CN107641144A

CN107641144A - 一种小分子多肽及其制备方法

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Publication number: CN107641144A
Application number: CN201710864671.6A
Authority: CN
Inventors: 陆家海
Original assignee: Guangzhou Marine Peptide Gene Polytron Technologies Inc
Current assignee: Guangzhou Marine Peptide Gene Polytron Technologies Inc
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2018-01-30

Abstract

本发明公开了一种小分子活性多肽及其制备方法，所述小分子活性多肽来源于鱼卵，分子量为小于10,000道尔顿。所述小分子活性多肽采用机械破碎、物理冻融方法并结合切向流过滤系统制备而成，此方法能够快速地从营养丰富的鱼卵细胞中获取优质的天然的具有各种活性的小分子多肽，且操作简单易行，避免了对大型仪器的依赖。本发明的小分子活性多肽通过体外抗氧化活性检测，其抗氧化能力很强，将低浓度的小分子活性多肽用于培养大鼠骨髓间充质干细胞时，细胞的增殖速率明显提高。本发明的小分子活性多肽可应用于化妆品、保健品、抗癌辅助用品等领域。

Description

一种小分子多肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及天然产物提取技术领域，具体涉及一种小分子多肽及其制备方法。

背景技术

在人体生命活动代谢过程中会不断产生各种氧自由基，最具有代表性的就是羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)和脂自由基(ROO·)。人体老化或皮肤衰老会产生过多的自由基，导致体内自由基清除系统生成减少、自由基清除不力，从而引起各种疾病、皮肤老化、脂褐素生成增多以及老年斑的形成。

近年来，活性小分子多肽倍受关注，它们与生物体内其它物质相比，最大的特点便是具有很高的抗氧化生物活性，在生物体的生长发育和新陈代谢中起着至关重要的作用。目前市场上流通的多是具有抗氧化、免疫调节、抗菌、营养补充等功效的活性小分子多肽，其被广泛地应用于化妆品、保健品、抗癌辅助用品等的生产。例如，具有抗氧化、抗老化作用、参与胶原蛋白合成的活性肽如胜肽、六肽-11、棕榈酰三肽-1、棕榈酰寡肽、肉豆蔻酰五肽-4、己酰四胜肽-3、乙酰基四肽-9；具有抗皱功能的神经递质类成分如神经肽、六胜肽。这些多肽的来源有人工合成、植物蛋白水解和动物蛋白水解等多种途径。人工合成途径虽然具有效率高、功效明显等优势，但因其有潜在的毒性，所以在人体使用方面受限。植物蛋白是蛋白水解活性多肽的主要来源，常见的有水稻胚乳蛋白、花生蛋白、藻类蛋白质、玉米蛋白、大豆蛋白等，这些蛋白通过胰酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶等蛋白酶水解获得活性小分子多肽(Antioxidative peptides from foodproteins:A review.Peptides. 2010,31:1949–1956)。植物蛋白来源充足，其蛋白酶水解产物的相关产品在市场上已占有一定的份额，但作为蛋白来源的原料花生、豆类等多为过敏原，其水解产物不能排除引起过敏的可能性。因而，安全性较高的动物蛋白如鱼子作为功能性多肽来源的前景越来越受到青睐。

活性小分子多肽的分离纯化通常采用超滤、柱层析、高效液相等方式，但上述方法对仪器要求较高，分离纯化步骤复杂，费时费力。切向流技术属于膜分离技术，耗能小、设备体积小、实施操作方便，获得的多肽组分质量稳定，适用于海洋水产品抗氧化肽的分离纯化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种小分子多肽及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种小分子多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取鱼卵；

(2)破碎鱼卵细胞，过滤离心，收集上清；

(3)采用切向流超滤系统进行超滤后，过滤除菌，制备得到小分子多肽的混合物。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中的鱼卵是从深海鱼或淡水鱼中获得。

作为本发明的优选实施方式，所述深海鱼包括三文鱼或鲟鱼；所述淡水鱼包括鲤鱼。

动物的卵细胞含有丰富的有价值的营养成份，富含抗氧化活性多肽的主要氨基酸如色氨酸、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、蛋氨酸(Wang WY,De Mejia EG. 2005)。此外，还富含具有功能辅助作用的成分如维生素(维生素A、维生素B、维生素C、维生素B1、维生素B6、维生素PP、维生素E)，以及钙、铜、镁、铁和锌等矿物元素。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中破碎鱼卵细胞的方法为：机械破碎后进行反复冻融。将细胞放在低温下冷冻(约-20℃)，然后在室温中融化，重复2-3次而达到深度破碎作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中切向流超滤系统的截留分子量为10,000道尔顿。

超滤膜筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。本发明收集的是透过液，得到分子量小于10,000道尔顿的小分子多肽混合物。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中采用0.22μm微孔滤膜对滤液进行过滤除菌。

本发明还提供了一种采用所述小分子多肽的制备方法得到的小分子多肽。

优选地，所述小分子多肽是分子量小于10,000道尔顿的小分子多肽混合物。

本发明还提供了一种所述小分子多肽在制备抗氧化剂方面的应用。

本发明还提供了一种所述小分子多肽在制备化妆品、保健品、抗癌辅助用品方面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明此方法能够快速地从营养丰富的鱼卵细胞中获取优质的天然的具有各种活性的小分子多肽，且操作简单易行，避免了对大型仪器的依赖。通过对其进行活性检测，发现本发明的活性的小分子多肽具有较好的抗氧化效果。此外，采用本发明的活性小分子多肽的制备方法，能够最大程度地保留了鱼卵中的其他重要成分，如辅酶和矿物元素。它们的存在使获得的小分子多肽溶液不需要额外地添加其他物质即可实现多肽功能的最大化。

附图说明

图1为不同浓度小分子多肽对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 小分子多肽的制备方法

1、获取鱼卵；

将新鲜的三文鱼解剖后，取出鱼卵，在室温下用自来水清洗干净后用蒸馏水润洗3遍，获取新鲜鱼卵，-20℃保存。

2、破碎鱼卵细胞，过滤离心，收集上清；

将步骤1中的鱼卵室温解冻后，放置在冰浴中用高速匀质机进行均质处理，加适量注射用水于鱼卵匀浆中，混匀，置-20℃，反复冻融2～3次。匀浆用8 层纱布进行粗过滤，然后再用连续流离心机离心处理(离心温度4℃)，收集上清液。

3、采用切向流超滤系统进行超滤后，过滤除菌，制备得到小分子多肽的混合物。

(1)将步骤2中制备得到的鱼卵细胞裂解上清液用截留分子量10,000道尔顿的切向流超滤系统进行分子截留，获取小于10,000道尔顿的小分子多肽过滤液；

(2)0.22μm微孔滤膜对滤液进行过滤除菌；

(3)BCA试剂盒测定蛋白浓度，最后用注射用水调整浓度为1mg/mL；

实施例2 细胞毒性实验

本实施例为通过干细胞增殖实验检测本发明小分子多肽细胞毒性的一种实施例，测定方法为：

(1)采用大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)，10％胎牛血清的DMEM于 37℃，5％CO2培养箱中培养。

(2)将培养到第三代的BM-MSCs细胞用胰酶消化成单细胞悬液,以2×10⁴/ mL的细胞密度,每孔200μL接种到96孔板中。待细胞融合至约80％时，更换培养基。

(3)设置9个实验组和一个对照组，实验组分别加入含有25μg/mL、50μg /mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、 300μg/mL鱼子多肽的DMEM完全培养基100μL,每个浓度组设置6个复孔。对照组为不含小分子多肽的DMEM完全培养基。

(4)孵育24h后弃培养液，用MTT染料还原反应测定存活细胞的数目，用酶标仪检测各组吸光度(使用波长570nm)，实验重复3次。

结果如图1所示，发现将本发明的小分子多肽添加进BM-MSCs细胞中，在 300μg/mL浓度以内均未显示对细胞增殖的阻碍作用。相反，低浓度的小分子多肽对细胞的增殖有促进作用。

实施例3 抗氧化活性检测-测定对羟自由基(·OH)清除能力

本实施例为通过羟自由基(·OH)清除能力实验检测本发明小分子多肽抗氧化活性的一种实施例。

体外抗氧化活性的评价方法主要包括测定其清除自由基(羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基)的能力、清除过氧化氢的能力、对脂质氧化的抑制率、还原能力(包斌，德力格尔桑，许勤。抗氧化肽的研究进展[J]。内蒙古农业大学学报。2004，25(1)：121-124)等。羟自由基(·OH)等活性氧中间体是典型的氧自由基。当人体老化或皮肤衰老产生过多自由基，或衰老导致体内自由基清除系统生成减少、自由基清除不力都可导致自由基增多，从而引起各种疾病、皮肤老化、脂褐素生成增多以及老年斑的形成。由于羟自由基是人体内最活泼的自由基，其毒性最大，反应速度极快，可以破坏生物体内的脱氧核糖核酸和蛋白质，因此羟自由基清除率是评价多肽抗氧化的一个很重要的指标；生物体内的脂质容易发生自氧化并产生毒性，导致生物体产生癌症以及衰老，因此，脂类也常作为被氧化的底物以检测多肽的抗氧化能力。

对羟自由基(·OH)清除能力的测定方法为：

(1)实验组以及对照组样品制备；

设置3个实验组，两个对照组。实验组样本配置：准备1mg/mL、0.25mg/mL，及0.063mg/mL本发明小分子多肽原液，冷藏放置；阳性对照样本配置：配制 1mg/mL、0.1mg/mL的谷胱甘肽(GSH)溶液作为阳性对照；阴性对照样本的配制：用溶剂替代样本作为空白对照；

(2)吸取1.0mL样品于10mL离心管中，分别加入8.0mM FeSO₄溶液0.3 mL，3.0mM水杨酸溶液1.0mL以及20mM H₂O₂溶液0.25mL，37℃水浴30min；

(3)取出用流水冷却至室温后，加入0.45mL蒸馏水，使最终体积为3.0 mL，3000r/min离心10min；

(4)取上清液于510nm波长处测吸光度，比较各样品对·OH的清除效果。

OH清除率/％＝[A₀-(A₁-A₂)]/A₀×100

式中，A₀为蒸馏水+FeSO₄+H₂O₂+水杨酸的吸光度；A₁为样品+FeSO₄+H₂O₂+ 水杨酸的吸光度；A₂为样品+FeSO₄+H₂O₂+水的吸光度。

结果如表1所示，可知，小分子多肽具有一定的羟自由基清除能力，其中以0.25mg/mL浓度清除能力最强达80％以上，与1mg/mL GSH相当，说明本发明的小分子多肽具有加强的抗氧化活性。

表1：羟自由基(·OH)清除能力

注：空白对照A0值为0.131.清除率越高抗氧化效果越好。

实施例4 抗氧化活性检测-测定对抗脂质过氧化作用的能力

本实施例为通过对抗脂质过氧化作用的能力实验检测本发明小分子多肽抗氧化活性的一种实施例。

此方法以卵黄脂蛋白为底物建立过氧化脂质模型反应体系。

(1)用PBS溶液(pH 7.45，0.1M)按体积比为l：25配置卵黄悬液，卵黄悬液使用之前要持续搅拌十分钟以保持其均一性。

(2)取卵黄悬液0.2mL、样品溶液0.1mL、25mM FeS04·7H20溶液0.2mL，并用PBS溶液补足到2.0mL，放置在水浴锅中恒温37℃培养1h。

(3)将试管取出后，向样品管中加入三氯乙酸溶液(0.5mL、20％)，静置 l0min，以3500rpm/min离心10min，取2.0mL上清液，在上清液中分别加入硫代巴比妥酸溶液(1.0mL，质量分数0.8％)，盖紧后在100℃下保持水浴15 min，取出后冷却。

(4)在波长532nm条件下测定吸光度，以PBS溶液做为空白参比，计算样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率：SA(％)＝(Ac-As)/Ac×100式中，Ac为不加样品的吸光度；As为加入样品的吸光度。

结果如表2所示，小分子多肽具有一定的抗脂质过氧化作用的能力，该能力在不同浓度的小分子多肽之间没有明显的差异。与阳性对照GSH的比较结果来看，两者不存在明显差异。说明本发明的小分子多肽具有较强的抗脂质过氧化活性。

表2：抗脂质过氧化能力

注：抑制率越高抗氧化效果越好。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种小分子多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取鱼卵；

(2)破碎鱼卵细胞，过滤离心，收集上清；

2.如权利要求1所述小分子多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的鱼卵是从深海鱼或淡水鱼中获得。

3.如权利要求2所述小分子多肽的制备方法，其特征在于，所述深海鱼包括三文鱼或鲟鱼；所述淡水鱼包括鲤鱼。

4.如权利要求1所述小分子多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，破碎鱼卵细胞的方法为：机械破碎后进行反复冻融。

5.如权利要求1所述小分子多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，切向流超滤系统的截留分子量为10,000道尔顿。

6.如权利要求1所述小分子多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用0.22μm微孔滤膜对滤液进行过滤除菌。

7.一种采用如权利要求1至6任一项所述小分子多肽的制备方法得到的小分子多肽。

8.如权利要求7所述小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽是分子量为小于10,000道尔顿的小分子多肽混合物。

9.一种如权利要求7或8所述小分子多肽在制备抗氧化剂方面的应用。

10.一种如权利要求7或8所述小分子多肽在制备化妆品、保健品、抗癌辅助用品方面的应用。