JPH08505467A - 高分子混合物の溶解した高分子を製取および再緩衝および／または濃縮する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は分離すべき高分子混合物に液体クロマトグラフィー装置に入る前または液体クロマトグラフィー装置中での分離過程の間に、分離過程を促進する緩衝液を添加し、分離後該緩衝液を、製取された高分子の濃縮または保存の目的のために全部または部分的に除去および／または交換する、液体クロマトグラフィー装置を使用して高分子混合物の溶解した高分子を製取および再緩衝および／または濃縮する方法に関する。このような方法において再緩衝および／または濃縮を僅かな装置的出費で迅速かつ連続的に行なうことができるようにするため、本発明は、緩衝液の除去および／または交換を、液体クロマトグラフィー装置の溶出液を用いて連続的に行なわれる向流透析によって行なうことを提案する。本発明により提案された向流透析は、溶出液に酵素的検出のための特殊な低分子基質を供給することを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 高分子混合物の溶解した高分子を製取お よび再緩衝および／または濃縮する方法 本発明は、分離すべき高分子混合物に、液体クロマトグラフィー装置に送入す る前または液体クロマトグラフィー装置中での分離過程の間に、分離過程を促進 する緩衝液を添加し、分離後該緩衝液を、製取された高分子群の濃縮または保存 の目的のために全部または部分的に除去および／または交換する、液体クロマト グラフィー装置を使用して高分子混合物の溶解した高分子を製取および再緩衝お よび／または濃縮する方法に関する。 記載した部類の方法はとくに、たとえば体液からの高分子製剤の製取に関する 生化学実験室において適用される。その際、混合物の成分と液体クロマトグラフ ィー装置の吸着剤との間の相互作用を的確に制御するためには、分離すべき混合 物に分離過程に有利な影響を及ぼす特殊な低分子物質、たとえば塩類等を含有す る特殊な緩衝液を添加しなければならない。しかしこれらの特殊な緩衝液は、製 取された製剤中ではたいてい好ましくないかまたは有害であり、この理由から製 剤から全部または部分的に除去するかまたは他の緩衝液と交換しなければならな い。 技術水準によれば、緩衝液の除去および／または交換を液体のクロマトグラフ ィー装置の溶出液の分別によって行なうことは普通である。このため差当り、異 なる分子群を連続系列で含有する、液体クロマトグラフィー装置の溶出液を個々 の受器に分配し、引き続き別個の工程で濃縮（緩衝液の除去）または再緩衝（緩 衝液の交換）が行なわれる。この手段は面倒でありかつ著しい時間および装置的 出費を必要とする。この方法において不可避的に生じる時間的遅延は、敏感な高 分子が過度に長く、高分子に対して有害な緩衝液中にとどまるときに、とくに不 利である。しばしば、高分子自体の寿命も短かいので、再緩衝（Umpufferung） および／または濃縮の面倒な工程のために十分な時間が存在しない。 従って、本発明の課題は、冒頭に記載した部類の方法を、再緩衝および／また は濃縮を著しく迅速、連続的かつできるだけ僅少な装置的出費で実施することが できるように発展させることである。 この課題の解決のために、本発明は冒頭に記載した部類の方法から出発して、 緩衝液の除去および／または交換を、液体クロマトグラフィー装置の溶出液を用 いて連続的に行なわれる向流透析によって行なうことを提案する。 本発明による方法は、濃縮および／または再緩衝が極めて早期に直接に、液体 クロマトグラフィー装置中 での連続的分離に引き続いて、しかも全溶出液に対し、向流透析の同一工程で行 なわれるという利点を有する。これによって、濃縮および／または再緩衝のため の方法は著しく促進され、唯一つの装置、即ち向流透析に適当な処理モジュール 中で行なうことができる。そのために、本発明による方法の適用の際、必要な装 置的出費も著しく低減する。 本発明の有利な１実施形は、向流透析のために、半透膜が高分子を通さずかつ 中空糸を液体クロマトグラフィー装置の溶出液が貫流し、該中空糸のまわりを向 流で溶媒に溶解した低分子物質が流過する中空糸膜モジュールを使用することを 配慮する。 かかる中空糸膜モジュールは原則的には、たとえば血液透析（腎臓透析）の目 的のための医療技術から公知である。さらに、ヨーロッパ特許（ＥＰ−Ｂ１）第 ５８１６８５号からは液体クロマトグラフィー装置の溶出液を中空糸膜反応器中 で、良好かつ迅速な分析の目的のために、試料および／または流展剤の成分群と 反応すべき試薬で処理することは公知である。この方法は、検査すべき高分子群 をできるだけ損傷せずに含有すべき生化学的製剤の製取のためには不適当である 。 本発明による方法のとくに有利な１実施形は、溶出液に対して向流で導かれる 溶媒が酵素的検出のための特殊な低分子基質を含有することを配慮する。これに より、同一の工程で溶出液の連続中に含有されている高分子群に関する情報を得 ることが可能である。この酵素的検出においては溶離物は、製取される製剤中へ 損傷されずに入るべき被検高分子物質とは同様に反応しない。 さらに、本発明の対象は液体クロマトグラフィー装置および／液体クロマトグ ラフィー装置の流出管中に配置された少なくとも１つの中空糸膜モジュールから なる上述した方法を実施するための装置であり、この装置は中空糸膜モジュール が分離可能な迅速結合装置により液体クロマトグラフィー装置の流出管中に接続 されていることを特徴とする。 こうして、たぶん試料ごとに異なる、濃縮または再緩衝の過程に対し、必要な 場合迅速に交換または任意に互いに結合することのできる別個の中空糸膜モジュ ールを提供することが可能である。 向流透析における中空糸膜モジュールの申分のない機能のためには十分な交換 時間ならびに十分な長さの濃度勾配を配慮することが必要である、この理由から 本発明は中空糸膜モジュールにおいて中空糸の数および中空糸の有効長からなる 商が０．５ｍm^-1の値を上廻らず、中空糸の内径が０．２５ｍmの値を上廻らない こと提案する。この寸法の割合において、透析過程に対して最適である半透膜で の貫流時間、ひいては接触時間ならびに濃度勾配の長さが生じる。 次に、本発明の３実施例を、後接された中空糸膜モジュールを有する液体クロ マトグラフィー装置の構造を概略的に示す図面につき詳述する。 図面において液体クロマトグラフィー装置は全体が参照記号１で示されている 。液体クロマトグラフィー装置は、上方に流入口２、下方に流出口３を有する。 流入口２中へは、適当な緩衝液を加えた、高分子物質の分離すべき混合物、たと えば体液が流入する。液体クロマトグラフィー装置１の内部において、貫流する 混合物中に存在する高分子群が公知のように順次に移動し、その際場合により希 釈されおよび／または低分子物質と混合する。流出口３からは、種々の高分子群 が時間的にずれた形で、つまり順次に流出する。しかし、流出口３から出る溶出 液はなおあらかじめまたは分離の間に添加された緩衝液を含有し、この緩衝液は 製取すべき製剤にとり好ましくないかまたはむしろ有害である。 溶出液から好ましくないかまたはむしろ有害な緩衝液の物質を除去および／ま たは置換するために、液体クロマトグラフィー装置１の流出口３に、緩衝液の除 去および／または交換が向流透析によって行なわれる中空糸膜モジュール４が接 続されている。 この中空糸膜モジュールは内部に、半透過性、つまり低分子物質のみを通すが 高分子物質は通さない中空糸５を多数備えている。この中空糸５の空洞を、液体 クロマトグラフィー装置１の溶出液が矢印６の方向に貫流する。同時に、中空糸 ５はその全長にわたり矢印６に対し反対方向に、溶出液中に存在する緩衝液を的 確に制御する、つまり除去するかまたは置換するのを可能にする組成の透析液が 中空糸のまわりを流過する。場合により、透析液は酵素的検出のための特殊な低 分子基質を含有していてもよい。 中空糸を貫流する溶出液と、向流で導かれる透析液との間の十分な接触を形成 するために、本発明による中空糸膜モジュールにおいては一方で中空糸５の数お よび中空糸の有効長からなる商が０．５ｍm^-1よりも小さく、他方では各中空糸 の内径が０．２５ｍｍよりも小さいことが意図されている。 透析液はケーシング接続部７および８により中空糸膜モジュール中へ流入する 。流動方向は矢印９によって示されている。 さらに図面から明らかなように、中空糸膜モジュール４の全接続部は迅速に分 離しうる差込みまたはねじ締め接続部として構成されている。これにより、モジ ュール４を迅速に交換し、他のモジュールに代えるかまたは場合により幾つかの モジュール４を適当に互いに接続することが可能である。 次に、本発明による方法を３つの具体的実施例につき説明するが、第１の実施 例は緩衝液中の高分子の濃縮に関し、第２の実施例は再緩衝に関し、第３の実施 例は付加的な酵素的検出に関する： 例１ 生物学的高分子からなる混合物、たとえば細胞粗抽出物を、たとえばセフラク リル（Sephracryl）Ｓ−２００ＨＲを用いるゲル濾過によるクロマトグラフィー で分離する。その際分離原理により不可避の試料溶液の希釈は、後接された中空 糸膜モジュールを用いる濃縮によって再び解消される。吸湿性のポリエチレング リコールの２０％水溶液（分子量＝２００００）を向流洗浄のために使用する。 これにより、溶出液から半透膜を介して緩衝液が除去され、それにより高分子の 濃縮が行なわれる。 例２： 生物学的高分子からなる混合物、たとえば血漿を、たとえばチオール・セファ ロース（Thiol-Sepharose）を用いる共有結合クロマトグラフィーによってクロ マトグラフィー分離する。次に、後接された中空糸膜モジュールは、分離のため 必然的に溶出液に添加され、次の光学的タンパク質検出を不可能にする物質、た とえばβ−メルカプトエタノールおよび２−チオピリジル群を再び除去すること ができる。この場合、向流洗浄のためには、生理的食塩緩衝液を使用する。 例３： 例１または例２に記載した実験を、中空糸膜モジュールに第２中空糸膜モジュ ールを直列に後接するよう に補足する。ここでは向流でたとえばＮＡＤＨおよびピルビン酸塩が緩衝液中へ 透析される。モジュールを通過した後、溶出液中の酵素乳酸デヒドロゲナーゼは 、たとえば３４０ｎｍにおける測光により、ピルビン酸の乳酸デヒドロゲナーゼ による乳酸への変換において起きるＮＡＤＨの損失について検出することができ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カウフマン，ミヒャエル ドイツ連邦共和国 Ｄ―44388 ドルトム ント フラスポエーテ 69 (72)発明者 シュヴァルツ，トーマス ロルフ ドイツ連邦共和国 Ｄ―42799 ライヒリ ンゲン ギンスターヴェーク ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分離すべき高分子混合物に、液体クロマトグラフィー装置に入る前または液 体クロマトグラフィー装置中での分離過程の間に、分離過程を促進する緩衝液を 添加し、分離後該緩衝液を、製取される高分子群の濃縮または保存の目的のため に全部または部分的に除去および／または交換する、液体クロマトグラフィーを 使用して高分子混合物の溶解した高分子を製取および再緩衝および／または濃縮 する方法において、緩衝液の除去および／または交換を、液体クロマトグラフィ ー装置の溶出液を用いて連続的に行なわれる向流透析によって行なうことを特徴 とする高分子混合物の溶解した高分子を製取および再緩衝および／または濃縮す る方法。 ２．向流透析のために、半透膜が高分子を通さずかつ中空糸を液体クロマトグラ フィー装置の溶出液が貫流し、該中空糸のまわりを向流で溶媒に溶解した低分子 物質が流過することを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．溶出液に対し向流で導かれる溶媒が酵素的検出のための特殊な低分子基質を 含有することを特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４．液体クロマトグラフィー装置および液体クロマトグラフィー装置の流出管中 に配置された少なくとも １つの中空糸膜モジュールからなる、請求項１から３までのいずれか１項記載の 方法を実施するための装置において、中空糸膜モジュールが分離可能の迅速結合 装置により液体クロマトグラフィー装置の流出管中に接続されていることを特徴 とする高分子混合物の溶解した高分子を製取および再緩衝および／または濃縮す る装置。 ５．中空糸膜モジュールにおいて中空糸の数および中空糸の有効長からなる商が ０．５ｍm^-1の値を上廻らず、かつ中空糸の内径が０．２５ｍｍの値を上廻らな いことを特徴とする請求項４記載の装置。