JPH08507506A - コラゲナーゼ活性阻害剤とそのような阻害剤を含む化粧品組成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 望ましくはソバ殻の水性タンパク抽出物から成るコラゲナーゼ活性阻害剤の使用法が明らかにされている。望ましくは、前記抽出物は、pH８の水性溶媒中に抽出することによって得られる。前記阻害剤を含む化粧品組成も明らかにされている。

Description

【発明の詳細な説明】 コラゲナーゼ活性阻害剤とそのような阻害剤を含む化粧品組成 本発明は、化粧品学の分野に係わるものである。 より正確には、本発明はコラーゲンの分解に関与する酵素活性を阻害する特性 を有する阻害剤に係わるものである。 コラーゲンは、結合組織の細胞間物質を構成するムコ多糖類由来のタンパク質 である。結合組織は、ヒトにおいては早期胚の間葉から形成され、皮膚、血管、 骨、鍵、軟骨、角膜等の多様な臓器の形成に関与している。結合組織は主に細胞 、繊維芽細胞、原繊維網から構成され、原繊維網は網状繊維、弾性繊維、コラー ゲン繊維の３種類の繊維から構成される。コラーゲン繊維を形成するコラーゲン タンパクは、中性可溶性コラーゲン、コラーゲンの主要形態である酸可溶性コラ ーゲン、加熱により水性媒質中でゼラチンに変換する特性を有する不溶性コラー ゲンの３つの形態で結合組織内に存在し得る。結合組織は、それが含まれる臓器 内で臓器を支持する役割を果たしており、この役割は本質的にコラーゲン繊維が 果たしている。結合組織の強度は、コラーゲン繊維が含まれる量とその方向によ って決定される。 皮膚の主要成分の１つであるコラーゲンは、数多くの研究テーマとなっており 、これらの研究は、特に化粧品学の分野において、角質層の水和と皮膚表面にフ ィルムを形成することにより皮膚の外見を改善することを主な目的とする多くの 化粧品組成の生産に応用されてきた。 また、化粧品学研究のもう１つの軸は、コラーゲン分解に関与する酵素、コラ ゲナーゼの阻害剤に関する研究である。 これらの阻害剤は、非常に多様な化学構造を持っているものと思われる。これ らは、システイン、スルホン酸塩、その中でも特にヒドロキシキノロンスルフォ ネート、フェナントロリン、EDTA、トリニトロベンゼンまたはアセチルイミダゾ ール等の低分子量（100ドルトン未満）化合物で、これらの低分子量化合物の中 で、システインが最も多用される阻害剤である。ケトン、アルデヒドまたはチオ エステルの形態の高分子量（1000ドルトン以上）ペプチドもコラゲナーゼ活性阻 害剤となり得る。 このような阻害剤は、特に皺取りクリームと、更に一般的には多くのスキンケ ア用組成に応用されている。 化学構造によるが、これらの化合物は合成または抽出によって得られる。 本発明の目的は、天然物から抽出されるコラゲナーゼ酵素活性阻害剤を提供す ることである。 本発明の第二の目的は、簡単かつ安価な抽出法を用いて得られるこのような阻 害剤を提案することである。 本発明の更なる目的は、化粧品学の分野で簡単に使用できる形態でこのような 阻害剤を調製することである。 これらの種々の目的は、ソバ殻のタンパク抽出物であるコラゲナーゼ酵素活性 阻害剤に係わる本発明によって達成される。 ソバ（buckwheat）は、タデ科（Polygonaceae）に属する１年草植物で、デン プンが豊富な種子を目的として栽培され、食品用に挽いて粉にされる。このタイ プの粉は、特にパンケーキを作るのに使用される。 ソバの実は、１種子を含む一般に殻と呼ばれる外被から構成され、痩果の外観 を有する。従って、フランス語で“ble noir”としても知られるソバは穀類であ り、製粉に使用するには、種子を含む殻を種子そのものから分離しなくてはなら ない。 今日まで、ソバの種子の殻には用途はなく、種子から分離後破棄されていた。 従って、本発明はこの副産物に付加価値を付ける手段となる。 本発明によるコラゲナーゼ活性阻害剤は、望ましくはソバ殻の水性抽出液から 成る。 本発明は、以下の段階から成るこのような阻害剤抽出処理工程にも係わるもの である。 ‐水性溶媒中でソバ殻を挽く。 ‐得られた混合物を一定温度でインキュベートする。 ‐得られた混合物を濾過する。 ‐濾過物を遠心分離する。 ‐前記タンパク抽出物を含む遠心分離上清を収集する。 また、前記溶媒は塩基性pHになるように緩衝されているという特色を有する。 望ましくは、処理工程に用いられるpHは８である。 同様に望ましくは、処理工程の種々の段階の実行温度は約25℃である。 処理工程の変法によれば、後者は前記タンパク抽出物を含む上清の限外濾過か ら成る更なる段階を含む。 本発明の別の変法によれば、処理工程は、前記タンパク抽出物を含む上清の透 析から成る更なる段階を含む。 最後に、処理工程は望ましくは最終凍結乾燥段階を含む。 本発明は、ソバ殻のタンパク抽出物であるコラゲナーゼ活性阻害剤を少なくと も１種類は含む化粧品用組成にも係わるものである。 本発明は、図を参照しながら、この後の本発明を限定することを目的としない 生産方法の具体例の説明を読むことによって、更によく理解されるであろう。図 の内容を下記に示す。 ‐図１は、処理工程のpHと温度に関するソバ殻１グラムに付き得られたタンパ ク量を示すグラフである。 ‐図２は、pHと温度に関する得られた抽出物中の可溶性タンパクのパーセンテ ージを示すグラフである。 ‐図３は、異なるpHと温度条件において、可溶性分画中の乾燥生成物100g中の タンパク含有量を示すグラフである。 １kgの普通のソバ殻（タデ科ソバ属）を、８倍容量のpH８の緩衝液（20mMトリス （塩酸）緩衝液）と混合する。次に、混合物を細かく挽き、この段階で得られた 生成物を25℃で１時間インキュベートする。次に、この生成物を、篩で濾過し、 遠心分離する。遠心分離により得られたタンパク抽出物を含む上清を収集し、こ の分画を限外濾過と凍結乾燥法により濃縮する。この処理工程の最後に、ソバ殻 １kg当たり30gのタンパク抽出物が得られる。 本処理工程の生産テストも、その前に使用された緩衝液を、pH６の20mMクエン 酸ナトリウム緩衝液とpH９の20mMトリス（塩酸）緩衝液に置き換えることによっ て、pH６とpH９において実施された。これらのテストはそれぞれ、25℃、37℃、 60℃で実施された。 これらの各テストにおいて得られたソバ殻１グラム当たりのタンパク抽出物の 量が表１に示されており、そのデータがグラフ形式で図１に再現されている。（ このタンパク抽出物の30gという値は、タンパク質に用いられる滴定法によるも のである。この場合に使用された方法は、以下の出版物に基づき、PIERCE研究所 によって開発されたB.C.A.法（Bicinchonimic Acid Protein Assay Kit）である 。L0WRY，O.H．et al．（1951）J．Biol．chem．193,265；TIKHONOV，V.N．and USTATIN，I.S．（1965）Zh．Anal．Khim．20,390；MAZ0NSKI，T．etal．（1963 ）Zeszyty，Nauk．Politech．Slask．Chem．13,63；SMITH，P.K．et al．（1985 ）Anal．Biochem．150,76）。 表２は、抽出されたタンパク分画中の可溶性タンパクのパーセンテージを示し ている。表２のデータは、図２にグラフ形式で再現されている。 最後に、表３は、得られた抽出物の可溶性分画の乾燥生成物（D.P.）100g中の タンパク含有量を示している。これらのデータは図３に再現されている。 表１、２、３において分類されたデータから、どの温度で処理工程を実施した 場合でも、pH＝６においてタンパク可溶化が最も低くなることが確認できる。収 率が最も低いのもこのpHである（ソバ殻１g当たり約20mg）。この収率は、pHを ８に固定すれば、同様にどの温度でも39％改善され、ソバ殻１g当たり約30mgに 達する。更に塩基性のpH（pH＝９）を用いると、タンパク抽出量は温度に比例す る。用いられた操作条件下では、操作温度を10℃上げると、抽出されるタンパク 量は約9g増加する。しかし、抽出されたタンパクの溶解度は得られたタンパク量 と直接比例していないことは明らかである。例えば、酸性度が高いpH値（pH＝６ ）と37℃の温度において、最大量のタンパク質が溶解するが（図２参照）、抽出 量は最小である（図１参照）。同様の溶解性の特色がpH＝９においても観察され る。pH８、60℃において、タンパク質の溶解度が最高となることが観察される。 しか し、pH８、温度が60℃または37℃において得られるタンパク質は比較的不安定で 、時間の経過と共に沈殿する傾向がある。 水性層で抽出された乾燥物質中に含まれるタンパク質のパーセンテージを検討 すると、pH＝６ではタンパク質が抽出物の1／2以上を占めることは決してないが 、塩基性のpH値では72％から82％を占めることが示されている。 これらの種々のテストから得られた結果から、pH８、温度約25℃で抽出処理工 程を行うのが望ましい。 この後者のpHと温度条件で抽出後得られたタンパク抽出物について、コラゲナ ーゼ活性をテストした。この活性は、以下の方法に従って評価した。 0.5％コラーゲンを微量滴定皿のミクロウェルに分配した。乾燥後、得られた タンパク抽出物50μｌ、次に重量で0.005％のコラゲナーゼ20μｌをウェルの中 に入れた。 ウェル皿を37℃で４時間インキュベートした。蒸留水で連続３回洗い流し、0. 25％クマシーブル−100μｌを加え、コラゲナーゼによるコラーゲン分解の指標 とした。 同時に、本発明によるタンパク抽出物を加えない微量滴定ウェル皿でテストを 実施した。この皿をネガティブコントロールとした。 インキュベーション後ウェルの染色を観察することによって、コラーゲン分解 阻害作用を評価した。 ＊青色の染色反応は、コラーゲンが分解されていない、つまりコラゲナーゼ活 性が阻害されていること（陽性反応）を意味する。 ＊染色反応が認められない場合には、コラーゲンが分解されている、つまりコ ラゲナーゼ活性が阻害されていないこと（陰性反応）を意味する。 ソバ殻のタンパク抽出物を用いてこのテストを実施すると、全てのウェルが青 色に変色した。より厳密な分析により、ソバ殻のタンパク抽出物は、１gのソバ 殻 当たり1600Uもの高いコラゲナーゼ阻害作用を示すことが明らかにされた。 従って、この種の抽出物は、皮膚に塗布することを目的としたクリームまたは その他の調合品を製造する化粧品学の分野で特に使用することができる。 本発明の実施に関する本具体例の目的は、発明の範囲を制限することではない 。特に、本発明の枠組みの範囲内で、記述されている以外の処理工程に従って、 ソバ殻に存在するタンパク分画を抽出することも考えられる。また、記述されて いる以外の他の種類の化粧品に、記述されているコラゲナーゼ活性阻害剤を使用 することも考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デグール，ヴァンサン フランス国、13004 マルセイユ、ブール ヴァール・ドゥ・ラ・フェデラシオン ４ (72)発明者 ジャロ，ジャクリーヌ フランス国、13015 マルセイユ、アンパ ス・デ・オリヴァデ 15 (72)発明者 セルベール，ジャン‐マリー フランス国、35380 プレラン・ル・グラ ン、ラ・シェズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ソバ殻のタンパク抽出物から成るコラゲナーゼ酵素活性阻害剤。 ２． 前記抽出物が水性抽出物である請求の範囲第１項記載のコラゲナーゼ酵 素活性阻害剤。 ３． 水性溶媒中でソバ殻を挽き、 得られた混合物を一定温度でインキュベートし、 得られた混合物を濾過し、 濾過物を遠心分離し、 前記タンパク抽出物を含む遠心分離上清を収集する、という段階から成り、 また、前記溶媒は塩基性のpHになるように緩衝されている請求の範囲第２項記載 の阻害剤の抽出処理工程。 ４． 前記pHが８である請求の範囲第３項記載の抽出処理工程。 ５． 前記段階が約25℃で実施される請求の範囲第３項または第４項記載の抽 出処理工程。 ６． 前記タンパク抽出物を含む前記上清の限外濾過から成る更なる段階を含 む請求の範囲第３項ないし第５項記載の抽出処理工程。 ７． 前記タンパク抽出物を含む前記上清の透析から成る更なる段階を含む請 求の範囲第３項ないし第６項記載の抽出処理工程。 ８． 前記処理工程が最終凍結乾燥段階を含む請求の範囲第６項または第７項 記載の抽出処理工程。 ９． ソバ殻のタンパク抽出物から成る凍結乾燥製品。 10． 少なくとも1種類のコラゲナーゼ活性阻害剤を含む請求の範囲第１項ま たは第２項記載の化粧品用組成。