KR20010020505A - 음성 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드화합물의 제조방법 및 용도 - Google Patents

음성 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드화합물의 제조방법 및 용도 Download PDF

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알랜 티. 존슨
앤드류 엠. 스탠비벤
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사무엘.제이. 질레트
타인 티. 둥
선일 나그팔
비댜사갈 벌리곤다
민 텡
로산트하 에이 찬드라라트나
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마틴 에이.보에트
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Abstract

아릴-치환된 및 아릴 및 (3-옥소-1-프로페닐)-치환된 벤조피란, 벤조티오피란, 1,2-디하이드로퀴놀린 및 5,6-디하이드로나프탈렌 유도체는 레티노이드 음성 호르몬 및/또는 길항제-유사 생물학적 활성을 갖는다. 발명된 RAR 길항제는 사람을 포함한 포유동물에 RAR 효능제의 결합된 수용체 부위에서의 작용을 억제 또는 경감시키기 위한 목적으로 투여할 수 있다. 특정적으로, RAR 효능제는 레티노이드 약물과 함께 투여 또는 공동투여되어 레티노이드 또는 비타민 A 또는 비타민 A 전구체에 의해 유발된 독성 또는 부작용을 억제 또는 경감할 수 있다. 레티노이드 음성 호르몬은 다른 레티노이드 및 핵 수용체 효능제의 활성을 강화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 AGN 193109로 불리는 레티노이드 음성 호르몬은 시험관내 트란스활성화 검정에서 다른 레티노이드 및 스테로이드 호르몬의 효과를 효과적으로 증가시켰다. 또한, 트란스활성화 검정은 음성 호르몬 활성을 갖는 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 이들 검정은 구성성 전사 활성화제 도메인을 갖도록 유전공학적으로 조작된 키메라성 레티노이드 수용체의 활성을 하강 조절하는 음성 호르몬의 능력에 기초를 두고 있다.

Description

음성 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드 화합물의 제조방법 및 용도{Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities}
레티노이드-유사 활성을 갖는 화합물은 본 분야에 잘 알려져 있으며 많은 미국특허 및 기타특허나 과학지에 기술되어 있다. 본 분야에 일반적으로 알려져 있고 수용되고 있는 바로는 레티노이드-유사 활성은 많은 질병 및 상태와 연관된 증세를 치유하거나 경감시키기 위해 사람을 포함한 포유동물을 치료하는데 유용하다는 점이다.
레티노이드(비타민 A 및 이의 유도체)는 여러 생물학적 계통에서 세포의 증식과 분화에 대한 영향을 포함하여 폭넓은 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 활성에 의해 레티노이드는 피부질환 및 암을 포함한 여러 질병의 치료에 유용하다. 종래에 레티노이드-유사 생물학적 활성을 갖는 수 많은 화합물이 개발되었고 그러한 화합물을 기술한 특허나 화학문헌도 많이 있다. 관련 특허문헌으로는 미국특허 제4,980,369, 5006,550, 5,015,658, 5,045,551, 5,089,509, 5,134,159, 5,162,546, 5,234,926, 5,248,777, 5,264,578, 5,272,156, 5,278,318, 5,324,744, 5,346,895, 5,346,915, 5,348,972, 5,348,975, 5380,877, 5,399,561, 5,407,937 및 여기에 인용된 특허 및 공보가 포함되고 이들은 특히 레티노이드-유사 생물학적 활성을 갖는 크로만, 티오크로만 및 1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린 유도체를 기술하거나 그에 관한 것이다. 또한, 일부 계류중에 있는 특허원도 레티노이드-유사 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다.
미국특허 제4,740,519 (Shroot 등), 4,826,969 (Maignan 등), 4,326,055 (Loeliger 등), 5,130,335 (Chandraratna 등), 5,037,825 (Klaus 등), 5,231,113 ((Chandraratna 등), 5,324,840 (Chandraratna 등), 5,344,959 (Chandraratna 등), 5,130,335 (Chandraratna 등), 공개된 유럽특허원 제0 176 034 A (Wuest 등), 0 350 846 A (Klaus 등), 0 176 032 A (Frickel 등), 0 17 033 A (Frickel 등), 0 253 302 A (Klaus 등), 0 303 915 A (Bryce 등), 영국특허원 GB 2190378 (Klaus 등), 독일특허원 DE 3715955 A1 (Klaus et al), DE 3602473 A1 (Wuest 등) 및 논문 (J. Amer. Acad. Derm. 15: 756-764 (1986) (Sporn 등), Chem. Pharm. Bull. 33: 404-407 (1985) (Shudo 등), J. Med Chem. 31: 2182-2192 (1988) (Kagechika 등), Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids CRC Press Inc. 1990 pp. 334-335, 354 (Dawson 등)에는 테트라하이드로나프틸 잔기를 포함하고 레티노이드-유사 또는 연관된 생물학적 활성을 갖는 화합물이 기술되어 있거나 그에 관한 것이다. 미국특허 제4,391,731 (Boller 등)은 액정 조성물에 유용한 테트라하이드로나프탈렌 유도체를 기술하고 있다.
Kagechik 등의 문헌 J. Med. Chem 32:834 (1989)는 레티노이드-유사 활성을 갖는 특정 6-(3-옥소-1-프로페닐)-1,2,3,4-테트라메틸-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌 유도체 및 연관된 프라본 화합물을 기술하고 있다. Shudo 등의 문헌 Chem. Pharm. Bull. 33-404 (1985) 및 Jetten 등의 문헌 Cancer Research 47:3523 (1987)에는 또한 3-옥소-1-프로페닐 유도체 (찰콘 화합물) 및 이들의 레티노이드-유사 또는 연관된 생물학적 활성이 기술되어 있거나 그에 관한 것이다.
불행하게도 레티노이드-유사 활성을 갖는 화합물(레티노이드)는 또한 두통, 배자기형발생, 점막피부 독성, 근육골격 독성, 지혈증 장애, 피부 자극 및 간독성을 포함하여 치료용량 수준에서 많은 부작용을 일으킨다. 이들 부작용은 질병을 치료하는데 있어서 레티노이드의 적용 및 이용에 제약을 준다.
현재 본 분야에 일반적으로 알려져 있기로는 포유동물 ( 및 기타 유기체)에 두 가지 주요 유형의 레티노이드 수용체가 존재한다. 이러한 두 가지 유형의 수용체를 각각 RAR 및 RXR로 지칭하고 있다. 각 유형에는 아유형이 있는데 RAR의 경우는 RAR-α, RAR-β 및 RAR-γ가 있고 RXR의 경우도 RXR-α, RXR-β 및 RXR-γ가 있다. 두 유형의 수용체는 이들의 리간드 결합 특이성에 따라 서로 구분될 수 있는 전사 인자이다. 모든-트란스-RA (ATRA)는 RAR-α, RAR-β 및 RAR-γ를 포함한 RAR 레틴산 수용체에 결합하여 활성화시킨다. 다른 리간드인 9-시스-RA (9CRA)는 RAR과 레티노이드 X 수용체 (RXR) 부류 둘다에 결합하여 활성화시킨다.
또한, 본 분야에는 두 가지 주요 레티노이드 수용체 유형의 분포와 몇 가지 아유형의 분포가 포유동물의 여러 조직이나 기관에서 균일하지 않은 것으로 알려져 있다. 게다가, 본 분야에서 일반적으로 받아들여지고 있는 바로는 레티노이드의 많은 원치않는 부작용이 하나 이상의 RAR 수용체 아유형에 의해 매개되고 있다는 점이다. 따라서, 레티노이드 수용체에 효능제-유사 활성을 갖는 화합물 가운데 주요 유형의 하나에 대한 특이성 또는 선택성 및 수용체의 한 부류 내의 하나 이상의 아유형에 대한 특이성 또는 선택성이 원하는 약물특성으로 여겨지고 있다.
비교적 최근에 RAR 수용체와 결합하나 동일한 수용체의 효능제에 의한 반응을 유도하지 않는 화합물이 개발되었다. 따라서, 레티노이드 반응을 유도하지 않으면서 RAR 수용체와 결합하는 화합물은 생물학적 검정 및 계통에서 RAR 효능제의 활성을 좀더 적게 또는 크게 차단할 수 있다. 더욱 특히, 공개된 PCT 특허원 제WO 94/14777호는 RAR 레티노이드 수용체와 결합하는 특정 헤테로사이클릭 카르복실산 유도체를 기술하고 여드름, 건선, 류마티스성 관절염 및 비루스성 감염증과 같은 특정 질병 또는 상태의 치료에 유용하다고 언급하고 있다. 유사한 기술내용이 Yoshimura 등의 문헌 J. Med. Chem. 38: 3163-3173 (1995)에 기술되어 있다. Kaneko 등의 문헌 Med. Chem. Res. 1:220-225 (1991), Apfel 등의 문헌 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7129-7133 August 1992 Cell Biology, Eckhardt 등의 문헌 Toxicology Letters 70:299-308 (1994), Keidel 등의 Molecular and Cellular Biology 14:287-298 (1994) 및 Eyrolles 등의 J. Med. Chem. 37:1508-1517 (1994)은 하나 이상의 RAR 레티노이드 아유형에 길항제 유사 활성을 갖는 화합물을 기술하고 있다.
레티노이드 화합물의 요법에 따른 바람직하지 않은 부작용이외에 경우에 따라 비타민 A 또는 비타민 A 전구체의 과다용량에 의해 심각한 의학적 상태가 발생된다. 이러한 상태는 비타민 보충제의 과다한 복용 또는 고수준의 비타민을 함유하는 특정 어류 및 동물의 간을 섭취한데서 기인한다. 비타민 A 과다증후군에서 관찰되는 만성 또는 급성 독성에는 두통, 피부박리, 골독성, 지혈증 장애 등이 포함된다. 최근 몇 년간에 걸쳐 비타민 A 유사체 (즉, 레티노이드)에 의해 관찰된 독성은 비타민 A 과다증후군의 독성을 반드시 재현하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실은 공통된 생물학적 원인으로 RAR 활성화를 시사한다. 이들 독성은 현재 보조 조치에 의해 주로 치료되며 또한 간, 비타민 보충제 또는 레티노이드와 같은 원인 물질에 더 이상 노출되지 않도록 함으로써 치료되고 있다. 독성중 일부는 시간이 경과하면서 해소되기는 하나 어떠한 독성(예, 조기 골단판 폐쇄)은 영구적이다.
일반적으로 말해서, 특정 해독제가 약물에 의한 독성을 치료하는데 최적이기는 하나 기존의 수 천개 가운데 불과 약 이십 여개의 화학물질이나 이들의 부류만이 특정적으로 알려진 해독능을 지니고 있다. 특정 해독제가 비타민 A 과다증 및 레티노이드 독성의 치료에 가치가 있음은 분명하다. 사실, 점증적으로 효능적인 레티노이드가 임상적으로 사용됨에 따라 레티노이드 독성에 대해 특이적인 해독제가 생명을 구할 수 있을 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은 하기 일반식(1)의 화합물을 제공한다:
상기식에서,
X는 S, O, NR'(여기서, R'는 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이다) 또는 [C(R1)2]n(여기서, R1은 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이고 n은 0 내지 2의 정수이다)이고;
R2는 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬, F, Cl, Br, I, CF3, 불소 치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬, OH, SH, 탄소수 1 내지 6의 알콕시 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬티오이며;
R3은 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 F이고;
m은 0 내지 3의 정수이며;
o는 0 내지 3의 정수이고;
Z는, -N=N-, -N=CR1-, -CR1=N, -(CR1=CR1)n'-(여기서, n'는 0 내지 5의 정수이다), -CO-NR1-, -CS-NR1-, NR1-CO, -NR1-CS, -COO-, -OCO-, -CSO- 또는 -OCS-이고;
Y는 페닐 또는 나프틸 그룹이거나 피리딜, 티에닐, 퓨릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸릴로 이루어진 그룹중에서 선택된 헤테로아릴이거나(여기서, 페닐과 헤테로아릴은 임의로 하나 또는 두 개의 R2그룹으로 치환된다), Y는 Z가 -(CR1=CR1)n'-이고 n'가 3, 4 또는 5일 경우 (CR1=CR1)n'과 B사이에 직접 결합을 나타내고;
A는 (CH2)q(여기서, q는 0 내지 5이다), 탄소수 3 내지 6의 저급 측쇄 알킬, 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬, 탄소수 2 내지 6이고 이중결합이 한 개 또는 두 개인 알케닐, 탄소수 2 내지 6이고 삼중결합이 한 개 또는 두 개인 알키닐이며;
B는 수소, COOH 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, COOR8, CONR9R10, -CHOH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O 또는 트리-저급 알킬실릴이고, 여기서, R7은 탄소수 1 내지 5의 알킬, 사이클로알킬 또는 알케닐 그룹이고, R8은 탄소수 1 내지 10의 알킬 그룹 또는 트리메틸실릴알킬 (여기서, 알킬 그룹은 탄소수가 1 내지 10이다) 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬 그룹이거나 R8은 페닐 또는 저급 알킬페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬, 또는 페닐 또는 저급 알킬페닐이고, R11은 저급 알킬, 페닐 또는 저급 알킬페닐이며, R12은 저급 알킬이고 R13은 탄소수 2 내지 5의 이가 알킬 라디칼이고;
R14은 (R15)r-페닐, (R15)r-나프틸 또는 (R15)r-헤테로아릴 (여기서, 헤테로아릴 그룹은 O, S 및 N으로 이루어진 그룹중에서 선택된 1 내지 개의 헤테로원자를 갖고 r은 0 내지 5의 정수이다);
R15은 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8), OH, OCOR8, OR8, CN, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 불소 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬, 탄소수 1 내지 10이고 이중결합이 1 내지 3개인 알케닐, 탄소수 1 내지 10이고 삼중결합이 1 내지 3개인 알키닐 또는 트리알킬실릴 또는 트리알킬실릴옥시 (여기서, 알킬 그룹은 독립적으로 탄소수가 1 내지 6이다)이다.
또한, 본 발명은 하기 일반식(101)의 화합물을 제공한다:
상기식에서,
X는 S, O, NR'(여기서, R'는 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이다) 또는 [C(R1)2]n(여기서, R1은 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이고 n은 0 내지 2의 정수이다)이고;
R2는 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬, F, Cl, Br, I, CF3, 불소 치환된 9탄소수 1 내지 6의 알킬, OH, SH, 탄소수 1 내지 6의 알콕시 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬티오이며;
R3은 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 F이고;
m은 0 내지 3의 정수이며;
o는 0 내지 3의 정수이고;
Y는 페닐 또는 나프틸 그룹이거나 피리딜, 티에닐, 퓨릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸릴로 이루어진 그룹중에서 선택된 헤테로아릴이고(여기서, 페닐과 헤테로아릴은 임의로 하나 또는 두 개의 R2그룹으로 치환된다);
A는 (CH2)q(여기서, q는 0 내지 5이다), 탄소수 3 내지 6의 저급 측쇄 알킬, 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬, 탄소수 2 내지 6이고 이중결합이 한 개 또는 두 개인 알케닐, 탄소수 2 내지 6이고 삼중결합이 한 개 또는 두 개인 알키닐이며;
B는 수소, COOH 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O 또는 트리-저급 알킬실릴이고, 여기서, R7은 탄소수 1 내지 5의 알킬이고, R8은 탄소수 1 내지 10의 알킬 그룹 또는 트리메틸실릴알킬 (여기서, 알킬 그룹은 탄소수가 1 내지 10이다) 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬 그룹이거나 R8은 페닐 또는 저급 알킬페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬, 또는 페닐 또는 저급 알킬페닐이고, R11은 저급 알킬, 페닐 또는 저급 알킬페닐이며, R12은 저급 알킬이고 R13은 탄소수 2 내지 5의 이가 알킬 라디칼이고;
R14은 (R15)r-페닐, (R15)r-나프틸 또는 (R15)r-헤테로아릴 (여기서, 헤테로아릴 그룹은 O, S 및 N으로 이루어진 그룹중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖고 r은 0 내지 5의 정수이다);
R15은 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8), OH, OCOR8, OR8, CN, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 불소 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬, 탄소수 1 내지 10이고 이중결합이 1 내지 3개인 알케닐, 탄소수 1 내지 10이고 삼중결합이 1 내지 3개인 알키닐 또는 트리알킬실릴 또는 트리알킬실릴옥시 (여기서, 알킬 그룹은 독립적으로 탄소수가 1 내지 6이다)이고;
R16은 H 또는 탄소수 1 내지 6의 저급 알킬이며;
R17은 H, 탄소수 1 내지 6의 저급 알킬, OH 또는 OCOR11이고;
p는 0 또는 1이며, 단, p가 1일 때 R17치환체 그룹은 없고, m은 0 내지 2의 정수이다.
본 발명의 화합물은 특정 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위하여 투여되는 레티노이드의 원치않는 특정 부작용을 예방하는데 유용하다. 이 목적을 위해 본 발명의 화합물은 레티노이드와 함께 동시투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 레티노이드 약물 또는 비타민 A의 과다용량 또는 이에 의한 독성으로 인한 급성 또는 만성 독성을 치료하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 포유동물을 포함한 생물학적 계통에서 모든 또는 일부의 RAR 수용체 부위를 차단하여 수용체 부위에서 RAR 효능제의 작용을 방지 또는 감소시키기 위한 RAR 길항제의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 레티노이드 (비타민 A 또는 비타민 A 전구체를 포함) 만성 또는 급성 독성과 레티노이드 요법의 부작용을 (a) 예방 및 (b) 치료하기 위한 RAR 길항제의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 특정 관점으로서 포유동물의 병리상태를 치료하는 방법을 제공한다. 치료되는 상태는 레틴산 수용체 활성과 연관이 있다. 이 방법은 레틴산 수용체 아유형인 RARα, RARβ및 RARγ중의 하나에 결합할 수 있는 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 그 길항제 또는 음성 호르몬은 포유동물의 병리상태에 대해 치료능을 제공하기에 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
급성 또는 만성 레티노이드 또는 비타민 A 독성에 대한 해독제로서 RAR 길항제를 포유동물에 장내(예, 위장내삽관법 또는 음식/물 혼합법) 또는 비경구(예, 십이지장내, 근육내, 피하, 국부)로 투여할 수 있다. 투여경로에 대한 유일한 요건은 길항제를 표적 조직에 전달할 수 있어야 한다는 것이다. RAR 길항제는 단독으로 또는 부형제와 혼합하여 제형될 수 있다. RAR 길항제는 예를 들면 장내로 사용하는 경우에 액제로 제형될 필요가 없다.
레티노이드 요법의 보조제로서 및 투여되는 레티노이드 약물의 여러 부작용을 예방하기 위하여 RAR 길항제를 유사하게 장내 또는 비경구로 투여할 수 있다. RAR 길항제와 RAR 효능제는 동일한 경로로 투여할 필요가 없다. 중요한 것은 충분한 양의 RAR 길항제가 RAR 효능제에 노출되는 동안에 목적하는 조직에 계속적으로 존재해야 한다는 것이다. 레티노이드 독성의 예방을 위하여 RAR 길항제를 RAR 효능제와 동시에 또는 RAR 효능제로 치료하기 전에 투여하는 것이 최상이다. 많은 경우에 있어서 RAR 길항제는 효능제와는 다른 경로로 투여된다. 예를 들면 장내로 투여된 레티노이드의 바람직하지 않은 피부 효과는 국소적으로 투여된 RAR 길항제에 의해 예방 또는 경감될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 레티노이드 음성 호르몬을 동정하는 방법이다. 이 방법은 적어도 단백질 도메인이 완전한 레티노이드 수용체의 DNA 결합 도메인 C-말단에 위치한 재조합 레티노이드 수용체의 결합에 대해 전사적으로 반응하는 레포터 유전자를 갖는 형질감염 세포를 수득하고, 첨가된 레티노이드가 없는 상태에서 증식된 미처리 형질감염 세포에서의 레포터 유전자의 기본 발현 수준을 측정하며, 음성 호르몬 활성에 대해 시험하기 위하여 형질감염 세포를 레티노이드 화합물로 처리하고, 처리된 세포에서 레포터 유전의 발현 수준을 측정하며, 처리세포와 미처리세포에서 측정된 레포터 유전자의 발현 수준을 비교하고, 레티노이드 음성 호르몬으로서 미처리 세포에서 측정된 레포터 유전자의 기본 발현 수준에 비하여 처리세포에서 낮은 수준의 레포터 유전자 발현 수준을 생성하는 레티노이드 화합물을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 완전한 수용체는 RARα, RARβ및 RARγ아유형이다. 다른 양태로서 완전한 수용체는 RXRα, RXRβ및 RXRγ아유형이다. 재조합 수용체는 또한 재조합 RAR 또는 RXR 수용체일 수 있다. 일부 양태로서, 재조합 수용체는 구성 전사 활성화제 도메인을 갖는 키메릭 레티노이드 수용체이다. 이러한 구성 전사 활성화제 도메인은 전체 음성 전하를 띄는 다수의 아미노산을 포함하거나 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP-16 전사 활성화제 도메인과 같은 바이러스성 전사 활성화제 도메인의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구성 전사 활성화제 도메인이 전체 음성 전하를 띄는 양태로서, 레티노이드 수용체는 재조합체이고 이로부터 DNA 결합 도메인 (예, 레틴산 반응 요소외에 다른 시스-조절 요소에 대해 특이적인 DNA 결합 도메인)이 결실될 수 있다. 형질감염 세포는 바람직하게는 실질적으로 내인성 레티노이드 (예, 활성화된 목탄 추출 혈청을 포함한 것)가 없는 성장 배지에서 증식된다. 이 방법에서, 레포터 유전자는 루시퍼라제 유전자일 수 있다. 이 경우 측정 단계는 발광측정을 포함할 수 있다. 또한, 레포터 유전자는 β-갈락토시다제 유전자일 수 있다. 이 경우는 측정 단계가 β-갈락토시다제 검정을 포함한다. 형질감염 세포는 녹색 원숭이 세포 또는 사람 세포와 같은 형질감염 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 포유동물에 투여된 스테로이드 상과 수용체 효능제의 약물 활성을 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 스테로이드 상과 수용체 효능제와 함께 스테로이드 상과 수용체 효능제의 약물 활성을 증폭시키기 위한 약제학적 유효량의 레티노이드 음성 호르몬을 포함한 조성물을 포유동물에 동시투여하는 것을 포함한다. 약물 활성은 예를 들면 항-AP-1 활성을 측정함으로써 시험관내 레포터 유전자 트란스-활성화 검정에서 측정가능하다. 증폭될 약물 활성은 망막 색소 상피에서 측정가능한 유형의 활성과 같은 증식억제 활성일 수 있다. 스테로이드 상과 수용체 효능제는 레티노이드 수용체 효능제, 비타민 D 수용체 효능제, 글루코코르티코이드 수용체 효능제, 갑사언 호르몬 수용체 효능제, 페록시좀 증식제-활성화된 수용체 효능제 또는 에스트로겐 수용체 효능제일 수 있다. 레티노이드 수용체 효능제는 올-트란스-레틴산 또는 13-시스 레틴산과 같은 RAR 효능제일 수 있다. 레티노이드 수용체 효능제는 또한 RXR 효능제일 수 있다. 바람직한 비타민 D 수용체 효능제는 1,25-디하이드록시비타민 D3일 수 있다. 바람직한 글루코코르티코이드 수용체 효능제는 덱사메타손이다. 바람직한 갑상선 호르몬 수용체 효능제는 바람직하게는 30 nM 이하 또는 거의 대등한 해리 상수를 갖는 3,3',5-트리요오도티로닌이다. RAR-특이적 레티노이드 음성 호르몬의 예로는 AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 및 AGN 193871이 포함된다. 약제학적으로 유효한 용량의 레티노이드 음성 호르몬을 포함한 조성물은 스테로이드 상과 효능제와 동시투여할 수 있고 공동투여전에 배합할 수 있다. 이들은 또한 별도의 조성물로서 공동투여할 수 있다.
본 발명은 레티노이드 음성 호르몬 및/또는 레티노이드 길항제-유사 생물학적 활성을 갖는 신규한 화합물에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 치환된 3-옥소-1-프로페닐 그룹에 의해 치환될 수 있는 4-아릴 치환된 벤조피란, 4-아릴 치환된 벤조티오피란, 4-아릴 치환된 1,2-디하이드로퀴놀린 및 8-아릴 치환된 5,6-디하이드로나프탈렌 유도체에 관한 것이다. 이들 신규한 화합물은 레티노이드 길항제 유사-활성을 가지며 레티노이드, 비타민 A 및 비타민 A 전구체에 의해 유도된 포유동물에서의 독성을 억제 또는 치료하거나 원치않는 또는 바람직하지 않는 부작용을 억제 또는 경감시키기위해 레티노이드로 포유동물을 치료하기 위한 보조제로서 유용하다. 또한, 본 발명은 다른 레티노이드 및 스테로이드 호르몬의 생물학적 활성을 증대시키고 리간드가 없는 레틴산 수용체의 기본 활성을 억제시키기 위한 레티노이드 음성 호르몬의 용도에 관한 것이다.
도 1은 AGN 193109의 화학 구조를 보여준다
도 2A 내지 도 2F는 AGN 193109가 RAR에서의 ATRA-의존 트란스활성화를 억제했음을 보여주는 일련의 선 그래프이다. 도2A 및 도2B는 RAR-α 수용체에서의 활성을 나타내고 도2C 및 도2D는 RAR-β 수용체에서의 활성을 나타내며 도2E 및 도2F는 RAR-γ 수용체에서의 활성을 나타낸다. 도2A, 도2C 및 도2E에서 흰 사각형은 레틴산 처리를 나타내고 검정 원형은 AGN 193109 처리를 나타낸다. 도2B, 도2D 및 도2F에서 일직선은 10-8M ATRA 및 여러 농도의 AGN 193109로 처리한 후 측정한 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도3A 및 도3B는 레포터 플라스미드 ERE-tk-Luc 및 발현 플라스미드 ER-RAR-α로 형질감염되고 여러 농도의 ATRA(도3A) 또는 AGN 193109(도3B)로 자극된 CV-1 세포에서 검출된 루시퍼라제 활성을 나타내는 선 그래프이다. 데이터 포인트는 세 개의 독립된 루시퍼라제 측정치의 평균±표준편차를 나타낸다. 상이한 양의 공동형질감염된 ER-RAR-α(0.05, 0.1 및 0.2 μg/웰)을 사용하여 실시한 형질감염의 결과는 각 도에 표시되어 있다.
도4A 및 도4B는 레포터 플라스미드 ERE-tk-Luc 및 발현 플라스미드 ER-RAR-β로 형질감염되고 여러 농도의 ATRA(도4A) 또는 AGN 193109(도4B)로 자극된 CV-1 세포에서 검출된 루시퍼라제 활성을 나타내는 선 그래프이다. 데이터 포인트는 세 개의 독립된 루시퍼라제 측정치의 평균±표준편차를 나타낸다. 상이한 양의 공동형질감염된 ER-RAR-β(0.05, 0.1 및 0.2 μg/웰)을 사용하여 실시한 형질감염의 결과는 각 도에 표시되어 있다.
도5A 및 도5B는 레포터 플라스미드 ERE-tk-Luc 및 발현 플라스미드 ER-RAR-γ로 형질감염되고 여러 농도의 ATRA(도5A) 또는 AGN 193109(도5B)로 자극된 CV-1 세포에서 검출된 루시퍼라제 활성을 나타내는 선 그래프이다. 데이터 포인트는 세 개의 독립된 루시퍼라제 측정치의 평균±표준편차를 나타낸다. 상이한 양의 공동형질감염된 ER-RAR-γ(0.05, 0.1 및 0.2 μg/웰)을 사용하여 실시한 형질감염의 결과는 각 도에 표시되어 있다.
도6은 ERE-tk-Luc 레포터 플라스미드와 ER-RAR-α 키메릭 수용체 발현 플라스미드로 공동형질감염되거나 ERE-tk-Luc 레포터 플라스미드와 ER-RXR-α 키메릭 수용체 발현 플라스미드와 RAR-γ-VP-16 발현 플라스미드로 공동형질감염된 CV-1 세포의 ATRA 및 AGN 193109 용량 반응을 보여준다. ER-RXR-α 공동형질감염된 세포를 ATRA(사각형) 및 AGN 193109(다이아몬드)로 처리하였다. ER-RXR-α와 RAR-γ-VP-16으로 공동형질감염된 세포를 ATRA(원형) 또는 AGN 193109(삼각형)으로 처리하였다.
도7은 ERE-tk-Luc 레포터와 ER-RAR-γ 발현 작제물로 형질감염된 다음 10-8M의 ATRA 및 수평축에 표시된 농도의 시험 화합물로 처리된 CV-1 세포의 용균물에서 기록된 루시퍼라제 활성 측정치를 나타내는 선 그래프이다. 시험 화합물은 AGN 193109(사각형), AGN193357(흰 다이아몬드), AGN 193385(원형), AGN 193389(삼각형), AGN 193840(빗금친 사각형) 및 AGN 192870(검정 다이아몬드)이다.
도8은 ERE-tk-Luc 레포터와 RAR-γ-VP-16 발현 작제물로 형질감염된 다음 수평축에 표시된 농도의 시험 화합물로 처리된 CV-1 세포의 용균물에서 기록된 루시퍼라제 활성 측정치를 나타내는 선 그래프이다. 시험 화합물은 ATRA(흰 사각형), AGN 193109(흰 원형), AGN193174(흰 삼각형), AGN 193199(빗금친 사각형), AGN 193385(빗금친 원형), AGN 193389(역 삼각형), AGN 193840(구형 채워진 사각형) 및 AGN 193871(반-검정 다이아몬드)이다.
도9A, 도9B 및 도9C는 트란스활성화 검정과 관련하여 도해된 음성 보조활성화제 단백질(-)과 RAR(음영 상자)사이의 상호작용을 AGN 193109가 조절할 수 있는 기전에 대한 다이아그램이다. 도9A는 음성 보조활성화제 단백질과 양성 보조활성화제 단백질(+)이 RAR과의 결합 평형에 있음을 보여준다. 리간드이 부재하에 레포터 유전자의 기본 수준 전사가 얻어진다. 도9B에 도해된 바와 같이 RAR 효능제의 첨가는 RAR과 양성 보조활성화제 단백질의 결합을 촉진하고 상승조절된 레포터 유전자 전사를 낳는다. 도9C에 도해된 바와 같이 AGN 193109의 첨가는 음성 보조활성화제 단백질과 RAR의 결합을 촉진하고 레포터 유전자 전사를 억제한다.
도10은 AGN 193109의 농도는 10-8M로 고정해 두고 AGN 191183 농도(10-10내지 10-12M)의 함수로서 TPA-유도된 Str-AP1-CAT 발현의 억제를 보여주는 막대 그래프이다. AGN 191183 단독으로 실시된 시험의 결과는 빗금친 막대로 나타나 있고 띠형 막대는 AGN 193109와 AGN 191183의 병합 처리에 의한 결과를 보여준다.
도11은 AGN 193109가 RAR과 다른 핵 수용체과 일원의 활성을 증폭할 수 있는 기전에 관한 다이아그램이다. 이 다이아그램에 도해된 바와 같이, 도입된 RAR(AB-C-DEF 도메인을 갖는 흰 사각형)는 한정된 공급으로 존재하는 음성 보조활성화제 단백질(ncp)가 RAR상에 은폐하고 그럼으로써 두 개의 군 RAR+ncp와 RAR-ncp를 유도하기 때문에 항-AP1 검정에서 RAR 리간드에 대해 민감성을 증가시켰다. RAR-ncp는 리간드에 대한 민감성을 증가시켰다. 비-RAR 핵 인자(AB-C-DEF 도메인을 갖는 음영 사각형)는 ncp가 AGN 193109의 활성에 의해 RAR에 은폐하기 때문에 동질의 리간드에 대한 민감성을 증가시켰다. 핵 수용체의 모듈 도메인은 표준 명명법에 따라 "AB"(리간드 독립 트란스활성화 도메인), "C"(DNA 결합 도메인) 및 "DEF"(리간드 조절된 트란스활성화 도메인 및 이량체화 도메인)로서 지정한다.
도12는 MTV-DR3-Luc 레포터 플라스미드로 형질감염된 CV-1 세포에서 1,25-디하이드록시비타민 D3용량 반응에 미치는 AGN 193109의 영향을 보여주는 선 그래프이다. 형질감염체를 1,25-디하이드록시비타민 D3(검정 사각형), 1,25-디하이드록시비타민 D3와 10-8M AGN 193109 (검정 삼각형) 및 1,25-디하이드록시비타민 D3과 10-7M AGN 193109(검정 원형)으로 처리하였다.
도13은 TPA 유도된 Str-AP1-CAT 활성의 1,25-디하이드록시비타민 D3-매개된 억제에 미치는 AGN 193109(10 nM)의 영향을 보여주는 막대 그래프이다. 검정 막대는 1,25-디하이드록시비타민 D3단독으로 처리된 형질감염 세포에서 CAT 활성의 억제를 나타낸다. 흰 막대는 1,25-디하이드록시비타민 D3과 AGN 193109로 병합 처리된 형질감염 세포에서 CAT 활성의 억제를 나타낸다.
도14는 RAR-γ 및 RAR 반응성 MTV-TREp-Luc 레포터 작제물로 공동형질감염된 헬라세포에 미치는 AGN 193109 단독 또는 이와 AGN 191183의 병합의 영향을 보여주는 선 그래프이다. 이 그래프에 도해된 약물 처리는 다음과 같다: AGN 193109 단독(사각형), AGN 19310와 10-10M의 AGN 191183의 병합, 및 AGN 193109와 10-9M의 AGN 191183의 병합.
도15는 ECE16-1 세포가 EGF(검정 사각형)에 반응하여 증식하나 단독의 특정 배지(흰 원형)에 반응하여 증식하지 않음을 보여주는 선 그래프이다. AGN 193109 단독으로 처리된 세포는 검정 삼각형으로 나타나 있다. 검정 원형은 10 nM AGN 191183과 0 내지 1000 nM AGN 193109로 처리된 세포에 대해 얻은 결과를 나타낸다.
도16은 AGN 191183 레티노이드 효능제의 존재 또는 부재하에 CaSki 세포의 증식에 미치는 AGN 193109의 영향을 보여주는 막대 그래프이다. 단독의 특정 배지(DM)에서 증식된 샘플(흰 막대)을 제외하고 모든 샘플 그룹은 20 ng/ml의 상피 성장 인자(EGF)를 도입받았다. 띠형 막대는 1000 nM AGN 193109의 존재하에 증식된 샘플을 나타낸다. 이 과정에서 사용된 AGN 191183의 농도는 수평축에 나타나 있다.
도17은 AGN 193109가 망막 색소 상피(RPE) 세포에 ATRA의 증식억제 활성을 증폭시켰음을 보여주는 용량반응곡선이다. ATRA 단독으로 처리된 샘플은 검정 사각형으로 나타나 있다. ATRA와 AGN 193109(10-7M)의 병합으로 처리된 샘플은 검정 원형으로 나타나 있다. 여러 샘플을 처리하기 위해 사용된 ATRA 농도는 수평축에 나타나 있다.
도18은 13-시스-RA 및 ATRA 둘다가 RPE 세포 성장을 억제하였고 AGN 193109가 13-시스-RA의 증식억제 활성을 증폭시켰음을 보여주는 용량반응곡선이다. 용량반응에서 나타나 있는 샘플 처리에는 13-시스-RA 단독(검정 사각형), 13-시스-RA와 AGN 193109(10-6)(검정 원형), 13-시스-RA와 AGN 193109(10-8M)의 병합(검정 삼각형) 및 ATRA(검정 다이아몬드)가 포함된다. 샘플처리에서 사용된 13-시스-RA와 ATRA의 농도는 수평축에 나타나 있다.
도19는 AGN 193109가 일차 RPE 세포 배양에서 덱사메타손의 증식억제 활성을 증폭하였음을 보여주는 용량반응곡선이다. 용량반응에서 보여진 여러 샘플에는 ATRA(검정 사각형), 단독의 덱사메타손(검정 원형), 덱사메타손과 AGN 193109(10-8M)의 병합(검정 삼각형) 및 덱사메타손과 AGN 193109(10-6M)의 병합(검정 다이아몬드)이 포함된다. 샘플처리에 사용된 덱사메타손과 ATRA의 농도는 수평축에 나타나 있다.
도20은 AGN 193109가 일차 RPE 세포 배양에서 갑상선 호르몬(T3)의 증식억제 활성을 증폭하였음을 보여주는 용량반응곡선이다. 용량반응에서 보여진 여러 샘플에는 ATRA(검정 사각형), 단독의 T3(검정 원형), T3과 AGN 193109(10-8M)의 병합(검정 삼각형) 및 T3과 AGN 193109(10-6M)의 병합(검정 다이아몬드)이 포함된다. 샘플처리에 사용된 T3과 ATRA의 농도는 수평축에 나타나 있다.
서열목록
(1) 일반정보
(i) 출원인: 비젼 파마슈티칼즈 엘.피. 알러간으로서 사업을 행하는 텍사스 리미티드 파트너쉽
(ii) 발명의 명칭: 음성 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드 화합물의 제조방법 및 용도
(iii) 서열 수: 9
(iv) 연락 주소:
(A) 연락인: 알러간
(B) 가: 2525 듀퐁 드라이브
(C) 시: 어어빈
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 92612
(v) 컴퓨터 해독 형태
(A) 매개형태: 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM 호환
(C) 작동 시스템: 윈도우즈 95
(D) 소프트웨어: 윈도우즈 버전 2.0용 FastSEQ
(vi) 현 출원 데이터:
(A) 출원번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 선출원 데이터:
(A) 출원번호: 08/613,863
(B) 출원일: 1996년 3월 11일
(A) 출원번호: 08/522,778
(B) 출원일: 1995년 9월 1일
(A) 출원번호: 08/522,779
(B) 출원일: 1995년 9월 1일
(A) 출원번호: 08/542,648
(B) 출원일: 1995년 10월 13일
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 카를로스 에이 피셔
(B) 등록번호: 36,510
(C) 참조번호: 17171CIP
(ix) 연락정보:
(A) 전화번호: 714-246-4920
(B) 팩스번호: 714-246-4249
(C) 텔렉스
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 1
TCAGGTCACC AGGAGGTCAG A
(2) 서열 2에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 101 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 2
(2) 서열 3에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 101 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 3
(2) 서열 4에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 4
GTACAAGGTT CACGAGGTTC ACGTCTTA
(2) 서열 5에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 16 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 5
TCAGGTCATG ACCTGA
(2) 서열 6에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 6
CCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA
(2) 서열 7에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 7
TCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC
(2) 서열 8에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열 8
ACGCGTCCGG AAGACCTGGT
(2) 서열 9에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(xi) 서열 설명: 서열
9 ATTCTGCAGG TACATGTCCA
정의
본 발명의 목적을 위해 RAR 길항제는 1 마이크로몰 미만의 Kd(Kd<1μM)로 하나 이상의 RAR 아유형에 결합하지만 수용체 공동형질감염 검정에서 그 RAR 아유형-조절된 유전자의 유의적인 전사 활성화를 일으키지 않는 화학물질로서 정의된다. 통상적으로, 길항제는 효능제의 활성을 억제하는 화학물질이다. 따라서, 수용체 길항제의 활성은 통상적으로 효능제의 활성을 억제하는 능력으로서 측정한다.
RAR 효능제는 1 마이크로몰 미만의 Kd(Kd<1μM)로 하나 이상의 RAR 수용체 아유형에 결합하지만 수용체 공동형질감염 검정에서 그 RAR 아유형-조절된 유전자의 전사 활성화를 일으키는 화학물질로서 정의된다. 용어 "RAR 효능제"에는 RAR외에 다른 수용체, 예컨데 RXR 수용체와 결합하고/하거나 활성화할 수 있는 화학물질이 포함된다.
본 명세서에 사용된 음성 호르몬 또는 역 효능제는 어떠한 리간드의 존재하에서도 일어나는 기본 상태에 비하여 불활성 상태를 수용체가 채택하도록하는 수용체에 대한 리간드이다. 따라서, 길항제는 효능제의 활성을 억제할 수 있는데 반하여 음성 호르몬은 효능제의 부재하에 수용체의 형태를 변형시킬 수 있는 리간드이다. 음성 호르몬 또는 역 효능제의 개념은 본드 등에 의해 개발되었다[Bond et al., Nature 374:272 (1995)]. 더욱 특히, 본드 등은 비리간드된 β2-아드레노셉터가 불활성 형태와 자발적 활성 형태사이에 평형으로 존재하다는 것을 제시하였다. 효능제는 활성 형태에서 수용체를 안정화하는 것으로 제안되고 있다. 반대로 역 효능제는 불활성 수용체 형태를 안정화하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 길항제가 효능제를 억제하기 때문에 그 활성을 나타내는 한편 음성 호르몬은 비리간드된 수용체의 활성 형태로의 자발적인 전환을 억제함으로써 효능제의 부재하에 그 활성을 추가로 나타낼 수 있다. 단지 길항제의 서브세트만이 음성 호르몬으로서 작용할 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 AGN 193109는 길항제이고 음성 호르몬이다. 최근에 레티노이드의 어떠한 것도 음성 호르몬 활성을 나타낸다고 제시된 바 없다.
본 명세서에 사용된 두 개의 약제학적으로 활성인 화합물의 공동투여는 시험관내 또는 생체내 관계없이 두 개의 별개의 화학물질의 전달을 의미한다. 공동투여는 별개 물질의 동시 전달, 혼합 물질의 동시 전달 및 한 물질의 전달 후 두 번째 물질의 전달을 의미한다. 모든 경우에 있어서 공동투여되는 물질은 서로 공동작용한다.
용어 알킬은 노르말 알킬, 측쇄 알킬 및 사이클로알킬로 알려진 모든 그룹을 의미한다. 용어 알케닐은 하나 이상의 불포화 부위를 갖는 노르말 알케닐, 측쇄 알케닐 및 사이클로알케닐 그룹을 포함한다. 유사하게, 용어 알키닐은 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 노르말 알키닐 및 측쇄 알키닐을 포함한다.
저급알킬은 노르말 저급알킬의 경우에 1 내지 6개의 탄소를, 저급측쇄 및 사이클로 그룹의 경우 3 내지 6개의 탄소를 갖는 알킬 그룹의 상기 정의된 넓은 정의를 의미한다. 저급 알케닐은 노르말 저급알케닐 그룹의 경우 2 내지 6개의 탄소를, 측쇄 및 사이클로 저급알케닐 그룹의 경우 3 내지 6개의 탄소를 갖는 것으로 정의된다. 또한, 저급알키닐은 노르말 저급알키닐 그룹의 경우 2 내지 6개의 탄소를, 측쇄 저급 알키닐 그룹의 경우 4 내지 6개의 탄소를 갖는 것으로 정의된다.
본 명세서에 사용된 용어 "에스테르"는 유기화학에서 고전적으로 사용된 용어의 정의에 속하는 모든 화합물을 포함한다. 이는 유기 및 무기 에스테를 포함한다. 일반식(1) 또는 일반식(101)에서 B가 -COOH인 경우 이 용어는 그 작용기를 알콜 또는 티올, 바람직하게는 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜로 처리하여 유도된 생성물을 포함한다. 에스테르가 B가 -CH2OH인 화합물로부터 유도되는 경우, 이 용어는 인-기본 및 황-기본 산을 포함한 에스테르를 형성할 수 있는 유기산으로부터 유도된 화합물 또는 R11이 바람직하게는 지방족 부분에 1 내지 6개의 탄소를 갖는 치환 또는 비치환된 지방방향족 그룹 또는 치환 또는 비치환된 헤테로방향족, 방향족, 지방족 그룹을 포함한다.
본 명세서에 달리 언급되어 있지 않는 한, 바람직한 에스테르는 탄소원자 10개 이하의 포화된 지방족 알콜 또는 산 또는 탄소원자 5 내지 10개의 사이클릭 또는 포화된 지환족 알콜 및 산으로부터 유도된다. 특히 바람직한 지방족 에스테르는 저급알킬 산 및 알콜로부터 유도된 것이다. 또한, 페닐 또는 저급알킬 페닐 에스테르가 바람직하다.
아미드는 유기화학에서 고전적으로 정의된 것을 포함한다. 이 경우에 있어서, 아미드로는 비치환된 아미드 및 모든 지방족 및 방향족 일 및 이 치환된 아미드가 포함된다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한 바람직한 아미드는 10개 이하의 탄소원자를 갖는 포화된 지방족 라디칼 또는 탄소원자 5 내지 10개를 갖는 사이클릭 또는 포화된 지환족 라디칼로부터 유도된 일 및 이 치환된 아미드이다. 특히 바람직한 아미드는 치환되고 비치환된 저급 알킬 아민으로부터 유도된 것이다. 또한 바람직한 것은 치환되고 비치환된 페닐 또는 저급 알킬페닐 아민으로부터 유도된 일 및 이 치환된 아미드이다. 비치환된 아미드 또한 바람직하다.
아세탈 및 케탈에는 K가 (-OR)2인 일반식-CK의 라디칼이 포함된다. 여기서, R은 저급알킬이다. 또한, K는 R7이 탄소수 2 내지 5의 직쇄 또는 측쇄 저급알킬인 -OR7O-일 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염은 염을 형성할 수 있는 작용기(예, 산 작용기)를 갖는 본 발명의 어떠한 화합물에 대해서도 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 모 화합물의 활성을 유지하고 투여받는 대상자 및 투여와 관련하여 어떠한 해로운 부작용도 제공하지 않는 염이다.
약제학적으로 허용되는 염은 유기 또는 무기 염기로부터 유도될 수 있다. 이 염은 일가 또는 다가 이온일 수 있다. 특히 관심이 있는 것은 무기 이온으로 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘이다. 유기 염은 아민, 특히 일, 이 및 삼 알킬 아민과 같은 암모늄염 또는 에탄올 아민으로 만들 수 있다. 염은 또한 카페인, 트로메타민 및 유사한 분자로 형성될 수 있다. 산부가염을 형성할 수 있도록 충분히 염기성인 질소가 있는 경우 염은 무기 또는 유기산 또는 요오드화 메틸과 같은 알킬화제로 형성될 수 있다. 바람직한 염은 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산으로 형성된 것이다. 또한, 일, 이 또는 삼 산과 같은 단순한 많은 유기산이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 가운데 일부는 트란스 및 시스(E 및 Z) 이성체를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 함유할 수 있고 이에 따라 에난티오머 형태 및 디아스테레오머 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 범위는 모든 이성체 자체, 시스와 트란스 이성체의 혼합물, 디아스테레오머의 혼합물 및 에난티오머(광학 이성체)의 라세미 혼합물을 포함한다. 본 명세서에 화합물 또는 비대칭 탄소의 형태 (시스, 트란스 또는 R 또는 S)에 관하여 특별히 달리 언급되어 있지 않는 한 이러한 이성체의 혼합물이나 이들 이성체 중의 어느 하나인 것이다.
레티노이드 길항제 유사 생물학적 활성을 갖는 아릴 치환된 벤조피란, 벤조티오피란, 1,2-디하이드로퀴놀린 및 5,6-디하이드로나프탈렌 유도체
일반식(1)에서 심볼 Y와 관련하여, 본 발명의 바람직한 화합물은 Y가 페닐, 피리딜, 티에닐 또는 푸릴인 것이다. 더욱 바람직한 화합물은 Y가 페닐 또는 피리딜인 것이고 훨씬 더 바람직한 화합물은 Y가 페닐인 것이다. Y(페닐) 및 Y(피리딜)상의 치환과 관련하여, 바람직한 화합물은 페닐 그룹이 Z 및 A-B 그룹에 의해 1,4(파라) 치환되고 피리딘 환이 Z 및 A-B 그룹에 의해 2,5 치환된 것이다 (피리딘 명명에서 2,5 위치에서의 치환은 니코틴산 명명에서 6-위치에서의 치환에 상응한다). 본 발명의 바람직한 화합물에서 Y 그룹상에 임의 R2치환체는 없거나 임의 R2치환체는 불소이다.
바람직한 화합물의 A-B 그룹은 (CH2)n-COOH 또는 (CH2)n-COOR8(여기서, n 및 R8은 상기 정의된 바와 같다)이다. 더욱 바람직하게는 n은 0이고 R8은 저급알킬이거나 n은 0이고 B는 COOH이거나 이들의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물 가운데 바람직한 예의 대다수는 X가 [C(R1)2]n(여기서, n은 1이다)이다. 그러나, n이 0(인덴 유도체)이고 X가 S 또는 O(벤조티오피란 및 벤조피란 유도체)인 화합물도 바람직하다. X가 [C(R1)2]n이고 n이 1일 경우 R1은 바람직하게는 탄소수 1 내지 6의 알킬이며 더욱 바람직하게는 메틸이다.
일반식(1) 화합물의 테트라하이드로나프탈렌, 벤조피란, 벤조티오피란 또는 디하이드로퀴놀린 잔기의 방향족 부분에 연결된 R2그룹은 바람직하게는 H, F 또는 CF3이다. R3은 바람직하게는 수소 또는 메틸이고, 더욱 바람직하게는 수소이다.
본 발명의 화합물 및 일반식(1)에 나타낸 그룹 Z와 관련하여, 다수의 바람직한 예에서 Z는 아세틸렌 연결 ()을 나타낸다. 그러나, 연결그룹 Z는 디아조 그룹(Z=-N=N-), 올레핀 또는 폴리올레핀 그룹(Z=-(CR1=CR1)n-), 에스테르(Z=-COO-), 아미드(Z=-CO-NR2-) 또는 티오아미드(Z=-CS-NR2-) 연결로서 바람직하다.
R14그룹과 관련하여, 바람직한 화합물은 R14가 페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 2-티에닐 또는 2-티아졸릴인 것이다. R15그룹(R14그룹의 치환체)은 바람직하게는 H, 저급알킬, 트리플루오로메틸, 염소, 저급알콕시 또는 하이드록시이다.
가장 바람직한 본 발명의 화합물은 일반식(2), 일반식(3), 일반식(4), 일반식(5) 및 일반식(5a)와 관련하여 표1에 나타나 있고 일반식(5b) 및 일반식(5c)와 관련하여서는 표1A에 나타나 있다.
화합물번호 일반식 R14 * Z R2 * R8 *
1 2 4-메틸페닐 H Et
1a 2 페닐 H Et
2 2 3-메틸페닐 H Et
3 2 2-메틸페닐 H Et
4 2 3,5-디메틸페닐 H Et
5 2 4-에틸페닐 H Et
6 2 4-t-부틸페닐 H Et
7 2 4-클로로페닐 H Et
8 2 4-메톡시페닐 H Et
9 2 4-트리플루오로메틸페닐 H Et
10 2 2-피리딜 H Et
11 2 3-피리딜 H Et
12 2 2-메틸-5-피리딜 H Et
13 2 3-하이드록시페닐 H Et
14 2 4-하이드록시페닐 H Et
15 2 5-메틸-2-티아졸릴 H Et
15a 2 2-티아졸릴 H Et
16 2 4-메틸-2-티아졸릴 H Et
17 2 4,5-디메틸-2-티아졸릴 H Et
18 2 2-메틸-5-피리딜 H Et
19 2 2-피리딜 H Et
20 2 3-메틸페닐 H Et
21 2 4-에틸페닐 H Et
22 2 4-메톡시페닐 H Et
23 2 4-트리플루오로메틸페닐 H Et
24 2 3,5-디메틸페닐 H Et
25 2 4-클로로페닐 H H
26 2 3-피리딜 H H
27 2 2-메틸페닐 H H
28 2 3-하이드록시페닐 H H
39 2 4-하이드록시페닐 H H
30 2 5-메틸-2-티아졸릴 H H
30a 2 2-티아졸릴 H H
31 2 4-메틸-2-티아졸릴 H H
32 2 4,5-디메틸-2-티아졸릴 H H
33 2 5-메틸-2-티에닐 H H
33a 2 2-티에닐 H H
34 2 5-메틸-2-티에닐 H H
34a 2 2-티에닐 H H
35 2 4-메틸페닐 -CONH- H Et
36 2 4-메틸페닐 -CONH- H H
37 2 4-메틸페닐 -COO- H Et
38 2 4-메틸페닐 -COO- H (CH2)2Si(CH3)
39 2 4-메틸페닐 -COO- H H
40 2 4-메틸페닐 -CONH- F Et
41 2 4-메틸페닐 -CONH- F H
42 2 4-메틸페닐 -CSNH- H Et
43 2 4-메틸페닐 -CSNH- H H
44 2 4-메틸페닐 -CH=CH- H Et
45 2 4-메틸페닐 -CH=CH- H H
46a 2 4-메틸페닐 -N=N- H Et
46b 2 4-메틸페닐 -N=N- H H
47 2 4-메틸페닐 H Et
48 2 4-메틸페닐 H H
49 2 4-메틸페닐 H Et
50 2 4-메틸페닐 H H
51 2 4-메틸페닐 - - Et
52 2 4-메틸페닐 - - H
60 2 4-메틸페닐 H H
60a 2 페닐 H H
61 2 4-t-부틸페닐 H H
62 2 4-메틸페닐 -CSNH- F Et
63 2 4-메틸페닐 -CSNH- F H
64 2 4-메틸페닐 ---- - Et
65 2 4-메틸페닐 ---- - H
66 2 2-퓨릴 H Et
67 2 2-퓨릴 H H
화합물 번호 일반식 R14 * R2 * R8 *
212 5b 4-메틸페닐 -- Et
203 5b 4-메틸페닐 -- H
221 5c 4-메틸페닐 H Et
204 5c 4-메틸페닐 H H
222 5c 4-메틸페닐 F Et
205 5c 4-메틸페닐 F H
레티노이드 길항제 유사 생물학적 활성을 갖는 아릴 및 (3-옥소-1-프로페닐)-치환된 벤조피란, 벤조티오피란, 1,2-디하이드로퀴놀린 및 5,6-디하이드로나프탈렌 유도체
일반식(101)에서 심볼 Y와 관련하여, 본 발명의 바람직한 화합물은 Y가 페닐, 피리딜, 티에닐 또는 푸릴인 것이다. 더욱 바람직한 화합물은 Y가 페닐 또는 피리딜인 것이고 훨씬 더 바람직한 화합물은 Y가 페닐인 것이다. Y(페닐) 및 Y(피리딜)상의 치환과 관련하여, 바람직한 화합물은 페닐 그룹이 -CR16=CR17- 및 A-B 그룹에 의해 1,4(파라) 치환되고 피리딘 환이 -CR16=CR17- 및 A-B 그룹에 의해 2,5 치환된 것이다 (피리딘 명명에서 2,5 위치에서의 치환은 니코틴산 명명에서 6-위치에서의 치환에 상응한다). 본 발명의 바람직한 화합물에서 Y 그룹상에 임의 R2치환체는 없다.
바람직한 화합물의 A-B 그룹은 (CH2)n-COOH 또는 (CH2)n-COOR8(여기서, n 및 R8은 상기 정의된 바와 같다)이다. 더욱 바람직하게는 n은 0이고 R8은 저급알킬이거나 n은 0이고 B는 COOH이거나 이들의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물 가운데 바람직한 예는 X가 [C(R1)2]n(여기서, n은 1이다)이다. 그러나, X가 S 또는 O(벤조티오피란 및 벤조피란 유도체)인 화합물도 바람직하다. X가 [C(R1)2]n이고 n이 1일 경우 R1은 바람직하게는 탄소수 1 내지 6의 알킬이며 더욱 바람직하게는 메틸이다.
일반식(101) 화합물의 테트라하이드로나프탈렌, 벤조피란, 벤조티오피란 또는 디하이드로퀴놀린 잔기의 방향족 부분에 연결된 R2그룹은 바람직하게는 H, F 또는 CF3이다. R3은 바람직하게는 수소 또는 메틸이고, 더욱 바람직하게는 수소이다.
R14그룹과 관련하여, 바람직한 화합물은 R14가 페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 2-티에닐 또는 2-티아졸릴인 것이다. R15그룹(R14그룹의 치환체)은 바람직하게는 H, 저급알킬, 트리플루오로메틸, 염소, 저급알콕시 또는 하이드록시이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 일반식(102)와 관련하여서 표2에 나타나 있다.
생물학적 활성, 투여방식
상기된 바와 같이 본 발명의 화합물은 하나 이상의 RAR 수용체 아유형의 길항제이다. 이것은 본 발명의 화합물이 하나 이상의 RAR 수용체 아유형과 결합하지만 동일한 수용체의 효능제에 의해 유도되는 반응을 유도하지 않음을 의미한다. 본 발명의 화합물 가운데 일부는 모든 세 개의 RAR 수용체 아유형(RAR-α, RAR-β 및 RAR-γ)의 길항제이고 이들을 RAR 팬 길항제라 한다. 일부 다른 것은 단지 하나 또는 두 개의 RAR 수용체 아유형의 길항제이다. 본 발명의 범위에 속하는 일부 화합물은 하나 또는 두 개의 수용체 아유형의 일부 효능제이고 나머지 아유형의 길항제이다. 본 발명의 화합물은 RXR 수용체에 결합하지 않으며 이에 따라 이들은 RXR의 효능제도 아니고 길항제도 아니다.
억제 또는 경감될 필요가 있는 바람직하지 않은 부작용의 부위 및 성질에 따라 본 발명에 따라 사용된 화합물은 단지 하나 또는 두 개의 RAR 수용체 아유형의 길항제일 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 일부 화합물은 하나 또는 두 개의 RAR 수용체 아유형의 일부 효능제이고 나머지 아유형의 길항제일 수 있다. 일반적으로 말해서, 그러한 화합물은 그 길항 효과가 과다용량 독성 또는 바람직하지 않은 부작용의 주원인인 RAR 수용체 아유형에 있는 경우 본 발명에 따라 사용가능하다. 이와 관련하여, 일반적으로 말해서, 화합물은 하기된 공동형질감염 검정에서 그 화합물이 주어진 수용체 조절된 레포터 유전자의 유의적인 전사 활성화를 일으키지 않으나 약 1μM 미만의 Kd값으로 그 수용체와 결합한다면 그 수용체 아유형의 길항제로 여겨진다.
화합물이 RAR 길항제이고 이에 따라 본 발명에서 사용될 수 있는지 여부는 다음과 같은 검정법으로 시험할 수 있다.
RAR-α, RAR-β, RAR-γ, RXR-α 수용체 아유형에서 효능제-유사 활성에 대해 시험하고 문헌[Feigner P.L. 및 Holm M. Focus Vol 11, No. 2(1989)에 공개된 바를 기초로 한 키메릭 수용체 트란스활성화 검정은 1994년 8월 18일 공개된 국제특허원 제WO94/17796호에 상세히 기술되어 있다. 이 국제특허원은 1993년 2월 11일 출원된 미국특허원 제08/016,404호를 우선권 주장하고 있으며 이 미국특허원은 미국특허 제5,455,265호로 허여되었다. 국제특허원 제WO94/17796호 및 미국특허 제5,455,265호는 본원에 참고로 인용된다. 화합물은 본 발명에서 RAR 길항제로서 사용될 자격이 있기 위해서는 이 검정에서 주어진 수용체 아유형(RAR-α, RAR-β 또는 RAR-γ)를 통해 레포터 유전자의 유의적인 활성화를 일으켜서는 안된다.
본 발명의 화합물의 길항제/효능제 유사 활성을 측정하는 홀로수용체 트란스활성화 검정 및 수개의 레티노이드 수용체 아유형에 결합하는 능력을 측정하는 리간드 결합 검정은 1993년 6월 24일 공개된 국제특허원 제WO93/11755호 (특히 30 내지 33쪽 및 37 내지 41쪽)에 기술되어 있다. 이 국제특허원 명세서는 본원에 참고로 인용된다. 홀로수용체 트란스활성화 검정은 이하 기술된다.
홀로수용체 트란스활성화 검정
CV1 세포(5000개 세포/웰)를 헤이만 등의 인산 칼슘 방법 (Heyman et al. Cell 68:397-406)에 의해 자동 96-웰 포맷에서 RAR 발현 벡터 가운데 하나 (10 ng)와 함께 RAR 레포터 플라스미드 MTV-TREp-LUC (50 ng)으로 형질감염시켰다. RXR-α 및 RXR-γ 트란스활성화 검정의 경우 RXR-반응 레포터 플라스미드 CRBPII-tk-LUC(50 ng)과 함께 적당한 RXR 발현 벡터(10 ng)를 상기 헤이만의 문헌 및 Allegretto et al. J. Biol. Chem. 268: 26625-26633에 기술된 바와 같이 사용하였다. RXR-β 트란스활성화 검정의 경우, RXR-반응 레포터 플라스미드 CPRE-tk-LUC(50 mg)과 함께 RXR-β 발현 벡터(10 mg)를 상기된 바와 같이 사용하였다. 이들 레포터는 사람 CRBPII로부터의 DRI 요소와 프로모터로부터의 특정 DRI 요소를 함유한다(Mangelsdorf et al. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, pp 319-349, Raven Press Ltd., New York and Heyman et al.). β-갈락토시다제(50 ng) 발현 벡터를 형질감염 효율의 편차를 정상화하기 위해 형질감염에서 내부조절로서 사용하였다. 세포를 6시간 동안 3번 형질감염시키고 36시간동안 레티노이드와 함께 배양한 다음 추출물을 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 활성에 대해 검정하였다. 홀로수용체 트란스활성화의 상세한 실험절차는 상기 헤이만과 알레그레토의 문헌에 기술되어 있다. 이 검정에서 얻은 결과는 키메릭 수용체 트란스활성화 검정에서와 마찬가지로 EC50값으로 표시한다. 헤이만의 문헌[Cell 68: 397-406], 알레그레토의 문헌[J. Biol. Chem. 268: 26625-26633] 및 만젤스도르프의 문헌[The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, pp. 319-349, Raven Press Ltd., New York]은 본원에 참조로 인용된다. 리간드 결합 검정의 결과는 Kd값으로 표시된다 (Cheng et al. Biochemical Pharmacology 22: 3099-3108, 본 문헌은 본원에 참조로 인용된다).
화합물은 본 발명에서 RAR 길항제로서 사용될 자격이 있기 위해서는 이 검정에서 주어진 수용체 아유형(RAR-α, RAR-β 또는 RAR-γ)를 통해 레포터 유전자의 유의적인 활성화를 일으켜서는 안된다. 또한, 화합물은 결합된 수용체 아유형의 길항제로서 작용할 수 있기 위해서 약 1 마이크로몰 미만의 Kd(Kd<1μM)로 리간드 결합검정에서 RAR 수용체 아유형 가운데 적어도 하나와 결합해야 한다. 단 동일한 수용체 아유형은 그 화합물에 의해 유의적으로 활성화되지 않는다.
본 발명의 특정 예시된 화합물에 대하여 하기 표3은 홀로수용체 트란스활성화 검정의 결과를 보여주며 표4는 모든 트란스 레틴산에 대한 시험 화합물의 본 검정에서의 효율(%)을 나타내고 있다. 표5 및 표5A는 본 발명의 특정 예시된 화합물에 대한 리간드 결합 검정의 결과를 보여준다.
홀로수용체 트란스활성화 검정
화합물번호 EC50(나노몰)
RARα RARβ RARγ RXRα RXRβ RXRγ
18 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
19 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
20 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
21 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
22 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
23 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
24 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
25 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
26 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
27 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
28 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
29 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
30 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
31 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
32 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
34 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
36 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
39 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
41 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
45 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
46b 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
52 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
60 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
61 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
63 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
101 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
103 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
표3에서 0.0은 화합물이 본 검정에서 모든 레틴산보다 활성(효율)이 20% 미만임을 가리킨다.
트란스활성화 검정 효율(RA 활성%)
화합물번호
RARα RARβ RARγ RXRα RXRβ RXRγ
18 4.00 1.00 0.00 2.00 10.00 1.0
19 0.00 5.0 3.0 0.0 9.00 4.0
20 3.0 4.0 0.00 4.00 0.00 3.0
21 2.00 2.00 2.00 3.00 3.00
22 0.00 0.00 2.00 1.00 0.00 2.00
23 0.00 6.00 3.00 1.00 0.00 4.00
24 3.00 7.00 4.00 1.00 0.00 3.00
25 2.00 3.00 3.00 5.00 0.00 3.00
26 1.00 6.00 0.00 2.00 0.00 3.00
27 9.00 14.00 6.00 2.00 0.00 4.00
28 2.00 10.00 2.00 2.00 0.00 3.00
29 0.00 6.00 11.00 0.00 6.00 2.00
30 3.00 5.00 1.00 0.00 9.00 3.00
31 4.00 14.00 2.00 1.00 8.00 6.00
32 0.00 2.00 2.00 1.00 0.00 2.00
34 3.00 5.00 2.00 1.00 0.00 3.00
36 1.00 5.00 0.00 1.00 7.00 2.00
39 1.00 7.00 9.00 2.00 0.00 1.00
41 3.00 5.00 6.00 1.00 0.00 3.00
45 2.00 0.00 7.00 3.00 8.00 0.00
46b 4.00 5.00 3.00 2.00 0.00 4.00
52 0.00 15.00 3.00 0.00 0.00 10.00
60 0.00 1.00 4.00 3.00 0.00 3.00
61 2.00 2.00 0.00 1.00 0.00 3.00
63 2.00 2.00 7.00 1.00 0.00 1.00
101 0.00 4.00 2.00 1.00 0.00 3.0
103 4.00 120.0 7.0 0.00 0.00 2.0
리간드 결합 검정
화합물번호 Kd(나노몰)
RARα RARβ RARγ RXRα RXRβ RXRγ
18 24.00 11.00 24.00 0.00 0.00 0.00
19 565 210 659 0.00 0.00 0.00
20 130.00 22.0 34.00 0.00 0.00 0.00
21 16 9 13 0.00 0.00 0.00
22 24.0 17.0 27.0 0.00 0.00 0.00
23 32.00 25.00 31.00 0.00 0.00 0.00
24 699 235 286 0.00 0.00 0.00
25 50 17 20 0.00 0.00 0.00
26 40.00 31.00 36.00 0.00 0.00 0.00
27 69.00 14.00 26.00 0.00 0.00 0.00
28 669 77 236 0.00 0.00 0.00
29 234 48 80 0.00 0.00 0.00
30 683 141 219 0.00 0.00 0.00
31 370 52.00 100.00 0.00 0.00 0.00
32 0.00 89.00 169.00 0.00 0.00 0.00
34 52.00 30.00 17.00 0.00 0.00 0.00
36 13.00 550.00 0.00 0.00 0.00 0.00
39 67.00 38.00 113.00 0.00 0.00 0.00
41 5.1 491 725 0.00 0.00 0.00
45 12.0 2.80 17.0 0.00 0.00 0.00
46b 250 3.70 5.80 0.00 0.00 0.00
52 60.00 63.00 56.00 0.00 0.00 0.00
60 1.5 1.9 3.3 0.00 0.00 0.00
61 96 15 16 0.00 0.00 0.00
63 133 3219 0.00 0.00 0.00 0.00
101 750 143 637 0.00 0.00 0.00
103 301 273 261 0.00 0.00 0.00
표 5에서 0.0는 1000 nM 이상의 값을 가리킨다.
리간드 결합 검정
화합물 번호 Kd(나노몰)
RARα RARβ RARγ
203 32±15 2256±1257 ＞30,000
204 2.8±1.1 320±87 7258±2648
205 0.69±1.11 541±112 7280±2720
레틴산 15±1.7 13±2.5 18±1
표3, 4 및 5에 요약된 시험 결과로부터 알 수 있듯이, 예시된 본 발명의 화합물은 RAR 수용체 아유형의 길항제이나 RXR 수용체 아유형에 대해 친화성이 없다. 본 발명의 다른 화합물은 일부의 길항제일 수 있으나 모든 RAR 수용체 아유형의 길항제 및 나머지 RAR 아유형의 효능제일 수 없다. 이러한 성질 때문에 본 발명의 화합물은 생물학적 검정에서 RAR 효능제의 활성을 차단하는데 사용할 수 있다. 사람을 포함한 포유동물에서 본 발명의 화합물은 RAR 효능제와 함께 공동투여할 수 있고 약물학적 선택성 또는 부위-특이적 전달 때문에 RAR 효능제의 바람직하지 않은 효과를 우선적으로 방지할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 비타민 A 보충제의 과다한 섭취 또는 고수준의 비타민 A를 함유한 특정 어류나 동물의 간을 섭취한데서 기인하는 급성 또는 만성 비타민 A 과다섭생을 치료하는데 사용할 수 있다. 본 분야에서는 비타민 A 과다증후군에서 관찰되는 독성(두통, 피부박리, 골독성, 지혈증 장애)은 다른 레티노이드로 관찰된 독성과 유사하거나 동일한 것으로 알려져 있다. 이러한 사실은 공통된 생물학적 원인, 즉 RAR 활성화를 시사한다. 본 발명의 화합물은 RAR 활성화를 차단하기 때문에 상기 독성을 치료하는데 적합하다.
본 발명의 화합물은 피부에 국소로 공동투여될 때 RAR 효능제 레티노이드에 의해 유도된 피부 자극을 실질적으로 억제할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물은 RAR 효능제 화합물이 전신 투여된 환자 또는 동물에서 피부자극을 차단하기 위해 피부에 국소 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 기존의 레티노이드 독성으로부터의 회복을 가속화할 수 있고, 공동투여된 레티노이드에 의해 유발된 트리글리세리드과다증을 차단할 수 있으며, RAR 효능제(레티노이드)에 의해 유도된 골 독성을 차단할 수 있다.
일반적으로 말해서, 본 발명에 따라 포유동물의 치료를 위해 적용하는 경우, 길항제 화합물은 비타민 A, 비타민 A 전구체에 대한 해독제로서 또는 원인인자(비타민 A 전구체 또는 다른 레티노이드)의 섭취를 중단한 후 과다섭생 또는 지속된 노출에 의한 레티노이드 독성에 대한 해독제로서 장내 또는 국소 투여할 수 있다. 다른 방식으로, 길항제 화합물은 레티노이드가 치료능을 제공하고 공동투여된 길항제가 레티노이드의 여러 부작용을 경감 또는 제거하는 상황에서 본 발명에 따라 레티노이드 약물과 함께 공동투여한다. 이러한 방식으로 적용하는 경우 길항제는 부위-특정 방식으로, 예를 들면 국소 적용된 크림 또는 로션으로서 투여할 수 있는 한편 공동투여된 레티노이드는 장내로 투여할 수 있다.
본 발명에 따라 치료 적용하는 경우 길항제 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있는 약제학적으로 허용되는 부형제 및 비히클을 사용하여 정제, 환제, 캡슐, 액제, 현탁제, 크림, 연고, 겔, 최연제, 로션 등과 같은 약제 조성물내로 함유시킨다. 예를 들면, 국소제형의 제조는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, Edition 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 잘 기술되어 있다. 국소적용하는 경우 길항제 화합물은 또한 산제 또는 스프레이 (특히, 에어로졸 형태)로서 투여할 수 있다. 만일 약물이 전신 투여되어야 하는 경우 산제, 환제, 정제 등이나 경구 투여에 적합한 시럽 또는 엘릭서제로서 제형할 수 있다. 정맥내 또는 십이지장내 투여하는 경우, 길항제 화합물은 주사에 의해 투여할 수 있는 액제 또는 현탁제로서 제형할 수 있다. 어떤 경우는 길항제 화합물을 주사제로 제형하는 것이 유용할 수 있다. 또한 어떤 경우는 길항제 화합물을 좌제나 방출연장제로 제형하는데 유용할 수 있다.
길항제 화합물은 본 발명에 따른 치료 유효량으로 투여한다. 치료농도는 특정 상태(예, 레티노이드 또는 비타민 A 노출에 의한 독성 또는 레티노이드 약물의 부작용)를 줄이거나 그러한 상태의 악화를 저지하는 농도이다. 본 발명에 따라 레티노이드-유도된 독성 또는 부작용을 차단하는 길항제 화합물을 공동투여할 때 길항제 화합물은 피부 자극과 같은 특정 상태의 개시를 억제하는 예방 방식으로 사용하는 것으로 이해되어야 한다.
유용한 치료 또는 예방 농도는 상태에 따라 다양하고 어떤 경우에는 치료받고 있는 상태의 중증도 및 환자의 치료에 대한 민감성에 따라 다양하다. 따라서, 일정하게 유용한 단일 농도는 없으며 만성 또는 급성 레티노이드 독성이나 연관된 치료대상의 상태의 특성에 따라 농도를 조절할 필요가 있다. 이러한 농도는 통상적인 실험을 통해 결정할 수 있다. 그러나, 제제의 밀리리터당 0.01 내지 1.0 밀리그램의 길항제 화합물을 함유하는 제제는 국소 적용에 치료학상 유효한 농도를 함유하는 것으로 기대된다. 전신적으로 투여하는 경우 0.01 내지 5 mg/체중kg/일이 치료 결과를 낳을 것으로 예상된다.
RAR 효능제-유도된 독성의 예방 또는 치료에 RAR 길항제의 사용 근간은 RAR 효능제에 의한 RAR 수용체의 활성화의 경쟁적 억제이다. RAR 길항제의 이들 두 적용사이에 주된 차이는 기존의 레티노이드 독성의 존재 또는 부재이다. 하기된 예의 대부분은 레티노이드 독성을 예방하는데 사용하는 레티노이드의 용도에 관한 것이다. 그러나 본 명세서에 기술된 일반적인 방법은 또한 기존의 레티노이드 독성을 치료하는데도 적용된다.
레티노이드 독성 및/또는 레티노이드 약물의 부작용을 예방 또는 치료하기 위한 RAR 길항제의 용도를 증명하는 실험의 설명
실시예 1: 국소 적용된 효능제에 의해 유도된 피부 자극은 국소 적용된 길항제로 치료된다.
화합물 4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸나프탈렌-2-일)프로펜-1-일]벤조산 (일명, AGN 191183)은 강력한 RAR 효능제로서 잘 알려져 있다(예, 미국특허 제5,324,840호의 명세서 및 도2b 참조). (AGN 번호는 화합물을 구분하기 위하여 본 발명의 양수인이 자체적으로 지정한 참조번호이다).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산(일명, AGN 192869 또는 화합물 60a)는 이의 제법이 하기된 화합물이다. 이 화합물은 RAR 길항제이다.
국소 투여된 RAR 효능제 AGN 191183에 의해 유도된 피부 자극은 RAR 길항제 AGN 192869를 탈모된 마우스에 국소 투여하여 차단시킬 수 있다.
더욱 자세하게는, 피부자극은 피부 박리 및 찰과의 일일 평가에 의해 반정량 규모로 측정하였다. 한 자리 수인 국부 자극 점수는 실험 과정동안에 동물에 유도된 피부자극을 요약한 것이다. 국부 자극 점수는 다음과 같이 계산한다. 국부 자극 점수는 박리점수 합과 찰과점수 합의 대수합이다. 박리점수 합은 0 내지 9로, 찰과점수 합은 0 내지 8로 나타나고 최대 중증, 개시시간 및 관찰된 박리 및 찰과의 평균 중증도에 의해 결정된다.
박리의 중증은 5점 스케일로 기록되고 찰과의 중증은 4점 스케일로 기록되는데 점수가 클수록 중증도가 큰 것이다. 총합의 최대 중증도는 관찰 과정동안에 주어진 동물에 매겨진 최고 일일 중증 점수이다.
점수 합의 개시 시간에서 0 내지 4의 점수는 다음과 같이 매겨진다:
점수 합의 평균 중증은 일일 박리 또는 찰과 점수의 합을 관찰 일수로 나눈 값이다. 치료 첫날은 계산하지 않는다. 그 이유는 약물 화합물이 최초 치료 시간에 작용할 수 있는 기회를 갖고 있지 않기 때문이다.
박리 및 찰과 점수 합을 계산하기 위하여 개시 점수의 평균 중증도 및 시간을 합산하고 2로 나눈다. 이 결과를 최대 중중 점수에 더한다. 그런 다음 박리 및 찰과 점수를 합하여 총 국부 자극 점수를 얻는다. 각 동물에 국부 자극 점수를 정하며 이 값은 동물 군의 개개 점수에 대한 평균±표준편차로서 나타낸다. 값은 가장 근접한 정수로 표시한다.
탈모된 암컷 마우스[Crl:SKH1-hrBR](생후 8 내지 12주, n=6)를 5일간 연속하여 아세톤, AGN 191183, AGN 192869 또는 AGN 192869와 191183의 일부 혼합물로 국소 처리하였다. 각 화합물의 용량은 표7에 나타나 있다. 처리는 4 ml/kg의 총량(약 0.1 ml)으로 등 피부에 적용한다. 매일 마우스를 관찰하고 마지막 처리 후 3일이 경과한 때까지, 즉 8 일째까지 박리 및 찰과에 대하여 점수를 매겼다.
실험 디자인 및 결과(실시예 1)
그룹 용량AGN 191183(mg/kg/d) 용량AGN 192869(mg/kg/d) 몰비(192869: 191183) 국부자극점수
A 0 0 -- 0±0
B 0.025 0 -- 8±2
C 0.025 0.06 2:1 5±2
D 0.025 0.30 10:1 2±1
E 0.025 1.5 50:1 1±0
F 0 1.5 -- 0±0
실시예 1에 대한 국부 자극 점수는 표7에 나타나 있다. 아세톤(비히클) 또는 AGN 192869(길항제) 어느 것도 1.5 mg/kg/d (그룹 F)의 용량에서 국부 자극을 유도하지 않는 것으로 관찰되었다. AGN 191183 (RAR 효능제)은 0.025 mg/kg/d의 용량에서 경미한 국부 자극을 유발하였다. 그러나, AGN 191183-유도된 국부 자극은 AGN 192869에 의해 용량-의존 양상으로 억제되었고 50배 몰 과용량의 AGN 192869의 존재하에서는 자극이 거의 완전히 없어졌다. 이는 국부 RAR 길항제가 국부 RAR 효능제에 의해 유발된 피부 자극을 차단한다는 것을 증명하는 것이다. RAR 효능제-유도된 피부 자극의 완전한 차단은 화합물 4-[(4,5-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산(AGN 193109, 또한 본 명세서에서는 화합물 60으로도 명명된다)과 같이 RAR 길항제가 보다 효능적인 경우 효능제에 대한 길항제의 보다 낮은 몰비에서 달성될 수 있다.
실시예 2: 경구 적용된 효능제에 의해 유도된 피부 자극은 국소 적용된 길항제로 차단된다.
강력한 RAR 효능제 AGN 191183 (4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸나프탈렌-2-일)프로펜-1-일]벤조산)과 강력한 RAR 길항제 4-[(4,5-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산(AGN 193109, 화합물 60)를 본 실시예에서 사용하였고 실험 동물(마우스)의 체중을 전시 RAR 효능제 노출의 마커로서 사용하였다.
탈모된 암컷 마우스 그룹(생후 8 내지 12 주, n=6)을 옥수수 오일 또는 옥수수 오일(5 mg/kg)에 현탁된 AGN 191183(0.26 mg/kg)로 위장 삽관에 의해 처리하였다. 동시에 마우스를 등 피부에 비히클(97.6% 아세톤/2.4% 디메틸설폭사이드) 또는 비히클(6 ml/kg)중의 AGN 193109의 용액으로 국부 처리하였다. 다른 처리 그룹에 대한 특정 용량은 표8에 나타나 있다. 처리는 매일 4일간 연속 투여하였다. 마지막 처리 후 1일이 경과된 날까지 마우스의 체중을 재고 실시예 1에 기술된 바와 같이 매일 국부 자극에 대해 점수를 매겼다. 최초 체중(1일째)에서 최종 체중(5일째)을 빼고 최초 체중으로 나눈다음 100%로 곱하여 체중 변화율을 계산한다. 국부 자극 점수는 실시예 1에 기술된 바와 같이 계산한다.
다른 마우스 그룹에 대한 국부 자극 점수와 체중 감소는 표8에 나타나 있다. 국부 및 경구 비히클(즉, 아세톤 및 옥수수 오일)의 병합 처리는 아무런 국부 자극이나 체중 감소를 일으키지 않았다. 마찬가지로, 경구 비히클과 국부 길항제 AGN 193109의 병합 처리도 아무런 국부 자극이나 체중 감소를 일으키지 않았다. 경구 AGN 191183 단독은 실질적인 체중 감소와 피부 자극을 유도하였다. AGN 191183-유도된 피부 자극은 AGN 193109의 보다 적은 용량으로 병합 처리했을 때 실질적인 감소가 얻어졌고 AGN 193109의 보다 많은 용량에서 완전히 차단되었다. AGN 191183-유도된 체중 감소는 국부 AGN 193109에 의해 용량-연관된 양상으로 차단되었으나 그 차단이 완전하지는 않았다. 따라서, 국부 AGN 193109는 AGN 191183의 피부 독성을 우선적으로 차단하였다. 아마, 낮은 수준의 AGN 193109는 전신적으로 흡수되었고 이에 따라 AGN 191183에 의해 유도된 체중 감소를 부분적으로 차단하였다. 그러나, 그러한 흡수는 사람과 같이 흡수성이 덜한 피부를 갖는 종에서 훨씬 덜 할 것이다. 또한, AGN 193109에 의한 체중 감소 억제는 AGN 191183 유도된 피부 자극의 경감에 기인한다고 할 수 있다.
실험 디자인 및 결과 (실시예 2)
그룹 국소용량AGN 193109(mg/kg/d) 경구용량AGN 191183(mg/kg/d) 중걍증가 또는 감소% 국부자극점수
A 0 0 1±2 0±0
B 0 0.26 (21±6) 8±1
C 0.12 0.26 (9±5) 1±1
D 0.47 0.26 (3±5) 0±1
E 0.47 0 3±3 0±0
따라서, 실시예 2는 국부 투여된 RAR 길항제가 경구 투여된 RAR 효능제에 의해 유도된 피부자극을 우선적으로 차단하는데 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예3: 국소 적용된 길항제는 기존 레티노이드 독성으로부터의 회복을 촉진한다.
본 실시예에서는, RAR 효능제 AGN 191183으로의 국부 처리에 의해 체중 감소를 유도한 다음 시험 동물을 비히클 또는 RAR 길항제 AGN 193109로 국부 처리한다.
탈모된 암컷 마우스(생후 8 내지 12주 n=5)를 비히클(97.6% 아세톤/2.4% DMSO, 4ml/kg)중의 AGN 191183(0.13 mg/kg/d)으로 매일 2일간 국부 처리하였다. 그런 다음 이들 마우스(n=5) 그룹을 비히클 또는 비히클(4 mg/kg) 중의 AGN 193109로 3일째부터 시작하여 3일간 연속하여 매일 국부 처리하였다. 1 내지 5일째 및 8일째에 마우스의 체중을 쟀다. 체중은 평균±표준편차로 나타낸다. 평균치를 언페어드, 투-테일드 t-테스트를 사용하여 통계적으로 비교하였다. P<0.05에서 차는 유의적인 것으로 고려되었다.
결과(실시예 3)
처리(3일 내지 5일째) 체중(g)
1일 2일 3일 4일 5일 8일
비히클 24.6±1.5 23.9±1.2 21.4±1.2 20.3±1.7 21.0±1.4 24.7±1.0
AGN 193109 23.9±1.0 23.5±1.2 21.4±0.6 22.2±0.7 22.8±0.8 25.0±1.1
실시예 3에서 체중의 시간 경과는 표9에 나타나 있다. 마우스의 두 그룹의 체중은 1일 및 2일째 AGN 191183 처리의 결과로서 2일 및 3일째 나란히 감소되었다. 두 그룹에서의 체중은 1, 2 또는 3일째에 유의적으로 다르지 않았다. 그러나, AGN 93109 처리는 4 및 5일째에 비히클 처리에 비하여 체중을 유의적으로 증가시켰다. 이들 데이터는 AGN 191183-유도된 체중 감소로부터의 회복이 AGN 193109의 후속 처리에 의해 가속되었음을 나타낸다. 체중은 8일째에 마우스의 두 그룹사이에서 유의적으로 다르지 않았다. 이는 전체 회복이 충분한 시간하에서 두 그룹에서 달성될 수 있음을 가리킨다. 따라서, RAR 길항제는 비록 RAR 효능제-유도된 독성에 이어 RAR 길항제의 처리가 후속된다고 하더라도 RAR 효능제-유도된 독성을 경감시키는데, 즉 RAR 효능제 독성 시나리오에서 효과적이다.
실시예 4: 경구 적용된 길항제는 경구적으로 공동투여된 레티노이드 효능제에 의해 유도된 트리글리세리드과혈증을 차단한다.
5-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-3,5,5,8,8-펜타메틸나프탈렌-2-일)프로펜-1-일]-2-티오펜카르복실산은 공지된 RAR/RXR 팬-효능제이고(미국특허 제,324,840호 컬럼 32 참조) AGN 191659로 명명된다. 이 화합물은 랫트에서 급성 트리글리세리드과혈증을 유도하기 위해 경구적으로 사용되었고 AGN 193109 화합물 60이 AGN 191659-유도된 트리글리세리드과혈증을 차단하기 위해 경구적으로 공동투여되었다.
숫컷의 피셔 랫트(생후 6 내지 7주, n=5)를 옥수수오일(비히클), AGN 191659, AGN 193109 또는 AGN 191659와 AGN 193109의 혼합물로 위장내 삽관하여 처리하였다. AGN 191659와 AGN 193109는 옥수수오일중의 미세한 현탁액으로서 주입되었다. 용량을 포함한 실험디자인은 표10에 나타나 있다.
이산화탄소로 마취한 후 대정맥에서 채혈하였다. 혈청을 저속 원심분리에 의해 분리하였다. 총 혈청 트리글리세리드 (트리글리세리드 + 글리세롤)를 키트로서 시판되고 있고 96-웰 평판 포맷으로 만든 표준 분광계 엔드포인트 검정으로 측정하였다. 혈청 트리글리세리드 수분은 평균±표준편차로서 표시한다. 원-웨이 변이분석으로 평균을 통계적으로 비교하고 유의적 차이가 발견되는 지를 던네트 시험하였다. P<0.05에서 차는 유의적인 것으로 고려되었다.
표10에 나타난 바와 같이 AGN 191659는 자체적으로 비히클 처리에 비하여 혈청 트리글리세리드의 유의적인 상승을 일으켰다. AGN 193109는 자체로서 혈청 트리글리세리드를 유의적으로 증가시키지 않았다. 중요한 것은 1: 내지 5:1의 비율에서 AGN 193109와 AGN 191659의 혼합물이 혈청 트리글리세리드를 대조군과 유의적으로 다르지 않는 수준으로 감소시켰다.
실험 디자인 및 결과 (실시예 4)
그룹 처리(용량) 혈청트리그리세라이트(mg/dl)
A 비히클 55.0±3.1
B AGN 193109 (19.6 mg/kg) 52.4±6.3
C AGN 191659(3.7 mg/kg) 122.5±27.6
D AGN 191309(3.9 mg/kf)+AGN 191659(3.7mg/kg) 55.7±14.7
E AGN 193109(19.6 mg/kg)+AGN 191659(3.7 mg/kg) 72.7±8.9
실시예 4는 RAR 길항제를 사용하여 공동투여된 레티노이드에 의해 유도된 트리글리세리드과혈증을 차단할 수 있음을 증명한다.
실시예 5: 비경구 적용된 길항제는 비경구 공동투여된 레티노이드 효능제에 의해 유도된 골 독성을 차단한다.
실시예 5는 RAR 길항제가 RAR 효능제에 의해 유도된 골 독성을 차단할 수 있음을 증명한다. 이 실시예에서, AGN 193109를 사용하여 기니아 피그에서 공동투여된 RAR 효능제 AGN 191183에 의해 유발된 미숙 골단판 폐쇄을 차단한다.
숫컷 하트레이 기니아 피그(생후 약 3주, n=4)의 그룹에 비히클(20% 디메틸설폭사이드/80% 폴리에틸렌 글리콜-300), AGN 191183(0.06 mg/ml) 또는 AGN 191183(0.06 mg/ml)와 AGN 193109 (0.34 mg/ml)의 혼합물을 함유한 삼투펌프로 복강내 주입하였다. 삼투펌프는 제조업자에 의해 14일간 시간당 약 5μl의 용액을 계속 전달하도록 고안되었다.
주입 후 14일 경과하여 동물을 이산화탄소로 질식시켜 치사시켰다. 좌측 경골을 제거하고 10% 완충 포르말린에 넣었다. 경골을 포름산/포르말린 용액에 3 내지 4일간 노출시켜 석회질을 제거하고 파리핀 섹션을 준비하였다. 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 표준 방법에 의해 염색하였다. 인접 경골 골단 판을 검사하여 폐쇄 또는 비폐쇄로서 점수를 매겼다. 경골 판 폐쇄는 경골 성장 판 연골의 연속 중단, 즉 골 및/또는 섬유아 조직으로의 치환으로서 정의된다.
4 마리의 비히클-처리된 기니아 피그 모두는 실험 종점에서 경골 판 폐쇄를 보여주지 않았다. 이것은 기니아 피그 골단의 인접 경골 판이 동물이 적어도 10개월이 될 때까지 정상적으로 폐쇄하지 않기 때문에 예상된 것이다. 그러나, AGN 191183과 AGN 193109의 혼합물로 처리된 기니아 피그의 어떠한 것도 경골 판 폐쇄를 보여주지 않았다. 따라서, 5배 몰 과량의 AGN 193109는 비경구적으로 공동투여되었을 때 AGN 191183-유도된 골 독성을 완전히 차단하였다.
RAR 길항제 화합물
화합물 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (AGN 193109, 화합물 60) 및 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산(AGN 192869, 화합물 60a)는 본 발명에 따라 RAR 수용체를 차단하기 위한 상기된 동물 시험에 사용된 RAR 길항제의 예이다. 하기 일반식(1)의 화합물은 본 발명에 따라 사용하기 위한 추가의 RAR 길항제 화합물에 대한 또 다른 일반적인 예로서 작용한다.
일반식(1)에서 X는 S, O, NR'(여기서, R'는 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이다)이거나 [C(R1)2]n(여기서, R1은 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이고 n은 0 또는 1의 정수이다)이고, R2는 수소, 탄소수 1 내지 6의 저급알킬, F, CF3, 탄소수 1 내지 6의 불소 치환된 알킬, OH, SH, 탄소수 1 내지 6의 알콕시 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬티오이며, R3은 수소, 탄소수 1 내지 6의 저급알킬 또는 F이고, m은 0 내지 3의 정수이며, o는 0 내지 3의 정수이고, Z는, -N=N-, -N=CR1-, -CR1=N, -(CR1=CR1)n'-(여기서, n'는 0 내지 5의 정수이다), -CO-NR1-, -CS-NR1-, -NR1-CO, -NR1-CS, -COO-, -OCO-, -CSO-, -OCS-이고, Y는 페닐 또는 나프틸 그룹이거나 피리딜, 티에닐, 푸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸릴로 이루어진 그룹중에서 선택된 헤테로아릴이고, 상기된 페닐 및 헤테로아릴 그룹은 임의로 하나 또는 두 개의 R2그룹으로 치환되거나, Z가 -(CR1=CR1)n'이고 n'가 3, 4 또는 5일 때 Y는 언급된 (CR2=CR2)n'그룹과 B사이에 직접 결합을 나타내고, A는 (CH2)q(여기서, q는 0 내지 5이다), 탄소수 3 내지 6의 저급 측쇄 알킬, 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬, 탄소수 2 내지 6이고 이중결합이 한 개 또는 두 개인 알케닐, 탄소수 2 내지 6이고 삼중결합이 한 개 또는 두 개인 알키닐이며, B는 수소, COOH 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O 또는 트리-저급 알킬실릴이고, 여기서, R7은 탄소수 1 내지 5의 알킬, 사이클로알킬 또는 알케닐 그룹이고, R8은 탄소수 1 내지 10의 알킬 그룹 또는 트리메틸실릴알킬 (여기서, 알킬 그룹은 탄소수가 1 내지 10이다) 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬 그룹이거나 R8은 페닐 또는 저급 알킬페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬, 또는 페닐 또는 저급 알킬페닐이고, R11은 저급 알킬, 페닐 또는 저급 알킬페닐이며, R12은 저급 알킬이고 R13은 탄소수 2 내지 5의 이가 알킬 라디칼이고, R14은 (R15)r-페닐, (R15)r-나프틸 또는 (R15)r-헤테로아릴 (여기서, 헤테로아릴 그룹은 O, S 및 N으로 이루어진 그룹중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖고 r은 0 내지 5의 정수이다), R15은 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8), OH, OCOR8, OR8, CN, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 불소 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬, 탄소수 1 내지 10이고 이중결합이 1 내지 3개인 알케닐, 탄소수 1 내지 10이고 삼중결합이 1 내지 3개인 알키닐 또는 트리알킬실릴 또는 트리알킬실릴옥시 (여기서, 알킬 그룹은 독립적으로 탄소수가 1 내지 6이다)이다.
합성방법-아릴 치환된 화합물
일반식(1)의 대표적인 RAR 길항제 화합물은 본 명세서에 도해된 화학합성 경로에 의해 만들 수 있다. 화학자는 본 명세서에 기술된 조건이 일반식(1)의 화합물 모두에 대해 적용될 수 있는 특정 양태임을 인지할 것이다.
반응도식 1은 Z 그룹이 에티닐 작용기(-CC-)이고 X가 [C(R1)2]n(여기서, n은 1이다)인 일반식(1)의 화합물의 합성을 도해한 것이다. 즉, 반응도식 1은 본 발명의 에티닐 치환된 디하이드로나프탈렌 유도체의 합성을 도해한 것이다. 이 반응도식에 따르면 일반식(6)의 테트라하이드로나프탈렌-1-온 화합물을 브롬화하여 일반식(7)의 브로모 유도체를 제공한다. 일반식(6)의 화합물은 일반식(1)과 관련하여 상기된 바와 같이 목적하는 R1, R2및 R3치환체를 이미 갖고 있다. 일반식(6) 화합물의 바람직한 예는 문헌[Arnold et al. J. Am. Chem. Soc. 69: 2322-2325(1947)에 기술된 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논이다. 1-브로모-3-페닐프로판으로부터 이 화합물의 바람직한 합성 경로는 본 명세서의 실험 부분에 기술되어 있다.
이어서, 일반식(7)의 화합물을 (트리메틸실릴)아세틸렌과 반응시켜 일반식(8)의 (트리메틸실릴)에티닐-치환된 3,4-디하이드로-나프탈렌-1(2H)-온 화합물을 제공한다. (트리메틸실릴)아세틸렌과의 반응은 전형적으로 불활성 대기하, 제1동 요오드, 전형적으로 일반식 Pd(PPh3)2Cl2를 갖는 적합한 촉매, 산 수용체(예, 트리에틸아민)의 존재하에, 가열(약 100℃)하에 실시한다. 전형적인 반응시간은 약 24시간이다. 이어서, 일반식(8)의 (트리메틸실릴)에티닐-치환된 3,4-디하이드로-나프탈렌-1(2H)-온 화합물을 메탄올과 같은 알콜성 용매에서 염기(수산화칼륨 또는 탄산칼륨)과 반응시켜 일반식(9)의 에티닐 치환된 3,4-디하이드로-1-나프탈렌-1(2H)-온을 제공한다. 그런 다음 일반식(9)의 화합물을 방향족 또는 헤테로방향족 시약 X1-Y(R2)-A-B'(일반식 10)과 불활성 대기하, 제1동 요오드, 전형적으로 일반식 Pd(PPh3)2Cl2를 갖는 적합한 촉매, 산 수용체(예, 트리에틸아민)의 존재하에 결합시킨다. 다른 방법으로서, 일반식(9) 화합물의 아연 염(또는 다른 적합한 금속 염)을 Pd(PPh3)4또는 유사한 착염의 존재하에 일반식(10)의 시약과 결합시킬 수 있다. 전형적으로, 시약 X1-Y(R2)-A-B'(일반식 10)와의 결합 반응은 실온 또는 점차 상승된 온도에서 실시한다. 일반적으로 말해서, 에티닐아릴 유도체 또는 이의 아연 염과 할로겐 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 화합물(예, 일반식 10의 시약)사이의 결합은 미국특허 제5,246,456호에 기술되어 있다. 이 특허는 본 명세서에 참고로 인용된다. 일반식(11)의 화합물은 본 발명의 예시적인 화합물에 대한 전구체이거나 본 분야에 널리 알려진 반응에 의해 쉽게 보호그룹이 제거될 수 있는 B' 그룹에서 보호된 그의 유도체이다. 일반식(11)의 화합물은 또한 본 분야에 널리 알려진 반응 및 형질전환에 의해 대표적인 화합물의 다른 전구체로 전환시킬 수 있다. 이러한 반응은 "동족체 및 유도체"로의 전환으로서 반응도식 1에 나타나 있다. 몇가지 대표적인 화합물의 합성에 사용된 한 가지 그러한 전환은 에스테르 그룹(B 또는 B'가 에스테르일 때)을 비누화하여 유리 카르복실산 또는 이의 염을 제공한다.
일반식(10)의 할로겐 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 화합물은 일반적으로 말해서 본 분야에 널리 알려진 반응에 의해 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 예는 예컨대 4-요오도벤조산의 에스테르화에 의해 얻을 수 있는 에틸 4-요오도벤조에이트이다. 다른 예는 6-클로로니코틴 산에서 할로겐 교환 반응을 실시한 다음 에스테르화하여 얻을 수 있는 에틸 6-요오도니코티노에이트이다. 더욱 일반적으로 말해서, 일반식(9)의 화합물과 반응시킬 수 있는 일반식(10)의 아릴 및 헤테로아릴 화합물의 합성 및/또는 일반식(11)의 화합물의 유도체화에 관하여 하기 공지된 일반적인 합성 방법을 사용할 수 있다.
카르복실산은 전형적으로 이 산을 염화수소 또는 티오닐 클로라이드와 같은 산 촉매의 존재하에 적당한 알콜의 용액중에서 환류시켜서 에스테르화한다. 다른 방도로서, 카르복실산을 디사이크로헥실카르보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에 적절한 알콜과 결합시킬 수 있다. 아세탈과 케탈은 문헌[March, Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company, p. 810]에 기술된 방법으로 쉽게 만든다. 알콜, 알데하이드 및 케톤 모두는 각각 에테르 및 에스테르, 아세탈 또는 케탈을 문헌[McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 및 Protecting Proups, Ed. Greene, John Wiley ＆ Sons, 1981]에 기술된 것과 같은 공지된 방법에 의해 형성함으로써 보호할 수 있다.
반응도식 1의 결합반응을 실시하기 전에 일반식(10)의 화합물에서 n의 값을 증가시키기 위해서(일반식(10)에 상응하는 화합물은 시판되고 있지 않다) 방향족 또는 헤테로방향족 카르복실산을 아른드트-이스테르트 조건하에 또는 다른 동족체화 절차에 따라 연속처리하여 동족체화한다. 또 다른 방도로서, 카르복실산이 아닌 유도체는 적절한 절차에 의해 동족체화할 수 있다. 이어서, 동족체화된 산은 하기된 일반적인 절차에 의해 에스테르화할 수 있다.
A가 하나 이상의 이중 결합을 가진 알케닐 그룹인 일반식(10)의 화합물(또는 다른 중간체 또는 예시 화합물)은 예를 들면 유기화학자에게 널리 알려진 반응절차에 의해, 위티그 및 유사 반응에 의해 알파-할로-아르알킬-카르보실산, 에스테르 또는 유사 카르복스알데하이드로부터 할로겐을 제거하여 이중 결합을 도입함으로써 만들 수 있다. A 그룹이 삼중(아세틸렌) 결합을 가진 일반식(10)의 화합물(또는 다른 중간체 또는 예시 화합물)은 상응하는 방향족 메틸 케톤을 리튬 디이소프로필아미드와 같은 강염기와 반응시키고 디에틸 클로로포스페이트와 반응시킨 후 리튬 디이소프로필아미드를 첨가하여 제조할 수 있다.
일반식(11)의 화합물(또는 다른 중간체 또는 예시 화합물)로부터 유도된 산 및 염은 상응하는 에스테르로부터 쉽게 얻을 수 있다. 알카리 금속 염기로의 염기성 비누화는 산을 제공한다. 예를 들면, 일반식(11)의 에스테르(또는 다른 중간체 또는 예시 화합물)은 바람직하게는 불활성 대기하에 실온에서 약 3몰 과량의 염기(예, 수산화리튬 또는 수산화칼륨)와 함께 알칸올과 같은 극성 용매에 용해시킬 수 있다. 이 용액은 15 내지 20시간동안 교반시킨 후 냉각하고 산성화한 다음 통상적인 수단에 의해 가수분해물을 회수한다.
아미드는 상응하는 에스테르 또는 카르복실산으로부터 본 분야에 공지된 적절한 아미드화 수단에 의해 형성할 수 있다. 이러한 화합물을 제조하는 한 가지 방법은 산을 산 클로라이드로 전환시킨 다음 이 화합물을 수산화암모늄 또는 적절한 아민으로 처리하는 것이다.
알콜은 상응하는 산을 티오닐 클로라이드 또는 다른 수단(J. March, Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company)에 의해 산 클로라이드로 전환시키고 이러서 산 클로라이드를 나트륨 보로하이드라이드(상기 문헌 March의 p. 1124)로 환원시켜 상응하는 알콜을 수득함으로써 제조한다. 다른 방도로서, 에스테르를 감온하에 리튬 알루미늄 하이드라이드로 환원시킬 수 있다. 이들 알콜을 윌리암슨 반응 조건(상기 문헌 March의 p. 357)하에 적당한 알킬 할라이드로 알킬화하여 상응하는 에테르를 얻는다. 이들 알콜은 적당한 산과 산 촉매 또는 디사이클로헥실카르보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재하에 반응시켜 에스테르로 전환시킬 수 있다.
알데하이드는 메틸렌 클로라이드에서 피리디늄 디크로메이트(Corey, E.J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979) 또는 메틸렌 클로라이드에서 디메틸 설폭사이드/옥살릴 클로라이드(Omura, K., Swern, D., Tetrahedron 34: 1651 (1978))와 같은 약 산화제를 사용하여 상응하는 일차 알콜로부터 제조할 수 있다.
케톤은 적당한 알데하이드로부터 이 알데하이드를 알킬 그리냐드 시약 또는 유사한 시약으로 처리한 후 산화시켜 제조할 수 있다.
아세탈 또는 케탈은 상응하는 알데하이드 또는 케톤으로부터 상기 문헌 March, p. 810에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다.
B가 H인 일반식(10)의 화합물(또는 다른 중간체 또는 예시 화합물)은 바람직하게는 할로겐이 I인 상응하는 할로겐화된 방향족 또는 헤테로 방향족 화합물로부터 제조할 수 있다.
반응도식 1에 있어서, 일반식(11)의 화합물을 저온(-78℃ 내지 0℃)하에 테트라하이드로푸란과 같은 불활성 에테르 형 용매중에서 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘과 반응시킨다. 이것은 반응도식 1에 나타나 있는데 여기서 통상 분리되지 않는 나트륨 염 중간체는 일반식(12)로서 괄호로서 나타나 있다. 이 반응은 일반식(13)으로 표시된 트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체를 형성한다. (Tf=SO2CF3). 이어서, 일반식(13)의 화합물은 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 RH로부터 유도된 유기금속 유도체(R14Met(Met는 일가 금속을 나타낸다), 바람직하게는 R14Li(R14는 일반식(1)과 연관되어 정의된다)와 반응시켜 일반식(14)로 표시된 본 발명의 예시 화합물로 전환시킨다. 유기금속 유도체, 바람직하게는 일반식 R14Li의 리튬 유도체와의 반응은 보통 염화아연(ZnCl2) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)-팔라듐(0)(Pd(PPh3)4)의 존재하에 테트라하이드로푸란과 같은 불활성 에테르 형 용매에서 실시한다. 시판되고 있지 않은 유기리튬 시약 R14Li는 본 분야에 공지된 방법에 따라서 에테르 형 용매에서 화합물 R14H(또는 이의 할로겐 유도체 R14-X1(여기서 X1은 할로겐이다))로부터 제조할 수 있다. 시약 R14Li와 일반식(13)의 화합물 사이의 반응을 위한 온도 범위는 일반적으로 말해서 약 -78℃ 내지 50℃이다. 일반식(14)의 화합물은 상기된 반응에 따라서 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다.
반응도식 1에 나타낸 중간체 일반식(7)의 화합물 7-브로모-테트라하이드로나프탈렌-1-온은 일반식 R14MgBr (R14는 일반식(1)과 관련하여 정의된 바와 같다)의 그리냐드 시약으로 전환시켜 일반식(15)의 삼차 알콜을 얻을 수 있다. 삼차 알콜을 산으로 처리하여 탈수시켜 일반식(16)의 3,4-디하이드로-7-브로모나프탈렌 유도체를 얻는다. 이 유도체는 본 발명의 다른 화합물을 합성하기 위한 중간체로서 작용한다 (반응도식 6, 7 및 8 참조).
반응도식 2에 있어서, X가 S, O 또는 NR'이고 Z 그룹이 에티닐 작용기()인 일반식(1)의 화합물에 대한 합성 경로가 기술되어 있다. 이 반응순서에서 출발물질은 일반식(17)로 표시된 구조식의 브로모페놀, 브로모티오페놀 또는 브로모아닐린이다. 본 명세서를 간단하게 하기 위해서, 이하에서는 X는 벤조티오피란 유도체의 제조에서와 같이 주로 황으로 고려될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기술된 반응식도 본 분야 전문가에 명백한 변형과 함께 본 발명의 벤조피란(X=O) 및 디하이드로퀴놀린(X=NR') 화합물을 제조하는데 적합하다는 것을 명심하여야 한다. 따라서, 일반식(17)의 화합물, 바람직하게는 파라 브로모티오페놀, 파라 브로모페놀 또는 파라 브로모아닐린을 염기성 조건하에서 일반식(18)의 3-브로모 카르복실산과 반응시킨다. 이 반응도식에서, 심볼은 일반식(1)과 관련하여 기술된 의미를 갖는다. R3이 수소인 일반식(18)의 시약 예는 3-브로모프로피온산이다. 일반식(18)의 3-브로모카르복실산과의 반응은 일반식(19)의 화합물을 낳는다. 일반식(19)의 화합물을 산으로 처리하여 폐환시켜 일반식(20)의 6-브로모티오크로만-4-온 유도체(X가 S인 경우) 또는 6-브로모크로만 유도체(X가 0인 경우)를 수득한다. 이어서, 일반식(20)의 브로모 화합물을 일반식(7)의 브로모 화합물을 본 발명의 화합물로 전환하기 위한 반응도식 1에 기술된 것과 유사한 조건하에서 동일한 반응순서로 적용시킨다. 따라서, 간단히 요약하면, 일반식(20)의 브로모 화합물을 일반식(21)의 화합물 (트리메틸실릴)아세틸린과 반응시켜 6-(트리메틸실릴)에티닐-치환된 티오크로만-4-온 또는 크로만-4-온을 수득한다. 그런 다음, 일반식(21)의 화합물 (트리메틸실릴)아세틸린과 반응시켜 6-(트리메틸실릴)에티닐-치환된 티오크로만-4-온 또는 크로만-4-온을 염기(수산화칼륨 또는 탄산칼륨)와 반응시켜 일반식(22)의 에티닐 치환된 6-에티닐 치환된 티오크로만-4-온을 얻는다. 이어서, 일반식(22)의 화합물을 반응도식 1의 유사 반응에 대해 기술된 것과 유사한 조건하에서 방향족 또는 헤테로방향족 시약 X1-Y(R2)-A-B'(일반식 10)과 결합시켜 일반식(23)의 화합물을 생성한다.
그런 다음, 일반식(23)의 화합물을 반응도식 1의 유사 반응에 대해 기술된 것과 유사한 조건하에서 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드와 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘과 반응시켜 일반식(24)로 표시된 4-트리풀루오로메틸설포닐옥시 벤조티오피란 또는 벤조피란 유도체를 수득한다. 이어서, 일반식(24)의 화합물을 반응도식 1과 관련하여 기술된 바와 같이 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기금속 유도체와 반응시켜 일반식(25)의 화합물로 전환시킨다.
반응도식 1에서 일반식(7)의 중간체 7-브로모-테트라하이드로나프탈렌-1-온 화합물을 사용하는 것과 유사하게, 일반식(20)의 중간체 6-브로모티오크로만-4-온 화합물을 반응도식 6, 7 및 8에서 하기된 바와 같이 본 발명의 범위내에서 다른 화합물의 제조를 위해 사용할 수 있다. 또한, 일반식(25)의 화합물은 반응도식 1과 관련하여 기술된 것과 유사한 반응으로 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다.
반응도식 3은 X가 [C(R1)2]n이고 n은 0이며 Z 그룹은 에티닐 작용기(-CC-)인 일반식(1)의 화합물에 대한 합성 경로를 기술한 것이다. 이 반응도식에 따르면, 일반식(26)의 6-브로모-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 유도체를 반응도식 1 및 2와 관련하여 상기된 반응과 유사한 반응 순서(트리메틸실릴아세틸렌과의 반응을 출발로 한다)로 반응시켜 일반식(27) 내지 (30)의 중간체를 통해 일반식(31)의 인덴 유도체를 수득한다. 반응도식 3의 범위에 속하는 바람직한 양태로서, 출발물질은 화학문헌[Smith et al. Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123-131]에 따라 입수가능한 6-브로모-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온이다. 6-브로모-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온과 같은 일반식(26)의 화합물은 또한 하기된 바와 같이 본 발명에서 사용하기 위한 다른 예시 화합물의 합성에 사용할 수 있다.
반응도식 4에서, Z가 -(CR1=CR1)n'-이고 n'가 3, 4 또는 5이고 Y는 -(CR1=CR1)n'-그룹과 B사이에 직접결합을 나타내는 일반식(1)의 예시 화합물에 대한 합성경로가 기술된다. 이 합성경로는 X 그룹이 [C(R1)2]n이고 n이 1인 예시 화합물(디하이드로나프탈렌 유도체)에 대해 기술한 것이다. 그러나, 반응도식 4 및 이하의 반응도식에 기술된 반응 및 합성방법이 또한 이 분야 전문가에게 자명한 변형과 함께 X가 S, O, NR'인 유도체(벤조티오피란, 벤조피란 또는 디하이드로퀴놀린 유도체) 또는 [C(R)]이고 n이 0인 유도체(인덴 유도체)에 적용가능하다.
반응도식 4에 따르면, 일반식(32)의 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌 유도체를 프리델 크라프츠 조건하에서 산 클로라이드(R1COCl)와 반응시키고 생성된 아세틸화된 생성물을 예를 들면 존스 산화반응으로 산화시켜 일반식(33)의 이성체 6- 및 7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 유도체의 혼합물을 수득한다. 이 반응의 특정 바람직한 예로서, 일반식(32)의 출발화합물은 본 명세서의 실험 섹션에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있는 1,2,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸나프탈렌(공지 화합물)이다. 일반식(33)의 7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 유도체를 산의 존재하에 에틸렌 글리콜과 반응시켜 일반식(34)의 hcp를 케탈 유도체로서 엑소사이클릭 케톤 잔기의 옥소 작용기를 보호한다. 그런 후 일반식(34)의 케탈을 일반식 R14MgBr (심볼은 일반식(1)과 관련하여 정의된 바와 같다)의 그리냐드 시약과 반응시켜 일반식(35)의 삼차 알콜을 수득한다. 이어서, 디옥솔란 보호 그룹을 제고하고 삼차 알콜을 산으로 처리하여 탈수시켜 일반식(36)의 3,4-디하이드로-7-아세틸나프탈렌 유도체를 얻는다. 일반식(36) 화합물의 케톤 작용기를 강 알카리성 조건하에서 일반식(37)의 포스페이트 시약과 호르너 에몬스(또는 유사) 반응시킨 후 환원시켜 일반식(38)의 알데하이드 화합물을 수득한다. 강 알카리성 조건하에 일반식(39)의 시약과의 다른 호르너 에몬스 (또는 유사) 반응은 일반식(40)의 화합물을 제공한다. 일반식(40)의 화합물은 상기된 반응에 따라 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다. 바람직한 화합물의 제조를 위해 사용된 일반식(37)의 호르너 에몬스 시약의 특정 예는 디에틸시아노메틸포스포네이트이고 일반식(39)의 호르너 에몬스 시약의 예는 디에틸-(E)-3-에톡시카르보닐-2-메틸알릴포스포네이트이다.
반응도식 5는 Z 그룹이 아조 그룹(-N=N-)인 화합물을 제조하는 합성 방법을 기술하고 있다. 반응도식 4에서와 같이 이 방법은 X 그룹이 [C(R1)2]n이고 n은 1인 예시 화합물(디하이드로나프탈렌 유도체)을 위해 기술된 것이다. 그러나, 기술된 합성방법은 본 분야에 전문가에게 자명한 변형과 함께 본 발명에 사용하기 위한 모든 아조 화합물, 즉 X가 S, O, NR'인 유도체(벤조티오피란, 벤조피란 또는 디하이드로퀴놀론 유도체) 또는 [C(R1)2]n이고 n이 0인 유도체(인덴 유도체)에 적용가능하다. 그러므로, 니트로 그룹을 표준 질화 조건하에 일반식(6)의 출발 화합물에 도입시켜 일반식(41)의 3,4-디하이드로-7-니트로-1(2H)-나프탈레논 유도체를 수득한다. 일반식(41)의 화합물을 일반식(42)의 3,4-디하이드로-7-아미노-1(2H)-나프탈레논 유도체로 환원시키고 그런 후 아조 화합물을 제조하기 위해 정상적으로 사용된 조건하에서 일반식 ON-Y(R2)-A-B (일반식 43)의 니트로소 화합물과 반응시킨다. 일반식(43)의 니트로소 화합물은 본 분야에 공지된 반응에 따라 수득할 수 있다. 바람직한 화합물의 합성을 위해 사용되는 그러한 화합물의 특정 예는 에틸 4-니트로소벤조에이트이다. 그런 후 일반식(44)의 아조 화합물을 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘과 반응시켜 일반식(45)의 4-트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체를 생성한다. 그런 다음 일반식(45)의 화합물을 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기금속 유도체와 반응시켜 일반식(46)의 아조 화합물로 전환시킨다. 이들 두 반응, 즉 4-트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체로의 전환 및 유기금속 유도체와의 후속 반응은 반응도식 1, 2 및 3과 관련하여 상기되어 있으며 예시적인 RAR 길항제 화합물을 유도하는 몇 가지 바람직한 합성 방법에서 사용된다.
반응도식 6은 Z 그룹이 COO- 또는 CONR1(R1은 바람직하게는 H이다)인 일반식(1)의 화합물을 제조하기 위해 바람직한 합성 방법을 기술한 것이다. 이들 에스테르 및 아미드 유도체는 반응도식 1에 기술된 바와 같이 얻을 수 있는 일반식(16)의 3,4-디하이드로-7-브로모나프탈렌 유도체로부터 제조한다. 따라서, 일반식(16)의 화합물을 냉온에서 테트라하이드로푸란과 같은 불활성 에테르 형 용매에서 t-부틸리튬과 같은 강염기와 반응시키고 이산화탄소를 첨가하여 일반식(47)의 5,6-디하이드로-2-나프탈렌카르복실산 유도체를 제공한다. 이어서, 일반식(47)의 화합물을 X2가 OH 또는 NR1그룹이고 R1이 바람직하게는 수소인 일반식 X2-Y(R2)-A-B의 화합물(일반식 48)과 반응시킨다. 본 분야의 전문가는 일반식(48)의 화합물이 공지방법에 따라 얻을 수 있는 아릴 또는 헤테로아릴 하이드록시 또는 아미노 유도체이다. 일반식(47)의 화합물과 일반식(48)의 화합물사이의 반응은 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 및 4-디메틸아미노피리딘의 존재하에 두 화합물을 결합시키는 것과 같이 여러 알려진 에스테르 또는 아미드 형성 조건하에서 실시할 수 있다. 또 다른 방도로서, 일반식(47)의 화합물을 염기의 존재하에 일반식(48)의 화합물과 결합시키기 위해 상응하는 산 클로라이드로 전환시킬 수 있다. 일반식(48)의 아미드 또는 에스테르 화합물은 상기된 바와 같이 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다. 비록 반응도식 6이 일반식(1)의 X 그룹이 [C(R1)2]n이고 n이 1인 예시 화합물(디하이드로나프탈렌 유도체)에 대해 기술되고 있으나, 여기에 기술된 방법은 벤조피란, 벤조티오피란, 디하이드로퀴놀린 및 인덴 유도체의 제조에 적용될 수 있다.
Z가 -OCO-, NR1CO인 일반식(1)의 화합물 뿐만 아니라 상응하는 티오에스테르 및 티오아미드 유사체는 브로모 작용기가 아미노 또는 하이드록실 그룹으로 치환된 일반식(16)의 화합물로부터 유도된 중간체로부터 미국특허 제5,324,744호(이의 명세서는 본 명세서에 참고로 인용된다)의 방법에 따라 제조할 수 있다.
반응도식 6A는 Z 그룹이 CONH인 일반식(1)의 특정 바람직한 디하이드로나프탈렌 화합물(아미드 유도체)의 합성 경로를 기술한 것이다. 비록 이 특정 합성경로에서 사용딘 시약의 성질이 이 반응도식에 나타나 있으나, 다음과 같은 설명이 또한 제공된다. 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논을 염화 알루미늄의 존재하에 브롬화하여 본 반응도식에서 첫 번째 화합물인 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논(화합물 B)를 수득한다. 화합물 B를 4-브로모톨루엔으로부터 얻은 그리냐드 시약과 반응시켜 1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌(화합물 C)을 수득하고 이를 파라-톨루엔 설폰산과 함께 가열하여 탈수시켜 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌(화합물 D)를 얻는다. 화합물 D를 t-부틸리튬으로 처리하여 금속 할로겐 교환을 일으키고 생성된 유기리튬 화합물을 이산화탄소로 급냉시켜 5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실 산(화합물 K)을 생성한다. 화합물 K를 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 4-메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 에틸 4-아미노벤조에이트, 에틸 2-플루오로-4-아미노벤조에이트 또는 에틸 2,6-디플루오로-4-아미노벤조에이트와 축합시켜 각각 에틸 4[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트(화합물 35), 에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 40) 및 에틸 2,6-디플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 212)을 수득한다. 이들 에틸 에스테르를 비누화하여 유리 카르복실산 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 36), 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 41) 및 2,6-디플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 203)을 각각 수득한다.
반응도식 6B는 Z 그룹이 CONH인 일반식(1)의 특정 바람직한 벤조피란(크로멘) 화합물(아미드 유도체)에 대한 합성 경로를 기술한 것이다. 이 반응도식에 따르면, 디하이드로쿠마린 (화합물 213)을 메틸 마그네슘 클로라이드와 그리냐드 반응시킨 다음 삼차 알콜 중간체를 산과 함께 가열하여 2,2-디메틸크로만(화합물 214)를 생성한다. 화합물(214)를 프리델-크라프츠 반응으로 6-아세틸-2,2-디메틸크로만(화합물 215)로 전환시키고 이 전환된 화합물을 수산화 나트륨의 존재하에 NaOCl로 산화시킨 후 에스테르화하여 에틸 2,2-디메틸크로만-6-카르복실레이트(화합물 216)을 생성한다. 화합물(216)을 빙초산에서 브롬으로 처리하여 에틸 8-브로모-2,2-디메틸크로만-6-카르복실레이트(화합물 217)를 수득한다. 화합물(217)를 삼산화 크롬으로 산화시켜 크로만 환의 4-위치에서 케톤 기능을 형성하고 에틸 8-브로모-2,2-디메틸-4-크로마논-6-카르복실레이트(화합물 218)를 형성한다. 4-브로모톨루엔으로부터 만드 그리냐드 시약과 화합물(218)을 반응시키고 이어서 p-TSOH와 함께 가열하여 중간 삼차 알콜의 탈수를 완성하여 에틸 8-브로모-2,2-디메틸-4-톨릴-4(2H)-크로만-6-카르복실레이트(화합물 219)를 수득한다. 화합물(219)를 염기로 비누화하여 상응하는 유리 카르복실산인 8-브로모-2,2-디메틸-4-톨릴-4(2H)-크로만-6-카르복실산(화합물 220)을 생성한다. 화합물(220)을 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이드 하이드로클로라이드(EDC)와 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 에틸 2-플루오로-4-아미노벤조에이트 및 에틸 2,6-디플루오로-4-아미노벤조에이트와 축합시켜 에틸 2-플루오로-4-[[8-브로모-2,2-디메틸-4-톨릴-6-크로마닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 221) 및 에틸 2,6-디플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 212)을 각각 수득한다. 화합물(221) 및 화합물(222)를 비누화하여 상응하는 카르복실산인 2-플루오로-4-[[8-브로모-2,2-디메틸-4-톨릴-6-크로마닐)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 204) 및 2,6-디플루오로-4-[[8-브로모-2,2-디메틸-4-톨릴-6-크로마닐)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 205를 각각 수득한다.
반응도식 7은 Z가 -(CR1=CR1)n'이고 n'는 0인 일반식(1)의 화합물을 제조하는 바람직한 합성방법을 기술한 것이다. 일반식(50)의 화합물을 일반식(6)의 화합물과 일반식(10)의 할로 화합물로부터 유도된 그리냐드 시약과 결합반응시켜 수득할 수 있다. 결합반응은 전형적으로 테트라하이드로푸란과 같은 불활성 에테르 형 용매중에서 아연 염과 니켈(Ni(O)) 촉매의 존재하에서 실시한다. 일반식(50)의 화합물은 상기된 바와 같이 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다.
반응도식 8에는 Z가 -(CR1=CR1)n'이고 n'는 1인 화합물의 제조를 위한 바람직한 합성방법이 기술되어 있다. 더욱 자세하게는, 반응도식 8은 디하이드로나프탈렌 유도체이고 Z 그룹이 비닐(-CH=CH-) 작용기를 나타내는 화합물을 제조하는 바람직한 방법을 기술한 것이다. 그러나, 본 명세서에 기술된 일반적인 방법은 본 분야에 전문가에게 자명한 변형과 함께 유사한 벤조피란, 벤조티오피란, 디하이드로퀴놀린 화합물 및 비닐 그룹이 치환된 화합물에 적용가능하다. 따라서, 반응도식 8에 따라, 7-브로모-1(2H)-나프탈레논 유도체를 구조식 -CH2=CH-Y(R2)-A-B(일반식 51)과 적합한 촉매, 전형적으로 일반식 Pd(PPh3)을 갖는 촉매 및 산 수용체(예, 트리에틸아민)의 존재하에 불활성 가스(아르곤) 대기하에 반응시킨다. 이 반응의 조건은 일반식(9)의 아세틸렌 유도체와 일반식(30)의 시약과의 결합(예를 들면 반응도식 1 참조)과 유사하고 이러한 유형의 반응은 일반적으로 헥크 반응으로서 본 분야에 알려져 있다. 일반식(51)의 비닐 유도체는 공지 방법에 따라 수득할 수 있으며 본 발명에서 사용될 바람직한 화합물의 합성을 위해 사용된 그러한 시약의 예는 에틸 4-비닐벤조에이트이다.
헥크 결합 반응의 생성물은 일반식(52)의 에테닐 유도체이며 그런 후 이 유도체를 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘으로 처리하여 본 발명에서 사용된 화합물로 전환시켜 일반식(53)의 4-트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체를 생성한다. 이어서, 4-트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체를 상기된 바와 같이 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기금속 유도체와 반응시킨다. 생성된 일반식(54)의 화합물을 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다.
일반식(54)의 화합물은 또한 위티그 또는 호르너 에몬스 반응을 사용하는 합성경로를 통해 얻을 수 있다. 예를 들면, 일반식(33)의 중간체(반응도식 4 참조)를 미국특허 제5,324,840호 (이의 내용은 본 명세서에 참조로 인용한다)에 유사한 호르너 에몬스 반응에 대해 기술된 바와 같이 트리페닐포스포늄 브로마이드 (위티그) 시약, 더욱 바람직하게는 구조식 (EtO)2PO-CH2-
Y(R2)-A-B의 디에틸포스포네이트 (호르너 에몬스) 시약과 반응시킬 수 있다. 바로 앞서 언급된 호르너 에몬스 반응은 일반식(52)의 구조와 유사한 중간 화합물을 제공하고 일반식(52)의 화합물에 대해 반응도식 8에 기술된 반응 순서에 의해 일반식(54)의 화합물로 전환시킬 수 있다.
합성방법-아릴 및 (3-옥시-1-프로페닐)-치환된 화합물
일반식(101)의 예시적인 RAR 길항제 화합물은 여기에 도해된 화학합성 경로로 제조할 수 있다. 합성 화학자는 본 명세서에 기술된 조건이 일반식(101)로 표시된 화합물 모두에 대해 일반화될 수 있는 특정 양태임을 쉽게 인식할 것이다.
반응도식 101은 X가 [C(R1)2]n이고 n은 1이며 p는 0이고 R17은 H 또는 저급 알킬인 일반식(101)의 화합물에 대한 합성을 기술한 것이다. 즉, 반응도식 101은 3,4-디하이드로나프탈렌 유도체인 본 발명의 화합물에 대한 합성을 도해한 것이다. 이 반응도식에 따라, R3및 R2그룹(이들은 일반식(101)과 관련하여 정의되어 있다)으로 적절히 치환된 일반식(103)의 테트라하이드로나프탈렌 화합물은 출발물질로서 작용한다. 일반식(103)의 화합물의 바람직한 예는 화학문헌[Mathur et al. Tetrahedran, 1985, 41: 1509]에 기술되어 있는 1,3,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸-나프탈렌이다. 1-브로모-3-페닐프로판으로부터 이 화합물의 합성을 위해 바람직한 경로는 또한 본 명세서의 실험 섹션에 기술되어 있다.
일반식(103)의 화합물을 프리델 크라프츠 유형 반응으로 구조식 R16CH2COCl(R16은 일반식(101)과 관련하여 정의된 바와 같다)을 갖는 산 클로라이드와 반응시킨 후 아세트산 중에서 삼산화 크롬으로 산화시켜 이성체 6 및 7 아실-3,4-디하이드로-1(2H)-나프탈레논 유도체를 제공한다. 본 발명의 관점에서 바람직한 6-아실 유도체만이 반응도식 101에서 구조식(일반식 104)으로 나타나 있다. 본 발명의 바람직한 화합물의 제조에서 R1그룹은 메틸이고 R2, R3및 R16은 수소이며 이에 따라 일반식(104)에 상응하는 바람직한 중간체는 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-아세틸-1(2H)-나프탈레논이다.
그런 후 일반식(104)의 화합물의 엑소사이클릭 케톤 작용기는 예를 들면 산중에서 에틸렌 글리콜로 처리하여 케탈로서 보호하여 일반식(105)의 1,3-디옥솔라닐 유도체를 제공한다. 이어서, 일반식(105)의 화합물을 일반식 R14MgBr (R14은 일반식(101)과 관련하여 정의된 바와 같다)의 그리냐드 시약과 반응시켜 일반식(106)의 1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-나프탈렌 유도체를 생성한다. 그런 다음 일반식(106)의 화합물의 엑소사이클릭 케톤 작용기를 산으로 처리하여 탈보호하고 탈수시켜 일반식(107)의 화합물을 수득한다.
일반식(105)의 화합물로부터 일반식(107)의 화합물을 얻는 다른 방법은 저온(-78℃ 내지 0℃)하에 테트라하이드로푸란과 같은 불활성 에테르 유형 용매중에서 일반식(10)의 화합물을 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘 (Tf=SO2CF3)과 일반식(105)의 화합물을 반응시키는 것이다. 이 반응은 보통 분리되지 않고 반응도식 101에 도시되어 있지 않은 나트륨 염 중간체를 통해 진행한다. 전체 반응은 트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체를 낳으며 그런 후 이를 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기금속 유도체(R14Met(여기서, Met는 일가 금속을 나타낸다)), 바람직하게는 R14Li와 반응시킨다. 유기금속 유도체, 바람직하게는 일반식 R14Li의 리튬 유도체와의 반응은 보통 염화아연 및 테트라키스(트리페닐포스핀)-팔라듐(0)(Pd(PPh3)4)의 존재하에 불활성 에테르 유형 용매(예, 테트라하이드로푸란)에서 실시한다. 시판되지 않고 있으나 유기금속 시약 R14Li는 이 분야에 알려진 방법에 따라 에테르 유형 용매중에서 화합물 R14H(또는 이의 할로겐 유도체 R14-X1(여기서, X1는 할로겐이다))로부터 제조할 수 있다. 시약 R14Li와 트리플루오로메틸설포닐옥시 유도체사이의 반응을 위한 온도범위는 일반적으로 말해서 약 -78℃ 내지 50℃이다.
본 발명의 화합물은 일반식(107)의 케톤 화합물과 일반식(108)의 알데하이드 또는 케톤사이의 축합 결과로서 형성된다. 본 발명의 바람직한 예시 화합물의 제조시 일반식(108)의 시약은 4-카르복시벤즈알데하이드(R17H)이다. 일반식(108)의 범위에 속하고 축합반응 및 본 발명의 범위에 속하는 화합물(일반식 101)의 합성에 적합한 다른 시약의 예로는 다음과 같다: 5-카르복시-피리딘-2-알데하이드, 4-카르복시-피리딘-2-알데하이드, 4-카르복시-티오펜-2-알데하이드, 5-카르복시-티오펜-2-알데하이드, 4-카르복시-푸란-2-알데하이드, 5-카르복시-푸란-2-알데하이드, 4-카르복시아세토페논, 2-아세틸-피리딘-5-카르복실산, 2-아세틸-피리딘-4-카르복실산, 2-아세틸-티오펜-4-카르복실산, 2-아세틸-티오펜-5-카르복실산, 2-아세틸-푸란-4-카르복실산 및 2-아세틸-푸란-5-카르복실산. 후자의 화합물들은 화학문헌[예, Decroix et al. J. Chem. Res.(S), 4: 134(1978); Dawson et al., J. Med. Chem. 29: 1282(1983); 및 Queguiner et al. Bull Soc. Chimique de France No. 10, pp. 3678-3683(1969)]에 따라 입수가능하다. 일반식(107)과 일반식(108)의 화합물사이에 축합반응은 알콜성 용매중에서 염기의 존재하에서 실시한다. 바람직하게는, 이 반응을 수산화나트륨의 존재하에 에탄올중에서 실시한다. 본 분야의 전문가는 이 축합 반응을 알돌 축합으로 인식할 것이며 본 명세서에 기술된 바람직한 예의 경우에(일반식(107)의 케톤을 일반식(108)의 알데하이드와 축합) 클라이젠-쉬미트 반응으로서 인식할 것이다. (참조: March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, pp. 694-695 McGraw Hill (1968)). 일반식(109)의 화합물은 본 발명의 범위에 속하며 또한 추가의 형질전환시켜 본 발명의 다른 화합물을 생성할 수 있다. 또 다른 방도로서, 일반식(108)의 A-B 그룹은 널리 알려져 있고 유기화학자의 기술에 속하는 특성의 하나 이상의 합성 형질전환 후만이 일반식(101)에서 정의된 바와 같이 본 발명의 범위에 속하는 그룹일 수 있다. 예를 들면, A-B 그룹에 실행된 반응은 탈보호 단계, 동족체화, 에스테르화, 비누화, 아미드 형성 등일 수 있다.
일반적으로 말해서, 일반식(107)의 화합물과 반응할 수 있는 일반식(108)의 아릴 및 헤테로아릴 화합물의 합성 및/또는 일반식(109) 화합물의 유도체화를 위해 다음의 널리 알려지고 공지된 일반적인 합성 방법을 사용할 수 있다.
상기된 바와 같이, 카르복실산을 염화수소 또는 티오닐 클로라이드와 같은 산 촉매의 존재하에 적당한 알콜의 용액 중에서 환류시켜서 카르복실산을 에스테르화한다. 또 다른 방도로서, 카르복실산을 디사이클로헥실카르보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재하에 적절한 알콜과 축합시킬 수 있다. 에스테르는 통상적인 수단에 의해 회수하고 정제한다. 아세탈과 케탈은 문헌[March, Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company, p. 810]에 기술된 방법으로 쉽게 제조한다. 알콜, 알데하이드 및 케톤 모두는 문헌[McOmie, Pleum Publishing Press, 1973 and Protecting Groups, Ed. Greene, John Wiley ＆ Sons, 1981]에 기술된 것과 같은 공지 방법에 의해 에테르 및 에스테르, 아세탈 또는 케탈을 형성함으로써 각각 보호할 수 있다.
반응도식 101의 축합반응을 실시하기 전에 일반삭(108)의 화합물에서 n의 값을 증가시키기 위해 (여기서, 일반식(108)에 상응하는 화합물은 시판되고 있지 않다) 방향족 또는 헤테로방향족 카르복실산을 (알데하이드 그룹을 보호하는 한편) 아르드트-아이스테르트 조건하에 또는 다른 동족체화 절차에 따라 연속 처리하여 동족체화할 수 있다. 다른 방도로서, 카르복실산이 아닌 유도체는 또한 적절한 절차에 의해 동독체화할 수 있다. 이어서, 동족체화된 산은 상기된 일반적인 절차에 의해 에스테르화할 수 있다.
A가 하나 이상의 이중 결합을 갖는 알케닐 그룹인 일반식(108)의 화합물(또는 본 발명의 다른 중간체)은 예를 들면 유기 화학자에게 잘 알려진 합성 반응도식에 의해, 위티그 및 유사 반응에 의해 또는 알파-할로-아릴알킬-카르복실산, 에스테르 또는 유사 카르복스알데하이드로부터 할로겐을 제거하여 이중결합을 도입함으로써 제조할 수 있다. A 그룹이 삼중(아세틸렌) 결합을 갖는 일반식(108)의 화합물(또는 본 발명의 다른 중간체)은 상응하는 방향족 메틸 케톤을 리튬 디이소프로필아미드와 같은 강 염기와 반응시키고, 디에틸 클로로포스페이트와 반응시킨 다음 리튬 디이소프로필아미드를 첨가하여 제조할 수 있다.
일반식(109)의 화합물(또는 본 발명의 다른 중간체 또는 화합물)로부터 유도된 산 및 염은 축합반응의 결과로서 또는 상응하는 에스테르로부터 직접 쉽게 얻을 수 있다. 알카리 금속 염기로 염기성 비누화하여 산을 얻을 수 있다. 예를 들면, 일반식(109)의 에스테르(또는 본 발명의 다른 중간체 또는 화합물)를 약 3몰 과량의 염기(예, 수산화리튬 또는 수산화칼륨)와 함께, 바람직하게는 불활성 대기하에 실온에서 알칸올과 같은 극성 용매중에 용해시킬 수 있다. 이 용액은 15 내지 20 시간동안 교반시킨 후 냉각 및 산성화시키고 통상의 수단으로 가수분해물을 회수한다.
아미드는 상응하는 에스테르 또는 카르복실산으로부터 이 분야에 공지된 적당한 아미드화 수단에 의해 형성할 수 있다. 이러한 화합물을 제조하는 한 가지 방법은 산을 산 클로라이드로 전화시킨 다음 이 화합물을 수산화암모늄 또는 적당한 아민으로 처리하는 것이다.
알콜은 상응하는 산을 티오닐 클로라이드 또는 다른 수단(J. March, Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company)을 이요하여 산 클로라이드로 전환시킨 다음 산 클로라이드를 나트륨 보로하이드라이드(상기 March 문헌 p. 1124)로 환원시켜 제조할 수 있다. 다른 방도로서, 에스테르를 감온에서 리튬 알루미늄 하이드라이드로 환원시킬 수 있다. 윌리암슨 반응 조건(상기 March 문헌 p. 357)하에 적절한 알킬 할라이드로 그들 알콜을 알킬화하여 상응하는 에테르를 수득한다. 이들 알콜은 산 촉매 또는 디사클로헥실카르보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재하에 적절한 산과 반응시켜 에스테르로 전환시킬 수 있다.
알데하이드는 메틸렌 클로라이드중에서 피리디늄 디크로메이트(Corey, E.J., Schmidt, G., Tet. Lett., 399, 1979) 또는 메틸렌 클로라이드중에서 디메틸 설폭사이드/옥살릴 클로라이드(Omura, K., Swern, D., Tetrahedron, 34: 1651 (1978))와 같은 약 산화제를 이용하여 상응하는 일차 알콜로부터 제조할 수 있다.
케톤은 알데하이드를 알킬 그리냐드 시약 또는 유사한 시약으로 처리한 다음 산화시켜 제조할 수 있다.
아세탈과 케탈은 상기 March 문헌 p. 810에 기술된 방법에 의해 상응하는 알데하이드 또는 케톤으로부터 제조할 수 있다.
반응도식 102에, p가 0이고 축합 환 구조의 방향족 부분에서 R2가 OH이며 R17이 OH인 본 발명에 따른 일반식(101)의 화합물을 합성하는 경로가 기술되어 있다. 본 분야의 전문가는 이들 화합물이 엔올 형태의 β-디케톤임을 쉽게 인지할 것이다. 또한, 반응도식 102는 p가 1인 본 발명 화합물의 합성경로를 기술하고 있다. 본 분야의 전문가는 후자 화합물이 플라본임을 쉽게 인지할 것이다. 따라서, 이 반응도식에 따라 일반식(110)의 1,2,3,4-테트라하이드로-6-메톡시나프탈렌-1-온 유도체를 CH2Cl2과 같은 적합한 용매중에서 사염화티탄의 존재하에 디알킬아연(R1Zn)과 반응시켜 옥소 작용기를 디알킬 그룹 R1R1으로 치환시켜 R1이 저급알킬인 일반식(111)의 화합물을 수득한다. 반응도식 102에 따라 제조되는 본 발명의 화합물의 바람직한 양태에 있어서, R3그룹은 수소이고 R1은 메틸이다. 따라서, 디알킬 아연 시약은 디메틸 아연이고 일반식(110)의 바람직한 출발물질은 1,2,3,4-테트라하이드로-6-메톡시나프탈렌-1-온이다. 후자 화합물은 알드리치 케미칼 컴퍼니로부터 구입할 수 있다. 그런 후 일반식(111)의 1,2,3,4-테트라하이드로-1,2-디알킬-6-메톡시 나프탈렌 유도체를 아세트산 및 무수 아세트산 중에서 삼산화크롬으로 산화시켜 일반식(112)의 1,2,3,4-테트라하이드로-3,4-디알킬-7-메톡시 나프탈렌-1-온 유도체를 수득한다. 일반식(112)의 케톤 화합물을 그리냐드 시약 (R14MgBr, R14는 일반식(101)에서 정의된 바와 같다)과 반응시켜 일반식(113)의 1-하이드록시-1-아릴-3,4-디하이드로-3,4-디알킬-7-메톡시 나프탈렌 유도체를 수득한다. 일반식(113)의 하이드록시 화합물을 바람직하게는 산중에서 가열하여 제거반응시켜 일반식(114)의 디하이드로나프탈렌 화합물을 수득한다. CH2Cl2과 같은 적합한 용매중에서 삼브롬화붕소로 처리하여 일반식(114)의 화합물의 페놀성 메틸 에테르 작용기로부터 메틸 그룹을 제거한 후 페놀성 OH를 R16CH2CO 그룹을 도입하는 아실화제로 아실화하여 일반식(115)의 화합물을 생성한다. 바람직한 양태로서 R16은 H이며 이에 따라 아실화제는 아세틸 클로라이드 또는 무수 아세트산이다. 아세틸화 반응은 피리딘과 같은 염기성 용매중에서 실시한다. 일반식(115)의 아실화 페놀 화합물을 염화알루미늄과 승온에서 반응시켜 프리스 재배치시키고 일반식(116)의 1-아릴-3,4-디알킬-디하이드로-6-아실-7-하이드록시-나프탈렌 화합물을 생성한다. 일반식(116) 화합물의 페놀성 하이드록실 그룹을 CO-Y(R2)-A-B 그룹을 도입하는 아실화제(예, 산 클로라이드)로 아실화하여 일반식(117)의 화합물을 수득한다. 산 클로라이드 시약 Cl-CO-Y(R2)-A-B (또는 유사 아실화제)에서 심볼 Y, R 및 A-B는 일반식(101)에서 정의된 바와 같다. 이 반응도식에 따른 본 발명의 바람직한 화합물의 제조에서 이 시약은 ClCOC6H4COOEt (테레프탈산의 반 에틸 에스테르 반 산 클로라이드)이다.
일반식(117)의 화합물을 피리딘 중에서 수산화칼륨과 같은 강 염기와 반응시켜 분자내 클라이젠 축합반응의 결과로서 일반식(118)의 화합물을 수득한다. 일반식(118)의 화합물은 본 발명의 범위내에 속하며 축합 환 잔기의 방향족 부분에서 R2치환체가 OH이고 R17이 OH인 일반식(101)의 화합물에 속한다. 상기 반응(분자내 클라이젠 축합)과 상기 프리즈 재배열과 관련하여, 이들 가능한 반응 기전은 본 명세서에 기술된 반응을 자세히 설명하기 위한 목적으로 및 본 분야에 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 기술된 반응을 실시하고 본 발명의 화합물을 제조하는 일을 용이하게 하기 위한 목적으로 본 명세서에 기술한 것임을 주지하여야 한다. 그러나, 본 발명자들은 반응 기전 및 이론에 구애받지 않기를 원하며 본 명세서에 청구된 발명은 이로서 한정되어서는 아니된다.
일반식(118)의 화합물을 아세트산과 같은 적합한 양자성 용매중에서 황산과 같은 강산과 반응시켜 일반식(119)의 플라본 화합물을 생성한다. 일반식(119)의 화합물도 p가 1인 일반식(101)의 범위에 속하는 본 발명의 화합물이다. 일반식(118) 및 일반식(119)의 화합물 모두는 좀더 반응 및 형질변환시켜 반응도식 101과 관련하여 상기된 바와 같이 추가의 동족체 및 유도체를 제공할 수 있다. 이것은 반응도식 102에 동족체 및 유도체로의 전환으로서 표시되어 있다.
반응도식 103에 X가 S, O 또는 NR'이고 p가 0이며 R17은 H 또는 저급알킬인 본 발명의 일반식(101) 화합물을 생성하는 합성경로가 기술되어 있다. 그러나, 반응도식 102에 기술된 일반적인 합성원리를 적용함으로써 본 분야의 전문가는 상기 합성방법을 변형 또는 응용하여 X가 S, O 또는 NR'이고 p가 1이거나 X가 S, O 또는 NR'이고 p가 0이며 축합 환 잔기의 방향족 부분에서 R2그룹이 OH이고 R17이 OH인 본 발명의 화합물을 수득할 수 있다.
반응도식 103의 출발 화합물은 일반식(120)의 페놀, 티오페놀 또는 아닐린 유도체이다. 본 발명의 현재 바람직한 화합물에서 R2및 R16그룹은 둘다 수소이고 일반식(120)의 바람직한 출발 화합물은 화학문헌 (Nuyken, et al. Polym. Bull (Berlin) 11:165 (1984))에 공지된 3-에테닐-티오페놀 또는 3-에테닐-페놀이다. 본 명세서를 간략하게 하기 위하여 이하에서는 X는 본 발명의 벤조티오피란 유도체를 제조하는 경우 주로 황으로 고려될 수 있다. 그러나, 여기에 기술된 반응도식은 또한 본 발명의 범위에 속하는 벤조피란(X=O) 및 디하이드로퀴놀린(X=NR')의 제조시 본 분야 전문가에 명백한 변형으로 적합할 수 있음을 명심하여야 한다. 따라서, 일반식(120)의 화합물을 염기성 조건하에서 일반식(121)의 3-브로모 카르복실산과 반응시킨다. 이 반응도식에서 심볼은 일반식(101)과 연관되어 기술된 의미를 갖는다. R3이 수소인 일반식(121)의 시약에 대한 예로는 3-브로모프로피온산을 들 수 있다. 일반식(121)의 3-브로모카르복실산과의 반응은 일반식(122)의 화합물을 낳는다. 후자를 산으로 처리하여 폐환시켜 일반식(123)의 7-에테닐-티오크로만-4-온 유도체(X가 S인 경우) 또는 7-에테닐-크로만 유도체(X가 O인 경우)을 생성한다. 일반식(123)의 7-에테닐-티오크로만-4-온 또는 7-에테닐-크로만-4-온 유도체를 Pd(II)Cl2및 CuCl2촉매의 존재하에 산화시켜 일반식(124)의 상응하는 7-아실(케톤) 화합물을 생성한다. 본 분야의 전문가는 후자 반응을 왁커 산화반응으로서 인식할 것이다. 일반식(124) 화합물의 엑소사이클릭 케톤 그룹을 예를 들면 산중의 에틸렌 글리콜로 처리하여 케탈의 형태로 보호하여 일반식(125)의 1,3-디옥솔라닐 유도체를 생성한다. 그런 다음, 일반식(125)의 화합물을 반응도식 101에서 일반식(105)의 화합물에 대해 기술한 바와 유사한 일련의 반응에 적용시킨다. 따라서, 일반식(125)의 1,3-디옥솔라닐 유도체를 일반식 RMgBr의 그리냐드 시약과 반응시켜 일반식(126)의 삼차 알콜을 생성한 후 산에서 탈수시켜 일반식(127)의 벤조티오피란(X는 S), 벤조피란(X는 O) 또는 디하이드로퀴놀린(X는 NR') 유도체를 생성한다. 이어서, 일반식(127)의 케톤 화합물을 염기의 존재하에 알돌 축합 (클라이젠-쉬디트) 반응으로 일반식(108)의 시약과 반응시켜 본 발명의 일반식(128) 화합물을 생성한다. 일반식(128)의 화합물은 반응도식 101 및 102와 관련하여 상기된 바와 같이 다른 동족체 및 유도체로 전환시킬 수 있다.
특정 실시예
2-하이드록시-2-메틸-5-페닐펜탄
무수 Et2O 200 ml중의 마그네슘 13.16 g(0.541 몰)의 혼합물에 Et2O 100 ml중의 용액으로서 1-브로모-3-페닐 프로판 100.0 g(0.492 몰)을 첨가하였다. 5 내지 10 ml의 용액을 첨가한 후 첨가를 그리냐드 시약의 형성이 진행중에 있을 때까지 중지시켰다. 남은 브로마이드를 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 그리냐드 시약을 35℃에서 20분간 교반시킨 다음 31.46 g(0.541)의 아세톤을 45분에 걸쳐 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반시킨 후 0℃로 냉각시킨 후 조심스럽게 20% HCl을 첨가하여 산성화하였다. 수성층을 Et2O(3x200 ml)로 추출하고 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 MgSO4로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 잔사를 증류시켜 담황색 오일로서 비점 99 내지 102℃/0.5 mmHg 인 생성물을 63.0 g(72%)를 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.28-7.18 (5H, m), 2.63 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.68 (2H, m), 1.52 (2H, m), 1.20 (6H, s).
1,2,3,4-테트라하이드로-디메틸나프탈렌
메탄설폰산 400 ml 중의 P2O5(55.3 g, 0.390 몰)의 혼합물을 모든 고체가 용해될 때까지 아르곤하에서 105℃로 가열하였다. 생성된 용액을 실온으로 냉각시키고 2-하이드록시-2-메틸-5-페닐펜탄 (63.0 g, 0.354 몰)을 서서히 교반하면서 첨가하였다. 4시간 후 조심스럽게 용액을 1L의 얼음에 부어 반응을 급정지시켰다. 생성 혼합물을 Et2O(4x125 ml)로 추출하고 합한 유기층을 물, 포화 수성 NaHCO3, 물 및 포화 수성 NaCl로 추출한 후 MgSO4로 건조시켰다. 감압하에 용액을 농축한 후 증류시켜 투명 오일로서 65 내지 67℃/1.1 mmHg인 생성물 51.0 g(90%)를 생성하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.32 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.16-7.05 (3H, m), 2.77 (2H, t, J = 6.3 Hz), 1.80 (2H, m), 1.66 (2H, m), 1.28 (6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 A)
빙초산 350 ml와 무수 초산 170 ml의 용액을 0℃로 냉각시키고 CrO325.0 g(0.25 ml)를 조심스럽게 조금씩 나누어 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30분간 교반시킨 후 120 ml의 벤젠을 첨가하였다. 1,2,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸나프탈렌을 30 ml의 벤젠중의 용액으로서 서서히 첨가하였다. 첨가가 종료되었을 때 반응액을 0℃에서 4시간 교반시켰다. 용액을 H2O(200 ml)로 희석시키고 Et2O(5x50 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 물, 포화 수성 NaCO3및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 MgSO4로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 잔사를 증류시켜 담황색 오일로서 비점 93 내지 96℃/0.3 mmHg 인 생성물을 16.0 g(74%)를 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.02 (1H, dd, J = 1.3, 7.8 Hz), 7.53 (1H, m), 7.42 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.29 (1H, m), 2.74 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.02 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.40 (6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논 (화합물 B)
환류 콘덴서, 건조관 및 첨가깔데기가 부착된 100 ml 삼목 플라스크에 AlCl39.5g (71.4 밀리몰)과 CH2Cl2의 혼합물을 충진시켰다. 이 혼합물에 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논 (5.0g, 28.7 밀리몰)을 실온에서 교반하에 적가하였다 (주의: 발열반응). 이어서, 아주 천천히 브롬 5.5g(34.5 밀리몰)을 첨가하고 생성 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. (주지: 교반이 정지되면, 혼합물은 교반이 재개될 때까지 70℃로 가온될 수 있다). 그런 다음 빙냉 6M HCl을 서서히 첨가하여 반응을 급정지시켰다. 혼합물을 Et2O로 추출하고 합한 유기층을 물, 포화 수성 NaHCO3및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 MgSO4로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 잔사를 증류시켜 담황색 오일로서 비점 140℃/0.4 mmHg 인 생성물을 5.8 g(74%)를 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.11 (1H, d, J = 3.0 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 3.0, 9.0 Hz), 7.31 (1H, d, J = 9.0 Hz), 2.72 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.01 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.28 (6H, s).
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈레논 (화합물 C)
THF 25 ml 중의 마그네슘 (648.0 mg, 27.0 밀리몰)의 혼합물에 THF 10 ml 중의 브로모톨루엔 (5.40 g, 31.8 밀리몰)의 용액을 2회로 나누어 첨가하였다. 2 ml의 용액을 첨가하여 반응을 개시한 후 남은 용액을 첨가깔데기를 경유하여 서서히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반한 다음 용액을 캐뉼라를 사용하여 두 번째 플라스크로 옮겼다. 생성된 그리냐드 시약에 THF 15 ml중의 용액으로서 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논(화합물 C) 4.0 g(15.9 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 밤새 환류로 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 빙냉 10% HCl을 조심스럽게 첨가하여 반응을 급정지시켰다. Et2O로 추출한 후 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 MgSO4로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 컬럼 크로마토그래피하여(헥산/EtOAc, 96:4) 무색고체로서 생성물을 수득하였다. 1H NMR (CDC13):δ7.36 (1H, dd, J = 2.1 7.6 Hz), 7.26 (3H, m), 7.12 (3H, s), 2.34 (3H, s), 2.24-2.04 (2H, m), 1.81 (1H, m), 1.55 (1H, m), 1.35 (3H, s), 1.30 (3H, s).
3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌(화합물 D)
딘-스탁 트랩이 부착된 플라스크에 1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈레논 (화합물 C) 3.4 g(9.85 밀리몰)과 벤젠 40 ml를 충진시켰다. 촉매량의 p-톨루엔설폰산 일수화물을 첨가하고 생성 용액을 2시간 환류로 가열하였다. 실온으로 냉각시켰을 때 Et2O를 첨가하고 용액을 물, 포화 수성 NaHCO3및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 MgSO4로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 컬럼 크로마토그래피하여(100% 헥산/실리카 겔) 무색고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.32 (1H, dd, J = 2.1, 8.2 Hz), 7.21 (5H, m), 7.15 (1H, d, J = 2.1 Hz), 5.98 (1H, t. J = 4.7 Hz), 2.40 (3H, s), 2.32 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.30 (6H, s).
7-에티닐-3,4-디하이드로-4,4-디메틸나프탈렌-1(2H)-온 (화합물 E)
트리에틸아민 150 ml 중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논 (화합물 B) 7 g(27.6 밀리몰)의 용액(아르곤 스트림으로 15분간 섬광됨)에 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 0.97 g(1.3 밀리몰)과 요오드화제일구리 0.26 g(1.3 밀리몰)을 첨가하였다. 용액 혼합물을 아르곤으로 5분간 섬광시킨 다음 (트리메틸실릴)아세틸렌 39 ml(36.6 밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 압력튜브에 밀봉하고 예열된 오일욕(100℃)에 24시간 넣어 두었다. 이어서, 반응혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 에탄올로 세척한 다음 여액을 진공농축시켜 조 7-(트리메틸실릴)에티닐-3,4-디하이드로-4,4-디메틸나프탈렌-1(2H)-온을 수득하였다. 메탄올 50 ml 중의 이 조 TMS-아세틸렌 화합물의 용액에 K2CO30.6 g(4.3 밀리몰)을 첨가하였다. 혼합물을 주변온도에서 8시간 교반하고 여과하였다. 여액을 진공농축하고 에탄올로 희석한 후 물, 10% HCl 및 염수로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시키고 진공농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 10% EtOAc-헥산)하여 정제하여 백색고체로서 표제화합물을 수득하였다. PMR (CDCl3):δ1.39 (6H, s), 2.02 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.73 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.08 (1H, s), 7.39 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 1.8, 8.2 Hz), 8.14 (1H, d, J = 9 1.8 Hz).
에틸-4-요오도벤조에이트
100 ml 무수 에탄올중의 4-요오도벤조산 10 g(40.32 밀리몰)의 현탁액에 2 ml 티오닐 클로라이드를 첨가하고 혼합물을 환류로 3시간 가열하였다. 에테르 용액을 포화 NaHCO3및 NaCl 포화용액으로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 잔사를 쿠겔뢰르 증류시켜 (100℃, 0.55 mm) 무색 오일로서 표제화합물을 수득하였다. PMR (CDCl3):δ1.42 (3H, t, J ~ 7 Hz), 4,4 (2H, q, J ~ 7 Hz), 7.8 (4H).
6-요오도니코틴산
요오드화나트륨(20.59 g, 137.40 밀리몰)을 -78℃로 아르곤하에서 냉각시킨 다음 요오드산(97.13 g, 759.34 밀리몰)을 첨가하였다. 냉각욕을 제거하고 현탁액을 5분간 교반시켰다. 이 혼합물에 6-클로로니코틴산(22.09 g, 140.20 밀리몰)을 첨가하고 생성 혼합물을 교반하면서 서서히 주변온도로 가온하였다. 혼합물을 125℃로 24시간동안 환류가열하고 주변온도로 냉각한 후 0℃에서 아세톤 (500 ml)에 부었다. 황색 고체를 여과하여 수거하고 200 ml의 1N 수성 NaHSO3액으로 세척하였다. 메탄올로부터 재결정(결정을 에틸 에테르로 세척하였다)하여 융점 177-179℃인 표제화합물을 백색결정으로서 수득하였다[융점 187-192, Newkome et al. "Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives" J. Org. Chem. 51: 953-954 (1986)] 1H NMR (DMSO-d6):δ8.81 (1H, dd, J = 0.8, 2.4 Hz), 8.01 (1H, dd, J = 0.8, 8.2 Hz), 7.91 (1H, dd, J = 2.4, 8.2 Hz).
에틸 6-요오도니코티노에이트
디클로로메탄(100 ml)중의 6-요오도니코틴산(23.38 g, 94.20 밀리몰)의 현탁액에 디클로로메탄 (250 ml)중의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(19.86 g, 103.6 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물에 에탄올(12.40 g, 269.27 밀리몰)과 디메틸아미노피리딘(1.15 g, 9.41 밀리몰)을 차례로 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 24.5시간동안 가열하고 진공농축한 다음 물(200 ml)로 희석하고 에틸 에테르(550 ml)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨 다음 황색 고체로 농축시켰다. 섬광 크로마토그래피(실리카, 10% EtOAc-헥산)하여 정제하여 유점이 48 내지 49℃인 백색 침상으로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.94 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.91 (1H, dd, J = 2.1, 8.2 Hz), 7.85 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.41 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz).
에틸 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 F)
트리에틸아민 100 ml중의 6 g(21.7 밀리몰)의 아르곤 스트림으로 15분간 섬광시킨 7-에티닐-3,4-디하이드로-4,4-디메틸나프탈렌-1(2H)-온 (화합물 E) 4 g(21.7 밀리몰)과 에틸 4-요오도벤조에이트 6 g(21.7 밀리몰)의 용액에 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 5 g(7.2 밀리몰)과 요오드화제일구리 1.4 g(7.2 밀리몰)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤으로 5분간 섬광시키고 주변온도에서 18시간 교반하였다. 반응혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 진공 농축시켰다. 섬광 크로마토그래피(실리카, 10% EtOAc-헥산)하여 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. PMR (CDCl3):δ1.41 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.41 (6H, s), 2.04 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.76 (2H, t, J = 6.5 Hz), 4.40 (2H, q, J = 7.2 Hz), 7.44 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.68 (1H, dd, J = 1.8, 8.2 Hz), 8.04 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.15 (1H, d, J = 1.8 Hz).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 G)
THF 5.6 ml 중의 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 291.6 mg(1.59 밀리몰)의 냉각 용액(-78℃)에 THF 4.0 ml중의 에틸 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 F) 500.0 mg(1.44 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 35분간 교반한 다음 THF 4.0 ml중의 5-클로로(2-비스-트리플루오로메틸설포닐)이미드 601.2 mg(1.59 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. -78℃에서 1시간 교반한 후 용액을 0℃로 가온한 다음 2시간동안 교반하였다. 반응을 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 급냉시켰다. 혼합물을 EtOAc(50 ml)로 추출하고 합한 유기층을 5% 수성 NaOH, 물 및 염수로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 진공 농축시켜 황색오일을 얻었다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 7% EtOAc-헥산)하여 정제하여 표제화합물을 무색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.04 (2H, dd, J = 1.8, 8.4 Hz), 7.60 (2H, dd, J=1.8, 8.4 Hz), 7.51 (2H, m), 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.40 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.02 (1H, t, J = 5.0 Hz), 2.44 (2H, d, J = 5.0 Hz), 1.43 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.33 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)
THF 2.0 ml 중의 4-브로모톨루엔 253.6 mg(1.482 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸 리튬(헥산중의 1.7M 용액) 189.9 mg(1.74 ml, 2.96 밀리몰)을 첨가하여 4-리티오톨루엔 용액을 제조하였다. 30분간 교반한 후 THF 3.0 ml중의 염화아연 269.4 mg(1.977 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 생성 용액을 실온으로 가온하고 30분간 교반한 다음 캐뉼라를 경유하여 THF 4.0 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 472.9 mg(0.988 밀리몰)과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 50 mg(0.04 밀리몰)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 45분간 50℃로 가열하고 실온으로 냉각한 다음 포화 수성 NH4Cl로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc(40 ml)로 추출하고 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하였다. 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고 진공하에 황색오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 5% EtOAc-헥산)하여 정제하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ1.35 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.36 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.42 (3H, s), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 7.25 (5H, m), 7.35 (2H, m), 7.52 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.98 (2H, d, J=8.5 Hz).
에틸 4-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-페닐-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1a)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 페닐리튬 (사이클로헥산/에탄올중의 1.8M 용액) 58.2 mg(0.36 ml, 0.69 밀리몰), 염화아연 1161. mg(0.85 밀리몰) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 13.8 mg(0.01 밀리몰)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 203.8 mg(0.43 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. PMR (CDCl3):δ1.36 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.7 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.02 (1H, t, J = 4.7 Hz), 7.20 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.27 (1H, m), 7.39 (6H, m), 7.52 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.98 (2H, d, J = 8.2 Hz).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 2)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 284.8 mg(2.090 밀리몰), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 3-메틸페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 3-메틸브로모벤젠 274.0 mg(1.568 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 201.2 mg(1.86 ml, 3.14밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 203.8 mg(0.43 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.99 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.39-7.14 (7H, m), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.60 (3H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 3)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 199.4 mg(1.463 밀리몰), THF 4.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 2-메틸페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 2-메틸브로모벤젠 178.7 mg(1.045 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 133.9 mg(1.23 ml, 2.09밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 200.0 mg(0.418 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.97 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.49-7.19 (6H, m), 6.81 (1H, d, J = 1.6 Hz), 5.89 (1H, t, J = 4.5 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.43-2.14 (2H, dq, J = 3.7, 5.4 Hz), 2.15 (3H, s), 1.39-1.34 (9H, m).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3,5-디메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 4)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 249.0 mg(1.827 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 3,5-디메틸페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 3,5-디메틸브로모벤젠 249.0 mg(1.350 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 167.7 mg(1.54 ml, 2.62밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40-7.33 (2H, m), 7.20 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.00 (1H, s), 6.97 (2H, s), 5.97 (1H, t, J=4.8 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.36 (6H, s), 2.34 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.37 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-에틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 5)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 249.0 mg(1.827 밀리몰), THF 4.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 4-에틸페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 4-에틸브로모벤젠 244.0 mg(1.305 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 167.7 mg(1.54 ml, 2.62밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.99 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.42-7.24 (7H, m), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.71 (2H, q, J = 7.6 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-(1,1-디메틸에틸)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 6)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 142.4 mg(1.045 밀리몰) 및 4-t-부틸페닐 리튬(THF 1.0 ml중의 4-t-부틸브로모벤젠 176.0 mg(0.78 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.5M 용액) 100.6 mg(0.97 ml, 1.57밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.52 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.99 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.28-7.45 (7H, m), 6.02 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.36 (2H, d, J=4.9 Hz), 1.59 (3H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.39 (9H, s), 1.35 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-클로로페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 7)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 249.0 mg(1.827 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 4-클로로페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 4-클로로-1-브로모벤젠 252.4 mg(1.305 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 133.9 mg(1.23 ml, 2.09밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40-7.27 (6H, m), 7.12 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.00 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.40 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메톡시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 8)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 249.0 mg(1.827 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 2-메톡시페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 4-메톡시-1-브로모벤젠 244.1 mg(1.305 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 167.7 mg(1.54 ml, 2.62 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.40-7.21 (5H, m), 6.95 (2H, d, J = 8.7 Hz), 5.97 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 4.34 (3H, s), 2.34 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-트리플루오로메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 9)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 249.0 mg(1.827 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 4-트리플루오로메틸페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 4-트리플루오로메틸브로모벤젠 296.6 mg(1.305 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 167.7 mg(1.54 ml, 2.62 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.67 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.54-7.36 (6H, m), 7.10 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.06 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 10)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 142.4 mg(1.045 밀리몰) 및 2-티오피리딘(THF 1.0 ml중의 2-브로모피리딘 123.8 mg(0.784 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.5M 용액) 100.6 mg(0.97 ml, 1.57 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.52 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (d6-아세톤):δ8.64 (1H, m), 7.99 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.85 (1H, ddd, J = 1.8, 7.7, 9.5 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.50 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.47 (2H, d, J = 1.1 Hz), 7.35 (2H, m), 6.32 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 1.35 (3H, t, J = 7.0 hz), 1.35 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 11)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 142.4 mg(1.045 밀리몰) 및 2-리티오피리딘(THF 1.0 ml중의 3-브로모피리딘 123.8 mg(0.784 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.5M 용액) 100.2 mg(0.92 ml, 1.56 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 170.0 mg(0.35 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ8.63-8.61 (2H, dd, J = 1.7 Hz), 7.99 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.67 (1H, dt, J = 7.9 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43-7.34 (3H, m), 7.10 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.07 (1H, t. J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.40 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.390 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.36 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸-5-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 12)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 142.4 mg(1.045 밀리몰) 및 2-메틸-5-리티오피리딘(THF 1.0 ml중의 2-메틸-5-브로모피리딘 134.8 mg(0.784 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.5M 용액) 100.5 mg(0.92 ml, 1.57 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ8.50 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.99 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.56 (1H, dd, J = 2.3, 8.0 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 2.3, 8.0 Hz), 7.37 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.21 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.11 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.63 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-((2,2-디메틸에틸)-디메틸실옥시)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 H)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 150.0 mg(1.10 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 3-((2,2-디메틸에틸)디메틸실옥시)페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 3-((2,2-디메틸에틸)디메틸실옥시)브로모벤젠 226.0 mg(0.787 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 100.2 mg(0.92 ml, 1.564 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 150.0 mg(0.314 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40-7.22 (4H, m), 6.95 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.84-6.82 (2H, m), 6.00 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (3H, s), 0.99 (9H, s), 0.23 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-((2,2-디메틸에틸)-디메틸실옥시)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 I)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 209.0 mg(1.53 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.02 밀리몰) 및 4-((2,2-디메틸에틸)디메틸실옥시)페닐 리튬(THF 2.0 ml중의 4-((2,2-디메틸에틸)디메틸실옥시)브로모벤젠 315.0 mg(1.09 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 140.3 mg(1.30 ml, 2.19 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 210.0 mg(0.439 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.39-7.25 (3H, m), 7.21 (2H, d, J = 8.5 Hz), 5.87 (2H, d, J = 8.5 Hz), 5.96 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.33 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.33 (6H, s), 1.01 (9H, s), 0.25 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-하이드록시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 13)
실온에서 THF 1.0 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-((2,2-디메틸에틸)-디메틸실옥시)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 H) 60.0 mg(0.114 밀리몰)의 용액에 테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF중의 1M 용액) 91.5 mg(0.35 ml, 0.35 밀리몰)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후 용액을 EtOAc로 희석하고 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거한 후 컬럼 크로마토그래피(4:1, 헥산: EtOAc)하여 무색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.39-7.21 (4H, m), 6.93 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.84 (1H, d, 7.1 Hz), 6.83 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.91 (1H, s), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-하이드록시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 14)
실온에서 THF 1.0 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-((2,2-디메틸에틸)-디메틸실옥시)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 I) 50.0 mg(0.095 밀리몰)의 용액에 테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF중의 1M 용액) 73.2 mg(0.29 ml, 0.29 밀리몰)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후 용액을 EtOAc로 희석하고 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거한 후 컬럼 크로마토그래피(4:1, 헥산: EtOAc)하여 무색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.98 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.41-7.20 (5H, m), 6.88 (2H, d, J = 8.4 Hz), 5.96 (1H, t, J = 4.5 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.34 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 15)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 150.0 mg(1.10 밀리몰), THF 4.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 14 mg(0.012 밀리몰) 및 5-메틸티아졸-2-일 리튬(THF 5.0 ml중의 5-메틸티아졸 82.0 mg(0.83 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(헥산중의 1.55M 용액) 53.2 mg(0.53 ml, 0.83 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 264.0 mg(0.522 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ7.99 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.88 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.55 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.54 (1H, s), 7.45 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz), 7.35 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.48 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.51 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.40 (3H, s), 1.32 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸릴)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 15a)
THF 1.0 ml중의 티아졸 53.4 mg(0.63 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 n-부틸-리튬(헥산중의 1.5M 용액) 41.2 mg(0.42 ml, 0.63 밀리몰)을 첨가하여 2-리티오티아졸의 용액을 제조하였다. 용액을 30분간 교반하고 THF 1.5 ml중의 염화아연 113.9 mg(0.84 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 생성 용액을 실온으로 가온하고 30분간 교반한 다음 유기아연을 캐뉼라를 경유하여 THF 1.5 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 200.0 mg(0.42 밀리몰)과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 12.4 mg(0.01 밀리몰)의 용액에 첨가하였다. 생성 용액을 50℃로 45분간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 포화 수성 NH4Cl로 희석시켰다. 혼합물을 EtOAc(40 ml)로 추출하고 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하였다 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고 진공 건조시켜 황색 오일을 얻었다. 컬럼 크로마토그래피(실리카, 20% EtOAc-헥산)하여 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물을 수득하였다. PMR (CDCl3):δ1.35 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.8 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.57 (1H, t, J = 4.8 Hz), 7.33 (1H, d, J = 3.3 Hz), 7.36 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.46 (1H, dd, J = 1.7, 8.1 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.87 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.92 (1H, d, J = 3.3 Hz), 8.00 (2H, d, J = 8.4 Hz).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 16)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 168.0 mg(1.23 밀리몰), THF 6.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 16 mg(0.014 밀리몰) 및 4-메틸티아졸-2-일 리튬(THF 6.0 ml중의 4-메틸티아졸 92.0 mg(0.93 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 n-부틸리튬(헥산중의 1.55M 용액) 59.6 mg(0.60 ml, 0.93 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 295.0 mg(0.617 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ8.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.80 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.45 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.87 (1H, s), 6.52 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.54 (3H, s), 2.39 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.33 (3H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 17)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 110.0 mg(0.84 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 12 mg(0.011 밀리몰) 및 4,5-디메틸티아졸-2-일 리튬(THF 2.0 ml중의 4,5-디메틸티아졸 71.0 mg(0.63 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 n-부틸리튬(헥산중의 1.55M 용액) 40.2 mg(0.39 ml, 0.63 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 200.0 mg(0.418 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ8.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.82 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.33 91H, d, J = 8.0 Hz), 6.45 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.41 (3H, s), 2.40 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.9 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.32 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸-5-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 18)
THF/물(3:1, v/v) 3 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸-5-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 12) 81.7 mg (0.194 밀리몰)과 LiOH-물 40.7 mg (0.969 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄을 첨가하여 반응을 급정지시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 다음 진공 농축시켜 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ8.41 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.63 (1H, dd, J = 2.3, 7.9 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.49 (2H, m), 7.33 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.95 (1H, s), 6.11 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.52 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.31 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 19)
THF/물(3:1, v/v) 3 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 10) 80.0 mg (0.196 밀리몰)과 LiOH-물 20.6 mg (0.491 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄을 첨가하여 반응을 급정지시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 다음 진공 농축시켜 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ8.64 (1H, m), 7.94 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.87 (1H, dt, J = 1.7, 7.8 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.50 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.47 (2H, s), 7.37 (1H, m), 7.25 (1H, s), 6.30 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.39 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.31 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 20)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 2) 30.0 mg(0.071 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 28.0 mg (0.70 밀리몰, 0.7 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.46 (2H, s), 7.32-7.13 (4H, m), 7.10 (1H, s), 6.98 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.34 (3H, s), 2.31 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.30 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-에틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 21)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-에틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 5) 47.0 mg(0.108 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 28.0 mg (0.70 밀리몰, 0.7 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.46 (2H, s), 7.29-7.21 (4H, m), 7.02 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.64 (2H, q, J = 7.5 Hz), 2.33 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.29 (6H, s), 1.22 (3H, t, J = 7.5 Hz).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메톡시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 22)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메톡시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 8) 80.0 mg (0.183 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 40.0 mg (1.00 밀리몰, 1.0 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.45 (2H, s), 7.24 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.02-6.89 (3H, m), 5.98 (1H, t, J = 4.4 Hz), 3.79 (3H, s), 2.31 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.29 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-트리플루오로메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 23)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-트리플루오로메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 9) 70.0 mg(0.148 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 60.0 mg (1.50 밀리몰, 1.50 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.80 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.61-7.47 (6H, m), 6.97 (2H, s), 6.16 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.30 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3,5-디메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 24)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-8-(3,5-디메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 4) 90.0 mg(0.207 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 48.0 mg (1.20 밀리몰, 1.20 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.45 (2H, s), 7.00 (1H, s), 6.97 (1H, s), 5.97 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.31 (2H, d, J = 4.5 Hz), 2.30 (6H, s), 1.29 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-클로로페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 25)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-클로로페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 7)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 48.0 mg (1.20 밀리몰, 1.20 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.51-7.48 (4H, m), 7.34 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.97 (1H, s), 6.07 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.34 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.29 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 26)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-피리딜)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 11) 45.0 mg(0.110 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 48.0 mg (1.20 밀리몰, 1.20 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ8.60 (1H, d, J = 4.6 Hz), 8.55 (1H, s), 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.76 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.51-7.46 (3H, m), 6.94 (1H, s), 6.14 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.31 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 27)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 3) 80.0 mg(0.190 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 60.0 mg (1.50 밀리몰, 1.50 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO):δ7.89 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.46 (2H, s), 7.29-7.14 (4H, m), 6.59 (1H, s), 5.90 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.39 (2H, m), 2.60 (3H, s), 1.39 (3H, s), 1.29 (3H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-하이드록시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 28)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(3-((2,2-디메틸페닐)-디메틸실옥시)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 H)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 40.0 mg (1.00 밀리몰, 1.00 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.49 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.35 (2H, s), 7.15-7.07 (2H, m), 6.77-6.69 (3H, m), 5.92(1H, t, J = 4.7 Hz), 2.25 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.23 (6H, s)
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-하이드록시페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 29)
EtOH 3 ml와 THF 2 ml중의 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-((2,2-디메틸에틸)-디메틸실옥시)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 I)의 용액에 NaOH (1.0 M 수용액) 60.0 mg (1.50 밀리몰, 1.50 ml)를 첨가하였다. 용액을 50℃로 2 시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 용매를 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ8.01 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.45 (2H, s), 7.20-7.17 (3H, m), 6.92-6.89 (2H, m), 5.97 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.34 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 30)
실온에서 EtOH 4 ml와 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 15)(100 mg, 0.23 밀리몰)의 용액에 수성 NaOH(1 ml, 1M, 1 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 50℃로 1시간 가온하고 진공 농축하였다. 잔사를 CH2Cl2와 에테르(5:1)의 용액중에 현탁시키고 1M 수성 HCl로 pH 5로 산성화하였다. 층을 분리하고 유기층을 염수로 세척한 다음 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압하에 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ7.96 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.95 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.65 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.64 (1H, s), 7.53 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.46 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.59 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.50 (3H, s), 2.39 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.27 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 30a)
THF/물(3:1, v/v) 3 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸릴)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 15a) 33.9 mg (0.08 밀리몰)과 LiOH-물 8.5 mg (0.20 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄을 첨가하여 반응을 급정지시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 다음 진공 농축시켜 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. PMR (d6-DMSO):δ1.29 (6H, s), 2.42 (2H, d, J = 4.6 Hz), 6.68 (1H, t, J = 4.6 Hz), 7.51 (2H, m), 7.62 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.77 (1H, d, J = 3.3 Hz), 7.93 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.98 (1H, d, J = 3.3 Hz).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 31)
실온에서 EtOH 4 ml와 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 16) (145 mg, 0.34 밀리몰)의 용액에 수성 NaOH(1 ml, 1M, 1 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 50℃로 1시간 가온하고 진공 농축하였다. 잔사를 CH2Cl2와 에테르(5:1)의 용액중에 현탁시키고 1M 수성 HCl로 pH 5로 산성화하였다. 층을 분리하고 유기층을 염수로 세척한 다음 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압하에 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ 7.94 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.87 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.63 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.50 (1H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.27 (1H, s), 6.58 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.43 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.26 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 32)
실온에서 EtOH 4 ml와 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 17) (58 mg, 0.13 밀리몰)의 용액에 수성 NaOH(1 ml, 1M, 1 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 50℃로 1시간 가온하고 진공 농축하였다. 잔사를 CH2Cl2와 에테르(5:1)의 용액중에 현탁시키고 1M 수성 HCl로 pH 5로 산성화하였다. 층을 분리하고 유기층을 염수로 세척한 다음 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압하에 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ7.94 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.86 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.50 (1H, dd, J = 1.6, 8.0 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.51 (1H, t, J = 4.9 Hz), 2.37 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 4.6 Hz), 2.32 (3H, s), 1.26 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸-2-티에닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 33)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 202.0 mg(1,48 밀리몰), THF 2.0 ml중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24 mg(0.022 밀리몰) 및 5-메틸-2-리티오펜(THF 2.0 ml중의 2-메틸티오펜 89.8 mg(0.195 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(펜탄중의 2.5 M 용액) 58.6 mg(0.36 ml, 0.915 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 170.0 mg(0.366 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. 1H NMR (CDCl3):δ8.00 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.87 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.74 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.15 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.52 (3H, s), 2.32 (2H, d, J = 4.8 Hz). 1.40 (3H, t, 7.1 Hz), 1.32 (6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티에닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 33a)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 186.8 mg(1.37 밀리몰), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 37.1 mg(0.03 밀리몰) 및 2-리티오펜(THF 1.0 ml중의 티오펜 86.5 mg(1.03 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 n-부틸리튬(헥산중의 1.5 M 용액) 65.9 mg(0.69 ml, 1.03 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.52 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. PMR (CDCl3):δ1.33 (6H, s), 1.36 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz) 4.34 (2H, q, J = 7.2 Hz), 6.25 (1H, t, J = 4.7 Hz), 7.13 (2H, m), 7.47 (4H, m), 7.62 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.00 (2H, d, J = 8.5 Hz).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸-2-티에닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 34)
실온에서 EtOH 2 ml와 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸-2-티에닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 33) (35.0 mg, 0.082 밀리몰)의 용액에 수성 NaOH(1 ml, 1M, 1 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 실온에서 밤새 교반시키고 10% HCl로 산성화하였다. EtOAc로 추출한 후 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하여 무색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ8.03 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.63 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.54-7.48 (3H, m), 6.89 (1H, m), 6.18 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.49 (3H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz) 1.32 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티에닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 34a)
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸릴)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 34a)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 물중의 LiOH 17.8 mg(0.42 밀리몰)을 사용하여 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티에닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 33a) 70.0 mg(0.17 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. PMR (d6-DMSO):δ1.27 (6H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.9 Hz), 6.23 (1H, t, J = 4.9 Hz), 7.14 (2H, m), 7.38-7.56 (4H, m), 7.61 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.92 (2H, d, J = 8.3 Hz).
5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카복실산 (화합물 K)
THF 2.0 ml중의 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌(화합물 D)(250.0 mg, 0.764 밀리몰)의 용액을 -78℃로 냉각시키고 t-부틸리튬 (1.68 밀리몰, 펜탄중의 1.7 M 용액) 1.0 ml를 서서히 첨가하였다. -78℃에서 1시간 교반시킨 후 CO2가스 (드라이 아이스를 증발시켜 발생시키고 건조관을 통과시킨다)를 1시간동안 반응액에 버블링시켰다. 이어서, 용액을 실온으로 가온하고 10% HCl을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. EtOAc로 추출한 다음 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 고체를 헥산으로 세척하여 표제화합물을 무색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.94 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.76 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.24 (4H, m), 6.01 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.40 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.35 (6H, s).
에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 35)
DMF 6.0 ml중의 5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카복실산 (화합물 K) 170.0 mg(0.58 밀리몰), 에틸 4-아미노벤조에이트 115.0 mg (0.70 밀리몰), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이드 하이드로클로라이드 145.0 mg(0.76 밀리몰) 및 4-디메틸아미노피리딘 92.4 mg(0.76 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 생성 용액을 물, 포화 수성 NaHCO3, 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 컬럼 크로마토그래피(10 내지 15% EtOAc/헥산)하여 생성물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.02 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.72 (2H, m), 7.65 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.52 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.25 (4H, m), 6.15 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.40 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.9 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.37 (6H, s).
에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산 (화합물 36)
EtOH 3.0 ml와 THF 4.0 ml중의 에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 35) 26.5 mg(0.06 밀리몰)의 용액에 NaOH 240.1 mg (6.00 밀리몰, 2 M 수용액중의 3.0 ml)를 첨가하였다. 실온에서 72시간 교반한 후 10% HCl을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. EtOAc로 추출하고 황산마그네슘으로 유기층을 건조시킨 다음 용매를 감압하에 제거하여 고체를 수득하였다. CH3CN으로 재결정하여 무색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ10.4 (1H, s), 7.91-7.81 (5H, m), 7.54 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.45 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.23 (4H, s), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.35 (5H, s), 1.33 (6H, s).
에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]옥시]-벤조에이트 (화합물 37)
DMF 2.0 ml중의 5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카복실산 (화합물 K) 17.5 mg (0.103 밀리몰), 에틸 4-하이드록시벤조에이트 17.5 mg(0.103 밀리몰), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이드 하이드로클로라이드 21.4 mg(0.112 밀리몰) 및 4-디메틸아미노피리딘 12.6 mg(0.103 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 생성 용액을 물, 포화 수성 NaHCO3, 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 컬럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)하여 생성물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.08 (2H, d, J = 8.1 Hz), 8.05 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.89 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.22 (5H, m), 6.05 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.39 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.38 (3H, s), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.37 (6H, s).
2-트리메틸실릴에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]옥시]-벤조에이트 (화합물 38)
DMF 4.0 ml중의 5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카복실산 (화합물 K) 93.5 mg (0.320 밀리몰), 2-트리메틸실릴에틸-4-하이드록시벤조에이트 76.0 mg(0.319 밀리몰), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이드 하이드로클로라이드 80.0 mg(0.417 밀리몰) 및 4-디메틸아미노피리딘 51.0 mg(0.417 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 생성 용액을 물, 포화 수성 NaHCO3, 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 컬럼 크로마토그래피(5% EtOAc/헥산)하여 생성물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.08 (2H, d, J = 8.8 Hz), 8.05 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.50 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.26-7.18 (6H, m), 6.05 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.42 (2H, t, J = 8.4 Hz), 2.40 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.39 (3H, s), 1.38 (6H, s), 0.09 (9H, s).
4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]옥시]-벤조에이트 (화합물 39)
THF 2.0 ml중의 2-트리메틸실릴에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]옥시]-벤조에이트 (화합물 38) 110.0 mg(0.213 밀리몰) 및 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (0.640 밀리몰, THF중의 1M 용액 0.64 ml) 167.3 mg의 용액을 실온에서 22시간동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 생성 용액을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 잔여 고체를 EtOAc 및 CH3CN으로 세척하여 생성물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ8.10 (2H, d, J = 8.8 Hz), 8.06 (1H, dd, J = 2.0, 8.1 Hz), 7.82 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.64 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.35 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.25 (4H, m), 6.08 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.35 (3H, s), 1.39 (6H, s).
에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]옥시]-벤조에이트 (화합물 40)
DMF 5.0 ml중의 5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카복실산 (화합물 K) 89.0 mg (0.49 밀리몰), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이드 하이드로클로라이드 102.0 mg(0.53 밀리몰) 및 4-디메틸아미노피리딘 65.0 mg(0.53 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 생성 용액을 물, 포화 수성 NaHCO3, 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 컬럼 크로마토그래피(20% EtOAc/헥산)하여 생성물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.96 (1H, s), 7.89 (1H, t, J = 8.4 Hz), 7.70 (2H, m), 7.52 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.23 (5H, m), 6.04 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.38 (3H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.36 (6H, s).
2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산 (화합물 41)
EtOH 2.0 ml와 THF 2.0 ml중의 에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]옥시]-벤조에이트 (화합물 40) 41.6 mg(0.091 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.00 밀리몰, 1M 수용액의 1.0 ml) 40.0 mg을 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반하고 10% HCl을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. EtOAc로 추출하고 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하였다. CH3CN으로 재결정하여 담황색 고체로서 표제화합물을 분리하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ9.84 (1H, s), 7.94-7.83 (3H, m), 7.64 (1H, dd, J = 2.0 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.23 (4H, s), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.36 (3H, s), 1.35 (6H, s).
에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)티오카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 42)
벤젠 12.0 ml중의 에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 35) 110.0 mg(0.25 밀리몰)과 [2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3-디티아-2,4-디포스페탄-2,4-디설파이드](로웨슨 시약) 121.0 mg (0.30 밀리몰)의 용액을 밤새 환류시켰다. 실온으로 냉각시켰을 때 혼합물을 여과하고 여액을 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (10 내지 25% EtOAc/헥산)하여 표제화합물을 황색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.92 (1H, s), 8.06 (2H, t, J = 8.5 Hz), 7.88-7.70 (3H, m), 7.42 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.18 (4H, m), 6.03 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.38 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.56 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (6H, s).
4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)티오카르보닐]아미노]-벤조산 (화합물 43)
EtOH 2.0 ml와 THF 2.0 ml중의 에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)티오카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 42) 84.0 mg(0.184 밀리몰)의 용액에 NaOH (1.50 밀리몰, 1M 수용액의 1.5 ml) 60.0 mg을 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반하고 10% HCl을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. EtOAc로 추출하고 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하였다. CH3CN으로 재결정하여 황색 고체로서 표제화합물을 분리하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ10.96 (1H, s), 8.05 (4H, m), 7.72 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 7.54 (1H, s), 7.46 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.20 (4H, m), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.33 (3H, s), 1.35 (6H, s).
2-아세틸-6-브로모나프탈렌 (화합물 L)
니트로벤젠 400 ml중의 2-브로모나프탈렌 44.0 g(0.212 몰)와 염화알루미늄 34.0 g(0.255 몰)의 찬 (10℃) 혼합물에 아세틸 클로라이드 21.0 g(267 밀리몰)을 첨가하였다. 기계적으로 교반된 혼합물을 실온으로 가온하고 18시간동안 40℃로 가열하였다. 빙욕에서 0℃로 냉각시킨 후 12M HCl(70 ml)을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. 층을 분리하고 유기상을 물과 묽은 수성 Na2CO3로 세척하였다. 쿠겔뢰르 증류한 후 10% EtOAc-헥산으로 재결정하여 갈색 고체로서 표제화합물 23 g을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.44 (1H, br s), 8.04-8.10 (2H, m), 7.85 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.82 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.64 (1H, d, J = 8.8 Hz), 2.73 (3H, s).
6-브로모-2-나프탈렌카르복실산 (화합물 M)
물 50 ml중의 차아염소산 나트륨 (62 ml, 수중 5.25%(w/w), 3.6 g, 48.18 밀리몰)과 수산화나트륨 (6.4 g, 160.6 밀리몰)의 용액에 1,4-디옥산 50 ml중의 2-아세틸-6-브로모나프탈렌 (화합물 L) 4 g(16.06 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 황색 용액을 오일욕에서 2시간 70℃로 가열하고 주변온도로 냉각시킨 다음 에틸 에테르(2x50 ml)로 추출하였다. 수성 층을 NaHSO3용액으로 희석시키고(KI 지시용액이 무색으로 될 때까지) 그런 다음 1N 황산으로 산성화(pH<2)하여 백색 침전물을 생성하였다. 혼합물을 에틸 에테르로 추출하고 합한 유기상을 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시키고 농축하여 고체로서 표제화합물 3.54 g(88%)을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6):δ8.63 (1H, br s), 8.32 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.10 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.00-8.05 (2H, m), 7.74 (1H, dd, J = 2.0, 8.8 Hz).
에틸 6-브로모-2-나프탈렌카르복실레이트 (화합물 N)
에탄올 (30 ml, 23.55 g, 511.0 밀리몰)중의 6-브로모-2-나프탈렌카르복실산 (화합물 M) 3.1 g(12.43 밀리몰)의 용액에 18M 황산(2 ml)를 첨가하였다. 용액을 30분간 환류시키고 실온으로 냉각시킨 다음 반응혼합물을 펜탄(100 ml)과 물(100 ml)사이에 분획하였다. 수성 상을 펜탄(100 ml)으로 추출하고 합한 유기층을 포화 수성 NaCl(100 ml)로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨 다음 농축시켜 회색 고체를 생성하였다. 섬광 크로마토그래피 (실리카, 10% EtOAc-헥산)하여 정제하여 백색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.58 (1H, br s), 8.10 (1H, dd, J = 1.7, 9 Hz), 8.06 (1H, d, J = 2 Hz), 7.83 (1H, d, J = 9 Hz), 7.80 (1H, d, J = 9 Hz), 7.62 (1H, dd, J = 2, 9 Hz).
에틸 (E)-4-[2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈레닐)에테닐]-벤조에이트 (화합물 O)
트리에틸아민 4.0 ml중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논 (화합물 B) 520.0 mg (2.00 밀리몰)와 에틸 4-비닐벤조에이트 510.0 mg(2.90 밀리몰)의 용액에 트리스(2-메틸페닐)포스핀 124.0 mg(0.40 밀리몰)을 첨가한 후 이어서 팔라듐(II)아세테이트 44.0 mg(0.20 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 2.5시간동안 95℃로 가열하고 실온으로 냉각한 후 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)하여 정제하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3);δ8.19 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.03 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.69 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.20 (2H, s), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.76 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.04 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz, 및 6H, s).
에틸 (E)-4-[2-(5,6,-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에테닐]-벤조에이트 (화합물 P)
THF 10.0 ml중의 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 440.0 mg(2.40 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 THF 25.0 ml중의 용액으로서 에틸 (E)-4-[2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈레닐)에테닐]-벤조에이트 (화합물 O) 700.0 mg(2.00 밀리몰)을 첨가하였다. -78℃에서 1.5 시간동안 교반시킨 후 960.0 mg(2.40 밀리몰)의 2[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘을 한 번에 첨가하였다. 30분 후에 용액을 0℃로 가온하고 3시간동안 교반하였다. 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 급정지시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 추출물을 5% 수성 NaOH로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 다음 용매를 감압하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(7% EtOAc/헥산)하여 표제화합물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.04 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.52 (1H, s), 7.49 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.20 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.10 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.00 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.43 (2H, d, J = 4.9 Hz), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.32 (6H, s).
에틸 (E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에테닐]벤조에이트 (화합물 44)
THF 2.5 ml 중의 4-브로모톨루엔 374.5 mg(2.20 밀리몰)의 용액에 t-부틸 리튬(2.04 밀리몰, 펜탄중의 1.7M 1.20 ml) 130.7 mg을 첨가하여 4-리티오톨루엔 용액을 -78℃에서 제조하였다. 30분 후 THF 2.0 ml중의 염화아연 313.4 mg(2.30 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 생성 용액을 실온으로 가온하고 1.25 시간동안 교반한 다음 캐뉼라를 경유하여 THF 2.0 ml중의 에틸 (E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에테닐]벤조에이트(화합물 P) 285.0 mg(0.590 밀리몰)과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 29.0 mg(0.025 밀리몰)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간동안 실온에서 교반한 다음 50℃에서 2시간동안 교반하였다. 실온으로 냉각한 다음 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 합한 추출물을 5% 수성 NaOH, 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(10% EtOAc-헥산)하여 정제하여 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.96 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.47 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.43-7.16 (7H, m), 7.07 (1H, d, J = 16.3 Hz), 6.93 (1H, d, J = 16.3 Hz), 5.97 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.0 Hz), 2.41 (3H, s), 2.33 (1H, d, J = 4.7 Hz), 1.38 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.33 (6H, s).
(E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에테닐]벤조산 (화합물 45)
THF 4.0 ml중의 에틸 (E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에테닐]벤조에이트 (화합물 44) 65.0 mg(0.190 밀리몰)의 용액에 LiOH (0.909 밀리몰, 1.1M 용액 1.0 ml) 30.0 mg과 MeOH 1.0 ml를 첨가하였다. 용액을 3시간동안 55℃로 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 감압하에 농축시켰다. 잔사를 물에 용해시키고 헥산으로 추출하였다. 수성 층을 10% HCl로 pH 1로 산성화하고 Et2O로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 수성 NaCl로 세척하고 EtOAc로 희석하여 등명한 용액을 생성한 후 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 무색 고체로서 표제화합물을 생성하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ7.86 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.58 (1H, dd, J = 1.7, 8.1 Hz), 7.41 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.28 (1H, d, J = 16.5 Hz), 7.23 (4H, s), 7.08 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.07 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.97 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.35 (3H, s), 2.31 (1H, d, J = 4.6 Hz), 1.29 (6H, s).
에틸 4-[2-(1,1-디메틸-3-(4-메틸페닐)-5-인데닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 47)
THF 1.0 ml중의 4-브로모톨루엔 32.0 mg(0.187 밀리몰)의 용액을 -78℃로 냉각시키고 24.0 mg의 t-부틸리튬 (0.375 밀리몰, 펜탄중의 1.7M 용액 0.22 ml)를 서서히 첨가하였다. 황색 용액을 30분간 교반시키고 이때 염화아연 29.8 mg(0.219 밀리몰)을 1.0 ml THF중의 용액으로서 첨가하였다. 생성 용액을 실온으로 가온하고 30분 후 1.0 ml THF중에 에틸 4-[2-(1,1-디메틸-3-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-5-인데닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 FF) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 2.9 mg(0.003 밀리몰)이 함유된 두 번째 플라스크에 첨가하였다. 생성 용액을 1시간동안 50℃로 가온하고 실온에서 4시간동안 교반하였다. 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 급정지시키고 Et2O로 추출하였다. 합한 유기층을 물, 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(10% Et2O/헥산)하여 무색 고체로서 표제화합물을 분리하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ8.03 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.66 (1H, s), 7.58 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.46 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.38 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.28 (2H, d, J = 9 Hz), 6.43 (1H, s), 4.40 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.43 (3H, s), 1.41 (3H, t; + 6H, s).
4-[2-(1,1-디메틸-3-(4-메틸페닐)-5-인데닐)에티닐]벤조산 (화합물 48)
THF/물 (3:1 v/v) 0.5 ml중의 에틸 4-[2-(1,1-디메틸-3-(4-메틸페닐)-5-인데닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 47) 10.0 mg(0.025 밀리몰)의 용액에 LiOH 물 5.2 mg(0.12 밀리몰)을 첨가하였다. 실온에서 48시간동안 교반한 후 용액을 헥산으로 추출하고 수성 층을 포화 수성 염화암모늄으로 산성화하였다. 고체 NaCl을 첨가하고 생성 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축시켜 무색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d6-DMSO):δ7.95 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.65 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.57 (2H, m), 7.49 (3H, m), 7.30 (2H, d, J = 7.9 Hz), 6.61 (1H, s), 2.36 (3H, s), 1.36 (6H, s).
3-(4-브로모티오펜옥시)프로피온산
탈기된 물 20.0 ml중의 NaOH 1.44 g(35.7 밀리몰)의 용액(아르곤으로 분무됨)에 4-브로모티오페놀 6.79 g(35.7 밀리몰)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 두 번째 플라스크를 탄산칼륨 2.26 g(16.3 밀리몰)과 탈기된 물 15 ml로 충진시켰다. 이 용액에 3-브로모프로피온산 5.00 g(32.7 밀리몰)을 조금씩 나누어 첨가하였다. 생성된 카르복실산 칼륨 용액을 나트륨 티올레이트 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 실온에서 48시간동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 여액을 벤젠으로 추출한 다음 합한 유기층을 버렸다. 수성 층을 10% HCl로 산성화하고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨 다음 감압하에 농축하였다. 생성된 고체를 Et2O-헥산으로 재결정하여 회색 결정으로서 표제 화합물을 생성하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.43 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.4 Hz), 3.15 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.68 (2H, t, J = 7.3 Hz).
2,3-디하이드로-6-브로모-(4H)-1-벤조티오피란-4-온
60 ml 메탄설폰산중의 3-(4-브로모티오펜옥시)프로피온산 3.63 g (13.9 밀리몰)의 용액을 75℃로 1.5 시간동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후 용액을 물로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 2N 수성 NaOH, 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 황색 고체를 수득하고 이를 컬럼 크로마토그래피(3% EtOAc-헥산)하여 생성물을 담황색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.22 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.48 (1H, dd, J = 2.1, 8.3 Hz), 7.17 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.24 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.98 (2H, t, J = 6.7 Hz).
2,3-디하이드로-6-(2-트리메틸실릴에티닐)-(4H)-1-벤조티오피란-4-온
THF 15.0 ml와 Et2NH 6.0 ml중의 2,3-디하이드로-6-브로모-(4H)-1-벤조티오피란-4-온 1.00 g(4.11 밀리몰) 및 CuI 78.3 mg (0.41 밀리몰)의 용액을 아르곤으로 5분간 분무시켰다. 이 용액에 2.0 ml(1.39 g, 14.2 밀리몰)의 (트리메틸실릴)아세틸렌 과 288.5 mg(0.41 밀리몰)의 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드를 차례로 첨가하였다. 생성된 검은 용액을 실온에서 3일간 교반시킨 다음 셀라이트 패드를 통해 여과한 다음 EtOAc로 세척하였다. 여액을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피하여(4% EtOAc-헥산) 표제화합물을 오렌지 오일로 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.13 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.36 (1H, dd, J = 2.1, 8.2 Hz), 7.14 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.19 (2H, d, J = 6.3 Hz), 2.91 (2H, d, J = 6.3 Hz), 0.21 (9H, s).
2,3-디하이드로-6-에티닐-(4H)-1-벤조티오피란-4-온
MeOH 15 ml중에 2,3-디하이드로-6-(2-트리메틸실릴에티닐)-(4H)-1-벤조티오피란-4-온 600 mg(2.25 밀리몰)과 K2CO3100.0 mg(0.72 밀리몰)을 함유한 용액을 실온에서 20시간 교반하였다. 용액을 물로 희석하고 Et2O로 추출하였다 .합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하여 표제화합물을 오렌지 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.17 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 1.8, 8.2 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.22 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.08 (1H, s) 2.94 (2H, t, J = 6.3 Hz).
에틸 4-[2-(6-2,3-디하이드로-(4H)-1-벤조티오피란-4-온일))에티닐]벤조에이트
THF 3 ml와 Et2NH 15 ml중의 에틸 4-요오도벤조에이트 594.0 mg (2.15 밀리몰) 및 2,3-디하이드로-6-에티닐-(4H)-1-벤조티오피란-4-온 405.0 mg(2.15 밀리몰)의 용액을 아르곤으로 15분간 분무시켰다. 이 용액에 503.0 mg(0.72 밀리몰)의 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드와 CuI 137 mg(0.72 밀리몰)을 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 20시간 교반시킨 다음 셀라이트 패드를 통해 여과한 다음 EtOAc로 세척하였다. 용매를 감압하에 제거하여 갈색 고체를 얻었다. 컬럼 크로마토그래피하여(3% EtOAc-헥산) 표제화합물을 오렌지 고체로 분리하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ8.15 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.02 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.69 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 2.1, 8.3 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.40 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.96 (2H, t, J = 6.3 Hz), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
에틸 4-[2-(6-(4-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]벤조에이트
THF 3.0 ml중의 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 221.9 mg(1.21 밀리몰)의 용액에 THF 4.0 ml중의 에틸 4-[2-(6-(2,3-디하이드로-(4H)-1-벤조티오피란-4-온일)에티닐]벤조에이트 370.0 mg(1.10 밀리몰)을 첨가하였다. 30분 후 THF 4.0 ml중의 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘의 용액을 서서히 첨가하였다. 반응액을 실온으로 서서히 가온하고 5 시간후에 포화된 수성 NH4Cl을 첨가하여 급정지시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 합한 유기층을 5% 수성 NaOH, 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 컬럼 크로마토그래피하여(4% EtOAc-헥산) 표제화합물을 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ8.12 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.56 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.49 (1H, dd, J = 1.7, 8, 1 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.33 (1H, t, J = 5.7 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.82 (2H, d, J = 5.7 Hz), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
에틸 4-[2-(6-(4-(4-메틸페닐)-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]벤조에이트 (화합물 49)
-78℃에서 THF 2.0 ml중의 4-브로모톨루엔 120.8 mg(0.70 밀리몰)의 용액에 t-부틸리튬 88.4 mg (1,38 밀리몰, 펜탄중의 1.7M 용액 0.81 ml)을 첨가하였다. 30분 후 THF 2.0 ml중의 ZnCl2131.6 mg(0.97 밀리몰)의 용액을 첨가하고 생성된 담황색 용액을 실온으로 가온하였다. 40분간 교반한 후 이 용액을 에틸 4-[2-(6-(4-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-(2H)-1-벤조티오피라닐)에티닐]벤조에이트 129.2 mg (0.28 밀리몰), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) 14.0 mg(0.012 밀리몰)과 THF 2.0 ml를 함유한 제2 플라스크에 첨가하였다. 생성된 용액을 50℃로 5시간동안 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 급정지시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시킨 후 오렌지 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피하여(3 내지 5% EtOAc-헥산) 표제화합물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (d6-아세톤):δ7.98 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.44-7.38 (2H, m), 7.26-7.15 (5H, m), 6.14 (1H, t, J = 5.8 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.53 (2H, d, J = 5.8 Hz), 2.37 (2H, s), 1.35 (3H, t, J = 7.1 Hz).
4-[2-(6-(4-(4-메틸페닐)-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]-벤조산 (화합물 50)
THF 2.0 ml와 EtOH 2.0 ml중의 에틸 4-[2-(6-(4-(4-메틸페닐)-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]벤조에이트 (화합물 49) 29.0 mg(0.07 밀리몰)의 용액에 NaOH (160.0 mg, 4.00 밀리몰, 2M 수용액 2.0 ml)를 첨가하였다. 생성 용액을 35℃에서 2시간동안 교반시킨 다음 실온으로 냉각시키고 추가로 2시간동안 교반하였다. 10% 수성 HCl을 첨가하여 반응 급정지시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하여 고체를 수득한 후 이를 CH3CN으로 세척하고 고진공하에서 건조시켜 표제화합물을 담황색 고체로 생성하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ7.90 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40 (4H, m), 7.25-7.13 (4H, m), 7.02 (1H, d, J = 1.7 Hz), 6.11 (1H, t, J = 5.7 Hz), 3.54 (2H, d, J = 5.7 Hz), 2.34 (3H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 R) 및 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 S)
디클로로메탄 (55 ml)중의 염화알루미늄 (26.3 g, 199.0 밀리몰)의 찬(0℃) 혼합물에 디클로로메탄 (20 ml)중의 아세틸클로라이드 (15 g, 192 밀리몰)과 1,2,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸나프탈렌 (24.4 g, 152 밀리몰)을 20 분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 주변 온도로 가온하고 4시간 교반하였다. 얼음(200 g)을 반응 플라스크에 첨가하고 혼합물을 에테르(400 ml)로 희석하였다. 층을 분리하고 유기상을 10% HCl (50 ml), 물(50 ml), 10% 수성 중탄산나트륨 및 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증류시켜 제거하여 황색 오일을 수득하고 이를 벤젠(50 ml)중에 용해시켰다.
아세트산(240 ml)과 무수 아세트산(120 ml)의 찬(0℃) 용액에 아르곤하에 삼산화크롬(50 g, 503 밀리몰)을 20분에 거쳐 조금씩 나우어 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하고 벤젠(120 ml)으로 희석시켰다. 상기 제조된 벤젠 용액을 20에 걸쳐 첨가 깔데기를 경유하여 교반하면서 첨가하였다. 8시간 후 조심스럽게 이소프로판올(50 ml)을 0℃에서 첨가하고 이어서 물(100 ml)을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. 15분 후에 반응 혼합물을 에테르(1100 ml) 및 물(200 ml)로 희석한 다음 고체 중탄산나트륨(200 g)으로 중화시켰다. 에테르 층을 물(100 ml) 및 포화 수성 NaCl(2x100 ml)로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 크로마토그래피하여 이성체 디케톤 혼합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.10 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.02 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.82 (1H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz), 2.77 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.64 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.44 (6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐)-1(2H)-나프탈레논 (화합물 T)
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 R) (140.0 mg, 0.60 밀리몰), 에틸렌 글리콜(55.0 mg, 0.90 밀리몰), p-톨루엔설폰산 일수화물(4 mg)과 벤젠(25 ml)의 혼합물을 딘-스탁 장치를 사용하여 12시간동안 환류시켰다. 10% 수성 중탄산나트륨을 첨가하여 반응을 급정지시키고 에테르(2x75 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 물(5 ml) 및 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 표제화합물을 오일로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.13 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.64 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.97-4.10 (2H, m), 3.70-3.83 (2H, m), 2.73 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.01 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.64 (3H, s), 1.39 (6H, s).
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐)나프탈렌 (화합물 U)
THF 2 ml중의 p-톨루일마그네슘브로마이드 (1.0 ml, 에테르중의 1M 용액) 195.4 mg(1.00 밀리몰)의 용액에 THF 5 ml중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐)-1(2H)-나프탈레논 (화합물 T) 135.0 mg(0.52 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 용액을 16시간 환류시키고 실온으로 냉각시킨 다음 에테르(50 ml)로 희석시켰다. 용액을 물(5 ml) 및 포화 수성 NH4Cl(5 ml)로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 컬럼 크로마토그래피하여(5% EtOAc/헥산) 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.37 (2H, d), 7.21 (1H, s), 7.13 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz), 3.88-3.99 (2H, m), 3.58-3.75 (2H, m), 2.34 (3H, s), 2.12-2.30 (2H, m), 1.79-1.90 (1H, m), 1.57 (3H, s), 1.48-1.58 (1H, m), 1.38 (3H, s), 1.31 (3H, s).
3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-아세틸나프탈렌 (화합물 V)
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐)나프탈렌 (화합물 U) 130.0 mg(0.38 밀리몰), p-톨루엔설폰산 일수화물(4 mg)과 벤젠(25 ml)의 혼합물을 16시간동안 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후 반응 혼합물을 에테르(100 ml)로 희석하고 10% 수성 중탄산나트륨, 물 및 포화 수성 NaCl로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하여 표제화합물을 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.83 (1H, dd, J = 1.8, 8.0 Hz), 7.66 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.22 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.03 (1H, t, J = 6.3 Hz), 2.47 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 6.3 Hz), 1.36 (6H, s).
(E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2-부텐니트릴 (화합물 W)
THF (6 ml)중의 NaH (48.0 mg, 2.00 밀리몰)의 슬러리에 디에틸시아노메틸포스포네이트 (450.0 mg, 2.50 밀리몰)을 첨가하였다. 40분 후에 THF(4 ml)중의 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-아세틸나프탈렌(화합물 V) 95.0 mg (0.33 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 교반한 후 에테르(100 ml)로 희석한 다음 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 컬럼 크로마토그래피(3% EtOAc/헥산)하여 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.39 (1H, d, J = 1H), 7.32 (1H, dd, J = 2.0, 8.1 Hz), 7.20-7.25 (4H, brs), 7.15 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.03 (1H, t, J = 6.0 Hz), 5.44 (1H, s), 2.42 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 6.0 Hz), 2.35 (3H, s), 1.35 (6H, s).
(E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2-부텐알 (화합물 X)
디클로로메탄 (4 ml)중의 (E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2-부텐니트릴 (화합물 W) 84.0 mg(0.29 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 디이소부틸알루미늄하이드라이드 (디클로로메탄중의 1M 용액) 0.50 ml(0.50 밀리몰)을 첨가하였다. 1시간 교반한 후 -78℃에서 에테르(100 ml)로 희석된 2-프로판올(1 ml)을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. 실온으로 가온한 후 용액을 물, 10% HCl 및 포화 수성 NaCl로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하여 표제화합물을 오일로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ10.12 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.43 (2H, s), 7.19-7.28 (5H, m), 6.27 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.03 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.47 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.37 (6H, s).
에틸(E,E,E)-3-메틸-7-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2,4,6-옥타트리에노에이트 (화합물 51)
THF (2 ml)중의 디에틸-(E)-3-에톡시카르보닐-2-메틸알릴포스포네이트 [문헌 J. Org. Chem 39: 821 (1974)에 따라 제조됨]의 찬(-78℃) 용액에 헥산(1.6 M 용액)중의 n-부틸리튬 26.0 mg(0.41 밀리몰, 0.65 ml)를 첨가하고 즉시 THF(3 ml)중의 (E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2-부텐알 (화합물 X) 82.0 mg(0.26 밀리몰)을 첨가하였다. 1 시간 후 반응 혼합물을 에테르(60 ml)로 희석하고 물(5 ml), 포화 수성 NaCl(5 ml)로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거한 후 컬럼 크로마토그래피하여(5% EtOAc/헥산, 이어서 1% EtOAc/헥산을 사용하여 HPLC) 표제화합물을 오일로서 분리하였다. 1H NMR (아세톤-d6):δ7.36-7.43 (2H, m), 7.18-7.27 (4H, m), 7.17 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.08 (1H, dd, J = 11.2, 15.2 Hz), 6.46 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.38 (1H, d, J = 15.2 Hz), 5.98 (1H, t, J = 4.7 Hz), 5.78 (1H, s), 4.10 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (3H, s), 2.33 (3H, s), 2.32 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.12 (3H, s), 1.31 (6H, s), 1.22 (3H, t, J = 7.1 Hz).
(E,E,E)-3-메틸-7-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2,4,6-옥타트리엔산 (화합물 52)
THF(1 ml)와 메탄올(1 ml)중의 에틸(E,E,E)-3-메틸-7-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)-2,4,6-옥타트리에노에이트(화합물 51) 85.0 mg (0.20 밀리몰)의 용액에 LiOH (0.5 ml, 1M 용액) 12.0 mg(0.50 밀리몰)을 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 교반하고 에테르(60 ml)로 희석한 다음 10% HCl(1 ml)로 산성화하였다. 용액을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 고체로서 표제화합물을 수득하고 이를 아세톤으로 재결정하여 정제하였다. 1H NMR (아세톤-d6):δ7.35-7.45 (2H, m), 7.19-7.28 (4H, m), 7.17 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.09 (1H, dd, J = 11.5, 15.1 Hz), 6.48 (1H, d, J = 11.5 Hz), 6.42 (1H, d, J=15.1 Hz), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 5.82 (1H, s), 2.36 (3H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.32 (3H, s), 2.13 (3H, s), 1.32 (6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-니트로-1(2H)-나프탈레논 (화합물 Y)
-5℃(빙-NaCl 욕)의 1.7 ml(3.0 g, 30.6 밀리몰, 18M)에 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논 783 mg(4.49 밀리몰)을 서서히 첨가하였다. 질산 426.7 mg(6.88 밀리몰, 0.43 ml, 16M)과 황산 1.31 g(0.013 몰, 0.74 ml, 18 M)의 용액을 서서히 첨가하였다. 20분 후 얼음을 첨가하고 생성된 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 추출물을 감압하에 농축시켜 잔사를 생성하고 이를 컬럼 크로마토그래피하여(10% EtOAc/헥산) 담황색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.83 (1H, d, J = 2.6 Hz), 8.31 (1H, dd, J = 2.8, 8.9 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.7 Hz), 2.81 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.08 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.45 (6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아미노-1(2H)-나프탈레논 (화합물 Z)
EtOAc 5.0 ml중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-니트로-1(2H)-나프탈레논 (화합물 Y) 230.0 mg(1.05 밀리몰)의 용액을 촉매량의 10% Pd-C와 함께 수소 1기압하 실온에서 24시간동안 교반하였다. 촉매를 셀라이트 패드를 통해 여과하여 제거하고 여액을 감압하에 농축시켜 진녹색 오일로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.30 (1H, d, J = 2.7 Hz), 7.22 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 2.7, 8.5 Hz), 2.70 (2H, t, J = 6.6 Hz), 1.97 (2H, t, J = 6.6 HZ), 1.34 (6H, s).
에틸 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈레닐)아조]-벤조에이트 (화합물 AA)
빙초산 5.0 ml중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아미노-1(2H)-나프탈레논 (화합물 Z) 198.7 mg(1.05 밀리몰)의 용액에 에틸 4-니트로소벤조에이트 180.0 mg(1.00 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 용액을 밤새 실온에서 교반시킨 다음 감압하에 농축시켰다. 잔여오일을 컬럼 크로마토그래피하여(15% EtOAc-헥산) 적색 고체로서 생성물을 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.57 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.19 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.07 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.94 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.58 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.41 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.79 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.07 (2H, t, J = 7.02 Hz), 1.44 (6H, s), 1.42 (3H, t, J = 7.1 Hz).
에틸 4-[(5,6,-디하이드로-5,5-디메틸-8-트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)아조]-벤조에이트 (화합물 BB)
-78℃의 THF 2.0 ml중의 비스(트리메틸실릴)아미드 90.4 mg(0.48 밀리몰, 1.0M THF 용액 0.48 ml)의 용액에 THF 2.0 ml중의 에틸 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈레닐)아조]-벤조에이트 (화합물 AA) 153.0 mg(0.437 밀리몰)을 첨가하였다. 진한 적색 용액을 -78℃에서 30분간 교반한 다음 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘을 THF 2.0 ml중의 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 3시간 후 물을 첨가하여 급정지시켰다. 유기층을 감압하에 적색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마그래피하여(25% EtOAc/헥산) 생성물을 적색 오일로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.21 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.96 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.94 (2H, m), 7.49 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.08 (1H, t, J = 2.5 Hz), 4.42 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.49 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.44 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.38 (6H, s).
에틸 4-[(5,6,-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)아조]-벤조에이트 (화합물 46a)
THF 1.0 ml중의 4-브로모톨루엔 84.0 mg(0.491 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 t-부틸 리튬(펜탄중의 1.7M 용액) 62.9 mg(0.58 ml, 0.98 밀리몰)을 첨가하여 4-리티오톨루엔 용액을 제조하였다. 30분간 교반한 후 THF 2.0 ml중의 염화아연 107.0 mg(0.785 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 생성 용액을 실온으로 가온하고 30분간 교반한 다음 캐뉼라를 통해 THF 2.0 ml중의 에틸 4-[(5,6,-디하이드로-5,5-디메틸-8-트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)아조]-벤조에이트 (화합물 BB) 94.7 mg(0.196 밀리몰)과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 25 mg(0.02 밀리몰)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 50℃로 1.5시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 포화 수성 염화암모늄으로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc(40 ml)로 추출하고 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하였다. 유기상을 황산마그네슘으로 건조시키고 진공하에 농축한 다음 컬럼크로마토그래피하여 (25% EtOAc-헥산) 적색 고체로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.21 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.96 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.94 (2H, m), 7.49 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.08 (1H, t, J = 2.5 Hz), 4.42 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.49 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.44 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.38 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)아조]-벤조산 (화합물 46b)
THF (2 ml)와 에탄올 (1 ml)중의 에틸 4-[(5,6,-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)아조]-벤조에이트 (화합물 46a) 16.5 mg(0.042 밀리몰)의 용액에 NaOH (2.0 ml, 1M 수용액) 80.0 mg(2.00 밀리몰)을 첨가하였다. 혼합물을 12시간 실온에서 교반하고 10% HCl로 산성화한 다음 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 잔사를 EtOAc/헥산으로 재결정하여 표제화합물을 적색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (acetone-d6):δ8.19 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.92 (2H, d, J = 8.5 hz), 7.88 (2H, dd, J = 2.1, 6.1 Hz), 7.66 (1H, s), 7.64 (2H, d, J = 2.3 Hz), 7.28 (4H, d, J = 3.0 Hz), 6.09 (1H, t, J = 2.5 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.8 Hz), 2.39 (3H, s), 1.40 (6H, s).
6-(2-트리메틸실릴)에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온 (화합물 CC)
탈기된 Et3N 100 ml중의 6-브로모-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온(Smith et al. Org. Prep. Proced. Int. 1978 10 123-131 참조) 815.0 mg (3.41 밀리몰)의 용액(아르곤으로 20분간 분무)에 요오드화제일구리 259.6 mg(1.363 밀리몰), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 956.9 mg(1.363 밀리몰)과 (트리메틸실릴)아세틸렌 3.14 g(34.08 밀리몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 70℃로 42시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 실리카 겔 패드를 통해 여과한 후 에테르로 세척하였다. 여액을 물, 1M HCl, 물 및 포화 수성 NaCl로 차례로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 감압하에 농축한 후 컬럼크로마토그래피(실리카 겔, 10% Et2O-헥산)하여 갈색 오일로서 표제화합물을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ7.79 (1H, d, J = 1.4 Hz), 7.69 (1H, dd, J = 1.6, 8.3 Hz), 7.42 (1H, d, J = 8.5 Hz), 2.60 (2H, s), 1.41 (6H, s), 0.26 (9H, s).
6-에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온 (화합물 DD)
MeOH 28 ml중의 6-(2-트리메틸실릴)에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온 (화합물 CC) 875.0 mg(3.41 밀리몰)의 용액에 탄산칼륨 197.3 mg(1.43 밀리몰)을 한 번에 첨가하였다. 실온에서 6시간 교반한 후 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. 잔사 오일을 실리카 겔 컬럼에 넣고 5% EtOAc-헥산으로 용출시켜 표제생성물을 무색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ7.82 (1H, s), 7.72 (1H, dd, J = 1.6, 7.8 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.4 Hz), 3.11 (1H, s), 2.61 (2H, s), 1.43 (6H, s).
에틸 4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-7-옥소-2-인데닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 EE)
Et3N 5 ml중의 6-에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-온 (화합물 DD) 280.0 mg(1.520 밀리몰)과 에틸 4-요오도벤조에이트 419.6 mg(1.520 밀리몰)의 용액을 아르곤으로 40분간 분무하였다. 이 용액에 트리페닐포스핀 271.0 mg(1.033 밀리몰), 요오드화제일구리 53.5 mg(0.281 밀리몰)과 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 53.5 mg(0.076 밀리몰)을 첨가하였다. 생성 혼합물을 환류로 2.5시간 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 Et2O로 희석하였다. 셀라이트 패드를 통해 여과한 후 여액을 물, 1M 염산, 물 및 포화 수성 NaCl로 차례로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피하여(15% EtOAc-헥산) 표제화합물을 담황색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (300 MHz, d6-아세톤):δ8.05 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.87 (1H, dd, J = 1.4, 8.1 Hz), 7.75 (2H, m), 7.70 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.60 (2H, s), 1.45 (6H, s), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
에틸 4-[2-(1,1-디메틸-3-(트리플루오로메틸-설포닐)옥시-5-인데닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 FF)
THF 0.5 ml중의 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 88.0 mg(0.48 밀리몰)의 용액을 -78℃로 냉각시키고 에틸 4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-7-옥소-2-인데닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 EE) 145.0 mg(0.436 밀리몰)을 THF 1.0 ml중의 용액으로서 첨가하였다. 반응을 서서히 실온으로 가온하고 5시간 후 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 급정지시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 합한 유기층을 5% 수성 NaOH, 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(10% Et2O-헥산)하여 생성물을 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (300 MHz, d6-acetone):δ8.05 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.69 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.63 (2H, s), 7.55 (1H, s), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.44 (6H, s), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 60)
THF/물 (4:1, v/v) 12 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)과 LiOH-물 35.6 mg(0.848 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산으로 추출하고 헥산 분획을 5% 수성 NaOH로 추출하였다. 수성 층을 합하고 1M HCl로 산성화한 다음 EtOAc 및 Et2O로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 진공하에 농축시켜 표제화합물을 무색고체로서 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ7.91 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.47 (2H, s), 7.23 (4H, q, J = 8.1 Hz), 7.01 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.35 (3H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.30 (6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 60a)
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸릴)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 30a)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 물중의 LiOH 5.9 mg(0.14 밀리몰)을 사용하여 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-페닐-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1a) 27.0 mg(0.07 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. PMR (d6-DMSO):δ1.31 (6H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.5 Hz), 6.05 (1H, t, J =J =J = 4.5 Hz), 7.00 (1H, s), 7.33 (2H, d, J = 6.2 Hz), 7.44 (4H, m), 7.59 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.90 (2H, d, J = 8.1 Hz).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-(1,1-디메틸에틸)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조산 (화합물 61)
THF/물 (3:1, v/v) 6 ml중의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-(1,1-디메틸에틸)페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 6) 80.0 mg(0.173 밀리몰)과 LiOH-물 18.1 mg(0.432 밀리몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 헥산으로 추출하고 남은 수성층을 1M 염산으로 산성화한 다음 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 진공하에 농축시켜 표제화합물을 무색 고체로서 생성하였다. 1H NMR (d6-DMSO):δ7.82 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.44 (6H, m), 7.25 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.02 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.32 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.32 (9H, s), 1.29 (6H, s).
에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)티오카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 62)
벤젠 12.0 ml중의 에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 40)과 [2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3-디티아-2,4-디포스펜탄-2,4-디설파이드](로웬슨 시약) 57.7 mg(0.143 밀리몰)의 용액을 밤새 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후 혼합물을 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피하여(10 내지 25% EtOAc/헥산) 표제 화합물을 황색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ9.08 (1H, s), 7.92 (1H, br s), 7.90 (1H, t, J = 8.2 Hz), 7.66 (1H, dd, J = 2.0, 6.0 Hz), 7.38 (3H, m), 7.18 (4H, m), 6.01 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.36 (3H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.38 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.33 (6H, s).
2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)티오카르보닐]아미노]-벤조산 (화합물 63)
EtOH 1.0 ml와 THF 1.0 ml중의 에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)티오카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 62) 46.5 mg(0.098 밀리몰)의 용액에 NaOH 55 mg (1.4 밀리몰)과 물 1.0 ml를 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후 EtOAc를 첨가하고 10% 염산을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. EtOAc로 추출한 후 합한 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하여 고체를 수득하고 이를 CH3CN으로 재결정하여 표제화합물을 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (d6-acetone):δ11.05 (1H, s), 8.02 (1H, m), 7.99 (1H, t, J = 8.3 Hz), 7.75 (1H, m), 7.69 (1H, dd, J = 2.0, 6.1 Hz), 7.52 (1H, s), 7.46 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.21 (4H, m), 6.04 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 2.33 (3H, s), 1.36 (6H, s).
에틸 5',6'-디하이드로-5',5'-디메틸-8'-(4-메틸페닐)-[2,2'-비나프탈렌]-6-카르복실레이트 (화합물 64)
THF (2.1 ml)중의 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌 (화합물 D) 0.45 g (1.40 밀리몰)의 용액을 아르곤하에 실온에서 마그네슘 (0.044 g, 1.82 밀리몰)에 첨가하였다. 두 방울의 에틸렌 디브로마이드를 첨가하고 서서히 혼탁해지고 황색을 띄는 용액을 1.5시간 동안 환류로 가열하였다. 제2 플라스크에 고진공하에서 용융되는 염화아연(0.210 g, 1.54 밀리몰)을 첨가하고 실온으로 냉각시킨 후 THF(3 ml)중에 용해시켰다. 그리냐드 시약을 제2 플라스크에 첨가하고 30분 후 실온에서 에틸 6-브로모-2-나프탈린카르복실레이트 (화합물 N) 0.293 g(1.05 밀리몰)과 THF(2 ml)의 용액을 첨가하였다. 제3 플라스크에 Ni(PPh3)4와 THF의 용액을 다음과 같이 준비하였다. THF(3.5 ml)중의 NiCl2(PPh3)2(0.82 g, 1.25 밀리몰)과 PPh3(0.66 g, 2.5 밀리몰)의 용액에 디이소부틸알루미늄 하이드라이드와 헥산(2.5 ml, 2.5 밀리몰)의 1M 용액을 첨가하고 생성 용액을 THF로 총 15 ml 용량으로 희석한 다음 실온에서 15분간 교반하였다. Ni(PPh3)4용액의 0.60 ml를 제2 플라스크에 15분 간격으로 세 번 첨가하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 1N 수성 염산 5ml를 첨가하여 반응을 급정지시키고 1시간동안 교반한 후 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하고 염수로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 용매를 진공하에 제거하였다. 잔사를 헥산으로 재결정하여 130 mg의 순수한 물질을 생성하였다. 모액을 감압하에 농축시키고 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(95:5-헥산:에틸 아세테이트)하여 170 mg의 표제화합물 (총 수득량=300 mg, 64%)을 무색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.57 (s, 1H), 8.05 (dd, 1H, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.84-7.95 (overlapping d's, 3H), 7.66 (dd, 1H, J = 1.7, 8.5 Hz), 7.58 (dd, 1H, J = 2.0, 8.0 Hz), 7.48 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.32 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.04 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 4.44 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 2.40 (s, 3H), 2.39 (d, 2H, J = 4.8 Hz), 1.45 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 1.39 (s, 6H).
5',6'-디하이드로-5',5'-디메틸-8'-(4-메틸페닐)-[2,2'-비나프탈렌]-6-카르복실레이트 (화합물 65)
에틸 5',6'-디하이드로-5',5'-디메틸-8'-(4-메틸페닐)-[2,2'-비나프탈렌]-6-카르복실레이트 (화합물 64) 0.19 g(0.43 밀리몰), EtOH(8 ml)와 1N 수성 NaOH(2 ml)의 용액을 60℃로 3시간 가열하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고 1N 수성 HCl로 산성화하였다. 에틸 아세테이트로 생성물을 추출하고 유기층을 합한 다음 물 및 염수로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 진공하에 제거하였다. 잔사를 THF/에틸 아세테이트로 0℃에서 재결정하여 35 mg의 순수한 물질을 생성하였다. 모액을 감압하에 농축하고 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피하여(100% 에틸 아세테이트) 정제하여 125 mg의 표제화합물 (총 수득량=160 mg, 90%)을 무색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6):δ8.57 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.96-7.82 (겹침 d's 3H), 7.65 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.50 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.28 (s, 1H), 7.26 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.01 (t, 1H, J = 4.5 Hz), 3.34 (br s, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.31 (d, 2H, J = 4.5 Hz), 1.31 (s, 6H).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-푸릴)-2-나프탈레닐]벤조에이트 (화합물 66)
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트 (화합물 1)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하고 염화아연 142.4 mg(1.045 밀리몰), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 24.1 mg(0.02 밀리몰) 및 2-리티오푸란(53.4 mg(0.784 밀리몰)의 찬 용액(-78℃)에 n-부틸리튬(헥산중의 1.5M 용액) 53.4 mg(0.52 ml, 0.78 밀리몰)을 첨가하여 제조됨)을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈레닐)에티닐]벤조에이트(화합물 G) 250.0 mg(0.52 밀리몰)을 표제화합물(무색 고체)로 전환시켰다. PMR (CDCl3):δ1.32 (6H, s), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 5.0 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.41 (1H, t, J = 5.0 Hz), 6.50 (2H, s), 7.36 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.45 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.49 (1H, s), 7.57 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.63 (1H, d, J = 1.7 Hz), 8.02 (2H, d, J = 8.2 Hz).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-푸릴)-2-나프탈레닐]벤조산 (화합물 67)
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸릴)-2-나프탈레닐]에티닐]벤조산 (화합물 30a)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하여 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-푸릴)-2-나프탈레닐]벤조에이트 (화합물 66)을 표제화합물 (무색 고체)로 전환시켰다. PMR (d6-DMSO):δ1.26 (6H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.9 Hz), 6.41 (1H, t, J = 4.9 Hz), 6.60 (2H, m), 7.45-7.53 (3H, m), 7.64 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.75 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.93 (2H, d, J = 8.3 Hz).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100C) 및 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100D)
디클로로메탄 (55 ml)중의 염화알루미늄 (26.3 g, 199.0 밀리몰)의 찬(0℃) 혼합물에 디클로로메탄 (20 ml)중의 아세틸클로라이드 (15 g, 192 밀리몰)과 1,2,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸나프탈렌 (24.4 g, 152 밀리몰)을 20 분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 주변 온도로 가온하고 4시간 교반하였다. 얼음(200 g)을 반응 플라스크에 첨가하고 혼합물을 에테르(400 ml)로 희석하였다. 수성층과 유기층을 분리하고 유기상을 10% HCl (50 ml), 물(50 ml), 10% 수성 중탄산나트륨 및 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증류시켜 제거하여 황색 오일을 수득하고 이를 벤젠(50 ml)중에 용해시켰다.
아세트산(240 ml)과 무수 아세트산(120 ml)의 찬(0℃) 용액에 아르곤하에 삼산화크롬(50 g, 503 밀리몰)을 20분에 거쳐 조금씩 나누어 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하고 벤젠(120 ml)으로 희석시켰다. 상기 제조된 벤젠 용액을 20에 걸쳐 첨가 깔데기를 경유하여 교반하면서 첨가하였다. 8시간 후 조심스럽게 이소프로판올(50 ml)을 0℃에서 첨가하고 이어서 물(100 ml)을 첨가하여 반응을 급정지시켰다. 15분 후에 반응 혼합물을 에테르(1100 ml) 및 물(200 ml)로 희석한 다음 고체 중탄산나트륨(200 g)으로 중화시켰다. 에테르 층을 물(100 ml) 및 포화 수성 NaCl(2x100 ml)로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 크로마토그래피하여 이성체 디케톤 혼합물을 수득하였다. (화합물 100C): 1H NMR (CDCl3):δ8.55 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.13 (1H, dd, J = 2.0, 8.3 Hz), 7.53 (1H, d, J = 8.3 Hz), 2.77 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.62 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 6.6 Hz), 1.41 (6H, s). (화합물 100D): 1H NMR (CDCl3):δ8.10 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.02 (1H, dd, J = 1.6 Hz), 7.82 (1H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz), 2.77 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.64 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.44 (6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐))-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100E)
벤젠 50 ml중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100C)와 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100D)의 1:5 혼합물 1.80 g(8.34 밀리몰)의 용액을 에틸렌 글리콜 517.7 mg(8.34 밀리몰)과 p-톨루엔설폰산 일수화물 20.0 mg(0.11 밀리몰)과 혼합하였다. 생성된 용액을 18시간동안 환류로 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 감압하에 농축시켰다. 표제화합물을 컬럼 크로마토그래피(10% EtOAc-헥산)하여 무색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.01 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.51 (1H, s), 7.43 (1H, dd, J = 1.7, 6.4 Hz), 4.07 (2H, m), 3.79 (2H, m), 2.74 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.04 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.67 (3H, s), 1.46 (6H, s).
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐))나프탈렌 (화합물 100F)
THF (2.54 ml, 에테르중의 1M 용액)중의 p-톨릴마그네슘브로마이드 496.2 mg(2.54 밀리몰)의 용액에 THF(5 ml)중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-일))-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100E, 200.0 mg, 0.769 밀리몰)의 용액을 첨가하였다. 용액을 16시간동안 환류시키고 실온에 냉각한 다음 물 및 포화 수성 NH4Cl으로 세척한 후 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 용매를 제거하여 표제화합물을 무색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.49 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.19 (2H, m), 7.10 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.05 (2H, m), 3.80 (2H, m), 2.34 (3H, s), 2.21 (1H, m), 2.10 (1H, m), 1.88 (1H, m), 1.65 (3H, s), 1.54 (1H, m), 1.39 (3H, s), 1.33 (3H, s).
3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌 (화합물 100G)
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐))나프탈렌 (화합물 100F 160.0 mg, 0.52 밀리몰), p-톨루엔설폰산 일수화물(4 mg) 및 벤젠 30 ml의 용액을 12시간 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후 반응 혼합물을 에테르(100 ml)로 희석시키고 10% 수성 중탄산나트륨, 물 및 포화 수성 NaCl로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하여 표제화합물을 생성하고 이를 컬럼 크로마토그래피(10% EtOAc-헥산)하여 황색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.97 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 1.7, 6.4 Hz), 7.22 (4H, s), 7.13 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.10 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.59 (3H, s), 2.40 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.38 (6H, s).
4-[3-옥소-3-(7,8-디하이드로-5-(4-메틸페닐)-8,8-디메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]-벤조산 (화합물 101)
MeOH 4.0 ml중의 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌 (화합물 100G) 78.7 mg(0.272 밀리몰)의 용액에 4-카르복시 벤즈알데하이드 53.1 mg(0.354 밀리몰)와 80 mg의 1M 수성 NaOH 2.0 ml(2.00 밀리몰)을 첨가하였다. 생성용액을 실온에서 12시간 교반하고 감압하에 농축한 다음 잔여 오일을 EtOAcdp 용해시켰다. 용액을 10% HCl로 처리하고 유기층을 물 및 포화 수성 NaCl로 세척한 다음 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 표제화합물을 무색 고체로서 생성하고 이를 CH3CN으로 재결정하여 정제하였다. 1H NMR (acetone-d6):δ8.00 (7H, m), 7.83 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.24 (4H, s), 7.13 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.12 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.8 Hz), 2.38 (3H, s), 1.41 (6H, s).
3,4-디하이드로-1-페닐-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌 (화합물 100H)
THF 10 ml중의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔라닐))-1(2H)-나프탈레논 (화합물 100E) 508.0 mg(1.95 밀리몰)의 용액에 페닐마그네슘 브로마이드 496.2 mg(2.54 밀리몰, Et2O중의 1M 용액 2.54 ml)를 첨가하였다. 생성 용액을 8시간 환류로 가열하고 물을 첨가한 다음 30분간 계속 가열하였다. THF를 감압하에 제거하고 수성 잔사를 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하에 농축시킨 다음 잔사를 컬럼 크로마토그래피하여(10% EtOAc-헥산) 무색 오일로서 표제화합물을 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ7.97 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 2.1, 8.0 Hz), 7.34 (5H, m), 7.10 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.12 (1H, d, J = 4.6 Hz), 2.59 (3H, s), 2.39 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.38 (6H, s).
4-[3-옥소-3-(7,8-디하이드로-5-페닐-8,8-디메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 (화합물 103)
EtOH 5.0 ml와 THF 1.0 ml중의 3,4-디하이드로-1-페닐-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌 (화합물 100H) 115.0 mg(0.42 밀리몰)과 4-포르밀-벤조산 65.0 mg(0.43 밀리몰)의 용액에 NaOH 120.0 mg(3.00 밀리몰, 1M 수용액 3.0 ml)를 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 실온에서 12시간동안 교반하였다. 용액을 6% 수성 HCl로 산성화하고 EtOAcfhf 추출하였다. 합한 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 감압하에 농축시킨 후 컬럼 크로마토그래피하여(50% EtOAc-헥산) 담황색 고체로서 분리하였다. 1H NMR (CDCl3):δ8.13 (2H, d, J = 7.7 Hz), 8.04 (1H, s), 7.81 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.75 (3H, m), 7.60 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.35 (5H, m), 7.14 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.15 (1H, t, J = 4.2 Hz), 2.41 (2H, d, J = 4.2 Hz), 1.41 (6H, s).
에틸 2,6-디플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 212)
에틸 4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노-벤조에이트 (화합물 35)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하여, DMF중에서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실산(화합물 K)을 에틸 2,6-디플루오로-4-아미노벤조에이트와 반응시켜 수득하였다.1H NMR δ7.82 (b, 1H), 7.68 (1H, dd, J = 2.1, 7.1 Hz), 7.50 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.47 (1H, d, J = 7.1 Hz), 7.28 (2H, d, J = 9.8 Hz), 7.23 (4H, m), 6.06 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.39 (2H, q, J = 4.1 Hz), 2.40 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.38 (3H, t, J = 4.1 Hz), 1.36 (6H, s).
2,6-디플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산 (화합물 203)
4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노-벤조산 (화합물 203)의 제조에서와 동일한 절차를 실시하여, EtOH와 THF중에서 에틸 2,6-디플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 212)을 NaOH와 반응시켜 표제화합물(화합물 203)을 고체로서 70% 수율로 수득하였다.1H NMR δ7.88 (1H, bs), 7.67 (1H, dd, J1 = 2.1, 7.1 Hz), 7.50 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.47 (1H, d, J = 7.1 Hz), 7.30 (2H, d, J = 10.3 Hz), 7.21 (4H, m), 6.05 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.39 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.36 (6H, s); MS (EI) m/e 447, 403, 275; HRMS 실측치 447.1604 (M), 계산치 C27H23F2NO3447.1646 (M). 분석치 (C27H23F2NO3·1.6 H2O) C, H, N.
2,2-디메틸크로만 (화합물 214)
0℃ 무수 THF (50 ml)중의 디하이드로쿠마린 (화합물 213, 5.0 g, 33.78 밀리몰)의 용액에 메틸 마그네슘 클로라이드 (33.7 ml, THF중의 3M 용액, 0.1 몰)을 적가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 추출(Et2O), 건조(황산나트륨) 및 감압하에 농축하여 디올(6.25 g)을 무색 고체로서 수득하였다. 디올을 벤젠(15 ml)중에서 15% 수성 H2SO4(50 ml)와 혼합하고 생성된 혼합물을 2시간동안 105℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후 혼합물을 Et2O로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시키며 감압하에 농축시켜 표제화합물 6.0 g(100%)을 담황색 액체로서 수득하였다.1H NMR δ7.08 (2H, m), 6.80 (2H, m), 2.79 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.81 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.35 (6H, s).
6-아세틸-2,2-다메틸크로만 (화합물 215)
무수 CH2Cl2(100 ml)중의 2,2-디메틸크로만 (화합물 214, 15 g, 19.4 밀리몰)의 용액에 아세틸 클로라이드(1.52 ml, 21.3 밀리몰)과 AlCl3(2.84 g, 21.3 밀리몰)을 차례로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 다음 빙수에 부었다. 추출(CH2Cl2), 건조(황산나트륨) 및 감압하에 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피하여(EtOAc:헥산 1:9) 표제화합물 2.15 g(54%)을 황색고체로서 수득하였다.1H NMR δ7.73 (2H, m), 6.80 (1H, d, J = 8.3 Hz), 2.83 (2H, t, J = 6.9 Hz), 2.54 (3H, s), 1.84 (2H, t, J = 6.9 Hz), 1.36 (6H, s). 분석치 (C13H16O2) C, H.
에틸 2,2-디메틸크로만-6-카르복실레이트 (화합물 216)
디옥산 (50 ml)와 표백제 (50 ml, 5.25% NaOCl)중의 6-아세틸-2,2-디메틸크로만 (화합물 215, 2.15 g, 10.5 밀리몰)의 용액을 4일간 65℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후 CCl4중의 I2의 용액 한 방울을 처리했을 때 그 용액의 분획이 무색으로 나타날 때까지 황산나트륨을 첨가하였다. 용액을 H2SO4(pH 4)로 산성화하고 에테르로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 1:3)하여 2,2-디메틸크로만-6-카르복실산 1.98 g(92%)를 연갈색 고체로서 수득하였다.1H NMR δ7.78 (2H, m), 6.82 (1H, d, J = 8.3 Hz), 2.83 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.85 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.37 (6H, s).
EtOH(50 ml)중의 이 고체(1.64 g, 7.95 밀리몰)의 용액에 H2SO4(0.5 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 95℃로 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 1:5)하여 표제화합물 1.91 g(100%)를 무색 고체로서 수득하였다.1H NMR δ7.79 (2H, m), 6.79 (2H, d, J = 8.3 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.82 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.84 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.38 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.36 (6H, s). 분석치 (C14H18O3·0.25H2O) C, H.
에틸 8-브로모-2,2-디메틸크로만-6-카르복실레이트 (화합물 217)
HOAc(4 ml)중의 에틸 2,2-디메틸크로만-6-카르복실레이트 (화합물 216, 500 mg, 2.14 밀리몰)의 용액에 Br2(0.11 ml, 2.14 밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 공기 스트림을 반응 혼합물에 통과시켜 과량의 Br2를 제거하였다. 용매를 감압하에 제거하고 잔사를 이용하여 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 1:9)하여 표제화합물 741 mg(100%)를 오일로서 수득하였다.1H NMR δ8.05 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.73 (1H, d, J = 2.2 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.84 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.85 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.40 (6H, s), 1.38 (3H, t, J = 7.2 Hz). 분석치 (C14H17BrO3·0.2 H2O) C, H.
에틸 8-브로모-2,2-디메틸-4-크로마논-6-카르복실레이트(화합물 218)
0℃ HOAc(15 ml)와 Ac2O(7.5 ml)의 용액에 CrO3(1.18 g, 12 밀리몰)을 조금씩 나우어 첨가하였다. 이 용액을 15분간 교반하고 벤젠(10 ml)으로 희석한 다음 벤젠 (5ml)중의 에틸 8-브로모-2,2-디메틸크로만-6-카르복실레이트(화합물 217, 741 mg, 2.38 밀리몰)의 용액을 수 분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 0℃에서 4시간 교반한 후 반응 혼합물을 얼음에 붓고 EtOAc로 추출한 다음 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축시켜 오일을 생성하였다. 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 1:9)하여 표제화합물 589 mg(76%)를 무색 고체로서 수득하였다.1H NMR δ8.5 (1H, d, J = 2.1 Hz), 8.40 (1H, d, J = 2.1 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.80 (2H, s), 1.54 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz); 분석치 (C14H15Bro4) C, H, N.
에틸 8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-4(2H)-크로마논-6-카르복실레이트(화합물 219)
아르곤 가스하에 -78℃에서 THF(20 ml)중의 에틸 8-브로모-2,2-디메틸-4-크로마논-6-카르복실레이트(화합물 218) 589 mg, 1.81 밀리몰의 용액에 p-톨릴마그네슘 브로마이드 (2.16 ml, 2.72 밀리몰, 에테르중의 1M 용액)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액을 0℃에서 첨가하고 생성 혼합물을 에테르로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 수성 NaCl로 세척하고 Na2SO4로 건조시킨 다음 감압하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산, 1:3)하여 표제 화합물과 중간체 삼차 알콜의 혼합물 297 mg을 오일로서 수득하였다. 이 혼합물을 무수 톨루엔 (15 ml)중의 p-TsOH(20 mg)와 혼합하고 110℃로 30분간 가열하였다. 실온으로 냉각한 후 용매를 감압하에 제거하고 컬럼 크로마토그래피하여(EtOAc:헥산 1:3) 생성물 182 mg(25%)를 분리하였다.1H NMR δ8.1 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.68 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.22 (4H, s), 5.67 (1H, s), 4.29 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.41 (3H, s), 1.56 (6H, s), 1.33 (3H, t, J = 7.1 Hz); MS (EI) m/e 402, 400, 387, 385, 359, 357. 분석치 (C21H21BrO3·0.45 H2O) C, H.
8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-4(2H)-크로만-6-카르복실산 (화합물 220)
EtOH (15 ml)와 THF(10 ml)중의 에틸 8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-4(2H)-크로만-6-카르복실레이트(화합물 219, 189 mg, 0.51 밀리몰)의 용액에 20% 수성 NaOH(2 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃로 2시간 가온하고 실온으로 냉각시킨다음 10% 수성 HCl로 pH4로 산성화하였다. 추출(EtOAc), 건조(황산마그네슘) 및 감압하에 농축하여 표제화합물(171 mg)(98%)를 무색 고체로서 수득하였다.1H NMR δ8.15 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.21 (m, 4H), 5.69 (s, 1H), 2.42 (s, 3H), 1.58 (s, 6H).
에틸 2-플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로마닐)카르보닐]아미노]벤조에이트 (화합물 221)
CH2Cl2(8 ml)중의 8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-4(2H)-크로만-6-카르복실산 (화합물 220) 100 mg (0.69 밀리몰)의 용액에 DMAP(87 mg, 0.69 밀리몰), 에틸 4-아미노-2-플루오로 벤조에이트 (53 mg, 0.29 밀리몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:헥산 1:3)하여 표제화합물 98 mg(63%)를 무색 고체로서 수득하였다.1H NMR δ7.99 (1H, bs), 7.89 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.88 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.65 (1H, dd, J = 12.8, 2.1 Hz), 7.25 (1H, dd, J = 7.5 Hz, 2.1 Hz), 7.19 (4H, s), 5.70 (1H, s), 4.36 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.38 (3H, s), 1.56 (6H, s), 1.39 (3H, t, J = 7.2 Hz). MS (EI) m/e 537, 537, 524, 526, 357, 355, 312. 분석치 (C28H25BrFNO4) C, H, N.
2-플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로마닐)카르보닐]아미노]벤조산 (화합물 204)
EtOH(5 ml)중의 에틸 2-플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로마닐)카르보닐]아미노]벤조에이트 (화합물 221) 135 mg(0.25 밀리몰)의 용액에 20% 수성 NaOH(2 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 10% 수성 HCl로 pH4로 산성화하였다. EtOH를 감압하에 제거하고 에틸 아세테이트와 물을 잔사에 첨가하였다. 유기층을 분리하고 포화 NaHCO3, 포화 수성 NaCl로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에 농축하여 표제화합물 110 mg(86%)를 무색 고체로서 수득하였다.1H NMR δ(아세톤-d6) 8.09 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.91 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.68 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 12.8, 2.1 Hz), 7.50 (1H, dd, J = 7.5 Hz, 2.1 Hz), 7.27 (4H, s), 5.87 (1H, s), 2.37 (3H, s), 1.56 (6H, s); MS (EI) m/e 511, 509, 496, 494, 452, 450, 357, 355, 312. 분석치 (C26H21BrFNO4·0.6 H2O) C, H, N.
에틸 2,6-디플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로만)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 222)
에틸 2-플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로마닐)카르보닐]아미노]벤조에이트 (화합물 221)의 합성에서와 동일한 절차를 실시하고 8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-4(2H)-크로만-6-카르복실산 (화합물 220) 100 mg(0.29 밀리몰)을 CH2Cl2중 DMAP와 EDC의 존재하에 에틸 2,6-디플루오로-4-아미노벤조에이트와 반응시켜 무색 오일로서 표제화합물 53 mg(33%)을 수득하였다.1H NMR δ7.87 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.47 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.28 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.19 (4H, m), 5.70 (1H, s), 4.38 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.41 (3H, s), 1.57 (6H, s), 1.38 (3H, t, J = 7.2 Hz). MS (EI) m/e 557, 555, 542, 540, 448, 446. 분석치 (C28H24BrF2NO4) C, H, N.
2,6-디플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로만)카르보닐]아미노]-벤조산 (화합물 205)
2-플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-디메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로마닐)카르보닐]아미노]벤조산 (화합물 204)의 합성에서와 동일한 절차를 실시하고
에틸 2,6-디플루오로-4-[[(8-브로모-2,2-메틸-4-(4-메틸페닐)-6-크로만)카르보닐]아미노]-벤조에이트 (화합물 222) 53 mg(0.1 밀리몰)을 EtOH중의 수성 NaOH로 처리하여 무색 고체로서 표제화합물 35 mg(70%)을 수득하였다.1H NMR δ(아세톤-d6) 9.93 (1H, bs), 8.07 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.66 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.54 (2H, d, J = 9.9 Hz), 7.27 (4H, s), 5.88 (1H, s), 2.38 (3H, s), 1.56 (6H, s); MS(EI)m/e 514,512,485,483,470,468. 분석치 (C26H20BrF2NO4) C, H, N.
핵 수용체 효능제의 기능강화 방법
개요
본 발명자들은 음성 호르몬 활성을 나타내는 아부류의 레티노이드 길항제를 다른 레티노이드 및 스테로이드 수용체 초과 호르몬의 생물학적 활성을 강화하는데 사용할 수 있음을 발견하였다. 이들 다른 레티노이드 및 스테로이드 수용체 초과 호르몬은 내인성 호르몬이거나 약제일 수 있다. 따라서, 예를 들면 레티노이드 음성 호르몬과 혼합하여 사용했을 때 약제학적 레티노이드 효능제의 특정 활성은 특정 생물학적 효과를 나타내는데 있어서 더욱 활성적으로 만들 수 있다.
약물 투여에 있어서의 이와 같은 조합 방법은 약제 레티노이드를 소량 사용하여도 향상된 효과를 얻을 수 있기 때문에 약제 레티노이드의 바람직하지 않은 부작용을 최소화할 수 있어 바람직하다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 도 1에 도시된 구조를 가진 합성 레티노이드인 AGN 193109가 독특하고 놀라운 약리 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. AGN 193109는 핵 수용체의 RAR 서브클래스에 대하여 이 수용체를 활성화시키거나 레티노이드 응답성 유전자의 전사를 자극하지 않고도 높은 친화성을 나타낸다. 그 대신, AGN 193109는 레티노이드 작동물질에 의한 RAR의 활성화를 억제하여 레티노이드 길항물질로서 작용한다.
또한, 본 발명자들은 특정한 질병 증상을 조절하기 위하여 레티노이드 작동물질이나 스테로이드 호르몬을 동시투여함이 없이 레티노이드 음성 호르몬을 사용할 수 있다는 것을 발견하였다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 개시된 레티노이드 음성 호르몬은 비리간드형 RAR에 응답성인 유전자의 고농도 기준 전사량을 억제조절할 수 있다. 예컨대, 비조절성 세포 증식이 비리간드형 RAR에 응답성인 유전자의 활성으로부터 얻어진다면, 이 유전자의 활성은 RAR를 불활성화시키는 레티노이드 음성 호르몬을 투여하면 감소될 수 있다. 결과적으로, 비리간드형 RAR의 활성에 좌우되는 세포 증식은 음성 호르몬에 억제될 수 있다. 비리간드형 RAR의 억제는 종래의 길항물질로는 얻어질 수 없다.
중요한 것은, AGN 193109가 RAR 기본 활성을 억제하면서 때로 다른 레티노이드와 스테로이드 수용체 초과 호르몬 작동물질의 활성을 강화시킬 수 있음을 발견한 것이다. 본 발명의 내용을 살펴볼 때, 음성 호르몬의 존재하에 작동물질의 농도를 감소시켜도 작동물질 단독물을 사용시 얻을 수 있는 것과 동일한 정량적 응답 반응이 실질적으로 유도되면 호르몬 작동물질은 AGN 193109와 같이 음성 호르몬일 가능성이 크다고 할 수 있다. 정량적 응답 반응은, 예컨대 시험관내 리포터 유전자 분석법으로 측정할 수 있다. 따라서, 특정 투여량이나 농도로 사용될 때 목적 응답반응을 유도하는 치료용 레티노이드는, 이보다 적은 투여량이나 농도를 AGN 193109와 함께 사용하는 경우 보다 많은 투여량이나 농도의 치료용 레티노이드를 단독으로 하는 경우와 실질적으로 동일한 효과를 제공한다면 이 치료용 레티노이드는 AGN 193109에 의해 효과가 증강되는 것이다. AGN 193109와 동시투여하면 효과가 증강될 수 있는 작동물질의 예로는 RAR 작동물질, 비타민 D 수용체 작동물질, 글루코코르티코이드 수용체 작동물질 및 티로이드 호르몬 수용체 작동물질을 포함한다. 보다 구체적으로, 동시투여에 의해 효과가 증강될 수 있는 구체적인 작동물질로는 ATRA, 13-cis 레틴산, 합성 RANR 작동물질 AGN 191183, 1,25-디히드록시비타민 D3, 덱사메타손 및 티로이드 호르몬(3,3',5-트리요오도치로닌)을 포함한다. 또한, 본 명세서에는 AGN 193109와 동시투여시 효과가 증강될 수 있는 기타 다른 호르몬을 동정하는데 사용할 수 있는 방법을 제시하고 있다.
따라서, AGN 193109는 단순히 레티노이드 길항물질에서 예상되는 방식으로 작용하는 것이 아니라 핵 수용체과에 속하는 각종 성분들의 활성을 증강시킬 수 있는 음성 호르몬으로서 작용한다. 또한, 본 발명은 기타 다른 핵 수용체 리간드의 활성을 증강시키는 AGN 193109의 능력과 음성 호르몬 활성을 설명할 수 있는 가능한 기작을 개시하고 있다. 이와 같은 기작에는 레티노이드 의존적 시그널링 경로에 참여하는 것으로 알려진 인자를 포함하고, 또 신규 음성 조절 성분도 더 포함한다.
당업자라면 AGN 193109 결합의 고 친화도 표적인 RAR이 각종 레티노이드 응답성 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자임을 잘 알고 있을 것이다. RAR의 시스 조절성 DNA 결합 부위는 레티노이드 의존적 방식으로 전사 조절되는 유전자 부근인 것으로 밝혀진 바 있다. 레틴산 응답 인자(RARE)라 알려진 이와 같은 DNA 부위에 대한 RAR 결합에 대해서는 잘 규명되어 있다. 중요한 것은, RARE가 1개의 RAR과 1개의 RXR로 이루어진 이종이량체에 결합한다는 점이다. 이종이량체의 RXR 성분은 RARE와 RAR/RXR 이종이량체 간에 높은 친화도 상호작용을 촉진하는 작용이 있다[Mangelsdorf et al. The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2nd edition, eds. Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York 1994, 본 발명에 참고 인용됨].
하기 상세히 기재되듯이, AGN 193109의 음성 호르몬 활성에 관한 본 발견은 RAR과 추정상의 음성 동시활성인자 단백질[Negative Coactivator Protein(NCP)]의 상호작용을 포함하는 기작과 일치한다. 제안된 기작에 따르면, 이 상호작용은 AGN 193109에 의해 안정화된다.
또한, 본 결과는 AGN 193109가 점유하고 있는 RAR 이외의 다른 핵 수용체와 상호작용하는데 있어 세포내 NCP의 유효성을 AGN 193109가 조정할 수 있다는 것을 시사하였다. 이것은 AGN 193109가 NCP에 대한 결합력을 공유하는 핵 수용체를 포함하는 전사 조절 경로의 효과를 증강시킬 수 있다는 것이다. 이러한 점에서, AGN 193109는 종래 레티노이드 길항물질에서는 예상하지 못한 활성인 각종 핵 수용체 경로를 조정하는 능력을 나타낸다. 따라서, AGN 193109는 내인성 호르몬 및 처방된 치료제를 포함하여, 핵 수용체 리간드의 활성을 증강시키는 제제로서 유용하다. 이러한 특정 구체예는 모든 핵 수용체 음성 호르몬이 NCP에 경쟁적으로 결합하는 기타 다른 핵 수용체의 활성을 증강시킨다는 보다 일반적인 논리로 해석될 수 있다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 기타 다른 물질 및 방법을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법과 물질은 다음과 같다. 본 명세서에 기재된 각종 핵산 조작과 절차를 수행하는데 사용할 수 있는 방법이 개시된 일반 문헌은 문헌[Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) 및 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al. eds., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1987)]이다. 이 문헌들의 개시 내용은 본 발명에 참고 인용하였다. 본 발명의 구성을 유도한 실험과 결과에 대하여 이하 상세히 설명하겠다.
실시예 6은 AGN 193109가 3종의 RAR 각각에 높은 친화성으로 결합하지만 레티노이드 의존적 유전자 발현을 활성화시키지는 못한다는 것을 증명하는데 사용된 방법에 대한 것이다.
실시예 6
RAR에 높은 친화성으로 결합하지만 레티노이드 의존적 유전자 발현을 활성화전달하지 못하는 AGN 193109
인간 RAR-α, RAR-β 및 RAR-γ 수용체를 실질적으로 문헌[Allegretto et al. in J.Biol.Chem. 268:26625(1993)]에 기재된 방법에 따라 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질로서 각각 발현시켰다. 이 재조합 수용체 단백질을 각각 사용하여 문헌[Heyman et al. in Cell 68:397(1992)]에 기재된 [3H]-ATRA 치환 분석법에 따라 AGN 193109 결합 친화도를 측정하였다. 해리 상수(Kd)는 문헌[Cheng et al. in Biochemical Pharmacology 22:3099(1973)]에 기재된 절차에 따라 측정하였다.
또한, AGN 193109을 사용하여 RAR 발현 벡터와 레티노이드 응답성 리포터 유전자 작제물로 순간 동시형질감염시킨 CV-1 세포 중에서의 RAR 활성화 전달 작용에 대하여 시험하였다. 수용체 발현 벡터 pRShRAR-α(Giguere et al. Nature 330:624(1987)], pRShRAR-β(Benbrook et al. Nature 333:669(1988)] 및 pRShRAR-γ(Ishikawa et al. Mol.Endocrinol. 4:837(1990)]를 각각 ΔMTV-TREp-Luc 리포터 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 이 루시퍼라제 리포터 플라스미드의 사용에 대해서는 문헌[Heyman et al. in Cell 68:397(1992)]에 개시되어 있다. 이 ΔMTV-TREp-Luc 플라스미드는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT) 리포터 유전자가 개똥벌레 루시퍼라제를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 문헌[Umesono et al. in Nature 336:262(1988)]에 기재된 ΔMTV-TREp-CAT 리포터 작제물과 실질적으로 동일하다. 녹색 원숭이 CV-1 세포의 형질감염은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrool et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989]에 기재된 인산칼슘 동시침전법을 사용하여 실시하였다. CV-1 세포를 12웰 다중웰 평판에 4 x 104/웰의 밀도로 평판배양하고, 표준 실험 절차에 따라 리포터 플라스미드 0.7 ㎍과 리포터 플라스미드 0.1 ㎍을 함유하는 인산칼슘 침전물로 순간 형질감염시켰다. 18 시간 후 세포를 세척하여 침전물을 분리하고, 10% 활성화 차콜 추출된 소 태아 혈청(Gemini Bio-Products)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Gibco)를 재주입하였다. 이 세포를 부형제 단독물(에탄올)이나 AGN 193109(10-9 내지 10-6 M)로 18 시간 동안 처리하였다. 세포 용균물을 0.1M KPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0 mM DTT, 2 mM EDTA중에 제조하였다. 루시퍼라제 활성은 개똥벌레 루시페린(Analytical Luminescence Laboratory)과 EG＆G Berthold 96웰 평판 루미노미터를 사용하여 문헌[de Wet et al. in Mol.Cell.Biol. 7:725(1987)]에 기재된 바와 같이 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 3반복으로 측정하여 평균값 ±SEM으로 나타내었다.
이 결과를 표 11에 제시하였는데, 이 결과로부터 AGN 193109가 각 RAR-α, RAR-β 및 RAR-γ에 높은 친화도로 결합하지만, 레티노이드 의존적 유전자 발현은 활성화시키지 못한다는 것을 알 수 있었다. 보다 구체적으로 설명하면, AGN 193109는 3종의 수용체 각각에 대해 2 내지 3 nM 범위의 Kd 값으로 결합하였다. 이와 같은 친밀한 결합에도 불구하고 AGN 193109는 ATRA에 의해 자극된 유도와 비해 유전자 발현을 활성화시키지 못하였다. 따라서, AGN 193109의 최대의 1/2 유효 농도(EC50)를 측정할 수 없었다. 표에 제시하지는 않았지만, AGN 193109의 RXR에 대한 친화도 역시 측정할 수 없다는 것을 발견하였다.
RAR의 AGN 193109 결합 및 활성화 전달작용
RAR-α RAR-β RAR-γ
EC50(nM) 활성 무 활성 무 활성 무
Kd(nM) 2 2 3
이하, 실시예 7은 AGN 193109가 ATRA 의존적 유전자 발현의 길항물질임을 증명하는데 사용된 방법에 대한 것이다.
실시예 7
ATRA에 의한 RAR 활성화 전달 작용의 AGN 193109 의존적 억제
ATRA 매개의 RAR 활성화에 대해 길항작용하는 AGN 193109의 활성은 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989]의 인산칼슘 동시침전법으로 동시형질감염시킨 CV-1 세포 를 사용하여 연구하였다. 진핵세포용 형질발현 벡터 pRShRAR-α(Giguere et al. Nature 330:624(1987)], pRShRAR-β(Benbrook et al. Nature 333:669(1988)] 및 pRShRAR-γ(Ishikawa et al. Mol.Endocrinol. 4:837(1990)]를 문헌[Hollenberg et al., Cell 55:899(1988)]에 기재된 ΔMTV-Luc 리포터 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 주목할만한 것은, 리포터 플라스미드가 TRE 팔린드롬 응답성 인자의 카피를 2개 포함한다는 것이다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 정확하게 인산칼슘 형질감염을 실시하였다. 세포에 부형제 단독물(에탄올), ATRA(10-9 내지 10-6M), AGN 193109(10-9 내지 10-6M) 또는 10-8M ATRA와 혼합된 AGN 193109(10-9 내지 10-6M)을 18 시간 동안 투여하였다. 세포 용해물과 루시퍼라제 활성 측정 역시 실시예 6에 기재된 바와 같이 실시하였다.
이 실험의 결과를 도 2A 내지 도 2F에 제시하였고, 여기에서 루시퍼라제값은 3반복 측정값의 평균±SEM으로 나타내었다. 보다 구체적으로 설명하면, 도 2A, 도 2C 및 도 2E에 제시한 결과는 형질감염된 세포를 ATRA로 자극하면 루시퍼라제 활성의 용량 응답성 증가를 유도한다는 것을 시사하였다. 이 결과로부터 ATRA가 실험계에서 3종의 RAR을 각각 활성화시키고, 따라서 길항물질의 활성을 측정할 수 있는 비교 기준으로 제공될 수 있음을 확인하였다. 도 2B, 도 2D 및 도 2F에 제시한 그래프 결과는 형질감염된 세포를 ATRA 10 nM과 AGN 193109를 증가 농도량으로 사용하여 동시처리하면 루시퍼라제 활성을 억제한다는 것을 시사한다. 구체적으로, AGN 193109과 ATRA를 동일 투여량으로 사용한 경우 3종의 RAR 아형 모두에 대하여 ATRA를 단독으로 사용한 경우보다 50% 이상의 억제율을 제공하였다. 또, AGN 193109를 여러 농도로 제공하여 ATRA 용량 응답 반응을 비교한 결과 ATRA가 AGN 193109에 의해 경쟁적으로 억제된다는 것을 알 수 있었다. 특히, 도 2에 도시된 모든 그래프 상의 수평축은 레티노이드 농도의 로그값을 나타낸다. 이 결과는 AGN 193109가 강력한 RAR 길항물질이라는 것을 증명하는 것이다.
다음으로, AGN 193109의 길항물질 활성에 근거가 되는 기작을 해명하기 위하여 실험하였다. 당업라라면 핵 수용체 활성화가 리간드 결합으로 유도되는 수용체의 형태 변화와 관련 있는 것으로 추정되고 있음은 잘 알고 있을 것이다. 실제, 프로테아제 차단 분석 결과 핵 호르몬 작동물질과 길항물질이 수용체 단백질을 여러 형태로 만든다는 것이 확인된 바 있다[Keidel et al. Mol.Cell.Biol. 14:287(1994); Allan et al. J.Biol.Chem. 267:19513(1992)]. 본 발명자들은 이와 같은 분석법을 사용하여 AGN 193109 및 ATRA가 RAR-α를 여러 형태로 만드는지를 측정하였다. 양성 대조군으로 프로테아제 감수성의 길항물질 특이적 패턴을 부여하는 것으로 알려진 RAR-α선택적 길항물질인 AGN 193583을 사용하였다.
실시예 8은 AGN 193109 결합을 형성시키는 RAR-α의 형태적 변화를 측정하는데 사용된 1가지 방법에 대한 것이다. 하기 기재되는 바와 같이, 이 실험 결과는 놀랍게도 AGN 193109가 원형인 RAR 길항물질에 의해 유도된 패턴과는 다르지만, RAR 작동물질인 ATRA에 의해 유도된 것과는 실질적으로 동일한 트립신 감수성 패턴을 유도하는 것으로 나타났다. 이와 같은 발견은 AGN 193109가 다른 레티노이드 길항물질과는 다른 성질을 갖고 있음을 암시하는 것이다.
실시예 8
프로테아제 차단 분석
벡터 pGEM3Z(파마시아) 중에 작제되고 RAR-αcDNA[Giguerer et al. Nature 330:624(1987)]를 함유하는 플라스미드를 TNT 결합된 세망적혈구 용해물 시험관내 전사-해독 시스템(프로메가)과 함께 사용하여 [35S]-메티오닌 표지된 RAR-α를 제조하였다. 표지된 단백질 RAR-α의 제한적 단백분해 절단을 문헌[Keidel et al. in Mol.Cell.Biol. 14:287(1994)]에 기재된 방법에 따라 실시하였다. [35S]-메티오닌 표지된 RAR-α를 함유하는 세망적혈구 용해물 일정량과 ATRA, AGN 193583 또는 AGN 193109을 총 부피 9 ㎕ 중에서 45 분 동안 얼음상에서 항온처리하였다. 모든 시험의 레티노이드 최종 농도는 ATRA 및 AGN 193109에 대해서는 10 nM로 하고 AGN 193583에 대해서는 1000 nM로 하였다. 레티노이드 최종 농도의 차이는 ATRA 및 AGN 193109(RAR-α에 대한 Kd가 각각 2nM 및 10nM임)와 AGN 193583(RAR-α에 대한 Kd가 ≥100 nM임)의 상대적 친화도가 약 10배의 차이가 있는 것에 근거한 것이다. 리간드 결합 후, 적당한 농도의 트립신 1 ㎕를 혼합물에 첨가하여 최종 농도 25, 50 또는 100 ㎍/㎖로 만들었다. 시료를 10분 동안 실온에서 항온처리하고, SDS 시료 완충액을 첨가하여 트립신 분해를 중지시켰다. 시료를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리하고 표준 절차에 따라 자동방사능사진 촬영하였다.
작동물질과 길항물질은 둘다 비리간드형 수용체 절단시 얻어지는 결과와 다른 독특한 패턴의 트립신 감수성을 유도하였다. 자동방사능사진 결과는 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도의 트립신이 레티노이드를 첨가하지 않은 상태에서 10 분동안 실온에서 처리되면 방사능표지된 RAR-α를 완전 분해하는 것으로 나타났다. 그러나, ATRA을 예비결합시킨 결과 2가지 주요 프로테아제 내성 종을 형성시켰다. 또한, RAR-α선택적 길항물질 AGN 193583을 예비결합시킨 결과 ATRA 예비결합시 얻어지는 것보다 분자량이 적은 프로테아제 내성 종을 형성시켰다. 이와 같은 결과는 레티노이드 작동물질 및 길항물질이 변화된 트립신 감수성에 의해 측정가능한 형태 변화를 유도한다는 것을 입증하였다. 놀라운 것은, AGN 193109를 예비결합시키면 ATRA의 예비결합시 얻어지는 것과 구별되지 않는 프로테아제 차단 패턴을 제공한다는 점이다.
이와 같은 결과를 통해 AGN 193109가 RAR-α에 결합되어 그 형태가 변화된다는 것을 확인하였다. 흥미로운 것은, 이와 같은 형태적 변화성이 길항물질 (AGN 193583) 결합에 의해 생성되는 변화 보다는 작동물질(ATRA)의 결합시 얻어지는 변화와 보다 유사하다는 점이다. 즉, AGN 193109 의존적 길항작용의 기작은 독특한 것임이 분명하다.
이어서, AGN 193109의 길항물질 활성을 설명할 수 있는 가능한 기작에 대하여 조사하였다. 구체적으로, 표준 겔 이동 분석법을 사용하여 AGN 193109가 RAR과 이것의 동족 DNA 결합 부위 사이의 상호작용을 억제하거나 RAR/RXR 이종이량체 형성을 혼란시키는지를 시험하였다.
이하, 실시예 9는 AGN 193109가 RAR/RXR 이량체화를 억제하거나 표적 DNA에 대한 이량체의 결합을 억제하지 않음을 증명하는데 사용된 겔 전기영동 이동성 전이 분석법에 관한 것이다.
실시예 9
겔 전이 분석법
시험관내 해독된 RAR-α는 35S-표지된 메티오닌을 배제시킨 것만을 제외하고는 실질적으로 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조하였다. 시험관내 해독된 RXR-α는 시험관내 전사물 형성의 주형으로서 문헌[Mangelsdorf, et al. in Nature 345:224-229(1990)에 기재된 RXR-αcDNA를 함유하는 pBluescript(II)(SK)계 벡터를 사용하여 유사하게 제조하였다. 표지된 RAR-α및 RXR-α를 단독물 또는 조합물로 사용하거나 또는 AGN 193109(10-6M)을 예비결합시킨 표지된 RAR-α및 RXR-α를 단독물 또는 조합물로 사용하여 서열 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3'(서열 번호 1)을 가진 말단 표지된 DR-5 RARE 이본쇄 프로브와 상호작용시켰다. 이 결합 혼합물을 표준 실험실 절차에 따라 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고 자동방사능사진촬영하였다. 자동방사능사진에서 겔 상의 모든 레인에 공통적으로 나타나는 1염기 지연된 종은 세망적혈구 용해물에 존재하는 미규명된 프로브 결합 인자를 나타내는 것이다. RAR/RXR 조합물만이 레티노이드 수용체 특이적 지연 종을 나타내었다. RAR 단독물이나 RXR 단독물은 프로브에 결합하여 이와 같이 전이된 종을 전혀 나타내지 않았다. AGN 193109의 존재는 이와 같은 상호작용을 감소시키지 않았다.
이와 같은 결과를 통해 AGN 193109가 RAR-α의 동종이량체 성질이나 이종이량체 성질을 실질적으로 변화시키지 않는다는 것을 알 수 있었다. 또한, AGN 193109는 동족 결합 부위를 포함하는 DNA 분절과 수용체 이량체의 상호작용을 억제하지 않았다.
AGN 193109의 특징을 이루는 고유 성질을 관찰하기 위하여 이 길항물질이 비리간드형 RAR의 활성을 더 억제할 수 있는지를 조사하였다. 이 조사에 사용된 수용체/리포터 시스템은 레티노이드 작동물질의 무첨가하에 다량의 구성적 활성을 나타내었다. 보다 구체적으로 설명하면, 이 실험에 ER-RAR 키메라 수용체 및 ERE-tk-Luc 리포터 시스템을 이용하였다. ERE-tk-Luc 플라스미드는 플라스미드 tk-Luc의 루시퍼라제 리포터 유전자와 HSV 티미딘 키나제 프로모터의 상류에 결찰되고 문헌[Klein-Hitpass, et al. in Cell 46:1053-1061(1986)]에 기재된 제노푸스 비텔로제닌 A2 유전자의 에스트로겐 응답성 5'-인접 영역의 영역 -397 내지 -87을 포함한다. 이 ER-RAR 키메라 수용체는 RAR의 "D-E-F"에 융합된 에스트로겐 수용체 DNA 결합 도메인으로 이루어진다. 당업자에게는, 이 "D-E-F" 도메인이 레티노이드에 결합하고, 레티노이드 유도성 활성화 전달 작용을 제공하고, RXR과의 이종이량체화 접촉 부위를 제공하는 작용을 한다는 것이 자명한 것이다. 따라서, 이 리포터 시스템내 루시퍼라제 발현은 형질감염된 키메라 수용체 작제물의 활성화에 따라 좌우된다.
이하, 실시예 10은 AGN 193109가 비리간드형 RAR에 의한 기본적인 유전자 활성을 억제한다는 것을 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다. 이 실험은 레티노이드 작동물질의 무첨가하에 실시하였다. 하기 제시된 결과는 AGN 193109가 음성 호르몬 활성을 나타낸다는 최초 발견을 제공한다.
실시예 10
순간 동시형질감염된 세포주 중에 존재하는 레티노이드 조절성 리포터의 기본 유전자 활성의 억제
CV-1 세포를 ER-RAR-α, ER-RAR-β 또는 ER-RAR-γ발현 플라스미드 중 어느 하나와 ERE-tk-Luc 리포터 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 이 ERE-tk-Luc 플라스미드는 제노푸스 레비스(Xenopus laevis) 비텔로제닌 A2자의 에스트로겐 응답성 프로모터 인자를 포함하고 있고, 문헌[Klein-Hitpass et al. in Cell 46:1053(1986)]에 기재된 리포터 플라스미드와, CAT 리포터 유전자 대신에 루시퍼라제를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열이 사용된 것을 제외하고는 실질적으로 동일하다. 동시형질감염에는 문헌[Graupner et al. in Biochem.Biophys.Res.Comm. 179:1554(1991)]에 기재된 ER-RAR-α, ER-RAR-β 및 ER-RAR-γ키메라 수용체 암호 폴리뉴클레오티드를 이용하였다. 이 폴리뉴클레오티드를 문헌[Ellis et al. in Cell 45:721(1986)]에 기재된 pECE 발현 벡터에 결찰시키고 SV-40 프로모터의 전사 조절하에 발현시켰다. 인산칼슘 형질감염은 리포터 플라스미드 0.5 ㎍/웰과 수용체 플라스미드 0.05 ㎍, 0.10 ㎍ 또는 0.2 ㎍/웰을 사용하여 실시예 6에 기재된 바와 같이 정확하게 실시하였다. 세포에 부형제 단독물(에탄올), ATRA(10-9 내지 10-6M), 또는 AGN 193109(10-9 내지 10-6M)를 18 시간 동안 투여하였다. 세포 용해물과 루시퍼라제 활성 측정 역시 실시예 6에 기재된 바와 같이 실시하였다.
도 3A, 도4A 및 도 5A에 제시한 실험 결과를 통해 ATRA가 모든 형질감염체에서 루시퍼라제 발현을 강하게 유도한다는 것을 확인하였다. 3종의 형질감염된 키메라 RAR 아이소폼이 나타내는 기본 루시퍼라제 발현율은 약 7000 내지 40000 상대적 광단위(rlu) 범위이었는데, 이것은 형질감염에 사용된 수용체 플라스미드의 양에 따라 다소 달라졌다. 즉, 3종의 키메라 수용체는 예상한 바와 같이 ATRA에 의해 활성화되었다. 보다 구체적으로 설명하면, 모두 3종의 수용체는 ATRA에 결합하고 ERE-tk-Luc 플라스미드 상에 보유된 루시퍼라제 리포터 유전자의 전사를 활성화하였다.
도 3B, 도 4B 및 도 5B는 어떤 외인성 레티노이드 작동물질의 부재하에 얻어지는 AGN 193109 용량 응답 곡선을 도시한 것이다. 흥미로운 것은, ER-RAR-α(도 3B)가 AGN 193109에 의해 거의 영향을 받지 않으며, ER-RAR-β및 ER-RAR-γ키메라 수용체(각각 도 4B 및 도 5B)가 AGN 193109 용량 응답적 루시퍼라제 리포터 활성 감소를 나타낸다는 점이다.
또한, 구성형 전사 활성인자 도메인을 병입시킨 키메라 RAR-γ수용체에 의해 매개되는 유전자 발현을 억제하는 작용을 시험하여 AGN 193109의 음성 호르몬 활성을 조사하였다. 보다 구체적으로 설명하면, 루시퍼라제 리포터 시스템의 2종류에 RAR-γ-VP-16이라고 하는 HSV VP-16의 산성 활성인자 도메인에 융합된 구성적 활성 RAR-γ키메라 수용체를 사용하였다. 제1 종류는 ER-RAR과 ER-RXR-α로 동시형질감염시킨 ERE-tk-Luc 리포터로 구성하였다. 제2 종류에는 ERE-tk-Luc 리포터 대신 ΔMTV-TREp-Luc 리포터를 사용하였다.
이하, 실시예 11은 RAR의 전사 활성인자 도메인의 활성을 AGN 193109가 억제할 수 있는지를 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다. 하지 제시되는 이 실험의 결과를 통해 AGN 193109가 작동물질의 부재하에 RAR-의존적 유전자 발현을 억제할 수 있음을 입증하고, 따라서 AGN 193109가 음성 호르몬 활성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
실시예 11
순간 형질감염된 세포의 RAR-VP-16 활성의 억제
CV-1 세포를 실시예 6에 기재된 인산칼슘 동시침전 기법에 따라 ERE-tk-Luc 루시퍼라제 리포터 플라스미드 0.5 ㎍/웰, ER-RXR-α키메라 리포터 발현 플라스미드 0.1 ㎍/웰 및 RAR-γ-VP-16 발현 플라스미드 0 ㎍ 또는 0.1 ㎍/웰을 사용하여 순간 동시형질감염시켰다. 키메라 수용체 ER-RXR-α는 RXR-α(Mangelsdorf, et al. Nature 345:224-229(1990)]의 호르몬 결합 도메인(아미노산 181 내지 458)을 에스트로겐 수용체 DNA 결합 도메인(Graupner, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554(1991)]에 융합시켜 구성하고, 문헌[Ellis et al. in Cell 45:721(1986)]에 기재된 SV-40계 발현 벡터 pECE로부터 발현시켰다. RAR-γ-VP-16은 본 발명에 참고 인용되는 문헌[Nagpal et al. in EMBO J. 12:2349(1993)]에 기재된 VP16RAR-γ1 발현 플라스미드와 동일한 것으로, 전길이 RAR-γ의 아미노 말단에 HSV의 VP-16 단백질의 활성화 도메인을 융합시킨 키메라 단백질을 암호한다. 형질감염 후 18 시간이 경과하면 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세정하고, 레티노이드를 제거하기 위하여 차콜로 추출된 10% FBS(Gemini Bio-Products) 함유의 DMEM(Gibco-BRL)을 첨가하였다. 이 세포에, 에탄올 부형제 중에 적당히 희석한 AGN 193109 또는 ATRA이나 에탄올 단독물을 첨가하여 18 시간 동안 처리하고, 그 다음 PBS로 세정한 뒤 0.1M KPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA를 사용하여 용해시켰다. 루시퍼라제 활성을 개똥벌레 루시페린(Analytical Luminescence Laboratory)과 EG＆G Berthold 96웰 평판 루미노미터를 사용하여 문헌[de Wet, et al. in Mol.Cell.Biol 7:725(1987)]에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 루시퍼라제 값은 3반복 측정한 결과의 평균 ±SEM으로 나타내었다.
도 6에 도시된 바와 같이, ERE-tk-Luc 리포터 작제물과 ER-RAR-α키메라 발현 플라스미드로 형질감염된 CV-1 세포는, RXR(Heyman et al. Cell 68:397(1992)]의 천연 리간드인 9C-RA에 대하여 ATRA의 이성체화 때문일 가능성이 큰 ATRA에 의한 루시퍼라제 활성의 약한 활성화를 나타내었다. 리포터 플라스미드와 키메라 수용체 플라스미드의 동일 혼합물로 형질감염시키고 AGN 193109로 처리한 세포는 루시퍼라제 활성에 어떤 영향도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 AGN 193109가 RXR에 결합하지 않기 때문인 것으로 예상된다. 또한, ERE-tk-Luc 리포터로 형질감염시킨 것은 유사하나 ER-RAR-α대신 ER-RAR 키메라 수용체 발현 플라스미드를 사용하여 형질감염시킨 CV-1 세포는 ATRA 처리 후 루시퍼라제 활성을 강력하게 유도하였다.
이와 반대로, 형질감염 혼합물에 ER-RXR-α및 ERE-tk-Luc 플라스미드와 함께 RAR-γ-VP-16 발현 플라스미드를 병입시킨 결과 레티노이드 무첨가하에 측정한 기본 루시퍼라제 활성을 유의적으로 증가시켰다. 이와 같이, ER-RXR-α 단독물로 형질감염된 세포를 사용하여 얻어진 결과와 비교하였을 때 ER-RXR-α/RAR-γ-VP-16 동시형질감염체에서 관찰되는 기본 루시퍼라제 활성의 증가는 재조합 ER-RXR-α및 RAR-γ-VP-16 단백질이 이종이량체화할 수 있다는 것을 시사하였다. 시스 조절성 에스트로겐 응답 인자와 상기 이종이량체의 상호작용은 VP-16 활성화 도메인을 ERE-tk-Luc 리포터의 프로모터 영역으로 표적화되게 유도하였다. 이와 같이 3중으로 형질감염시킨 세포를 ATRA로 처리하면 루시퍼라제 활성을 높은 기준량 보다 완만하게 증가시켰다. 하지만, 상기 3중 형질감염체를 AGN 193109로 처리한 결과 루시퍼라제 활성의 용량 의존적 감소가 나타났다. 중요한 것은, 도 6을 통해 도시된 바와 같이 ER-RXR-α및 RAR-γ-VP-16으로 동시형질감염된 세포를 AGN 193109로 처리하면 루시퍼라제 활성의 억제가 유도되고, 최대 억제율이 약 10-8M의 AGN 193109에 의해 일어난다는 점이다.
AGN 193109가 RXR의 존재하에 RAR-γ-VP-16의 구성적 전사 활성화 기능을 억제한다는 관찰은, RAR에 대한 AGN 193109의 결합이 트란스 작용성 음성 동시활성인자 단백질의 결합을 용이하게 하는 음성 형태를 안정화시키는 RAR 중의 형태적 변화를 유도하는 모델을 통해 설명되었다. AGN 193109/RAR 복합체가 NCP에 결합하게 되면, RAR은 보통 활성화된 RAR에 대해 응답성인 유전자의 전사를 상승조절할 수 없게 된다. 또한, 상기 모델은 세포내 NCP 저장물이 특정 상황에서 제한 농도이며 AGN 193109 자극된 RAR과의 복합체화에 의해 고갈될 수 있음을 암시한다.
또한, 도 6에 제시된 결과는 AGN 193109 10-6M에서도 ER-RXR-α및 RAR-γ-VP-16 단백질이 상호작용하여 리포터 유전자의 전사를 활성화시키는 이종이량체 성분을 형성한다는 것을 시사하였다. 보다 구체적으로 설명하면, ER-RXR-α 및 RAR-γ-VP-16으로 형질감염되고 최대 억제율을 제공하기에 충분한 농도(10-8 내지 10-6 M)의 AGN 193109로 처리된 세포는 약 16,000 rlu의 루시퍼라제 활성을 나타내었다. 이와 반대로, ER-RXR-α만으로 형질감염되고 그 다음 10-6M 의 고농도 AGN 193109로 처리된 세포는 단지 약 8,000 rlu의 루시퍼라제 발현율을 나타내었다. 즉, 10-6M의 AGN 193109의 존재하에서도 ER-RXR-α및 RAR-γ-VP-16을 모두 발현하는 세포에서 보다 높은 루시퍼라제 활성이 얻어진다는 사실은 두 재조합 수용체간에 상호작용이 지속된다는 것을 입증하는 것이다. AGN 193109에 의한 RAR-γ-VP-16 활성의 억제는 NCP 상호작용의 조정이 VP-16 활성화에 의해 동시지배될 수 있음을 암시하는 것이다. 따라서, AGN 193109 의존 방식에서 레티노이드에 의해 일반적으로 조절되지 않는 유전자의 발현을 조정하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
AGN 193109 조절성 유전자의 후보로는 RAR과 결합하거나 이종이량체화하고 활성화에 RAR 작동물질을 요구하지 않는 비RAR 인자로 구성된 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 것을 포함한다. RAR 작동물질로 자극하면 이 유전자의 발현에 거의 어떤 영향도 미치지 않겠지만 AGN 193109와 함께 투여하면 AGN 193109/RAR/NCP를 포함하는 불활성 전사 복합체의 형성을 촉진시킬 수 있다. 결과적으로, AGN 193109 레티노이드 음성 호르몬의 첨가는 다른 레티노이드 불감성 유전자의 전사를 하향 조절할 수 있다.
이와 동일한 기작에 의해 AGN 193109가 HL-60 세포 중의 조직 트란스글루타미나제(TGase) 유전자의 활성을 억제할 수 있다는 관찰을 설명할 수 있다. 염기쌍 5개 내지 7개에 의해 이격된 3개의 표준 레티노이드 절반 부위로 구성된 레티노이드 응답 인자는 이 유전자의 전사 조절 영역에서 동정되었다. TGase는 RXR 선택적 작동물질에 의해 유도될 수 있는 반면 RAR 선택적 작동물질에 대해서는 응답 반응하지 않는다. 이 TGase 레티노이드 응답 반응 인자는 RAR/RXR 이종이량체(Davies et al. in Press)에 의해 결합된다. 흥미로운 것은, AGN 193109가 RXR 작동물질에 의해 유도된 TGase 활성을 억제할 수 있다는 점이다. 이러한 AGN 193109 매개의 억제는 이종이량체의 RAR 성분에 대하여 NCP를 은폐시키고, 그 결과 결합된 RXR의 활성을 억제하는 상기 음성 호르몬의 작용으로 설명될 수 있다.
또한, 실시예 11에 기재된 것과 동일한 결과를, ERE-tk-Luc 리포터 플라스미드와 조합된 RAR-γ-VP-16 및 ER-RXR-α발현 작제물 대신에 RAR-γ-VP-16 발현 작제물과 ΔMTV-TREp-Luc 리포터 플라스미드를 사용하여 얻었다. 전술한 결과와 일치하듯이, ΔMTV-TREp-Luc 리포터에서의 RAR-γ-VP-16 활성이 AGN 193109에 의해 억제된다는 것을 발견하였다. 따라서, AGN 193109는 상기 키메라 수용체가 리포터 플라스미드의 프로모터 영역에 있는 에스트로겐 응답 인자에 간적 결합되는 대신 레틴산 수용체 응답 인자에 직접 결합되는 경우 RAR-γ-VP-16 활성을 억제하였다. 이와 같은 발견은 음성 호르몬 활성을 가진 제제를 동정하는 분석법이 특정 리포터 플라스미드를 사용해야 하는 것으로 제한될 필요가 없다는 것을 증명하는 것이다. 그 대신, 이 레티노이드 음성 호르몬을 동정하는데 유용한 실험 시스템이 특징으로 하는 중요한 특징은 구성적 전사 활성화 도메인을 포함하도록 조작된 RAR의 활성을 억제하는 화합물의 작용을 측정하는 단계를 포함한다는 점이다.
일반적으로, 레티노이드 음성 호르몬은 수용체의 DNA 결합 도메인에 대해 C 말단에 위치한 레티노이드 수용체 도메인을 최소한 포함하는 레티노이드 수용체 또는 키메라 수용체에 의한 직접 또는 간접 결합에 전사적으로 응답성인 리포터 유전자의 기본 발현율을 형질감염된 세포내에서 억제하는 레티노이드 화합물의 아군으로서 동정될 수 있다. 이 방법을 레티노이드 음성 호르몬을 동정하는데 유용한 선별 방법으로 변환시켰다. 본 발명의 선별 방법에 대한 각종 구체예에 있어, 음성 호르몬에 바람직한 수용체의 구조는 다양하다. 보다 구체적으로, 레티노이드 수용체는 RAR 또는 RXR 아형일 수 있다. 수용체는 경우에 따라 구성적 전사 활성인자 도메인을 포함하도로 조작될 수 있다. 음성 호르몬을 선별하는데 사용된 레티노이드 수용체는 경우에 따라 천연 수용체에 대해 내인성인 DNA 결합 도메인의 치환체로서 이종 DNA 결합 도메인을 포함하기도 한다. 하지만, 제2 수용체가 선별법에 사용되고, 음성 호르몬에 바람직한 레티노이드 수용체와 이량체화할 수 있다면, 레티노이드 수용체는 전사 조절 영역에 결합되는 제2 수용체와의 이량체화를 통해 리포터 유전자의 전사 조절 영역에 간접적으로 결합될 수 있기 때문에 DNA 결합 도메인을 요구하지 않을 수 있다.
선별 방법을 실시하는데 있어, 리포터의 기본 발현율을 억제하는 화합물의 작용은 일반적으로 시험관내 분석법으로 측정한다. 기본 발현율이란 외인적으로 첨가된 레티노이드 작동물질이 존재하지 않는 조건하에 형질감염된 세포에서 나타나는 리포터 발현의 기준율을 나타낸다. 경우에 따라, 시험관내에서 세포를 배양하는데 사용되는 혈청의 차콜 추출과 같은 절차를 통해 형질감염된 세포의 환경으로부터 내인성 레티노이드 리간드를 제거하는 단계를 실시할 수도 있다.
선별 방법에 유용한 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제, 베타 갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제 또는 면역화학 수단에 의해 검출될 수 있는 세포 표면 항원을 암호하는 유전자를 포함한다. 실제, 리포터 유전자의 성질은 이 방법을 작업성에 중요한 역할을 할 것으로 예상되지는 않는다. 하지만, 리포터 작제물의 전사 조절 영역은 음성 호르몬이 추구하는 전사 인자의 표적인 1종 이상의 시스 조절성 인자를 포함해야 한다. 예컨대, RAR 음성 호르몬을 동정하고자 하는 경우에, 리포터 작제물의 전사 조절 영역은 RAR 함유 단백질이 결합할 수 있는 시스 조절성 인자를 포함할 수 있다. 이 경우에는, 리포터 작제물의 전사 조절 영역의 시스 조절성 인자와 RAR의 DNA 결합 도메인 사이에 대응성이 있어야 한다. 따라서, 시스 조절성 에스트로겐 응답 인자에 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인과 구성적 전사 활성인자 도메인을 보유한 키메라 RAR이 선별 방법에 이용된다면, 이 리포터 작제물의 전사 조절 영역은 에스트로겐 응답 인자를 포함해야 한다.
리포터 분석법에 유용한 레티노이드 수용체(RARE)에 직접 결합하는 시스 조절 인자의 예는 본 발명에 참고 인용된 문헌[Mangelsdorf et al. in The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2nd edition, eds. Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York(1994)]에 개시되어 있다. 키메라 수용체에 간접적으로 결합하는 시스 조절 인자의 예로는 레티노이드 수용체에 결합된 DNA 결합 도메인으로 이루어진 키메라 수용체에 단백질의 DNA 결합 도메인이 병입될 수 있게 하는 임의의 DNA 결합 단백질에 대한 DNA 결합 부위를 포함한다. 키메라 수용체 중으로 유전자조작될 수 있고 이종 시스 조절성 인자를 인식하는 이종 DNA 결합 도메인의 구체적인 예로는 에스트로겐 응답 인자를 인식하는 것을 포함한다. 따라서, 선별법에 유용한 키메라 수용체의 레티노이드 수용체부는 레티노이드 수용체의 DNA 결합을 포함할 필요는 없으나 적어도 레티노이드 수용체의 리간드 결합 도메인은 포함해야 한다.
시스 조절 인자에 대한 간접 레티노이드 수용체 결합의 또 다른 예로는 시스 조절성 인자에 결합하여 레티노이드 수용체와 이량체화할 수 있는 단백질의 사용을 포함한다. 이 경우에, 레티노이드 수용체는 단지 DNA 결합에 주요 역할을 하는 단백질과의 결합에 의해 시스 조절성 인자와 결합한다. 이러한 시스템의 일 예로는 RAR과의 이량체화에 주요 역할을 하는 RXR의 도메인을 최소한 포함하고 RXR에 융합되는 이종 DNA 결합 도메인으로 구성된 융합 단백질의 이용을 포함한다. 동시도입된 RAR은 시스 조절 인자에 결합된 상기 융합 단백질과 이량체화할 수 있다. 따라서, 본 발명자는 시스 조절 인자와 RAR을 간접 결합시키기 위하여 RAR과 이량체화하는 모든 시스 조절 인자 결합 단백질은 음성 호르몬 선별법에 사용하기에 적합하다고 생각한다.
선별법의 바람직한 구체예에서, 레티노이드 음성 호르몬은 기준 활성을 증가시킨 유전자조작된 RAR 전사 인자의 기준 발현을 억제하는 레티노이드로 동정한다. 선별법의 작업성에 중요한 것은 아니지만, 다음 실시예에 이용되는 유전자조작된 RAR은 구성적 전사 활성화 도메인을 포함한다. 이 키메라 수용체의 사용은 레티노이드 무첨가하에 리포터 유전자의 기준 발현을 상승시킬 수 있는 수단을 제공한다는 점에서 유리하다. 본 발명에서는 전술한 절차에 순간 형질감염을 사용하였지만 키메라 수용체를 구성적으로 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주가 선별법에 유용할 것이다.
다음 실시예에 개시되는 바와 같이, 구성적 전사 활성인자 도메인을 가진 키메라 레티노이드 수용체는 에스트로겐 응답성 시스 조절 인자에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하도록 유전자 조작된 제2 수용체와 이종이량체화할 수 있다. 이 경우, 구성적 전사 활성인자 도메인을 가진 키메라 레티노이드 수용체는 DNA 표적 서열에 결합하는 제2 수용체에 대한 결합을 통해 리포터 유전자 발현을 간접적으로 조절하는 시스 조절 영역과 결합한다. 보다 구체적으로, 제2 수용체는 에스트로겐 응답 인자를 인식하는 DNA 결합 도메인을 포함하도록 유전자 조작하였다. 에스트로겐 응답 인자를 상류 프로모터 영역에 가진 리포터 유전자는 구성적 전사 활성인자 도메인을 가진 형질감염된 키메라 수용체의 부재하에서 레티노이드 작동물질과 응답반응하지 않기 때문에 바람직하다. 즉, 모든 리포터 유전자 활성은 형질감염된 수용체에 의한 것이다. 이와 같은 에스트로겐 응답 인자 DNA 결합 도메인과 에스트로겐 응답 인자 시스 조절 인자의 조합 사용은 단지 구체적으로 예시한 것으로, 당업자라면 비RARE 시스 조절 인자에 대해 특이성이 있는 기타 다른 유전자 조작된 수용체의 조합도 본 발명의 선별법에 유용하다는 것을 충분히 이해할 것이다.
선별법에 유용한 세포는 형질감염될 수 있는 진핵세포이다. 이 세포는 인간, 영장류 또는 설치류 세포와 같은 동물 세포일 수 있다. 본 발명자는 CV-1 세포를 사용하여 매우 우수한 결과를 얻었지만 기타 다른 배양 세포주 역시 성공적으로 사용할 수 있다는 것은 자명한 것이다. 구성적 전사 활성인자 도메인을 가진 키메라 레티노이드 수용체를 암호하는 발현 작제물의 도입에는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 통상적인 형질감염법을 사용할 수 있다.
구성적 전사 활성인자 도메인은 중성 pH 조건하에서 음전하를 나타내어 총괄적으로 산성을 띠는 복수의 아미노산으로 구성한다. 예컨대, 구성적 전사 활성인자 도메인은 바이러스 전사 인자에서도 발견되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구성적 전사 활성인자 도메인을 가진 바이러스 전사 인자의 일예는 헤르페스 단순 바이러스 16이다. 하지만, 다른 바이러스 또는 합성 전사 활성인자 도메인 역시 구성적 전사 활성인자 도메인을 가진 키메라 레티노이드 수용체를 암호하는 발현 작제물의 제작에 유용할 것이다.
하기 기재되는 바와 같이, 본 발명자는 레티노이드 음성 호르몬을 동정하는데 유용한 일반 선별법을 개발하였다. 이 선별법은 음성 호르몬과 단순한 길항물질을 구별하는 수단을 제공한다. 표 12는 RAR-γ에 대해 여전히 강력한 친화성을 나타내는 ATRA를 제외한 여러 레티노이드 화합물이 순간 동시형질감염 활성화전달 분석에서 상기 수용체를 활성화전달하지 못한다는 것을 개시하고 있다. 따라서, 이 화합물들이 RAR-γ길항물질인지, 그리고 이 길항물질 중에서 음성 호르몬 활성을 나타내는 화합물이 존재하는지를 조사하기 위하여 화합물들을 시험하였다.
이하, 실시예 12는 길항물질이고, 또한 음성 호르몬 활성을 나타내는 길항물질의 아군인 레티노이드 화합물을 동정하는데 사용되는 방법에 관한 것이다.
실시예 12
레티노이드 음성 호르몬 분석
CV-1 세포 4 x 104을 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989]에 기재된 인산칼슘 동시침전 기법에 따라 ERE-tk-Luc 루시퍼라제 리포터 플라스미드 0.5 ㎍, ER-RAR-γ키메라 리포터 발현 플라스미드 0.1 ㎍[Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554(1991)]을 사용하여 형질감염시켰다. 18 시간이 경과한 후 세포를 PBS로 세정하고, 활성 차콜로 추출된 10% FBS(Gemini Bio-Products) 함유의 DMEM(Gibco-BRL)을 첨가하였다. 이 세포에, 에탄올 중의 10-8 M ATRA나 에탄올 단독물을 첨가하여 처리하고, 첨가시 ATRA 처리 세포는 표 12에 기재된 화합물 10-9, 10-8, 10-7 또는 10-6 M로 처리하였다. 18 시간 후, 세포를 PBS로 세정하고, 0.1M KPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA를 사용하여 용해시켰다. 루시퍼라제 활성을 문헌[de Wet, et al. in Mol.Cell.Biol 7:725(1987)]에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
화합물 RAR-γ에서의 Kd(nM)a RAR-γ에서의 EC50(nM)b
ATRA 12 17
AGN 193109(화합물 60) 6 na
AGN 193174(화합물 34a) 52 na
AGN 193199 30 na
AGN 193385(화합물 23) 25 na
AGN 193389(화합물 25) 13 na
AGN 193840 40 na
AGN 193871(화합물 50) 30 na
a : 바큘로바이러스 발현성 RAR-γ에 대한 3H-ATRA 결합 경쟁으로 측정하고 쳉-프루소프 식에 따라 결정된 상대적 친화도(Kd)b : ΔMTV-TREp-Luc 및 RS-RAR-γ로 순간 동시형질감염시킨 CV-1 세포에서 측정된 EC50. "na"는 활성이 없음을 표시한 것이다.
표 12와 도 7에 부분적으로 제시한 결과를 통해 알 수 있듯이, ATRA를 제외한 표 12에 기재된 모든 화합물은 RAR-γ에 대해 레티노이드 길항물질이었다.
표 12에서 확인된 RAR-γ길항물질을, 그 다음 레티노이드 음성 호르몬인지를 측정하기 위하여 선별하였다. CV-1 세포 4 x 104을 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989]에 기재된 인산칼슘 동시침전 기법에 따라 ERE-tk-Luc 루시퍼라제 리포터 플라스미드 0.5 ㎍, ER-RXR-α키메라 발현 플라스미드 0.1 ㎍[Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554(1991)] 및 RAR-γ-VP-16[Nagpal et al. EMBO J. 12:2349(1993)] 0.2 ㎍을 사용하여 형질감염시켰다. 18 시간이 경과한 후 세포를 PBS로 세정하고, 활성 차콜로 추출된 10% FBS(Gemini Bio-Products) 함유의 DMEM(Gibco-BRL)을 첨가하였다. 세포는 표 12에 기재된 화합물 10-9, 10-8, 10-7 또는 10-6 M로 처리하였다. 음성 대조군은 에탄올 부형제만을 처리하였다. 18 시간 후, 세포를 PBS로 세정하고, 0.1M KPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA를 사용하여 용해시켰다. 루시퍼라제 활성을 문헌[de Wet, et al. in Mol.Cell.Biol 7:725(1987)]에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 표 12의 레티노이드 길항물질은 RAR-γ-VP-16 키메라 레티노이드 수용체의 구성적 전사 활성화 기능에 미치는 효과에 따라 2군으로 분리할 수 있다. 제1 군은 AGN 193174, AGN 193199 및 AGN 193840을 포함하는 것으로, ATRA 길항물질이더라도 RAR-γ-VP-16 활성을 억제하지 못하였다. 이와 반대로, AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 및 AGN 193871은 RAR-γ-VP-16 구성적 활성의 용량 의존적 억제를 나타내었다. 따라서, 두 군의 화합물은 RAR-γ길항물질이지만, 제2 군의 화합물만이 음성 호르몬 활성을 나타내었다. 이 분석법은 단순 레티노이드 길항물질과 레티노이드 음성 호르몬을 구별할 수 있어 유리하다.
이 실험 결과는 AGN 193109가 음성 호르몬을 나타내는 기준을 충족시킨다는 것을 입증하였다. 보다 구체적으로, 실시예 11에 제시된 결과는 AGN 193109가 외인성 레티노이드 리간드의 무첨가하에서도 RAR에 대하여 억제 활성을 발휘하는 작용이 있음을 증명하는 것이다. 이 화합물 자체는 ATRA 및 AGN 191183과 같은 작동물질과 RAR 간의 상호작용의 차단에 따라 좌우되지 않는 생물학적 활성을 갖고 있다. 이와 같은 발견으로부터 AGN 193109가 RAR과 NCP 간의 상호작용을 안정화시킨다는 결론을 얻었다. 도 9에 도시된 바와 같이, NCP/RAR/PCP 상호작용은 평형 상태로 존재한다. 작동물질은 PCP 상호작용을 증가시키고 NCP 상호작용을 감소시키는 반면, 역작동물질이나 음성 호르몬은 NCP를 안정화시키고 PCP 상호작용을 감소시킨다. 전술한 바와 같이, 본 실험 결과는 기타 다른 수용체에 대한 NCP의 세포내 유효성이 AGN 193109 투여에 의해 조정될 수 있다는 것을 암시한다. 보다 구체적으로 설명하면, AGN 193109가 RAR과 NCP의 복합체화를 촉진하여, RAR 이외의 다른 전사 인자와의 상호작용에 유효한 NCP의 세포내 저장물을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
이어서, AP-1 의존적 유전자 발현의 작동물질 매개 억제 작용에 대한 AGN 193109의 효과를 조사하였다. 문헌[Endocr.Rec.14:651(1993)]에서 Pfhal은 레티노이드 작동물질이 AP-1 활성의 억제에 관여하는 기작에 의해 유전자 발현을 하향 조절할 수 있다는 것을 개시하였다. 본 발명자는 AP-1 활성을 측정하기 위해 고안된 모델 시스템에서 레티노이드 작동물질과 함께 사용하였을 때 AGN 193109가 2가지 효과를 나타내는 것으로 추정하였다. 첫째, AGN 193109는 아마도 작동물질의 효과에 대해 길항작용하여 AP-1 활성의 작동물질 의존적 억제를 감소시킬 수 있다. 또는, AGN 193109는 작동물질의 활성을 증강시켜 작동물질 의존적 AP-1 활성의 억제를 확대시킬 수 있다.
실시예 13은 AGN 193109가 레티노이드 작동물질의 항AP-1 활성을 증강시킴을 증명하는데 사용된 방법에 대한 것이다. 하기 기재되는 바와 같이, AGN 191183 레티노이드 작동물질은 AP-1 의존적 유전자 발현을 약하게 억제하였다. AGN 193109와 레티노이드 작동물질의 혼합물은 AP-1 의존적 유전자 발현을 강하게 억제하였다. AGN 193109 자체는 항AP-1 활성을 거의 나타내지 않았다.
실시예 13
레티노이드 작동물질의 항AP-1 활성을 증강시키는 AGN 193109
HeLa 세포를 LIPOFECTAMINE(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 문헌[Giguere et al. in Nature 33:624(1987)]에 기재된 플라스미드 pRS-hRARα0.2 ㎍ 및 Str-AP1-CAT 리포터 유전자 작제물 1 ㎍으로 형질감염시켰다. Str-AP1-CAT는 래트 스트로멜리신-1 프로모터[Matrisian et al., Mol.Cell.Biol. 6:1679(1986)]의 위치 -84 내지 +1에 해당하는 DNA 단편을 pBLCAT3[Luckow et al., Nucl.Acids Res. 15:5490(1987)]의 HindIII-BamHI 부위 사이에 클로닝하여 제조하였다. 이 스트로멜리신-1 프로모터의 서열은 유일한 인헨서 인자로서 AP1 모티프를 포함한다[Nicholson et al., EMBO J. 9:4443(1990)]. 이 프로모터 서열은 하기 서열을 가진 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 제조하였다.
5'-AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGGGTGACTCTGCAAATACTGCCACTCTATAAAAGTTGGGCTCAGAAAGGTGGACCTCGAGGATCCAG-3'(서열 번호 2) 및
5'-CTGGATCCTCGAGGTCCACCTTTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATTTGCAGAGTCACCCGCAAACTGACTCATAATTGCTTCCATAAGCTTCT-3'(서열 번호 3).
형질감염, 적당한 화합물로의 처리 및 CAT 활성의 측정을 비롯한 실험을 본 발명에 참고인용되는 문헌[Nagpal et al. in J.Biol.Chem.270:923(1995)]에 기재된 바와 같이 실시하였다.
이 실험 결과, AGN 193109가 레티노이드 작동물질인 AGN 191183의 항AP-1 활성을 증강시킨다는 것을 알 수 있었다. 보다 구체적으로 설명하면, 10-12 내지 10-10 M 농도 범위에서 AGN 191183은 TPA 유도 Str-AP1-CAT 발현을 억제하지 못하였다. 10-10 내지 10-8 M 범위의 AGN 193109로 처리하여도 AP-1 매개의 리포터 활성을 실질적으로 억제하지 못하였다. 하지만, 도 10에 제시된 결과는 AGN 193109(10-8M)와 10-12 내지 10-10M 범위의 AGN 191183을 혼합한 혼합물로 형질감염체를 자극하면 TPA 유도성 Str-AP1-CAT 발현이 12% 내지 21% 정도 실질적으로 억제된다는 것을 시사한다. 따라서, AGN 193109는 이 레티노이드 작동물질이 보통 AP-1 활성을 억제하지 못하는 조건하에서 AGN 191183의 항AP-1 활성을 증강시킨다.
본 발명자는 AGN 193109가 아마도 RAR 상에 NCP를 AGN-193109 의존적으로 격리시키는 것과 관련된 기작에 의해 작동물질 매개의 AP-1 활성의 억제를 증강시키는 것으로 추정하였다. RAR은 1,25-디히드록시비타민 D3, 글루코코르티코이드, 티로이드 호르몬, 에스트로겐 및 프로게스테론에 대한 수용체를 포함하는 핵 수용체의 초과에 속한다. 따라서, NCP에 대한 결합능이 핵 수용체 초과의 여러 구성원간에 공유될 수 있다는 추정은 합리적인 것이다. 이에 따라, AGN 193109가 핵 수용체의 초과와 상호작용하는 1종 이상의 리간드의 항AP-1 활성을 증강시킬 수 있는지 조사하였다.
상기 실시예에 제시된 결과를 통해 명백히 알 수 있는 것은, AGN 193109가 레티노이드 작동물질의 항AP-1 활성을 증강시킨다는 것이다. 보다 구체적으로 설명하면, AGN 193109는 AGN 191183의 항AP-1 활성을 검출할 수 있는 한계 투여량을 감소시켰다. AGN 193109 자체는 본래 항AP-1 활성이 거의 없는 바, 이러한 핵 수용체 작동물질에 미치는 효과는 상승작용적인 것이다. 또한, AGN 193109 음성 호르몬이 비타민 D3 수용체의 천연 리간드인 1,25-디히드록시비타민 D3의 항AP-1 활성을 증강시킨다는 것도 발견하였다.
상기 실시예에서 관찰된 AGN 193109와 AGN 191183 간의 상승작용은 레티노이드 작동물질의 항AP-1 활성과 이 활성의 AGN 193109 매개의 증강 작용이 다른 기작에서 얻어져야 한다는 것이 필연적임을 암시하였다. 이 두 제제의 작용 기작이 동일하다면 AGN 193109와 작동물질의 조합에 의해 얻어지는 효과는 첨가 효과일 것이다. 그러나, 조합은 어떤 제제 단독에 의해서 얻어지는 것보다 큰 효과를 나타내었는데, 이 효과는 이러한 발견 전에는 예상치도 못한 것이었다.
중요한 것은, AGN 193109 매개의 RAR 작동물질의 증강작용이 레티노이드 작동물질보다 약 100배 이상의 몰 농도로 AGN 193109를 사용하여 실시되었다는 점이다. 따라서, 대부분의 RAR은 AGN 193109와 결합하고 남은 극소수의 RAR 만이 작동물질에 결합할 수 있다. 이와 같은 사실에도 불구하고, AGN 193109에 의해 결합되지 않은 RAR 군은 레티노이드 작동물질에 결합하여 리포터 유전자 발현의 억제 작용으로 측정할 수 있는 작동물질 의존적 응답 반응을 강력하게 자극할 수 있었다. 따라서, 이러한 데이터가 암시하는 것은 AGN 193109에 의해 유도되는 RAR이 이종원성일 가능성이 있다는 것이다.
RAR과 NCP의 상호작용을 촉진시키는 작용에 의해 나타나는 AGN 193109의 음성 호르몬 활성은 AGN 193109와 레티노이드 작동물질 간에 나타나는 상승작용을 이해할 수 있게 하였다. 본 실험의 결과는 세포를 AGN 193109로 처리하면 RAR과 NCP의 결합을 촉진시키고, 이에 따라 세포내 유리 RAR과 유리 NCP의 수가 감소하는 모델과 완전히 일치하였다. 따라서, 기능적으로 상이한 2군의 RAR을 생성하였다. 제1군은 NCP에 결합된 RAR을 대표로 한다. 이와 같은 AGN 193109/RAR/NCP 복합체는 레티노이드 작동물질에 의해 활성화될 수 없다. 제2군은 NCP에 결합되지 않고, 작동물질과의 상호작용을 위해 남아있는 RAR로 이루어진다. 이 제2군은 NCP가 실질적으로 없는 환경에 존재하는 유리 RAR을 나타내기 위하여 "RAR*"이라고 표시한다.
RAR*은 평형 결합을 통해 NCP에 결합할 가능성은 감소되어 있고, 예컨대 항AP-1 활성처럼 레티노이드 작동물질에 대한 감수성은 측정가능할 정도로 증가되어 있다. 이러한 이유는 NCP의 세포내 저장물이 AGN 193109 투여에 의해 고갈되는 반면 PCP 저장물은 고갈되지 않기 때문이다. 따라서, 유리 RAR은 레티노이드 작동물질에 결합하여 NCP가 실질적으로 고갈된 환경에서 PCP 인자와 상호작용할 수 있다. 또한, 기타 다른 핵 수용체의 각각의 작동물질에 대한 감수성을 증가시키는 AGN 193109의 작용도 AGN 193109/RAR 복합체와 상호작용하는 것과 같은 RAR과 상기 기타 다른 핵 수용체가 상호작용하는 성질이 있기 때문이다. 이와 같은 핵 수용체과의 구성원들이 나타내는 AGN 193109 매개의 NCP 유효성의 조정에 관한 모델은 도 11에 개략적으로 도시하였다.
이 조직적 모델을 통해 AGN 193109가 레티노이드 작동물질 이외의 다른 핵 수용체 리간드의 활성도 조정할 수 있을 것으로 추정하게 되었다. 이하, 실시예를 통해 예시되듯이 본 발명자는 AGN 193109가 시험관내 활성화 전달 분석에서 1,25-디히드록시비타민 D3의 활성을 증강시키는 것을 확인하였다.
실시예 14는 활성화 전달 분석에서 AGN 193109가 1,25-디히드록시비타민 D3의 활성을 증강시키는지를 증명하는데 사용된 방법에 대한 것이다.
실시예 14
1,25-디히드록시비타민 D3 활성을 증강시키는 AGN 193109
문헌[Felgner et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413(1987)]에 기재된 양이온성 리포좀 매개의 형질감염법을 사용하여 Hela 세포를 형질감염시켰다. 세포 5 x 104을 12웰 다중웰 평판에 평판배양하고 10% FBS를 보충한 DMEM에서 증식시켰다. 이 세포를 웰 당 DNA의 최종 농도가 1.0 ㎍가 되게 하는 캐리어 DNA로서 플라스미드 pGEM3Z(파마시아 인크.) 0.3 ㎍ 및 리포터 플라스미드 ΔMTV-Luc[Heyman et al. in Cell 68:397(1992)]에 결찰시킨 마우스 오스테오폰틴 유전자[Ferrara et al. J.Biol.Chem. 269:2971(1994)] 유래의 1,25-디히드록시비타민 D3 응답 인자 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3'(서열 번호 4)을 2 카피 포함하는 리포터 플라스미드 MTV-VDRE-Luc 0.7 ㎍과 함께 LIPOFECTAMINE 시약(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 무혈청 배지에서 동시형질감염시켰다. 형질감염 6 시간 후, 세포에 차콜 추출된 FBA를 최종 농도 10%로 포함하는 증식 배지를 주입하였다. 형질감염 18 시간 후, 세포를 부형제 단독(에탄올) 또는 에탄올 중에 최종 농도가 10-8 내지 10-7 M인 AGN 193109로 처리하였다. 6 시간 후, 1,25-디히드록시비타민 D3를 에탄올 중에 최종 농도가 10-10 내지 10-7 M이 되게 첨가하였다. 1,25-디히드록시비타민 D3 처리후 18 시간이 경과하여 세포를 수거하여 용해시켰다. 루시퍼라제 활성은 전술한 바와 같이 측정하였다. 이 실험 시스템은 1,25-디히드록시비타민 D3-의존적 유전자 발현을 모니터하고 정량하는 통상적인 방법을 제공하였다.
도 12에 제시한 결과는 1,25-디히드록시비타민 D3을 단독으로 사용하여 얻은 결과에 비해 1,25-디히드록시비타민 D3과 함께 AGN 193109를 동시투여하면 용량 응답 곡선이 좌측으로 이동한다는 것을 나타내었다. 이를 통해 AGN 193109가 시험관내 활성화 전달 분석에서 1,25-디히드록시비타민 D3의 효과를 증강시킨다는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, 도 12에는 10 내지 100 nM 만큼 낮은 농도의 AGN 193109가 1,25-디히드록시비타민 D3을 약 10배 더 활성화시킨다는 것을 그래프로 도시하였다. 즉, 약 2,000 rlu의 루시퍼라제 발현율을 생성하기 위해서는 1,25-디히드록시비타민 D3이 10-8M 필요하지만 이 비타민을 10-8 내지 10-7M 농도의 AGN 193109와 함께 동시투여하면 동일한 루시퍼라제 발현율을 얻기 위해 상기 1,25-디히드록시비타민 D3 농도의 1/10 정도만이 필요한 것이다. 도 12에 그래프로 도시하지는 않았지만, AGN 193109를 10-9 내지 10-8M 사용한 경우에도 실질적으로 동일한 결과가 얻어졌다. 따라서, AGN 193109와의 동시투여는 음성 호르몬의 부재하에 유사한 효과를 얻는데 필요한 1,25-디히드록시비타민 D3의 양을 실질적으로 감소시켰다.
흥미로운 것은, 비타민 D 수용체(VDR) 발현 플라스미드를 동시형질감염시켜 상기 절차를 반복하면 1,25-디히드록시비타민 D3의 활성을 증강시키는 AGN 193109의 작용이 동시에 감소한다는 점이다. 이러한 결과는 VDR의 과잉발현이 1,25-디히드록시비타민 D3의 활성을 증강시키는 AGN 193109의 작용에 영향을 미칠 수 있음을 나타내는 것으로 추정하였다. 따라서, 조직 특이적 방식으로 상이할 수 있는 리간드 수용체의 세포내 농도는 수용체에 결합하는 리간드의 활성을 증강시키는 AGN 193109의 작용에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 다시 적정성 NCP가 비타민 D3 응답 반응의 조절에 기여한다는 모델과 일치하며 전술한 모델군을 지지하였다.
이하 실시예에 예시되듯이, 본 발명자는 AGN 193109가 1,25-디히드록시비타민 D3의 항AP-1 활성을 증강시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 관찰을 설명하는 AGN 193109 작용의 활성에 대한 모델에서 NCP는 이 약물의 존재하에 RAR에 강력하게 결합하는 것으로 나타났다. HeLa 세포에 존재하는 내인성 비타민 D 수용체는 1,25-디히드록시비타민 D3 리간드에 대해 보다 큰 감수성을 나타내는 것으로 추정되는데, 이것은 Str-AP1-CAT 리포터로부터 발현을 억제하는 상기 리간드의 작용을 확대시킨 결과이다.
실시예 15는 AGN 193109가 1,25-디히드록시비타민 D3의 항AP-1 활성을 증강시키는지 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다.
실시예 15
1,25-디히드록시비타민 D3의 항AP-1 활성을 증강시키는 AGN 193109
문헌[Nagpal et al. in J.Biol.Chem. 270:923(1995)]에 기재된 방법에 따라 LIPOFECTAMINE을 사용하여 Str-AP1-CAT 1㎍으로 HeLa 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 AGN 193109 단독물(10-9 내지 10-7M), 1,25-디히드록시비타민 D3 단독물(10-12 내지 10-7M) 또는 AGN 193109 10-8M 존재하의 1,25-디히드록시비타민 D3(10-12 내지 10-7M)로 처리하였다.
이 실험 결과, AGN 193109가 TPA 유도성 AP-1 활성을 억제하는 1,25-디히드록시비타민 D3의 작용을 증강시키는 것을 나타났다. AGN 193109는 10-9 내지 10-7M 범위로 단독으로 사용하는 경우 검출가능한 항AP-1 활성을 나타내지 않았다. 도 13에 제시된 결과는 1,25-디히드록시비타민 D3이 10-8 내지 10-7M의 농도 범위에서만 TPA 자극된 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 10-8M AGN 193109의 존재하에 TPA 자극된 CAT 활성의 1,25-디히드록시비타민 D3 매개 억제에 대한 분석 결과, 항AP-1 활성이 10-10 내지 10-9M의 1,25-디히드록시비타민 D3에서 검출되고 1,25-디히드록시비타민 D3을 단독으로 처리한 경우보다 10-8 내지 10-7M 용량에서의 활성이 증가되는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 1,25-디히드록시비타민 D3 매개의 항AP-1 활성에 대한 AGN 193109 의존적 조정 현상은 RAR에 NCP를 격리시켜 NCP가 다른 핵 수용체계 구성원과 상호작용하지 못하게 한 모델과 일치하였다. 따라서, 이 수용체는 1,25-디히드록시비타민 D3 처리에 의해 더욱 감수성이 높아진다.
RAR 매개의 활성화 전달 작용과 항AP-1 활성을 구성하는 기작은 아마도 상이할 것이다. 이와 같은 결론은 AGN 193109를 다량으로 투여하면 항AP1 활성을 실질적으로 억제함이 없이 활성화전달 작용을 완전하게 억제한다는 관찰로부터 얻어진 것이다. 따라서, AGN 193109 처리에 의해 RAR* 형성이 매개되는지에 관한 모델을 지지하는 추가 증거를 얻어야 했다. 이를 얻기 위하여 AGN 193109가 시험관내 활성화 전달 분석법에서 RAR 특이적 작동물질 AGN 191183의 활성을 증강시킬 수 있는지 조사하였다.
이하, 실시예 16은 RAR 특이적 작동물질인 AGN 191183의 활성을 AGN 193109가 증강시키는지 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다. 이 실험 결과, 특정 환경하에서 AGN 193109가 RAR 특이적 레티노이드의 효력을 증가시키고 AGN 193109가 RAR* 형성을 촉진시킨다는 강력한 증거를 제공한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 16
AGN 193109 동시투여에 의한 레티노이드 효과의 증강
문헌[Felgner et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413(1987)]에 기재된 양이온성 리포좀 매개의 형질감염법을 사용하여 Hela 세포를 형질감염시켰다. 세포 5 x 104을 12웰 다중웰 평판에 평판배양하고 10% FBS를 보충한 DMEM에서 증식시켰다. 이 세포를 RAR-γ 발현 플라스미드 pRShRAR-γ[Ishikawa et al. Mol.Endocrinol. 4:837(1990)] 0.1 ㎍ 및 리포터 플라스미드 ΔMTV-Luc[Heyman et al. in Cell 68:397(1992)]에 삽입시킨 TREpal 응답 인자 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3'(서열 번호 5)을 2 카피 포함하는 리포터 플라스미드 MTV-TREp-Luc 0.7 ㎍과 함께 LIPOFECTAMINE 시약(2 ㎍/웰, Life Technologies, Inc.)을 사용하여 무혈청 배지에서 동시형질감염시켰다. 형질감염 6 시간 후, 세포에 차콜 추출된 FBS를 최종 농도 10%로 포함하는 증식 배지를 주입하였다. 형질감염 18 시간 후, 세포를 부형제 단독(에탄올) 또는 에탄올 중에 최종 농도가 10-11 내지 10-8 M인 AGN 193109로 처리하였다. 6 시간 후, AGN 191183을 에탄올 중에 최종 농도가 0, 10-10 또는 10-9 M이 되게 첨가하였다. AGN 191183으로 18 시간 처리한 후 세포를 수거하여 전술한 바와 같이 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
예비 실험 결과, 10-9M AGN 193109가 HeLa 세포에서 10-9M AGN 191183의 응답 반응을 억제하는데 비교적 비효과적인 것으로 나타났다. 이 결과는 CV-1 세포 중에서 10-8 M ATRA를 억제하는 10-9M의 AGN 193109의 작용과 대조적인 것이었다(도 2).
도 14에 제시된 결과는 AGN 193109가 RAR*의 형성을 자극할 것이라는 것을 추정을 지지하였다. AGN 193109의 길항작용 및 음성 호르몬 활성의 특성과 일치되게 AGN 193109로의 처리는 2상 용량 응답 곡선을 나타내었다. 최소 용량의 AGN 193109(10-11 내지 10-10M)는 AGN 191183 단독 투여시보다 우수한 루시퍼라제 활성 자극 효과를 나타내었다. 이 효과는 RAR*이 AGN 193109에 의해 생성된다는 것을 암시한다. 흥미로운 것은, 이 효과가 또 AGN 193109 단독 처리시 관찰된다는 점인데, 이것은 RAR*이 내인성 리간드에 응답반응할 수 있음을 암시한다. AGN 191183은 합성 레티노이드 작동물질로서, ATRA와 같이 RAR을 통해 전사를 활성화시킨다. 실시예 7에서 ATRA 대신에 AGN 191183을 사용하면 정량적으로 유사한 결과가 얻어질 것이다(즉, AGN 193109는 10nM AGN 191183의 효과에 길항작용할 것이다.) 실시예 16은 AGN 193109가 RAR 작동물질의 길항물질로서 작용할 수 있고, AGN 193109의 동시투여로 RAR 작동물질에 의해 매개되는 활성화를 증강시키는 용량 조건을 용이하게 확인할 수 있다는 것을 예시한 것이다. 중요한 것은, 실시예 16에 사용되는 화합물의 용량이 실시예 7에 기재된 실험에 사용되는 용량 보다 실질적으로 적다는 점이다. 본 발명자는 AGN 193109의 처리가 RAR 이종원성 RAR 대 RAR*을 유도할 수 있다고 제안하였다. 이러한 뚜렷한 이종원성(즉, 증강시키는 작용)은 활성화 전달 작용 대 AP-1 억제 작용에 있어 상이한 윈도우를 나타낸다. 곡선이 이상인 이유는 AGN 193109의 양이 증가함에 따라 작동물질에 결합할 수 있는 RAR이 비례적으로 적어지기 때문이다. 이것은 AP-1 억제 작용의 경우에는 뚜렷하지 않은 바, 이러한 차이가 동일한 수용체 종에 의한 AP-1 억제와 활성화 전달에 관한 2가지 상이한 기작을 반영하는 것임을 고찰해야 하였다.
임상 실험을 통해 일부 레티노이드가 전암성 및 악성 경부 병변의 성장을 억제하는데 유용하다는 것을 확인하였다. 이러한 결론을 지지하는 연구에 대해서는 문헌[Graham et al. in West.J.Med. 145:192(1986), Lippman et al. in J.Natl.Cancer Inst. 84:241(1992) 및 Weiner et al. in Invest. New Drugs 4:241(1986)]에 공개되어 있다.
또한, 배양 세포를 사용하여 각종 레티노이드의 증식억제 효과를 정량하는 시험관내 연구 결과를 통해서도 유사한 결론이 얻어졌다. 보다 구체적으로 설명하면, 문헌[Agarwal et al. in Cancer Res. 51:3982(1991)]에서는 경부 이형성의 조기 단계를 모델화하는데 ECE16-1 세포주를 이용하여, 레틴산이 상피 성장인자(EGF) 의존적 세포 증식을 억제할 있음을 입증하고 있다.
이하, 실시예 17은 AGN 193109가 ECE16-1 세포주의 증식을 억제하는 AGN 191183 레티노이드 작동물질의 활성에 길항작용할 수 있는지를 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다.
실시예 17
ECE16-1 세포 중에서 레티노이드의 증식억제 효과에 길항작용하는 AGN 193109
ECE 16-1 세포를 DMEM:F12(3:1), 비필수 아미노산, 5% FBS, 5㎍/㎖ 트란스퍼라제, 2nM의 3,3',5 트리요오도티로닌(티로이드 호르몬 또는 "T3"), 0.1 nM 콜레라 독소, 2mM L-글루타민, 1.8 x 10-4M 아데닌 및 10ng/㎖ EGF를 함유하는 완전 배지에 1 x 104세포/㎠의 밀도로 파종하였다. 세포를 하룻밤 동안 평판에 부착시킨 다음, DMEM:F12(3:1), 2mM L-글루타민, 비필수 아미노산, 0.1% 소 혈청 알부민, 1.8 x 10-4M 아데닌, 5 ㎍/㎖ 트란스페린, 2nM T3, 아스코르브산 50 ㎍/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 페니실린 100 유닛/㎖ 및 젠타마이신 50 ㎍/㎖을 함유하는 제한 배지로 이식하였다. 제한 배지(DM)에 EGF 10ng/㎖을 보충하였다. EGF 처리된 세포에 1000 nM AGN 193109 단독물 또는 AGN 193109 0 nM, 0.1 nM, 1.0 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1000 nM과 조합한 AGN 191183 레티노이드 작동물질 10 nM을 투여하였다. 3일간 처리한 후, 세포를 문헌[Hembree et al. in Cancer Res. 54:3160(1994)]에 기재된 바와 같이 수거하고 세포수를 COULTER 계수기로 측정하였다.
도 15에 제시된 결과를 통해 알 수 있듯이, ECE16-1 세포는 제한 배지 단독에 의해서가 아닌 EGF에 대한 응답 반응으로 증식하는 것으로 나타났다. 이것은 문헌[Andreatta-van Leyen et al. in J.Cell.Physio. 160:265(1994) 및 Hembree et al. in Cancer Res. 54:3160(1994)]에 의해 공개된 바 있는 발견을 확인시켜 주었다. 10 nM의 AGN 191183과 0 nM의 AGN 193109는 EGF 매개의 증식을 완전하게 억제시켰다. 따라서, AGN 191183은 강력한 증식억제 레티노이드이다. AGN 193109의 농도를 0 nM에서 10 nM로 증가시키면 AGN 191183 매개의 증식 억제 작용에 약 50% 정도 길항작용하였다. AGN 193109를 10배 과량의 몰량으로 사용하면 AGN 191183의 증식억제 효과를 완전하게 역전시켰다. 1000 nM AGN 193109 단독물에 의한 세포 처리는 EGF 매개의 증식 증가에 어떤 영향도 미치지 않았다. 이와 같은 결과는 AGN 193109가 AGN 191183과 같은 레티노이드에 의한 증식 억제에 감수성인 경부 상피를 대표하는 세포 처리에 사용되는 경우, 레티노이드의 증식억제 효과에 길항작용은 하지만, 본래의 증식억제 활성은 거의 나타내지 않음을 입증하는 것이었다. 주목할만한 것은, AGN 193109가 ECE16-1 모델 시스템을 사용한 경우 AGN 191183 작동물질의 증식억제 활성을 증강시키는 어떤 증거도 나타내지 않는다는 점이다.
ECE16-1 세포주로 실험한 모델 시스템과 대조적으로, 경부 이형성과 관련된 세포 증식이 레티노이드 작동물질에 의해 억제될 수 없다는 다른 예가 있다. 예컨대, 문헌[Agarwal et al. in Cancer Res. 54:2108(1994)]은 레티노이드 요법에 무응답성인 경부 종양의 모델로서 CaSki 세포의 이용에 관해 기재하고 있다. 하기 기재되는 바와 같이, 레티노이드 처리는 세포 증식을 억제하지 않고 CaSki 세포의 증식율에 거의 영향을 미치지 않았다. 다음 실시예는 이 세포주의 증식율에 미치는 AGN 193109 음성 호르몬의 효과에 대한 것이다. 이 실험의 결과는 놀랍게도 AGN 193109가 레티노이드 작동물질의 증식억제 효과에 무응답성인 경부 종양 세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
이하, 실시예 18은 AGN 193109가 AGN 191183과 같은 다른 레티노이드의 증식억제 효과에 응답 반응하지 않는 경부 종양 세포주의 성장을 억제함을 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다. 특히, AGN 193109는 레티노이드 무첨가하에 증식억제 활성을 나타내었다.
실시예 18
경부 종양 유래의 세포주 CaSki의 증식율을 억제하는 AGN 193109
CaSki 세포 증식에 미치는 EGF 단독물, AGN 191183 레티노이드 작동물질과의 조합물 및/또는 10-6M 농도의 AGN 193109 음성 호르몬과의 조합물의 효과를 시험하였다. 세포 증식 분석은 전술한 ECE16-1 세포에 관한 연구에서와 같이 실시하였다. EGF는 최종 20 ng/㎖의 농도로 레티노이드 처리된 배양물에 첨가하였다. 세포를 AGN 193109 첨가 또는 무첨가하에 AGN 191183(10-10 내지 10-6M)으로 총 3일 동안 처리하였다. 이 배지를 새 배지로 교환하고 2종의 레티노이드 화합물 각각을 적당량 매일 첨가하였다. 세포수를 전술한 바와 같이 COULTER 계수기로 측정하였다.
도 16에 제시된 결과를 통해 알 수 있듯이, CaSki 세포는 레티노이드 작동물질의 효과에 실질적으로 내성이 있고, AGN193109가 레티노이드 무첨가하에 증식억제 활성을 나타낸다. 배양액 중에 첨가된 EGF의 존재는 CaSki 세포 증식을 자극하였다. 이와 같은 결론은 AGN 191183의 무첨가를 나타내는 사선 막대와 제한 성장 배지("DM") 단독물 처리를 나타내는 흰 막대의 결과를 비교하여 얻은 것이다. AGN 191183 처리는 CaSki 종양 세포주에 대해 증식억제 활성을 전혀 나타내지 않았다. 본 발명자는 레티노이드 작동물질과 관련된 세포 증식율의 임의의 미량 증가는 무시하였는데, 그 이유는 레티노이드 작동물질의 농도를 수만배 증가시켜야 증식율이 대략 20% 정도 증가하였기 때문이다. 따라서, AGN 191183 작동물질은 CaSki 세포의 증식율에 거의 영향을 미치지 않는다고 결론지었다.
또한, 도 16에 제시한 결과는 AGN 193109가 CaSki 경부 상피 세포주의 증식을 억제함을 나타낸다. 이 결과는 "O" AGN 191183 흑색 막대와 "0" AGN 191183 사선 막대로 나타낸 측정값을 비교하여 얻은 것이다. 즉, AGN 193109는 AGN 191183과 같은 레티노이드 작동물질에 의해 성장 억제되지 않는 경부 종양 세포를 치료하는데 사용했을 때 레티노이드 작동물질의 무첨가하에 생물학적 응답 반응을 자극할 수 있었다.
AGN 193109 음성 호르몬이 세포 증식을 억제할 수 있다는 본 발견은 비리간드형 RAR이 증식에 요구되는 유전자의 발현을 매개하는 모델과 일치하였다. AGN 191183과 같은 RAR 작동물질이 세포 증식에 거의 영향을 미치지 않거나 아마도 미소하게 세포 증식을 촉진시키는 반면, AGN 193109는 증식억제 효과를 나타내었다. AGN 193109 음성 호르몬은 아마도 RAR에 결합하여 NCP 결합을 촉진시키고 이 RAR을 불활성 형태로 형성시키는 것을 추정된다. 이 모델에 따르면, 이것은 비리간드형 RAR에 의해 양성 조절되는 유전자 활성을 억제하였다. 이와 같이 비리간드형 RAR의 활성을 하향 조절하는 AGN 193109의 작용은 아마도 RAR과 NCP의 결합을 촉진하는 작용에서 얻어지는 것으로 사료된다.
당업자라면 일부 레티노이드 작동물질이 망막을 분리시키는 세포 증식의 바람직하지 않은 결과를 제어하는데 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 망막 분리 후 망막 색소 상피세포(RPE)는 역분화하고, 증식한 후 망막하 공간으로 이동한다. 이 과정은 망막 재부착을 목적으로 하는 외과 시술의 성공에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 문헌[Campochiaro et al. in Invest. Opthal ＆ Vis. Sci. 32:65(1991)]은 ATRA와 같은 RAR 작동물질이 1차 인간 RPE 배양물의 성장에 증식억제 효과를 나타낸다고 입증하고 있다. 또한, 레티노이드 작동물질은 망막 재부착 수술 후 망막 분리 빈도를 감소시키는 것으로 밝혀진 바 있다[Fekrat et al. Opthamology 102:412(1994)]. 다음 실시예에 개시되는 바와 같이, 1차 인간 RPE 배양물의 성장을 억제하는 AGN 193109 음성 호르몬의 작용을 분석하였다.
이하, 실시예 19는 인간 망막 색소 상피세포의 1차 배양물에서 AGN 193109가 레티노이드 길항물질의 증식억제 효과를 증강시키는 것을 증명하는데 사용된 방법에 관한 것이다.
실시예 19
ATRA의 증식억제 활성을 증강시키는 AGN 193109
인간 망막 색소 상피세포(RPE)의 1차 배양물은 문헌[Campochiaro et al. in Invest. Opthal ＆ Vis. Sci. 32:65(1991)]에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 세포 5 x 104을 5% FBS를 함유하는 DMEM(기브코)을 첨가한 24웰 다중웰 평판의 16 ㎜ 웰에서 평판배양하였다. 또한, 세포를 에탄올 부형제 단독, 에탄올 중의 ATRA(10-10 내지 10-6 M), 에탄올 중의 AGN 193109(10-10 내지 10-6 M) 또는 ATRA(10-10 내지 10-6 M)과 10-6M AGN 193109으로 모의 처리하였다. 이 세포에 총 처리 5일 동안 2일에 한번씩 상기 화합물의 적당 농도를 함유하는 새 배지를 주입하였다. 트립신으로 적당히 분해하여 세포를 평판으로부터 분리하고 세포수를 전자세포계수기로 계수하였다.
도 17에 제시한 결과는 AGN 193109가 RPE 세포에 대한 ATRA의 증식억제 활성을 급격하게 증강시킨다는 것을 나타내고 있다. ATRA에 의한 1차 RPE 세포의 처리는 대조군 배양물에 비하여 10-6M ATRA로 처리시 RPE 세포 증식을 약 40% 감소시키면서 용량 의존적 감소를 유도하였다. AGN 193109 처리는 이 실험에서 시험된 모든 농도에서 RPE 세포의 증식율을 거의 변화시키지 못하였다. 놀랍게도, ATRA(10-11 내지 10-6 M)와 10-6M AGN 193109를 조합한 경우 ATRA 단독 처리시보다 강한 증식억제 활성을 나타내었다. 따라서, AGN 193109 동시처리는 ATRA의 증식억제 효과를 증강시켰다. 보다 구체적으로 설명하면, 이 도면에 도시된 결과는 AGN 193109 10-7M과 함께 ATRA 10-10M만을 사용하여도 ATRA 10-8M 사용한 경우의 증식억제 효과가 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다. 즉, AGN 193109 음성 호르몬은 ATRA의 증식억제 활성을 약 100배 유의적으로 증강시켰다.
별도의 실험으로, ATRA(10-11 내지 10-6 M)의 증식억제 효과와 ATRA와 AGN 193109 10-6M의 증식억제 효과를 비교한 결과, AGN 193109의 존재하에 ATRA에 대한 1차 RPE 세포의 감수성이 뚜렷히 증가하는 것으로 증명되었다. 이 시스템에서, AGN 193109는 단독으로 사용되는 경우 레티노이드 길항물질로서 작용하거나 증식억제 효과를 나타내지도 않았다. 하지만, AGN 193109를 동시투여하면 레티노이드 작동물질의 증식억제 활성을 증강시켰다.
그 다음, 전술한 RPE 세포 증식을 측정하는 기술과 조건을 사용하여 1차 RPE 배양물에 있어서 AGN 193109가 13-cis 레틴산(13-cis RA)의 증식 억제 효과를 증강시키는지 시험하였다. 주목할 것은, 13-cis RA가 임상적으로 중요하다는 것이다. 보다 구체적으로, 13-cis RA는 여러 질병 상태, 예컨대 여드름[Peck et al. N.Engl.J.Med. 300:329(1977); Jones et al. Br.J.Dermatol. 108:333(1980)] 및 인터페론 2α와 조합 사용시 피부와 경부의 판상 세포 종양[Lippman et al. J.Natl.Cancer Inst. 84:241(1992); Moore et al. Seminars in Hematology 31:31(1994)]의 치료에 유용하다.
도 18에 제시된 결과는 13-cis RA(10-12 내지 10-6 M)와 ATRA(10-12 내지 10-6 M)가 RPE 세포 증식을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다. 주목할 것은, 13-cis 이성질체가 이 분석법에서 ATRA에 비해 효과가 약 2배 정도 적다는 것이다. AGN 193109 및 ATRA를 동시투여하여 얻은 결과(전술함)와 유사하게, 13-cis RA(10-12 내지 10-6 M)와 함께 AGN 193109(10-8 또는 10-6 M)를 동시투여한 결과 RPE 세포 증식의 억제를 매개하는데 있어 13-cis RA의 효능을 급격하게 증가시켰다. 13-cis RA 단독 처리시와 대조적으로 AGN 193109의 동시투여는 13-cis RA의 효능을 증강시켰다. 즉, AGN 193109는 13-cis RA의 증식억제 활성을 증강시킨다.
다음으로, AGN 193109가 1차 RPE 세포 배양물에 있어 기타 다른 핵 수용체 호르몬의 활성을 증강시키는지 시험하였다. 강력한 항염증성과 면역억제성을 임상적으로 실험하는데 사용해온 화합물군 중 하나는 합성 글루코코르티코이드 수용체 작동물질인 덱사메타손이다. 갑상선 호르몬(T3; 3,3',5'-트리요오도티로닌)은 갑상선기능저하증 치료시 호르몬 대체요법에 주로 사용되는 천연 갑상선 호르몬 수용체 작동물질이다. 이 실험에 사용된 방법은 ATRA와 13-cis RA를 이용한 실험에 대하여 전술한 것과 동일하다.
이 실험의 결과는 AGN 193109와 핵 수용체 작동물질의 동시투여시 핵 수용체 작동물질의 증식억제 활성을 증강시키는 것으로 나타났다. 보다 구체적으로 설명하면, 도 19에 제시한 결과는 RPE 세포를 덱사메타손(10-11 내지 10-6 M)이나 ATRA(10-12 내지 10-6 M)으로 단독 처리하면 RPE 세포 증식을 실질적으로 억제할 수 없다는 것을 나타낸다. 그러나, 덱사메타손(10-11∼10-6 M) 및 AGN 193109 10-8 M 또는 10-6 M으로 RPE 세포를 처리하면 ATRA로 처리하여 유발되는 억제와 유사한 범위로 RPE 세포 증식을 억제한다. 유사하게, 도 20에 제시된 결과로부터 AGN 193109가 갑상선 호르몬의 증식억제 활성을 가능하게 한다는 것을 알 수 있다. 덱사메타손을 이용하여 얻은 결과와 유사하게, RPE 세포 증식은 갑상선 호르몬(10-11 내지 10-6 M)을 이용한 단일 제제 치료로는 억제하기 어렵다. 그러나, 갑상선 호르몬(10-11 내지 10-6 M) 및 AGN 193109(10-8 M 또는 10-6 M)로 RPE 세포를 동시 처리하면 갑상선 호르몬 의존 방식으로 RPE 세포 증식을 억제하였다. 본 발명자들은 AGN 193109가 1차 RPE 배양물을 이들 핵 수용체 작용물질의 증식 억제 효과에 민감하게 한다고 결론내렸다. AGN 193109가 이들 효과를 매개하는 기작은 NCP/RAR 상호작용의 조절과 관련되어 있는 것 같다.
본 발명자들은 레티노이드 길항물질에 민감한 기타 실험계에서 마커 유전자의 발현에 대한 AGN 193109의 효과를 추가로 검사하였다. MRP8 및 스트로멜리신 유전자는 모두 각종 생물학적 시스템에서 레티노이드 작용물질에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다. 예컨대, Wilkinson 등의 문헌[J.Cell Sci. 91:221(1988)] 및 Medsen 등의 문헌[J. Invest. Dermatol. 99:299(1992)]에는 MRP8 유전자 발현이 건선에서 상승된다는 것이 개시되어 있다. 역으로, MRP8 유전자 발현은 인간의 건선 피부(Nagpal et al., 1995년 제출), 인간의 케라티노사이트가 다량있는 배양물(Chandraratna 등, J. Invest. Dermatol. 102:625(1994)) 및 배양된 인간의 신생 포피 케라티노사이트(Thacher et al., J.Invest.Dermatol. 104:594(1995))에서 레티노이드 작용물질 AGN 190168에 의해 억제되었다. Nagpal 등의 문헌[J. Biol. Chem. 270:923(1995)]에는 스트로멜리신 mRNA량이 배양된 인간의 신생 포피 케라티노사이트내의 AGN 190168과 같은 레티노이드 작용물질에 의해 억제된다는 것이 개시되어 있다. 본 발명자들은 AGN 191183 레티노이드 길항물질 또는 AGN 193109로 배양된 인간의 신생 포피 케라티노사이트의 처리후에 이들 유전자의 조절된 발현을 분석하였다.
실시예 20은 AGN 193109가 배양된 케라티노사이트내에서 MRP-8 발현을 억제한다는 것을 입증하는데 사용된 방법을 개시하고 있다.
실시예 20
AGN 193109는 케라티노사이트에서의 MRP-8 발현을 억제한다
일차 포피 케라티노사이트를 Nagpal 등의 문헌 J. Biol. Chem. 270:923(1995)에서 기술된 방법에 따라 분리하고, 클론텍에서 구입한 케라티노사이트 성장배지(KGM)에서 배양하였다. AGN 191183 (10-7M) 또는 AGN 193109 (10-6M)로 처리한 3일 후, 총 세포RNA를 처리하고 조절한 케라티노사이트에서 표준방법에 따라 분리하였다. mRNA를 그리세르알데하이드 인산 디하이드로지나제 (GAPDH) 가정부 유전자 또는 MRP-8에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 증폭 프로토콜에서 이후 주형으로 제공되는 cDNA로 역전사시켰다. GAPDH 프라이머는 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' (서열번호 6) 및 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' (서열번호 7)을 갖는다.
MRP-8 프라이머는 5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3' (서열번호 8) 및 5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3' (서열번호 9)를 갖는다. MRP-8증복반응으로부터의 정제물 (10㎕)는 12 주기에서 시작하고 21 주기에서 끝나는 매 주기 PCR 증폭에서 제거되었다. 유사하게, GAPDH 증폭반응 정제물은 15주기에서 시작하고 24 주기에서 끝나는 매 PCR 주기후 제거되었다. 시료는 2% 아가로스 겔상에 전기영동시키고 에티디움 브로마이드 염색으로 분리증폭물을 검출하였다. 증폭물의 염색세기는 주어진 프라이머 세트에 특이적인 개시 mRNA 양의 정량적인 수단을 제공하였다.
이와같은 방법의 결과는 두 AGN 191183과 AGN 193109 모두 독립적으로 케라티노사이트에서 MRP-8 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 염색된 GAPDH 증폭물의 세기는 AGN 191183 및 AGN 193109로 처리한 케라티노사이트 대조구로부터 분리한 개시물질을 나타내는 겔 레인에서 실질적으로 동등하였다. GAPDH 증폭물을 나타내는 약한 밴드들은 18 주기 PCR 증폭 후 제거된 시료에 해당하는 레인들에서 첫 번째로 검출되었다. 다양한 겔 레인에 있어서 염색 세기가 동등한 것은 모든 시료에 동등한 양의 개시물질이 사용되었음을 의미한다. 따라서, MRP-8 증폭물을 나타내는 염색 밴드의 세기가 다른 것은 다양한 개시시료 사이의 MRP-8 mRNA 발현에 차이가 있음을 의미하는 것이었다. 예상한 바와 같이, MRP-8 증폭신호는 비처리된 대조구와 비교하여 AGN 191183 (10-7M) 처리된 배양물에서 억제되었다. 또한 배양된 케라티노사이트에 대한 AGN 193109 (10-6M) 처리는 낮은 염색 증폭생성물 세기로 판단할 때 MRP8 발현을 억제한다.
하기 실시예에서 기술한대로, AGN 1913109은 케라티노사이트에서 이차 마커유전자의 발현을 억제한다. Nagpal 등의 문헌 J. Biol. Chem. 270:923 (1995)에서 신생인간포피 케라티노사이트 배양물에서 스트로멜리신 mRNA 발현이 RAR 특이길항제에 의해 하향조절된다고 보고하였다. Nicholson 등의 문헌 EMBO J. 9:4443 (1990)에서 AP-1 프로모터 구성요소는 스트로멜리신-1 유전자의 레티노이드-의존 음성조절에 중요한 역할을 한다고 보고하였다. 그러므로, AGN 193109가 본 유전자의 발현을 변경할 수 있는지를 결정하는 것은 흥미로운 일이다.
실시예 21은 외래첨가된 레티노이드 길항제 부재시 스트로멜리신-1 유전자 발현을 AGN 193109가 억제하다는 것을 입증하기 위하여 사용된 방법을 기술하고 있다.
실시예 21
배양 케라티노사이트에서 스트로멜리신-1 발현을 억제하는 AGN 193109
일차 포피 케라티노사이트에 RAR 길항제 AGN 191183 (10-7M), 또는 AGN 193109 (10-6M)을 24시간동안 처리하거나 또는 모의처리하였다. 모의처리 및 레티노이드 처리된 케라티노사이트로부터 제조된 총 RNA가 역전사되었고, 결과물 cDNA는 본원에 인용된 나그팔 등의 문헌 J. Biol. Chem. 270:923 (1995)에서 기술한대로 β-액틴 또는 스트로멜리신-1 올리고 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 18 주기 PCR 증폭에서 매 3 주기 개시 후, PCR 증폭 반응에서 10 ㎕ 시료를 제거하였다. 시료는 2% 아가로스 겔상에서 전기영동되고, 에티디움 브로마이드 염색을 실시한 후 검출하였다.
본 방법의 결과는 AGN 193109가 외래부가된 레티노이드 길항제 부재시 스트로멜리신-1 유전자 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 보다 명확하게 설명하면, β-액틴 증폭물을 나타내는 에티디움-염색 밴드들은 18 주기 PCR 후 아가로스 겔 상에서 쉽게 검출되었다. 모든 밴드세기는 부가적 증폭반응주기와 함께 증가하는 반면, AGN 191183을 처리한 세포를 나타내는 시료에서는 염색밴드가 다소 낮은 세기를 보였다. 이는 다소 적은양의 RNA가 AGN 191183을 처리한 세포에 해당하는 개시시료에 존재한다는 것을 의미한다. 위의 결과는 또한 스트로멜리신-1 mRNA를 33 주기 PCR 증폭에서 개시한 모의처리 케라티노사이트에서 검출할 수 있다는 것을 의미한다. 예상한 바와 같이, 모의처리한 시료에서 유도된 시료와 비교하여 보다 약한 밴드세기로 판단할 때, 스트로멜리신-1 mRNA 발현은 AGN 191183 (10-7M) 처리 후 억제되었다. β-액틴 증폭물의 세기가 정상적이고, MRP-8 발현 즉정에서 획득한 결과와 일치할 때, 케라티노사이트의 AGN 193109 (10-6M) 처리는 스트로멜리신-1 mRNA 수준의 하향조절을 야기시켰다. 실제로, AGN 193109 처리에 의하여 자극된 하향조절은 RAR 길항제 AGN 191183로 케라티노사이트를 처리하여 유발된 하향조절과 구별된다.
본원에 개시된 바와 같이, AGN 193109는 공동투약된 스테로이드 초과 길항제활성 변조에 관한 세 개의 가능한 효과중 어느하나를 보유할 수 있다. 첫 번째, AGN 193109는 효과가 없을 것이다. 두 번째, AGN 193109는 길항제 효과를 상쇄시켜, 결국 길항제 활성을 감소시킬 것이다. 마지막으로, AGN 193109는 길항제 활성을 증진시켜 길항제에 의해 생성된 효과의 자극을 유도할 수 있다.
AGN 193109로 변조할 수 있는 활성을 보유한 화합물은 레티노이드 수용체 길항제 및 기타 스테로이드수용체 초과군들과 결합하는 길항제를 포함한다. 이와같은 후자의 길항제 카테고리는 비타민 D 수용체 길항제, 글로코코르티코이드 수용체 길항제 및 타이로이드 호르몬 수용체 길항제 등을 포함한다. 현재까지 미지의 리간드를 보유한 페록시좀 증식제-활성 수용체, 에스트로겐 수용체 및 고아 수용체등은 AGN 193109에 의해 유효성이 증진될 수 있다. 만일 스테로이드 초과 길항제가 RAR 길항제인 경우, AGN 192109는 상기 길항제의 활성을 증진시키거나 또는 상쇄할 수 있다. 만일 AGN 193109와 조합하여 사용되는 길항제가 RAR 이외의 핵 수용체와 결합할 수 있는 경우, AGN 193109 공동투약이 효과가 없거나 또는 길항제에 민감하게 되어 길항제 활성을 증진할 것이다.
세 개의 가능한 AGN 193109 활성을 결정하기 위한 일반화된 방법은 다음과 같은 톡특한 시스템을 가질 것이다. 이와같은 서술은 스테로이드 수용체 초과와 AGN 193109의 공동투약에 대한 각각의 가능한 결과들을 설명한다. 핵수용체 길항제의 활성을 조절할 수 있는 AGN 193109 능력을 평가하는데 유용한 생물 시스템은 설정 조직배양 세포주, 바이러스 형질전환 세포주, 시험관 일차배양세포 및 살아있는 유기체를 이용한 생체내 연구등을 포함하지만 여기에 제한을 두지는 않는다. 이와같은 시스템에서 AGN 193109의 생물학적 효과를 측정하는 것은 다양한 생물학적 종결점을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이와같은 종결점은 세포증식의 분석, 계획된 세포사멸 분석, 유전자발현 분석을 통한 세포의 분화상태의 분석, 누드 마이스에서 종양을 형성하는 세포능력 분석 및 리포터 유전자물의 일시적 또는 안정도입 후 유전자발현 분석등을 포함한다.
설명을 목적으로, mRNA "X"로 명명된 mRNA 종은 조직 "Z"로부터 분리한 일차배양 "Y" 세포에서 "X" 유전자로부터 발현된다. 표준 배양조건하에서, 유전자 X의 발현을 포함하여 다수의 Y 세포유전자 마커가 유지되는 곳에서, 레티노이드 길항제를 첨가하는 것은 다수의 X mRNA 감소를 유도한다. 유전자 X 발현분석은 세포 mRNA의 분리 및 중합효소 사슬반응, 리보뉴클레아제 보호 또는 노던 분석과 같은 RNA 블럿팅 방법에 의해 다수의 X mRNA 수준을 측정하여 평가될 수 있다. 조직 Z로부터 분리한 후, 일차 Y 세포를 적당한 성장 배지에서 배양한다. 이와같은 단계는 세포를 네 개의 시료그룹으로 분리하여 레티노이드 길항제와 AGN 193109의 다양한 투약을 실시할 수 있도록 한다. 첫 번째 그룹은 대조구로서 오직 매개체만을 투약받는다. 두 번째 그룹은 RAR 길항제, 레틴산 및 에탄올을 최종 농도가 10-11내지 10-6M이 되도록 투여한다. 최저 투약량은 시스템의 민감도에 의존하여 실험적으로 결정될 필요가 있다. 이와같은 결정은 본 분야에서 보통의 기술을 가진 사람에게는 정해진 실험범위내에 해당한다. 세 번째 그룹은 그룹 2 세포에 투여하는 투약량과 동일한 핵수용체 길항제 및 일정투약량의 AGN 193109를 투약할 것이다. 그룹 3 세포에 투여하는 AGN 193109 투약량도 실험적으로 결정할 필요가 있지만, RAR 아유형(즉, 10-8M 이상)에 대한 AGN 193109 친화상수(Kd)에 근접하여야 한다. 네 번째 그룹은 그룹 3에서 길항제 공동투약을 위해 사용되는 투약량을 포함하여 최소 AGN 193109 투약량을 투여할 것이다. 이와같은 투약방법의 대안책으로는 AGN 193109를 그룹 2에서 기술한바와 같이 앞선 실시예에서 기술된 레티노이드 길항제로 대치시키고 그룹 3 및 4에서 기술한대로 AGN 193109를 일정 투약량의 레티노이드 길항제로 대치시키는 것이다. 적정배양 후, 길항제 활성의 지표로서 측정되는 생물학적 종결점 결정을 위해 적절한 방법으로 세포를 회수하여야 한다.
예를 들면, 레틴산에 의존한 유전자 발현의 조절에 대한 AGN 193109의 효과 분석은 상기 기술한 각각의 네 가지 프로토콜에 따라 처리된 세포로부터 회수한 mRNA에서 다수 mRNA 종류 X의 비교를 포함한다. 대조 세포로부터 유래된 RNA는 X mRNA의 기선 발현을 결정하도록 제공할 것이며, 발현되지 않는 조건을 나타낼 것이다. 레틴산으로 처리한 세포에서 유래된 mRNA 풀에서 측정한 결과를 이용하여 이들 수준을 비교하여 유전자 발현에 대한 길항제 효과를 결정할 수 있다. 레틴산 처리에 의해 유발된 특이 mRNA의 정량화된 억제수준은 AGN 193109만으로 또는 레틴산과 AGN 193109 공동으로 병행하여 처리한 세포에서의 mRNA 풍족과 비교할 수 있다. 이와같은 일반화된 실예는 레티노이드 길항제에 의해 억제된 유전자 발현에 대한 공동투약된 AGN 193109의 효과 분석을 설명하는 반면, 실예는 레티노이드 길항제에 의해 유도된 유전자에 대한 공동투약된 AGN 193109 효과 분석을 대안적으로 기술할 수 있다. AGN 193109가 길항제로서, 음성 호르몬으로서 행동할 것인지, 또는 특정 시스템에 효과가 없는지등을 결정하는 중요한 특징으로는 AGN 193109의 존재 및 부재시 효과의 증폭을 정량적으로 비교하는 것을 포함할 것이다.
AGN 193109가 공동투약된 길항제의 활성을 증진시키는 실예로는 레틴산과 AGN 193109를 결합하여 처리하는 것이 레틴산만을 처리한 세포에서 측정된 X mRNA 발현수준보다 더욱 억제된 X mRNA 발현 수준을 야기하는 경우가 될 것이다. 보다 명확하게 설명하면, Y축상의 생물학적 효과의 투약반응 곡선 (즉, X mRNA 풍족의 억제) 대 X축상의 길항제 투약량 (로그 스케일)과의 비교를 통하여 AGN 193109 공동처리 존재 및 부재시에 X mRNA 풍족의 길항제-매개 억제를 비교할 수 있다. 길항제에 대한 생물학적 반응에 민감하게 하여 길항제의 활성을 증진시키는 AGN 193109 능력은 투약반응곡선에서 왼쪽방향 변경으로 타나날 것이다. 보다 명확하게 설명하면, AGN 193109 존재시 길항제만을 사용하여 수득할 수 있는 생물학적 효과와 동일한 효과를 얻기 위해서 보다 적은 길항제가 요구된다.
공동투약한 길항제의 AGN 193109 매개길항의 실예로는 레틴산과 AGN 193109를 결합하여 처리하는 것이 레틴산만으로 처리한 세포에서 측정된 X mRNA 발현수준보다 약화된 X mRNA 발현억제 수준을 야기하는 경우가 될 것이다. AGN 193109의 존재 및 부재시 X mRNA 억제투약반응곡선 대 길항제 로그투약의 비교는 투약반응곡선에서 오른쪽방향 변경을 입증할 것이다. 보다 명확하게 설명하면, AGN 193109 존재시 길항제만을 처리한 단일 작용물 처리를 통하여 수득된 생물학적 효과와 동일한 효과를 얻기위해서는 보다 많은 양의 길항제가 요구될 것이다.
AGN 193109가 길항 또는 효력증진을 매개하는 상기 실예들은 AGN 193109와 레티노이드 길항제의 공동투약에 대한 실험적 결과를 기술하고 있다. 그러나, 만일 AGN 193109와 공통투약된 길항제가 길항제를 길항시키는 대신 RAR 이외의 스테로이드 수용체 초과군과 결합하고 활성화시킬 수 있는 길항제라면, AGN 193109가 길항제 활성에 효과가 없는 것이 가능하게 된다. 만일 이와같은 길항제와 AGN 193109의 공동투약이 길항제만을 처리한 세포에서 측정된 mRNA 발현수준과 동일한 발현수준을 보인다면, 이후 RAR:NCP 연합 증진을 통하여 NCPs의 유용성에 영향을 주는 AGN 193109 능력이 본 시스템에서 효과를 발휘할 수 없을 것이다. 이는 AGN 193109가 공통투약된 길항제에 대하여 효과를 갖지 못하는 실예이다.
길항예
레티노이드 길항제와 공동투약된 AGN 193109의 효과를 결정하는 상기 일반화된 실예에서 기술된 방법은 실시예 7에서 기술한 방법을 통하여 예증된다. 세 개의 레틴산 수용체중 하나 및 레티노이드 길항제 유도 MTV-TREp-Luc 수용체 생성물과 함께 공동감염된 CV-1 세포에게 에탄올(대조군, 그룹 1), 최종농도 10-9내지 10-6M AGN 193109 (그룹 2), 레틴산 10-8M과 공동투약된 최종농도 10-9내지 10-6M AGN 193109 (그룹 3) 또는 레틴산 (10-8M, 그룹 4)을 투약하였다. 그룹 1과 그룹 4의 루시퍼라제 활성을 비교하여 첨가된 AGN 193109 부재시 루시퍼라제 수용체 유전자의 발현을 유도하는 레티노이드 길항제 수준을 결정할 수 있다. 그룹 3 세포와 그룹 4 세포에서의 루시퍼라제 수용체 유전자의 발현을 비교하여 본 시스템에서 레티노이드 길항제의 길항제로서 AGN 193109이 행동하는 것을 밝혔다.
길항예
레티노이드 길항제와 공동투약된 AGN 193109 효과를 결정하는 일반화된 실예에서 개시된 방법은 실시예 17에서 AGN 193109가 ECE-16-1 형질전환 경부상피세포에서 EGF-자극 세포증식의 레티노이드 길항제-매개 억제 길항제로서 작용한다는 것을 결정하기 위하여 유사하게 사용되었다. 본 방법에서, ECE-16-1 세포 처리는 EGF 만으로 처리한 대조 시료 (그룹 1), 최종 농도 10-6M의 EGF 및 AGN 193109를 함께 처리한 시료 (그룹 2), 10-8M의 레티노이드 길항제 AGN 191183 단일 투약과 함께 공동투약된 최종농도 10-10내지 10-6M EGF 및 AGN 193109를 결합하여 처리한 시료 (그룹 3), 10-8 M의 EGF 및 AGN 191183을 결합하여 처리한 시료 (그룹 4)를 포함한다. 3일 후, 세포증식속도을 결정하였다. 세포가 EGF에 의하여 증식 자극을 받은지의 여부를 결정하는 것은 EGF를 포함하지 않은 한정배지에 세포를 노출시키는 부가적인 조절처리가 포함되기 때문에 가능하다. 그룹 1의 세포수와 그룹 4의 세포수를 비교하여 RAR 길항제 AGN 191183이 ECE-16-1 세포의 EGF-자극 증식을 억제하는 것을 결정한다. 그룹 3 및 그룹 4를 비교하여 AGN 193109가 본 시스템에서 RAR 길항제의 활성을 길항하는 것을 밝힌다.
효과증진 예
레티노이드 길항제와 공동투약된 AGN 193109의 효과를 결정하는 일반화된 실예에서 개시된 방법은 AGN 193109가 MTV-VDRE-Luc 수용체 유전자를 유도하는 1,25-디하이드록시비타민 D3와 함께 감염된 Hela 세포에서 핵수용체 길항제의 활성을 증진시키는가를 결정하기 위하여 실시예 14에서 사용되었다. 감염된 세포 처리는 매개체 단독 (대조구, 그룹 1), 최종농도가 10-10내지 10-7M 1,25-디하이드록시비타민 D3(그룹 2), 최종농도가 10-8또는 10-7M AGN 193109와함께 공동투약된 최종농도 10-10내지 10-7M 1,25-디하이드록시비타민 D3(그룹 3), 및 단일 작용물 처리로서 최종농도 10-8또는 10-7M AGN 193109 (그룹 4)를 포함한다. 그룹 2 및 그룹 2 세포에서 측정한 루시퍼라제 활성을 비교하여 1,25-디하이드록시비타민 D3자극 루시퍼라제 활성이 투약량에 의존한다는 것을 결정한다. 그룹 4 (AGN 193109 단일 작용물 처리)의 세포와 그룹 3 (AGN 193109 공동투약)의 세포에서 측정한 루시퍼라아제 활성을 비교하여 주어진 농도의 AGN 193109 존재시 투약-의존성 1,25-디하이드록시비타민 D3자극 루시퍼라제 활성을 결정한다. 이와같은 예에 있어서, 제로 값은 AGN 193109 단독으로 처리한 세포에서의 루시퍼라제 활성을 의미한다 (그룹 4). 이와같은 투약방법은 세 개의 1,25-디하이드록시비타민 D3 투약반응곡선을 비교할 수 있게 한다. AGN 193109 부재시 1,25-디하이드록시비타민 D3의 투약반응곡선과 AGN 193109 (10-8 또는 10-7 M)의 공동투약을 나타내는 곡선을 비교하여 절반-최대반응에서 왼쪽방향 변경으로 입증된 바와같이 길항제 활성의 효과증진을 입증하였다.
효과증진 예
레티노이드 길항제와 공동투약된 AGN 193109의 효과를 결정하는 일반화된 실예에서 개시된 방법은 AGN 193109가 인간 망막색소 상피세포의 일차배양에서 RAR 길항제의 항증식활성을 증진시키는가를 결정하기 위하여 실시예 19에서 추가로 사용되었다. 세포 처리는 에탄올 매개체 단독 (그룹 1), 최종농도가 10-10내지 10-6M 레틴산 (그룹 2), 10-6M AGN 193109와 함께 공동투약된 최종농도 10-10내지 10-6M 레틴산 (그룹 3), 및 최종농도 10-10또는 10-6M AGN 193109 단독 (그룹 4)을 포함한다. 그룹 1 및 그룹 2의 세포를 사용하여 수득한 분석 결과를 비교하여 투약량에 의존하는 레틴산에 의한 이들 세포들의 증식 억제를 결정한다. 유사하게, 그룹 3의 세포와 그룹 1의 세포를 사용하여 수득한 결과를 비교하여 공동투여된 AGN 193109 존재시 레틴산에 의한 이들 세포들의 투약량에 의존하는 증식 억제를 결정한다. 그룹 4는 단일처리 작용물로서 사용되었을 때 AGN 193109가 이들 세포의 증식속도를 실질적으로 변경시키지 못한다는 것을 입증하였다. 그룹 2 및 그룹 3에서 일반화된 레틴산 매개 세포증식의 억제 투약반응곡선을 비교하여 AGN 193109가 RAR 길항제의 항증식효과에 대해 일차 RPE 세포를 민감하게하여 RAR 길항제의 활성을 증진시킨다는 결론의 기초를 제공한다.
상기에서 지적한대로, Agarwal 등의 문헌 Cancer Res. 54:2108 (1994)에서 HPV 불멸화된 ECE-16-1 세포의 성장과는 달리 CaSki 세포성장은 레티노이드 길항제 처리에 의하여 억제되지 않는다고 보고하였다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 CaSki 세포성장이 레티노이드 길항제 부재시 AGN 193109에 의해 억제된다는 것을 우연히 발견하였다. 하기 실시예는 생체내에서 CaSki 세포종양의 성장을 억제하기 위해 AGN 193109를 사용하는 방법에 대하여 기술한다.
실시예 22
AGN 193109 투약을 통한 누드 마이스에서의 CaSki 세포종양 성장의 억제
1×106CaSki 세포를 각 패널의 누드 마이스에 주입한다. 본 분야의 보통의 기술을 가진 사람에게 친숙한 기술을 사용하여 종양 형성을 측정한다. 주입 후, 마이스를 무작위로 대조그룹과 실험그룹으로 분리한다. 대조 그룹은 위약투약을 실시한다. 실험그룹은 AGN 193109를 투약한다. 위약투약을 실시한 동물은 옥수수 오일로 위내삽관을 실시한다. 실험동물은 매일 20μMol/kg AGN 193109이 포함된 옥수수 오일을 투여한다. 눈금 캘리퍼스를 사용하여 종양체적을 입방 mm로 측정한다. 종양체적을 시간의 함수로 도표화한다. AGN 193109를 투여한 마이스는 연구기간동안의 종양 크기와 개수로 판단하여 대조 마이스의 종양에 비하여 종양 증식속도가 급격히 감소한다. 이와같은 결과는 AGN 193109가 레티노이드 길항제의 투여를 포함한 치료에 내성이 있는 경부암으로 진전되는 것을 억제한다는 생체내 증거를 제공한다.
상기에서 지적한 바와 같이, CaSki 세포는 레티노이드 길항제 치료에 반응적이지 않은 경부암 모델이다. 그러나, 본 발명자는 CaSki 세포성장이 레티노이드 길항제의 처리없이 AGN 193109에 의해 억제된다는 것을 본원에서 개시하였다. CaSki 세포증식을 억제하는 AGN 193109 능력은 AGN 1934109가 레티노이드 길항제 처리에 둔감한 경부암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 제시한다. 하기 실시예는 경부암의 치료에 있어서 AGN 193109의 치료 가능성을 평가하는데 사용될 수 있는 방법을 기술한다.
실시예 23
경부암 환자에서 AGN 193109의 치료가능성 평가
발전된 경부암을 보이는 환자를 일차로 규명한다. 경부생체검사법은 본 분야에서 보통의 기술을 가진 사람에게 친숙한 방법에 따라 얻어진다. 외식된 종양세포를 세 개의 시료그룹으로 분리할 수 있도록 충분한 세포수를 제공하기 위하여 표준기술에따라서 조직배양으로 증식시킨다. Agarwal 등의 문헌 Cancer Res. 54:2108 (1994)에서 기술한 배양조건을 본 목적을 위해 사용된다. 첫 번째 그룹은 대조구로서 보존되며, 매개체(에탄올) 만을 투여받는다. 두 번째 그룹은 10-10내지 10-6M 농도의 RAR 길항제 레틴산으로 처리한다. 세 번째 그룹은 10-10내지 10-6M AGN 193109 투약으로 처리한다. 종양세포는 매일 신선한 성장배지를 공급받으며, 각 시료그룹에 적당하도록 상기 기술한 레티노이드를 공급받는다. 3일 후 전기세포계수기를 사용하여 세포수를 측정한다. 대조배양에서의 세포수와 레틴산 처리한 배양에서의 세포수를 비교하여 RAR 길항제가 배양 경부암세포의 성장속도를 억제시킨다는 것을 알 수 있다. 대조적으로, AGN 193109로 처리한 세포는 대조그룹에서의 세포수와 비교할 경우 세포수가 투약량에 의존하여 감소한다. AGN 193109로 처리하여 배양 경부암세포 증식을 억제하는 이와같은 결과는 AGN 193109가 전이질병을 가진 경부암환자 치료용 치료제로 유용할 것이라는 것을 의미한다.
일차 종양제거수술을 받은 경부암환자 및 전이질병을 보이는 환자를 본 보고에서 AGN 193109의 치료적 이점을 입증하는 것을 찾는 무작위적인 의료연구에 기록한다. 환자들은 두 그룹으로 나눈다. 일차 그룹은 대조 그룹이며, 반면 이차 그룹군은 AGN 193109로 처리한다. 본 분야에서 보통의 기술을 보유한 사람에게 익숙한 기술에 따라서 모든 체계적인 투약에 적당한 조성물을 제조하기 위하여 AGN 193109를 제약학적으로 수용할 수 있는 부형제와 결합된다. 대조그룹은 모의조성물을 투여하고 실험그룹은 AGN 193109 음성 호르몬을 포함한 조성물을 투여한다. 환자에게는 최대허용투약량을 투여하고 3 개월 내지 1년 동안 매일 투약한다. 본 연구결과는 건강하게 생존하는 시간을 측정하여 정량화한다. AGN 193109를 투약한 개인들은 전이질병의 완전한 완화를 보이는 불균형한 환자수를 포함하여 건강한 생존기간이 현저히 증가함을 나타내고 있다. 이와같은 결과는 AGN 193109가 레틴산과 같은 레티노이드 길항제의 항증식효과에 반응하지 않는 경부암의 생체내 치료를 위한 치료용도를 갖는다는 것을 의미한다.
상기에서 개시된 바와 같이, AGN 193109가 인간 망막색소 상피세포의 일차배양물에서 RAR 길항제의 항증식 활성을 증진시켰다. 따라서, 동일한 치료 종료점을 얻기위하여 보다 적은 양의 RAR 길항제가 요구되므로 생체내에서 RAR 길항제와 AGN 193109를 공동투약하는 것이 길항제의 치료지수를 증가시키리라 기대된다. 또한, AGN 193109는 인간 망막색소 상피세포의 일차배양물을 글로코코르티코이드 및 타이로이드 호르몬 수용체 길항제의 항증식효과에 대하여 민감하게 한다는 것을 증명하였다. 하기 PVR 래빗 모델은 각각의 AGN 193109와 RAR 길항제(13-시스 레틴산)의 공동투약 또는 타이로이드 호르몬 수용체 길항제 투약을 통하여 획득한 치료지수가 증가하였다는 것을 입증하기 위하여 둘로 분리한 연구에서 사용될 것이다. 현저하게, Sen 등의 문헌 Opthalmol. 106:1291 (1988)에 의해 발표된 망막분리의 래빗 모델은 시험관에서 일차 RPE 세포의 증식을 억제하는 레티노이드 길항제가 또한 생체내에서 망막분리 빈도를 억제한다는 것(Araiz등 Invest. Opthalmol. 34:522 (1993))을 입증하기 위하여 사용되었다. 그러므로, 망막분리 예방에 있어서 치료물질로서 레티노이드 길항제를 사용하는 것에 관하여, 레티노이드 길항제의 시험관 및 생체내 활성사이의 상관관계를 이미 설정하였다. 하기 실시예는 망막분리를 예방하는 치료용도로 AGN 193109를 사용하는 방법에 대하여 기술한다.
실시예 24
증식 유리망막증 (PVR) 치료에 있어서 스테로이드 초과 수용체 길항제의 치료가능성을 증대시키기 위한 AGN 193109의 사용
일차 연구에서, 인간 RPE 세포를 Sen 등의 문헌 Arch. Opthalmol. 106:1291 (1988)에서 기술된 방법에 따라 래빗 눈의 유리공동으로 주입하였다. 유리내부 주입후, 래빗을 다섯 그룹으로 분리한다. 첫 번째 그룹(대조구)은 매개체만을 유리내부에 주입할 것이다. 두 번째 그룹은 유리내부 주입을 통하여 단일 작용물 치료로서 레틴산 (100 ㎍)을 투여한다. 세 번째 그룹은 단일 작용물 치료로서 AGN 193109 (100 ㎍)를 투여한다. 네 번째 그룹은 그룹 2에 투여한 양의 10분의 일 투여량(10 ㎍)으로 RAR 길항제 (레틴산)를 유리내부 주입한다. 다섯 번째 그룹은 AGN 193109 (100 ㎍)과 레틴산 (10 ㎍)을 결합하여 유리내부 주입을 통하여 투약한다. 동물은 인간 RPE 세포의 유리내부 주입 후 하루동안 단일 유리내부 주입으로 적절한 치료를 받는다. 래빗은 7일, 14일 및 28일에 간접 검안경검사를 실시하고 수축성 망막분리의 심각성 및 빈도에 대하여 등급을 매긴다. 100 ㎍ 레틴산을 주입한 그룹의 래빗은 AGN 193109 또는 레틴산 (10 ㎍)을 투약한 대조 래빗 또는 래빗들과 비교하여 현저하게 경감한 망막분리의 심각성 및 빈도를 보인다. AGN 193109 및 레틴산 (10 ㎍)를 결합하여 투약한 그룹의 래빗은 대조구, AGN 193109 또는 레틴산 (10 ㎍)으로 처리한 그룹의 래빗과 비교하여 현저하게 경감한 망막분리의 심각성 및 빈도를 보인다. 이와같은 결과는 AGN 193109가 생체내 PVR 모델에서 RAR 길항제 레틴산의 치료지수를 향상시킨다는 것을 증명한다.
두 번째 연구에서, 래빗에게 래빗 눈의 유리동공으로 인간 RPE 세포를 주입하고 이후 네 개의 그룹으로 분리한다. 첫 번째 그룹(대조구)은 매개체만을 유리내부에 주입한다. 두 번째 그룹은 유리내부 주입을 통하여 단일 작용물 치료로서 타이로이드 (100 ㎍)를 투여한다. 세 번째 그룹은 단일 작용물 치료로서 AGN 193109 (100 ㎍)를 투여한다. 네 번째 그룹은 AGN 193109 (100 ㎍)와 타이로이드 호르몬 (100 ㎍)을 결합하여 유리내부 주입을 통하여 투약한다. 래빗은 7일, 14일 및 28일에 간접 검안경검사를 실시하고 수축성 망막분리의 심각성 및 빈도에 대하여 등급을 매긴다. 네 그룹에 있어서 망막분리의 빈도 및 심각성을 비교하여 AGN 193109 또는 타이로이드 호르몬을 사용한 단일 작용물 치료가 대조 래빗과 비교할 때 망막분리를 억제하지 못한다는 것을 증명한다. 대조적으로, AGN 193109 및 타이로이드 호르몬을 결합하여 투여한 래빗 그룹은 현저히 경감된 망막분리 발생 및 심각성을 보인다. 이와같은 결과는 AGN 193109가 생체내 PVR 모델에서 타이로이드 호르몬의 치료지수를 향상시킨다는 것을 증명한다.
하기 실시예는 망막재부착 수술을 행하는 인간환자를 치료하기 위하여 사용되는 RAR 길항제의 치료지수를 증진시키기 위한 AGN 193109의 사용방법에 대하여 기술한다.
실시예 25
RAR 길항제 13-시스 레틴산의 치료지수 증대
PVR로부터 야기된 망막분리증을 갖고있는 성인 지원자를 일차적으로 선별한다. 개개인은 본 분야의 표준기술을 사용하여 망막분리 교정수술을 시행한다. 이후 환자들을 다섯 그룹으로 나눈다. 대조그룹은 망막분리 교정수술을 시행하고 레티노이드 화합물을 투여하지 않은 환자들로 구성된다. 두 번째 그룹은 수술 후 4주 동안 매일 두 번씩 13-시스 레틴산 40 mg을 경구투여한다. 세 번째 그룹은 수술 후 4주 동안 매일 두 번씩 13-시스 레틴산 4 mg을 경구투여한다. 다섯 번째 그룹은 수술 후 4주 동안 매일 두 번씩 13-시스 레틴산 4 mg과 AGN 193109 40 mg을 결합하여 경구투여한다. 치료 방법 및 약물효과의 평가는 Fekrat 등의 문헌 Ophthalmology 102:412 (1995)에 기술된대로 본질적으로 수행한다.
다섯 그룹 모두의 수술 후 환자들에게서 망막재분리의 빈도 및 심감성을 본 분야에서 보통의 기술을 가진 사람에게 익숙한 안과조사기술을 사용하여 9달 동안 관찰한다. 13-시스 레틴산 40 mg을 경구투여한 환자들은 대조 환자, 매일 두 번씩 13-시스 레틴산 4 mg을 경구투여한 환자 또는 매일 두 번씩 AGN 193109 40 mg을 경구투여한 환자와 비교할 경우 현저히 감소된 망막재분리 발생을 보인다. 수술 후, AGN 193109 40 mg 및 13-시스 레틴산 4 mg을 결합하여 매일 두 번씩 4주 동안 경구투여 받은 환자그룹을 조사하여 이와같은 환자그룹의 치료 결과가 4주 동안 매일 두 번씩 13-시스 레틴산 40 mg을 경구투약받은 환자와 동일하거나 또는 우수하다는 것을 증명하고 있다. 이와같은 결과는 AGN 193109 음성 호르몬이 PVR 환자에 있어서 망막분리의 빈도 및 심각성을 경감시켜 RAR 길항제의 치료지수를 항상시킨다는 것을 증명한다.
핵수용체 음성 호르몬을 동정하기위한 일반화된 분석
본 발명자는 AGN 193109가 RAR 핵수용체의 기초 전사활성을 억제할 수 있는 음성 호르몬으로 작용할 수 있다는 것을 상기에서 증명하였다. 추가로, 본 발명자는 음성 호르몬 활성을 갖는 세포로부터의 단순 길항제인 RAR 리간드를 식별하기 위하여 ERE-tk-Luc 루시퍼라제 수용체 플라스미드 및 ER-RXR-α와 RAR-γ-VP-16 수용체 발현 플라스미드를 공동감염시킨 CV-1 세포를 사용한 분석을 기술하였다.
본 발명자는 RAR 음성 호르몬이 RAR과 NCPs 사이의 상호작용 증대를 향상시켜 RAR-매개 전사활성의 억제를 매개한다고 결론지었다. 추가로, 본 발명자는 AGN 193109가 핵수용체의 스테로이드 초과군 사이의 NCPs 상호할당과 동일한 방법으로 기타 핵수용체의 길항제효과를 증진시킬 수 있다는 것을 증명하였다. 이와같이, 리간드는 비-RAR 핵수용체에서 음성호르몬 활성을 갖는 화합물을 동정하기 위하여 디자인되고 스크린될 수 있다.
ERE-tk-Luc 루시퍼라제 수용체 플라스미드 및 ER-RXR-α와 RAR-γ-VP-16 수용체 발현 플라스미드로 공동감염시킨 CV-1 세포의 사용에 기초한 RAR 음성 호르몬 스크리닝 방법은 RAR-γ-VP-16 플라스미드의 RAR-γ 부분이 페록시좀 증식-활성 수용체 (PPAR), 비타민 D 수용체 (VDR), 타이로이드 호르몬 수용체 (T3R) 또는 RXR과 혼성이합체화할 수 있는 기타 스테로이드 초과 핵수용체로 전환되는 것을 일반적으로 채택할 수 있다. 이와같은 플라스미드에 공동감염된 CV-1 세포는 높은 기저수준의 루시퍼라제 활성을 발현한다. RAR-γ 부분을 치환한 수용체의 도메인과 결합한 리간드와 결합할 수 있는 리간드는 루시퍼라제 활성을 억제하는 리간드 능력을 측정하여 음성호르몬 활성에 대하여 쉽게 스크린될 수 있다.
RXR과 혼성이합체화하지 않는 스테로이드 초과 핵수용체 (예, 글루코코르티코이드 및 에스트로겐 수용체)에 대하여, 동일한 종결결과를 이종 프로모터 요소 및 루시퍼라제 또는 기타 수용체 유전자와 혼성화된 적절한 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 반응 요소루시퍼라제 수용체 플라스미드로 구성된 GR-VP-16 또는 ER-VP-16 수용체를 사용하여 달성할 수 있다. 일반화된 음성 호르몬 스크리닝 분석의 본질적인 특징은 적어도 역길항체가 스크린되기 위한 특정 핵수용체의 리간드 결합도메인의 함유 및 수용체 유전자의 프로모터에 핵수용체 리간드 결합 도메인을 위치시키는 방법이다. 이는 수용체의 천연 DNA 결합부위를 사용하거나 또는 대안적으로 이종 DNA 결합 도메인을 보유한 키메라 수용체의 제조 및 이종 DNA 결합 도메인에게 인식되는 DNA 조절요소의 조절하에 위치한 수용체 유전자의 상응하는 사용으로 달성할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 역길항체를 스크린하기 위한 핵수용체를 발현하는 플라스미드는 높은 기초활성을 제공하기 위하여 HSV vP-16 활성화 도메인과 같은 구성적 활성화 도메인을 포함한 혼성단백질로서 이와같은 핵수용체를 발현한다. 이와같은 높은 기초활성은 효과적으로 분석감도를 증가시키며, 이로인해 첨가 핵수용체 길항제 부재시 기초 전사활성을 억제하는 핵수용체 리간드의 분석을 가능하게 한다.
하기의 실시예는 타이로이드 호르몬 수용체에서 음성 호르몬 활성을 갖는 화합물을 스크린하기 위하여 사용될 수 있는 방법에 관하여 기술한다.
실시예 26
타이로이드 호르몬 수용체 음성 호르몬을 동정하는 방법
CV-1 세포를 루시퍼라제 수용체 플라스미드 ERE-tk-Luc와 플라스미드 ER-RXR-α 및 T3R-VP-16에 공동감염시킨다. T3R-VP-16은 RAR-γ-VP-16의 RAR-γ 부분이 타이로이드 호르몬 수용체 cDNA로 치환된 것을 제외하고는 플라스미드 RAR-γ-VP-16과 동일하다. 이와같이, T3R-VP-16은 타이로이드 호르몬 수용체의 N-말단을 보유한 골격에 HSV VP-16의 활성화도메인을 포함한 혼성 단백질을 발현한다. 표준 감염 및 세포배양방법이 본 목적을 위해 사용된다. 감염 후, 세포를 세척하고 활성탄으로 추출된 10% 태아송아지혈청이 포함된 성장배지를 공급한다. 세포는 매개체만으로 (에탄올), 타이로이드 호르몬 (10-9내지 10-10M) 또는 TR-1 화합물 (10-9내지 10-6M)로 처리한다. TR-1은 타이로이드 호르몬 반응 수용제 유전자 및 타이로이드 호르몬 수용체 발현 플라스미드를 사용하여 결합경쟁연구에서는 타이로이드 호르몬 수용체와 강한 친화력을 보이지만, 일시적 공동감염 상호활성화 분석에서는 감염 타이로이드 호르몬 수용체를 활성화시키지는 않는 합성 타이로이드 호르몬 수용체이다. 추가로, TR-1은 타이로이드 수용체 길항제와 같이 상호활성화에 매개된 타이로이드 호르몬을 길항시킬 수 있다.
ERE-tk-Luc, ER-RXRα 및 T3R-VP-16에 감염된 CV-1세포로부터의 루시퍼라제 활성분석은 매개체-처리된 세포에서 높은 루시퍼라제 수용체 기초활성수준을 증명한다. 타이로이드 호르몬으로 처리한 세포는 투약량에 의존하여 루시퍼라제 활성이 다소 증가함을 보인다. TR-1으로 처리한 세포는 루시퍼라제 활성이 투약량에 의존하여 경감함을 보였다. 이는 TR-1이 타이로이드 수용체 역길항제 활성을 보이며, 이는 타이로이드 호르몬 수용체와의 증가된 NCP 상호작용에 기인한다고 추정된다.
인간 일차 망막색소 상피세포의 증식속도는 RAR 길항제 처리에 의해 억제된다. 본 관찰의 치료값은 망막재부착 수술 후 레티노이드 치료를 사용하였음을 증명하였다. 본 발명자는 공동투약방법에 있어서 AGN 193109 RAR 음성호르몬이 일차 RPE 세포를 ATRA 및 13-시스 레틴산 항증식효과에 대해 민감하게 할 수 있다는 것을 증명하였다. 추가로, 또한 AGN 193109는 RPE 세포를 기타 핵수용체 길항제의 항증식효과에 대해 민감하게 함을 보여주었다. 보다 명확하게 말하면, AGN 193109는 RPE 세포를 글루코코르티코이드 길항제, 덱사메타손 및 타이로이드 호르몬 길항제 3,3',5-트리이오도타이로닌 T3의 항증식 효과에 대해 민감하게 한다. 이와같은 데이터는 AGN 193109가 핵수용체류군들에게 분담된 NCPs 유용성을 변화시킨다는 모델과 일치하였다. 타이로이드 호르몬 수용체 역길항제 TR-1을 보유한 RPE 세포의 처리는 RAR 길항제 13-시스 레틴산과 같은 비타이로이드 수용체 길항제가 단일작용물 처리와 같은 13-시스 레틴산과 비교하여 RPE 배양물에 대한 증가된 항증식효과를 유도하는 것과 같이 분담된 NCPs 유용성을 유사하게 변경할 것이다.
하기 실시예는 일차 RPE 세포를 RAR 길항제의 항증식 활성에 대해 보다 민감하게 하는데 사용될 수 있는 방법을 기술한다. 그중에서도, 추가로 본 실시예는 RAR 길항제 활성의 음성호르몬 공동투약을 통한 효과증진 방법을 기술한다.
실시예 27
TR-1 타이로이드 호르몬 역길항제의 공통투약을 통한 RAR 길항제 항증식효과에 대한 일차 망막색소 상피세포 민감화
인간 일차 RPE 세포를 수득하고 표준방법에 따라 배양한다. 배양된 세포는 네 그룹으로 분리하고 다음과 같이 처리한다. 그룹 1은 매개체만을 투약한다 (에탄올). 그룹 2는 10-11내지 10-6M 농도로 13-시스 레틴산을 처리한다. 그룹 3은 10-11내지 10-1M 농도로 타이로이드 호르몬 역길항제 TR-1으로 처리한다. 그룹 4는 10-11내지 10-6M 농도의 TR-1과 13-시스 레틴산을 공통처리한다. 세포에 신선한 성장배지를 재공급하고, 5일동안 2일 간격으로 적절한 화합물을 재처리한다. 실험기간동안의 증식속도는 전기세포계수기를 사용하여 배양물내 세포수 측정을 통하여 정량화한다.
TR-1 처리한 세포(그룹 3)는 대조구세포(그룹 1)와 본질적으로 동일한 세포증식속도를 보이며, 측정된 배양물 성장속도에 대한 역길항제 효과가 없다. 13-시스 레틴산으로 처리한 세포 (그룹 2)는 투약량에 의존하여 세포수가 감소한다. 그룹 4 세포의 투약량 의존 세포증식 감소와 그룹 3에서 수득된 감소를 비교하여 그룹 2 세포와 비교되는 그룹 4 세포 (13-시스 RA 및 TR-1 공동투약)에서 왼쪽으로 RAR 길항제 투약반응곡선이 변경되는 것을 측정하여, RPE 배양물이 13-시스 레틴산의 항증식효과에 대해 민감하도록 하는 TR-1 타이로이드 호르몬 수용체 역길항제 공동투여 능력을 증명한다.

Claims (34)

  1. 하기 일반식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    상기식에서,
    X는 C(R1)2또는 O이고;
    R1은 수소 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이며;
    R2는 탄소수 1 내지 6의 저급 알킬, F, Cl, Br, I, CF3, 불소 치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬, OH, SH, 탄소수 1 내지 6의 알콕시 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬티오이며;
    m은 0 내지 3의 정수이며;
    R3은 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 F이고;
    o는 0 내지 3의 정수이고;
    s는 1 내지 3의 정수이며;
    R8은 탄소수 1 내지 10의 알킬 그룹 또는 트리메틸실릴알킬 (여기서, 알킬 그룹은 탄소수가 1 내지 10이다) 또는 탄소수 5 내지 10의 사이클로알킬 그룹이거나 R8은 페닐 또는 저급 알킬페닐이고;
    R15은 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, COR2, NR8CON(R8), OH, OCOR8, OR8, CN, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 불소 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬, 탄소수 1 내지 10이고 이중결합이 1 내지 3개인 알케닐, 탄소수 1 내지 10이고 삼중결합이 1 내지 3개인 알키닐 또는 트리알킬실릴 또는 트리알킬실릴옥시 (여기서, 알킬 그룹은 독립적으로 탄소수가 1 내지 6이다)이며;
    r은 0 내지 5의 정수이고;
    CONH 그룹은 벤조피란의 6 또는 7위치에 있고 디하이드로나프탈렌 환의 2 또는 3위치에 있다.
  2. 제1항에 있어서, X가 C(R1)2이고 R1이 CH3인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, r은 1이고 R15는 저급알킬인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, R15가 4-메틸인 화합물.
  5. 제2항에 있어서, o가 0인 화합물.
  6. 제2항에 있어서, m이 0인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, X가 O인 화합물.
  8. 제 7항에 있어서, r이 1이고 R15가 저급알킬인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, R15가 4-메틸인 화합물.
  10. 제7항에 있어서, R3이 CH3이고 o가 2이며 CH3치환체가 벤조피란 환의 2위치를 점유하고 있는 화합물.
  11. 제7항에 있어서, R2이 Br이고 m이 1이며 브로모 치환체가 벤조피란 환의 8위치에 있는 화합물.
  12. 하기 일반식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    상기식에서,
    X는 C(CH3)2또는 O이고;
    R2는 H 또는 Br이며;
    R2' 및 R2"는 독립적으로 H 또는 F이고;
    R3은 수소 또는 CH3이며;
    R8은 H, 탄소수 1 내지 6의 저급알킬이다.
  13. 제12항에 있어서, X가 C(CH3)2이고 R3은 H인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, R2가 H인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, R2'가 H인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, R8이 H 또는 에틸인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  17. 제15항에 있어서, R2"가 F인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, R8이 H 또는 에틸인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  19. 제12항에 있어서, X가 O이고 R3이 CH3인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, R2가 Br인 화합물.
  21. 제20항에 있어서, R2'가 H이고 R2"가 H인 화합물.
  22. 제21항에 있어서, R8이 H 또는 에틸인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  23. 제20항에 있어서, R2'가 F이고 R2"가 H인 화합물.
  24. 제23항에 있어서, R8이 H 또는 에틸인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  25. 제20항에 있어서, R2'가 F이고 R2"가 F인 화합물.
  26. 제25항에 있어서, R8이 H 또는 에틸인 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  27. RARα, RARβ및 RARγ로 이루어진 그룹중에서 선택된 레틴산 수용체 아유형에 결합할 수 있는 제1항에 따른 화합물인 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬을 레틴산 수용체 활성과 연관된 포유동물의 병리상태에 대하여 치료효과를 제공하기에 약제학적으로 효과적인 양으로 투여함을 특징으로 하여 상기 포유동물의 병리상태를 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 병리상태가 포유동물에 레티노이드 화합물을 투여한데서 기인한 독성 또는 부작용이고 치료효과가 그러한 독성 또는 부작용의 예방 또는 경감인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬이 포유동물에 의해 레티노이드 약물 또는 비타민 A 또는 비타민 A 전구체의 흡입에 의해 유발된 기존의 병리상태를 치유 또는 경감하기 위해 투여되는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬이 치료목적상 투여된 레티노이드 약물의 국소 부작용을 차단 또는 경감하기 위해 국소적으로 투여하는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬이 치료목적상 투여된 레티노이드 약물의 국소 부작용을 차단 또는 경감하기 위해 국소적으로 투여하는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬이 레티노이드 약물 또는 비타민 A에 의해 유발된 기존의 상태 또는 부작용을 치료하기 위해 국소적으로 투여되는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬이 레티노이드 약물 또는 비타민 A에 의해 유발된 기존의 상태 또는 부작용을 치료하기 위해 국소적으로 투여되는 방법.
  34. 제27항에 있어서, 레티노이드 길항제 또는 음성 호르몬이 레티노이드 약물 또는 비타민 A의 공동투여에 의해 유발된 골 독성을 차단 또는 경감하기 위해 전신적으로 투여되는 방법.
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