ES2641069T3

ES2641069T3 - Procedimiento para producir un fitoextracto a partir de aguas de vegetación y orujos de aceite de oliva

Info

Publication number: ES2641069T3
Application number: ES12169465.7T
Authority: ES
Inventors: Stefano GERMANI; Massimo Vitagliano; Daniele Pizzichini; Massimo Pizzichini
Original assignee: PHENOFARM Srl
Current assignee: PHENOFARM Srl
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: ITMI20110941A1; US20120302515A1; EP2526785B1; EP2526785A1; US8815815B2; PT2526785T

Abstract

Procedimiento para la extracción y concentración de compuestos polifenólicos contenidos en aguas de vegetación y/u orujos obtenidos del procesamiento de aceitunas que comprende: 1) recogida del líquido que consiste en aguas de vegetación y/u orujos después del procedimiento de molienda de aceitunas; 2) pretratamiento químico, físico y enzimático; 3) filtración tangencial a una T en el intervalo de 45 a 50ºC, preferiblemente microfiltración cerámica (MF), obteniendo así una fracción de concentrado y una fracción de permeado; 4) evaporación a vacío de la fase de permeado obtenida en 3); en el que dicho pretratamiento 2) comprende: a) acidificación hasta un pH de entre 2,5 y 4; b) tratamiento enzimático mediante la adición de una reserva de enzimas celulolíticas y pectolíticas, caracterizado porque durante dicho tratamiento el líquido se mantiene con agitación hidráulica operando un procedimiento para la recirculación del mismo líquido de manera excéntrica con respecto a la pared del reactor, en el que dicha agitación se mantiene durante un tiempo de 2 a 6 h, preferiblemente durante aproximadamente 4 h a una T en el intervalo de 30 a 50ºC cuando se trabaja con aguas de vegetación, y dicha agitación hidráulica se mantiene durante 12-24 h a una T en el intervalo de 50 a 80ºC cuando se trabaja con orujos; c) eliminación del residuo sólido o semisólido, denominado tapón, que se recoge en la superficie al final de dicha etapa b) donde dicho residuo tiene una densidad comprendida entre 0,7 y 0,85 g/cm3, en el que dicha eliminación tiene lugar bombeando y enviando la masa líquida recogida en el fondo del tanque de pretratamiento a la sección de filtración posterior y dicho tapón constituye el 2-7% en peso con respecto a la masa total del agua de vegetación y contiene aproximadamente el 20% de los sólidos presentes en las aguas de vegetación iniciales.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Procedimiento para producir un fitoextracto a partir de aguas de vegetacion y orujos de aceite de oliva

Se describe el procedimiento para obtener un fitoextracto de aguas de vegetacion (VW) y orujos que proceden de la molienda de aceitunas. Dicho procedimiento se basa en la combinacion de metodos de pretratamiento fisicoquimicos y enzimaticos, filtracion tangencial en membrana y evaporacion a vacio. El metodo permite la extraccion ecosostenible y eficaz de los componentes activos implicados. El extracto final se caracteriza por la presencia de un alto recuento de polifenoles y se aplica en las industrias alimentaria, cosmetica y fitoterapeutica.

Estado de la tecnica

El cultivo de las aceitunas representa una industria de produccion crucial para toda la zona del mediterraneo y en Italia en particular. En Italia, los olivos se distribuyen sobre una superficie principalmente montanosa que representa en total aproximadamente una quinta parte de la superficie designada para los olivos en todo el mundo. Sin embargo, esta industria adolece del inconveniente de una generacion considerable de residuos que, en particular, comprenden tejidos vegetales (hojas y podas) y residuos reales de la produccion de aceite de oliva (VW, orujos humedos y usados). Estos ultimos se caracterizan por una fuerte carga de contaminantes, por lo que requieren procedimientos adecuados para poder desecharlos segun las leyes medioambientales en vigor (en lo que respecta a Italia, DL 574 con fecha de 11/11/96). A lo largo de los ultimos diez anos, la comunidad cientifica e industrial ha multiplicado los esfuerzos para proporcionar una solucion al problema en cuanto a la eliminacion de aguas residuales del aceite de oliva. Entre las soluciones propuestas, las mas interesantes tienen como objetivo valorar estas aguas residuales recuperando una recuperacion de sustancias de alto valor anadido, particularmente sustancias de polifenol a las que se han asociado numerosas propiedades biomedicas y funcionales. El uso de desechos y residuos que se derivan de la cadena de produccion del aceite de oliva puede permitir la generacion de recursos economicos partiendo de materiales de partida no convencionales (orujos humedos, VW, orujos usados sin semilla) derivados de la comercializacion de componentes activos en industrias de produccion tales como la industria alimentaria, cosmetica y fitoterapeutica.

Se sabe que los compuestos de origen vegetal pueden expresar diferentes propiedades biologicas (por ejemplo, propiedades antioxidantes, antirradicales, antimicrobianas) y, en muchos casos, la molecula individual es menos activa con respecto a la mezcla de los compuestos, sugiriendo, por tanto, una accion sinergica entre ellos. En realidad, a menudo sucede que los extractos de partida de origen vegetal revelan una bioactividad mayor con respecto a la observable cuando se usan los compuestos simples presentes en los mismos. Respecto a esto, la actividad antirradical de los extractos vegetales se mide por medio de una prueba in vitro que usa el radical estable DPPH (difenilpicrilhidrazilo) que simula la actividad de tales extractos frente a radicales oxigenados endogenos, tales como los radicales hidroxido y superoxido. El uso del radical DPPH permite estudiar la cinetica de reduccion de radicales y tambien calcular la CE50, es decir, la concentracion de extracto que reduce el 50% del radical. Se sabe que el hidroxitirosol y la oleuropeina aglicona son potentes agentes antioxidantes y cardioprotectores. La oleuropeina revela una actividad de dilatacion coronaria, hipoglucemica y anticolesterolemica y, de manera similar al hidroxitirosol, retrasa la oxidacion de las LDL (lipoproteinas de baja densidad). Se ha demostrado que el hidroxitirosol reduce la expresion genica de las lineas celulares de iNOS y COX-2, evitando por tanto la activacion de los factores de la transcripcion NF-KB, el factor clave en la aterosclerosis, STAT-1a e IRF-1. Tambien se observo una prevencion de la activacion de NF-KB en un estudio ex vivo de monocitos de voluntarios sanos expuestos al consumo de aceite de oliva, lo que sugiere un posible efecto antiinflamatorio por el aceite. Existen numerosos estudios respecto a las actividades biologicas de las moleculas con una estructura de fenilpropanoide, demostrando una actividad antioxidante, antiinflamatoria, antivirica y antifungica de las mismas. Dichos estudios se centran principalmente en evaluar los efectos del verbascosido o acteosido, uno de los fenilpropanoides mas estudiados hasta la fecha. El verbascosido tambien revelo actividad inmunomoduladora in vitro, en particular, aumenta la actividad quimiotactica de los neutrofilos. El mismo verbascosido revelo, en un cultivo de celulas neuronales PC12, tener una actividad de proteccion frente a la neurotoxicidad inducida por la 1 -metil-4-fenilpiridina (MPP+), un ion que, al activar caspasa-3, provoca estres oxidativo grave en las celulas. Tambien se indicaron actividades antineoplasicas tanto respecto al verbascosido como al isomero del mismo, el isoacteosido. Las pruebas in vivo en las celulas de leucemia murina P-388, revelaron que los dos fenilpropanoides mostraron una accion citotoxica de ED50 equivalente a 10 pg/ml para el isoacteosido y 26 pg/ml respecto al verbascosido. Una subclase de polifenoles adicional (mas especificamente, una subclase de flavonoides) de interes biologico particular, presente especificamente en las pulpas de aceitunas pigmentadas, es la clase de compuestos de antocianosido o antocianinas que consisten, en particular, en derivados de glucosido de cianidina, siendo el mas abundante de ellos cianidina-3-O-rutinosido. Los antocianosidos son pigmentos presentes especificamente en la piel de uvas y pequenas frutas, comercializados como extractos normalizados de residuos de orujo o bayas, y ampliamente estudiados en vista de su actividad biologica. El termino antocianidinas, referido a la clase de los compuestos no glucosilados correspondientes (siendo la cianidina uno de los principales representantes de los mismos), se ha creado para designar a las sustancias responsables del color de las flores, y es relevante para un grupo de pigmentos solubles en agua responsables de los colores rojo, rosa, violeta y azul de la mayor parte de las flores y frutas. Los farmacos que contienen antocianidinas se usaron en preparaciones galenicas para el tratamiento de la sintomatologia relacionada con la fragilidad capilar. Tales compuestos tambien muestran un alto poder antioxidante y pueden proteger a las celulas de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

danos oxidativos provocados por radicales libres.

Los documentos US2002198415 (A1), US2008090000 (A1), US2010216874 (A1) describen, partiendo de residuos de la industria de produccion de aceite de oliva, como obtener extractos a base de polifenoles, mediante tratamiento con acido de las VW y un almacenamiento prologando de los mismos de hasta 12 meses a un pH comprendido entre 1 y 6 con el objetivo de determinar la conversion de oleuropeina en hidroxitirosol. Tras dicha incubacion, se convirtio la oleuropeina inicial en un 75-90% en hidroxitirosol. El documento WO2007/013032 describe un procedimiento para recuperar un concentrado rico en hidroxitirosol de residuos de la industria de produccion de aceite de oliva, particularmente aguas de vegetacion y residuos de podas (hojas). Dicho procedimiento proporciona el uso, tras la extraccion usando un disolvente (agua o alcohol), de sistemas de extraccion con fluidos supercriticos, nanofiltracion o, alternativamente, osmosis inversa para recuperar hidroxitirosol y compuestos polares minoritarios. El producto asi obtenido es un extracto a base de hidroxitirosol. El compuesto WO2005/123603 describe un procedimiento de separacion basado en tecnologias de membrana especificamente dirigido a recuperar compuestos de interes de las VW. En tal procedimiento, a las diversas operaciones de separacion por filtracion en membrana tangencial, se les introdujo una filtracion inicial dirigida a maximizar el contenido en polifenol util comercial (tal como hidroxitirosol) en detrimento de la posible oleuropeina aun presente en las VW. El pretratamiento consiste en acidificar VW aun recientes hasta un pH de aproximadamente 3 - 4,5, seguido por una hidrolisis enzimatica. A la separacion del producto liquido asi tratado mediante centrifuga le siguen una serie de operaciones de filtracion tangencial en cascada, que comprenden una microfiltracion seguido por nanofiltracion y, por ultimo, por un procedimiento de osmosis inversa, que se obtiene de las diversas fracciones de polifenol retenidas con diferente grado de purificacion y del agua purificada del permeado de osmosis inversa que puede usarse para producir bebidas. El documento W02008/090460 describe un ejemplo adicional de un procedimiento para recuperar el componente hidroxitirosol de los residuos de la industria de produccion del aceite de oliva, en el que no hay residuos de molienda usados solos sino una cantidad dada de aceitunas verdes con el objeto de obtener un producto particularmente enriquecido en hidroxitirosol. El texto propone un primer tratamiento de hidrolisis acida a una temperatura mayor que la temperatura de reflujo para el material inicial (orujos y pulpas de aceitunas verdes), seguido por una clarificacion del producto resultante (por ejemplo mediante filtracion), a su vez seguido por un tratamiento en una resina de cromatografia de intercambio ionico. El producto adsorbido en tal columna, tras la elucion, puede proporcionarse a su vez a una segunda columna de cromatografia cargada con una resina adsorbente no ionica. El producto adsorbido en esta ultima resina, tras la elucion, se concentra adicionalmente en hidroxitirosol, si es necesario, mediante una filtracion tangencial en membrana, especificamente osmosis inversa, cuyo material retenido es el producto deseado. El documento W02009/016482 describe un procedimiento para el tratamiento de materia vegetal, incluyendo las VW de aceitunas. Los autores proponen un procedimiento que comprende acidificacion, dos etapas de lisis enzimatica, que proporciona un paso para la separacion de los solidos entre las dos etapas de lisis enzimatica, microfiltracion y evaporacion a vacio.

La descripcion anterior, revela que los estudios respecto a las actividades de fitocomplejos extraidos de los residuos del procesamiento de aceitunas se concentran en el hidroxitirosol mientras que los estudios recientes (Cardinali et al J Agric Food chem vol 58 n.° 15, 2010) muestran que la actividad de una fraccion con tamano molecular mayor de 5000 Da y sin moleculas de bajo peso molecular, tales como hidroxitirosol y tirosol, revela una mayor accion antioxidante.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento innovador para tratar residuos de molienda que puede obtener extractos ricos en componentes biologicamente activos de alto peso molecular, perdiendose estos componentes al aplicar los metodos de tratamiento de residuos de molienda conocidos en la bibliografia. En una realizacion adicional, el procedimiento de la presente invencion, aplicado a las VW y orujos que proceden de la molienda de aceitunas de las variedades Leccino y Carboncella, conduce a la obtencion de un producto cuya composicion y caracteristicas funcionales constituyen una parte integrante de la presente invencion.

Descripcion de la invencion

La invencion se describe mejor mediante el procedimiento segun la reivindicacion 1 y la reivindicacion de producto 12. La presente invencion tiene como objetivo definir el procedimiento para obtener un extracto rico en componentes biologicamente activos de alto peso molecular (PM > 500 Da), partiendo de las VW y orujos que proceden de la molienda de aceitunas. El metodo propuesto en el presente documento se basa en la combinacion de los metodos de pretratamiento fisicoquimicos y enzimaticos, de la tecnologia de filtracion tangencial en membrana (microfiltracion) y evaporacion a vacio. En particular, el presente procedimiento proporciona una etapa de agitacion hidraulica durante el procedimiento enzimatico que permite, operando usando aguas de vegetacion, la formacion de una capa superficial solida, denominada tapon, que se retira posteriormente de manera mecanica. En realidad, es la separacion de dicho tapon, cuya composicion se describe en el presente documento, la que permite obtener el producto final que tiene la composicion deseada. En una realizacion preferida, dicho procedimiento se aplica a las VW y orujos que proceden de la molienda de aceitunas de las variedades Leccino y Carboncella. El extracto asi obtenido se caracterizo a partir de un punto de vista funcional y de composicion y se reivindican las propiedades del mismo para aplicaciones especificas en la industria alimentaria, cosmetica, fitoterapeutica en el presente documento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Descripcion de las figuras

Figura 1: esquema del procedimiento de tratamiento para orujos y VW.

Figura 2: (a) curva de productividad para el procedimiento de microfiltracion llevado a cabo en VW. (b) Curva de productividad para el procedimiento de microfiltracion llevado a cabo en orujos.

Figura 3: Factor de estabilidad, expresado en %, del extracto denominado Phenolea Complex evaluado en aceite de oliva (a, b) y en manteca (c).

Figura 4: peso humedo del tapon medido al final de tres procedimientos de pretratamiento.

Figura 5: imagen de representacion y grosor del tapon obtenido en un procedimiento a escala de laboratorio que se opera usando un agitador mecanico (a) o usando un agitador hidraulico (b).

Figura 6: esquema del circuito de recirculacion accionado en el reactor.

Descripcion detallada de la invencion:

El procedimiento consiste en adoptar tecnologias complementarias (reactor enzimatica de recirculacion, filtracion tangencial, evaporacion a vacio) para la extraccion y la concentracion de polifenoles contenidos en las matrices de interes (VW y orujos). Dicho procedimiento comprende: 1) recoger aguas de vegetacion y orujos despues del procedimiento de molienda de aceitunas; 2) pretratamiento ffsico-qufmico-enzimatico; 3) filtracion tangencial, preferiblemente microfiltracion ceramica (MF); 4) evaporacion a vacio con reduccion del extracto liquido obtenido en la etapa 3) para dar una pasta semisolida. Se indica un esquema de dicho procedimiento en la figura 1.

Para los fines de la presente descripcion, la expresion agitacion hidraulica se usa para indicar la agitacion de la masa liquida obtenida operando un procedimiento para la recirculacion del mismo liquido de manera excentrica con respecto a las paredes del reactor. Se indica un esquema de dicha recirculacion en la figura 6. Una apertura dispuesta en la base inferior del reactor permite la salida del liquido del reactor introduciendolo en un conducto. Dicho conducto regresa al reactor a traves una apertura dispuesta en la base superior y desciende de nuevo a lo largo del reactor hasta la reintroduccion del liquido en el fondo de dicho reactor, en una posicion excentrica con respecto a las paredes del reactor. El liquido puede circular en dicho conducto debido a un sistema de bombeo adecuado, seleccionado preferiblemente de entre una bomba de centrifuga y una bomba peristaltica, indicado por una flecha en la figura 6. El producto que se obtiene mediante el procedimiento de la presente invencion es un extracto seco o suave que contienen todo el contenido polifenolico en las matrices iniciales, caracterizado por un contenido en polifenoles total comprendido entre 40 y 100 ppm. Dicho producto se destina a las industrias alimentaria, cosmetica y farmaceutica.

Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

1) recogida de las aguas de vegetacion y los orujos despues del procedimiento de molienda de aceitunas;

2) pretratamiento, que comprende las siguientes etapas:

a) acidificacion hasta un pH comprendido entre 2,5 y 4;

b) tratamiento enzimatico anadiendo una reserva de enzimas pectoliticas y celuloliticas y manteniendo con agitacion hidraulica;

c) eliminacion del residuo solido o semisolido que se recoge en la superficie al final de dicha etapa b);

3) filtracion tangencial, preferiblemente microfiltracion ceramica (MF) con subsiguiente obtencion de una fraccion de concentrado y una fraccion de permeado;

4) evaporacion a vacio de la fase de permeado obtenida en la etapa 3).

Dicho pretratamiento 1) se lleva a cabo tanto en las aguas de vegetacion como en los orujos con el objetivo de i) reducir y separar parte de la carga para dar suspensiones solidas presente en la matriz (fibras celulosicas, globulos de aceite, residuos de pulpa), mejorar la capacidad de filtracion del extracto de partida; ii) solubilizar los componentes polifenolicos y antocianicos que, al permanecer unidos a los residuos de la pared celular, son dificiles de recuperar. Tal como se sabe, los orujos y las aguas de vegetacion se caracterizan por un alto contenido en solidos que tienen un impacto negativo sobre el procedimiento de filtracion tangencial, reduciendo los valores de productividad observados en la etapa de MF en aproximadamente el 50%. Ademas, la matriz celulosica atrapa los polifenoles evitando el paso de los mismos a la disolucion y determinando la falta de expresion de la accion antioxidante de los mismos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las aguas de vegetacion y los orujos se tratan inmediatamente tras terminar la produccion de los mismos en el molino, en el plazo de 24 horas desde la produccion de los mismos, preferiblemente en el plazo de 12 horas, para reducir el fenomeno de oxidacion por los biofenoles. Las aguas de vegetacion y los orujos producidos se recogen por separado en los tanques de almacenamiento y se pretratan por separado usando la combinacion de enzimas pectoliticas y celuloliticas, enzimas de despolimerizacion que aumentan la liberacion de los compuestos de interes de la estructura compleja, tipica de las paredes celulares de las aceitunas, en las que se incluyen. Esta etapa proporciona un proceso de acidificacion para inhibir las actividades de la oxidorreductasa tal como polifenol oxidasa (PPO) y peroxidasa (POD), ambas facilitadas por la exposicion de la disolucion de aire. Al operar usando aguas de vegetacion, el procedimiento de pretratamiento permite reducir los solidos en suspension comprendidos entre el 40/60% y un aumento del contenido polifenolico total (expresado en equivalentes de acido galico, GAE) comprendido entre el 20/30%. Al operar usando orujos, el pretratamiento permite recuperar aproximadamente el 7080% de los polifenoles presentes en la matriz inicial. El panel derivado de los mismos (orujos usados) debido a la composicion de los mismos en una sustancia de nitrogeno puede constituir un agente de mejora del suelo organico valido para su uso en agricultura.

En particular, dicho procedimiento 2) para el pretratamiento de las aguas de vegetacion y los orujos comprende:

a) acidificacion hasta un pH comprendido entre 2,5 y 4;

b) tratamiento enzimatico anadiendo una reserva de enzimas pectoliticas y celuloliticas y mantenimiento en agitacion hidraulica (recirculacion);

c) eliminacion del residuo solido o semisolido, denominado tapon, que se recoge en la superficie al final de dicha etapa b), en donde dicho residuo tiene una densidad comprendida entre 0,7 y 0,85 g/cm3.

En dicha etapa a), la acidificacion se produce anadiendo un acido, seleccionado preferiblemente de entre acido citrico, acido sulfurico, acido clorhidrico o mezcla de los mismos. En dicha etapa b), dichas enzimas son de calidad alimentaria y se producen preferiblemente a partir de cepas seleccionadas de entre Aspergillus nigery Trichoderma longibrachiatum y se anaden en cantidades comprendidas entre el 0,02 y el 0,1% peso/peso. En el caso de operacion usando aguas de vegetacion, dicha agitacion hidraulica se mantiene durante un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 6 h, preferiblemente durante aproximadamente 4 h a una T comprendida entre 30-50°C; en el caso de operacion usando orujos, dicha agitacion hidraulica se mantiene durante aproximadamente 12-24 h a una T comprendida entre 50-80°C.

La agitacion hidraulica y las condiciones de temperatura usadas en el pretratamiento conducen a una inclusion progresiva de aire y particulas de aceite en la fase solida, determinando el flotamiento de dicha fase solida sobre la parte liquida, con una separacion espontanea de los solidos. La fase solida, el tapon, que se acumula en la parte superior de la masa de reaccion tambien recoge las inclusiones de aceite que permanecen en la masa de reaccion, conduciendo, por tanto, a una separacion en fases de agua/aceite que contribuye al flotamiento espontaneo observado. Dicho tapon esta constituido principalmente por sustancias coloidales, grasas, fibras vegetales, sales, azucares y trazas de polifenol (0,5 - 1 mg/g de polifenol total expresado en GAE) y constituye el 2-7% en peso con respecto a la masa total del agua de vegetacion. En esta fraccion se recoge parte de los solidos en suspension presentes en el agua de vegetacion, aproximadamente el 20% de los solidos presentes en las aguas de vegetacion iniciales. Dicho tapon tiene una estructura rica en inclusiones de aire que aumentan el grosor del mismo reduciendo la densidad aparente del mismo, que llega hasta estar comprendido entre aproximadamente 0,7 y aproximadamente 0,84 g/cm3. Segun avanza el procedimiento, la superficie tiende a enfriarse y se vuelve pesada, las inclusiones de aire se reducen y por tanto la masa de flotamiento se comprime y la densidad aparente se aproxima de nuevo a la de las aguas de vegetacion (1,00 g/cm3). Debido a este motivo, si el procedimiento de agitacion hidraulica se prolonga mas alla de 6 horas cuando se trabaja con VW o mas alla de 24 horas cuando se trabaja con orujos, la masa tiende a recompactarse depositandose en el fondo. Por tanto, es esencial para el presente procedimiento la retirada de dicho tapon de la superficie de la masa de reaccion durante la etapa de engrosamiento, preferiblemente despues de aproximadamente 4 h de agitacion hidraulica cuando se trabaja con VW y despues aproximadamente 24 h cuando se trabaja con orujos.

Dicha etapa c) se lleva a cabo bombeando y enviando a la seccion de filtracion posterior la masa liquida que se recoge en el fondo del tanque de pretratamiento.

En una realizacion adicional, despues de dicha etapa de evaporacion 4, llevada a cabo hasta obtener una humedad comprendida entre el 50 y el 80%, se lleva a cabo la siguiente etapa:

4’) atomizacion hasta obtener un producto final con una humedad comprendida entre el 3 y el 6%.

El producto que se deriva de la etapa de pretratamiento tanto para los orujos como para las aguas de vegetacion esta constituido por un liquido (extracto) caracterizado tal como se muestra en la tabla 1:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 1

Parametro: Valores medidos en la masa liquida tras la etapa de pretratamiento

pH: 3-5,0

Conductividad electrica (mS/cm): 10-20

Agua: 86-94%

Salinidad (g/l): 8-12

P2O5: 1-2,2

K2O: 5-8

FeO, MgO: Aproximadamente 0,6

Materia seca (105°C): 6-14%

Acidos organicos (g/l): 5-12

BOD5* (g/l de O2): 50-150

COD *(g/l de O2): 80-180

Grasas (g/l): 0,3-23

Azucares (g/l): 20-35

Polifenoles totales (g/l): 3-24

*BOD: demanda biologica de oxfgeno

*COD: demanda qufmica de oxfgeno

La masa liquida obtenida mediante el pretratamiento se somete, por tanto, a dicha etapa 3) de filtracion tangencial. La masa liquida que se deriva de la etapa de pretratamiento se somete a una etapa de filtracion perpendicular en una bolsa filtrante (punto de corte de 60 micrometros) y el extracto se envia a la seccion de microfiltracion. Dicha microfiltracion se lleva a cabo usando modulos de membrana de ceramica con un tamano molecular comprendido preferiblemente en el intervalo de entre 0,1-1,4 micrometros con una superficie de filtracion activa comprendida entre 0,20 y 1 m2 por modulo individual. Los modulos de ceramica pueden tener una estructura interna constituida por de 8 a 85 canales. El extracto se filtra a una T comprendida entre 15 y 60°C, preferiblemente entre aproximadamente 45 y aproximadamente 50°C a una presion comprendida entre 3 y 10 bares, preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6 bares y conduce a concentracion progresiva. Durante la prueba, el flujo del permeado con respecto al tiempo y la superficie de membrana esta comprendido entre 15 y 100 l/m2h, preferiblemente entre 19 y 90 l/m2h. La variabilidad de punto de corte y la configuracion del modulo permiten minimizar el impacto sobre el rendimiento de la filtracion que se deriva de las oscilaciones de composicion naturales de la matriz entrante (contenido en solidos y contenido en polifenoles, factores relacionados con la estacionabilidad de la matriz) y maximizan simultaneamente la productividad en cuanto a la cantidad de permeado a lo largo del tiempo. La temperatura de funcionamiento seleccionada permite una permeacion optima de la sustancia organica y conduce a un producto final enriquecido en cuanto a las sustancias polifenolicas. Dicha temperatura se mantiene bajo control mediante una unidad de refrigeracion. Al final de la microfiltracion, la fraccion de concentrado comprende todas las particulas corpusculares (fibras celulosicas, globulos de aceite, bacterias y celulas vegetales) mientras que el permeado esta constituido por una disolucion, de color rojo normalmente intenso debido a la presencia de pigmentos antocianicos que tienen un peso molecular comprendido entre 400 y 500 Da, y comprende toda la reserva de polifenoles y sustancias organicas e inorganicas disueltas (azucar, proteinas, sales). La fase de microfiltracion se lleva a cabo hasta la obtencion de un factor de concentracion comprendido entre 5 y 20, tras alcanzar la VCR preestablecida el procedimiento continua a traves de un procedimiento de diafiltracion (DF). La DF comprende i) anadir al volumen de concentrado obtenido volumenes equivalentes de agua osmotica; ii) nueva filtracion hasta la permeacion de todo el volumen de agua anadida. La DF permite aumentar el contenido molecular polifenolico en la fraccion de permeacion. El equivalente de volumen de agua anadido al concentrado obtenido en la VCR preestablecida se define como “diavolumen”. Por ultimo, el permeado se envia a la unidad de evaporacion a vacio.

Durante la filtracion, los modulos pueden experimentar obstruccion, por tanto, se lleva a cabo un procedimiento para controlar y contener este fenomeno, denominado impulso de retorno (“backpulsing"). Este procedimiento proporciona un regimen de flujo definido del permeado de contracorriente, con el objetivo de retirar el deposito que se forma progresivamente sobre la superficie de la membrana. El regimen de impulso de retorno permite mantener la productividad dentro de niveles aceptables y reducir los procedimientos de lavado y la concentracion de las disoluciones de detergente.

En la posterior etapa de evaporacion a vacio 4, el permeado se coloca en un concentrador/evaporador que funciona con los siguiente parametros: T comprendida entre 30 y 40°C, de manera preferible aproximadamente 35°C, velocidad de flujo del destilado: 5-50 l/h, presion de descarga del compresor comprendida entre 15 y 35 bares, de manera preferible aproximadamente 20,5-21,5 bares, presion de aspiracion del compresor comprendida entre 4 y 9 bares, de manera preferible aproximadamente 5,6-5,9 bares, vacio: 90-95 mbares, preferiblemente 92 mbares, VCR: 5-20. La evaporacion continua hasta obtener un producto final con una humedad comprendida entre el 10 y el 30%, preferiblemente entre aproximadamente el 20 y aproximadamente el 30%.

El producto final se obtiene sin requerir soportes tecnologicos tales como maltodextrinas, goma arabiga u otros

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

habitualmente usados en fitoextractos pero con el solo uso de medios mecanicos y a baja temperatura.

Alternativamente, la etapa 4 puede ir seguida por una etapa atomizacion para obtener un extracto seco que tiene un contenido de humedad comprendido entre el 3 y el 6%.

La aplicacion del presente procedimiento a aguas de vegetacion y orujos que proceden de la molienda de aceitunas de las variedades Leccino y Carboncella permite obtener un producto que tiene la pigmentacion caracteristica de las variedades Carboncella, debido a la presencia de antocianinas que caracterizan el producto. Dicho producto se denomina Phenolea Complex. Los compuestos identificados en el extracto de Phenolea Complex comprenden acidos fenolicos, fenilpropanoides tales como verbascosido y los derivados del mismo y compuestos de flavonoide, principalmente luteolina y glucosido de apigenina, pero tambien quercetina y crisoeriol asi como hidroxitirosol. El perfil nutricional tipico del extracto obtenido mediante el procedimiento reivindicado en el presente documento que opera en aguas de vegetacion y orujos que proceden de la molienda de aceitunas de las variedades Leccino y Carboncella se resume en la tabla 2 a continuacion:

Tabla 2:

proteinas: 2,00-3,00 g/100 g

grasas: 0,05-0,15 g/100 g

fibras alimentarias: 1,5-2,5 g/100 g

cenizas: 5,5-6,5 g/100 g

hidratos de carbono: 59,00-63,00 g/100 g

azucares: 11,00-13,00 g/100 g

sodio: 340-380 mg/kg

metales pesados:: <0,1 mg/kg

productos fitofarmaceuticos:: Ninguno

mohos: <10 UFC/1 g

levaduras: <10 UFC/1 g

La combinacion de dichas moleculas polifenolicas que se encuentra en el extracto que opera en aguas de vegetacion y orujos de las variedades Leccino y Carboncella mediante el metodo descrito en el presente documento confiere de manera sorprendente caracteristicas distintivas a dicho extracto. Dichas caracteristicas hacen que sea particularmente adecuado para aplicaciones en las industrias alimentaria, cosmetica y fitoterapeutica. Los extractos obtenidos usando la molecula reivindicada en el presente documento, mas en particular, el extracto denominado Phenolea Complex, revelo ser eficaz para su uso en la preparacion de productos nutriceuticos, como agentes antioxidantes para equilibrar y reforzar el sistema inmunitario frente a danos provocados por radicales libres, como agentes antioxidantes para la proteccion de ADN, proteinas y lipidos frente al dano oxidativo, como componentes para alimentos y bebidas funcionales destinados para el consumo humano y veterinario. Dichos extractos, preferiblemente Phenolea Complex, se aplican en la industria de produccion alimentaria, como antioxidantes para evitar la rancidificacion y como conservantes antimicrobianos en carne fresca y/o congelada, productos de salchicha, productos de horneado, salsas y condimentos generalmente en productos alimentarios que contienen una parte de grasa sujeta a rancidificacion y/o en los productos alimentarios sujetos a proliferacion bacteriana. Lo mismo puede usarse en la preparacion de cosmeticos o medicamentos para uso topico con accion detoxificante y suavizante para reparar danos relacionados con la edad y/o danos provocados por agentes de estres externos o internos. Algunas de estas actividades se indican en los ejemplos que siguen y que son una parte integrante de la presente invencion sin limitar el campo de proteccion de la misma.

El procedimiento reivindicado en el presente documento comprende una serie de etapas que, solas o en combinacion entre si, ofrecen ventajas considerables con respecto a lo que se conoce en el estado de la tecnica.

La etapa de pretratamiento asociada con la formacion del residuo solido o semisolido (tapon) representa una etapa crucial del procedimiento tanto en cuanto a la optimizacion del rendimiento del sistema de produccion como en cuanto al rendimiento y calidad del producto. En particular, la retirada de dicho tapon al final de dicha etapa 2), sin requerir el uso de etapas de pretratamiento adicionales, conduce a:

1) una mejora de aproximadamente el 50-60% de la productividad (cantidad de permeado durante el tiempo) de la posterior etapa de MF;

2) mejora del rendimiento de la seccion de MF en cuanto a la concentracion: tras la retirada de dicho tapon se observa en realidad un aumento del 60-80% en la razon de concentracion en volumen (VCR),

3) reduccion de incrustacion (obstruccion) de los filtros de membrana con consiguiente reduccion de los procedimientos de lavado y menor impacto medioambiental asociado con la eliminacion de las disoluciones de detergente usadas para reacondicionar los modulos;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4) obtencion de un producto en pasta semisolido potencial, constituido por dicho tapon, que va a destinarse para cosmetica, cria de animales o para producir energia. En realidad, tal producto puede aplicarse como pienso o complemento en la industria alimentaria animal, o tambien puede constituir una biomasa util para la produccion de fertilizantes o energia y/o como lodos de belleza para uso cosmetico.

La etapa de evaporacion permite obtener una melaza que contiene solamente el 10-30% de agua y una reserva de polifenoles (simples y complejos) para facilitar la sinergia entre las diferentes moleculas y crear las mejores condiciones para la aparicion de la actividad biologica. En realidad, el 10-30% de contenido de humedad reproduce la composicion quimica original presente en la aceituna. La evaporacion que elimina aproximadamente el 70-90% del agua presente en el suministro cargado, concentra el contenido polifenolico hasta obtener un titulo de polifenoles total equivalente al 4-10%. Ademas, dicha etapa permite una concentracion de la fraccion de liquido sin suministrar calor, evitando el estres termico del producto final y garantizando la conservacion de la reserva original de moleculas polifenolicas y antocianicas. La ausencia de oxigeno dentro de la caldera de ebullicion protege parcialmente el producto frente a contaminaciones biologicas. La retirada de agua del producto postevaporado facilita una mayor capacidad de conservacion y una reduccion de la contaminacion biologica. El producto asi obtenido mantiene la solubilidad en agua de los compuestos presentes inalterada, facilitando la aplicacion de los mismos. Ademas, debido a la etapa de evaporacion llevada a cabo mediante el procedimiento descrito en el presente documento, el producto final se obtiene sin requerir soportes tecnologicos generalmente usados tales como maltodextrinas, goma arabiga, silice, y evitando por tanto los fenomenos relacionados con la modificacion de las sustancias quimicas presentes. Las posibles modificaciones incluyen cristalizacion de azucares, formacion de laca, precipitacion de sales, fenomenos que podrian poner en peligro la funcionalidad de las moleculas polifenolicas de interes y la posibilidad de interaccion de las mismas. Ademas, la adicion de soportes tecnologicos conduce a una desventaja inherente relacionada con la adicion de solutos adicionales dentro del extracto original que conduciria a una reduccion del titulo de las sustancias de interes.

Una ventaja adicional se encuentra en la posibilidad de reutilizar el agua evaporada en los procedimientos de tratamiento evitando asi el consumo de agua del sistema de suministro de agua o pozo. Por ultimo, el concentrador/evaporador funciona a vacio, optimizando el rendimiento de la energia aplicada.

Se suministra una cantidad de destilado al sistema de microfiltracion para la tecnica de diafiltracion. Se ha prestado atencion al destilado producido, caracterizado por sustancias volatiles inicialmente presentes en el producto introducido en una caldera que imita el aroma de aceitunas frescas y, por tanto, al papel que esta fraccion puede desempenar en la industria cosmetica y alimentaria.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Pretratamiento de las VW, condiciones de agitacion hidraulica (escala de laboratorio).

Se llevaron a cabo tres procedimientos en paralelo. A partir de un unico lote de VW, se tomaron 3 muestras de 1 litro cada una. Se trataron las tres muestras a pH 3-3,5, a una temperatura de 50°C. A cada una de las tres muestras se le anadio una preparacion enzimatica, que consistia en pectinasa y celulasa obtenida partiendo de moho (Aspergillus niger), a una concentracion del 0,064% peso/peso. Se seleccionaron tambien dichas enzimas para la mejor separacion de las particulas de aceite en la etapa de rotura llevada a cabo de ese modo. En realidad, las enzimas, que destruyen la matriz pecto-celulosica de las VW, permiten que los solidos en suspension se agreguen en la parte superior de la masa de reaccion, extrayendose los mismos hacia arriba junto con las burbujas de aire y las particulas de aceite. La alteracion de la parte fibrosa por las enzimas constituye la base de la agregacion del tapon que no se produce en ausencia de enzimas, a menos que sea en porciones muy pequenas. La caracteristica distintiva de los tres procedimientos consiste en el tipo de agitacion llevada a cabo tras la adicion de la preparacion enzimatica en cada una de las tres muestras. Se sometio la muestra 1 a una agitacion mecanica central, en la que se mantuvo un anclaje magnetico en agitacion centralmente en el fondo de la masa de reaccion a un regimen de aproximadamente 100 revoluciones/minuto. Se sometio la muestra 2 a una agitacion mecanica lateral, en la que se dispuso un anclaje magnetico en una posicion descentrada en el fondo de la masa de reaccion y se mantuvo en agitacion a un regimen de aproximadamente 100 revoluciones/minuto. Se sometio la muestra 3 a agitacion hidraulica, en la que un sistema de bombeo peristaltico opero una recirculacion de liquido en posicion excentrica con respecto a la masa de reaccion, extrayendo el liquido de la base inferior de la masa de reaccion y reintroduciendo el mismo, a traves de un conducto, en una posicion excentrica inferior con respecto a dicha masa. Se continuo la agitacion durante 120 minutos.

La figura 4 indica el peso promedio del tapon humedo tal como se mide en cada una de las tres muestras. La muestra 1 revelo la formacion de un vortice que no permitio el engrosamiento del tapon. La muestra 2 revelo la formacion de una zona de calma y una zona de turbulencia, con la consiguiente formacion de un tapon superior cuyo peso humedo fue de aproximadamente 40 g. En cambio, la muestra 3 revelo una recuperacion de solidos en el tapon equivalente a al menos el 20% de los solidos contenidos en dichas VW. En particular, el peso del tapon recuperado es de aproximadamente 90 g.

La figura 5 indica una imagen del tapon tal como se obtiene en la muestra 2, sometida a agitacion mecanica lateral,

5

10

15

20

25

30

35

40

y en la muestra 3, sometida a agitacion hidraulica. El segmento indica la altura del tapon obtenido, equivalente a 0,8 cm en la muestra 2 y a 4,5 cm en la muestra 3.

Se obtuvieron resultados totalmente comparables operando en las condiciones descritas anteriormente, encontrandose la unica variante en el uso de una preparacion enzimatica al 0,1% peso/peso.

Ejemplo 2: Pretratamiento de las VW, condiciones de agitacion hidraulica (planta de viabilidad).

Se introdujeron VW en un reactor y se sometieron a las condiciones descritas en el ejemplo 1: pH 3-3,5, 50°C. A dichas VW se les anadio una preparacion de pectinasa y celulasa obtenida partiendo de moho (Aspergillus niger), a una concentracion del 0,064% peso/peso. Se sometio la masa liquida a agitacion hidraulica, tal como se define en la presente invencion. Se monitorizo la formacion y la altura del tapon a intervalos posteriores. Se observo que se alcanzo el pico de altura del tapon tras 4 h de agitacion hidraulica.

Ejemplo 3: Composicion del tapon

Se sometieron VW a un procedimiento de pretratamiento tal como se describe en el ejemplo 1, operando con agitacion hidraulica. Se retiro la fraccion solida del tapon y se analizo la composicion de la misma. La composicion de dicha fraccion se indica en la tabla 3.

Tabla 3

Composicion centesimal del “tapon” de la fraccion solida

: %

HUMEDAD: 76,02

PROTE'INAS: 4,73

GRASAS: 9,84

FIBRAS ALIMENTARIAS: 4,3

CENIZAS: 1,02

SALES, AZUCARES Y OTROS ELEMENTOS TRAZA: 5,1

Ejemplo 4: Microfiltracion llevada a cabo en la masa liquida obtenida del pretratamiento de las VW y los orujos.

Se llevo a cabo microfiltracion usando modulos de membrana de ceramica con tamano molecular equivalente a 0,14 micrometros. Los parametros de funcionamiento usados se indican en la tabla 4 a continuacion:

Tabla 4:

Parametros del procedimiento: Valor

Velocidad de flujo de suministro: 0,5 m3/hora

Presion transmembrana: 1,35 bares

Presion de funcionamiento: 5-6 bar

Temperatura: 20-50°C

Velocidad de flujo: 6-7 m/s

VCR (razon de concentracion en volumen): alrededor de 8-10

Los resultados obtenidos operando en las VW y en los orujos en cuanto a productividad surgen de las curvas indicadas en las figuras 2a y 2b, respectivamente.

Ejemplo 5: Procedimiento de extraccion aplicado a la variedad Carboncella

La tabla 5 indica el perfil polifenolico promedio observado en las VW de la variedad Carboncella, antes de someterse a procedimientos de extraccion, tal como se evalua mediante HPLC/DAD.

Tabla 5:

Aguas de vegetacion de la variedad Carboncella: mg/l

deriv. gluc. oleosido (390): 682,9

gluc. oleosido (390): 2238,9

acido elenolico AE (242): 471,6

glic. OH-Tyr (170): 55,3

der. OH-Tyr: 71,9

OH-Tyr (hidroxitirosol): 228,6

gluc. OH-Tyr (316): 268,6

5

10

15

20

25

30

Tyr: 74,3

gluc. Tyr (300): 0,0

der. Tyr: 48,3

acido vanilico (168): 0,0

desmetil-oleurop. (526): 0,0

derivado secoiridoide (320): 0,0

DACOLAG (320): 768,2

oleocantal (304): 0,0

derivado de acido cafeico: 34,7

acido cafeico: 0,0

acido p-cumarico (164): 0,0

bOH verbascosido (isomeros) (640): 63,7

verbascosido (624): 68,7

isoverbascosido: 10,6

ester cafeoilico de secologanosido (552): 62,0

ester p-cumaroilico de secologanosido (536): 78,3

total: 5226,7

Ejemplo 6: Procedimiento de extraccion partiendo de VW que proceden de las variedades Leccino y Carboncella y analisis nutricional del extracto obtenido.

Se pretrataron 4.500 l de aguas de vegetacion procedentes de la molienda de aceitunas de las variedades Leccino y Carboncella mediante acidificacion usando acido clorhidrico hasta alcanzar un pH de 2,5. Se aplico un tratamiento enzimatico posterior a las mismas anadiendo enzimas pectoliticas y celuloliticas producidas por las cepas de Aspergillus niger y Trichoderma longibrachiatum en cantidades totales equivalentes al 0,05% peso/peso. Se mantuvo la suspension con agitacion hidraulica durante 4 h, a una T de 37°C. Se elimino el residuo semisolido presente en la superficie al final de las 4 h. Se filtro el liquido obtenido del pretratamiento en una bolsa filtrante (punto de corte de 60 micrometros) y se envio el extracto a la seccion de microfiltracion. Se llevo a cabo dicha microfiltracion usando modulos de membrana de ceramica con tamano molecular equivalente a aproximadamente 0,14 micrometros con superficie de filtracion activa comprendida entre 0,20 y 1 m2 por modulo individual. El extracto se filtra a una T de 47°C a una presion de 5 bares. Se obtiene un volumen de concentrado equivalente a aproximadamente 450 l, al que se le anade un volumen igual de agua desmineralizada antes de llevar a cabo una nueva filtracion usando filtros como los usados en la etapa previa para el procedimiento de diafiltracion (DF) definido que se lleva a cabo hasta que el volumen de agua anadido al concentrado este totalmente permeado por la membrana. Se dispone el permeado asi obtenido (V= 4.050 + 450 l) en un evaporador a vacio, donde se llevan a cabo operaciones a 35°C, con una presion de descarga del compresor de aproximadamente 21 bares y una presion de aspiracion del compresor de aproximadamente 5,7 bares, con un vacio de aproximadamente 92 mbares. Se lleva a cabo evaporacion hasta alcanzar un nivel de humedad equivalente a aproximadamente el 27%. De una cantidad inicial de 4.500 l de VW, se obtienen aproximadamente 220 kg de extracto en forma de pasta semisolida. Los valores en cuanto a volumenes de las fracciones liquidas de procedimiento, ademas del volumen del extracto final, se indican en la tabla 6.

Tabla 6:

FRACCIONES DEL PROCEDIMIENTO

VW: 4.500

CONCENTRADO DE MF: 450 I

PERMEADO DE MF: 4.050 l

DIAVOLUMEN: 450 l

EXTRACTO LIQUIDO DE PREEVAPORACION: 4.500 l

EXTRACTO FINAL: 220 kg

El producto asi obtenido, denominado Phenolea Complex, tiene las siguientes caracteristicas quimicas y nutricionales.

Tabla 7:

proteinas: 2,50 g/100 g

grasas: 0,10 g/100 g

fibras alimentarias: 2,0 g/100 g

cenizas: 6,00 g/100 g

hidratos de carbono: 61,00 g/100 g

azucares: 12,00 g/100 g

sodio: 360 mg/kg

5

10

15

20

25

30

35

40

metales pesados:: <0,1 mg/kg

productos fitofarmaceuticos:: Ausentes

moho: <10 UFC/1 g

levadura: <10 UFC/1 g

polifenoles totales (expresados en equivalentes de acido galico): 45/100 mg/g

El perfil por espectrometria de masas del producto asi obtenido se indica en la tabla 8 a continuacion. Tabla 8

DETERMINACION DE BIOFENOLES MEDIANTE HPLC: Phenolea Complex

BIOFENOLES TOTALES: 280 nm | mg/kg | 45261

PERFIL DE FENOLES NATURALES

FENOLES NATURALES TOTALES: 280 nm mg/kg 39257

ALCOHOLES AROMATICOS TOTALES: 280 nm mg/kg 21328

Hidroxitirosol: 280 nm mg/kg 20131

Tirosol: 280 nm mg/kg 1197

DERIVADOS DE OLEUROPElNA: 280 nm mg/kg 23005

DERIVADOS DE LIGSTROSIDO: 280 nm mg/kg 1710

VERBASCOSIDO: 280 nm mg/kg 1089

OLEOCANTAL: 280 nm mg/kg 1020

LIGNANOS TOTALES (pinorresinol y acetoxipinorresinol): 280 nm mg/kg 36

ACIDOS FENOLICOS TOTALES acido protocatetico, acido vanilico, acido cafeico, acido p-cumarico, acido ferulico: 280 nm mg/kg 4784

FLAVONOIDES TOTALES: 280 nm mg/kg 222

Luteolina: 280 nm mg/kg 222

Apigenina: 280 nm mg/kg n.d.

ACIDOS SECOIRIDOIDES TOTALES: 240 nm mg/kg 7695

Acido descarboximetil-elenolico: 240 nm mg/kg 2408

Acido elenolico: 240 nm mg/kg 5287

Ejemplo 7: Evaluacion de las propiedades antioxidantes de aceites vegetales y grasas animales del extracto Phenolea Complex en comparacion con dos extractos comerciales de romero.

Con el objetivo de evaluar las propiedades antioxidantes en productos alimentarios, en particular en aceites vegetales y grasas animales, del extracto vegetal denominado Phenolea Complex en comparacion con dos tipos de extractos comerciales de romero (tipo I y tipo II definidos), se prepararon muestras con diferentes niveles de adicion de extracto para definir la eficacia en el control de la oxidacion lipidica del producto.

Cuando se sometio a prueba en aceite de oliva, el factor de proteccion del extracto Phenolea Complex, anadido al aceite de oliva en cantidades equivalentes a 0,75 g/kg o 1 g/kg, en ambas concentraciones usadas, supera los dos tipos de extractos comerciales de romero usados, en las mismas concentraciones, en la comparacion (figuras 3a, 3b).

En manteca, tal como se indica en la figura 3c, el extracto Phenolea Complex alcanza un indice de estabilidad marcadamente superior que los dos extractos comerciales de romero.

El metodo Rancimat (Metrohm mod. 679) se uso para determinar la estabilidad como funcion de la descomposicion oxidativa.

Los datos indicados en este caso revelan la actividad considerable del extracto denominado Phenolea Complex, que puede usarse, por tanto, por ejemplo, en la industria de produccion de salchichas, con el objetivo de proteger el producto y especialmente reemplazar algunos aditivos (antioxidantes).

Ejemplo 8: Tipo de composicion polifenolica del extracto Phenolea Complex.

La composicion polifenolica en cuanto a acidos fenolicos, alcoholes fenolicos, secoiridoides y flavonoides medida en el extracto Phenolea Complex debe considerarse equivalente (desde un punto de vista de la calidad) con respecto a la composicion polifenolica del aceite de oliva virgen extra. Respecto a la cantidad, el extracto obtenido mediante el procedimiento reivindicado en el presente documento tiene una concentracion polifenolica mayor. La tabla 9 indica el contenido en compuestos polifenolicos identificados en el extracto Phenolea Complex con el analisis de espectrometria de masas CL/EM en comparacion con las composiciones promedio de un aceite de oliva virgen extra de Sabina.

Comparacion de los principales biofenoles de las variedades Carboncella/Leccino: Phenolea Complex ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA DE SABINA

DETERMINACION DE BIOFENOLES MEDIANTE HPLC: mg/kg mg/l

BIOFENOLES TOTALES incluyendo:: 45261 389,56

Hidroxitirosol: 20131 1,72

Tirosol: 1197 1,12

Derivados de oleuropeina: 23005 51,88

OLEOCANTAL: 1020 25,65

LIGNANOS TOTALES (pinorresinol y acetoxipinorresinol): 36 116,43

Luteolina: 222 4,10

Acido elenolico: 5287 65,94

Claims

10

15

20

25

30

35 2.

40

3.

45

4.

50

5.

55

6.

60

7.

65 8.

REIVINDICACIONES

Procedimiento para la extraccion y concentracion de compuestos polifenolicos contenidos en aguas de vegetacion y/u orujos obtenidos del procesamiento de aceitunas que comprende:

1) recogida del liquido que consiste en aguas de vegetacion y/u orujos despues del procedimiento de molienda de aceitunas;

2) pretratamiento quimico, fisico y enzimatico;

3) filtracion tangencial a una T en el intervalo de 45 a 50°C, preferiblemente microfiltracion ceramica (MF), obteniendo asi una fraccion de concentrado y una fraccion de permeado;

4) evaporacion a vacio de la fase de permeado obtenida en 3); en el que dicho pretratamiento 2) comprende:

a) acidificacion hasta un pH de entre 2,5 y 4;

b) tratamiento enzimatico mediante la adicion de una reserva de enzimas celuloliticas y pectoliticas, caracterizado porque durante dicho tratamiento el liquido se mantiene con agitacion hidraulica operando un procedimiento para la recirculacion del mismo liquido de manera excentrica con respecto a la pared del reactor, en el que dicha agitacion se mantiene durante un tiempo de 2 a 6 h, preferiblemente durante aproximadamente 4 h a una T en el intervalo de 30 a 50°C cuando se trabaja con aguas de vegetacion, y dicha agitacion hidraulica se mantiene durante 12-24 h a una T en el intervalo de 50 a 80°C cuando se trabaja con orujos;

c) eliminacion del residuo solido o semisolido, denominado tapon, que se recoge en la superficie al final de dicha etapa b) donde dicho residuo tiene una densidad comprendida entre 0,7 y 0,85 g/cm3, en el que dicha eliminacion tiene lugar bombeando y enviando la masa liquida recogida en el fondo del tanque de pretratamiento a la seccion de filtracion posterior y dicho tapon constituye el 2-7% en peso con respecto a la masa total del agua de vegetacion y contiene aproximadamente el 20% de los solidos presentes en las aguas de vegetacion iniciales.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que, despues de dicha etapa 3) de filtracion tangencial, tambien se lleva a cabo la siguiente etapa:

3’) adicion de agua, preferiblemente agua osmotica, a dicho concentrado, y diafiltracion posterior hasta la permeacion de todo el volumen de agua anadido obteniendo asi una fraccion de permeado que se envia a la etapa de evaporacion 4), junto con la fraccion de permeado obtenida en 3);

en el que dicho volumen de agua anadido es preferiblemente igual al volumen de dicho concentrado.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha etapa de evaporacion 4) continua hasta que se obtiene un producto final que tiene niveles de humedad en el intervalo del 10 al 30%, preferiblemente desde el 20 hasta el 30%.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha etapa de evaporacion 4) continua hasta que se obtiene un producto que tiene niveles de humedad en el intervalo del 50 al 80%, y tambien se lleva a cabo la siguiente etapa:

4’) atomizacion hasta un producto final que tiene niveles de humedad en el intervalo del 3 al 6%.

Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas aguas de vegetacion y/u orujos se recogen y se procesan en el plazo de 24 horas desde su produccion, preferiblemente en el plazo de 12 horas.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha acidificacion tiene lugar anadiendo un acido, seleccionado preferiblemente de acido citrico, acido sulfurico, acido clorhidrico o mezclas de los mismos.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dichas enzimas son enzimas de calidad alimentaria y se producen preferiblemente por cepas seleccionadas de Aspergillus nigery Trichoderma longibrachiatum y se anaden en cantidades en el intervalo del 0,02-0,1% peso/peso.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicho residuo recogido en la superficie al final de dicha etapa b), el tapon, consiste principalmente en sustancias coloidales, grasas, fibras vegetales, sales,

10.

10

15

11.

20

12.

25

30

13.

35 14.

15.

40

16.

azucares y trazas de polifenoles.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha masa liquida que se deriva de la etapa de pretratamiento 2) se somete a una etapa de filtracion perpendicular en una bolsa filtrante, preferiblemente con un punto de corte de aproximadamente 60 micrometros y luego se envia a dicha seccion de filtracion tangencial.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha filtracion se lleva a cabo con modulos de membrana de ceramica con un punto de corte molecular que oscila preferiblemente entre 0,1 y

1.4 micrometros que tienen una superficie de filtracion activa comprendida entre 0,20 y 1 m2 por modulo individual a una presion comprendida entre 3 y 10 bar, preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 6 bar con un flujo de permeado en el tiempo en el intervalo de 15 a 100 l/m2h, preferiblemente desde 19 hasta 90 l/m2h, en el que dicha filtracion se continua hasta que se obtiene un factor de concentracion en el intervalo de 5 a 20.

Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que en dicha etapa 4) de evaporacion a vacio, el permeado obtenido en dichas etapas 3) y/o 3’) se coloca en un concentrador/evaporador que funciona con los siguiente parametros: T en el intervalo de 30 a 40°C, de manera preferible aproximadamente a 35°C, velocidad de flujo del destilado: 5-50 l/h, altura de descarga del compresor en el intervalo de 15 a 35 bar, de manera preferible aproximadamente 20,5-21,5 bar, presion de aspiracion del compresor en el intervalo de 4 a 9 bar, de manera preferible aproximadamente 5,6-5,9 bar, vacio: 90-95 mbar, preferiblemente 92 mbar.

Producto obtenido de aguas de vegetacion y/u orujos del procesamiento de aceitunas segun el procedimiento reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas aguas de vegetacion y/u orujos se exponen a un pretratamiento que determina el flotamiento de una fase solida sobre la parte liquida con una separacion espontanea de los solidos, en el que dicha fase solida se elimina entonces bombeando y enviando la masa liquida recogida en el fondo del tanque de pretratamiento a la seccion de filtracion posterior y dicha fase solida contiene aproximadamente el 20% de los solidos presentes en las aguas de vegetacion iniciales, en el que dicha filtracion es una filtracion tangencial que se opera a una T en el intervalo de 45 a 50°C, preferiblemente es microfiltracion ceramica (MF).

Producto segun la reivindicacion 12, en el que dichas aguas de vegetacion y/u orujos proceden de la operacion de molienda de aceitunas de las variedades Leccino y Carboncella.

Producto segun las reivindicaciones 13 que comprende una cantidad de fibras alimentarias de entre 1,5 y

2.5 g/100 g.

Producto segun la reivindicacion 13, denominado Phenolea Complex, caracterizado por el perfil quimico nutricional indicado en la tabla:

proteinas: 200-3,00 g/100 g

grasas: 0,05-0,15 g/100 g

fibras alimentarias: 1,5-2,5 g/100 g

cenizas: 5,5-6,5 g/100 g

hidratos de carbono: 59,00-63,00 g/100 g

azucares: 11,00-13,00 g/100 g

sodio: 340-380 mg/kg

metales pesados:: <0,1 mg/kg

productos fitofarmaceuticos:: Ninguno

mohos: <10 UFC/1 g

levaduras: <10 UFC/1 g

Producto segun la reivindicacion 15, caracterizado por el siguiente perfil de HPLC:

DETERMINACION DE BIOFENOLES MEDIANTE HPLC: Phenolea Complex

BIOFENOLES TOTALES: 280 nm | mg/kg | 45261

PERFIL DE FENOLES NATURALES

FENOLES NATURALES TOTALES: 280 nm mg/kg 39257

ALCOHOLES AROMATICOS TOTALES: 280 nm mg/kg 21328

Hidroxitirosol: 280 nm mg/kg 20131

Tirosol: 280 nm mg/kg 1197

DERIVADOS DE OLEUROPElNA: 280 nm mg/kg 23005

DERIVADOS DE LIGSTROSIDO: 280 nm mg/kg 1710

VERBASCOSIDO: 280 nm mg/kg 1089

OLEOCANTAL: 280 nm mg/kg 1020

LIGNANOS TOTALES (pinorresinol y acetoxipinorresinol): 280 nm mg/kg 36

FLAVONOIDES TOTALES: 280 nm mg/kg 222

Luteolina: 280 nm mg/kg 222

Apigenina: 280 nm mg/kg n.d.

ACIDOS SECOIRIDOIDES TOTALES: 240 nm mg/kg 7695

Acido descarboximetil-elenolico: 240 nm mg/kg 2408

Acido elenolico: 240 nm mg/kg 5287

17. Producto segun la reivindicacion 12 6 13 para su uso en los sectores alimentario, cosmetico y fitoterapico.

18. Producto segun la reivindicacion 12 6 13 para su uso en la preparacion de productos nutriceuticos, tales

5 como antioxidantes para equilibrar y reforzar el sistema inmunitario frente a danos provocados por radicales

libres, tales como antioxidantes para la proteccion de ADN, proteinas y lipidos frente al dano oxidativo, tales como componentes para alimentos y bebidas funcionales destinados para el consumo humano y veterinario.

10 19. Producto segun la reivindicacion 12 6 13 para su uso en tecnologia de los alimentos, como antioxidante

para evitar la rancidez y como conservante antimicrobiano, o bien solo o bien en combinacion con otros aditivos alimentarios seleccionados preferiblemente de acido ascorbico, ascorbato de sodio, en carnes frescas y congeladas, salchichas de tipo salami, productos horneados, aderezos y condimentos y en alimentos que contienen una parte grasa sujetos a rancidez y/o en alimentos sujetos a proliferacion 15 bacteriana en general y deterioro del color.

20. Producto segun la reivindicacion 12 o 13 para su uso en la preparacion de cosmeticos o medicamentos para uso topico que tiene una accion antioxidante, detoxificante y calmante dirigida a la reparacion del dano relacionado con la edad y/o el dano provocado por agentes estresantes externos o internos.

20