JPH08503460A - ブラジキニンアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式：（ＢＫＡｎ）（Ｘ）（Ｙ）式中、ＢＫＡｎはブラジキニン アンタゴニストペプチドであり；Ｙは薬作用発生団であり；そしてＸはＢＫＡｎ成分とＹ成分とを化学的に結合する架橋結合である、で表わされるブラジキニン アンタゴニスト。

Description

【発明の詳細な説明】 ブラジキニン アンタゴニスト 本発明は、もう一種の相違する薬作用発生団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ） に共有結合したブラジキニン アンタゴニスト（ＢＫＡｎ）成分からなる、医薬 として有効なヘテロダイマーに関するものである。関連出願 １９９２年１０月１５日付けで発行された先行出願ＷＯ ９２／１７２０１に は、型式： Ｘ（ＢＫＡｎ）₂ 式中、ＢＫＡｎはブラジキニン アンタゴニストペプチドを表わし、そしてＸ は２個のＢＫＡｎを、それらの末端に対して中間の位置で結合している結合基で ある、 で表わされるブラジキニン アンタゴニストダイマーが記載されている。この置 き換えできるブラジキニン部分は同一または相違することができる。しかしなが ら、この出願にはまた、ＢＫＡｎペプチドと相違するレセプター活性を有するも う一種のペプチド、例えばＮＫ₁またはＮＫ₂アンタゴニストペプチドまたはｍｕ −オピオイド（ｏｐｉｏｉｄ）レセプターアゴニストペプチドとを、結合基Ｘを 介して結合させることが包含されている。このようなヘテロダイマーは、それら の相当する活性が密接に関連している場合に、特に有用である。すなわち、多く の病態生理学的に重要なプロセスにおいて、炎症と神経原性メディエーターとの 間に緊密な相互作用が存在することは公知である。例えば、この現象は組織外傷 （事故および手術後）から派生する両方の痛みおよび喘息において生じる。両状 況において、組織と血漿由来メディエーター（例えばＢＫ₂レセプター部位で作 用するキニン類など）およびニューロン由来因子、例えばサブスタンスＰ（ＮＫ₁ レセプター）およびニューロキニンＡ（ＮＫ₂ レセプター）とは、複雑な相互 作用を演じる。また、剌激された場合に、その種類に無関係に神経原性ペプチド （サブスタンスＰ、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、コレサイスト キニン、ＣＧＲＰなど）の放出を抑制できるｍｕ−オピエート クラスのニュー ロンレセプターの局所的作用も存在する。 これらの相互作用、およびまたその他の炎症と神経原性メディエーターとの間 の相互反応が生じた場合には、この病態生理学に付随する症状の改善に普遍的に 有効であると見做される薬剤は１種も存在していない。上記引用出願に開示され ているヘテロダイマーは、二重選択性を有する単一の薬剤によって、この問題に 対応しようとするものである。このようなヘテロダイマーの別の利点はまた、当 業者にとって明白であろう。発明の簡単な説明 その最も広い態様において、本発明は、ブラジキニン アンタゴニストではな い、もう一種の薬作用発生団を、ＢＫＡｎペプチドと結合させることによって得 られるヘテロダイマーに関するものであり、この薬作用発生団は、ＷＯ ９２／ １７２０１に記載されているようなペプチドまたは、例えば痛みおよび（または ）炎症プロセスに責任のある異種の非ブラジキニン成分に対して有効な、あるい はキニン類の活性に関連するか、またはキニン類の活性に関係して生じる、他の 問題に対して有効な、非ペプチドのどちらかであることができる。生成する化合 物は、２種のレセプター集団と、あるいはまたレセプターおよび酵素と、相互反 応することができる「二重作用性」化合物である。この作用性は、単一の分子が ２種のレセプターに対抗することを、または１種のレセプターと酵素とに同時的 に対抗することを示唆するものではなく、この分子が２種のタイプのレセプター の一方と、あるいは１種のレセプターおよび（または）酵素と相互反応すること ができることのみを示唆するものである。しかしながら、このような化合物を適 当な投与量で投与した場合の総合的薬理学的効果は、これらの２つの種類の活性 の少なくとも合計に相当する。これらの化合物は、一体の形態にデザインするこ とができ、あるいは各々がそれ自体同定できる活性を保有する、２つの分離した 分子として会合されているようにデザインすることもできる。 本発明のヘテロダイマーは、構造的に下記式で表わすことができる： （Ｙ）（Ｘ）（ＢＫＡｎ） 式中、ＢＫＡｎはブラジキニン アンタゴニストペプチドであり；Ｘは結合基 であり；そしてＹはブラジキニン アンタゴニストではなく、かつまたＢＫＡｎ 成分とは相違するレセプターまたは酵素、好ましくは痛みまたは炎症プロセスに 関連するレセプターまたは酵素に対して活性を示すペプチドまたは非ペプチドの 薬作用発生団である。 本発明のヘテロダイマーは、痛みまたは炎症に対して、より広い処置スペクト ルを提供する可能性を有する。炎症状態では、その重篤度に関係なく、単一の薬 剤またはメディエーターが、意図する症状の臨床治療全体に対して完全に応答で きるという見込みは格別に少ない。これに付随して、炎症病態生理学においてブ ラジキニンはある役割を与えられているから、炎症性障害の処置に使用される組 み合わせ治療には、その総合的作用プロフィールの一部として、ブラジキニン拮 抗作用が必ず包含される。広いスペクトルおよび強力な非特異的治療方法（例え ば、喘息におけるステロイド類の使用）は、多分効果的ではあるが、また望まし くない、潜在的で重篤な副作用および毒性という重荷を付随する。 かなりの場合に、２種の別々のメディエーターが、相乗的に作用し、これらが また処置しようとする疾患の発現にとって圧倒的に臨床的に重要であることが知 られている。このような場合としては、例えば喘息に関連する、およびまた外傷 または手術後の痛みに関連する、ＮＫ₁レセプター部位で作用するサブスタンス ＰおよびＢＫ₂レセプター部位で作用するブラジキニンの場合がある。同様に、 炎症におけるさらに重要な下流エフェクターの１つとしての向神経性エラスター ゼと炎症の発現および持続に重要な炎症メディエーターの１つとしてのブラジキ ニンはまた、それらの作用において相乗的であると見做すことができる。 代謝安定性、選択性およびレセプター結合性などの特徴を改善するために、ホ モダイマーの形態の医薬活性物質を提供しようとする試みは、別種の系に関して 以前に開示されている。この従来の研究には、作用を強化するために、および（ または）持続時間を増加させるために、ペプチドアゴニストとアンタゴニストと を二量化する手段が包含される。Ｃａｐｏｒａｌｅ等によるＰｒｏｃ．１０ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐ． ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ４４９−４５１（１９８８）およびＲ ｏｓｅｎｂｌａｔｔ等によるヨーロッパ特許出願Ｎｏ．ＥＰ２９３ １３０Ａ２参照。また、ペプチドアゴニストの二量化が、エンケファリン／エン ドフィリンに関して（Ｓｈｉｍｏｈｉｇａｓｈｉ，Ｙ．等によるＢＢＲＣ，１４ ６，１１０９−１１１５，１９８７）；サブスタンスＰに関して（Ｈｉｇｕｃｈ ｉ等によるＥ．Ｊ．Ｐ．，１６０，４１３−４１６，１９８９）；ブラジキニン に関して（Ｖａｖｒｅｋ，Ｒ．およびＳｔｅｗａｒｔ，Ｊ．によるＪ．Ｐｒｏｃ ．８ｔｈ Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ． ，３８１−３８４，１９８３）；ニ ューロキニンＡおよびＢに関して（Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．等によるＥ．Ｊ．Ｐ．， １５１，３１７−３２０，１９８８）；インシュリンに関して（Ｒｏｔｈ，Ｒ． Ａ．等によるＦＥＢＳ，１７０，３６０−３６４，１９８４）；および心房ナト リウム排泄増加性ペプチドに関して（Ｃｈｉｎｏ，Ｎ．等によるＢＢＲＣ，１４ １，６６５−６７２，１９８６）、開示されている。アンタゴニストの二量化は 、パラチロイドホルモンに関して開示されている（Ｃａｐｒｏａｌｅ，Ｌ．Ｈ． 等によるＰｒｏｃ．１０ｔｈ Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，４４９−４５ １，１９８７）。しかしながら、これらの刊行物には、本発明が意図するブラジ キニン アンタゴニストおよび相違する薬作用発生団からなるヘテロダイマーは 開示されていない。発明の詳細な説明 多数のブラジキニン アンタゴニストペプチドが当技術で公知であり、これら のかなりを本発明のダイマーのＢＫＡｎ成分を提供するという目的に使用するこ とができる。インビトロで、非常に強力なブラジキニン アンタゴニストの１種 は下記式を有するペプチドである： Ｒｅｇｏｌｉ等によるＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ，１１：１５６−１６１（１９９０）参照。簡潔にするために、 本明細書においてこのペプチドをＣＰ−００８８と記する。 ＣＰ−００８８は使いやすいものであるが、その他の入手できる、公知のブラ ジキニン アンタゴニストペプチドもまた、本発明の目的に使用することができ ることは、当業者にとって明白であろう。広く種々の、このようなブラジキニン アンタゴニストペプチドが、近年の特許刊行物に記載されており、これらはい づれも、本発明の目的に使用することができる。例えば、ＥＰ−Ａ−０３３４２ ４４（ＰｒｏｃｔｅｒおよびＧａｍｂｌｅ）には、或るアミノ酸残基が修飾され ている、ノナーおよび大型ブラジキニン アンタゴニストペプチドが記載されて いる。ＥＰ−Ａ−０３７０４５３（Ｈｏｅｃｈｓｔ）ならびにＷＯ ８９／０１ ７８０およびＷＯ ８９／０１７８１（Ｓｔｅｗａｒｔ等）にはまた、ブラジキ ニン アンタゴニストペプチドが記載されている。これらの特許刊行物の中で、 本発明が意図するダイマーを開示しているものはない。しかしながら、上記した ように、これらの刊行物のペプチドもまた、本発明の実施に使用することができ る。 結合基Ｘは、成分ＢＫＡｎおよびＹの活性を干渉しないかぎり、いずれの結合 基ＸもＢＫＡｎ成分とＹ成分とを一緒に、化学的に、または共有的に結合させる ために使用することができる。この結合基は、無機（例えば、−Ｓ−）または有 機であることができ、インビボで加水分解されて、またはその他の解離を受けて 、活性成分ＢＫＡｎおよびＹを遊離するものから選択することができる。別様に は、この結合基は、使用時点で、当該ヘテロダイマーが一体のまま残されるよう な基であることもできる。 好ましくは、この結合基は、ＢＫＡｎペプチド鎖上のスルフヒドリル基を、も う一種の薬作用発生団成分と反応させることにより誘導される−Ｓ−原子を包含 することができる。これは、ペプチド鎖内のシステイン（Ｃｙｓ）スルフヒドリ ル基、すなわち当該ペプチドの末端の中間位置のスルフヒドリル基を含む反応に より達成することができる。このためには、初めに出発ＢＫＡｎペプチドを修飾 して、このペプチド鎖の適当な位置にＣｙｓ基を包含させることが必要であるこ ともある。例えば、ＣＰ−００８８は、その６位置のＳｅｒをＣｙｓにより置き 換えることによって修飾して（以下の記載において、このように修飾されたＣＰ −００８８をＣＰ−０１２６と称する）、もう一種の薬作用発生団をＣｙｓスル フヒドリル基を介して都合よく結合させることができる。 ＣＰ−０１２６は、下記の構造式により示すことができる： 略記号を用いると、この式は、 _DＲ−Ｒ−Ｐ−Ｊ−Ｇ−Ｆ−Ｃ−_DＦ−Ｌ−Ｒ で表わすことができる。 結合位置としてＣｙｓを使用すると、結合基Ｘはシステインスルフヒドリルの −Ｓ−を包含する。これは、結合基Ｘの全体（例えばジスルフィドに基づくダイ マーの場合）であることができ、またはその一部分のみであってもよい。従って 、例えばこの結合基は、その末端でＢＫＡｎおよびＹに結合しているビススクシ ンイミドヘキサンのようなビススクシンイミドアルカンからなることができる。 これらの、およびその他の結合基は出願人の関連特許出願に開示されており、こ れらのいずれもを、本発明の目的に使用することができる。その他の結合基Ｘは 以下に示す６群の化合物から誘導することができ、これらのうちの若干は−Ｓ− 原子を必要としないか、あるいは含有していないものであり、これらの基は一般 的カテゴリイとして、アミノ酸類縁体リンカーまたはマレイミドに基づくリンカ ーと見做すことができる。これらのリンカーは、単に例として包含されるもので あって、全ての可能な結合分子の全部を包含しようとするものではない： クラス Ｉ （アミノ酸類縁体） クラス II （マレイミドに基づくリンカー） アミノ酸類縁体リンカー（クラスＩ）は、ＢＫＡｎのペプチド鎖中に直接挿入 することができ、このリンカーを使用することにより、対の薬作用発生団（成分 Ｙ）を用いて、エラスターゼ安定性または不安定性のヘテロダイマーを形成する ことができる。別のものとして、マレイミドに基づくリンカーを、所望の薬作用 発生団と反応させることもでき、これは次いで、スルフヒドリル含有ペプチドに 結合させることができる。さらにまた、Ｒ₃ として−ＣＯ₂Ｈを含有する、これ らの化合物群のいずれかからのリンカーを、これらの化合物群からの別種のリン カーと反応させて、エラスターゼ不安定性リンカー（Ｒ₃＝−ＯＨ含有リンカー ）またはエラスターゼ安定性リンカー（Ｒ₃＝−ＮＨ₂含有リンカー）を形成する ことができ、これらを使用して、所望のペプチド／非ペプチドヘテロダイマーを 形成することができる。Ｒ₁およびＲ₂は、エステルに基づく結合要素のカルボニ ル炭素に対して、完全な非干渉接近または有意の干渉接近が得られるように変化 させることができ、これによって当該エステルのインビボ加水分解速度を所望の とおりに制御することができる。 本発明のダイマーの製造にここで使用される、リンカー−修飾ＢＫＡｎまたは 薬作用発生団のうちの或るものは、それら自体新規であり、本発明のもう一つの 態様を構成する。 本発明のヘテロダイマーの成分Ｙは、ブラジキニン アンタゴニストでないか ぎり、いかなるペプチドまたは非ペプチドの薬作用発生団でもよく、これらの薬 作用発生団は痛みおよび（または）炎症プロセスに関連する、相違する（非ブラ ジキニン）成分に対して活性を示すものであり、これにより２種の相違するレセ プター集団またはレセプターおよび酵素と独立して相互反応することができる、 二重作用性化合物が提供される。 すなわち、例えば成分Ｙは非ペプチドｍｕ−オピオイドレセプターアゴニスト、 例えばモルヒネ、あるいはオキシコドン（ｏｘｙｃｏｄｏｎ）またはオキシモル ホン（ｏｘｙｍｏｒｐｈｏｎｅ）のようなその誘導体の１種であることができる 。 シクロオキシゲナーゼ抑制（ＣＯＩ）が望まれる場合には、Ｙ成分として、イ ンドメタシンを選択すると有用である。しかしながら、その他の慣用の非ステロ イド系抗炎症剤、例えばアスピリン、イブプロフェン、ナプロキシン等のいずれ もを使用することができる。この場合には、シクロオキシゲナーゼが一般的に細 胞内酵素であると考えられていることから、このＢＫＡｎ／ＣＯＩヘテロダイマ ーは、インビボＣＯＩ活性を得るために、加水分解される必要があることがある 。 向神経性エラスターゼ抑制が要求される場合には、これは活性エステル、例え ば２−フェニル−アルカノエートエステルであることができる。ヘテロアリール アルカノエートエステラーゼインヒビターを使用することもできる。本発明にお いて成分Ｙとして使用される、好適な向神経性エラスターゼインヒビターを、以 下でＣＥ−１２１８と記する。このＣＥ−１２１８は新規化合物であると信じら れ、本発明のさらにもう一つの態様を構成する。 ここで、成分Ｙとしてまた使用することができる、その他の種類のエステラー ゼインヒビターには、フルオロメチルケトン類、ホスホネート類、ベンゾオキサ ゾール類、ベーターラクタム類などが包含される。 前記したように、成分Ｙは、ブラジキニン アンタゴニスト活性以外の所望の 活性を有する、ペプチドまたは非ペプチドインヒビターからなることができる。 しかしながら、このＹ成分は好ましくは、例えば痛みまたは炎症を処理する場合 に、ブラジキニンの活性と共通性、または緊密な関連性を有するレセプターまた は酵素に対する活性が提供されるように選択する。各種症状に対して、ＢＫＡｎ とｍｕ−オピオイドレセプターアゴニスト、向神経性エラスターゼインヒビター 、シクロオキシゲナーゼインヒビターまたはＮＫ₁ またはＮＫ₂ レセプターアン タゴニストとの組み合わせに使用される理論的原理を、説明の目的で以下に示す 。ＢＫＡｎ／ｍｕ−オピオイドレセプターアゴニスト Ｃ−ファイバー求心体（Ｃ−Ｆｉｂｅｒ ａｆｆｅｒｅｎｔｓ）は痛みの感覚 ならびに炎症の神経原性成分としての両方を媒介することが知られている。これ らの求心性ニューロンは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経支配組織の両方 において、特異的剌激および非特異的剌激に応答して、種々のニューロペプチド を放出する。これらのニューロペプチドの幾つかには、神経伝達物質の中で、サ ブスタンス−Ｐ、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、カルシトニン遺伝子関 連ペプチド（ＣＧＲＰ）、コレサイストキニン（ＣＣＫ）、バソアクティブイン テスティナル ポリペプチド（ＶＩＰ）、およびニューロペプチドＹが包含され る。この複雑性に加えて、相違するＣ−ファイバーは、その神経支配組織に依存 して、これらのニューロペプチドを異なる量および（または）割合で含有するも のと見做される。これらのペプチドはいずれも、多数の疾患および臨床症状と関 係する種々の神経原性プロセスにおいて寄与役割を演じることが証明されている 。実際に、これらのペプチドに対する特定のアンタゴニストが、種々の製薬会社 および独立した調査研究所によって、強力な治療薬として開発されている。 この他の点では種々様々のニューロン群に共通する特徴の一つは、これらがい ずれも、これらのニューロペプチドの放出を調整するｍｕ−オピオイドレセプタ ーを有することにある。内因性エンケファリンおよびその他の外部から投与され た小さい分子量の化合物、例えばモルヒネ、オキシモルホン、フェンタニルおよ びそれらの誘導体は、ｍｕ−オピオイドレセプターアゴニストとして局所的に（ 末梢における末端ｍｕ−オピオイドレセプターの部位で）およびＣＮＳにおいて 、作用することにより末梢Ｃ−ファイバーからのニューロペプチドの放出を抑制 する。この抑制は、特定のＣ−ファイバーに含有されているペプチドの配列およ びそれらの放出を生じさせる剌激の両方とは独立している。 その結果として、ホルモン性および神経原性プロセスによって生じる症状の処 置に関して、特に良好な活性様相を有するものと考えられる１群の重要な化合物 は、ＢＫＡｎ／ｍｕ−オピオイドレセプターアゴニスト ヘテロダイマーである 。これらの化合物は、キニン類により示されるような炎症プロセスのホルモン性 成分およびニューロペプチドの放出により生じる炎症の神経原性局面の両方を軽 減もしくは阻止することが予想される。さらにまた、存在するｍｕ−オピオイド アゴニストの使用を制限する要素の一つに、これらの薬剤により処置しようとす る患者における中毒および（または）耐用性の発現の可能性は言うまでもなく、 またそれらの鎮静、錯乱および呼吸運動の低下をもたらす性質がある。ｍｕ−オ ピオイドアゴニストのこれらの望ましくない局面は、これらの物質がＣＮＳを容 易に透過する性質を有することによるものである。しかしながら、ＢＫＡｎ／ｍ ｕ−オピオイドレセプターアゴニスト ヘテロダイマーは、そのＢＫＡｎの高度 にカチオン性の性質によって、ＣＮＳを必ずしも透過しない。従って、ｍｕ−オ ピオイドレセプターアゴニスト活性は、末梢に限定され、その結果として、この 種 の化合物の副作用／毒性プロフィールは実質的に減少される。ＢＫＡｎ／向神経性エラスターゼインヒビター（ＮＥＩ） 前記したように、全身的および局所的の両方の炎症応答の制御を、炎症経路の 一つ以上で介在させる必要があることがある。特に、炎症プロセスの開始および 維持に責任がある主要メディエーター（例えばブラジキニン）の活性を阻止する 能力および実際の組織変質および損傷に責任がある主要最終経路エフェクター（ 例えば向神経性エラスターゼ）の活性を阻止する能力は、非経口治療を要する敗 血症またはその他の重篤な炎症症状の、あるいはまた炎症性皮膚疾患または歯／ 末梢症状の「単一医薬による治療」にとって、鍵でありうる。 両標的（ブラジキニンレセプターおよび向神経性エラスターゼ）は本質的に細 胞外のものであるから、組み合わされたＢＫＡｎ／ＮＥＩ活性を有するヘテロダ イマーは、一体のままで残るように、または解離されるように、デザインするこ とができる。しかしながら、２種の活性薬作用発生団の解離が望まれる場合には 、当該ヘテロダイマーを構成する、これら２種の活性成分をつなぎ合わせる結合 分子が、例えば血漿ヒドロラーゼによる加水分解されるようにデザインすること ができる。このタイプの解離性または加水分解性ヘテロダイマーをここで説明す る。ＢＫＡｎ／シクロオキシゲナーゼインヒビター（ＣＯＩ） ブラジキニンの生物学的活性の大部分は、プロスタグランジンの発生と関連し 合っている。例えば、炎症による痛みに関連する痛感過敏のほとんどは、損傷し た組織による、およびまたＣ−ファイバーそれら自体による、或る種のプロスタ グランジンの発現に依存しているものと見做される。後者の場合に、ブラジキニ ンおよびサブスタンス−Ｐは、これらの「第二メッセンジャー」の主要刺激原で あるものと見做される。損傷した組織によるプロスタグランジンの発現はブラジ キニンとは独立している。このペプチド炎症後メディエーターとプロスタグラン ジンとの相互反応は、別の設定でも生じ、二重作用性化合物の標的であると考え ることができる。シクロオキシゲナーゼは細胞内酵素であることから、かつまた 官能性ブラジキニンレセプターが外部血漿膜に限定されることから、ＢＫＡｎ／ ＣＯＩ組み合わせ活性を有するヘテロダイマーは、その各薬作用発生団がインビ ボ解離を受ける必要があることがある。ＢＫＡｎ／ＮＫ₁−レセプターアンタゴニスト（ＮＫ１Ａｎ） ブラジキニンおよびサブスタンス−Ｐは、炎症の開始および維持において相乗 的に作用すること、およびまた喘息および種々の痛みを伴う症状の両方における 神経原性成分であることが知られている。これらの状況の両方において、ブラジ キニンは末梢の痛みおよび（または）喘息における咳および呼吸困難の発作を媒 介するＣ−ファイバー感覚求心性を剌激することができる、最も強力ではないが 、かなり強力な薬物の一つである。一次剌激に無関係に、これらのニューロンは サブスタンス−Ｐを放出し、このサブスタンス−Ｐはブラジキニンの活性および これらの剌激が作用する第二感覚神経末端におけるその他の剌激を増幅させ、か つまた増大させる。この初期剌激、引き続く局所的増幅の「ワン／ツウ パンチ 」は、充分に解明されており、いずれか一つが介在することによる成功または失 敗に関して有意に連座している。これらのプロセスの両成分を単一の化合物の標 的にすることによって、１種の特定の薬物を単独で使用した場合に比較して、優 れており、かつまた組み合わせ治療に比較して、簡単で、また安価な、二重特異 性薬剤を提供することが可能になる。ＢＫＡｎ／ＮＫ₂−レセプターアンタゴニスト（ＮＫ２Ａｎ） ブラジキニンの急性気管支平滑筋収縮を生じさせる能力は少なくとも特に、サ ブスタンス−Ｐを放出する同一Ｃ−ファイバーによるニューロキニンＡの放出に 依存している。ニューロキニンＡは、気管支平滑筋に対して、ＮＫ₂ レセプター を介してその効果を発揮する。しかしながら、ブラジキニンそれ自体より多くの ニューロキニンＡをニューロンから放出させることができ、その結果として、Ｂ Ｋ₂／ＮＫ₂アンタゴニスト組み合わせ活性を有する二重特異性アンタゴニストは 、いずれか別の単一の薬剤に比較して、喘息の患者の気管支収縮のより良好な総 合的改善を必ずもたらす。 本発明のヘテロダイマーは、ＷＯ ９２／１７２０１に記載の方法と一般的に 同一の方法で製造することができる。通常、この方法には、ＢＫＡｎペプチド鎖 に沿った適当な位置で、このＢＫＡｎ成分に結合基Ｘを挿入し、引き続いてこの 結合基を介して、ＢＫＡｎに非ペプチド薬作用発生団を結合させることを包含す る。別法として、結合基Ｘを非ペプチド薬作用発生団に付加し、次いでこのリン カー修飾薬作用発生団にＢＫＡｎを結合させることもできる。代表的製造方法を 以下で説明するが、各種変更を採用できることは認識されるであろう。 本発明を下記の例で説明するが、これらの例は制限しようとするものではない 。 例１−４（ＢＫＡｎ／ｍｕ−オピオイドアゴニスト） 本発明を例示するために、４種の相違するペプチド／オピエートヘテロダイマ ー（これらをＣＰ−０４７７、ＣＰ−０４８８、ＣＰ−０４９４およびＣＰ−０ ４９９で表わす）を製造した。これらの化合物のうちの３種は、ＣＰ−０１２６ （_DＲ−Ｒ−Ｐ−Ｊ−Ｇ−Ｆ−Ｃ−_DＦ−Ｌ−Ｒ）を使用して製造し、そして４種 目はＣＰ−０３４７（_DＲ−Ｒ−Ｐ−Ｊ−Ｇ−Ｔｈｉ−Ｃ−_DＴｉｃ−Ｏｉｃ−Ｒ ）を使用して製造した。同様に、２種の相違するオピエート（オキシコドンおよ びオキシモルホン）ならびに２種の相違するリンカー化学物質を使用して、それ ぞれ下記のヘテロダイマーを得た： ヘテロダイマー、ＣＰ−０４７７、ＣＰ−０４８８、ＣＰ−０４９４およびＣ Ｐ−０４９９を、添付図面１を引用して、以下に詳細に示すとおりにして製造し た：化合物Ｉの製造 オキシコドン塩酸塩（０．１８２ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、酢酸（０．４７５ ｍｌ、８．３ｍｍｏｌ）、Ｓ−ベンジルシステアミン（０．１７４ｇ、１．０４ ｍｍｏｌ）およびメタノール（５ｍｌ）を組み合わせ、室温で１時間撹拌した。 シアノホウ水素化ナトリウム（９５％、０．０３３ｇ、０．５２ｍｍｏ１）を添 加し、この反応混合物を室温で２４時間撹拌した。この混合物を減圧で濃縮した 。生成する油状物を酢酸エチルに溶解し、この酢酸エチルフラクションを飽和重 炭酸ナトリウム溶液により洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次いで減圧 の 下に蒸発させた。この粗生成物を、シリカカラムにおいてクロマトグラフイに付 し、ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９：１、容量／容量）およびＥｔＯＡ ｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ₃Ｎ（９：１：０．２、容量／容量／容量）により順次溶出 した。化合物Ｉが２５．０％（５９．０ｍｇ）の収率で油状物として単離された 。化合物ＩＩ（ＣＰ−０４７７）の製造 Ｉ（０．０５９ｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を、乾燥テトラヒドロフラン２ｍｌ に溶解し、次いでオーブン乾燥した三ッ頚１００ｍｌフラスコに移した。このフ ラスコに、デュワー（ｄｅｗａｒ）コンデンサー、窒素供給源およびアンモニア 導入口を備えていた。−７８℃に維持されている、このフラスコ中に、ほぼ１０ ｍｌのアンモニアを凝縮させた。強い青色が維持されるまで、ナトリウム少片を 添加し、次いで４０秒後に、固体塩化アンモニウムにより、反応を静止させた。 この反応混合物を室温まで加温し、次いでアンモニアをバブラーを通して沸騰除 去し、メタノール（２５ｍｌ×３）を添加し、次いで減圧の下に蒸発させた。単 離されたチオールを最低量のＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２ｍｌ） 中に溶解した。化合物Ｘ（約０．３当量）をトリス緩衝液（０．５Ｍ、４．０ｍ ｌ）中に溶解し、上記ＤＭＦ溶液に添加し、次いで１７時間撹拌した。この粗製 混合物を逆相Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムにおいて、水中１５−４０％ ＣＨ₃ＣＮ勾配、０．１％一定ＴＦＡを使用して、２０分間にわたって精製した 。保有時間は１６．０分であった。凍結乾燥させた後に、２６．４ｍｇのＩＩが 、白色粉末として単離された。分析 ： 質量スペクトル分析は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｌａｓｅｒｍａｔ Ｍａｓｓ Ａ ｎａｌｙｚｅｒで行った。 分子量計算値…１９１６ 分子量実測値…１９１８アミノ酸分析 ： 化合物ＩＩＩの製造 メタノール（１０．０ｍｌ）に溶解した酢酸アンモニウム（２．２ｇ、２８． ４ｍｍｏｌ）およびオキシコドン塩酸塩（１．０ｇ、２．８４ｍｍｏ１）の混合 物に、ＮａＣＮＢＨ₃（０．１８ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）のメタノール（４．０ ｍｌ）性溶液を添加した。生成する溶液のｐＨを、濃塩酸の添加により７．０に 調整し、１７時間撹拌し、次いで濃塩酸の添加によりｐＨ１．０に酸性化した。 溶媒を減圧の下に除去し、残留する生成物を水に溶解した。この水性層をクロロ ホルムにより抽出し、次いで１０％炭酸ナトリウム溶液によりｐＨ９．０に調整 し、ＮａＣｌにより飽和し、次いでクロロホルムにより抽出した。このクロロホ ルム層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次いで減圧の下に蒸発させた。この粗 製油状物を、シリカゲルクロマトグラフイにより精製し、ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡ ｃ−ＭｅＯＨ（９：１、容量／容量）、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ₃Ｎ（９： １：０．３、容量／容量／容量）により順次溶出した。化合物ＩＩＩが４７．０ ％（０．４２ｇ）の収率で油状物として単離された。化合物ＩＶの製造 ＢＯＣ−グリシン（０．１６ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．１２５ ｇ、０．９ｌｍｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ ルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（９８．０％、０．１８ｇ、０．９１ｍｍｏ ｌ）を、ＤＭＦ（２．０ｍｌ）に溶解し、次いで０℃で１時間撹拌した。この反 応混合物に、ＤＭＦ（３．０ｍｌ）に溶解したアミンＩＩＩ（０．２４ｇ、０． ７６ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温まで加温し、次いで１７時間撹 拌した。ＤＭＦを減圧の下に除去し、生成する生成物を酢酸エチルに溶解した。 この酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液、ブラインにより洗浄し、次いで 硫酸マグネシウム上で乾燥させた。この有機相を減圧の下に蒸発させ、この粗製 混合物を、シリカゲルカラムにおいてフラッシュクロマトグラフイに付し、Ｅｔ ＯＡｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ₃Ｎ（９．５：０．５：０．３、容量／容量／容量）に より溶出した。化合物ＩＶが８２．０％（０．２９ｇ）の収率で油状物として単 離された。化合物Ｖの製造 化合物ＩＶから、塩化メチレン（５．０ｍｌ）中でＴＦＡ（５．０ｍｌ）を用 いて、ＢＯＣ保護基を分離した。塩化メチレンを減圧の下に除去し、この残留物 を塩化メチレン（２０ｍｌ×３）とともに、次いでトリエチルアミン（３ｍｌ× ３）とともに、ストリッピングに付した。３−Ｓ−ベンジルメルカプトプロピオ ン酸（０．１５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．１５ｇ、０．７５ｍｍｏ ｌ）、ＨＯＢｔ（０．１０３ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＥｔ₃Ｎ（０．３５ ｍｌ、２．４８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５．０ｍｌ）に溶解し、次いで０℃で１ 時間撹拌した。この反応混合物に、ＤＭＦ（３．０ｍｌ）中のアミン（０．２３ ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応混合物を室温まで加温し、 次いで１７時間撹拌した。ＤＭＦを減圧の下に蒸発させ、この残留物を Ｅｔ ＯＡｃに溶解した。このＥｔＯＡｃ層を１０％Ｎａ₂ＣＯ₃、ブラインにより洗浄 し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄上）、次いで減圧の下に蒸発させた。この粗製生成物 をフラッシュシリカゲルカラムにおいて精製し、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ₃ Ｎ（９：１：０．３、容量／容量／容量）により溶出した。化合物Ｖが６０．０ ％（０．２０５ｇ）の収率で油状物として単離された。化合物ＶＩ（ＣＰ−０４８８）の製造 Ｖ ３２．０ｍｇ（０．０５７ｍｍｏｌ）から、ＩＩに関して上記した方法を 使用して保護基を分離し、単離されたチオールを、トリス緩衝液中で化合物Ｘ（ ０．０７３ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）と反応させた。この粗製混合物をＩＩに関 して上記した方法を使用して精製した。生成物の保有時間は、１６．８２分であ った。９．５ｍｇ（１０％）の化合物ＶＩが、凍結乾燥後に、白色粉末として得 られた。質量スペクトルデータ ： 分子量計算値：２００２ 分子量実測値：２００４アミノ酸分析 ： 化合物ＶＩＩの製造： オキシモルホン塩酸塩（０．５６ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）、Ｓ−ベンジルシス テアミン（０．６９ｇ、４．１５ｍｍｏｌ）、酢酸（１．５２ｍｌ、２６．５ｍ ｍｏｌ）およびシアノホウ水素化ナトリウム（０．１１ｇ、１．６６ｍｍｏｌ） を、Ｉに関して上記した方法にしたがい使用した。この粗製混合物の精製に使用 された第三の溶出剤、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ₃ Ｎの組成は、９：１：０． ３、容量／容量／容量であった。この精製により、０．２１３ｇの化合物ＶＩＩ （２９．０％）が油状物として単離された。化合物ＶＩＩＩ（ＣＰ−０４９４）の製造 化合物ＶＩＩ（０．０６３ｇ，０．１４ｍｍｏｌ）から、ＩＩに関して上記し た方法を使用して保護基を分離した。このチオールを次いで、トリス緩衝液中で Ｘ（０．３３５ｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）により処理した。この粗製混合物を、 逆相Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムにおいて、水中１５−７０％勾配ＣＨ₃ ＣＮ、０．１％一定ＴＦＡを３５分にわたり使用して精製した。ＶＩＩは、１ ５．０分の保有時間を有した。１１９．０ｍｇ（４５．０％）のＶＩＩが、凍結 乾燥後に、白色粉末として単離された。質量スペクトルデータ ： 分子量計算値：１９０２ 分子量実測値：１９０４アミノ酸分析 ： 化合物ＩＸ（ＣＰ−０４９９）の製造： 化合物ＶＩＩ（０．００９ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）から、その保護基をＩＩに 関して上記した方法を使用して分離し、このチオールを次いで、トリス緩衝液中 でＸＩ（０．０２６ｇ、０．０１６ｍｍｏ１）と反応させた。この粗製混合物を 、Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムにおいて、水中１５−７０％勾配ＣＨ₃ ＣＮ、０．１％一定ＴＦＡを３５分にわたり、８．０ｍｌ／分の流速で使 用して精製した。ＩＸの保有時間は、１４．２２分であった。ＩＸ（６．４ｍｇ 、２０．０％）が、凍結乾燥後に、白色粉末として単離された。質量スペクトルデータ 分子量計算値：１９５７ 分子量実測値：１９５８ インビトロ試験 ＢＫＡｎ／ｍｕ−オピオイドレセプターアゴニスト ヘテロダイマーを、ラッ トの子宮（ＢＫ₂−レセプター活性）試験法および電気剌激したモルモットの回 腸（ｍｕ−オピエートレセプター活性）試験法を使用して、インビトロで試験し た。これらの試験方法は、当技術で周知である。得られた結果を表Ｉに示す： オキシコドンも、またオキシコドンから誘導されたヘテロダイマー（ＣＰ−０ ４７７およびＣＰ−０４８８）もどちらも、ｍｕ−オピエートレセプターアゴニ スト活性に係わる、インビトロモルモット回腸試験法において、いずれかの活性 を示したことは注目されるべきである。これは多分、完全に活性であるためには 、オキシコドンはインビボで脱メチル化される必要があると見做されるという事 実によるものである。その結果として、相当する脱メチル化性酵素に欠けている 試験法では、オキシコドンおよびオキシコドン由来化合物が、活性を示すものと は予想されない。 しかしながら、さらに重要なことは、これらのヘテロダイマーのＢＫＡｎ成分 の活性に係わる、およびオキシモルホン含有化合物の活性に係わる、ラット子宮 に対するデータである。表Ｉに略述されているデータから見ることができるよう に、これらのヘテロダイマーの全部において、完全活性が保留されており、また オピエートとしてオキシモルホンを採用した化合物では、完全ｍｕ−オピオイド レセプターアゴニスト活性が保留されていた。これらのデータから、ＢＫＡｎ／ ｍｕ−オピオイドレセプターアゴニスト ヘテロダイマーはインビボ系において 、それらの各レセプター集団と相互反応することができることが証明される。 インビボ試験 これらの化合物のインビボ活性を試験するために、炎症および神経原性痛みモ デルを使用した。このモデルは、マウスの後肢の足裏ふくらみ部分にホルマリン ５０μｌを注入して、その挙動応答を測定するものである。これらの実験からの データを図１、２および３にまとめて示す。対照マウス（○印）は、注入された ホルマリンの特徴的二相型応答、すなわち短時間持続する初期応答、引き続く静 止期間の後の、後肢をなめる動作を示す期間が持続する応答を示す。この後肢を なめる動作は、後肢が赤くなり、痛みがあることを意味する。なめる動作を示す 期間が長いほど、その剌激はさらに大きい痛みを伴うものである。 オキシモルホン（図２ＡおよびＢ）は、両相のなめる動作に費やす時間を減少 させるが、最高投与量（０．９および３．０μｍｏｌｅ／ｋｇ）によって、この 動作を有意に軽減させると、カタレプシイおよび露骨な呼吸低下が生じる。ブラ ジキニンアンタゴニストＣＰ−０１２７（強力なＢＫ₂選択的アンタゴニスト… 図３ＡおよびＢ）は、このホルマリン試験の両相でなめる動作に費やす時間を減 少させるが、その投与量は臨床上で実用される量よりも実質的に多い量である。 これに対して、ＣＰ−０４９４（図４ＡおよびＢ）は、両相の痛み応答を阻止す るばかりでなく、またこの場合の投与量は、オキシモルホン（０．９μｍｏｌｅ ／ｋｇ）またはＣＰ−０１２７（１２．６μｍｏｌｅ／ｋｇ）のどちらか単独に 比較して実質的に少なく、しかも適度にまたは際立って重要なことに、数時間に わたる催眠作用が見られない。これらのデータは、ＢＫＡｎ／ｍｕ−オピオイド レセプターアゴニスト ヘテロダイマーが、前記の理論的考察から予想されるよ うに、親のどちらの薬作用発生団よりも、医薬として品質的に優れていることを 示している。 上記化合物が、種々の化合物の代表例であって、当該ヘテロダイマーを構成す る成分（ＢＫＡｎ、リンカーおよび（または）ｍｕ−オピオイドレセプターアゴ ニスト）のそれぞれを変えて、所望の最適効果を生じさせることができることは 、当業者にとって明白であろう。 例５（ＢＫＡｎ／ＮＥＩ） 合成経路３に示されている構造を有するＢＫＡｎ／ＮＥＩ型の化合物（ＣＰ− ０５０２）を、例示の目的で合成した。このクラスの化合物は強力な局所的およ び（または）全身的抗炎症剤として使用することができる。この化合物はＣＰ− ０１２６およびプロトタイプ エラスターゼインヒビター、ＣＥ−１２１８から 誘導される（下記合成経路１、化合物（６）参照）。 合成経路１ このヘテロダイマーに使用された結合要素は、血清エステラーゼにより結合さ れる、結合性エステルの不干渉加水分解が起きるように選択されている。このリ ンカーを変えて、エステルカルボニル炭素の立体的接近性を変更することによっ て、あるいはこの化学物質をアミド架橋に変換することによって、加水分解速度 を、急速からゼロまで変化させることができることは、当業者にとって明白であ る。潜在的な加水分解による分解を生じない、完全に安定なリンカー分子もまた 使用することができる。 ＢＫＡｎ／ＮＥＩヘテロダイマー（１種または２種以上）の合成および分析 これらの化合物の合成は、合成経路２および３を引用して説明する。下記の詳 細な合成では、合成経路１したがうエラスターゼインヒビターＣＥ−１２１８の 製造が包含される。合成経路１： ４−ｔｅｒｔ−ブチルアセトフェノン（１）の合成 ： 乾燥している１リットルフラスコに、撹拌しながら、ＣＳ₂（２５０ｍｌ）お よびＡＩＣｌ₃（１３３．３４ｇ、０．５６ｍｏｌ）を入れた。この懸濁液を氷 浴中で冷却し、次いでｔｅｒｔ−ブチルベンゼン（５０．００ｇ、０．３７ｍｏ ｌ）およびアセチルクロライド（７８．５０ｇ、０．４１ｍｏｌ）の溶液を、２ 時間にわたり滴下して添加した（温度は、２５℃以上には上昇させない）。この 反応混合物を、室温で一夜にわたり撹拌し、次いで氷を満たした２リットルビー カーに注ぎ入れた。６Ｎ ＨＣｌ ２００ｍｌにより反応を静めた後に、この溶 液をＮａＣｌで飽和し、次いで分離した。この水性層をエーテル（２×１００ｍ ｌ）により洗浄し、次いで前の有機層と合わせた。この新しい有機溶液を水（１ ００ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄ ）、次いで蒸発させて、油状物 を得た。この油状物を蒸留し、４−ｔｅｒｔ−アセトフェノン５２．１ｇ（７９ ．３％）を、清明な無色油状物として得た（沸点_0.05mm：７０−７６℃）。 メチル ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセテート（２）の合成： Ｐｂ（ＯＡｃ）₄（１３２．０６ｇ、０．２９８ｍｏｌ）およびベンゼン２５ ０ｍｌを含有する、機械撹拌機を備えた、乾燥１リットルフラスコを窒素により 浄化し、氷浴中で冷却させた。この冷却したスラリーに、メタノール７０ｍｌ中 のＢＦ₃ ＯＥｔ₂（１３７．８ｍｌ、１．１２ｍｏｌ）、４−ｔｅｒｔ−ブチル アセトフェノン（５０．００ｇ、０．２８４ｍｏｌ）の溶液を１時間にわたり滴 下して添加した。この混合物を一夜にわたり撹拌し、水（５００ｍｌ）により反 応を静め、エーテル２５０ｍｌにより稀釈し、次いで層を分離させた。この有機 層を水により洗浄し、ＮａＨＣＯ₃ により稀釈し（注意深く）、次いでＭｇＳＯ₄ 上で乾燥させた。この混合物を濾過し、蒸発させ、次いで蒸留して、メチル４ −ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセテート３１．２ｇ（５３．４％）を、清明な無 色油状物として得た（沸点_0.04mm：７５−８０℃）。 メチル ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレート（３）の合成： メチル４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセテート（３０．００ｇ、０．１４５ ｍｏｌ）およびインドメタシン（４５．４１ｇ、０．３２０ｍｏｌ）の乾燥ＴＨ Ｆ１２５ｍｌ中の溶液を、ＴＨＦ２００ｍｌ中のＮａＨ（８．７２ｇ、０．３６ ３ｍｏｌ）のスラリーに、３０分にわたり滴下して添加した。この添加の完了後 に、この反応混合物を、還流の下に１．５時間、加熱した。この反応混合物を、 室温まで冷却させ、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、次いで濃縮させ た。この残留物をエーテルにより稀釈し、Ｈ₂Ｏにより洗浄し、次いでＭｇＳＯ₄ 上で乾燥させた。溶剤を蒸発させると、所望の生成物が油状物として得られた。 この粗製メチル４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレートおよびＫＯＨ（１ ０．０７ｇ、０．１７９ｍｏｌ）含有４：１ＥｔＯＨ／Ｈ₂Ｏの混合物を、還流 の下に４時間、加熱した。ＥｔＯＨを減圧の下に蒸発させ、残留する溶液を２Ｎ ＨＣｌによりｐＨ２に酸性にし、次いで沈殿した固形物を濾別した。 この白色固形物を乾燥させ（６０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）、所望の生成物を 得た（２３．４５ｇ、メチル４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセテートから７３ ．２％）。 ４−（３′−カルボ−ｔｅｒｔ−ブトキシ−プロピルメルカプト）フェニル ４ −ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレート（４）の合成 ： ＣＨ₂Ｃｌ₂１６ｍｌ中の４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソ酪酸（２．００ｇ 、０．００９１ｍｏｌ）およびチオニルクロライド（１．６２ｇ、０．０１３６ ｍｏｌ）の混合物を、アルゴンの下に一夜にわたり撹拌した。揮発性成分を減圧 の下に蒸発させ、生成する固形物をＴＨＦ（１５ｍｌ）に溶解し、次いでＴＨＦ （１５ｍｌ）中のＴＥＡ（２．５ｍｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４′−ヒド ロキシフェニル）メルカプトブチレート（２．４４ｇ、０．００９１ｍｏｌ）の 溶液を、１０分間にわたり滴下して添加した。この混合物を３日間撹拌し、Ｅｔ₂ Ｏにより稀釈し、次いで５％ＮａＨＣＯ₃により抽出した。この有機層をＨ₂Ｏ 、ブラインにより洗浄し、次いで乾燥させた（ＭｇＳＯ₄）。蒸発の後に、無色 油状物を分離し（ＨＰＬＣ、シリカゲル、７０：３０ＣＨ₂Ｃｌ₂／ヘキサン〜Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂線状勾配）、所望の生成物を油状物として得た（２．２０ｇ、５１．５ ％）。 ４−（３′−カルボキシープロピルメルカプト）フェニル ４−ｔｅｒｔ−ブチ ルフェニルイソブチレート（５）の合成 ： ＣＨ₂Ｃｌ₂２０ｍｌ中の４−（３′−カルボ−ｔｅｒｔ−ブトキシプロピルメ ルカプト）フェニル ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレート（２．４０ ｇ、０．００５１０ｍｏｌ）の撹拌溶液に、三フッ化酢酸（２５ｍｌ）を１５分 間にわたって添加した。さらに１５分の後に、揮発性成分を除去し、この油状物 を結晶化させ（ヘキサン）、所望の生成物１．９４ｇ（９１．８％）を白色固形 物として得た、融点：８６．０−８７．０℃、 ４−（３′−カルボキシープロピルスルホニル）フェニル ４−ｔｅｒｔ−ブチ ルフェニルイソブチレート（６）の合成 ： ５０ｍｌフラスコに、４−（３′−カルボキシ−プロピルスルホニル）フェニ ル ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレート（１．６４ｇ、０．００３９ ６ｍｏｌ）、ＨＯＡｃ（２５ｍｌ）および３０％Ｈ₂Ｏ₂１５ｍｌを入れた。この 反応混合物を、一夜にわたり撹拌し、Ｈ₂Ｏ（５０ｍｌ）により稀釈し、生成す る固形物を濾別した。乾燥（１２時間、１ｍｍＨｇ）の後に、この固形物を再結 晶させ（ＣＨ₂Ｃｌ₂／ヘキサン）、所望の生成物１．５４ｇ（８７．１％）を白 色粉末として得た、融点：１０７−１０８．５℃。 ６−マレイミドヘキサノール（７）の合成： ６−マレイミドヘキサノール（７）の合成は、下記の合成経路２に記載の結合 方法を使用する： 合成経路２ １００ｍｌフラスコに、６−アミノヘキサノール（０．７６ｇ、０．００６４ ｍｏｌ）および飽和ＮａＨＣＯ₃２５ｍｌを入れた。このホモジネートを室温で 撹拌し、次いでＮ−メトキシカルボニルマレイミド（１．００ｇ、０．００６４ ｍｏｌ）を固形物として添加した。この混合物は、この添加後に短時間で清明に なり、この混合物を１時間撹拌した。この混合物をＥｔＯＡｃにより抽出し、乾 燥させ（ＭｇＳＯ₄）、次いで蒸発させた。生成する混合物をシリカゲル上で分 離した（ＣＨ₂Ｃｌ₂〜ＥｔＯＡｃ）。生成物が白色固形物として得られた、０． ３２ｇ（２５．２％）。この生成物は、さらに精製することなく使用した。 ＣＰ−０５０２の合成 化合物（６）（ＣＥ−１２１８）を化合物（７）によりエステル化し、生成さ れた化合物（８）を次いでＣＰ−０１２６と結合させて、ダイマーＣＰ−０５０ ２を生成させた。これらの後者の反応を合成経路３に示す： 合成経路３ 合成経路３をさらに詳細に参照して、化合物（６）（２００ｍｇ、０．４４８ ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１２４ｍｌ、２当量）、６−マレイミドヘ キサノール（７）（９７ｍｇ、１．１当量）を、塩化メチレン２ｍｌ中に溶解し た。この撹拌した溶液に、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィ ン酸クロライド（１２２ｍｇ、１．０当量）を添加した。生成する懸濁液を室温 で４時間、撹拌した。この反応混合物を塩化メチレン２５ｍｌにより稀釈し、次 いで飽和ＮａＨＣＯ₃により洗浄した。この有機溶液を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥さ せ、次いで溶剤を減圧の下に、除去した。シリカゲル クロマトグラフイ（２× １８ｃｍカラム）に付し、３５／６５アセトン／ヘキサン（Ｒｆ＝０．４）によ り溶出して、化合物（８）を無色油状物として得た。 化合物（８）（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミ ン１００μｌ含有ＤＭＦ１０ｍｌ中に溶解した。１００ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ ）のＣＰ−０１２６を添加し、時々撹拌しながら、反応を３０分間進行させた。 この反応混合物をＶｙｄａｃｌ′′Ｃ−１８逆相カラムに注入し、次いでＨ₂Ｏ 中の１５％−９０％アセトニトリルにより１０ｍｌ／分の速度で、３５分間にわ たり溶出した（一定０．１％ＴＨＦ）。相当するフラクションを凍結乾燥させ、 白色粉末（ＣＰ−０５０２）５２ｍｇ（３５％）を生成した。レーザー脱着質量 スペクトル分析Ｍ／Ｚ＝１８９０（Ｍ＋Ｈ）、計算値＝１８９０。自動式アミノ 酸配列結果により、変更されたアミノ酸が無い正しいペプチド配列が確認された 。 ＢＫＡｎ／ＮＥＩヘテロダイマー（１種または２種以上）のインビトロ活性 下記の化合物のＢＫＡｎ活性およびＮＥＩ活性のインビトロ評価を、当業者に 公知の標準方法にしたがい行った。ＢＫＡｎ活性（ｐＡ₂）は、ラット子宮標本 を使用して評価し、そしてＮＥＩ（Ｋ₁ ^SS）活性は、精製ヒト向神経性エラスタ ーゼ（ＨＮＥ）および合成可溶性色素産生性基質、メトキシスクシニル−アラニ ル−アラニル−プロピル−バリル−パラニトロアニリン（ＭＯＳ−ＡＡＰＶ−ｐ ＮＡ）を使用して行った。インヒビターを、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム、０ ．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、５％Ｄ ＭＳＯ、ｐＨ７．５、中のＭＯＳ−ＡＡＰＶ−ｐＮＡ（０．５ｍＭ）と混合し、 次いでＨＮＥ（１０−２０ｎＭ）を添加した。ニトロアニリンの生成を、２５℃ において、４００−４１０ｎｍの波長で、分光光度測定により追跡した。次いで 、ＥＮＺＦＩＴＴＥＲプログラムにより、Ｋ₁ ^SSを包含する標準酵素運動学的パ ラメーターを自動式に計算した。 下記の結果が得られた： 表ＩＩのデータは、ＮＥＩ活性に係わり、一体形態ヘテロダイマー（ＣＰ−０ ５０２）と遊離モノマー状ＮＥＩ分子（ＣＥ−１２１８）との間には、それらの 各Ｋ₁ ^SSに関して、僅かな相違があることを示している。しかしながら、これは 、その加水分解生成物、ＣＰ−０４８７（ＣＰ−０１２６のスクシンイミドヘキ サノール誘導体）に比較した、一体形態ヘテロダイマーのＢＫＡｎ部分の活性に ついては真実ではない。すなわち、一体形態化合物の力値は、モノマー状ＢＫＡ ｎよりも、ほとんど全対数的（ｆｕｌｌ ｌｏｇ）に小さい。興味深いことに、 この一体形態化合物が示す活性は、不可逆性ブラジキニン拮抗作用形式であり、 長いインキュベーション時間において子宮収縮を誘発させるブラジキニンのアン タゴニスト活性は明白に増加される。これらのタイプのレセプター相互反応は、 標準ｐＡ₂分析法では充分には測定されず、ＢＫＡｎ活性に係わるＣＰ−０４８ ７とＣＰ−０５０２との間に見出だされる活性の相違は、実際よりもはるかに明 白であることがある。これらのデータの基礎に存在する分子薬理学的メカニズム とは無関係に、ＢＫＡｎとＮＥＩとの組み合わせ活性を単一の分子中に導入でき ることは明白である。 上記データは、当該一体形態化合物のインビボ加水分解が、これら２種の分子 の挙動を変えることができ、それによってこの一次化合物のインビボ活性が総合 的に増加されることを示唆している。残念なことに、ＢＫＡｎとＮＥＩとの組み 合わせインビボ活性の評価に使用することができる確立されている動物モデルは 存在していない。従って、当該一体形態ヘテロダイマーのインビボ加水分解に係 わる潜在能力を評価するために、インビトロ「代用」系を使用した。この代用系 は、本発明のヘテロダイマーをヒト血漿とともにインキュベートし、生成する代 謝物を逆相ＨＰＬＣにより分析することからなる。 ＣＰ−０５０２を、新しく採取したヒト血漿に添加し、種々の時間にわたり、 ３７℃でインキュベートした。指定時点で、試料を酸性（０．１Ｎ ＨＣｌ）ア セトニトリルにより処理して、血漿タンパク質を沈殿させた。一定量（７５μｌ ）の上清を次いで、Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラムにおいて、０．１ ％ＴＨＦ中の２４％−８０％アセトニトリル勾配を使用して分析した。この溶出 液を２１４ｎｍで追跡した。 図５ａおよびｂは、このタイプの分析を示す代表的逆相ＨＰＬＣクロマトグラ ムである。これらのクロマトグラムから見ることができるように、親の化合物は 、スクシンイミドヘキサノール修飾モノマー、ＣＰ−０４８７およびその脱Ａｒ ｇ⁹誘導体に容易に加水分解されるものと見做される（血漿カルボキシペプチダ ーゼは、当該一体形態ヘテロダイマー、ＣＰ−０５０２およびＣＰ−０４８７の 両方から末端アルギニン残基を開裂させる）。この加水分解反応の見掛け上のＴ_1/2 は、ほぼ１１３分間である。このヘテロダイマーのＮＥＩ成分は、活性エス テルであり、同様に加水分解を受ける。これに対して、一体形態ＮＥＩモノマー およびその加水分解生成物は、このグラフの中央部分に見られる血漿由来ピーク により不明瞭にされており、この系を使用して可視化することはできない。ＮＥ Ｉはヘテロダイマーの成分として、モノマーの場合と同等の活性を有するから、 当該ヘテロダイマーの、その２種の成分部分への解離が、ＢＫＡｎ成分に係わる 場合に比較して、その活性に対する作用は小さいものと見做される。 このヘテロダイマーの加水分解速度が、「結合」エステル分子の空間的環境お よびまた電子的環境により影響を受けることができること、および使用される化 学物質の種類が、当該ヘテロダイマーの２種の成分の解離速度（またはその欠落 ）の調節に使用することができる化学物質の種類の単に一つの例であることは、 当業者にとって明白であろう。 例６（ＢＫＡｎ／ＣＯＩ） ＢＫＡｎ／ＣＯＩヘテロダイマーの合成および分析 代表的ＢＫＡｎ／ＣＯＩヘテロダイマー（ＣＰ−０４６０）を、下記合成経路 ４および５にしたがい合成した： 合成経路４ ６−マレイミドヘキサニル １−（４−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２ −メチル−３−インドヒルアセテート（９）の合成 １００ｍｌフラスコに、インドメタシン（１．９０ｇ、０．００５３２ｍｏｌ ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂ ２５ｍｌおよびＤＣＣ（０．５５ｇ、０．００２６６ｍｏｌ） を入れた。２時間後に、この混合物を濾過し、ＤＣＵをＣＨ₂Ｃｌ₂１５ｍｌによ り洗出し、この新しい溶液に、６−マレイミドヘキサノール（０．５０ｇ、０． ００２５３ｍｏｌ）を固形物として添加し、次いで無水Ｎａ₂ＣＯ₃（０．３２ｇ 、０．００３０４ｍｏｌ）を添加した。４日間後に、この混合物を濾過し、Ｅｔ₂ Ｏにより稀釈し、次いでＨ₂Ｏ中５％Ｎａ₂ＣＯ₃により洗浄し、次いで乾燥させ た（ＭｇＳＯ₄）。生成する黄色油状物を、ＨＰＬＣ（シリカゲル；ＣＨ₂Ｃｌ₂ 〜８０：２０ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＥｔＯＡｃ、線状勾配、６０分間）で精製して、所望 の生成物を黄色油状物として得た、０．７９ｇ（５８．０％）。¹Ｈ 化合物（９）とＣＰ−０１２６との結合による、ＣＰ−０４６０の生成を、下 記の合成経路５およびその後の記載により説明する： 合成経路５ ＣＰ−０１２６（１００ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチル アミン５０μｌ含有９５％ＤＭＦ／５％０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中で、時々 撹拌しながら３０分間、化合物（９）（０．１２ｍｏｌ、１．５当量）と反応さ せた。この反応混合物を、Ｖｙｄａｃ １′′Ｃ−１８逆相カラム上に、１０ｍ ｌ／分の速度で注入し、１５％アセトニトリル／０．１％ＴＨＦから４０％アセ トニトリル／０．１％ＴＨＦの勾配溶出を、２０分間使用することによって精製 した。相当するフラクションを凍結乾燥させて、無色粉末（ＣＰ−０４６０）６ ４ｍｇ（４５％）を生成させた。レーザー脱着質量分光光度測定：Ｍ／Ｚ＝１８ ０２（Ｍ＋Ｈ）、計算値＝１８０２。 前記したように、ＣＯＩに係わる研究において、ＣＯＩを細胞内に浸透させる には、ＢＫＡｎからの解離が必要であることがある。従って、 ＢＫＡｎ／ＣＯＩヘテロダイマーの機能的活性を評価するために、ＣＰ−０４６ ０をラット肺実質ストリップにさらし、次いでここにアラキドン酸をチャレンジ させた。この組織は、両方の非特異的エラスターゼ活性を有し、かつまたアラキ ドン酸をトロンボキサンに変換し（シクロオキシゲナーゼ依存性経路を経る）、 次いで最終的に、この試験法で見出だされる平滑筋収縮に応答することが知られ ている。 この系を使用して、インドメタシンおよびＣＰ−０４６０に係わるｌｏｇ用量 比シフトは、それぞれ０．９９８＋／−０．４２５および１．０２９＋／−０． ０４２であることが見出だされた。この数値は、インドメタシン単独およびＣＰ −０４６０の両方が、外部から施用されたアラキドン酸に対する応答として生じ る収縮を、同等の力値で阻止することを示している。ＢＫＡｎそれ自体は、この 系で効果を有していない。これらのデータは、ＢＫＡｎ／ＣＯＩヘテロダイマー のＣＯＩ成分が、エステル分解活性およびシクロオキシゲナーゼ活性の両方を含 む組織において、機能的活性を有することを示している。 一体形態ＣＰ−０４６０をまた、標準ラット子宮試験法を用いてＢＫＡｎ活性 に係わり試験し、このＣＰ−０４６０のｐＡ₂は、ほぼ７．８であることが見出 だされた。さらにまた、ＣＰ−０４６０は（ＣＰ−０５０２と同様に）、ブラジ キニン誘発子宮収縮の伝統的競合性アンタゴニストとしては挙動せず、むしろ特 により高い濃度で、「疑似−非競合性」アンタゴニストのタイプの挙動を示した 。遊離インドメタシンが、いかなる濃度でも効果を有していないことから、この 非定型挙動は、ＣＯＩ活性それ自体の活性を反映することはできない。 見出だされたデータに係わる説明とは無関係に、ここで例示されているもの以 外の別種の２種の化合物と同様に、各種の適当な結合分子を使用して、加水分解 性エステルに基づくヘテロダイマーを形成するための、ＣＯＩモノマーの遊離ヒ ドロキシル基およびカルボキシル基（これらの基はかなりのＣＯＩに共通の特徴 である）を提供することによって、薬理学的に重要なＢＫＡｎ／ＣＯＩヘテロダ イマーを製造できることは、当業者にとって明白である。このような化合物は、 種々の炎症または痛みを伴う症状の処置に、およびまた子宮平滑筋機能障害活動 の処置に、使用することができる。 本発明を、上記で非ペプチドであるＹ成分を使用して説明したが、この成分は 同等に、前記ＷＯ ９２／１７２０１に例示されている、ヘテロダイマーを包含 する、完全ペプチドまたはその部分からなることができる。 本発明のダイマーは、慣用の医薬組成物の形態で使用することができ、この組 成物は活性成分および医薬上で許容される担体からなる。このような組成物は、 局所、経口、エアゾル、筋肉内、皮下または静脈内投与に適する形態であること ができる。このような組成物中に存在する活性成分の量は、用途および投与方法 に依存して、例えば約０．００１−９０．０重量％の範囲であることができ、さ らに多くのまたは少ない量の活性成分を使用することもできる。好ましい投与量 は、意図する用途および投与方法に基づき格別に変えることができる。しかしな がら、通常、有効用量は０．１−１００マイクログラム／体重ｋｇの程度である 。 本発明の範囲は、別紙請求の範囲により定められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/18 8318−4Ｈ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 グッドフェロー，バル スミス アメリカ合衆国 80030 コロラド州ウエ ストミンスター，フーカー コート 10045 (72)発明者 マラセ，マノジュ ブイ. アメリカ合衆国 80021 コロラド州ウエ ストミンスター，ダブリュ．エイティーエ イトス プレース 9661 (72)発明者 スプルース，ライル ダブリュ. アメリカ合衆国 80005 コロラド州アー バダ，ホイト コート 7747 (72)発明者 ワリー，エリック ティー. アメリカ合衆国 80403 コロラド州ゴー ルデン，ダブリュ．セブンティーセブンス プレース 15955

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： （ＢＫＡｎ）（Ｘ）（Ｙ） 式中、ＢＫＡｎはブラジキニン アンタゴニストペプチドであり；Ｙは ＢＫＡｎ以外の相違する薬作用発生団であり；そしてＸはＢＫＡｎ成分とＹ成分 とを化学的に結合する結合分子である、 で表わされるヘテロダイマー。 ２．Ｙが、炎症プロセスの非キニン成分に対抗する活性を有する非ペプチド薬 作用発生団である、請求項１に記載のヘテロダイマー。 ３．Ｙが、炎症プロセスの非キニン成分に対抗する活性を有するペプチド薬作 用発生団である、請求項１に記載のヘテロダイマー。 ４．Ｙが、ｍｕ−オピオイド レセプターアゴニストである、請求項１に記載 のヘテロダイマー。 ５．Ｙが、向神経性エラスターゼインヒビターである、請求項１に記載のヘテ ロダイマー。 ６．Ｙが、シクロオキシゲナーゼ インヒビターである、請求項１に記載のヘ テロダイマー。 ７．Ｙが、ＮＫ₁ レセプターアンタゴニストまたはＮＫ₂ レセプターアンタゴ ニストである、請求項１に記載のヘテロダイマー。 ８．Ｘが、加水分解性である、請求項１に記載のヘテロダイマー。 ９．Ｘが、非加水分解性である、請求項１に記載のヘテロダイマー。 10． Ｘが、ＢＫＡｎ中に挿入されたアミノ酸またはアミノ酸類縁体からなる 、請求項１に記載のヘテロダイマー。 11． Ｘが、マレイミド／スクシンイミドに基づく架橋基からなる、請求項１ に記載のヘテロダイマー。 12． Ｘが、ビススクシンイミドアルカンからなる、請求項１に記載のヘテロ ダイマー。 13． Ｘが、ＢＫＡｎペプチドスルフヒドリル基のＳ原子からなる、請求項１ に記載のヘテロダイマー。 14． Ｙが、オキシコドンまたはオキシモルホンからなる群から選択される、 請求項１に記載のヘテロダイマー。 15． Ｙが、インドメタシンである、請求項１に記載のヘテロダイマー。 16． Ｙが、向神経性エラスターゼ インヒビターであり、そしてＸが ＢＫＡｎペプチド鎖のスルフヒドリル基のイオウ原子を介してＢＫＡｎに結合し ているスクシンイミド基を含んでいる、請求項１に記載のヘテロダイマー。 17． 向神経性エラスターゼ インヒビターが、４−（３′−カルボキシ−プ ロピルスルホニル）フェニル−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレートで ある、請求項１６に記載のヘテロダイマー。 18． ＢＫＡｎペプチド鎖に結合するために付加されているリンカー基を含む 、薬作用発生団。 19． リンカー基が、アミン、カルボン酸、ヒドロキシル、スルフヒドリルま たはマレイミド基、あるいはペプチド中に挿入できるアミノ酸からなる、請求項 １８に記載の薬作用発生団。 20． 非ペプチド薬作用発生団結合するためのリンカー基を含んでいる、 ＢＫＡｎペプチド。 21． リンカー基が、スルフヒドリル基、マレイミド基、あるいはヒドロキシ ル、アミンまたはカルボン酸基を末端に有するアルカン鎖からなる、請求項２０ に記載のＢＫＡｎペプチド。 22． ｍｕ−オピオイド レセプターアゴニストである、請求項１８に記載の 薬作用発生団。 23． 向神経性エラスターゼインヒビターである、請求項１８に記載の薬作用 発生団。 24． シクロオキシゲナーゼインヒビターである、請求項１８に記載の薬作用 発生団。 25． ＮＫ₁レセプターアンタゴニストまたはＮＫ₂レセプターアンタゴニスト である、請求項１８に記載の薬作用発生団。 26． ＢＫＡｎが、ＤＲ−Ｒ−Ｐ−Ｊ−Ｇ−Ｆ−Ｃ−ＤＦ−Ｌ−Ｒまたは_D Ｒ−Ｒ−Ｐ−Ｊ−Ｇ−Ｔｈｉ−Ｇ−_DＴｉｃ−Ｏｉｃ−Ｒである、請求項１に記 載のヘテロダイマー。 27． 薬作用発生団が、ｍｕ−オピオイド レセプターアゴニストである、請 求項２６に記載のヘテロダイマー。 28． 薬作用発生団が、向神経性エラスターゼ インヒビターである、請求項 ２６に記載のヘテロダイマー。 29． 薬作用発生団が、シクロオキシゲナーゼ インヒビターである、請求項 ２６に記載のヘテロダイマー。 30． 薬作用発生団が、ＮＫ₁アンタゴニストまたはＮＫ₂ アンタゴニストで ある、請求項２６に記載のヘテロダイマー。 31. 薬作用発生団が、４−（３′−カルボキシ−プロピルスルホニル）フェ ニル−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレートである、請求項２８に記載 のヘテロダイマー。 32． Ｘが、−Ｓ−によりＢＫＡｎ成分に結合しているビススクシンイミドア ルカン基からなる、請求項３１に記載のヘテロダイマー。 33． 化合物 ４−（３′−カルボキシ−プロピルスルホニル）フェニル−４ −ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソブチレート。 34． 請求項１に記載のヘテロダイマーおよび医薬上で許容される担体からな る、医薬組成物。 35． ブラジキニンアンタゴニストを使用する痛みおよび炎症の処置方法にお いて、請求項１に記載のヘテロダイマーを使用することからなる改良。