IT202100019226A1 - Processo produttivo di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo e relativi complessi polifenolici prodotti - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?Processo produttivo di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo e relativi complessi polifenolici prodotti?

La presente invenzione riguarda un processo produttivo di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo, i cui prodotti sono idonei per applicazioni nutraceutiche, farmaceutiche, cosmetiche e/o alimentari.

Inoltre, la presente invenzione riguarda complessi polifenolici prodotti mediante il processo produttivo citato.

In particolare, la presente invenzione riguarda un processo produttivo di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie, in particolare di Olea Europea di cultivar Coratina, utilizzabili nella preparazione di prodotti ad uso nutraceutico, farmaceutico, cosmetico ed alimentare che comprendono detto fitocomplesso polifenolico.

Com?? noto, l'olio extravergine d'oliva riduce il rischio di malattie coronariche, abbatte i radicali liberi dell'ossigeno, responsabili dell'invecchiamento cellulare, ha un'azione antimicrobica, ha un ruolo nella prevenzione dei tumori e nella regolazione della flora intestinale. Nonostante le pregevoli potenzialit? dell?olio di oliva, il contenuto di polifenoli presenti negli oli ? ridotto. Data la loro polarit? i polifenoli si disperdono infatti nelle acque di vegetazione, dove sono da 100 a 300 volte in quantit? maggiori rispetto a quelli che si trovano nell'olio. Nel processo di produzione dell?olio extravergine di oliva si perde cos? un grande quantitativo di polifenoli, ed in particolare di idrossitirosolo ricco di propriet? benefiche. Le acque di vegetazione (A.V.) sono reflui con basso pH, alta conducibilit? elettrica, facilmente fermentabili. Il carico inquinante delle A.V. ? legato all?elevato contenuto di sostanze organiche (zuccheri, pectine, grassi, sostanze azotate, polialcoli, poliacidi): il COD ? compreso tra 80 e 210 g/L di O2 e il BOD5 tra 50 e 150 g/L di O2. L?inquinamento ambientale delle AV ? principalmente legato alle alte concentrazioni (1-10 g/L) in polifenoli, di diverso peso molecolare, con spiccate propriet? antimicrobiche e fitotossiche, per altro resistenti alla degradazione biologica. Il carico inquinante di 1 m<3 >di A.V. corrisponde a circa 100-200 m<3 >di reflui domestici. Da oltre 40 anni le A.V. sono state oggetto di studi e ricerche finalizzati a ridurre il loro carico inquinante, ma i risultati complessivi sono stati molto scarsi, anche a causa dei costi elevati. Di fatto le AV sono state sempre sparse sui campi o smaltite illegalmente nella rete fognaria o nell'ambiente provocando danni all?agricoltura, alle falde acquifere e/o intasamento dei depuratori dei reflui civili.

Solo negli ultimi anni sono state sviluppate delle ricerche finalizzate alla valorizzazione delle A.V. recuperando i composti polifenolici presenti per le loro spiccate propriet? biologiche e benefiche per la salute umana.

Limiti principali dei processi di produzione di fitocomplessi attualmente noti sono di avere alto costo, non essere eco-compatibili e di non valorizzare sottoprodotti della produzione di olio d?oliva, in particolare da cultivar locali, per la realizzazione di prodotti per la salute dell?uomo.

Inoltre, uno dei limiti principali dei processi produttivi di fitocomplessi e dei relativi prodotti ? di non garantire nella composizione prodotta un adeguato tenore di verbascoside che ? un polifenolo particolarmente benefico ed avente azione antiossidante, antinfiammatoria, antimicotica, epatoprotettiva, neuroprotettiva e di regolazione cellulare.

Scopo della presente invenzione ? fornire un processo produttivo di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo, che consenta di ottenere un prodotto ricco in polifenoli ed in particolare contenente verbascoside, tale da superare i problemi attualmente presenti con riferimento alla tecnica nota.

? inoltre scopo della presente invenzione fornire un fitocomplesso polifenolico che valorizzi coltivazioni di cultivar autoctone, in particolare la cultivar Coratina, recuperando prodotti di scarto che andrebbero altrimenti smaltiti con ingenti costi economici ed ambientali, e che contenga un insieme di polifenoli la cui azione sinergica sia benefica ed efficace nell?uso nutraceutico, farmaceutico, cosmetico e/o alimentare per l?uomo.

Secondo la presente invenzione, viene realizzato un processo produttivo di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo , come definito nella rivendicazione 1.

Secondo la presente invenzione, vengono inoltre realizzati complessi polifenolici , come definito nella rivendicazione 9.

Per una migliore comprensione della presente invenzione viene ora descritta una forma di realizzazione preferita, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:

- La figura 1 mostra uno schema del processo produttivo di complessi polifenolici, secondo l?invenzione;

- La figura 2, mostra lo schema di una fase di flottazione con gas inerte del processo di produzione secondo l?invenzione;

- La figura 3 mostra uno schema di una fase di essiccazione del processo di produzione secondo l?invenzione;

- Le figure 4.a-4.d mostrano risultati emersi da prove sperimentali effettuate dal Richiedente, ed in particolare la figura 4.a mostra l?effetto del complesso polifenolico MOMAST, nelle sue varie formulazioni, sull?attivit? dell?enzima HMGCoAR, la figura 4.b mostra l?effetto del complesso polifenolico MOMAST sulla vitalit? delle cellule HepG2; la figura 4.c mostra l?effetto di MOMAST sul metabolismo del colesterolo; la figura 4.d mostra l?effetto di MOMAST sulla modulazione dei livelli del recettore dell?LDL di membrana e sulla capacit? funzionale delle cellule HepG2 di assorbire LDL extracellulare;

- Le figure 5.a, 5.b e 5.c mostrano rispettivamente un esempio di cromatogramma analisi HPLC del prodotto MOMAST PLUS in fase liquida , un esempio di cromatogramma analisi HPLC del prodotto MOMAST GR in forma solida granulare ed un esempio di cromatogramma analisi HPLC del prodotto MOMAST DERMA;

- Le figure 6.a ? 6.b mostrano l?effetto del prodotto polifenolico MOMAST sul pathway di PCSK9, secondo l?invenzione;

- La figura 7 mostra l?effetto di MOMAST sulla secrezione di PCSK9 da parte delle cellule HepG2. Confornto con la pravastatina, secondo l?invenzione.

In particolare, la figura 1 mostra un processo produttivo 100 di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo, secondo l?invenzione.

Il processo produttivo 100 comprende le fasi di:

- Alimentazione e stoccaggio, in opportuni serbatoi, di acque di vegetazione olearie, in particolare da cultivar coratina, ovvero alimentazione e stoccaggio della materia prima;

- Centrifugazione delle acque di vegetazione e separazione di una frazione residua di olio presente nelle AV e di una parte dei fanghi, invio della frazione residua di olio a usi finali industriali e dei fanghi a una fase di disidratazione dei fanghi;

- Fermentazione zuccherina anaerobica della matrice separata mediante la precedente fase di centrifugazione in presenza di un enzima pectolitico e/o cellulasico, ad una temperatura compresa tra 35?C e 45 ?C;

- Sedimentazione ed estrazione primaria con acqua ultrapura del prodotto di fermentazione, con successivo invio, del liquido chiarificato ottenuto, alla fase di flottazione e dei fanghi esausti alla fase di disidratazione dei fanghi;

- Flottazione in atmosfera inerte e abbattimento di solidi leggeri del liquido chiarificato nella fase precedente di sedimentazione ed estrazione, con ottenimento di fango esausto da inviare alla fase di disidratazione dei fanghi e di acque di vegetazione brillantate (A.V pretrattate) da inviare a una fase di stoccaggio di A.V. pretrattate e brillantate;

- disidratazione dei fanghi ottenuti nelle precedenti fasi di centrifugazione, sedimentazione ed estrazione primaria e flottazione, con ottenimento di liquido estratto da inviare a stoccaggio A.V. pretrattate e brillantate e di fango esausto disidratato di A.V. utilizzabile vantaggiosamente per applicazioni agronomiche, zootecniche, compostaggio o produzione di biogas;

- filtrazione delle A.V. pretrattate e brillantate stoccate nella fase precedente.

Secondo un aspetto dell?invenzione, la fase di filtrazione delle A.V. pretrattate e brillantate consente la separazione ed isolamento dei principi attivi presenti nelle acque di vegetazione brillantate (matrice pretrattata e prive di solidi), e comprende le fasi:

- Microfiltrazione con ottenimento di permeato e retentato da microfiltrazione;

- ricircolo del retentato da microfiltrazione alla fase di fermentazione anaerobica;

- ultrafiltrazione, preferibilmente a 1KDa, del permeato da microfiltrazione, con ottenimento di permeato e retentato da ultrafiltrazione (UF);

- Invio del permeato di UF 1KDa alla prima osmosi inversa (RO1) con ottenimento di permeato, ovvero acqua ultrapura, da riutilizzare nel processo 100 e retentato ovvero un intermedio del primo prodotto 101 ?MOMAST PLUS?;

- Recupero del retentato di UF 1 KDa, per essere sottoposto a Nanofiltrazione, preferibilmente a 300 Da, previo diafiltrazione con acqua ultrapura, con ottenimento di permeato e retentato da nanofiltrazione 300 Da;

- invio del retentato alla fase di disidratazione dei fanghi

- seconda osmosi inversa (RO2) del permeato di nanofiltrazione 300 Da, con ottenimento di acqua ultrapura come permeato, da riutilizzare nel processo, e di retentato da inviare a una fase di miscelazione, per ottenere un intermedio del terzo prodotto 103 ?MOMAST DERMA?; la fase di miscelazione comprende mescolare il 20% di retentato da seconda RO con 80% di intermedio ?MOMAST PLUS?, costituito dal retentato della prima RO.

Secondo un aspetto dell?invenzione il processo di produzione 100 comprende inoltre una fase di evaporazione sottovuoto dell?intermedio del primo prodotto 101 ?MOMAST PLUS?, ottenendo come concentrato il primo prodotto 101 in fase liquida, denominato ?MOMAST PLUS?.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il processo di produzione 100 comprende una fase di essiccazione (in particolare foam drying) del liquido concentrato costituente il primo prodotto 101 ?MOMAST PLUS? con ottenimento del secondo prodotto 102 ?MOMAST GR? in polvere secca.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il processo di produzione comprende una fase di evaporazione sottovuoto dell?intermedio del terzo prodotto, ottenuto dalla miscelazione del 80% dell?intermedio Momast PLUS e del 20% del retentato da seconda osmosi inversa. Il concentrato ottenuto dalla fase di evaporazione sottovuoto costituisce il terzo prodotto 103, denominato ?MOMAST DERMA?, in fase liquida.

Secondo un aspetto dell?invenzione, la fase di fermentazione zuccherina anaerobica a temperatura compresa tra 35 e 45 ?C consente di ottenere una matrice di AV a ridotto contenuto di zuccheri, con notevoli vantaggi rispetto all?arte nota sulla qualit? del prodotto finito e sulla capacit? produttiva dell?impianto.

Secondo un aspetto dell?invenzione, la fase di estrazione primaria avviene per dilavamento con 2 volumi di acqua ultrapura delle AV fermentate, con successiva sedimentazione statica. Il liquido chiarificato viene vantaggiosamente ed ulteriormente purificato mediante la fase di flottazione in atmosfera inerte ed il prodotto cos? ottenuto viene trattato nelle sezioni di filtrazione tangenziale, ottenendo una migliorata capacit? produttiva dell?impianto in cui avviene il processo 100 secondo l?invenzione.

Vantaggiosamente, le fasi di produzione del secondo prodotto in polvere secca sono ottimizzate e consentono di superare problemi tecnologici relativi all?arte nota. In particolare nei sistemi noti, tra i quali il brevetto italiano n.1020000118607 depositato dal Richiedente, l?essiccazione mediante spray dryer di estratti di AV, ottenuti con metodi naturali senza uso di solventi, non consente di ottenere un prodotto proficuamente utilizzabile nei processi industriali, in quanto a contatto con l?aria il prodotto caramellizza e diventa compatto, non scorrevole e non idrosolubile, comportando quindi lavorazione e produzione complesse.

Secondo l?invenzione invece, a seguito di varie prove sperimentali condotte dal Richiedente, nelle fasi di produzione del secondo prodotto in polvere secca si utilizza la tecnica del Foam Drying che consiste nel preparare una miscela di composto liquido MOMAST PLUS ed eccipienti , far inglobare aria ottenendo una schiuma e procedere con una successiva fase di essiccazione per strati di circa 3-5 mm di spessore in flusso di aria calda a temperatura preferibilmente pari a 75?C. Al termine della fase di essiccazione il processo comprende una fase di macinazione in modo da ottenere una polvere secca.

Secondo un aspetto dell?invenzione, gli eccipienti aggiunti nella fase di essiccazione sono: Sostituto vegetale dell?albume ; Maltodestrina; Gomma arabica; Silice colloidale.

Secondo un aspetto dell?invenzione la fase di fermentazione anaerobica avviene a temperatura compresa tra 35?C e 40?C .

Vantaggiosamente secondo l?invenzione la fase di nanofiltrazione a 1000 Dalton consente di ottenere un unico panel di molecole polifenoliche, con importante presenza di verbascoside, ottenendo vantaggiosamente la presenza di idorssitirosolo e tirosolo.

Secondo un aspetto dell?invenzione il secondo prodotto, MOMAST GR, in polvere secca comprende additivi costituiti da:

- Proteine vegetali;

- Maltodestrina;

- Gomma arabica;

- Silice colloidale.

Preferibilmente, gli additivi sono presenti nelle seguenti quantit?:

- Sostituto vegetale dell?albume in misura pari a 8-12% p/p

- Maltodestrina, in misura pari a 3 -6,5% p/p - Gomma arabica, in misura pari a 20 -30% p/p

- Silice colloidale, in misura pari a 1,0-2,0% p/p. Vantaggiosamente la fase di digestione anaerobica preliminare della frazione zuccherina presente nelle acque di vegetazione, consente di ridurre il tenore di tale componente nei prodotti finali. Vantaggiosamente, questo consente una pi? efficace purificazione e l?ottenimento di un titolo polifenolico pi? elevato e di conseguenza un prodotto finito di migliore qualit?

Pi? dettagliatamente, i complessi polifenolici ottenuti, mediante il processo descritto, da acque di vegetazione di Olea Europea di cultivar Coratina, sono costituiti da:

- Un primo prodotto, denominato MOMAST PLUS liquido idoneo ad uso nutraceutico, alimentare ed industriale in genere;

- Un secondo prodotto MOMAST GR, in polvere secca, idoneo all?uso nutraceutico, alimentare ed industriale in genere;

- Un terzo prodotto MOMAST DERMA, liquido arricchito in idrossitirosolo per uso cosmetico.

Vantaggiosamente i complessi polifenolici secondo l?invenzione sono prodotti in modo tale da garantire elevata qualit? della composizione polifenolica ed in particolare la presenza del verbascoside con idrossitirosolo e suoi derivati, consente di ottenere un effetto sinergico con gli altri polifenoli presenti nel complesso, svolgendo le seguenti azioni benefiche:

- antiossidante;

- antinfiammatoria;

- ipocolesterolemizzante

- di regolazione cellulare;

- epatoprotettiva;

- neuroprotettiva.

Vantaggiosamente, i complessi polifenolici ottenuti mediante il processo hanno propriet? antiossidanti, antiradicalica, antinfiammatoria generale ed ipocolesteroleminizzante, in particolare per il primo prodotto e per il secondo prodotto. Le propriet? sono comprovate da studi sperimentali condotti dal Richiedente. Il primo prodotto 101 MOMAST PLUS ha applicazione in campo industriale come agente antiossidante e conservante naturale, in prodotti o preparazioni.

Il terzo prodotto 103 MOMAST DERMA ha vantaggiosamente uso in campo cosmetico come agente antiossidante, con capacit? tonico trofica, elasticizzante, antirughe e riscostituente dell?epitelio.

Secondo l?invenzione, il processo di produzione 100 avviene in un impianto comprendente le seguenti apparecchiature:

- un separatore centrifugo verticale in cui avviene la fase di disoleazione, costituito da un separatore a dischi, rotante a circa 8000 rpm, capace di separare per forza centrifuga, l?olio come fase leggera, acque di vegetazione come fase intermedia e solidi fini pi? pesanti come fango denso;

- un reattore di fermentazione , preferibilmente di tipo Feed batch e cio? ad un iniziale riempimento con acqua di vegetazione contenente un substrato si associa una estrazione parziale del liquido fermentato ed uguale aggiunta di liquido fresco. La temperatura del liquido nel rattore ? di circa 35- 45? C;

- un sedimentatore Sd da 5 mc dotato sia di circuito di raffreddamento che di riscaldamento con circolazione di acqua glicolata;

- una apparecchiatura di flottazione con gas inerte, in particolare azoto, del tipo a gas disciolto a 5 bar;

- una macchina di concentrazione termica del tipo ad evaporazione a film cadente sottovuoto, a compressione meccanica del vapore d?acqua configurata per eliminare circa 60-80 kg/h di acqua dal liquido da concentrare con soli 10 kW elettrici. La temperatura di evaporazione ? compresa tra 40 a 60 ?C;

- un essiccatore del tipo double drum con velocit? dei tamburi regolabile da inverter, il cui riscaldamento avviene tramite vapore che riscalda internamente i tamburi controrotanti e gas (aria o azoto) deumidificata e riscaldata a 60 ?C che circola all?esterno dei tamburi, il gas ha anche il compito di evacuare i vapori prodotti dall?essiccamento. Le temperature di lavoro sono di circa 100 ?C e tempi di permanenza di qualche secondo (Vedi Figura 4).

In uso, le acque di vegetazione (AV) in arrivo al processo ed al relativo impianto vengono stoccate in un serbatoio di accumulo refrigerato a 10 ?C. Successivamente le AV vengono alimentate al separatore centrifugo verticale.

Le acque di vegetazione sono dunque disoleate e private dei solidi pi? pesanti ma comunque ancora ricche di solidi a peso specifico medio e dunque torbide.

Si inietta a questo punto dell?enzima pectolitico o cellulasico, in linea al processo o in un reattore S2 di stoccaggio delle acque disoleate.

A seguire, le acque di vegetazione risultano aerate dalla centrifuga e rese meno viscose ad opera degli enzimi che idrolizzano la pectina.

L?aerazione che volutamente si attua nella centrifuga verticale ? quella strettamente necessaria ad innescare il processo biologico successivo di fermentazione ad opera dei microrganismi in S2, senza aumentare la concentrazione di ossigeno disciolto, comunque deleterio per la stabilit? dei polifenoli di interesse

Le acque di vegetazione possono contenere dal 4 al 6% di zuccheri, che vengono fermentati ad opera dei microrganismi presenti, oltre agli zuccheri prodotti dalla idrolisi della cellulosa. Questo stadio ? realizzato nel reattore S2, agitato e riscaldato fino a 40 ?C. La fase di fermentazione ? necessaria non per la produzione di metaboliti secondari ma per il consumo di substrato fermentescibile. Infatti, riducendo i solidi disciolti e producendo biomassa sedimentabile, si riducono sostanze che possono aumentare i TDS, sostanza secca, nei successivi stadi di osmosi inversa e concentrazione termica, aumentando la concentrazione di polifenoli, comunque quest?ultimi, di difficile degradazione biologica.

Preferibilmente secondo l?invenzione, il reattore di fermentazione ? del tipo Feed batch e cio? ad un iniziale riempimento con acqua di vegetazione contenente un substrato si associa una estrazione parziale del liquido fermentato ed uguale aggiunta di liquido fresco. La temperatura del liquido nel rattore viene aumentata a circa 35- 40? C, valori per cui si ha la massima crescita di biomassa, per cui all?aumentare della temperatura si ha un aumento della velocit? di conversione, considerando per? che ad elevate temperature si ha un effetto sterilizzazione della biomassa.

Nel reattore S2, il liquido estratto presenta una concentrazione di substrato quasi nulla, per cui i microrganismi ormai nella fase stazionaria (non riescono ad accrescersi) o di autodistruzione, possono sedimentare facilmente per via della loro struttura particellare.

Il liquido uscente da S2 viene inviato in un sedimentatore Sd, dotato sia di circuito di raffreddamento che di riscaldamento con circolazione di acqua glicolata. In questa fase il fango, costituito da solidi organici non fermentescibili (bucce e polpa o terra) e microrganismi, sedimenta, depositandosi sul fondo. Vantaggiosamente, le sostanze colloidali e fementescibili sono state trasformate in biomassa solida che ha la funzione di letto adsorbente, nella discesa ingloba e chiarifica da solidi colloidali le acque di vegetazione fermentate.

Il processo produce in questo modo, alla stregua di un impianto di depurazione reflui biologico, un fango sedimentabile e un liquido chiarificato sulla sommit? del sedimentatore. Il liquido chiarificato viene alimentato nello stadio di flottazione con azoto (gas inerte).

Si procede a questo punto ad 1 o pi? cicli di wash out del fango sedimentato, mediante rabbocco del contenuto del sedimentatore Sd con acqua osmotizzata e mantenimento in agitazione idraulica dell?intero contenuto (fango+acqua) per circa 1 ora allo scopo di favorire il passaggio in soluzione dei polifenoli ancora contenuti nel fango. Si lascia sedimentare ottenendo nuovamente un fango sedimentabile e un liquido chiarificato sulla sommit? del sedimentatore che sar? inviato allo stadio di flottazione con azoto.

Infine il fango sedimentato sul fondo viene inviato in filtropressa per essere ulteriormente separato dal liquido in esso ancora contenuto (i solidi presenti sono di circa il 2-4%), aumentando l?efficienza di recupero della sostanza di interesse per l?azienda.

Tutto il liquido chiarificato viene alimentato ad una apparecchiatura di flottazione con azoto (gas inerte), del tipo a gas disciolto a 5 bar. Nella fase di flottazione, delle microbolle di azoto, prima disciolto e poi liberatosi dall?espansione del liquido da 5 a 1 bar, nella loro risalita nella vasca di espansione, catturano i solidi sospesi e colloidali residui, presenti nelle acque di vegetazione, chiarificandole ulteriormente.

Il fango galleggiante, contenente anche residui di olio, viene raccolto da uno skimmer e scaricato. Le acque di vegetazione ?brillantate? possono quindi essere stoccate per la successiva fase di brillantatura finale e sterilizzazione con microfiltrazione tangenziale.

Secondo un aspetto dell?invenzione, l?apparecchiatura in cui avviene la fase di microfiltrazione ? del tipo a membrane ceramiche con flusso tangenziale. I pori hanno dimensione media di 0,2 micron, capaci dunque di trattenere batteri e solidi colloidali responsabili di intorbidamento; trattamento utile al successivo trattamento di ultrafiltrazione. Il permeato microfiltrato viene inviato nello stadio di ultrafiltrazione mentre il retentato (concentrato), ricco di solidi sospesi, ritorna in testa al trattamento di fermentazione e chiarifica per il recupero della frazione liquida.

Nella fase di ultrafiltrazione tangenziale, il cut off di 1000 Da, permette di purificare il liquido microfiltrato, selezionando nel permeato solo molecole teoricamente con peso molecolare inferiore a 1000. In questo range di pesi molecolari rientrano sicuramente i tannini coloranti, per cui il permeato uscente ha colore apparentemente limpido e costituito prevalentemente da polifenoli di interesse commerciale: Idrossitirosolo (PM 154), tirosolo (PM 138) e verbascoside (PM 624) ed oleuropeina (PM 540), mentre i tannini con peso molecolare da 1000 a 3000 rimangono confinati nel retentato. Tuttavia nel retentato permane ancora una ulteriore frazione di polifenoli di interesse (Idrossitirosolo, Tirosolo e Verbascoside), per cui tale frazione viene accumulata per essere destinata successivamente ad un trattamento di ulteriore recupero di polifenoli.

Il liquido permeato nell?ultrafiltrazione da 1000 Da, ricco di polifenoli fisicamente selezionati ma ancora fortemente diluiti, viene inviato alla fase di osmosi inversa, capace di disidratare parzialmente tale liquido e concentrare la sostanza secca fino ad un max di 18%, eliminando acqua priva di Sali come permeato. Dallo stadio di concentrazione per osmosi si ottiene quindi un concentrato, che costituisce l?intermedio di lavorazione del prodotto ?MOMAST PLUS?, ed un permeato che viene recuperato per essere utilizzato nelle fasi di diafiltrazione presenti nel processo. L?intermedio di lavorazione del prodotto MOMAST viene inviato al successivo stadio di concentrazione termica sottovuoto che ha lo scopo di portare il contenuto di sostanza secca del liquido ad un valore di 45-50 brix ed una concentrazione di polifenoli noti a valori di 60-80 g/kg.

La macchina di concentrazione termica ? del tipo ad evaporazione a film cadente sottovuoto, a compressione meccanica del vapore d?acqua. Tale tipologia permette con sola energia elettrica di eliminare circa 60-80 kg/h di acqua (dipendentemente dal grado di concentrazione voluta) dal liquido da concentrare con soli 10 kW elettrici. La temperatura di evaporazione ? compresa tra 40 a 60 ?C. Il liquido concentrato uscente ? il primo prodotto finito ?MOMAST PLUS? ed ha la consistenza viscosa di sciroppo e viene stoccato in serbatoi inox con gas inerte (azoto).

Per la produzione del prodotto ?MOMAST DERMA?, il retentato ottenuto dalla Ultrafiltrazione a 1000 Da viene sottoposto ad un processo di recupero ulteriore dei polifenoli a basso peso molecolare (Idrossitirosolo e Tirosolo). Si procede con una Nanofiltrazione tangenziale a 300 Da, operando contemporaneamente un?abbondante diafiltrazione (4-5 volumi) con permeato di osmosi. In questo modo, vantaggiosamente, si estraggono nel permeato una importante frazione di molecole teoricamente con peso molecolare inferiore a 300, ancora contenute nel retentato di Ultrafiltrazione 1000 Da in ingresso a questa fase di processo. Il retentato esausto viene avviato ad operazioni di utilizzo come sottoprodotto per usi agronomici o per recupero energetico. il liquido permeato nella nanofiltrazione da 300 Da, ricco di polifenoli fisicamente selezionati ma ancora fortemente diluiti, viene inviato ad un successivo stadio di osmosi inversa, capace di disidratare parzialmente tale liquido e concentrare la sostanza secca fino ad un max di 18%, eliminando acqua priva di Sali come permeato. Dalla fase di concentrazione per osmosi si ottiene quindi un concentrato ricco di idrossitirosolo e Tirosolo ed un permeato che viene recuperato per essere utilizzato nelle fasi di diafiltrazione presenti nel processo 100. Il concentrato ottenuto viene miscelato con l?intermedio di lavorazione del Momast PLUS, con un rapporto di diluizione 1 a 5 (20% di concentrato di osmosi ed 80 % di intermedio Momast Plus), ottenendo in questo modo l?intermedio di lavorazione del Momast Derma. L?intermedio di lavorazione del MOMAST Derma viene inviato al successivo stadio di concentrazione termica sottovuoto che ha lo scopo di portare il contenuto di sostanza secca del liquido ad un valore di 45-50 brix ed una concentrazione di polifenoli a basso peso molecolare noti a valori di 70-90 g/kg.

La macchina di concentrazione termica ? del tipo ad evaporazione film cadente sottovuoto, a compressione meccanica del vapore d?acqua tale da permettere con sola energia elettrica di eliminare circa 60-80 kg/h di acqua (dipendentemente dal grado di concentrazione voluta) dal liquido da concentrare con soli 10 kW elettrici. La temperatura di esercizio ? compresa tra 40 a 60 ?C. Il liquido concentrato uscente ? il prodotto ? MOMAST DERMA? ed ha la consistenza di sciroppo e viene stoccato in serbatoi inox con gas inerte (azoto).

Secondo un aspetto dell?invenzione la linea di produzione del terzo prodotto ?MOMAST GR? consente di ottenere un complesso polifenolico in fase solida (polvere) mediante uno stadio di essiccazione del primo prodotto ?MOMAST PLUS? ottenendo un solido granulare con meno di 4% di umidit? residua.

Date le caratteristiche del primo prodotto MOMAST PLUS liquido, l?essiccazione con i metodi industriali pi? comuni (spray dryer o letto fluido), da sperimentazioni effettuate dal Richiedente, non ? risultata proficuamente praticabile. Si ? quindi studiata una nuova tecnica di essiccazione denominata Foam Drying, eseguendo vari test in laboratorio fino a determinare le migliore formulazione, per tipo e quantit? di degli eccipienti da utilizzare, e le migliori condizioni di processo.

Secondo un aspetto dell?invenzione, per consentire la formazione della schiuma e migliorare le caratteristiche di scorrevolezza, stabilit? e lavorabilit? della polvere granulare ottenuta vengono aggiunti, con riferimento al contenuto secco del ?Momast Plus? utilizzato, i seguenti eccipienti:

- Sostituto vegetale dell?albume in misura pari a 15-25% secco su secco

- Maltodestrina, in misura pari a 6-12% secco su secco

- Gomma arabica, in misura pari a 40-50% secco su secco

- Silice colloidale, in misura pari a 1,5-2,5% secco su secco

L?essiccazione avviene mediante un essiccatore appositamente realizzato del tipo double drum con velocit? dei tamburi regolabile da inverter. Il riscaldamento dell?essiccatore avviene tramite vapore che riscalda internamente i tamburi controrotanti e gas (aria o azoto) deumidificata e riscaldata a 60 ?C che circola all?esterno dei tamburi, il gas ha anche il compito di evacuare i vapori prodotti dall?essiccamento. Le temperature di lavoro sono di circa 100 ?C e tempi di permanenza di qualche secondo.

Il primo prodotto 101 ?Momast Plus? precedentemente prodotto nel medesimo impianto, secondo il processo descritto, viene additivato con gli eccipienti in modo da produrre una schiuma stabile e quindi inviato nell?essiccatore a formare, tramite un diffusore, un film sottilissimo sulla superficie dei tamburi riscaldati; nella rotazione si essiccher? in pochi secondi. Tale processo di essiccazione, denominata foam drying, permette una rapida essiccazione anche per prodotti non essiccabili con normali processi tipo spray dryer o letto fluido.

La schiuma prodotta infatti ? costituita da microbolle di gas che formano un film di interfacies sulla superficie di separazione che, per capillarit?, facilita l?eliminazione di acqua durante l?essiccamento. Il tempo di permanenza del fluido durante l?essiccamento ? variabile variando la velocit? di rotazione dei tamburi, regolando quindi il grado di umidit? residua, secondo il tipo di fluido trattato. Il gas circolante all?esterno dei tamburi (aria o azoto) viene trattato in modo che ci sia scambio termico e di massa; infatti viene riscaldato, poi raffreddato e deumidificato; tutto con il massimo recupero energetico attraverso installazione di scambiatori a tubi alettati inox per il preriscaldamento e contemporaneo preraffreddamento dello stesso gas. Il gas cos? riscaldato a 60 ?C e deumidificato, pu? da un lato convogliare il vapore che si libera dal film in essiccazione e trasportarlo fuori e dall?altro contribuire tramite diffusione (differenza di umidit? tra gas saturo al 100% a quella temperatura sulla superficie del film e umidit? quasi nulla nel gas) all?essiccamento del film solido. Il solido prodotto viene raffreddato gi? prima di essere staccato dal tamburo tramite gas freddo, in modo da aumentarne la viscosit? fino a raggiungere lo stato vetroso e facilitarne la movimentazione. Una lama fissa in materiale duro (AISI 420) permette il distacco del film dal tamburo e il convogliamento dello stesso in una coclea di trasporto fino al riempimento in sacchi per la successiva triturazione o macinazione.

L?essiccatore non ha emissioni di gas saturo all?esterno in quanto lo stesso viene deumidificato e ricircolato nell?essiccatore. I bassissimi tempi di permanenza del liquido concentrato da essiccare all?interno della macchina, permettono di ottenere un prodotto solido avente ottime caratteristiche di solubilit?, basse degradazioni di polifenoli e qualit? organolettiche simili a quelle del liquido di partenza.

Le scaglie cos? ottenute vengono successivamente triturate in un mulino in modo da ottenere una polvere granulare color ocra, scorrevole, stabile e con concentrazione polifenolica tra 60 e 100 gr/kg e grado di umidit? inferiore al 4%.

Secondo l?invenzione il complesso polifenolico, primo prodotto dell?processo di produzione e qui denominato MOMAST PLUS, ? un complesso polifenolico, allo stato fisico liquido, con contenuto in polifenoli totali dell?olivo maggiore di 60 g/kg, con la seguente composizione specifica di molecole polifenoliche: 4-6% idrossitirosolo; 0,4-1,5% tirosolo; 0,02-0,5% verbascoside; 0,0-1% oleuropeina; 0,5-3,5% altri polifenoli dell?oliva (In figura 5.a si riporta un esempio di cromatogramma).

Secondo un aspetto dell?invenzione, il complesso , secondo prodotto 102 del processo di produzione e qui denominato MOMAST GR, ? un complesso polifenolico, allo stato fisico solido in polvere, con contenuto in polifenoli totali dell?olivo maggiore di 60 g/kg, con la seguente composizione specifica di molecole polifenoliche: 4,5-7% idrossitirosolo; 0,5-2,0% tirosolo; 0,02-0,5% verbascoside; 0,0-0,1% oleuropeina; >0,5% altri polifenoli dell?oliva (In figura 5.b si riporta un esempio di cromatogramma).

Secondo un aspetto dell?invenzione, il complesso , terzo prodotto dell?processo di produzione e qui denominato MOMAST DERMA, ? un complesso polifenolico, allo stato fisico liquido, con contenuto in polifenoli totali dell?olivo maggiore di 50 g/kg, con la seguente composizione specifica di molecole polifenoliche: 4-6,5% idrossitirosolo; 0,4-2% tirosolo; 0,02-0,3% verbascoside; 0,0-1% oleuropeina; 0,5-3,0% altri polifenoli dell?oliva (In figura 5.c si riporta un esempio di cromatogramma).

Di seguito sono riportati usi preferiti dei fitocomplessi polifenolici secondo l?invenzione, supportati dagli studi specifici condotti su tali formulati e/o dai dati e studi riportati in letteratura scientifica.

Secondo un aspetto dell?invenzione il fitocomplesso ha applicazione ed uso come agente ipocolesterolemizzante per applicazioni in ambito nutraceutico e/o alimentare.

Il Richiedente ha testato in vitro il fitocomplesso MOMAST PLUS(standardizzato a concentrazione di 60 gr/kg di polifenoli totali) secondo la presente invenzione secondo il protocollo sperimentale di seguito descritto.

Lo studio ha avuto l?obiettivo principale di investigare i potenziali effetti ipocolesterolemizzanti dei composti fenolici contenuti nel prodotto MOMAST PLUS (formulazione liquida) per un potenziale uso nutraceuticosalutistico. Pi? precisamente, l?attivit? si ? focalizzata sulla investigazione della capacit? di MOMAST di modulare il metabolismo cellulare del colesterolo attraverso gli effetti di inibizione diretta dell?attivit? dell?enzima 3-idrossi-3-metilglutaril coenzima A reduttasi (HMGCoAR), noto target delle statine, terapia farmacologica di prima linea per il trattamento dell?ipercolesterolemia. Per questo motivo, lo studio ? stato condotto usando in parallelo la pravastatina, come composto attivo di riferimento. Le cellule umane epatiche HepG2 sono state scelte come sistema cellulare modello per effettuare tale studio. Il motivo principale risiede nel fatto che, il fegato ? l?organo ipocolesterolemizzante del nostro organismo, poich? esprime il maggior numero di recettori delle low density lipoproteins (LDL-R).

Pi? specificamente l?attivit? sperimentale ha permesso di:

1) valutare la capacit? di MOMAST di inibire in vitro l?attivit? dell?enzima HMGCoAR;

2) valutare la potenziale attivit? citotossica dei composti fenolici presenti in MOMAST su cellule umane epatiche HepG2 a diverse concentrazioni;

3) in base ai dati ottenuti ai punti 1 e 2, ? stato possibile selezionare la concentrazione ottimale per trattare le cellule HepG2 al fine di valutare gli effetti di MOMAST sulla modulazione del metabolismo del colesterolo intracellulare mediante esperimenti di Immunoblotting.

4) In fine, sono stati condotti esperimenti funzionali per valutare la capacit? delle cellule HepG2 di assorbire l?LDL fluorescente dall?ambiente extracellulare, confermando in vitro il meccanismo d?azione ipocolesterolemizzante.

La Figura 4.a mostra gli effetti in vitro di MOMAST sull?attivit? dell?HMGCoAR, l'enzima che gioca un ruolo chiave nella biosintesi intracellulare del colesterolo, dato che controlla la velocit? nella via di sintesi del mevalonato. Per valutare la capacit? di MOMAST di modulare l'attivit? di questo enzima, ? stata condotta un'indagine biochimica. I risultati suggeriscono chiaramente che il campione inibisce l'attivit? enzimatica con andamento doserisposta (Figura 4.a). In particolare, alle concentrazioni di 10, 50, 75, 100 e 500 ?g/mL, MOMAST inibisce l?attivit? enzimatica del 10 ? 5.2%, 34.5 ? 3.2%, 48.5 ? 0.5%, 80.2 ? 1.9% e 90 ? 0,3%, rispettivamente.

Questi risultati concordano con quelli ottenuti dalla caratterizzazione di un estratto fenolico ottenuto da EVOO della cultivar Coratina, che ? stato denominato OMN (Lammi et al., 2020 https://doi.org/10.3390/nu12061723). In breve, l'estratto di OMN riduce l'attivit? enzimatica del 18.2 ? 0.6%, 22.7 ? 6.0%, 43.3 ? 1.4% e 64.4 ? 5.4% rispettivamente a 10, 50, 100 e 250 (Lammi et al., 2020)

La Figura 4.b mostra l?effetto di MOMAST sulla vitalit? delle cellule HepG2. Pi? precisamente, sono stati condotti esperimenti di vitalit? cellulare per selezionare le concentrazioni di MOMAST potenzialmente capaci di mediare effetti citotossici sulle cellule HepG2. Dopo un trattamento di 48 ore, non ? stato osservato alcun effetto citotossico fino alla concentrazione di 50 ?g/mL rispetto alle cellule di controllo (C), suggerendo che MOMAST non ha mediato un effetto citotossico in questo intervallo di dose, mentre a 100 e 500 ?g/mL, ? stata osservata una mortalit? cellulare statisticamente significativa e pari al 47.2 ? 3.4% e 41.8 ? 13.7% (Figura 4.b). Pertanto, le seguenti indagini cellulari sono state eseguite a concentrazioni pari a 50 ?g/mL.

Successivamente, per valutare la capacit? di MOMAST di modulare il metabolismo del colesterolo, le cellule epatiche umane HepG2 sono state trattate MOMAST alla concentrazione di 50 ?g/mL e, in parallelo, con pravastatina (1 ?M) come controllo positivo. Sono stati condotti esperimenti di immunoblotting sui lisati cellulari. La Figure 3 indica chiaramente che MOMAST regola i livelli del fattore di trascrizione SREBP-2 del 142.8% ? 12.8% (p <0.0001, Figura 4.c-A). L'aumento dei livelli della proteina SREBP-2 porta da un aumento dei livelli totali della proteina recettoriale dell?LDL e di quelli della proteina enzimatica HMGCoAR fino a 156.7 ? 39.9% (p <0.01, Figura 4.c-B) e 137.4 ? 13.5% (p<0.001, Figura 4.c-C), rispettivamente.

Nella stessa serie di esperimenti, a 1 ?M, la pravastatina ha aumentato il livello della proteina SREBP-2 del 156 ? 4.6% (p <0.0001, Figura 4.c-A), la proteina LDLR del 152 ? 19.7% (p <0.05, Figura 4.c-B) e la proteina HMGCoAR del 133.4 ? 12.4% (p <0.01, Figure 4.c-C). l'analisi statistica indica che non sono state osservate differenze significative tra MOMAST e pravastatina, suggerendo lo stesso meccanismo d?azione.

La capacit? di MOMAST di modulare positivamente i livelli di proteina LDLR sulla superficie cellulare degli epatociti ? stata valutata utilizzando il saggio ICW, ovvero un dosaggio cellulare colorimetrico quantitativo che consente il rilevamento di proteine target in cellule in coltura fissate direttamente in micropiastre, utilizzando anticorpo primario specifico per il target di interesse e un anticorpo secondario coniugato con perossidasi (Lammi et al 2015, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.07.133).

La Figura 4.d suggerisce che MOMAST provoca un miglioramento dei livelli di LDLR specificamente localizzati sulla membrana cellulare degli epatociti, fino al 157.5 ? 16.2% (p <0.0001) (Figura 4.d-A). Nella stessa serie di esperimenti, a 1 ?M, la pravastatina ha aumentato l'LDLR del 127.3 ? 14.3% (p<0.001, Figura 4.d-A). Da un punto di vista funzionale, l'aumento del livello della proteina LDLR di membrana ha portato ad un aumento del 279.6 ? 40.1% (p <0,001, Figura 4.d-B) della capacit? delle cellule HepG2 di assorbire LDL dall'ambiente extracellulare dopo il trattamento con MOMAST (50 ?g/mL). Nelle stesse condizioni, la pravastatina (1 ?M) migliora la capacit? delle cellule epatiche di assorbire le LDL extracellulari del 226.9 ? 11.1% (p <0.01, Figura 4.d-B).

Alla luce dei risultati ottenuti, si pu? concludere che MOMAST ha un potenziale effetto ipocolesterolemizzante con un meccanismo d?azione simile alla statina e in accordo con quello dell'estratto fenolico EVOO di Coratina (OMN), come riportato da Lammi et al. (Lammi et al., 2020).

Ulteriori esperimenti sono stati condotti dal Richiedente al fine di valutare l?effetto di MOMAST sulla modulazione di PCSK9, un nuovo target ipocolosterolemizzante. In particolare, PCSK9 ? una proteina secreta che ? capace di legare il recettore dell?LDL attivandone la degradazione. Quindi, ridurre i livelli di PCSK9 o inibire questo target significa aumentare l?attivit? del recettore con un conseguente effetto ipocolesterolemizzante. Sulla base di queste considerazioni, le cellule HepG2 sono state trattate con MOMAST alla concentrazione di 50 ?g/mL, in parallelo, con pravastatina (1 ?M) come controllo positivo. Quindi, sono stati condotti esperimenti di immunoblotting sui lisati cellulari al fine di valutare l?effetto di MOMAST sulla modulazione dei livelli delle proteine PCSK9 e del suo fattore di trascrizione HNF1-alpha. La Figura 6 indica che MOMAST provoca una riduzione dei livelli proteici intracellulari di PCSK9 del 28?16.1% verso le cellule non trattate (p<0.01 Figure 6A), questo dato ? in accordo con la capacit? di MOMAST di ridurre i livelli del fattore di trascrizione HNF1- alpha del 30.9?24.4% rispetto alle cellule non trattate (p<0.01 Figure 6B). La pravastatina (1 ?M), invece, aumenta i livelli di questo target fino al 120.1?6.2% (p<0.5% Figure 6A) e questo ? in accordo con l?aumento del fattore di trascrizione fino a 116,7?3,4 (p<0.5, Figure 6B).

Sulla base di questi risultati, ? stato valutato l?effetto di MOMAST sulla modulazione della secrezione di PCSK9 maturo da parte delle cellule HepG2. Gli esperimenti di ELISA sono stati condotti testando in parallelo la pravastatina e i risultati hanno dimostrato che in accordo con i dati di immunoblotting, MOMAST riduce la secrezione della forma matura di PCSK9 del 28.7?4.1%, (p<0.0001, Figure 7), mentre la pravastatina aumenta la secrezione di PCSK9 fino a 119.6?1.2% (p<0.0001, Figure 7) Dai risultati ? chiaro che MOMAST ha un effetto ipocolesterolemizzante che si esplica con un meccanismo d?azione diverso dalla pravastatina. Questo rende MOMAST un prodotto interessante che con un comportamento duale ? in grado di mediare un effetto ipocolesterolemizzante sinergico superando i limiti intrinsechi al meccanismo d?azione della pravastatina.

Vantaggiosamente, la cultivar Coratina, tra le cultivar dell'albero d'ulivo, ? una delle maggiormente ricche di polifenoli e soprattutto di idrossitirosolo, le AV derivanti dalla lavorazione della cultivar Coratina sono particolarmente ricche di biofenoli pregiati, come l?idrossitirosolo, il Tirosolo ed il Verbascoside, che nel fitocomplesso secondo l?invenzione possono arrivare a costituire anche il 75-90% del contenuto fenolico totale.

Vantaggiosamente, l?invenzione comprende l?uso di sottoprodotti (Acque di Vegetazione) della lavorazione della specifica cultivar Coratina di Olea Europea, particolarmente diffusa in Puglia, per la estrazione di complessi polifenolici ad elevata purezza per contenuto di tirosolo, idrossitirosolo e derivati, mediante la specifica combinazione di processi fisici e meccanici, mediante le fasi e le apparecchiature descritte in precedenza.

Vantaggiosamente secondo l?invenzione il processo di produzione consente una importante presenza nei prodotti del polifenolo verbascoside, avente propriet? antinfiammatoria ed anche capacit? di bloccare l?attivit? e ridurre la presenza delle iNOS e COX-2. Inoltre vantaggiosamente il verbascoside pu? prevenire lo stress ossidativo, essendo dimostrato che l?inibizione dell?espressione della iNOS e COX-2 ? conseguente ad una riduzione della degradazione di IkB-? nel citosol con conseguente inattivazione di NF-kB nel nucleo.

Vantaggiosamente nei complessi polifenolici prodotti secondo l?invenzione vi ? effetto sinergico tra i polifenoli.

Inoltre, il processo di produzione 100 secondo l?invenzione, vantaggiosamente non comprende l?uso di fasi processi chimici e/o di solventi, ma esclusivamente sistemi meccanici e fisici.

Risulta infine chiaro che al processo di produzione di complessi polifenolici e ai relativi prodotti possono essere apportate modifiche e varianti senza per questo uscire dall?ambito protettivo della presente invenzione, come definito nelle rivendicazioni allegate.

Claims (11)

RIVENDICAZIONI

1. Processo produttivo (100) di complessi polifenolici da acque di vegetazione olearie con processo fermentativo caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di:

- Alimentazione e stoccaggio, in serbatoi, di acque di vegetazione olearie da cultivar coratina;

- Centrifugazione delle acque di vegetazione e separazione di una frazione residua di olio presente nelle acque di vegetazione e di una parte dei fanghi, e invio della frazione residua di olio a usi finali industriali e dei fanghi a una fase di disidratazione dei fanghi;

- Fermentazione zuccherina anaerobica di una matrice separata mediante la precedente fase di centrifugazione, in presenza di un enzima pectolitico e/o cellulasico, ad una temperatura compresa tra 35?C e 45 ?C;

- Sedimentazione ed estrazione primaria con acqua ultrapura del prodotto di fermentazione, e successivo invio del liquido chiarificato ottenuto a una fase di flottazione e dei fanghi esausti a una fase di disidratazione dei fanghi;

- Flottazione in atmosfera inerte e abbattimento di solidi leggeri del liquido chiarificato nella fase precedente di sedimentazione ed estrazione, con ottenimento di fango esausto, da inviare a una fase di disidratazione dei fanghi, e di acque di vegetazione brillantate da inviare a una fase di stoccaggio di acque di vegetazione pretrattate e brillantate;

- disidratazione dei fanghi ottenuti nelle precedenti fasi di centrifugazione, sedimentazione ed estrazione primaria e flottazione, con ottenimento di liquido estratto da inviare a stoccaggio di acque di vegetazione pretrattate e brillantate e di fango esausto disidratato di acque di vegetazione ;

- filtrazione delle acque di vegetazione pretrattate e brillantate chiarificate stoccate nella fase precedente.

2. Processo produttivo (100) secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che la fase di filtrazione delle acque di vegetazione pretrattate e brillantate comprende le fasi di:

- Microfiltrazione, con ottenimento di permeato e retentato da microfiltrazione;

- ricircolo del retentato da microfiltrazione alla fase di fermentazione anaerobica;

- ultrafiltrazione del permeato da microfiltrazione, con ottenimento di permeato e retentato da ultrafiltrazione;

- Invio del permeato di ultrafiltrazione a una prima osmosi inversa con ottenimento di permeato, costituito da acqua ultrapura, da riutilizzare nel processo e retentato, costituente un intermedio di un primo prodotto del processo;

- Recupero del retentato di ultrafiltrazione, per essere sottoposto a Nanofiltrazione, previa diafiltrazione con acqua ultrapura, con ottenimento di permeato e retentato da nanofiltrazione;

- invio del retentato a una fase di disidratazione dei fanghi;

- una seconda osmosi inversa del permeato di nanofiltrazione, con ottenimento di acqua ultrapura come permeato, da riutilizzare nel processo, e di retentato da inviare a una fase di miscelazione, per ottenere un intermedio di un terzo prodotto del processo, detta fase di miscelazione comprendendo mescolare il 20% di retentato da seconda osmosi inversa con 80% di retentato della prima osmosi inversa.

3. Processo produttivo (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere:

- una fase di evaporazione sottovuoto dell?intermedio del primo prodotto, ottenendo come concentrato un primo prodotto in fase liquida;

- una fase di essiccazione del primo prodotto con ottenimento di un secondo prodotto in polvere secca;

- una fase di evaporazione sottovuoto di un intermedio del terzo prodotto, costituito dalla miscelazione del 80% dell?intermedio del primo prodotto e del 20% del retentato da seconda osmosi inversa, con ottenimento di un terzo prodotto in fase liquida.

4. Processo produttivo (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di estrazione primaria comprende una fase di dilavamento con 2 volumi di acqua ultrapura delle acque di vegetazione fermentate, e successiva sedimentazione statica.

5. Processo produttivo (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di essiccazione per la produzione del secondo prodotto in polvere secca consiste in:

- miscelare composto liquido MOMAST ed eccipienti;

- far inglobare aria ottenendo una schiuma ;

- effettuare una fase di essiccazione per strati di circa 3-5 mm di spessore in flusso di aria calda

6. Processo di produzione secondo la rivendicazione 5 caratterizzato dal fatto che, gli eccipienti aggiunti nella fase di essiccazione sono: Sostituto vegetale dell?albume ; Maltodestrina; Gomma arabica; Silice colloidale.

7. Processo produttivo (100) secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il secondo prodotto (102) in polvere secca comprende additivi costituiti da:

- Sostituto vegetale dell?albume, in quantit? compresa tra 8% e 12% p/p

- Maltodestrina, in quantit? compresa tra 3 e 6,5% p/p - Gomma arabica, in quantit? compresa tra 20 e 30% p/p - Silice colloidale, in quantit? compresa 1,0 e 2,0% p/p.

8. Processo produttivo (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti apparecchiature di processo:

- un separatore centrifugo verticale in cui avviene la fase di disoleazione, costituito da un separatore a dischi, configurato per separare per forza centrifuga l?olio, come fase leggera, acque di vegetazione, come fase intermedia, e solidi fini pi? pesanti come fango denso;

- un reattore di fermentazione , del tipo Feed batch; - un sedimentatore Sd dotato di un circuito di raffreddamento e di un circuito di riscaldamento con circolazione di acqua glicolata;

- una apparecchiatura di flottazione con gas inerte, del tipo a gas disciolto;

- una macchina di concentrazione termica del tipo ad evaporazione a film cadente sottovuoto, a compressione meccanica del vapore d?acqua ;

- un essiccatore del tipo double drum con velocit? dei tamburi regolabile da inverter, il cui riscaldamento avviene tramite vapore che riscalda internamente tamburi controrotanti e gas deumidificata e riscaldata che circola all?esterno dei tamburi .

9. Prodotti polifenolici ottenuti mediante il processo secondo la rivendicazione 1, caratterizzati dal fatto di essere costituiti da:

- Un primo prodotto (101) liquido idoneo ad uso nutraceutico, alimentare ed industriale in genere;

- Un secondo prodotto (102) in polvere secca, idoneo all?uso nutraceutico, alimentare ed industriale in genere;

- Un terzo prodotto (103) liquido arricchito in idrossitirosolo per uso cosmetico.

10. Prodotti polifenolici secondo la rivendicazione 9 caratterizzati dal fatto che:

- detto primo prodotto (101) ? un complesso polifenolico, allo stato fisico liquido, con contenuto in polifenoli totali dell?olivo maggiore di 60 g/kg, con la seguente composizione specifica di molecole polifenoliche: 4-6% idrossitirosolo; 0,4-1,5% tirosolo; 0,02-0,5% verbascoside; 0,0-1% oleuropeina; 0,5-3,5% altri polifenoli dell?oliva;

- detto secondo prodotto (102) ? un complesso polifenolico, allo stato fisico solido in polvere, con contenuto in polifenoli totali dell?olivo maggiore di 60 g/kg, con la seguente composizione specifica di molecole polifenoliche: 4,5-7% idrossitirosolo; 0,5-2,0% tirosolo; 0,02-0,5% verbascoside; 0,0-0,1% oleuropeina; >0,5% altri polifenoli dell?oliva ;

- detto terzo prodotto (103) ? un complesso polifenolico, allo stato fisico liquido, con contenuto in polifenoli totali dell?olivo maggiore di 50 g/kg, con la seguente composizione specifica di molecole polifenoliche: 4-6,5% idrossitirosolo; 0,4-2% tirosolo; 0,02-0,3% verbascoside; 0,0-1% oleuropeina; 0,5-3,0% altri polifenoli dell?oliva.

11. Prodotti polifenolici secondo la rivendicazione 9, caratterizzati dal fatto di avere effetto ipocolesterolemizzante.