JPH0834799A

JPH0834799A - プロタミンの製造方法

Info

Publication number: JPH0834799A
Application number: JP5305795A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Mikajiri; 昭博三ケ尻; Shuji Jinno; 修次神野
Original assignee: Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Nissui Corp
Priority date: 1995-03-13
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 1996-02-06
Anticipated expiration: 2012-12-03
Also published as: JP2685424B2

Abstract

(57)【要約】【目的】魚類の白子から容易にかつ高純度にプロタミ
ンを抽出、精製することのできるプロタミンの製造方法
を提供する。【構成】魚類の白子からプロタミンを抽出するに際
し、あらかじめ白子を希鉱酸で洗浄処理する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、プロタミンの製造方
法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
魚類の白子から容易にかつ高純度にプロタミンを抽出、
精製することのできるプロタミンの製造方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】プロタミンは、ニシンやサケ
等の魚類やニワトリなどの脊椎動物の成熟精子核中に存
在している分子量４０００〜８５００の塩基性蛋白質で
あり、近年、医薬品、あるいは食品、化粧料、清掃用品
等の抗菌剤として注目されている。このプロタミンの工
業的製造方法としては、一般に、魚類の精巣（白子）を
磨砕し、その磨砕物から鉱酸でプロタミンを抽出する方
法が知られているが、通常この白子に付着している血液
や粘液、あるいは白子に含まれている各種蛋白質が夾雑
物として共に抽出されるため、従来より、夾雑物を含有
しない高純度のプロタミンを得るための抽出方法あるい
は鉱酸抽出液の精製方法が種々提案されている。

【０００３】たとえば、白子を磨砕することなくそのま
まの形状で直接鉱酸により抽出する方法が提案されてお
り、また、鉱酸抽出液の精製方法としては、アルカリ剤
の添加による塩析法、縮合リン酸塩の添加による沈澱
法、エタノール等の有機溶媒による沈澱法、酵素を作用
させる方法、プロタミンを遊離化した後イオン交換や電
気透析する方法等が提案されている。

【０００４】しかしながら、これらの方法によってもプ
ロタミンを効率よく抽出、精製することは困難であり、
高純度のプロタミンを製造するためには相当の手間とコ
ストをかけなければならなかった。たとえば、白子を磨
砕することなくプロタミンを抽出する場合でもヒストン
等の塩基性不純物蛋白質は同時に抽出され、それらがそ
の後の精製行程を妨害するので、高純度のプロタミンを
得ることが困難になっていた。

【０００５】このため、プロタミンを簡便な方法で高純
度に製造することのできる新しいプロタミンの製造方法
の開発が望まれていた。この発明は、以上の通りの事情
を踏まえてなされたものであり、従来法の欠点を改善
し、魚類の白子からプロタミンを簡便にかつ選択的に抽
出することができ、抽出液中にヒストン等の不純物蛋白
質や血液、粘液成分等の夾雑物が混入することがなく、
また、プロタミンの鉱酸抽出液を高純度に精製すること
もできる高品質プロタミンの製造方法を提供することを
目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、魚類の白子からプロタミンを抽
出するに際し、あらかじめ白子を希鉱酸で洗浄処理する
ことを特徴とするプロタミンの製造方法を提供する。

【０００７】

【作用】この発明の製造方法は、上記の通り、魚類の白
子からプロタミンを抽出するものであるが、上記の洗浄
処理を施す方法はプロタミンを選択的に抽出することを
可能とするものであり、希鉱酸を洗液として予め魚類の
白子を洗浄処理し、その後に鉱酸による抽出など任意の
方法でプロタミンを高純度で抽出することを可能とする
ものである。

【０００８】この洗浄処理では、ヒストン等の不純物蛋
白質、血液、粘液成分などの夾雑物だけを選択的に希鉱
酸中に抽出し、白子から夾雑物を十分に洗い出す。洗浄
処理を施す白子としては、そこに付着あるいは含有され
ている夾雑物が十分に洗浄除去されるように、磨砕した
ものとするのが好ましい。なお、白子の種類としては特
に制限はなく、サケ、ニシン、ニジマス、マグロなど従
来よりプロタミンの製造原料として使用されている白子
を広く使用することができる。

【０００９】また、洗液とする希鉱酸としては、白子の
種類にもよるが、０．０５〜０．２Ｎ程度の希鉱酸を使
用するのが好ましい。もちろんこの濃度は限定的ではな
いが、０．０５Ｎ未満の希鉱酸では夾雑物が抽出され難
くなるので十分な洗浄ができなくなり、一方０．２Ｎを
超える希鉱酸を使用すると夾雑物の他にプロタミンも抽
出されてプロタミンの損失をきたし生産性が低下するの
で好ましくない。

【００１０】希鉱酸の使用量は、白子の種類や量に応じ
て酸の総量（酸の規定度Ｎ×酸の使用量ｌ）が十分なも
のとなるように定めることが好ましく、一般には白子に
対して１〜３倍容量程度とするのが好適である。また、
洗浄処理はこのような希鉱酸を白子と混合攪拌し、洗液
を分離除去するだけで容易に行うことができるが、この
場合の混合攪拌時間（洗浄時間）は、白子の種類、希鉱
酸の規定度、使用量等に応じて高い洗浄効率を実現でき
るように適宜定める。通常は数時間以内で十分な洗浄処
理を達成することができる。

【００１１】以上のように、洗浄処理の条件は白子の種
類、希鉱酸の規定度および使用量、洗浄時間等の相互の
関係が全体として好適なものとなるように設定すること
が好ましい。このような条件としては、サケやニシン等
の魚類の白子の磨砕物に対して０．２Ｎの塩酸を１倍容
量使用し、洗浄時間を１時間とすることを例示すること
ができる。

【００１２】なお、夾雑物を抽出した洗液を洗浄後に白
子から分離除去する方法は、遠心分離や濾過等の常法に
よることができる。このように白子に洗浄処理を施した
後は、その洗浄処理物（すなわち洗浄処理した白子）か
ら抽出によりプロタミンを製造する。これによりヒスト
ン等の不純物蛋白質、血液、粘液成分等の夾雑物の含有
量が著しく低減した高純度のプロタミンの抽出液を得る
ことが可能となる。

【００１３】なお、この場合の抽出方法については特に
制限はなく従来の鉱酸による抽出方法を利用することが
でき、その際の抽出条件としては、使用する鉱酸の規定
度や量および抽出時間をプロタミンの抽出効率を高めら
れるように適宜設定する。抽出条件は白子の種類にもよ
るが、たとえばサケやニシン等の白子に対して１Ｎの鉱
酸を２倍容量使用し、抽出時間を１時間とする。

【００１４】また、抽出条件を設定するに際しては、抽
出時間を必要以上に長くしないようにし、通常数時間以
内とする。０．２Ｎ〜０．５Ｎ程度の希鉱酸を使用して
抽出する場合でも抽出に長時間をかけすぎるとかえって
抽出量が半減する。抽出したプロタミンは、必要により
さらに電気透析等の常法により脱塩濃縮と乾燥で遊離型
とすることができ、また従来の塩形成方法により、塩酸
塩、硫酸塩、硝酸塩等の所望の塩形態とすることができ
る。

【００１５】以上のように、この発明の方法は、洗浄処
理を施すことにより魚類の白子からプロタミンを選択的
に高純度抽出できるようにするが、プロタミンの鉱酸抽
出液は、適宜な方法でさらに精製してもよい。この場合
の精製方法としては、たとえば従来公知の、アルカリ剤
の添加による塩析法、縮合リン酸塩の添加による沈殿
法、エタノ−ル等の有機溶媒による沈殿法、酵素を作用
させる方法、プロタミンを遊離化した後イオン交換や電
気透析する方法等が適宜に併用される。

【００１６】また、この発明の発明者が提案している鉱
酸抽出液に酸可溶性カチオン系高分子凝集剤を添加して
夾雑物を分離除去する方法も適宜に用いられる。酸可溶
性カチオン系高分子凝集剤としては、酸溶液に溶解して
ポリ陽イオンとなるものを広く使用できる。たとえばキ
トサン、ポリアミノアルキルメタクリレート、ポリエチ
レンイミン、ハロゲン化ポリジアリルアンモニウム、ア
イオネン系凝集剤等を使用することができる。特に、キ
トサンは好適に使用することができる。

【００１７】これらの高分子凝集剤は常法の凝集分離法
によって使用することができる。たとえば、キトサンを
用いる場合には、任意の鉱酸によるプロタミンの抽出液
にキトサンを添加して攪拌混合し、ｐＨを８〜１０程度
に調整し、キトサンと共に夾雑物を沈澱させ、その沈澱
物を遠心分離等によって分離除去する。この発明におい
て、より高純度のプロタミンを製造する場合には、洗浄
処理をした白子からの鉱酸抽出液に、これらの精製方
法、特にこの発明者が提案している酸可溶性カチオン系
高分子凝集剤を用いる精製方法を適用することが望まし
い。すなわち、まず白子に前述の希鉱酸による洗浄処理
を施し、次にその洗浄処理物から鉱酸でプロタミンを抽
出し、そのプロタミンの鉱酸抽出液に対してこの精製方
法を適用する。

【００１８】なお、この場合においても鉱酸によるプロ
タミンの抽出方法自体は常法によることができる。ま
た、この精製後に遊離型、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の
所望の塩形態とすることも常法によることができる。以
下、この発明を実施例に基づいて具体的に説明する。

【００１９】

【実施例】実施例１白子の好適な洗浄条件を検討するために、プロタミン含
有量８％、５％、２．５％の３種類の白子に対して、そ
れぞれ次の（ｉ）〜（iii)の抽出処理を施し、それらの
抽出液中の成分を電気泳動法により検出した。

【００２０】（ｉ）１Ｎ塩酸、１倍容量による１時間の
抽出処理。（ii）０．２Ｎ塩酸、１．５倍容量による１時間の抽出
処理。 (iii)０．２Ｎ塩酸、１．５倍容量による１時間の抽出
処理をした後、さらにその抽出残渣に１Ｎ塩酸、１倍容
量による１時間の抽出処理。この結果、プロタミン含有量の異なるいずれの種類の白
子についても、（ｉ）の場合の抽出液にはプロタミンと
共にヒストン等の夾雑物が検出され、（ii）の場合の抽
出液にはプロタミンがほとんど検出されることなく相当
量のヒストンその他の夾雑物が検出され、また（iii)の
場合の抽出液にはヒストン等の夾雑物は検出されること
なくプロタミンのみが検出された。

【００２１】（ｉ）に対しての（ii）（iii)の対比から
明らかなように、ヒストン等の夾雑物を含有しない高純
度のプロタミン抽出液を得るためには、１Ｎ塩酸で抽出
処理をする前に、０．２Ｎ塩酸で洗浄処理して夾雑物を
抽出除去するのが有効であることが確認できた。実施例２白子の好適な洗浄条件あるいは抽出条件を検討するため
に、次のように、白子の種類、抽出溶媒としての塩酸の
規定度および使用量、抽出時間を変えて抽出処理を行
い、塩酸抽出液中に抽出されるプロタミンの回収率をＨ
ＰＬＣで測定し、また不純物蛋白質成分を電気泳動法に
より検出した。なおＨＰＬＣのスタンダードとしてはシ
グマ社製、ナカライテスク製、和光純薬製のSalmine su
lfate,Salmine chloride, Salmine free base 及びClup
eine sulfateを用いた。

【００２２】（ｉ）白子…プロタミン含有量８％、５
％、２．５％の３種類（ii）塩酸の規定度…０．２Ｎ、０．５Ｎ、１Ｎ、２Ｎ（iii)塩酸の使用量（白子に対する容量比）…１倍、２
倍、５倍（iv）抽出時間…１時間、２時間、２０時間ＨＰＬＣの測定結果をプロタミン含有量８％、５％およ
び２．５％の各々の白子について示したものが図１、図
２および図３である。

【００２３】この結果、塩酸中に抽出されるプロタミン
の回収率は白子の種類に応じて異なるものの塩酸の規定
度、使用量および抽出時間に対してほぼ同様の挙動を示
していた。すなわち、いずれの白子においても、１Ｎと
２Ｎの塩酸による場合にはプロタミンの回収率はほぼ等
しく、０．２Ｎの場合には著しく低下しており、特に
０．２Ｎの塩酸を１倍容量使用したものについては抽出
液には全くプロタミンが検出されなかった。

【００２４】これにより白子の洗浄処理には０．２Ｎ以
下の希鉱酸が好適であり、また抽出処理には０．２Ｎよ
り高い規定度の鉱酸が好適であることがわかった。ま
た、０．５Ｎ以下の場合にはプロタミンの回収率が塩酸
の使用量に大きく依存するが、１Ｎ以上の場合には依存
性は小さくなるので、安定的な回収率を確保するための
抽出処理としては１Ｎ程度以上の鉱酸を使用するのが好
ましいことがわかった。

【００２５】抽出時間に関しては、図２から明らかなよ
うに、数時間程度ではプロタミンの回収率に大きな差異
はないが、２０時間程度の長時間の処理を行うと、プロ
タミンが加水分解するためか、回収率が著しく低下し、
処理条件としては好ましくないこともわかった。実施例３サケの白子（プロタミン含有量７％）１Ｋｇを摩砕し、
０．２Ｎの塩酸１ｌを加えた後に攪拌して洗浄し、洗液
を遠心分離（７０００Ｇ，５分）により除去した。

【００２６】次に残渣に対して１Ｎの塩酸２ｌを加えて
攪拌し、遠心分離して上澄を採取し、中和してプロタミ
ン抽出液を得た。このプロタミン抽出液の成分を分析し
たところ、固形分７．４４％、プロタミン含有量２．８
５％、ＮａＣｌ含有量４．０１％であり、プロタミンの
純度（プロタミン含有量／（固形分−ＮａＣｌ含有
量））は８３．２％であった。

【００２７】このプロタミン純度は後述する洗浄処理を
しない比較例に比べて著しく高純度であった。実施例４実施例３と同様にして、サケの白子１Ｋｇを０．２Ｎの
塩酸１ｌにより洗浄し、次いで１Ｎの塩酸２ｌによりプ
ロタミンを抽出し、遠心分離して上澄を採取した。

【００２８】この上澄に、キトサン２．５Ｋｇを添加し
ｐＨを調整してプロタミン抽出液を精製した。この精製
したプロタミン抽出液の成分を分析したところ、固形分
６．９０％、プロタミン含有量２．６８％、ＮａＣｌ含
有量４．０５％であり、プロタミンの純度は９４％であ
った。比較例実施例３と同様にして、サケの白子１Ｋｇを摩砕し、１
Ｎの塩酸２ｌを加えて攪拌し、遠心分離して上澄を採取
し、中和してプロタミン抽出液を得た。

【００２９】このプロタミン抽出液の成分を分析したと
ころ、固形分８．７７％、プロタミン含有量２．６５
％、ＮａＣｌ含有量３．７８％であり、プロタミンの純
度は５３．１％にすぎなかった。洗浄処理や精製処理を
しないこの比較例のプロタミン純度は前述の実施例に比
べて著しく劣っていた。実施例５凍結保存していたサケの白子（プロタミン含有量７％）
１Ｋｇを解凍し、摩砕後、皮を除去した。これに０．２
Ｎの塩酸１ｌを加えて１時間攪拌して洗浄し、遠心分離
（７０００Ｇ，５分）により洗液を除去した。

【００３０】次に残渣に対して１Ｎの塩酸２ｌを加えて
１時間攪拌し、遠心分離して上澄を採取し、プロタミン
抽出液を得た。このプロタミン抽出液１．５ｌに０．２
Ｎの塩酸に溶解した１％キトサン（共和油脂工業社製フ
ローナック）１５０ｍｌを添加し、ｐＨを８〜１０に調
整して凝集沈澱させ、遠心分離して上澄を採取し、プロ
タミン抽出液の精製液１．７ｌを得た。

【００３１】次にこの精製液を使用して、以下のように
（ｉ）硫酸プロタミン、（ii）塩酸プロタミン、（iii)
遊離プロタミンを調製し、それらの純度を測定した。（ｉ）硫酸プロタミン精製したプロタミン抽出液１ｌに１０％硫酸１００ｍｌ
とエタノール５ｌを添加し、５℃に冷却後遠心分離（７
０００Ｇ，５分）して残渣を採取し、さらに乾燥して硫
酸プロタミン３６ｇを得た。この硫酸プロタミンの純度
は９４％であった。（ii）塩酸プロタミン精製したプロタミン抽出液１ｌにエタノール５ｌを添加
し、５℃に冷却後遠心分離（７０００Ｇ，５分）して残
渣を採取し、さらに乾燥して塩酸プロタミン３５ｇを得
た。この塩酸プロタミンの純度は９３％であった。（iii)遊離プロタミン精製したプロタミン抽出液１ｌをｐＨ１３に調整し、電
気透析（旭硝子社製Ｄｕ−ｏｂ型、３０Ｖ，５ｈｒ）に
よりほぼ電流が流れなくなるまで脱塩透析し、さらに濃
縮、乾燥して遊離プロタミン２７．５ｇを得た。この遊
離プロタミンの純度は９５％であった。実施例６凍結保存していたサケの白子（プロタミン含有量４％）
１Ｋｇを使用し、０．２Ｎの塩酸を１．５ｌ使用した以
外は実施例５と同様にして、硫酸プロタミン、塩酸プロ
タミンおよび遊離プロタミンを製造した。

【００３２】その結果、硫酸プロタミン１８ｇ、塩酸プ
ロタミン１８ｇおよび遊離プロタミン１５ｇを得た。実施例７凍結保存していたニシンの白子（プロタミン含有量４
％）１Ｋｇを実施例５と同様に処理してプロタミン抽出
液の精製液１．７ｌを得た。

【００３３】次にこの精製液を陰イオン交換樹脂（住友
化学社製Duolite Ａ−１６２）で処理し、エタノール５
ｌを添加し、５℃に冷却後遠心分離（７０００Ｇ，５
分）して残渣を採取した。この残渣を温水１００ｍｌで
再溶解し、エタノール１ｌを添加して沈澱物を得た。こ
れを乾燥して遊離プロタミン２０ｇを得た。この遊離プ
ロタミンの純度は９８％であり、極めて高純度であっ
た。

【００３４】

【発明の効果】この発明の方法により、魚類の白子から
プロタミンを簡便にかつ選択的に抽出し、またプロタミ
ン抽出液を高純度に精製することが可能となる。不純物
をほとんど含有せず極めて高純度で医薬品にも有用な高
品質のプロタミンを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】プロタミン含有量８％の白子からのプロタミン
の回収率を示した、塩酸濃度と回収率との相関図であ
る。

【図２】プロタミン含有量５％の白子からのプロタミン
の回収率を示した、塩酸濃度と回収率との相関図であ
る。

【図３】プロタミン含有量２．５％の白子からのプロタ
ミンの回収率を示した、塩酸濃度と回収率との相関図で
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】魚類の白子からプロタミンを抽出するに
際し、あらかじめ白子を希鉱酸で洗浄処理することを特
徴とするプロタミンの製造方法。
【請求項２】希鉱酸として、０．０５〜０．２Ｎのも
のを使用する請求項１のプロタミンの製造方法。
【請求項３】希鉱酸を、魚類の白子の１〜３倍容量使
用する請求項１または２のプロタミンの製造方法。