behandlung von proliferativer Vitreoretinopathie (PVR)
  • In einer ersten Studie werden humane RPE-Zellen in den Glaskörper des Kaninchenauges gemäß dem von Sen et al. beschriebenen Verfahren injiziert, Arch. Ophthalmol. 106: 1291 (1988). Nach der intravitrealen Injektion werden die Kaninchen in fünf Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) wird allein Träger durch intravitreale Injektion erhalten. Die zweite Gruppe erhält Retinolsäure als Einzelmittelbehandlung (100 μg) durch intravitreale Injektion. Die dritte Gruppe erhält AGN 193109 als Einzelmittelbehandlung (100 μg) durch intravitreale Injektion. Die vierte Gruppe erhält durch intravitreale Injektion den RAR-Agonisten (Retinolsäure) in einer Dosis von einem Zehntel der an Gruppe 2 verabreichten Menge (10 μg). Die fünfte Gruppe erhält die Kombination aus AGN 193109 (100 μg) und Retinolsäure (10 μg) durch intravitreale Injektion. Die Tiere erhalten eine einzelne intravitreale Injektion der entsprechenden Behandlung einen Tag nach der intravitrealen Injektion von humanen RPE-Zellen. Die Kaninchen werden durch indirekt Ophthalmoskopie an den Tagen 7, 14 und 28 untersucht und auf Häufigkeit und Schwere von traktionaler Netzhautablösung bewertet. Kaninchen aus der Gruppe, der 100 μg Retinolsäure injiziert wurde, weisen eine signifikant reduzierte Häufigkeit und Schwere von Netzhautablösung im Vergleich zu Kontrollkaninchen oder Kaninchen auf, die entweder AGN 193109 oder Retinolsäure (10 μg) allein erhielten. Kaninchen in der Gruppe, der die Kombination aus AGN 193109 und Retinolsäure (10 μg) verabreicht wurde, weisen eine signifikant reduzierte Häufigkeit und Schwere von Netzhautablösung im Vergleich zu denjenigen in den Gruppen aus entweder Kontrolle, AGN 193109 oder Retinolsäure (10 μg) auf. Dieses Ergebnis zeigt, daß AGN 193109 den therapeutischen Index des RAR-Agonisten Retinolsäure in einem in vivo-Modell von PVR verbessert.
  • In einer zweiten Studie werden die Kaninchen zuerst mit einer Injektion von humanen RPE-Zellen in den Glaskörper des Auges versehen und dann in vier Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) erhält allein Träger durch intravitreale Injektion. Die zweite Gruppe erhält Schilddrüsenhormon als Einzelmittelbehandlung (100 μg) durch intravitreale Injektion. Der dritten Gruppe wird AGN 193109 als Einzelmittelbehandlung (100 μg) durch intravitreale Injektion verabreicht. Der vierten Gruppe wird die Kombination aus AGN 193109 (100 μg) und Schilddrüsenhormon (100 μg) verabreicht. Die Kaninchen werden durch indirekte Ophthalmoskopie an den Tagen 7, 14 und 28 untersucht und auf Häufigkeit und Schwere der traktionalen Netzhautablösung bewertet. Ein Vergleich der Häufigkeit und Schwere der Netzhautablösung in den vier Gruppen zeigt, daß eine Einzelmittelbehandlung mit entweder AGN 193109 oder Schilddrüsenhormon die Netzhautablösung im Vergleich mit den Kontrollkaninchen nicht hemmt. Im Gegensatz weist die Gruppe von Kaninchen, der die Kombination aus AGN 193109 und Schilddrüsenhormon verabreicht wurde, ein/eine signifikant reduzierte s) Auftreten und Schwere von Netzhautablösung auf. Dieses Ergebnis zeigt, daß AGN 193109 den therapeutischen Index von Schilddrüsenhormon in einem In-vivo-Modell von PVR verbessert.
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht, wie AGN 193109 zur Steigerung des therapeutischen Index eines RAR-Agonisten verwendet werden kann, der zur Behandlung von menschlichen Patienten nach Netzhautanheftungsoperation verwendet wird.
  • Beispiel 25
  • Erhöhung des therapeutischen Index des RAR-Agonisten 13-cic-Retinolsäure
  • Eine Gruppe von erwachsenen Freiwilligen mit aus PVR resultierender Netzhautablösung wird zuerst identifiziert. Die Individuen erfahren eine chirurgische Reparatur der Ablösungen unter Verwendung von Techniken, die fachlicher Standard sind. Die Patienten werden dann in fünf Gruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe besteht aus Patienten, die eine chirurgische Reparatur der Netzhautablösung erfahren und keinerlei Retinoid-Verbindung erhalten. Die zweite Gruppe erhält oral 40 mg 13-cis-Retinolsäure zweimal täglich für vier Wochen postoperativ. Die dritte Gruppe erhält oral 40 mg AGN 103109 zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ. Die vierte Gruppe erhält oral 4 mg 13-cis-Retinolsäure zweimal täglich für vier Wochen postoperativ. Die fünfte Gruppe erhält oral 40 mg AGN 193109 in Kombination mit oral 4 mg 13-cis-Retinolsäure zweimal täglich für vier Wochen postoperativ. Das Behandlungsprotokoll und die Bewertung der Wirkstoffeffizienz werden im wesentlichen wie von Fekrat et al. beschrieben durchgeführt, Ophthalmology 102: 412 (1995).
  • Die Häufigkeit und Schwere der erneuten Netzhautablösung bei postoperativen Patienten in allen fünf Gruppen wird über einen Zeitraum von neun Monaten unter Verwendung von ophthalmologischen Untersuchungstechniken überwacht, die den Durchschnittsleuten vertraut sein werden. Patienten, die oral 40 mg 13-cis-Retinolsäure erhalten, weisen ein signifikant reduziertes Auftreten von erneuter Netzhautablösung im Vergleich mit Kontrollpatienten, Patienten, die oral 4 mg 13-cis-Retinolsäure zweimal täglich erhalten, oder Patienten auf, die oral 40 mg AGN 193109 zweimal täglich erhalten. Die Untersuchung der Patientengruppe, die die Kombination aus oral 40 mg AGN 193109 und oral 4 mg 13-cis-Retinolsäure zweimal täglich für vier Wochen postoperativ erhält, zeigt, daß das therapeutische Ergebnis dieser Patientengruppe gleich oder besser als diejenigen Patienten ist, die oral 40 mg 13-cis-Retinolsäure zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ erhalten. Dieses Ergebnis zeigt, daß das negative AGN 193109-Hormon den therapeutischen Index eines RAR-Agonisten aufgrund der Verringerung der Häufigkeit und Schwere von erneuter Netzhautablösung bei PVR-Patienten verbessert.
  • Verallgemeinerter Test zur Identifizierung von negativen Kernrezeptorhormonen
  • Wir haben oben gezeigt, daß AGN 193109 als negatives Hormon funktionieren kann, das die Basistranskriptionsaktivität von RAR-Kernrezeptoren unterdrücken kann. Ferner haben wir einen Test beschrieben, der CV-1-Zellen verwendet, die mit dem ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmid und den ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Rezeptorexpressionsplasmiden kotransfiziert wurden, zur Unterscheidung von RAR-Liganden, die einfache Antagonisten sind, von denjenigen mit negativer Hormonaktivität.
  • Wir haben schlußgefolgert, daß negative RAR-Hormone die Unterdrückung von RAR-vermittelter Transkriptionsaktivität vermitteln, indem eine erhöhte Wechselwirkung zwischen dem RAR und den NCPs gefördert wird. Ferner haben wir gezeigt, daß AGN 193109 die Wirkungen von Agonisten von anderen Kernrezeptoren in einer Weise potenzieren kann, die mit dem gegenseitigen Teilen von NCPs zwischen Vertretern der Steroidsuperfamilie von Kernrezeptoren übereinstimmt. Als solche können Liganden geschaffen und durchmustert werden, um Verbindungen mit negativer Hormonaktivität an diesen Nicht-RAR-Kernrezeptoren zu identifizieren.
  • Unser Verfahren zur negativen RAR-Hormondurchmusterung auf Basis der Verwendung von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmid und den ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Rezeptorexpressionsplasmiden kotransfiziert wurden, kann allgemein so angepaßt werden, daß die RAR-γ-Einheit des RAR-γ-VP-16-Plasmids zu derjenigen von Peroxisomproliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR), Vitamin D-Rezeptor (VDR), Schilddrüsenhormonrezeptor (T3R) oder jedem anderen Kernrezeptor der Steroidsuperfamilie, der mit RXR heterodimerisieren kann, umgewandelt wird. CR-1-Zellen, die mit solchen Plasmiden kotransfiziert werden, würden hohe Basisspiegel von Luciferaseaktivität exprimieren. Liganden, die die Ligandenbindungsdomäne des für die RAR-γ-Einheit substituierten Rezeptors binden können, können leicht auf negative Hormonaktivität durch Messung ihrer Fähigkeit zur Unterdrückung von Luciferaseaktivität durchmustert werden.
  • Für Kernrezeptoren der Steroidsuperfamilie, die nicht mit RXR heterodimerisieren (z.B. Glukokortikoid- und Östrogenrezeptoren), kann das gleiche Endergebnis unter Verwendung von GR-VP-16- oder ER-VP16-Rezeptoren und von einem Luciferase-Reporterplasmid, das aus dem entsprechenden Glukokortikoid- oder Östrogen-Response-Element besteht, fusioniert an ein heterologes Promotorelement und ein Luciferase- oder anderes Reportergen, erreicht werden. Ein wesentliches Merkmal eines verallgemeinerten negativen Hormondurchmusterungstests ist der Einschluß wenigstens der Ligandenbindungsdomäne des besonderen Kernrezeptors, für den inverse Agonisten zu durchmustern sind, und ein Verfahren zur Lokalisierung der Kernrezeptor-Ligandenbindungsdomäne für den Promotor eines Reportergens. Dies könnte unter Verwendung des natürlichen DNA-Bindungsortes der Rezeptoren oder alternativ durch Konstruktion eines chimären Rezeptors mit einer heterologen DNA-Bindungsdomäne und entsprechender Verwendung eines Reportergens, das unter der Kontrolle eines DNA- regulatorischen Elements steht, das durch die heterologe DNA-Bindungsdomäne erkannt wird, erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform würde das Plasmid, das den Kernrezeptor exprimiert, für den inverse Agonisten zu durchmustern sind, diesen Kernrezeptor als ein Fusionsprotein exprimieren, das eine konstitutive Aktivierungsdomäne enthält, wie zum die HSV VP-16-Aktivierungsdomäne, um eine hohe Basisaktivität bereitstellen zu können. Diese hohe Basisaktivität würde effektiv die Testempfindlichkeit erhöhen, was dadurch eine Analyse der Kernrezeptorliganden erlauben würde, die die Basistranskriptionsaktivität in Abwesenheit von zugegebenem Kernrezeptoragonisten unterdrücken.
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, das zur Durchmusterung auf Verbindungen mit negativer Hormonaktivität am Schilddrüsenhormonrezeptor verwendet werden kann.
  • Beispiel 26
  • Verfahren zur Identifizierung von negativen Hormonen am Schilddrüsenhormonrezeptor
  • CV-1-Zellen werden mit dem Luciferase-Reporterplasmid ERE-tk-Luc und den Plasmiden ER-RXR-α und T3R-VP-16 kotransfiziert. T3R-VP-16 ist identisch mit dem Plasmid RAR-γ-VP-16, außer daß die RAR-γ-Einheit von RAR-γ-VP-16 durch die Schilddrüsenhormonrezeptor-cDNA ersetzt wurde. Als solches exprimiert T3R-VP-16 ein Fusionsprotein, das die Aktivierungsdomäne von HSV VP-16 im Raster mit dem N-Terminus des Schilddrüsenhormonrezeptors enthält. Standardmäßige Transfektions- und Zellkulturverfahren werden für diesen Zweck eingesetzt. Nach der Transfektion werden die Zellen gespült und mit Wachstumsmedium gefüttert, das 10% fötales Kälberserum enthält, das mit Aktivkohle extrahiert wurde. Die Zellen werden mit Träger allein (Ethanol), Schilddrüsenhormon (10–9 bis 10–10 M) oder Verbindung TR-1 (10–9 bis 10–6 M) behandelt. TR-1 ist ein synthetischer Schilddrüsenhormonrezeptorligand, der eine starke Affinität für den Schilddrüsenhormonrezeptor in kompetitiven Bindungsstudien aufweist, der aber nicht transfizierten Schilddrüsenhormonrezeptor in transienten Kotransfektionstransaktivierungstests, die ein auf Schilddrüsenhormon reagierendes Reportergen und ein Schilddrüsenhormonrezeptor-Expressionsplasmid verwenden, aktiviert. Ferner kann TR-1 der Schilddrüsenhormon-vermittelten Transaktivierung entgegenwirken und ist als solches ein Schilddrüsenrezeptorantagonist.
  • Die Analyse der Luciferaseaktivität aus CV-1-Zellen, die mit ERE-tk-Luc, ER-RXR-α und T3R-VP-16 transfiziert wurden, zeigt ein hohes Basisniveau von Luciferasereporteraktivität in mit Träger behandelten Zellen. Die mit Schilddrüsenhormon behandelten Zellen zeigen eine schwache Zunahme von Luciferaseaktivität in einer dosisabhängigen Weise. Die mit TR-1 behandelten Zellen weisen eine dosisabhängige Abnahme der Luciferaseaktivität auf. Dies zeigt, daß TR-1 eine inverse Schilddrüsenrezeptor-Agonistenaktivität aufweist, vermutlich aufgrund der zunehmenden Wechselwirkung eines NCP mit dem Schilddrüsenhormonrezeptor.
  • Die Proliferationsrate von humanen primären Netzhautpigmentepithelzellen wird durch Behandlung mit RAR-Agonisten unterdrückt. Der therapeutische Wert dieser Beobachtung wurde in der postoperativen Verwendung der Retinoidtherapie nach Netzhautwiederanheftungsoperation gezeigt. Wir haben oben gezeigt, daß AGN 193109 RAR-negatives Hormon primäre RPE-Zellen für die antiproliferative Wirkung von ATRA und 13-cis-Retinolsäure bei Koverabreichungsverfahren sensibilisieren kann. Ferner wurde ebenfalls gezeigt, daß AGN 193109 RPE-Zellen für die antiproliferativen Wirkungen anderer Kernrezeptoragonisten sensibilisiert. Insbesondere sensibilisiert AGN 193109 RPE-Zellen für die antiproliferativen Wirkungen des Glukokortikoidagonisten Dexamethason und des Schilddrüsenhormonagonisten 3,3',5-Triiodthyronin, T3. Diese Daten stimmten mit unserem Arbeitsmodell überein, worin AGN 193109 die Verfügbarkeit von NCPs modulierte, die zwischen den Vertretern der Kernrezeptorfamilie geteilt wurden. Die Behandlung von RPE-Zellen mit dem inversen Schilddrüsenhormonrezeptor-Agonisten TR-1 wird in ähnlicher Weise die Verfügbarkeit von geteilten NCPs verändern, so daß die Koverabreichung mit einem Nicht-Schilddrüsenrezeptor-Agonisten, wie zum Beispiel mit dem RAR-Agonisten 13-cis-Retinolsäure, zu einer erhöhten antiproliferativen Wirkung auf die RPE-Kulturen im Vergleich zu 13-cis-Retinolsäure als Einzelmittelbehandlung führen wird.
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, das verwendet werden kann, um primäre RPE-Zellen empfindlicher gegenüber der antiproliferativen Aktivität eines RAR-Agonisten zu machen. Bemerkenswert veranschaulicht dieses Beispiel weiterhin, wie die Aktivität von RAR-Agonisten durch Koverabreichung mit einem negativen Hormon potenziert werden kann.
  • Beispiel 27
  • Sensibilisierung von primären Netzhautpigmentepithelzellen für die antiproliferativen Wirkungen von RAR-Agonisten durch Koverabreichung des TR-1 inversen Schilddrüsenhormonagonisten
  • Humane primäre RPE-Zellen werden gemäß Standardverfahren erhalten und kultiviert. Die kultivierten Zellen werden in vier Gruppen unterteilt und wie folgt behandelt. Gruppe 1 erhält allein Träger (Ethanol). Gruppe 2 wird mit 13-cis-Retinolsäure in Konzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–6 M behandelt. Gruppe 3 wird mit dem inversen Schilddrüsenhormonagonisten TR-1 mit Konzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–1 M behandelt. Gruppe 4 wird mit 13-cis-Retinolsäure mit Konzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–6 M TR-1 gleichzeitig behandelt. Die Zellen werden erneut mit frischem Wachstumsmedium gefüttert und erneut mit der entsprechenden Verbindung alle zwei Tage für insgesamt fünf Behandlungstage behandelt. Die Proliferationsrate über die Dauer des Experiments wird durch Messung der Zellzahl in den Kulturen unter Verwendung eines elektrischen Zellzählers quantifiziert.
  • Mit TR-1-behandelte Zellen (Gruppe 3) weisen Raten der zellulären Proliferation auf, die im wesentlichen die gleiche wie von Kontrollzellen (Gruppe 1) sind, und es gibt keine Wirkung dieses inversen Agonisten auf die gemessene Wachstumsrate der Kulturen. Mit 13-cis-Retinolsäure behandelte Zellen (Gruppe 2) weisen eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl auf. Ein Vergleich der dosisabhängigen Abnahme der zellulären Proliferation der Zellen der Gruppe 4 (13-cis-RA- und TR-1-Koverabreichung) mit der in Gruppe 3 erhaltenen zeigt die Fähigkeit der Koverabreichung des inversen Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonisten TR-1, RPE-Kulturen für die antiproliferative Wirkung von 13-cis-Retinolsäure zu sensibilisieren, gemäß Messung durch die Verschiebung der Dosis-Reaktions-Kuve dieses RAR-Agonisten zur linken Seite in Gruppe 4 im Vergleich zu Zellen der Gruppe 2.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Figure 01270001

Claims (21)

  1. Verbindung der Formel:
    Figure 01280001
    worin R2 H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen, F, Cl, Br, I, CF3, fluorsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen, OH, SH, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffen oder Alkylthio mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist; m eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist; R3 H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen oder F ist; o eine ganze Zahl mit einem wert von 0 bis 3 ist; s eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist; R8 H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen oder Trimethylsilylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffe aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffen ist oder R8 Phenyl oder Niederalkylphenyl ist; R15 unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, COR8, NR8CON(R8)2, OCOR8, OR8, CN, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine fluorsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxygruppe ist, worin die Alkylgruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffe aufweisen; r eine ganze Zahl mit einem wert von 0 bis 5 ist und die CONH-Gruppe in der 6- oder 7-Position des Benzopyrans ist oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
  2. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin r 1 ist und R15 Niederalkyl ist.
  3. Verbindung gemäss Anspruch 1 oder 2, worin R15 4-Methyl ist.
  4. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R3 CH3 ist, o 2 ist und die CH3-Substituenten die 2-Position des Benzopyranrings besetzen.
  5. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin R2 Br ist und m 1 ist und der Bromsubstituent in der 8-Position des Benzopyranrings ist.
  6. Verbindung gemäss Anspruch 1, die durch die folgende Formel gekennzeichnet ist:
    Figure 01300001
    worin R2 H oder Br ist; s 1 oder 2 ist; R3 N oder CH3 ist und R8 H oder Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffen ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
  7. Verbindung gemäss Anspruch 6, worin R3 CH3 ist.
  8. Verbindung gemäss Anspruch 6 oder 7, worin R2 Br ist.
  9. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 6 bis 8, worin R8 H oder Ethyl ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
  10. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 6 bis 8, worin s 1 ist.
  11. Verbindung gemäss Anspruch 10, worin R8 H oder Ethyl ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
  12. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 6 bis 8, worin s 2 ist.
  13. Verbindung gemäss Anspruch 12, worin R8 H oder Ethyl ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung.
  14. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Herstellung eines Medikaments, das nützlich zur Prävention oder Linderung der Toxizität oder unerwünschten Wirkungen in einem Säugetier ist, die aus der Verabreichung einer Retinoidverbindung an das Säugetier resultieren.
  15. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Herstellung eines Medikaments, das nützlich zur Heilung oder Linderung eines vorbestehenden pathologischen Zustands in einem Säugetier ist, der durch Einnahme eines Retinoidwirkstoffs oder von Vitamin A oder von Vitamin A-Vorläufern durch das Säugetier verursacht wird.
  16. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Herstellung eines Medikaments zur topischen Verabreichung, das nützlich zur Blockierung oder Linderung der unerwünschten topischen Nebenwirkungen eines Retinoidwirkstoffs ist, der für einen therapeutischen Zweck verabreicht wird.
  17. Verwendung gemäss Anspruch 16, worin der Retinoidwirkstoff systemisch verabreicht wird.
  18. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Herstellung eines Medikaments zur topischen Verabreichung, das nützlich zur Behandlung eines vorbestehenden Zustands oder einer Nebenwirkung ist, der/die durch einen Retinoidwirkstoff oder Vitamin A verursacht wird.
  19. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Herstellung eines Medikaments zur systemischen Verabreichung, das nützlich zur Behandlung eines vorbestehenden Zustands oder einer Nebenwirkung ist, der/die durch einen Retinoidwirkstoff oder Vitamin A verursacht wird.
  20. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Herstellung eines Medikaments zur systemischen Verabreichung, das nützlich zur Blockierung oder Linderung von Knochentoxizität ist, die durch gleichzeitige Verabreichung eines Retinoidwirkstoffs oder von Vitamin A verursacht wird.
  21. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 20, worin der Retinoidantagonist oder das negative Hormon systemisch verabreicht wird, um Knochentoxizität zu blockieren oder zu lindern, die durch gleichzeitige Verabreichung eines Retinoidwirkstoffs oder von Vitamin A verursacht wird.
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