JPH0786119B2 - プロタミンの製造方法 - Google Patents

プロタミンの製造方法

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JPH0786119B2
JPH0786119B2 JP8657489A JP8657489A JPH0786119B2 JP H0786119 B2 JPH0786119 B2 JP H0786119B2 JP 8657489 A JP8657489 A JP 8657489A JP 8657489 A JP8657489 A JP 8657489A JP H0786119 B2 JPH0786119 B2 JP H0786119B2
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protamine
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昭博 三ケ尻
修次 神野
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日本水産株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) この発明は、プロタミンの製造方法に関するものであ
る。さらに詳しくは、この発明は、魚類の白子から、容
易、かつ、高純度にプロタミンを抽出、精製することの
できるプロタミンの製造方法に関するものである。

(従来の技術とその課題) プロタミンは、ニシンやサケ等の魚類やニワトリなどの
脊椎動物の成熟精子核中に存在している分子量4000〜85
00の塩基性蛋白質であり、近年、医薬品、あるいは食
品、化粧料、清掃用品等の抗菌剤として注目されてい
る。

このプロタミンの工業的製造方法としては、一般に、魚
類の精巣(白子)を磨砕し、その磨砕物から鉱酸でプロ
タミンを抽出する方法が知られているが、通常この白子
に付着している血液や粘液、あるいは白子に含まれてい
る各種蛋白質が夾雑物として共に抽出されるため、従来
より、夾雑物を含有しない高純度のプロタミンを得るた
めの抽出方法あるいは鉱酸抽出液の精製方法が種々提案
されている。

前者の抽出方法としては、たとえば、白子を磨砕するこ
となくそのままの形状で直接鉱酸により抽出する方法が
提案されており、また、鉱酸抽出液の精製方法として
は、アルカリ剤の添加による塩析法、縮合リン酸塩の添
加による沈澱法、エタノール等の有機溶媒による沈澱
法、酵素を作用させる方法、プロタミンを遊離化した後
イオン交換や電気透析する方法等が提案されている。

しかしながら、これらの方法によってもプロタミンを効
率よく抽出、精製することは困難であり、高純度のプロ
タミンを製造するためには相当の手間とコストをかけな
ければならなかった。たとえば、白子を磨砕することな
くプロタミンを抽出する場合でもヒストン等の塩基性不
純物蛋白質が同時に抽出され、それらがその後の精製行
程を妨害するので、高純度のプロタミンを得ることが困
難になっていた。

このため、プロタミンを簡便な方法で高純度に取得する
ことのできる、新しいプロタミンの製造方法の開発が望
まれていた。

この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもので
あり、従来法の欠点を改善し、魚類の白子からプロタミ
ンを簡便にかつ選択的に抽出することができ、ヒストン
等の不純物蛋白質や血液、粘液成分等の夾雑物が混入す
ることがなく、プロタミンの鉱酸抽出液を高純度に精製
することもできる、新しい高品質プロタミンの製造方法
を提供することを目的としている。

(課題を解決するための手段) この発明は、上記の課題を解決するものとして、魚類の
白子から鉱酸によりプロタミンを抽出し、その鉱酸抽出
液に酸可溶性カチオン系高分子凝集剤を添加して夾雑物
を除去し精製することを特徴とするプロタミンの製造方
法を提供する。

さらに、この発明は、魚類の白子からプロタミンを抽出
する上記の通りのプロタミンの製造方法において、さら
に電気透析して脱塩処理することや、あらかじめ希鉱酸
によって洗浄処理を施した白子を用いること等をもその
態様として提供するものである。

この発明の製造方法は以上の通り、魚類の白子からプロ
タミンを抽出するものであるが、使用する鉱物の規定度
や量および抽出時間は、プロタミンの抽出効率を高めら
れるように適宜設定することができる。抽出条件は白子
の種類にもよるが、たとえばサケやニシン等の白子に対
して1Nの鉱酸を2倍容量使用し、抽出時間を1時間とす
る。

また、抽出時間を設定するに際しては、抽出時間を必要
以上に長くしないようにし、通常数時間以内とする。0.
2N〜0.5N程度の希鉱酸を使用して抽出する場合でも抽出
に長時間をかけすぎるとかえって抽出量が半減する。

抽出したプロタミンの抽出液は、必要によりさらに電気
透析等の常法により脱塩濃縮と乾燥で遊離型とすること
ができる。また従来の塩形成方法により、塩酸塩、硫酸
塩、硝酸塩等の所望の塩形態とすることができる。

そして、この発明方法では、上記の抽出により得られた
鉱酸抽出液を酸可溶性カチオン系高分子凝集剤を添加し
て夾雑物を分離除去することを特徴としている。

この場合、酸可溶性カチオン系高分子凝集剤としては、
酸溶液に溶解してポリ陽イオンとなるものを広く使用で
きる。たとえばキトサン、ポリアミノアルキルメタクリ
レート、ポリエチレンイミン、ハロゲン化ポリジアリル
アンモニウム、アイネオン系凝集剤等を使用することが
できる。特に、キトサンは好適に使用することができ
る。

これらの高分子凝集剤は常法の凝集分離法によって使用
することができる。たとえば、キトサンを用いる場合に
は、任意の鉱酸によるプロタミンの抽出液にキトサンを
添加して攪拌混合し、pHを8〜10程度に調整し、キトサ
ンと共に夾雑物を沈澱させ、その沈殿物を遠心分離等に
よって分離除去する。

また、この発明では、上記の鉱酸による抽出に先立っ
て、あらかじめ白子を希鉱酸によって洗浄することも有
効である。

この洗浄処理はプロタミンをさらに選択的に抽出するこ
とを可能とするものであり、希鉱酸を洗液として予め魚
類の白子を洗浄処理し、その後に上記の鉱酸による抽出
と酸可溶性カチオン系高分子凝集剤の添加の方法で高純
度のプロタミンを得ることを可能とする。

この洗浄処理では、ヒストン等の不純物蛋白質、血液、
粘液成分などの夾雑物だけを選択的に希鉱酸中に抽出
し、白子から夾雑物を十分に洗い出す。洗浄処理を施す
白子としては、そこに付着あるいは含有されている夾雑
物が十分に洗浄除去されるように、磨砕したものとする
のが好ましい。なお、白子の種類としては特に制限はな
く、サケ、ニシン、ニジマス、マグロなど従来よりプロ
タミンの製造原料として使用されている白子を広く使用
することができる。

また、洗液とする希鉱酸としては、白子の種類にもよる
が、0.05〜0.2N程度の希鉱酸を使用するのが好ましい。
もちろんこの濃度は限定的ではないが、0.05N未満の希
鉱酸では夾雑物が抽出され難くなるので十分な洗浄がで
きなくなり、一方0.2Nを超える希鉱酸を使用すると夾雑
物の他にプロタミンも抽出されてプロタミンの損失をき
たし生産性が低下するので好ましくない。

希鉱酸の使用量は、白子の種類や量に応じて酸の総量
(酸の規定度N×酸の使用量l)が十分なものとなるよ
うに定めることが好ましく、一般には白子に対して1〜
3倍容量程度とするのが好適である。

また、洗浄処理はこのような希鉱酸を白子と混合攪拌
し、洗液を分離除去するだけで容易に行うことができる
が、この場合の混合攪拌時間(洗浄時間)は、白子の種
類、希鉱酸の規定度、使用量等に応じて高い洗浄効率を
実現できるように適宜定める。通常は数時間以内で十分
な洗浄処理を達成することができる。

なお、洗浄処理の条件は白子の種類、希鉱酸の規定度お
よび使用量、洗浄時間等の相互の関係が全体として好適
なものとなるように設定することが好ましい。このよう
な条件としては、サケやニシン等の魚類の白子の磨砕物
に対して0.2Nの塩酸を1倍容量使用し、洗浄時間を1時
間とすることを例示することができる。

なお、夾雑物を抽出した洗液を洗浄後に白子から分離除
去する方法は、遠心分離や濾過等の常法によることがで
きる。

このように白子に洗浄処理を施した後は、その洗浄処理
物(すなわち洗浄処理した白子)から抽出によりプロタ
ミンを製造する。これによりヒストン等の不純物物質、
血液、粘液成分等の夾雑物の含有量が著しく低減した高
純度のプロタミンの抽出液を得ることが可能となる。

もちろん、この発明の鉱酸抽出による精製方法は、上記
の洗浄処理をした白子から抽出したプロタミンの鉱酸抽
出液に適用できる他、当然にも洗浄処理をしないプロタ
ミンの鉱酸抽出液にも適用でき、いずれの鉱酸抽出液か
らもプロタミンを高純度に得ることを可能とする。

以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明について説
明する。

実施例1 サケの白子(プロタミン含有量7%)1kgに、1Nの塩酸2
lを加えて攪拌し、遠心分離して上澄を採取することに
よりプロタミンの抽出液を得た。

このプロタミン抽出液にキトサン2.5gを添加し、pH9に
調整して凝集沈澱させ、遠心分離して上澄を採取し、さ
らに中和してプロタミン抽出液の精製物を得た。

この精製したプロタミン抽出液の成分を分析したとこ
ろ、固形分7.12%。プロタミン含有量2.75%、NaCl含有
量4.10%であり、プロタミンの純度は91%であった。

実施例2 サケの白子(プロタミン含有量7%)1kgを0.2Nの塩酸
1により洗浄し、次いで1Nの塩酸2lによりプロタミン
を抽出し、遠心分離して上澄を採取した。この上澄に、
キトサン2.5kgを添加しpHを調整してプロタミン抽出液
を精製した。

この精製したプロタミン抽出液の成分を分析したとこ
ろ、固形分6.90%、プロタミン含有量2.68%、NaCl含有
量4.05%であり、プロタミンの純度は94%であった。こ
のプロタミン純度は良好な品質であった。

比較例 実施例1および2のサケの白子1kgを磨砕し、1Nの塩酸2
lを加えて攪拌し、遠心分離して上澄を採取し、中和し
てプロタミン抽出液を得た。

このプロタミン抽出液の成分を分析したところ、固形分
8.77%、プロタミン含有量2.65%、NaCl含有量3.78%で
あり、プロタミンの純度は53.1%にすぎなかった。

プロタミン純度は前述の実施例1および2に比べて著し
く劣っていた。

実施例3 凍結保存していたサケの白子(プロタミン含有量7%)
1kgを解答し、磨砕後、皮を除去した。これに0.2Nの塩
酸1を加えて1時間攪拌して洗浄し、遠心分離(7000
G,5分)により洗液を除去した。

次に残渣に対して1Nの塩酸を2lを加えて1時間攪拌し、
遠心分離して上澄を採取し、プロタミン抽出液を得た。

このプロタミン抽出液1.5lに0.2Nの塩酸に溶解した1%
キトサン(共和油脂工業社製フローナック)150mlを添
加し、pHを8〜10に調整して凝集沈澱させ、遠心分離し
て上澄を採取し、プロタミン抽出液の精製液1.7lを得
た。

次にこの精製液を使用して、以下のように(i)硫酸プ
ロタミン、(ii)塩酸プロタミン、(iii)遊離プロタ
ミンを調製し、それらの純度を測定した。

(i) 硫酸プロタミン 精製したプロタミン抽出液1に10%硫酸100mlとエタ
ノール5lを添加し、5度に冷却後遠心分離(7000G,5
分)して残渣を採取し、さらに乾燥して硫酸プロタミン
36gを得た。この硫酸プロタミンの純度は94%であっ
た。

(ii) 塩酸プロタミン 精製したプロタミン抽出液1にエタノール5lを添加
し、5℃の冷却後遠心分離(7000G,5分)して残渣を採
取し、さらに乾燥して塩酸プロタミン35gを得た。この
塩酸プロタミンの純度は93%であった。

(iii) 遊離プロタミン 精製したプロタミン抽出液1をpH13に調製し、電気透
析(旭ガラス社製Du-od型、30V,5hr)によりほぼ電流が
流れなくなるまで脱塩透析し、さらに濃縮、乾燥して遊
離プロタミン27.5gを得た。この遊離プロタミンの純度
は95%であった。

実施例4 凍結保存していたサケの白子(プロタミン頑油量4%)
1kgを使用し、0.2Nの塩酸を1.5l使用した以外は実施例
3と同様にして、硫酸プロタミン、塩酸プロタミンおよ
び遊離プロタミンを製造した。

その結果、硫酸プロタミン18g、塩酸プロタミン18gおよ
び遊離プロタミン15gを得た。

実施例5 凍結保存していたニシンの白子(プロタミン含有量4
%)1kgを実施例3と同様に処理してプロタミン抽出液
の精製液1.7lを得た。

次にこの精製液を陰イオン交換樹脂(住友化学社製Duol
ite A−162)で処理し、エタノール5lを添加し、5度に
冷却後遠心分離(7000G,5分)して残渣を採取した。こ
の残渣を温水100mlで再溶解し、エタノール1を添加
して沈殿物を得た。これを乾燥して遊離プロタミン20g
を得た。この遊離プロタミンの純度は98%であり、極め
て高純度であった。

実施例6 白子の好適な抽出条件と洗浄条件とを検討するために、
次のように、白子の種類、抽出溶媒としての塩酸の規定
度および使用量、抽出時間を変えて抽出処理を行い、塩
酸抽出液中に抽出されるプロタミンの回収率をHPLCで測
定し、また不純物蛋白質成分を電気泳動法により検出し
た。なおHPLCのスタンダードとしてはシグマ社製、ナカ
ライテスク製、和光純薬製のSalmine sulfate,Salminec
hloride,Salmine free base及びClupeine sulfateを用
いた。

(i) 白子……プロタミン含有量8%、5%、2.5%
の3種類 (ii) 塩酸の規定度……0.2N、0.5N、1N、2N (iii) 塩酸の使用量(白子に対する容量比)……1
倍、2倍、5倍 (iv) 抽出時間……1時間、2時間、20時間 HPLCの測定結果をプロタミン含有量8%、5%および2.
5%の各々の白子について示したものが第1図、第2図
および第3図である。

この結果、塩酸中に抽出されるプロタミンの回収率は白
子の種類に応じて異なるものの塩酸の規定度、使用量お
よび抽出時間に対してほぼ同様の挙動を示していた。す
なわち、いずれの白子においても、1Nと2Nの塩酸による
場合にはプロタミンの回収率はほぼ等しく、0.2Nの場合
には著しく低下しており、特に0.2Nの塩酸を1倍容量使
用したものについては抽出液には全くプロタミンが検出
されなかった。

これにより白子の抽出処理には0.2Nより高い規定度の鉱
酸が好適であり、また洗浄処理には0.2N以下の希鉱酸が
好適であることがわかった。

また、0.5N以下の場合にはプロタミンの回収率が塩酸の
使用量に大きく依存するが、1N以上の場合には依存性は
小さくなるので、安定的な回収率を確保するための抽出
処理としては1N程度以上の鉱酸を使用するのが好ましい
ことがわかった。

抽出時間に関しては、第2図から明らかなように、数時
間程度ではプロタミンの回収率に大きな差異はないが、
20時間程度の長時間の処理を行うと、プロタミンが加水
分解するためか、回収率が著しく低下し、処理条件とし
ては好ましくないこともわかった。

(発明の効果) この発明の方法により、魚類の白子からプロタミンを簡
便にかつ選択的に抽出し、またプロタミン抽出液を高純
度に精製することが可能となる。不純物をほとんど含有
せず極めて高純度で医薬的にも有用な高品質のプロタミ
ンを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第1図、第2図および第3図は、各々、プロタミン含有
量8%、5%、および2.5%の白子からのプロタミンの
回収率を示した、塩酸濃度と回収率との相関図である。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】魚類の白子から鉱酸によりプロタミンを抽
    出した後に、その鉱酸抽出液に酸可溶性カチオン系高分
    子凝集剤を加え、夾雑物を除去して精製することを特徴
    とするプロタミンの製造方法。
  2. 【請求項2】魚類の白子から鉱酸によりプロタミンを抽
    出した後に、鉱酸抽出液に酸可溶性カチオン系高分子凝
    集剤を加え夾雑物を除去し、その後電気透析して脱塩処
    理することを特徴とするプロタミンの製造方法。
  3. 【請求項3】希鉱酸で洗浄処理した魚類の白子から鉱酸
    によりプロタミンを抽出する請求項1または2のプロタ
    ミンの製造方法。
  4. 【請求項4】酸可溶性カチオン系高分子凝集剤としてキ
    トサンを使用する請求項1ないし3のいずれかのプロタ
    ミンの製造方法。
  5. 【請求項5】魚類の白子に対して1Nの鉱酸を2倍容量使
    用し、抽出時間を1時間としてプロタミンを抽出する請
    求項1ないし4のいずれかのプロタミンの製造方法。
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