JPH08506083A

JPH08506083A - ボツリヌスｂ複合体を含有する医薬組成物

Info

Publication number: JPH08506083A
Application number: JP6502542A
Authority: JP
Inventors: ジョンソン，エリック，エー．; グッドノー，マイケル，シー．; ボロディック，ゲイリー，シー．
Original assignee: アソシエイテッドシナプスバイオロジクス
Priority date: 1992-06-23
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1996-07-02
Anticipated expiration: 2019-03-29
Also published as: CA2138020A1; US5696077A; WO1994000481A1; JP3510886B2; CA2138020C; EP0654040A1; AU4646393A; AU1629297A

Abstract

(57)【要約】医薬的に許容し得る賦形剤と混合した、C．botulinum由来Ｂ型ボツリヌス神経毒および安定化蛋白質からなる複合体を含有する医薬製剤。この製剤は、不随意筋痙れんまたは収縮により特徴づけられる疾患の患者における漸増可能な、局所的な、選択的な筋脱神経を誘発するのに有効である。

Description

【発明の詳細な説明】ボツリヌスＢ複合体を含有する医薬組成物発明の背景本発明は、ボツリヌス菌（C.botulinum）から誘導された神経毒を含有する医薬組成物および、制御されない筋活性により特徴づけられる疾患を治療するために、筋の選択的、局所的脱神経（denervation）に対してそれを使用する方法に関するものである。ボツリヌス神経毒は、クロストリジウムボツリヌス（Clostridium botulinu m），クロストリジウムバラティ（Clostridium baratii）およびクロストリジウムブチリカム（Clostridium butyricum）の菌種のある菌株によって産生される。ハースウェイ（Hatheway）は、“Bacterial Sources of Clostridial N eurotoxins”，Botulinum Neurotoxin and TetanusToxin，Simpson，LL（ed）， Academic Press，San Diego（1989）において、この毒素をＡ〜Ｇと称する７種の血清型に分類している。ボツリヌス神経毒は、抹消神経からのアセチルコリ放出を遮断する薬理学的に同様な毒素の群を含む。十分な投与量において、神経毒は、麻痺および死亡を起す。 Clostridium botulinum（C．botulinum）は、自然界に広く存在しそして、稀に、缶詰製造前に適正に滅菌されなかった保存食品からの食品中毒（すなわちボツリヌス中毒）の原因となる菌種である。薬理学的に同様な神経毒であるけれども抗原的に異なることにより特徴づけられる７種の主な型のC．botulinum菌株がある。これらの非常に強力な神経毒は、特殊な抗毒素によってのみ中和することができる。型Ａのボツリヌス毒素は、現在ある機能亢進の筋疾患の臨床処置に対して、ＦＤＡにより認可されている。線条筋に局所的に注射した場合、ボツリヌス毒素は、アセチルコリンの放出を遮断することにより筋を脱神経し、それによって筋の収縮を減少させ、そして筋萎縮を誘発することを包含する一連の薬理学的効果を有している。これらの効果は、約10〜15週継続し、その後、筋はその収縮性を回復し、そして萎縮は逆転する。これらの効果、例えば、一時的な脱神経および収縮性は、ボツリヌス毒素を、制御されない筋痙れんにより特徴づけられる局所的運動疾患の治療に対して有用なものにする。ボツリヌスＡ毒素は、瞼痙れん、反面痙れん、痙れん性斜頸、痙れん性音声障害および局所的手筋緊張異常を包含する多数の分節運動疾患を治療するために使用されている。スコット（Scott）等、Arch．Ophthalmol.，103：347-350（1985）；エルストン（Elston）およびラッセル（Russell），Br.Med.J.，290：1857-1859（1985）；ダットン（Dutton）およびバックレイ（Buckley），Arch．Neurol.，43：380- 382（1986）；ボロディック（Borodic）およびコツオリノ（Cozzolino），P1ast .Reconstr.Surg .，83（3）：546-554（1989）；ボロディック（Borodic）等、Ea r Nose and Throat J.，67（12）；914（1988）；ジャンコビック（Jankovic）およびオーマン（Orman），Neurology，37：616-623（1987）；ゲルブ（Gelb）等、Neurology，39；80-84（1989）；フレッチヤー（Fletcher）およびクイン（ quinn），Curr．0pin．Neurol．Neurosurg.，2：330-333（1989）；ルドロー（L udlow）等、Otolaryngol．Head Neck Surg.，101；122-131（1990）；およびグイクストラ（Dykstra）等、J．Urol.，139：919-922（1988）． C.botulinumにより産生されるＢ血清型の神経毒は、Ａ型毒素とは免疫学的に異なっている。ＡおよびＢ型に対する部分的アミノ酸配列の分析は、軽鎖の場合よりも、重鎖の一次的および二次的構造の間においてより大なる相同性を示す。ＡおよびＢ血清型の間の構造的相同性の程度は、軽鎖に対しては約20％でありそして重鎖に対しては約40％である。Ａ型毒素に対する抗体とＢ型毒素との交叉反応性は非常に低く、そしてＡ型毒素に対する抗体は、マウス検査においてＢ型毒素を中和しない。電気生理学的研究は、ＡおよびＢ型神経毒が、神経伝達物質放出プロセスにおいて異なる段階に影響を及ぼすということを実証している。Ｂ型は、量子伝達物質放出の同期化に影響を及ぼし、そしてこれに対してＡ型は影響を与えない。神経伝達物質のカルシウム−依存性放出の阻害の可逆性における相違もまた存在する。カルシウムイオノフォーレ（ionophore）を使用した神経終末へのカルシウムの導入は、Ｂ型神経毒により中毒されたものよりも、Ａ型により中毒されたシナプトソームからより速やかに伝達物質の放出を生ずる。アミノピリジンは、神経筋接合部におけるＡ型神経毒により生ずる可逆性阻害においてより有効である。微小管−解離薬剤は、神経伝達物質放出に対するＢ型毒素の阻害作用を遮断するのに有効であり、そしてＡ型毒素に対して有効でないということを実証している。神経伝達物質の放出に対するＢ型神経毒の作用は、Acta Physiol．Scand.，11 9：127-133（1983）におけるL.S.Sellin等による動物試験において示されている。彼等は、ラットの後脚においてＡ型およびＢ型の神経毒の効果を比較した。彼等は、Ａ型毒素の１および20マウスLD₅₀の間の投与量が、ラットの脚において麻痺を生ずるけれども、同じ効果を生ぜしめるのにＢ型の毒素の1200LD₅₀より多くの投与量が必要であったことを報告している。さらに、彼等は、Ｂ型の神経毒の効果は、Ａ型の結晶性毒素に対する２週間に比較して、数日間持続されるにすぎないことを報告している。Ａ型の神経毒は、多数の筋痙れん疾患を治療するために有利に使用し得るけれども、それはすべての病気にかかった患者に対して使用することはできない。ある患者は、Ａ型ボツリヌス毒素に対して免疫性を有するようになり、そしてそれに対する抗体を産生し、それによってその有効性が減少される。文献、例えば、ツイ（Tsui）等、Ann．Neuro1．23：181（1988）；ブリン（Brin）等、Mov ．Disord. ，2：237（1991）には、Ａ型毒素で処理した若干の患者におけるＡ型毒素に対する抗体の産生の報告が記載されている。抗体が、ボツリヌス毒素の有利な作用を中和することが示されている（同上のツイ（Tsui）等の文献）。長年にわたるＡ型毒素の反復投与の長期間の効果は、明らかでない。しかしながら、筋痙れん疾患を治療するためのＡ型毒素に代わる薬剤が要求されている。発明の要約本発明は、患者に選択的な、局所的な漸増可能な（titratable）脱神経を誘発するのに有効である医薬製剤に関するものである。該製剤は、非毒性のボツリヌス由来蛋白質と結合したC．botulinumＢ型神経毒を含有する蛋白質複合体を有する。この複合体は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定して、約300キロダルトン（KD）以上、好ましくは約300〜450KDの分子量を有す。この複合体は、使用可能な投薬単位への稀釈中および稀釈後の複合体の安定性を維持することを助ける賦形剤と混合される。本発明の製剤は、約7.3以下、好適には7.0以下のpH を有することにより特徴づけられる。中性〜酸性のpHレベルが複合体の安定性を改善し、そして複合体は、賦形剤の蛋自質の存在下で凍結乾燥することにより保存できるということが見出された。賦形剤は、好ましくは医薬的に許容し得る蛋白質、例えば、ヒト血清アルブミンおよび（または）ゼラチンである。賦形剤の存在は、神経毒／蛋白質複合体の溶液安定性を維持しながら、製剤を有用な投薬単位に稀釈することを可能にする。賦形剤は、また、組成物の凍結乾燥及び再構成に対する複合体の溶解性および活性を保持することを助ける。この医薬製剤を使用して、制御されない筋痙れんにより特徴づけられる運動疾患を治療する方法も、また、本発明の目的である。処置は、本発明の製剤の有効な投与量を直接病気にかかった筋に非経口的に局所的に投与することを含む。神経毒複合体は、一時的に筋と神経末端との間の神経接合を中断または低下し、それによって筋の不随意の収縮を軽減する。本発明の製剤を使用して治療することのできる疾患は、例えば、瞼痙れん、反面痙れん、痙れん性斜頸、痙れん性音声障害、局所的手筋緊張異常および筋肥大を包含する。図面の簡単な説明図１は、C．botulinumＢ型複合体の精製における工程を説明するフローチャートである。図２は、50mMクエン酸ナトリウム中のpH5.5におけるＤＥＡＥ−セファデックス上のクロマトグラフィー後の粗製複合体の存在を示すグラフである。図３は、Ｏ→0.5 M NaCl勾配を使用した20mM燐酸ナトリウム中のpH7.9におけるＤＥＡＥ−セファデックス上の複合体をクロマトグラフィー分離し、純粋な神経毒および結合した非毒性の結合蛋白質とすることを示すグラフである。ピーク１は、純粋な神経毒を示し、そしてピーク２〜５は、結合した非毒性の蛋白質を示す。発明の詳細な説明本発明の医薬製剤は、賦形剤と一緒にした、精製されたボツリヌスＢ型毒素および非毒性のボツリヌス由来蛋白質の安定な複合体を含む。この組成物は、制御されない筋痙れんまたは機能亢進により特徴づけられる痙れん性および／または収縮性筋疾患を治療するのに有用である。本発明の組成物に使用されるボツリヌス毒素は、Clostridiumbotulinum（C．b otulinum）から誘導されたＢ血清型毒素である。この神経毒は、約150,000ダルトンの分子量を有する蛋白質である。この毒素の活性形態は、１個または２個以上のジスルフイド結合により結合された軽鎖（〜50,000ダルトン）および重鎖（〜100,000ダルトン）からなる二鎖分子として存在する。 C．botulinum菌株Okra Ｂから誘導されたＢ型神経毒が、特に好ましい。C．bo tulinum Okra Ｂは、種々の研究グループからおよびアメリカンタイプカルチャーコレクションからＡＴＣＣ No.55323として入手することができる。上記神経毒との複合体の一成分を形成するボツリヌス由来蛋白質は、C．botul inum により神経毒と一緒に同時発現（Coexpressed）される赤血球細胞凝集因子を含む。この蛋白質は、上記神経毒と安定な複合体を形成する。１種または２種以上の蛋白質が、神経毒分子と結合することができる。Ｂ型神経毒および少なくとも１種の蛋白質から形成された好ましい複合体は、約300KDの分子量を有している（Ｍ複合体）。Ｂ型神経毒および少なくとも２種の蛋白質から形成された他の好ましい複合体は、約450KDの分子量を有している（Ｌ複合体）。これらの複合体は、複合しない神経毒に比較してすぐれた安定性および力価を有するために好ましい。ＬおよびＭ複合体の特異的毒性は、それぞれ、窒素（Ｎ）１mg当り約 4.0×10⁷〜4.8×10⁷マウス LD₅₀およびＮ１mg当り約8.8×10⁷〜9.6×10⁷マウスLD₅₀である。C．botulinum から精製されたＢ型毒素は、一般に、ＬおよびＭ複合体の混合物として存在する。賦形剤は、好ましくは稀釈および凍結乾燥中に、精製された製剤に加えられる。使用される賦形剤なる用語は、ベヒクルまたは安定剤として医薬製剤に加えられる医薬的に不活性な物質を意味する。この場合においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはゼラチンのような蛋白質賦形剤が好ましい。医薬製剤は、好ましくは7.3またはそれ以下、より好ましくは7.0またはそれ以下のpHを有している。酸性のpHレベルの使用は、稀釈中および稀釈後の毒素複合体の安定性を改善し、そして凍結乾燥およびその後の再構成に対して毒素複合体の活性を維持することを助ける。約7.0以上のpHレベルは、複合体を解離し、凍結乾燥によって活性の喪失を起こす。本発明の組成物は、次の一般的操作により製造することができる。Ｂ型神経毒および結合した凝集蛋白質を発現するC．botulinum菌を、これらの細菌を培養するために当業者に認識されている技術を使用して、合点（Confluence）まで発育させる。神経毒−蛋白質複合体は、細菌によって培地中に放出される。この培地から、例えばpHを約3.5またはそれ以下に低下することによって、それを沈澱させることができる。それから、神経毒複合体を含有する沈澱を培地から分離する。毒素は、pHを約6.5に上昇し、そしてCaCl₂の存在下において周囲温度で撹拌することによってはじめの沈澱物から抽出する。溶解しない物質を遠心分離により除去する。それから、上澄液中の毒素を、塩酸（HCl）を添加してpH3.7にすることによって、再沈澱させる。第２の沈澱物を遠心分離により集め、pH5.5の50mM クエン酸ナトリウムに溶解し、そしてそれに対して十分に透析する。他の酸性緩衝液をクエン酸ナトリウムの代わりに使用することができる。透析した毒素複合体は、例えば、DEAE-Sephadex^TMのようなアミン−官能基質を使用してpH5.5における陰イオン交換クロマトグラフィー処理する。結合しないフラクションが複合体を含有する。毒素複合体を硫酸アンモニウムで沈澱させ、そして沈澱をヘレット化し（例えば、遠心分離によって）そして必要に応じて、透析およびクロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。得られた物質は、実質的に発熱性物質または原核生物の蛋白質を含有していない、その結合した蛋白質と高度に純粋なＢ型神経毒との高度に濃縮された非結晶性の複合体である。本発明の医薬製剤を製造するために、精製された複合体を、賦形剤とおよび滅菌した稀釈剤と混合して毒素複合体を使用可能な投与レベルにうすめる。賦形剤の存在は、稀釈中および稀釈後の複合体の安定性を維持することを助ける。稀釈剤は、複合体の安定性に不利な影響を与えない何れの医薬的に許容し得る物質であってもよく、そして好ましくは、滅菌した生理的食塩水、生理学的緩衝液または水である。本発明の好ましい態様においては、毒素溶液のpHは、中性〜酸性のpH、好ましくは7.0以下のpHに調節される。これは、例えば、塩酸のような酸を使用して達成することができる。低いpHレベルは毒素複合体の取扱い中良好な安定性を与え、そして乾燥および次の再構成後の高いレベルの活性度の回収を可能にする。本発明の方法を使用してpH5.0で凍結乾燥した後、毒素活性度の9 0〜100％の回収が得られた。結果は、pH6.4（商業的に入手できるＨＳＡのpH）における乾燥が、活性度の≧75％を回収することを示す。神経毒複合体および賦形剤を含有する製剤は、必要に応じて貯蔵および（または）輸送のために乾燥し、そしてその後再構成することができる。乾燥は、好ましくは、凍結乾燥により達成される。凍結乾燥は、滅菌されたバイアル中の毒素複合体をフラッシェ凍結し、そして製剤中に存在する水を真空下で昇華することによって実施される。凍結乾燥した製品は、例えば、水、生理的食塩水または標準の燐酸塩緩衝液で再構成し、そして注射に先立って、pHを7. 3〜7.4の生理学的範囲に調節する。賦形剤は、好ましくは稀釈中および稀釈後の複合体の溶液安定性を与え、そして凍結乾燥および再構成に対して複合体の所望の活性レベルを保持するのに十分な濃度で使用される。賦形剤は、また、毒素がガラスに粘着しないことを確保する。これらの目的を達成するのに必要な濃度は、部分的に使用される賦形剤に依存する。複合体100単位（U．マウスLD₅₀として測定）当り賦形剤約0.1〜1.0mgの濃度が、大部分の処方に対して十分である。例えば、複合体100Uを含有するバイアル１個ありりヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）約0.9mgの濃度が、稀釈中および組成物の凍結乾燥および再構成において毒素複合体に安定性を与える。毒素複合体は特に賦形剤の不存在下、非常な稀釈溶液中にある場合は、変性および不活性化を受けやすい。バイアルの充填および凍結乾燥に先立つ濾過による毒素の殺菌は、殺菌された安全な製品を確保する。本発明の医薬組成物は、罹患した筋の痙れん性収縮を一時的に軽減するために、痙れん性筋疾患の患者に投与することができる。Ｂ型複合体は、不随意筋収縮を中断するけれども、それは処理した筋における随意筋収縮を可能にすることができる。一つの態様においては、治療は、例えば、筋電計コントロール下で微細なゲージのテフロン−被覆針を使用して、医薬組成物を直接筋に注射することからなる。毒素の十分な投与は、横紋筋に作用して、シナプス前膜からのアセチルコリン神経伝達物質の放出を遮断する。これは、毒素によって収縮した領域における筋の有効な脱神経を生ずる。この毒素は脱神経に対する特有の生理学的応答として起こるシナプス後アセチルコリンエステラーゼ活性の増加およびアセチルコリン受容体の集団の増加を起こす。数日後に軸索末端は新芽を形成し、そして数カ月にわたって、側副運動軸索は、筋繊維との新しい神経筋結合を確立する。神経筋結合が再生するにつれて、筋の機能は、疾患の痙れん性収縮症状とともに復帰する。それから治療を反復しなければならない。疾患に対して投与される本発明の組成物の投与量は患者の体重および治療される筋グループに依存する。一般に、それは、１回の投与量当り約1000Ｕ（Ｕはホワイトマウスに対するLD₅₀として定義される）以下である。１マウスLD₅₀は、１ Uに等しいものであると考えられる。特定の場合における投与量は、経験的に、非常に低い投与量から出発し、そして観察および経験によって投与量を増加するように決定することができる。異なる個々の患者は、異なる方法で処置に応答することができるので、選択された条件に対する一患者における有効な投与量は、同じ条件の他の患者に対して必要な投与量と同一ではない。しかしながら、Ａ型毒素の治療プロトコールが、若干のガイドラインを与える。一般に、はじめに低い投与量を投与し、そして効果を測定する。投与量は、最低の副作用をもって所望の効果が得られるまで小量づつ増加する（すなわち、漸増する）。ボツリヌス神経毒を標準化する方法および臨床的使用に対する独特に標準化された投与量を製造する方法は、“Controlled Administration of Chemodenervating Pharmace uticals”と題する発明の名称の米国特許出願07/570,395に記載されている。該米国特許出願の教示を参照として本明細書中に引用する。数Ｕ乃至約500〜1000Uまでの投与量を、所望の治療効果を達成するために使用することができる。好ましい投与量は、約500U以下、好ましくは300U以下である。例１は、マウスLD₅₀を基にしてＢ型神経毒複合体の活性を測定する方法を記載する。本明細書中に記載したボツリヌスＢ型神経毒複合体は、通常の神経伝達物質放出の可逆的阻害を与える神経筋接合における化学的脱神経を生ずる。本発明の医薬的組成物は、高度に純粋なそして高度に活性なＢ型複合体を含有しており、そしてこの組成物は、痙れん性または機能亢進性筋活性により特徴づけられる神経筋疾患を治療するのに有用である。本発明の組成物は、安定な注射することのできる処方およびこれらの痛い、そして衰弱させる疾患に罹患した患者を治療するためにこれらの処方を使用する方法を提供する。さらに、本発明を、以下の例により説明する。しかしながら、これらの例は如何なる点においても本発明を限定することを企図するものではない。例Ａ．C.botulinum Okra ＢからのＢ型複合体の精製材料 TPGY：トリプチケースペプトン、グルコース、酵母エキス、トリプチケースペプトン（BBL Miicrobiology Systems， Becton Dickinson and Co.，Cokeysville，MD 21030） 5.0％バクトペプトン（Difcs Labs，Detroit MI） 0.5％ D-グルコース（Mallinckrodt，Paris，Ky） 0.4％システイン-HCl（Sigma Chemical，St．Louis MO） 0.2％酵母エキス（Difco） 0.1％；pH 7.4 M's培地；トリプチケースヘプトン（BBL） 2.0 ％バクトペプトン（Difco） 0.75％ D-グルコース（Mallinckrodt） 0.5 ％酵母エキス（Difco） 1.0％；pH7.4 DEAE-Sephadex^TMA-50（Sigma）操作ＴＰＧＹ管（10ml）に、C．botulinum Okra Ｂ（ＡＴＣＣNo．55323）の凍結した貯蔵培養菌0.5mlを接種した。この管を37℃で一夜培養した。次の日に、M's 培地の１ｌの増進培養液に、ＴＰＧＹ管の約10mlを接種し、そして37℃で培養した。24時間後に、M's培地の12ｌの大型ガラス瓶に、この増進した培養液を接種し、そして37℃で４日間培養した。４日後に、培養液を室温にし、そして大型ガラス瓶中の培養液のpHを3N H₂SO₄でpH3.5に低下させた。得られた沈澱を室温で一夜沈降させた。次の日に透明な上澄液を傾瀉分離し、そして沈澱を２ｌの目盛りをしたシリンダー中でさらに沈降させた。次の日に、残りの上澄液を除去し、そして1.0 M CaCl₂ 150mlを撹拌しながら加えた。全容量を脱イオン化水で2.0ｌに増加させ、そしてpHを１N NaOHで6.5に上昇させた。毒素溶液を遠心分離により清澄化し、そして1N HClをpH3.7になるように添加して毒素を再沈澱させた。得られた沈澱を室温で一夜沈降させた。次の日に、毒素沈澱を遠心分離により集め、そして50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）約50mlに溶解した。毒素を同じ緩衝液に対して一夜十分に透析した。透析した毒素を遠心分離し、そして上澄液をpH5.5の50mMクエン酸ナトリウムで平衡化したＤＥＡＥ-Sephadex（Sigma ）の1000mlカラム上でクロマトグラフィー処理した。図２に示されるように0.51 のＯＤ_260/278の比を使用して、Ａ_278nmにおける溶液の光学密度を測定（278nmにおける1.0吸光度単位＝1ml 当り蛋白質約1.8mg）することにより測定して、未結合のフラクションは、蛋白質135mgを含有する。得られた複合体は非結晶性であり、そして１mg当り約3×10⁷ LDの平均特異的毒性を有している。毒素複合体は、硫酸アンモニウムを使用して60％飽和にすることによって沈澱させた。必要である場合は、硫酸アンモニウム沈澱物約30mgを遠心分離によりペレット化した。このペレットをpH7.9の25mM 燐酸ナトリウムに溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析した。それから毒素複合体をpH7.9のＤＥＡＥ-Sephadexの40mlカラム上でクロマトグラフィー処理した。複合体の毒素および結合した非毒性の結合蛋白質は、図３に示されるように、 0〜0.5M NaClの線状勾配を使用して分離し、毒性および非毒性の蛋白質を分離した。図３におけるピーク１は、精製された神経毒を示し、そしてピーク２〜５は、非毒性の結合蛋白質を示す。Ｂ．医薬に使用されるボツリヌスＢ型毒素の製剤ボツリヌス毒素の医薬製剤は、上述したようにして得られた精製された毒素を使用して製造した。製剤は、次の処方を有す。 C．botulinum Ｂ型毒素（25mM燐酸ナトリウム（pH6.4）に0.07mg/mlの濃度で溶解した非結晶性の懸濁液）；アルブミン（ヒト、２５％溶液ＵＳＰ）0.72ml；および滅菌した蒸留水99.28ml。生物学的活性の測定上記毒素の生物学活性は、溶解およびろ過後マウス検査により測定した。毒素は、完全に溶解するのに３時間未満を必要とする。溶解は、しばしばおだやかに混合しながら、室温で遂行した。泡立ち攪拌および渦巻き攪拌のような激しい攪拌は、それが変性を起こすため、避けなければならない。それから、この使用原料の力価を、マウスにおける腹腔内注射による毒素の力価測定にって測定した。この力価測定は、毒素／ＨＳＡ溶液を30mM燐酸塩（0.2 ％のゼラチン含有、pH6.2）（ゲル−燐酸塩）中において消去まで連続的に稀釈し、そしてそれぞれの稀釈液0.5mlを体重18〜22gの白マウスに腹腔内的（ＩＰ）に注射することにより行われた。それから48〜72時間で殺す最終稀釈液を、２マウスLD₅₀/ml（１マウス致死量/0.5ml）を示すと仮定した。この稀釈から、使用原料のLD₅₀/mlの数値を計算することができる。それから、この使用原料を同じ滅菌した9.0mg／mlのＨＳＡ中における1,000LD₅₀/mlまで稀釈した。この原料毒素溶液を４℃で貯蔵した。４〜６匹のマウスのそれぞれに、終点に達するまで適当な稀釈液0.5mlを腹腔内的に注射した。それから、注射したマウスの数の50％を殺す稀釈液を１LD₅₀/0 .5mlまたは２LS₅₀/mlを示すものとみなした。この情報から、もとの使用原料の力価を計算し、そして適当な稀釈を行って200LD₅₀/mlを有する溶液を得た。それから、それぞれ0.5mlを滅菌したバイアル中に滅菌的に入れ、そしてバイアルそれ自体を凍結乾燥し、そして窒素下で密閉した。凍結乾燥後のバイアルの力価は適当な数を試料取りすることにより測定した。検査のために、約100LD₅₀を含有するバイアルを試験されるそれぞれのバイアルに滅菌した水または生理的食塩水1.0mlを加えることにより再構成した。毒素およびＨＳＡをおだやかな転倒混合により、室温で少なくとも15分再溶解させた。それから、内容物を連続的に次の通り稀釈した。 1:20 （ゲル−燐酸塩1990μl中再構成した毒素100μl）、 1:30 （ゲル−燐酸塩1933.3μl中再構成した毒素66.7μl）、 1:40 （ゲル−燐酸塩1950μl中再構成した毒素50μl）、 1:50 （ゲル−燐酸塩1960μl中再構成した毒素40μl）、 1:60 （ゲル−燐酸塩1967.3μl中再構成した毒素33.3μl）。それから、３匹のマウスのそれぞれに、上記の稀釈液のそれぞれ0.5mlを腹腔内的に注射し、そして48〜72時間観察した。上記から計算した終点は、バッチが使用される前、100LD₅₀/バイアル±20％であった。Ｃ．ウサギにおけるボツリヌスＢ毒素の組織化学的作用方法および材料これらの実験に使用されたＢ型毒素は、C．botulinum ＣＤＣ培養菌208〔“ 豆菌株（bean strain）”-British Culture Collection NCTC-7273〕から製造した。この微生物は、５価ワクチンの処方に使用されるＢ型トキソイド製剤に対する源を与える。培地は、1000mlを形成するのに十分な量の普通の生理的食塩水中で稀釈されたトリプチケース（BBL Microbiology Systems）15gおよび酵母エキス５gからなる。pHを、水酸化ナトリウムで7.2に調節した（溶液Ａ）。20％のグルコースからなる他の溶液を121℃で15分オートクレーブ処理した（溶液Ｂ）。溶液Ａ10mlを、溶液Ｂ200mlに入れた（溶液Ｃ）。微生物の24時間培養液を、ＣＭＧ培地（BBL Microbiology Systems）を使用して得た。ＣＭＧ−ボツリヌスＢ毒素培養液を使用し溶液Ｃに接種した。毒性測定を３日にわたり行なった。１日・・・・10,000マウスLD₅₀/ml ２日・・・・100,000マウスLD₅₀/ml ３日・・・・100,000マウスLD₅₀/ml IU＝白マウスに対する１LD₅₀ ３日後に、３Ｎ硫酸をフラスコに加えた。これは安定な生物学Ｂ型毒素活性を有する懸濁液、“泥液（mud）”を与える。この製剤をpH4.7に調節した酢酸塩緩衝液中に５％のグリセリンおよび５％のゼラチンを含有する普通の塩溶液で稀釈した。筋組織病理学２〜３kgの白ウサギの背最長筋から得た標本を直ちに冷（４℃）ホルモール− カルシウム（Bakerの溶液）中に入れ、そして４℃で６〜12時間固定した。それから、筋標本をガム・シュークロース溶液中で３時間凍結防止した。筋をＯＣＴ化合物（Tissue Tek）中において、標本チャックで横および縦平面の両方において配向し、そして低温槽で凍結した。切断組織切片（10μm）を、ゲル−被覆スライド上に接着させ、２分間空気乾燥し、そして次にアセチルコリンエステラーゼ活性のために染色した（Geneser-：Jensen and Blackstad，1971）。筋原線維ＡＴＰアーゼ活性（Brooke，Kaiser（1969）；Dubowitz and Brooke，In：Muscl e Biopsy：A Modern Approack，J.N.Walton（ed.），W.B.Saunders CO．Ltd．Lo ndon（1973））およびＮＡＤＨ活性（Scarpelle，Hess，Pearse，（1958）；Dub owitz and Brooke，同上文献）に対する酵素組織化学を標本に対して行なった。アセチルコリンエステラーゼ活性に対する切片は、マレイン酸緩衝液（マレイン酸1.96g，NaOH 0.8g，IN NaOH 10.8ml，蒸留水200ml）13ml，アセチルチオコリンアイオダイド10mg、0.03M硫酸第二銅2ml、0.1Mクエン酸ナトリウム１mlおよび0.5Mフエリシアン・カリウムを含有する溶液中で37℃で１時間培養した。引き続いて低温槽切片は、ヘマトキシリンおよびエオシンで、またはゴモリトリクローム染色で染色して正常な組織形態を評価した。また、新鮮な骨格筋組織をイソペンタン中でフラツシュ凍結し、そして液体窒素を使用して-160℃に冷却した。連続切断切片（10μm）を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはトリクロームで染色して組織変化を確認した。アセチルコリンエステテラーゼ活性に対する酵素組織化学を使用して終板構造を定量し、そして脱神経を評価した。組織学的測定は、バイオクアント（Bioquant II）システムを使用して行なった。線維サイズ変動（variation）比較を少なくとも200の線維の直径から計算した標準偏差および変動値（variance volues）を使用して行なった。また、Ｆ比試験を行なって線維サイズ変動性を比較した。結果：ａ．ボツリヌスＢ毒素の点注射後５週間（投与量＝15U/kg）脱神経の指標として繊維サイズ変動性分析を使用して、ボツリヌスＢ毒素の注射５週間後に、注射部位における著しい程度の繊維サイズ変動性を実証した（繊維サイズ直径中央値＝44.4ミクロン、変動＝493、標準偏差＝22.2）。未処理の比較対照値（繊維サイズ直径平均値＝37.95、変動＝78.6、標準偏差＝8.9）に比較した場合、繊維サイズ変動は、比較対照より有意により大きかった（Ｆ比＝4. 32 Ｐ＜0.01）注射点から3.0cmの筋生検と比較した場合、繊維サイズ変動性の有意な減少（繊維直径中央値＝58、変動＝278、標準偏差16.4）がみられた。３cmにおける繊維サイズ変動性は、注射点とは有意に異なっており（Ｆ比＝1.77、Ｐ＜0.05）、局所脱神経が３cmの部位におけるよりも注射部位においてより著しいことを示す。しかしながら、3.0cmにおける繊維サイズ変動性は、比較対照標本における繊動性より有意に大きく（Ｆ比＝2.4、Ｐ＜0.01）、注射点からのこの距離においてさえ脱神経が行なわれていることを示す。さらに、コリンスステラーゼの拡散は、注射部位においてもっとも著しかった。注射部位から３cmの部位においては、アセチルコリンエステラーゼ拡散は実質的に減少し、正常な強度に接近する。比較対照標本においては、pH9.4における筋原繊維ＡＴＰアーゼ活性は、１型および２型繊維を実証する。１型／２型繊維の数または％比は、全体の3.5％であった。１型繊維は、生理的食塩水を注射した比較対照組織において筋標本を通じて一様に分布している。注射部位においては、両型の繊維に対して影響を与える筋繊維サイズの著しい変動がある。繊維型のパターンが小さなグループ又は１型繊維で変化することは、脱神経および再新を示唆する。１型／２型繊維の比が顕著に増加して、１型繊維は、全集団の22％を示す。注射部位から3.0cm離れた部位においては、繊維サイズ変動性は非常に少ない。１型の繊維の％は減少（全体の10.7％）するけれども、なお正常でない。ＮＡＤＨ活性は、同様に、繊維サイズならびに繊維型の変化を示す。さらに、確認された方法は、注射部位における脱神経と一致した筋原繊維間のネットワークを変化する。ｂ．ボツリヌスＢ毒素の点注射後１４週間１４週間対５週間における注射部位を比較した場合、アセチルコリンエステラーゼ染色は有意に低い。比較対照と比較した場合、１４週間におけるアセチルコリンエステラーゼ活性の差は非常に小さい。繊維サイズ変動性は、注射１４週間後において、比較対照変動性とは有意に相違しない（平均直径＝29.5ミクロン、変動＝75.7、標準偏差＝8.7、Ｆ比＝0.7 Ｐ＝NS）。さらに、１３週間後注射位から４cmはなれた筋組織と注射部位と比較した場合、繊維サイズ変動性またはアセチルコリンエステラーゼ染色パターンに差はない（繊維直径＝28.1、変動54、Ｓ＝7.4、Ｆ比＝0.47、Ｐ＝NS）。要約すると、14週間においては、アセチルコリンエステラーゼおよび繊維サイズ分析は、有意な脱神経を示すものとは思われない。ｃ．５週間後のボツリヌスＡ毒系拡散勾配データ（投与量＝２-３U/kg）試験した３匹の動物において、筋繊維に対するアセチルコリンエステラーゼ染色の拡散と関連した注射部位におけるかなりな繊維サイズ変動があった（直径中央値＝27.3ミクロン、Ｓ＝24.55、Ｖ＝212、Ｆ比＝2.5、Ｐ＜0.01）。注射部位からの15mmの部位においては、同様な繊維サイズ変動性およびコリンエステラーゼ拡散（直径中央値＝30.7、Ｓ＝12.9、Ｖ＝166、Ｆ＝1.98、Ｐ＜0.01）が認められた。40mmにおいては、アセチルコリンエステラーゼ染色パターンならびにより一様な筋繊維直径サイズのかなりな収縮があった（直径中央値＝24.9、Ｓ＝9. 7、Ｖ＝93、Ｆ＝1.11、Ｐ＝NS）。45mmにおいては、アセチルコリンエステラーゼ染色パターンおよび筋繊維サイズ変動は、比較対照（直径中央値＝30.6、Ｓ＝ 6.4、Ｖ＝41、Ｆ＝0.49、Ｐ＝NS）と同様であった。ｄ．背最長筋の長さにわたる比較対照筋繊維直径サイズおよびアセチルコリンエステラーゼ染色パターン第１表は、同じ生理的食塩水注射部位および15mm間隔における繊維サイズ変動性およびアセチルコリンエステラーゼ染色パターンの比較対照値を示す。結果は、Ｂ型毒素は、点注射から局所脱神経を生じせしめることができ、そしてＡ型毒素と同様な可逆性を有している。それ故に、Ａ毒素で薬理学的に有用である局所脱神経効果は、Ｂ毒素の適用によって二倍にすることができる。均等性当業者は、通常の実験を使用して、本明細書に記載した特定の態様に対しいくつかの均等を確かめることができる。このような均等は、以下の請求の範囲に包含されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年５月１１日【補正内容】請求の範囲１．１ml当り10⁴マウスLD₅₀単位またはそれ以下の濃度における複合体の安定性を維持するための医薬的に許容し得る賦形剤と混合された、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定して約300KD〜約450KDの分子量を有する複合体を形成するボツリヌス由来安定化蛋白質と結合したC．botulinumＢ型神経毒を含有する凍結乾燥した実質的に塩を含有していない製剤からなり、そして水溶液中で再構成したときに、その毒性活性の少なくとも75％を保持する製剤からなる局所的な、部分的な、漸増可能な筋脱神経を誘発するのに使用される医薬製剤。２．再構成したときに5.0と7.3との間のpHを有することを特徴とする請求の範囲第１項記載の医薬製剤。３．約7.0より低いpHを有する請求の範囲第２項記載の医薬製剤。４．再構成したときに、その毒性活性の少なくとも90％を保持する請求の範囲第１項記載の医薬製剤。５．蛋白質賦形剤がアルブミンおよびゼラチンからなる群から選択されたものである請求の範囲第１項記載の医薬製剤。６．安定化蛋白質の少なくとも１種が、C．botulinumにより神経毒と一緒に同時発現された赤血球細胞凝集因子からなる請求の範囲第１項記載の医薬製剤。７．実質的に上記の神経毒および安定化蛋白質以外の細菌蛋白質を含有していない請求の範囲第１項記載の医薬製剤。８．随意収縮を可能にしながら不随意収縮を滅少させるのに十分な再構成した組成物の投与量を筋体積内の一点に注射し、そして該投与量を筋体積を通して拡散させてその部分的脱神経を誘発させることを可能にすることによる、哺乳動物の筋の体積を選択的、部分的、一時的、化学的に脱神経する医薬の製造に対する請求の範囲第１項記載に記載された再構成した製剤の使用。９．筋の予定された体積内の離れた部位に再構成した組成物の個々の投与量を注射することからなり、そしてこれらの部位の場所的関係が、該体積の全体を少なくとも部分的に脱神経するのに十分なものである請求の範囲第８項記載の使用。 10．筋の体積が単一の筋からなり、方法が、上記組成物の単位投与量を筋の神経支配帯域に注射し、そして該投与量を該神経支配帯域を通して拡散させて筋の全体の部分的脱神経を誘発させることから請求の範囲第８項記載の使用。 11．筋の神経支配帯域の少なくとも一部分に、随意筋剌激を可能にしながら、痙れんおよび不随意収縮を減少させるのに十分な量の再構成された製剤を投与することによる、病原性神経剌激により誘発された患者の筋の痙れんおよび不随意収縮を減少する医薬の製造に帯する請求の範囲第１項記載の再構成された製剤の使用。 12．筋の神経支配帯域の少なくとも一部分に、随意筋剌激を可能にしながら、振せん、硬直または痙性を減少させるのに十分な量の再構成された製剤を注射することによる、振せん、硬直または痙性を減少する医薬の製造に対する請求の範囲第１項記載の再構成された製剤の使用。 13．水性媒質中で再構成したときに、その活性の75％以上を保持する凍結乾燥された実質的に塩を含有していないボツリヌス毒素製剤。 14．水性媒質中で再構成したときに、その活性の90％以上を保持する請求の範囲第13項記載の毒素製剤。 15．5.0と7.3との間のpHを有し、そして賦形剤として安定化蛋白質を含有する実質的に塩を含有していない水溶液中の透析し精製された毒素を凍結乾燥する工程からなる貯蔵−安定化されたボツリヌス毒素医薬製剤の製法。 16．水溶液が燐酸塩緩衝液からなる請求の範囲第15項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ボロディック，ゲイリー，シー. アメリカ合衆国 02021 マサチューセッツ，カントン，ケンシントンドライブ 90

Claims

【特許請求の範囲】１．１ml当り10⁴マウスLD₅₀単位またはそれ以下の濃度における複合体の安定性を維持するための医薬的に許容し得る賦形剤と混合された、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定して少なくとも300KDの分子量を有する複合体を形成するボツリヌス由来安定化蛋白質と結合したC．botulinumＢ型神経毒を含有する凍結乾燥した製剤からなり、そして水溶液中で再構成したときに、その毒性活性の少なくとも75％を保持する製剤からなる局所的な、部分的な、漸増可能な筋脱神経を誘発するのに使用される医薬製剤。２．再構成したときに5.0と7.3との間のpHを有することを特徴とする請求の範囲第１項記載の医薬製剤。３．約7.0より低いpHを有する請求の範囲第２項記載の医薬製剤。４．再構成したときに、その毒性活性の少なくとも90％を保持する請求の範囲第１項記載の医薬製剤。５．蛋白質賦形剤がアルブミンおよびゼラチンからなる群から選択されたものである請求の範囲第１項記載の医薬製剤。６．安定化蛋白質の少なくとも１種が、C．botulinumにより神経毒と一緒に同時発現された赤血球細胞凝集因子からなる請求の範囲第１項記載の医薬製剤。７．実質的に上記の神経毒および安定化蛋白質以外の細菌蛋白質を含有していない請求の範囲第１項記載の医薬製剤。８．随意収縮を可能にしながら不随意収縮を減少させるのに十分な再構成した組成物の投与量を筋体積内の一点に注射し、そして該投与量を筋体積を通して拡散させてその部分的脱神経を誘発させることを可能にすることによる、哺乳動物の筋の体積を選択的、部分的、一時的、化学的に脱神経する医薬の製造のための請求の範囲第１項記載に記載された再構成した製剤の使用。９．筋の予定された体積内の離れた部位に再構成した組成物の個々の投与量を注射することからなり、そしてこれらの部位の場所的関係が、該体積の全体を少なくとも部分的に脱神経するのに十分なものである請求の範囲第８項記載の使用。 10．筋の体積が単一の筋からなり、方法が、上記組成物の単位投与量を筋の神経支配帯域に注射し、そして該投与量を該神経支配帯域を通して拡散させて筋の全体の部分的脱神経を誘発させることから請求の範囲第８項記載の使用。 11．筋の神経支配帯域の少なくとも一部分に、随意筋剌激を可能にしながら、痙れんおよび不随意収縮を減少させるのに十分な量の再構成された製剤を投与することによる、病原性神経剌激により誘発された患者の筋の痙れんおよび不随意収縮を減少する医薬の製造のための請求の範囲第１項記載の再構成された製剤の使用。 12．筋の神経支配帯域の少なくとも一部分に、随意筋剌激を可能にしながら、振せん、硬直または痙性を減少させるのに十分な量の再構成された製剤を注射することによる、振せん、硬直または痙性を減少する医薬の製造に対する請求の範囲第１項記載の再構成された製剤の使用。 13．水性媒質中で再構成したときに、その活性の75％以上を保持する凍結乾燥されたボツリヌス毒素製剤。 14．水性媒質中で再構成したときに、その活性の90％以上を保持する請求の範囲第13項記載の毒素製剤。 15．5.0と7.3との間のpHを有し、そして賦形剤として安定化蛋白質を含有する水溶液中の透析し精製された毒素を凍結乾燥する工程からなる貯蔵−安定化されたボツリヌス毒素医薬製剤の製法。 16．水溶液が燐酸塩緩衝液からなる請求の範囲第15項記載の方法。