KR102285176B1 - 단백질 용액으로부터의 연속식 완충제 또는 배지 교환을 위한 한외여과 장치 - Google Patents

단백질 용액으로부터의 연속식 완충제 또는 배지 교환을 위한 한외여과 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 완충제 또는 배지를 연속식으로 교환하기 위한 한외여과 장치, 상기 한외여과 장치에서 완충제 또는 배지를 연속식으로 교환하기 위한 방법, 그리고 본 발명의 한외여과 장치를 포함하는, 생물약제 및 생물학적 거대분자 생성물, 특히 단백질, 예컨대 모노클로날 항체 및 백신을 특히 (반)연속식으로 제조하기 위한 시스템에 관한 것이다.

Description

단백질 용액으로부터의 연속식 완충제 또는 배지 교환을 위한 한외여과 장치{ULTRAFILTRATION UNIT FOR CONTINUOUS BUFFER OR MEDIA EXCHANGE FROM A PROTEIN SOLUTION}
본 발명은 연속식 완충제 또는 배지 교환을 위한 한외여과 장치, 상기 한외여과 장치에서의 연속식 완충제 또는 배지 교환 방법, 그리고 본 발명에 따른 한외여과 장치를 포함하는, 특히 단백질, 예컨대 모노클로날 항체 및 백신과 같은 생물약제 및 생물학적 거대분자 생성물의 특히 (반)연속식 제조를 위한 플랜트에 관한 것이다.
적용 면에서, 연속식 작동은 생물 반응기에의 공급물 스트림의 투입 및 제조 플랜트로부터의 생성물 스트림의 제거가 중단 없이 이루어진다는 것을 의미하는데, 많은 단계들이 반-연속식일 수 있다.
엄격하게 규제되는 약제의 제조는 정제 및 멸균된 생물반응기의 준비 및 무균 생성물의 보장을 위한 많은 시간적, 기술적 및 인력적 노력을 필요로 한다. 다목적 플랜트에서, 또는 2개 생성물 구획 사이에서 생성물 교체시의 상호-오염을 신뢰성 있게 회피하기 위해서는, 세척 이외에도, 매우 까다로운 세척 검증을 필요로 하며, 필요할 경우 이는 공정 변형 내내 반복되어야 한다. 이는 상류 공정 USP, 즉 발효기에서의 생물학적 생성물의 생성, 및 또한 하류 공정 DSP, 즉 발효 생성물의 정제 모두에 적용된다.
엄밀하게 발효에서는 무균 환경이 성공적인 배양에 필수적이다. 배치식 또는 유가식(fed batch) 발효기의 멸균의 경우, 일반적으로 SIP 기술 (SIP = 제자리 멸균)이 사용된다. 특히 짧은 이용 기간 및 빈번한 생성물 교체의 경우 반응기 이용가능성의 규모에 있어 준비 절차로 인한 반응기 미가동시간이 있을 수 있다. USP에서는 생물공학적 제조, 예컨대 배지 준비 및 발효의 공정 단계가 영향을 받으며, DSP에서는 가용화, 냉동, 해동, pH 조정, 예를 들면 크로마토그래피, 침전 또는 결정화에 의한 생성물 분리, 완충제 교환 및 바이러스 불활성화가 영향을 받는다.
최대한의 청결 및 멸균성을 유지하면서도 빠르고 유연성 있는 제조 플랜트의 재적재를 위한 요건을 충족하기 위해, 바람직하게는 일회용 기술을 사용하는 연속식 제조 설계가 시장에서 꾸준하게 성장하는 관심을 받고 있다.
WO2012/078677호는 크로마토그래피 및 제조 플랜트, 특히 일회용 플랜트에의 그의 통합에 의한 생물약제 생성물의 연속식 제조를 위한 방법 및 플랜트에 대해 기재하고 있다. WO2012/078677호가 생물약제 및 생물학적 생성물의 연속식 제조를 위한 접근법을 제공하고 있기는 하지만, 개시되어 있는 해결책은 실제로는 충분하지 않다.
생물약제 및 생물학적 생성물의 제조 방법은 보통 서로 연관되어 있는 하기의 제조 단계들을 포함한다:
1. 관류 배양
2. 세포 체류 시스템.
또한, 단계 1 및 2에 대한 대안으로써, 유가식 배양이 존재한다.
3. 세포 분리
4. 바람직하게는 농축을 동반한 완충제 또는 배지 교환
5. 바람직하게는 멸균 여과에 의한 미생물존재량(bioburden) 감소
6. 포획 크로마토그래피.
보통은 생성물 스트림의 추가적인 정제를 위하여 추가 단계들이 수행되는데, 특히 하기이다:
7. 바이러스 불활성화
8. 중화
9. 임의적으로 추가적인 미생물존재량 감소 (멸균 여과).
생물약제 제조에 있어서의 높은 품질 표준으로 볼 때, 여기에 보통 하기의 단계들도 후속한다:
10. 크로마토그래피에 의한 중간 및 정밀 정제
11. 미생물존재량 감소, 예컨대 멸균 여과
12. 바이러스 여과
13. 완충제 교환 및 바람직하게는 농축
14. 멸균 여과.
상기한 제조 과정에서, 영양소 용액을 포함하는 발효기 내의 세포는 생물학적 생성물을 생성시킨다. 이와 같은 경우, 영양소 용액은 세균 및 포자와 같은 미생물을 위한 이상적인 성장 배지이기도 하다.
현재 한 가지 문제점은 이후의 공정 단계에서 미생물 오염의 위험성을 감소시키는 것이다. 공정이 더 오래 걸릴수록, 특히 연속식 공정에서는 이와 같은 문제점을 해결하는 것이 더 중요해진다. 단백질의 제조시에는, 하나 이상의 공정 단계에서 생성물 용액의 완충제 또는 배지 교환 (= 완충제 교환)이 수행된다. 또한, 많은 공정 단계에서 때로는 공급물 스트림/생성물 스트림의 하나 이상 파라미터, 특히 농도, 부피/유량, pH 및 전도성의 까다로운 조정을 필요로 한다. 특히, 다양한 크로마토그래피 단계들은 공급물 스트림의 하나 이상 파라미터의 다양한 새로운 조정을 필요로 할 수 있다. 또한, 연속식 공정의 경우, 바람직하게는 연속적인 공정 용액이 제공되어야 한다.
WO2012/078677호가 특히 크로마토그래피 장치 직전의 완충제 또는 배지 교환, 또는 공급물 스트림의 조정에 대한 세부사항을 제공하고 있지 않기 때문에, 개시되는 연속식 플랜트의 적용성은 특히 농도, pH 및 전도성과 관련한 구체적인 조정을 필요로 하지 않는 유형의 크로마토그래피로 제한된다.
현행 기술에서는, 완충제 교환이 배치식 공정에서 공급물 파라미터를 조정하기 위한 수단으로 알려져 있다. 보통, 한외여과 막을 사용한 배치식 투석여과가 사용된다. 여기에서, 생성물 용액은 처음에는 용기 내에 위치된다. 상기 용액은 한외여과 막을 통하여 회로에서 펌핑되는데, 이 경우 생성물은 가능한 한 막에 의해 보유되는 반면, 염/완충제는 막을 통하여 투과액으로서 제거된다. 생성물 용기에서의 충전 수준은 보통 일정하게 유지되는데, 투과액 부피가 세척액에 의해 대체되기 때문이다. 이후, 생성물 중 염의 잔류 농도가 이상적으로는 하기와 같이 계산되는데: C=Co*exp(세척 부피/생성물 용액 부피), 여기서 Co는 최초 염 농도이다. 공급물 스트림이 용기로 연속적으로 공급되지 않으며 생성물 스트림이 용기로부터 연속적으로 제거되지 않으므로 배치식 공정임에도 불구하고, 이와 같은 공정은 문헌에서 대부분 연속식 투석여과로 잘못 명명되어 있다. 이는 배치가 완전히 처리될 때까지 완충제가 연속적으로 시스템에 공급된다는 사실에 기인한다 (문헌 [Alois Jungbauer, "Continuous downstream processing of biopharmaceuticals", Trends in Biotech., 2013 (8), 479-492], WO2009017491호).
한외여과 모듈은 혈액투석, 혈액여과 및 혈액투석여과에서도 사용된다. 혈액투석은 순수하게 확산성이며 압력-추진 공정이 아니라는 점에서 다른 한외여과 방법들과 다르다. 그러나, 공정 기술 면에서, 혈액투석 역시 인간 신체가 생성물 용기로 간주될 수 있으며 환자의 혈액이 일반적으로 수 시간에 걸쳐 세척되어야 하는 배치식 공정이다. 또한, 현행 기술에서, 투석은 실험실에서의 단백질 용액의 탈염 및 완충제 교환용으로 알려져 있다. 그러나, 소위 느린 확산으로 인하여, 투석은 더 작은 실험실용 부피를 위한 방법일 뿐이다 (서모사이언티픽(ThermoScientific) 사 [http://www.piercenet.com/browse.cfm?fld ID= 5753AFD9 -5056-8A 76-4E 13-5F9E9B4324DA], CN102703550호).
동적 투석은 투석의 속도 및 또한 효율 둘 다를 증가시키기 위하여 유동 동역학을 사용한다. 샘플 및/또는 투석액의 순환에 의해, 투석 시간을 상당히 단축하기 위한 최고로 가능한 농도 구배가 생성된다. 입사 유동의 다른 장점은 많은 경우에서 압력 차이가 생성되면서도 막 오염이 방지된다는 것이다. 이와 같은 추가적인 추진력은 반투과성 막을 가로지르는 저삼투성 물질 전달 속도를 증가시켜, 투석 절차 동안의 샘플 농축을 가능케 한다. 적용분야에 따라, 투석액 스트림 및 샘플이 정적이거나 또는 유동성일 수 있는 두 가지의 기본적인 방법이 존재한다. 이러한 방법들은 다양한 이유 및 다양한 목적으로 동적 투석에 사용되고 있다. 샘플이 유동하는 경우, 현행 기술에서 그것은 생성물 관을 포함하는 순환 시스템에서 전달된다 ([http://de.spectrumlabs.com/dialysis/Dynamic.html]). 이와 같은 방법 역시 배치식 방법이다.
적용 면에서, 연속식 투석여과는 공급물 스트림 및 세척 스트림이 연속적으로 한외여과 장치에 공급된다는 것을 의미한다. 적용 면에서, 반-연속식 작동은 일반적으로 구획식 또는 배치식 정제로 이해되는 것, 즉 하나 이상 용기로부터의 단백질 용액의 하나 이상 구획이 연속적으로 한외여과 장치로 공급되며, 여기에서는 세척액 역시 연속적으로 공급 투입되는 것을 의미한다.
현행 기술에서, 실제 연속식 투석여과는 수개의 투석여과 단계들을 병류 유동 또는 향류 유동으로 함께 연결하는 것에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 이를 위해서는 장비 비용이 상응하여 커진다 (문헌 [Alois Jungbauer, "Continuous downstream processing of biopharmaceuticals", Trends in Biotech., 2013 (8), 479-492]).
공급물 파라미터의 조정, 그리고 특히 생성물 스트림의 완충제 교환을 위한 간단한 연속 해결책은 아직 알려져 있지 않다.
US4963264A호는 항체의 정제에 사용될 수 있는 투석 장치 및 방법에 대해 개시하고 있다. 중공 섬유 모듈이 사용된다. 생성물 및 세척 용액은 향류 방법으로 공급되며, 용액은 순환되지 않는다. 친화성 흡착제에 의해 표적 종이 막의 다른 측으로 추출되며, 그에 따라 투과액 중으로 회수된다. 구체적인 실시양태에서, US4963264 A호는 추가적인 세부사항 제공 없이 일부 실험에 있어서 가변적인 압력을 설정하기 위하여 반대압력 수단이 사용되었음을 언급하고 있다.
US3582488A호는 생물학적 종 예컨대 단백질의 투석, 완충제 교환 및/또는 농축을 위한 장치 및 방법에 대해 개시하고 있다. 이를 위하여, 편평 막 모듈이 사용되며, 모세관으로 간주될 수도 있는 소형 채널로 유동이 전달된다. 장치는 향류식 방법으로 작동된다. 유출구의 압력 장치로서, US3582488A호는 클램프를 기술하고 있는데, 순수 유동을 생성시키는 것에 의해 생성물의 농축을 수행하기 위한 것으로써, 완충제 교환의 향상을 수행하기 위한 것은 아니다.
커닉(KURNIK) 등은 순수 유동을 조절하기 위한 유출구 유동의 조절 없이 직렬로 연결된 수개의 중공 섬유 막 모듈을 사용하는 향류 투석에 의한 단백질의 완충제 교환에 대해 개시하고 있다. 100-배 풍부화가 달성될 수 있다 (문헌 [KURNIK RONALD T ET AL: "Buffer exchange using size exclusion chromatography, countercurrent dialysis, and tangential flow filtration: Models, development, and industrial application", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING - COMBINATORIAL CHEMISTRY, WILEY, NEW YORK, NY, US, Vol. 45, No. 2, 1st January 1995 (1995-01-01), pages 149-157, XP002311649]).
결과적으로, 첫 번째 과제는 완충제 교환에 의한 생성물 스트림의 조정, 특히 연속식 생성물 스트림의 농도, pH 및/또는 전도성의 조정을 가능케 하는 해결책의 제공에 있다. 특히, 상기 해결책은 유연해서, 하나 이상의 서로 다른 크로마토그래피 정제 단계의 요건에 대하여 생성물 스트림의 조정을 가능케 해야 한다.
상기 과제는 생성물 스트림 (= 공급물 스트림)과 세척액 (= 투석액)이 유동하며 완충제 교환이 중공 섬유 한외여과 모듈에서의 생성물 스트림과 세척액의 순환 없이 수행되는 한외여과 장치에서의 병류, 향류 또는 교차류, 바람직하게는 향류로 작동되는 1종 이상의 중공 섬유 한외여과 모듈 (= 모세관 한외여과 모듈), 바람직하게는 혈액투석 모듈의 사용에 의해 해결되었다. 적용시, 모세관으로 전달되는 생성물 스트림은 막 기술에서 일반적인 바와 같이 공급물 스트림 또는 공급물로도 지칭된다. 적용시, 모세관으로부터 전달되는 생성물 스트림은 막 기술에서 일반적인 바와 같이 보유물(retentate)로도 지칭된다. 적용시, 모세관으로 전달되는 세척액은 막 기술에서 일반적인 바와 같이 투석액, 투석 완충제 또는 투과액으로도 지칭된다. 적용시, 모세관으로부터 전달되는 세척액은 폐기물 스트림으로도 지칭된다.
일반적으로, 시중에서 구입가능한 중공 섬유 한외여과 모듈/모세관 한외여과 모듈이 사용된다. 본원에서 한외여과 막의 분자량 컷-오프 (MWCO)는 수율 손실 ≤ 90 %, 바람직하게는 ≤ 30 %, 특히 바람직하게는 ≤ 10 %가 초과되지 않도록 하는 방식으로 막이 중공 섬유/모세관 내에 표적 생성물을 보유하도록 선택되어야 한다. 동시에, 더 작은 분자 및 이온은 막에 의해 보유되지 않는다. 수율 손실은 공급물 스트림 중 생성물과 비교하였을 때의 막을 통하여 투과하는 생성물의 손실을 의미하는 것으로써, 보통 예를 들면 크로마토그래피법, ELISA 등과 같은 공지의 방법들 중 하나를 사용한 샘플의 측정에 의해 측정 또는 분석된다.
모세관 한외여과 모듈은 제약 산업의 요건에 부합하는 시중에서 구입가능한 스팀-멸균 또는 감마-멸균된 것이 유리하다. 예를 들어 일 시험 플랜트에서는, 190 ㎛의 내부 직경 및 35 ㎛의 벽 두께를 가지는 폴리아릴 에테르 술폰 (PAES)과 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 중합체 블렌드의 모세관을 포함하는 감브로(Gambro) 사의 혈액투석 모듈인 레바클리어(Revaclear) 300 모세관 투석기가 사용되었다 ([http://www.gambro.com/PageFiles/21256/Revaclear%20White%20Paper.pdf?epslanguage=en]). 대안적으로, 예를 들면 GE 헬스케어(Healthcare) 사의 공정 규모 한외여과 중공 섬유 카트리지 (UFP-750-E-55A)와 같은 중공 섬유 모듈 역시 사용가능하다.
본 발명에 있어서, 공급물 스트림은 제어되는 방식으로 한외여과 모듈의 중공 섬유/모세관으로 전달되며, 세척액은 제어되는 방식으로 자켓(jacket) 측으로 전달된다. 보유물은 제어되는 방식으로 중공 섬유/모세관으로부터 전달되어, 플랜트로 이동된다. 놀랍게도, 생성물 스트림의 순환 없이 완충제 교환이 성공적으로 수행될 수 있다는 것이 발견되었다. 이는 단일 한외여과 모듈의 사용으로 이미 이루어진다. 그러나, 수개의 한외여과 모듈을 직렬 또는 병렬로 연결하는 것이 유리할 수 있다. 본 방법에서, 세척액은 공급물 스트림에 대하여 병류, 교차류 또는 향류로, 바람직하게는 교차류로, 특히 바람직하게는 향류로 펌핑된다. 생성물 스트림 (예컨대 완충제 A의 단백질 용액)은 여기에서 저부로부터 한외여과 모듈의 중공 섬유/모세관을 통하여 상향 유동하는 한편, 자켓 측의 세척액 (완충제 S)은 보통 상부로부터 중공 섬유/모세관을 지나 하향으로 통과되는 향류식 작동이 더 적은 세척액으로 더 높은 순도 (완충제 교환 효율)를 가능케 한다. 마찬가지로, 생성물 스트림은 상부로부터 혈액투석 모듈의 모세관을 통하여 하향 유동하는 한편, 자켓 측의 세척액은 저부로부터 모세관을 지나 상향으로 통과될 수 있다. 놀랍게도, 이와 같은 간단한 해결책이 연속식 작동에서도 생성물 스트림의 효율적인 완충제 교환을 가능케 한다는 것이 발견되었다.
생성물 스트림 (= 공급물 스트림) 및 세척액 (= 투과액)을 전달하는 데에는 매 경우 하나의 펌프가 사용된다. 모세관으로부터의 생성물 스트림 (= 보유물)의 제어되는 제거에는, 생성물 스트림의 제어되는 제거를 위한 수단으로서 하나의 추가적인 펌프 또는 제어 밸브가 사용된다. 보유물의 제어되는 제거를 위한 펌프 (= 보유물 펌프)의 사용을 통하여, 보유물 제거의 제어는 간단해진다. 특히 멸균 일회용 기술의 사용시 이는 낮은 유량에서 특히 유리한데, 이 경우 더 낮은 유량 (≤ 100 ml/분)을 신뢰성 있게 측정하는 적정한 유동 센서가 존재하지 않기 때문이다. 특히 바람직하게는, 연동 펌프가 여기에 사용될 수 있는데, 연동 일회용 펌프는 시중에서 구입가능해서 멸균 및 또한 일회용 기술이 이용가능하다는 장점을 가진다.
3개의 펌프, 즉 공급물 스트림 (= 공급물 펌프) 및 투과액 (= 투과액 펌프)을 전달하기 위한 2개의 펌프 및 보유물 펌프 뿐이라면, 제4의 스트림은 제어되지 않는다. 3개 펌프 중 하나에서 있을 수 있는 고장이 알려지지 않고 유지될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 세척액의 제어되는 제거를 위하여, 모세관과 자켓 측 (= 외부 측) 사이의 압력 비가 조정된다. 이는 역시 보통 세척액의 제어되는 제거를 위한 수단으로서의 세척액 제거용의 추가적인 펌프 또는 제어 밸브의 사용에 의해 수행된다. 모세관 한외여과 모듈을 포함하는 본 발명에 따른 한외여과 장치를 도 1 및 2에 예로써 나타내었는데, 이에 제한되는 것은 아니다.
공급물 스트림 및 세척액 유동 (= 투석 완충제)은 펌프를 통하여 생성된다. 보유물 유동은 바람직하게는 정변위 펌프(positive displacement pump), 예컨대 연동 펌프 (도 1)를 통하여, 또는 대안적으로는 제어 밸브 및 유동 제어 (실시양태 나타내지 않음)을 통하여 생성된다.
바람직하게는, 막의 일 측으로부터 타 측으로의 단회로(short circuit) 유동을 방지하기 위하여, 유입구 유동들 (도 1, 공급물 및 투석 완충제)의 압력 비가 조절된다. 이를 위해서는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 투과액 유출구에 추가적인 제4의 펌프가 사용될 수 있거나 (도 1), 또는 바람직하게는 투과액 유출구가 밸브 또는 유체정역학적 압력에 의해 스로틀링될 수 있다 (도 2).
4개의 펌프를 사용하는 실시양태에서, 3개 펌프, 즉 공급물 스트림 및 세척액 (=투과액 펌프)을 전달하기 위한 2개의 펌프와 보유물 펌프는 바람직하게는 제어하에 가동되는 한편, 세척액의 제어되는 제거를 위한 펌프 (= 폐기물 펌프)는 압력 센서를 통하여 조절된다. 더 정확하게 말하자면, 폐기물 펌프는 혈액투석 모듈의 압력이 투과액 측에서 측정하였을 때 예컨대 200 mbar로 제어되도록 촉발된다. 이와 같은 압력-제어 폐기물 펌프는 이후 공급물 펌프의 부피 유동/유량을 정확하게 전달해야 한다. 더 낮은 유량에서는, 내향 전달 펌프들인 공급물 또는 투과액 펌프 중 하나, 또는 외향 전달 펌프 (보유물 또는 폐기물 펌프) 중 하나가 결함이 있는 것이다. 이와 같은 방식으로, 유동 측정 없이 모든 펌프가 올바르게 펌핑되고 있는지를 모니터링하는 것이 가능하다.
바람직하게는, 투과액 유출구의 압력 제어를 위하여 밸브 또는 유체정역학적 압력이 사용될 수 있다. 한외여과 장치의 추가적인 실시양태를 도 3에 도식으로 나타내었는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 펌프 M0303은 하나 이상의 혈액투석 모듈 (DF 모듈)로 부피 유동을 전달한다. 바람직하게는, 하나 이상의 혈액투석 모듈이 직렬로 연결된다. 압력 센서 P0303은 바람직하게는 한외여과 장치의 공급물 압력을 모니터링한다. 이는 최대 압력을 초과하여 상승할 경우, 단계가 가동중지된다. 한외여과 장치 후, 펌프 M0304는 바람직하게는 혈액투석 모듈에서의 생성물 농도의 변화 및 막 상의 겔 층 형성을 방지하기 위하여, M0303 만큼 빠르게 정확하게 펌핑한다. 펌프 M0304는 투석된 보유물을 중간 백(bag) B0302로 전달한다. 세척액은 펌프 M0305에 의해 M0303보다 더 빠른 유량으로 혈액투석 모듈의 투과액 측 (= 모세관의 자켓 측)으로 펌핑된다. 여기서 펌프 M0303의 유량은 도달해야 할 보유물 중 원하는 완충제 농도를 위하여 충분하게 높게 설정된다. 사용된 세척액은 백 B0304에 수집된다.
본 출원의 첫 번째 주제는 하나 이상의 모세관 한외여과 모듈을 포함하며 하기를 특징으로 하는, 생물약제 및 생물학적 거대분자 생성물을 함유하는 생성물 스트림의 연속식 한외여과를 위한 장치이다:
- 하나 이상의 펌프가 생성물 스트림을 한외여과 모듈의 모세관으로 전달하고,
- 펌프가 모세관으로부터 생성물 스트림을 전달하고,
- 하나 이상의 추가적인 펌프가 세척액을 모세관의 외부 상으로 통과시키며,
- 한외여과 모듈을 통하여 생성물 스트림 및 세척액을 순환시키기 위한 수단이 없음.
바람직하게는, 한외여과 모듈로부터의 세척액의 제어되는 제거를 위한 수단이 사용된다.
본 출원의 추가적인 주제는 공급물 스트림이 모세관 한외여과 모듈의 하나 이상의 모세관 한외여과 막을 통하여 세척액으로 세척되는 것, 공급물 스트림이 모세관으로 전달되며, 세척액이 모세관 외부 상으로 통과되는 것, 공급물 스트림이 한외여과 모듈로 연속식으로 공급되며, 세척액이 한외여과 모듈에 연속식으로 공급 투입되고 그로부터 연속식으로 제거되는 것, 공급물 스트림 및 세척액이 한외여과 모듈을 통하여 순환되지 않는 것을 특징으로 하는, 연속식 한외여과를 위한 본 발명에 따른 장치에서의 생물약제 및 생물학적 거대분자 생성물을 함유하는 공급물 스트림의 연속식 한외여과 방법이다.
막의 측들 사이에서의 소형 분자 및 이온들의 효율적인 교환을 달성하기 위하여, 막을 가로지르는 순수 부피 유동이 가능한 한 최소화됨으로써, 투석법에서와 같이 수송이 가능한 한 확산에 의해 이루어진다. 확산 수송은 특히 비-투과 물질의 희석 또는 농축이 최대 1 내지 5의 계수, 바람직하게는 1 내지 2의 계수, 특히 바람직하게는 1의 계수로 이루어지는 경우에 달성된다.
본 발명에 따라, 수개의 한외여과 모듈이 직렬 또는 병렬로 연결될 수 있다. 본원에서, 직렬인 한외여과 모듈의 수는 한외여과 모듈들에 걸친 전체 압력 손실이 1 bar를 초과하지 않도록 선택되어야 한다. 병렬로 연결되는 한외여과 모듈의 수는 모세관으로의 공급물 스트림이 제조자에 의해 권장되는 최대 유량을 초과하지 않도록 선택되어야 하는데; 권장 유량의 0.1 내지 15 %, 특히 이와 같은 유량의 0.1 내지 5 %인 유량이 바람직하다.
예를 들면, 시험 플랜트에서는, 감브로 사의 혈액투석 모듈인 레바클리어 300 모세관 투석기가 사용되었다. 이러한 모듈에서, 공급물 스트림은 모듈 당 500 ml/분, 바람직하게는 75 ml/분, 더 우수하게는 25 ml/분을 초과하지 않아야 한다. 모듈들은 모듈 유입구와 유출구 사이의 전체적인 압력 차이 (= 모세관 한외여과 모듈의 막을 가로지르는 압력 손실)가 1 bar의 권장 유량을 초과하지 않도록 직렬로 연결될 수 있다.
보유물 중 불순물의 가능한 한 고도의 고갈을 달성하기 위하여, 공급물 스트림에 대한 세척액 (= 투석액 스트림)의 유동 비는 보통 가능한 한 높게 선택된다. 이와 같은 비의 정확한 수준은 필요한 최소한의 고갈은 물론, 분자의 확산 속도에 따라서도 달라진다. 동시에, 일 모듈에서의 투석액 스트림은 또한 제조자에 의해 권장되는 최대 유동을 초과하지 않아야 한다. 경제적인 관점에서도, 투석액 스트림을 제한하는 것이 바람직하다. 배치식으로 작동되는 투석여과 공정의 경우, 3-6, 때로는 10인 공급물 유체 부피에 대한 세척액 부피의 비를 설정하는 것이 통상적인 관행이다. 본 발명에 따른 방법에서는, 공급물 스트림에 대한 투석액 스트림의 비가 3-6인 유사한 설정이 첫 번째 접근법으로 선택될 수 있는데, 일반적으로는 실험적으로 생성물의 특성에 대하여 적합화된다.
놀랍게도, 투석 모듈의 시동 (세척 및 탈기에 의한 개시)이 세척 품질에 결정적이라는 것이 발견되었는데, 다른 경우 모든 모세관이 완전히 활용되지는 않기 때문이다. 바람직하게는 낮은 유량으로 인하여, 모세관 측 및 또한 자켓 측에서 투석 모듈을 탈기하는 것이 특별한 어려움이다.
본 발명에 따라, 매 투석 모듈 개시 전에, 제조자에 의해 권장되는 혈액 유량의 적어도 10 % 내지 100 %, 바람직하게는 15 내지 100 %, 특히 바람직하게는 30 내지 100 %를 사용하여 투석 모듈로부터 더 이상의 기포가 유출되지 않을 때까지 공급물 측 및 또한 자켓 측 모두가 완충제 용액을 사용하여 플러싱된다. 이와 같은 경우, 공급물 측 및 또한 자켓 측 모두에 기포가 없는 것이 중요하다.
본 발명에 따라, 공급물 및 투석액 스트림은 이들 유동이 분명하게 한정되도록, 즉 공급물 공간 (= 모세관 내부)으로부터 투석액 공간 (= 모세관 외부/자켓 측)으로, 또는 그 반대로 원치 않는 순수 유동이 발생할 수 없도록 조절된다. 이를 위하여, 하기의 측정이 이루어질 수 있다:
- 오프라인/온라인 신호 UV, 전도성, pH, 유동 측정에 의한 생성물 스트림의 모니터링, 또는 HPLC, Elisa 등과 같은 생성물 품질을 확인하기 위한 오프라인 측정,
- 자켓 측 (= 투석액 공간) 또는 공급물 측 (= 공급물 공간) 상에 압력을 적용하는 것이 유리할 수 있음. 이와 같은 목적으로는, 펌프 또는 밸브 중 어느 하나인 각 유체의 제어되는 제거를 위한 수단이 관련 유출구에서 사용될 수 있음.
본 발명에 있어서, 연속식 한외여과를 위한 본 발명에 따른 장치는 제조 플랜트, 특히 상기언급된 제조 단계들 중 하나 이상의 연속식 또는 반-연속식 실행을 위한 제조 플랜트에 통합된다.
따라서, 본 출원의 추가적인 주제는 생물약제 및 생물학적 거대분자 생성물을 함유하는 생성물 스트림의 연속식 한외여과를 위한 본 발명에 따른 1개 이상의 장치를 포함하는 제조 플랜트이다.
또한, 생물약제 및 생물학적 생성물의 제조를 위한 상기언급된 제조 단계들 중 많은 것에서 생성물 스트림의 일련의 희석 및 농축이 이루어지는데, 이는 연속식 공정 작동의 과제가 된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제조 플랜트는 생성물 스트림의 연속식 한외여과를 위한 장치들 중 하나의 전 또는 후에, 생성물 스트림의 농축을 위한 장치 (농축 장치로도 지칭됨)를 포함한다. 바람직하게는, 제조 플랜트에서의 연속식 한외여과를 위한 본 발명에 따른 장치는 농축 장치의 유출구 파이프에 연결된다. 본 발명에 있어서, 도 3에 예로써 나타낸 바와 같이, 농축 장치는 재순환 루프 (= 농축 루프), 그리고 농축 루프 내의 하나 이상의 투과액 유출구가 구비된 막 모듈, 농축 루프 내의 순환 유동을 조정하기 위한 펌프 M0302, 및 탈기 백 (번호지정 없음)을 포함한다. 농축 루프에서, 생성물 스트림은 연속식으로 농축된다. 펌프 M0301은 보통 저장 백(holding bag)으로부터 농축 루프로 생성물 스트림을 전달한다. 막 모듈과 마찬가지로, 하나 이상의 CFF 한외여과 모듈 (교차 유동 여과) 또는 대안적으로는 ATF (교호 접선 유동) 한외여과 모듈이, 그러나 바람직하게는 보통 하나의 CFF 모듈이 사용된다. 예를 들어, 시험 플랜트에서는, GE 헬스케어 라이프사이언스(Healthcare LifeScience) 사의 CFF 모듈 RTP UFP-30-C-5S가 사용된다.
M0302로부터의 유량은 보통 막 제조자에 의해 언급되는 최소 과유량(overflow rate) 이상으로 설정된다. 예를 들면, 모듈 RTP UFP-30-C-5S의 경우, 2 l/분 이상이 설정된다. 펌프 M0303은 농축 루프로부터 생성물 스트림을 전달한다. 본원에서, 펌프 M0303의 유량은 펌프 M301의 유량과 관련하여 설정된다. 이와 같은 비는 원하는 농축 계수에 상응한다. 이와 같은 경우, 액체가 농축 루프로부터 막을 통과하여 투과액으로 가지만 그 동안 생물학적 생성물은 가능한 한 보유되도록 하는 압력이 압력 센서 P0301 및 P0302에서 설정된다. 보통 생물학적 생성물의 90 % 이상, 바람직하게는 90-95 %, 특히 바람직하게는 95-100 %를 보유시키는 막이 사용된다. 기재된 설계에서는, 펌프는 통하고 막은 통하지 않는 액체 유동이 없으면서 공급 압력을 또한 유지할 수 있는 펌프가 사용된다. 본원에서는 바람직하게는 연동 펌프가 사용된다. 대안으로서, 그를 통하여 투과액 유동이 조정되는 제어 밸브-유량계 조합이 사용될 수도 있다.
막 모듈의 막을 통과하는 투과액은 투과액 유출구를 통하여 용기 B0304에 수집된다. 펌프 M0301과 농축 루프 사이의 압력 센서 P0301은 막 모듈 전의 압력을 모니터링하여, 최대 압력이 초과되는 경우, M0302의 가동중지를 야기할 수 있다. 이와 같은 경우에는, 막 모듈이 교체되어야 한다. 이와 같은 경우, 농축 루프는 바람직하게는 전체적으로 새로운 멸균된 것으로 대체된다. 그러나, 막 카세트의 사용시에는, 전적으로 카세트를 병렬로 작동하는 것이 보통이다. 막 카세트는 직렬 또는 병렬로, 바람직하게는 병렬로 배열될 수 있다. 보통, 압력 센서 P0302는 농축 루프 후의 압력을 측정하는데, 그에 의해 막횡단 압력이 측정될 수 있다. 유동 센서 F0301 (미도시)은 보통 농축 루프에서의 부피 유동을 측정한다. M0301의 유량에 대하여 고정된 비로, 펌프 M0303은 농축 루프로부터 나와 한외여과 장치로 가는 부피 유동을 전달한다.
멸균성의 유지는 (반)연속식 제조 플랜트에 있어서의 추가적인 문제이자 과제이다. 본 발명에 따른 제조 플랜트에서, 모든 구성요소들은 튜브, 특히 일회용 튜브에 의해 서로 연결된다. 예를 들면, 생체적합성 튜브인 파르메드(Pharmed) BPT® (내열성 실리콘 튜브)가 사용된다. 플랜트의 다른 구성요소들 역시 바람직하게는 일회용 구성요소로써; 특히 일회용 반응기, 일회용 여과 요소, 일회용 밸브, 일회용 센서 (유동, pH, 전도성, UV, 압력), 일회용 세포 체류 시스템, 일회용 튜브, 일회용 막, 일회용 커넥터, 일회용 크로마토그래피 컬럼, 일회용 용기 및 일회용 샘플링 시스템의 군에서 선택되는 구성요소들이 사용된다. 액체를 전달하기 위한 수단, 특히 펌프 역시 바람직하게는 일회용 펌프이다.
막 모듈 및/또는 한외여과 모듈을 교체하는 경우, 생성물 스트림은 보통 중단되며, 교체 기간 동안 중간 백 (도 3의 저장 백 B0301)이 충전된다.
미생물존재량의 추가적인 감소를 위한 멸균 여과용 장치의 사용을 통하여, 특정 모듈의 수명이 향상될 수 있으므로, 교체 기간 동안의 중간 백에서의 생성물 스트림의 중단 및 포획 (= 저장)은 정당화된다.
농축 루프의 대안으로써, 하나 이상의 폴(Pall) Corp 사의 카덴스(Cadence)™ 단일-통과 접선 유동 여과 카세트가 생성물 스트림을 농축하기 위한 장치로 사용될 수 있다 (US 7.682.511 B2호, http://www.pall.com/main/biopharmaceuticals/product.page?id=52742).
농축 단계를 통하여, 부피 유동은 현저하게 감소되며, 생성물 농도는 증가된다.
[ 실시예 ]
실시예 및 시험 플랜트:
발효 브로쓰(broth)로부터의 생성물 스트림의 완충제 교환에 있어서의 본 발명에 따른 해결책의 유용성을 조사하기 위하여, 실시예로서 도 3에 따른 시험 플랜트를 구축하였다. 시험 플랜트의 튜브로는, 3.2 mm의 내부 직경을 가지는 파르메드 BPT® 튜브를 사용하였다. 도 3의 구성요소 이외에도, 시험 플랜트는 시험 생성물 스트림으로서 세포가 없는 발효 브로쓰로 충전된 10 L 용기를 포함하였다. 튜브에 의해 용기 (미도시)와 연결된 제1 펌프 (M0301)가 먼저 도 3에 나타낸 바와 같이 생성물 스트림을 농축 장치로 전달하였다. 시험 분자로는 이뮤노글로불린 G 항체 (IgG 항체)를 선택하였다.
농축 장치는 농축 루프 및 막 모듈 (UF 모듈 3.1)과 함께 농축 루프로의 순환/유동을 위한 펌프 M0302, 튜브에 의해 연결된 탈기 백 (번호지정 없음), 및 수동 핀치 밸브 AB0301, AB0302 및 AB0303을 포함하였다. 막 모듈로는, 예로써 GE 헬스케어 라이프사이언스 사의 CFF 한외여과 모듈 RTP UFP-30-C-5S를 사용하였다.
M0302의 유량은 막 제조자에 의해 언급되어 있는 최소 과유량 속도(overflow speed)로 설정하였다. 예를 들어, 모듈 RTP UFP-30-C-5S의 경우, 2 l/분 이상을 설정하였다. 실제 농축 전에, AB0301 및 AB0303 및 AB0302를 부분적으로 개방하는 것에 의해 농축 루프를 먼저 탈기하였다. 농축 루프에 기포가 없는 경우, AB0302를 완전히 개방하고, AB0301 및 AB0303은 폐쇄하였다.
펌프 M0303은 농축 루프로부터 생성물 스트림을 전달하였다. 동시에, 펌프 M0303의 유량은 원하는 농축 계수에 상응하는 펌프 M0301의 유량에 대한 비로 설정하였다. 압력 센서 P0301 및 P0302에서는, 액체가 농축 루프로부터 막을 통과하여 투과액으로 가지만 그 동안 생물학적 생성물은 가능한 한 보유되도록 하는 압력을 설정하였다.
막 모듈의 막을 통과하는 투과액은 용기 B0304에 수집하였다. 펌프 M0301과 농축 루프 사이의 압력 센서 P0301은 막 모듈 전의 압력을 모니터링하여, 최대 압력이 초과되는 경우, M0302의 가동중지를 야기할 수 있었다. 이와 같은 경우, 막 모듈이 교체되어야 하였다. 압력 센서 P0302는 농축 루프 후의 압력을 측정하였는데, 그에 의해 막횡단 압력이 측정될 수 있었다. 유동 센서 F0301 (미도시)은 농축 루프에서의 부피 유동을 측정하였다.
펌프 M0303은 M0301로부터의 유량에 대하여 고정된 비로, 농축 장치로부터 이어지는 한외여과 장치로 부피 유동을 전달하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 시험 플랜트에서, 한외여과 장치는 190 ㎛의 내부 직경 및 35 ㎛의 벽 두께를 가지는 폴리아릴 에테르 술폰 (PAES)과 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 중합체 블렌드의 모세관을 포함하는 감브로 사의 혈액투석 모듈 (투석 모듈) 레바클리어 300 모세관 투석기를 포함하여 사용하였다 (http://www.gambro.com/PageFiles/21256/Revaclear%20White%20Paper.pdf?epslanguage=en).
펌프 M0303은 부피 유동을 혈액투석 모듈로 전달하였다. 압력 센서 P0303은 한외여과 장치의 공급물 압력을 모니터링하였다.
혈액투석 모듈의 개시 전에는, 공급물 측 및 또한 자켓 측 모두를 80-100 ml/분의 혈액 유량으로 완충제 용액 (= 세척액)을 사용하여 모듈로부터 더 이상 기포가 유출되지 않을 때까지 세척하였다 (시동). 여기에서는, 공급물 측 및 자켓 측 모두에 기포가 없는 것이 중요하였다. 생성물 스트림의 완충제 교환을 위하여, 다음에는, 공급물 스트림을 모듈 당 3 ml/분으로 설정하였다.
투석 완충제 (세척액)는 펌프 M0305를 사용하여 M0303에서의 것처럼 3 또는 6 ml/분의 유량으로 그리고 공급물 스트림에 대하여 향류로, 혈액투석 모듈 또는 모듈들의 투과액 측으로 펌핑하였다. 본원에서 M0303에서의 유량은 원하는 생성물 중 완충제 농도가 도달되기에 충분하도록 높게 설정하였다. 사용된 세척액은 백 B0304에 수집하였다.
공급물 및 투석액 스트림은 이들 유동이 분명하게 한정되도록, 즉 공급물 공간 (= 모세관 내부)으로부터 투석액 공간 (= 모세관 외부)으로, 또는 그 반대로 원치 않는 순수 유동이 발생할 수 없도록 조절/조정하였다.
이를 위하여, 하기의 측정을 수행하였다:
오프라인/온라인 신호 예컨대 UV, 전도성, pH, 유동 측정에 의한 생성물 스트림의 모니터링, 또는 HPLC 또는 Elisa와 같은 생성물 품질을 확인하기 위한 오프라인 측정.
한외여과 장치 후에는, 투석 모듈에서의 생성물 농도의 변화 및 막 상에서의 겔 층의 형성을 방지하기 위하여, 펌프 M0304가 농축 및 투석된 생성물 스트림을 M0303과 정확하게 동일한 속도로 중간 백 B0302로 전달하였는데, 그의 충전은 칭량 셀 W0302를 사용하여 모니터링하였다.
생성물 스트림의 수율 손실 및 성공적인 완충제 교환은 생성물, 글루코스 및 염의 농도의 측정에 의해 조사하였다.
제1 실험에서는, 생물학적 생성물을 함유하지 않는 생성물 스트림을 사용하여 이온 교환을 시험하였다. 하기 표 A는 각 펌프의 서로 다른 목표 유량을 사용한, 공급물 (Cond. 공급물) 및 보유물 (Cond. 보유물)의 전도성 측정치들을 나타낸다.
<표 A>
표 A. 생물학적 생성물이 없는 이온 교환
Figure 112016077975747-pct00001
추가적인 실험에서는, IgG 항체를 함유하는 생성물 스트림을 사용하여 이온 교환을 시험하였다 (HPLC Prot A에 의해 측정).
하기 표 B는 HPLC Prot A에 의해 측정된 관련 펌프들의 다양한 목표 유량에서의 보유물 (Cond. 보유물)의 전도성 및 보유물 중 IgG 항체의 농도 측정치들을 나타낸다.
수율 손실의 계산을 위하여, 투과액에서도 상기언급된 방법에 의해 상승된 유량에서의 조합된 샘플 중 IgG의 농도를 측정하였다. 이에 따르면, 투과액에서의 수율 손실은 1.4 %이었다.
이온 크로마토그래피에 의한 나트륨 아세테이트 농도의 측정은 생성물 스트림의 성공적인 완충제 교환을 입증하였다.
<표 B>
표 B. 항체를 사용한 투석 실험
Figure 112016077975747-pct00002
본 출원으로 이어진 연구는 유럽 지역 개발 펀드(European Regional Development Fund) (ERDF) 바탕의 재정 원조 협정인 "Bio.NRW: MoBiDiK- Modular Bioproduction - Disposable and Continuous"에 따라 후원되었다.

Claims (10)

  1. 하나 이상의 모세관 한외여과 모듈을 포함하는, 단백질을 함유하는 생성물 스트림의 연속식 한외여과를 위한 장치이며,
    - 하나 이상의 펌프가 생성물 스트림 (=공급물)을 한외여과 모듈의 모세관으로 전달하고,
    - 정변위 펌프가 모세관으로부터 생성물 스트림을 전달하고,
    - 하나 이상의 추가적인 펌프가 세척액을 모세관의 외부 상으로 통과시키고,
    - 장치가 한외여과 모듈로 생성물 스트림 및 세척액을 순환시키기 위한 수단을 포함하지 않고,
    - 투석 모듈로부터 더 이상의 기포가 유출되지 않을 때까지 공급물 측 및 자켓 측 모두가 완충제 용액을 사용하여 플러싱되는 시동 절차를 통해, 한외여과 장치가 공급물 측 및 자켓 측 모두에 기포가 없고,
    - 상기 시동 절차 동안의 완충제 용액의 유량이 혈액 유량의 10% 내지 100% 범위인
    것을 특징으로 하는, 연속식 한외여과를 위한 장치.
  2. 제1항에 있어서, 한외여과 모듈로부터의 세척액의 제어되는 제거를 위한 수단을 포함하는 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수개의 모세관 한외여과 모듈이 직렬 또는 병렬로 연결되는 것을 특징으로 하는 장치.
  4. 연속식 한외여과를 위한 장치에서 단백질을 함유하는 공급물 스트림을 연속식 한외여과하기 위한 방법이며,
    공급물 스트림이 모세관 한외여과 모듈의 하나 이상의 모세관 한외여과 막을 통해 세척액으로 세척되고,
    공급물 스트림이 모세관으로 전달되며, 세척액이 모세관 외부 상으로 전달되고,
    공급물 스트림 및 세척액이 한외여과 모듈로 연속식으로 공급되며, 한외여과 모듈로부터 연속식으로 제거되고,
    공급물 스트림 및 세척액이 한외여과 모듈로 순환되지 않으며, 모세관 내부로부터 모세관 외부로, 또는 그 반대로 원치 않는 순수 유동이 통과할 수 없도록 생성물 스트림 (보유물을 포함함)의 제거가 조절되고,
    투석 모듈로부터 더 이상의 기포가 유출되지 않을 때까지 공급물 측 및 자켓 측 모두가 완충제 용액을 사용하여 플러싱되는 시동 절차를 통해, 한외여과 모듈이 공급물 측 및 자켓 측 모두에 기포가 없고,
    상기 시동 절차 동안의 완충제 용액의 유량이 혈액 유량의 10% 내지 100% 범위인
    것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 연속식 한외여과를 위한 장치에서, 공급물 스트림 중 생성물이 최대 2의 계수만큼 농축되거나 또는 2의 계수만큼 희석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 세척액이 공급물 스트림에 대하여 교차류 또는 향류로 통과되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 수개의 모세관 한외여과 모듈이 직렬 또는 병렬로 있고, 모세관 한외여과 모듈의 막에 걸친 최대 압력 강하가 1 bar를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 단백질을 함유하는 생성물 스트림의 연속식 한외여과를 위한 하나 이상의 장치를 포함하는 제조 플랜트.
  9. 제8항에 있어서, 연속식 한외여과를 위한 장치와 연결되는 하나 이상의 농축 장치를 추가적으로 포함하는 제조 플랜트.
  10. 삭제
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