JPH0832636B2 - 肝炎ｂ型抗原組成物およびそれから誘導した肝炎ｂ型に対するワクチン - Google Patents
肝炎ｂ型抗原組成物およびそれから誘導した肝炎ｂ型に対するワクチンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はワクチンまたはワクチン中間体として有用な
粒子の溶液または懸濁液に関する。さらに詳しく述べる
と、本発明は免疫原性の高い新規な形態の粒子を保有す
る肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）に関する。本発明はその
ような粒子の生成方法および肝炎Ｂ型ウィルス（HBV）
に対して動物、例えばヒトおよびチンパンジーに免疫を
与える方法におけるそれらの使用に関する。
粒子の溶液または懸濁液に関する。さらに詳しく述べる
と、本発明は免疫原性の高い新規な形態の粒子を保有す
る肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）に関する。本発明はその
ような粒子の生成方法および肝炎Ｂ型ウィルス（HBV）
に対して動物、例えばヒトおよびチンパンジーに免疫を
与える方法におけるそれらの使用に関する。
肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）として現在述べられてい
ることと肝炎Ｂ型ウィルスとの関係は、アルフレッド・
Ｍ・プリンス（Alfred M.Prince）によって何年も前に
明確に確立されている〔プロ・ナショ・アカデ・サイ
（ユー・エス）（Pro.Nat.Acad.Sci（U.S.）60:814-82
1,1968〕。この抗原は約18〜24nmの粒度を有するリポ蛋
白粒子および同様な直径を有するフィラメントの膜内に
内在する蛋白質上において主に見い出される。これらは
HBVのビリオンを包囲しているものと同様な膜のフィラ
メントに相当することが知られており、また「デーン
（Dane）」粒子としても知られている。
ることと肝炎Ｂ型ウィルスとの関係は、アルフレッド・
Ｍ・プリンス（Alfred M.Prince）によって何年も前に
明確に確立されている〔プロ・ナショ・アカデ・サイ
（ユー・エス）（Pro.Nat.Acad.Sci（U.S.）60:814-82
1,1968〕。この抗原は約18〜24nmの粒度を有するリポ蛋
白粒子および同様な直径を有するフィラメントの膜内に
内在する蛋白質上において主に見い出される。これらは
HBVのビリオンを包囲しているものと同様な膜のフィラ
メントに相当することが知られており、また「デーン
（Dane）」粒子としても知られている。
その後、このような粒子を含むワクチンはブルムバー
グ（Blumberg）等の米国特許第3,636,191号に開示され
た。さらにその後、プリンスおよび他の人々によって、
デーン粒子およびフィラメントから誘導した膜蛋白を含
む他の肝炎Ｂ型ウィルスワクチンが開示された。これら
のデーン粒子およびフィラメントは肝炎Ｂ型ウィルスの
多くの慢性保菌者内に見い出された肝炎Be抗原を含んで
おり、またはこれらと一体化されていた。
グ（Blumberg）等の米国特許第3,636,191号に開示され
た。さらにその後、プリンスおよび他の人々によって、
デーン粒子およびフィラメントから誘導した膜蛋白を含
む他の肝炎Ｂ型ウィルスワクチンが開示された。これら
のデーン粒子およびフィラメントは肝炎Ｂ型ウィルスの
多くの慢性保菌者内に見い出された肝炎Be抗原を含んで
おり、またはこれらと一体化されていた。
上記研究が行われて以来、肝炎Ｂ型ウィルスに対する
ワクチンがHBsAg粒子と共に米国に紹介されるようにな
った。上記の米国特許第3,636,191号に多少述べられて
いるように、このワクチンは慢性的に感染している。HB
V保菌者の血漿から誘導された粒子を含むHBsAgの酵素消
化によって作られている。このワクチンはかなりの免疫
損失を伴う高価な精製方法によって製造されている。こ
の結果、充分な免疫応答を得るためには、得られた抗原
（HBsAg）を比較的多量に投与しなければならない。こ
のためワクチンを入手するためには、約30.00ドル／服
用量以上の比較的高い費用を支払わなければならなかっ
た。米国において肝炎Ｂ型ウィルスに対する免疫を得る
ためには、最初の注射および２回のブースターが要求さ
れるので、現在約100.00ドルの費用がかかり、このワク
チンが最も必要な世界の国々においては上記費用は支払
い不可能な額である。
ワクチンがHBsAg粒子と共に米国に紹介されるようにな
った。上記の米国特許第3,636,191号に多少述べられて
いるように、このワクチンは慢性的に感染している。HB
V保菌者の血漿から誘導された粒子を含むHBsAgの酵素消
化によって作られている。このワクチンはかなりの免疫
損失を伴う高価な精製方法によって製造されている。こ
の結果、充分な免疫応答を得るためには、得られた抗原
（HBsAg）を比較的多量に投与しなければならない。こ
のためワクチンを入手するためには、約30.00ドル／服
用量以上の比較的高い費用を支払わなければならなかっ
た。米国において肝炎Ｂ型ウィルスに対する免疫を得る
ためには、最初の注射および２回のブースターが要求さ
れるので、現在約100.00ドルの費用がかかり、このワク
チンが最も必要な世界の国々においては上記費用は支払
い不可能な額である。
従って、ずっと少ない投与量で安価に使用することが
できるように、著しく高い免疫原性を有するほとんど純
粋な形で肝炎Ｂ型表面抗原を含む肝炎Ｂ型ワクチンを提
供することが望まれていた。もちろん開始血漿中に存在
する伝染性ウィルスを完全に不活性化して伝染の危険性
をなくすことも必須の要件である。
できるように、著しく高い免疫原性を有するほとんど純
粋な形で肝炎Ｂ型表面抗原を含む肝炎Ｂ型ワクチンを提
供することが望まれていた。もちろん開始血漿中に存在
する伝染性ウィルスを完全に不活性化して伝染の危険性
をなくすことも必須の要件である。
肝炎Ｂ型の大部分は公衆衛生措置の資金が限られてい
るアジアおよびアフリカにおける発展途上国の人々に感
染している。肝炎Ｂ型ウィルスの感染、その結果による
肝硬変および肝臓癌に発達する危険性にさらされている
多くの人々を救済するために、そのようなワクチンを提
供すること、およびこのワクチンを安価に提供すること
はこの20世紀における義務である。発展途上国の多くの
地方においては、ワクチンを使用する必要がある場合、
免疫に要する費用は１人あたり1.00ドル未満でなければ
ならない。
るアジアおよびアフリカにおける発展途上国の人々に感
染している。肝炎Ｂ型ウィルスの感染、その結果による
肝硬変および肝臓癌に発達する危険性にさらされている
多くの人々を救済するために、そのようなワクチンを提
供すること、およびこのワクチンを安価に提供すること
はこの20世紀における義務である。発展途上国の多くの
地方においては、ワクチンを使用する必要がある場合、
免疫に要する費用は１人あたり1.00ドル未満でなければ
ならない。
上記事項に従って、本発明によれば天然には決して見
られない新規な形態（morphology）を有する形に著しく
形質転換（transform）され、かつ驚くほど免疫原性が
高められたHBs抗原を含む粒子から成るワクチンまたは
ワクチン中間体が提供される。本発明のワクチンは、カ
プリル酸ナトリウムで安定化したヒト血清アルブミン以
外の血清蛋白が５重量パーセント未満の量で存在するこ
とを特徴としており、かつこのワクチンは血清蛋白を本
質的に含有しないことが好ましい。
られない新規な形態（morphology）を有する形に著しく
形質転換（transform）され、かつ驚くほど免疫原性が
高められたHBs抗原を含む粒子から成るワクチンまたは
ワクチン中間体が提供される。本発明のワクチンは、カ
プリル酸ナトリウムで安定化したヒト血清アルブミン以
外の血清蛋白が５重量パーセント未満の量で存在するこ
とを特徴としており、かつこのワクチンは血清蛋白を本
質的に含有しないことが好ましい。
精製後に残存している恐れのあるウィルスを不活性化
するためにフラッシュ加熱の特別な方法を用いると、チ
ンパンジーの試験によって測定されたようにウィルスを
不活性化するのみならず、かなりの割合の粒子が新規な
形態に変質するということが発見された。これら新規な
形態は、加熱段階前には存在しなかった直径15〜30nmの
フィラメント状形態から成っている。これらフィラメン
ト形態には第１図および電子顕微鏡写真に図示されてい
る新規な形態がある。これらの形態には多数の変形の直
線状フィラメント、閉鎖状、即ち環状フィラメントおよ
び枝分れフィラメントがある。
するためにフラッシュ加熱の特別な方法を用いると、チ
ンパンジーの試験によって測定されたようにウィルスを
不活性化するのみならず、かなりの割合の粒子が新規な
形態に変質するということが発見された。これら新規な
形態は、加熱段階前には存在しなかった直径15〜30nmの
フィラメント状形態から成っている。これらフィラメン
ト形態には第１図および電子顕微鏡写真に図示されてい
る新規な形態がある。これらの形態には多数の変形の直
線状フィラメント、閉鎖状、即ち環状フィラメントおよ
び枝分れフィラメントがある。
一般的に言って、そのような奇妙なフィラメント構造
を有する粒子を含むHBsAgの割合は、電子顕微鏡検査に
よれば15〜75％である。好ましい場合、これら新規なフ
ィラメント構造に変換された粒子を含むHBsAgは、これ
ら粒子を含めたHBsAg全体の50％以上を占める。
を有する粒子を含むHBsAgの割合は、電子顕微鏡検査に
よれば15〜75％である。好ましい場合、これら新規なフ
ィラメント構造に変換された粒子を含むHBsAgは、これ
ら粒子を含めたHBsAg全体の50％以上を占める。
本発明のワクチンはさらにそれを製造する方法に特徴
を有する。一般的に言って、上記ワクチンは次の段階に
よって製造される： A.HBsAgを含む血漿例えばヒトの血漿をポリエチレング
リコールと接触させて、その中に含まれる他の血清蛋白
からHBsAgを分離させることにより血漿からHBsAgを沈澱
させ； B.そのように分離したHBsAgの負吸着を水酸燐灰石上で
行い、血清蛋白の大部分をさらに除去し； C.そのように吸着したHBsAgを等密度遠心法で処理し
て、残存する未処理デーン粒子を分離するとともにわず
かに残存している混入血清蛋白をさらに除去し； D.上記遠心法によってそのように分離した粒子0.5〜10m
g/mlの濃度で101〜105℃の温度で１〜15分間加熱するこ
とにより上記粒子に対して熱不活性化を行い、その後、
例えばそれらを氷水浴に導入することにより加熱粒子を
冷却することによって生成される。
を有する。一般的に言って、上記ワクチンは次の段階に
よって製造される： A.HBsAgを含む血漿例えばヒトの血漿をポリエチレング
リコールと接触させて、その中に含まれる他の血清蛋白
からHBsAgを分離させることにより血漿からHBsAgを沈澱
させ； B.そのように分離したHBsAgの負吸着を水酸燐灰石上で
行い、血清蛋白の大部分をさらに除去し； C.そのように吸着したHBsAgを等密度遠心法で処理し
て、残存する未処理デーン粒子を分離するとともにわず
かに残存している混入血清蛋白をさらに除去し； D.上記遠心法によってそのように分離した粒子0.5〜10m
g/mlの濃度で101〜105℃の温度で１〜15分間加熱するこ
とにより上記粒子に対して熱不活性化を行い、その後、
例えばそれらを氷水浴に導入することにより加熱粒子を
冷却することによって生成される。
上記の段階ＡからＣは重要である。なぜならば熱処理
を受ける原料塊が５重量パーセント未満の他の血清蛋白
を含むように、これら段階によりHBsAgを精製するから
である。言い換えると、熱処理を受ける原料塊は蛋白質
の全量に対して少なくとも95％、好ましくは99％以上の
HBsAg粒子を含む。好ましい場合、HBsAgは他の蛋白質で
希釈されることはないが、カプリル酸ナトリウムで処理
したアルブミンを追加の安定剤として加えてもよい。理
想的には、加熱不活性化段階（Ｄ段階）において処理さ
れる組成物はその純度、特に他の血漿蛋白を含まない点
を特徴としている。
を受ける原料塊が５重量パーセント未満の他の血清蛋白
を含むように、これら段階によりHBsAgを精製するから
である。言い換えると、熱処理を受ける原料塊は蛋白質
の全量に対して少なくとも95％、好ましくは99％以上の
HBsAg粒子を含む。好ましい場合、HBsAgは他の蛋白質で
希釈されることはないが、カプリル酸ナトリウムで処理
したアルブミンを追加の安定剤として加えてもよい。理
想的には、加熱不活性化段階（Ｄ段階）において処理さ
れる組成物はその純度、特に他の血漿蛋白を含まない点
を特徴としている。
しかしながら段階ＡからＣの生成物に対する熱活性化
段階は、ワクチンの安全性に寄与するのみならず、ワク
チンの免疫原性を極端に著しく高めるものである。この
不活性化段階は、2.5〜6.0分の全滞留時間の間、段階Ｃ
から得られた精製粒子溶液を101〜104℃の熱媒体（油
浴）に浸漬した直径2mmの管（例えば青銅またはステン
レススチール製）に通過させることにより101〜104℃の
温度で行うことが好ましい。加熱した溶液のHBsAg蛋白
濃度は0.1〜10mg/ml好ましくは約0.5〜6.0mg/mlでなけ
ればならず、このことは本発明にとって重要なことであ
る。注意すべきこととして、上記方法を実施する場合、
管内部の溶液を101〜104℃に加熱するためには、いくら
かの時間が必要であり、従って「全滞留時間」は溶液が
実際に101〜104℃で加熱される時間よりも長くなる。も
ちろん、この滞留時間は流量によって異なってくる。
段階は、ワクチンの安全性に寄与するのみならず、ワク
チンの免疫原性を極端に著しく高めるものである。この
不活性化段階は、2.5〜6.0分の全滞留時間の間、段階Ｃ
から得られた精製粒子溶液を101〜104℃の熱媒体（油
浴）に浸漬した直径2mmの管（例えば青銅またはステン
レススチール製）に通過させることにより101〜104℃の
温度で行うことが好ましい。加熱した溶液のHBsAg蛋白
濃度は0.1〜10mg/ml好ましくは約0.5〜6.0mg/mlでなけ
ればならず、このことは本発明にとって重要なことであ
る。注意すべきこととして、上記方法を実施する場合、
管内部の溶液を101〜104℃に加熱するためには、いくら
かの時間が必要であり、従って「全滞留時間」は溶液が
実際に101〜104℃で加熱される時間よりも長くなる。も
ちろん、この滞留時間は流量によって異なってくる。
配慮すべきこととして、溶液の温度を100℃以上にす
る時、連続流のフラッシュ加熱は溶液の気化を防止する
ために高圧の下で行わなければならない。このことは高
圧液体クロマトグラフィーポンプおよび受器から発する
静水圧ヘッドを用いることにより容易に行われる。
る時、連続流のフラッシュ加熱は溶液の気化を防止する
ために高圧の下で行わなければならない。このことは高
圧液体クロマトグラフィーポンプおよび受器から発する
静水圧ヘッドを用いることにより容易に行われる。
任意であるが、追加の不活性化は段階Ｃからの精製抗
原をトウィーン（Tween）80のような洗浄剤で処理する
ことにより、例えば２％のトウィーン80水溶液の等量を
加えることにより行うことができる。この処理はワクチ
ンの安全性をさらに高めるものである。しかしながら不
活性化工程において洗浄剤処理を行わなくとも免疫性の
高い生成物が得られる時には、洗浄剤処理を行わない方
がよい。
原をトウィーン（Tween）80のような洗浄剤で処理する
ことにより、例えば２％のトウィーン80水溶液の等量を
加えることにより行うことができる。この処理はワクチ
ンの安全性をさらに高めるものである。しかしながら不
活性化工程において洗浄剤処理を行わなくとも免疫性の
高い生成物が得られる時には、洗浄剤処理を行わない方
がよい。
フラッシュ加熱不活性化段階に続いて、回復し、精製
しおよびウィルスを不活性化した粒子溶液は、所望なら
ば、燐酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムゲルに
対する吸着によってアジュバント処理される。熱帯地方
において使用する場合、所望ならば、ミョウバンゲルの
添加に先立ってワクチンを凍結乾燥し、再水和後ミョウ
バンゲルを加えることは望ましいことである。
しおよびウィルスを不活性化した粒子溶液は、所望なら
ば、燐酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムゲルに
対する吸着によってアジュバント処理される。熱帯地方
において使用する場合、所望ならば、ミョウバンゲルの
添加に先立ってワクチンを凍結乾燥し、再水和後ミョウ
バンゲルを加えることは望ましいことである。
その後、溶液は0.15モルのNaClのような生理学的に問
題のない媒体で希釈することにより最終ワクチンとして
仕上げられる。
題のない媒体で希釈することにより最終ワクチンとして
仕上げられる。
安全性を最終的に確実なものとするために、最終バル
クまたは最終容器内においてミョウバンに吸着されたワ
クチンをさらに熱不活性化処理、即ち65℃で10〜18時間
処理することは望ましいことである。この最終「低温殺
菌法」段階は、チンパンジーの研究からHBVの約１万感
染量を不活性化することができることが知られており、
かつこの殺菌法はワクチンの免疫原性に対しては、殆
ど、またはまったく影響を及ぼさないものである。
クまたは最終容器内においてミョウバンに吸着されたワ
クチンをさらに熱不活性化処理、即ち65℃で10〜18時間
処理することは望ましいことである。この最終「低温殺
菌法」段階は、チンパンジーの研究からHBVの約１万感
染量を不活性化することができることが知られており、
かつこの殺菌法はワクチンの免疫原性に対しては、殆
ど、またはまったく影響を及ぼさないものである。
最終ワクチンにおいて、HBsAgを含む蛋白質濃度は0.1
〜10μg/mlである。注射による望ましい投与量はレシピ
エントの年齢によって決定される。大人の男性の場合、
HBsAgの一般的な投与量は１〜10μｇであり、筋肉内、
皮下または皮肉に注入される。
〜10μg/mlである。注射による望ましい投与量はレシピ
エントの年齢によって決定される。大人の男性の場合、
HBsAgの一般的な投与量は１〜10μｇであり、筋肉内、
皮下または皮肉に注入される。
次に第２図に従って本発明を説明する。通常、HBsAg
を含み、好ましくはさらに肝炎Be抗原（HBeAg）を含む1
00リットルの血漿をpH4.6に調整処理し、連続流遠心分
離機を用いて３〜８％の濃度のポリエチレングリコール
（分子量2,000〜8,000）で清澄化し、沈殿物を生成す
る。この沈殿物はHBsAgを含む粒子を含有している。他
の血清蛋白を含む上澄み液は除去され、沈殿物は蒸留水
を加えて容量を24リットルとし、かつpHを7.5〜8.0に調
節することにより再溶解される。次に溶液をpH5.0に調
節し、得られた沈殿物を除去する。
を含み、好ましくはさらに肝炎Be抗原（HBeAg）を含む1
00リットルの血漿をpH4.6に調整処理し、連続流遠心分
離機を用いて３〜８％の濃度のポリエチレングリコール
（分子量2,000〜8,000）で清澄化し、沈殿物を生成す
る。この沈殿物はHBsAgを含む粒子を含有している。他
の血清蛋白を含む上澄み液は除去され、沈殿物は蒸留水
を加えて容量を24リットルとし、かつpHを7.5〜8.0に調
節することにより再溶解される。次に溶液をpH5.0に調
節し、得られた沈殿物を除去する。
その後、組成物はpHを3.5〜5.0、最適値としては4.6
に調節した後、ポリエチレングリコール（分子量2.000
〜8.000）で処理され、ポリエチレングリコールの含有
量を2.5〜６重量パーセントに調節して、HBsAgを含む第
２沈殿物を生成する。この沈殿物から残留血清蛋白を含
む上澄み液を除去する。第２沈殿物はpH5.0の沈殿段階
の後、上記のごとく蒸留水を加えてpH6.0から8.0、理想
的な値としてはpH6.8に調節され、全容量を８リットル
にすることにより溶解される。
に調節した後、ポリエチレングリコール（分子量2.000
〜8.000）で処理され、ポリエチレングリコールの含有
量を2.5〜６重量パーセントに調節して、HBsAgを含む第
２沈殿物を生成する。この沈殿物から残留血清蛋白を含
む上澄み液を除去する。第２沈殿物はpH5.0の沈殿段階
の後、上記のごとく蒸留水を加えてpH6.0から8.0、理想
的な値としてはpH6.8に調節され、全容量を８リットル
にすることにより溶解される。
pH6.8の0.005M燐酸塩緩衝液のHBsAg含有溶液は、次に
充填水酸燐灰石と接触される。さらに上澄み液は0.02お
よび0.05M燐酸塩緩衝液とともに濾過により0.3リットル
まで濃縮され、さらに浮遊等密度帯状遠心法により処理
される。
充填水酸燐灰石と接触される。さらに上澄み液は0.02お
よび0.05M燐酸塩緩衝液とともに濾過により0.3リットル
まで濃縮され、さらに浮遊等密度帯状遠心法により処理
される。
この段階において、濃縮したHBsAgは固体KBrで1.23〜
1.30g/mlの密度に調節され、かつ1.3〜2g/mlクッション
上における直線状の1.05〜1.2g/ml KBr勾配の下でロー
ターに力学的に充填される。この勾配は25,000〜35,000
RPMで16〜24時間遠心分離機にかけ、ローターの中央に
ポンプで水を導入することにより分別される。1.17〜1.
22g/mlの密度に相当する画分は貯蔵される。
1.30g/mlの密度に調節され、かつ1.3〜2g/mlクッション
上における直線状の1.05〜1.2g/ml KBr勾配の下でロー
ターに力学的に充填される。この勾配は25,000〜35,000
RPMで16〜24時間遠心分離機にかけ、ローターの中央に
ポンプで水を導入することにより分別される。1.17〜1.
22g/mlの密度に相当する画分は貯蔵される。
得られた画分は標準食塩水で１〜10リットルの容量に
調整され、HBsAgを0.5〜10mg/mlの濃度に希釈する。そ
の後、溶液は場合により１〜３重量パーセントの濃度
で、等量のトウィーン80洗浄剤または他の両性イオン洗
浄剤の水溶液で処理することができる。HBsAg含有塊は
４〜25℃で0.5〜24時間洗浄剤と接触状態に置いてもよ
い。
調整され、HBsAgを0.5〜10mg/mlの濃度に希釈する。そ
の後、溶液は場合により１〜３重量パーセントの濃度
で、等量のトウィーン80洗浄剤または他の両性イオン洗
浄剤の水溶液で処理することができる。HBsAg含有塊は
４〜25℃で0.5〜24時間洗浄剤と接触状態に置いてもよ
い。
その後、組成物は0.22ミクロンのフィルターを通して
濾過され、かつ上記組成物は上記において述べたように
加圧下102〜105℃に保持されている油浴中における0.1
〜10mm、場合により１〜3mmの直径を有するステンレス
スチール管を通過させながら、101〜105℃で１〜15分
間、場合により２〜５分間加熱不活性化処理される。上
記圧力は沸騰を防止するのに充分高くなければならず、
即ち800〜1000mmHg、特に900〜1000mmHgでなければなら
ない。
濾過され、かつ上記組成物は上記において述べたように
加圧下102〜105℃に保持されている油浴中における0.1
〜10mm、場合により１〜3mmの直径を有するステンレス
スチール管を通過させながら、101〜105℃で１〜15分
間、場合により２〜５分間加熱不活性化処理される。上
記圧力は沸騰を防止するのに充分高くなければならず、
即ち800〜1000mmHg、特に900〜1000mmHgでなければなら
ない。
このように加熱された塊は、次に例えば氷水浴中にお
ける容器に入れることにより冷却される。一般に加熱処
理の終了後、２〜４℃までの冷却が５分以内の間行われ
る。しかしながら、20〜100℃、特に75〜90℃の誘導温
度で浴セット中における第２コイルに溶液を通過させ、
最適結果を得ることもできる。
ける容器に入れることにより冷却される。一般に加熱処
理の終了後、２〜４℃までの冷却が５分以内の間行われ
る。しかしながら、20〜100℃、特に75〜90℃の誘導温
度で浴セット中における第２コイルに溶液を通過させ、
最適結果を得ることもできる。
精製されかつフラッシュ加熱不活性化されたHBsAg含
有原料は次に燐酸アルミニウムアジュバントを用いて好
適に処理される。一般的に、予備滅菌された燐酸アルミ
ニウムは無菌条件の下で不活性化され、希釈された抗原
に加えられ、希釈された抗原の1ml当り0.3〜0.6mgの燐
酸アルミニウムの濃度とする。その後、アジュバント処
理された組成物は適当な容器に無菌充填される。最終容
器は追加の滅菌段階として65℃（「低温殺菌法」）で10
時間さらに保持されて、最終生成物の安全性をさらに確
実なものとする。ワクチンは免疫処理のために使用され
る前に、３年以内の間２〜６℃の温度に保持される。
有原料は次に燐酸アルミニウムアジュバントを用いて好
適に処理される。一般的に、予備滅菌された燐酸アルミ
ニウムは無菌条件の下で不活性化され、希釈された抗原
に加えられ、希釈された抗原の1ml当り0.3〜0.6mgの燐
酸アルミニウムの濃度とする。その後、アジュバント処
理された組成物は適当な容器に無菌充填される。最終容
器は追加の滅菌段階として65℃（「低温殺菌法」）で10
時間さらに保持されて、最終生成物の安全性をさらに確
実なものとする。ワクチンは免疫処理のために使用され
る前に、３年以内の間２〜６℃の温度に保持される。
上記に述べた方法でHBsAgを精製し、かつ0.1〜10mg/m
lの濃度で粒子を含む比較的純粋なHBsAgを上記のように
熱処理すると、普通の形状ではないHBsAg粒子が第４図
から第７図に示されているように生成される。最初のHB
sAg含有粒子は通常球形であり、大部分18〜24nmの大き
さを有しているが（第３図）、本発明の方法により製造
された粒子は特に第１図、第４図および第６図に見られ
るように、種々の形態を有するフィラメントに殆ど変形
されている。第４図から第７図、特に第５図には、これ
までに見たことのない特に著しく変形されたフィラメン
トが示されている。HBsAg抗原性を含むそのようなフィ
ラメントは枝分れまたは環形状によって特徴づけられて
いる。これらの形状は曲線状または直線状である。一般
的に言って、フィラメントは少なくとも50nmの長さを有
し、通常100〜1000nmである。
lの濃度で粒子を含む比較的純粋なHBsAgを上記のように
熱処理すると、普通の形状ではないHBsAg粒子が第４図
から第７図に示されているように生成される。最初のHB
sAg含有粒子は通常球形であり、大部分18〜24nmの大き
さを有しているが（第３図）、本発明の方法により製造
された粒子は特に第１図、第４図および第６図に見られ
るように、種々の形態を有するフィラメントに殆ど変形
されている。第４図から第７図、特に第５図には、これ
までに見たことのない特に著しく変形されたフィラメン
トが示されている。HBsAg抗原性を含むそのようなフィ
ラメントは枝分れまたは環形状によって特徴づけられて
いる。これらの形状は曲線状または直線状である。一般
的に言って、フィラメントは少なくとも50nmの長さを有
し、通常100〜1000nmである。
フィラメント状構造が枝分れしている時、枝分れ部分
の構造は少なくとも50nm、しばしば100〜300nmの長さを
有する。本発明の方法によって得られるフィラメントの
いくつかは、１つのフィラメント構造に対して少なくと
も３つの枝を有し、かつ不規則な形状を有しており、そ
の最小の長さは少なくとも100nmであり、好ましくは200
〜1000nmである。そのような枝分れまたは円形（環状）
フィラメントは、フラッシュ熱処理を受けない血清誘導
誘導HBsAg含有粒子において決して見ることができない
ものであり、このことは強調すべきことである。
の構造は少なくとも50nm、しばしば100〜300nmの長さを
有する。本発明の方法によって得られるフィラメントの
いくつかは、１つのフィラメント構造に対して少なくと
も３つの枝を有し、かつ不規則な形状を有しており、そ
の最小の長さは少なくとも100nmであり、好ましくは200
〜1000nmである。そのような枝分れまたは円形（環状）
フィラメントは、フラッシュ熱処理を受けない血清誘導
誘導HBsAg含有粒子において決して見ることができない
ものであり、このことは強調すべきことである。
第４図から第７図の電子顕微鏡写真において、本発明
のHBsAg含有粒子としては環状形粒子、枝分れフィラメ
ントおよび直線形フィラメント状粒子ならびに直径16〜
25nmの球形HBsAg粒子があることが観察される。
のHBsAg含有粒子としては環状形粒子、枝分れフィラメ
ントおよび直線形フィラメント状粒子ならびに直径16〜
25nmの球形HBsAg粒子があることが観察される。
新規な形態学的形状としては、突出状のフィラメント
状部分を有する環状形粒子がある。フィラメント状粒子
は通常少なくとも50nmの長さを有し、一般的に100〜300
nmの長さを有する。
状部分を有する環状形粒子がある。フィラメント状粒子
は通常少なくとも50nmの長さを有し、一般的に100〜300
nmの長さを有する。
洗浄剤処理を用いる時、枝分れしていないフィラメン
トは20℃で1.210〜1.230Gm/cc（平均1.224Gm/cc）の密
度を有することを特徴とし、従っていわゆるデーン粒子
および／または混入フィラメントを有する慢性HBsAg保
菌者の血漿内に見られる枝分れしていないフィラメント
と区別される。後者のフィラメントは1.200の平均密度
を有する。
トは20℃で1.210〜1.230Gm/cc（平均1.224Gm/cc）の密
度を有することを特徴とし、従っていわゆるデーン粒子
および／または混入フィラメントを有する慢性HBsAg保
菌者の血漿内に見られる枝分れしていないフィラメント
と区別される。後者のフィラメントは1.200の平均密度
を有する。
「環状形」粒子としては、ほとんど完全な円形または
環状形ならびにほぼ密閉状のものを生成する粒子があ
る。包囲状のHBsAg含有塊によって区画される領域は長
円形またはドーナツ形を含む任意の形であり、即ちその
領域は規則的または不規則的な形状を有することができ
る。
環状形ならびにほぼ密閉状のものを生成する粒子があ
る。包囲状のHBsAg含有塊によって区画される領域は長
円形またはドーナツ形を含む任意の形であり、即ちその
領域は規則的または不規則的な形状を有することができ
る。
上記新規な形態学的形状は以前に述べたミセル状粒子
とは全く異なっている。後者のミセル状粒子はポリペプ
チド鎖の疎水性端部から成る中央ハブを特徴としてお
り、このペプチド鎖の親水性部分はほぼ球形の粒子の表
面上に延びている。しかしながら本発明によって製造さ
れたフィラメントは中央ハブに接続されていない。フィ
ラメントのいくつかは不規則な環状形をしており、これ
ら自身突出状のフィラメントを有している。しかしなが
ら通常そのような突出状フィラメントは３つ以下であ
り、通常２つまたは単に１つである。もちろん本発明の
粒子は外側に突出するフィラメントを有する濃密な芯部
を有していない。
とは全く異なっている。後者のミセル状粒子はポリペプ
チド鎖の疎水性端部から成る中央ハブを特徴としてお
り、このペプチド鎖の親水性部分はほぼ球形の粒子の表
面上に延びている。しかしながら本発明によって製造さ
れたフィラメントは中央ハブに接続されていない。フィ
ラメントのいくつかは不規則な環状形をしており、これ
ら自身突出状のフィラメントを有している。しかしなが
ら通常そのような突出状フィラメントは３つ以下であ
り、通常２つまたは単に１つである。もちろん本発明の
粒子は外側に突出するフィラメントを有する濃密な芯部
を有していない。
本発明および本発明を実施する方法をさらに充分説明
するために、次の実施例を提示する。
するために、次の実施例を提示する。
実施例１ 慢性HBsAg保菌者から得られたHBeAgおよびHBsAgの両
方を含む貯蔵血漿が、pH4.6に調整し、ウェストファリ
ア（Westphalia）連続流遠心分離機において10.000RPM
で清澄される。清澄した上澄み液は最終濃度４％PEG600
0に４℃で調整し、20分間撹拌される。沈殿物が遠心分
離によらず２時間沈降させることにより回収され、pHを
7.5〜8.0に調整することによって最初の容量の1/5の蒸
留水で溶解した。次にpHが5.0まで下げられ、得られた
沈殿物を遠心分離により回収する。次に上澄み液のpHが
4.6に調整され、PEGが加えられ最終濃度を３％にする。
方を含む貯蔵血漿が、pH4.6に調整し、ウェストファリ
ア（Westphalia）連続流遠心分離機において10.000RPM
で清澄される。清澄した上澄み液は最終濃度４％PEG600
0に４℃で調整し、20分間撹拌される。沈殿物が遠心分
離によらず２時間沈降させることにより回収され、pHを
7.5〜8.0に調整することによって最初の容量の1/5の蒸
留水で溶解した。次にpHが5.0まで下げられ、得られた
沈殿物を遠心分離により回収する。次に上澄み液のpHが
4.6に調整され、PEGが加えられ最終濃度を３％にする。
４℃で一晩沈降した後、沈殿物が中和により再溶解さ
れ、この懸濁液は上記のようにpHを5.0に下げた後、清
澄される。この材料はpH6.8に調整され、0.005M燐酸塩
緩衝液の添加後、等量の充填水酸燐灰石で２〜３回連続
吸着することによりさらに精製される。その後、水酸燐
灰石沈降物が0.02および0.05Mの燐酸塩緩衝液で洗浄さ
れる。最後に、最初の上澄み液および水酸燐灰石沈降物
の洗浄物が貯蔵され、遠心分離により清澄され、アミコ
ン（Amicon）中空繊維カートリッジで最初の血漿の容量
の約0.3％まで濃縮される。濃縮したHBsAgは次に固体の
KBrで1.25mg/mlの密度に調節され、1.3g/mlクッション
上において直線状1.05〜1.2g/ml KBr勾配の下でベック
マン（Beckman）Ti-14ローター内に充填される。この勾
配は28,000rpmで18時間遠心分離され、ローターの中央
にポンプで水を供給することにより分別される。1.17〜
1.22g/mlの密度に相当する画分が貯蔵される。
れ、この懸濁液は上記のようにpHを5.0に下げた後、清
澄される。この材料はpH6.8に調整され、0.005M燐酸塩
緩衝液の添加後、等量の充填水酸燐灰石で２〜３回連続
吸着することによりさらに精製される。その後、水酸燐
灰石沈降物が0.02および0.05Mの燐酸塩緩衝液で洗浄さ
れる。最後に、最初の上澄み液および水酸燐灰石沈降物
の洗浄物が貯蔵され、遠心分離により清澄され、アミコ
ン（Amicon）中空繊維カートリッジで最初の血漿の容量
の約0.3％まで濃縮される。濃縮したHBsAgは次に固体の
KBrで1.25mg/mlの密度に調節され、1.3g/mlクッション
上において直線状1.05〜1.2g/ml KBr勾配の下でベック
マン（Beckman）Ti-14ローター内に充填される。この勾
配は28,000rpmで18時間遠心分離され、ローターの中央
にポンプで水を供給することにより分別される。1.17〜
1.22g/mlの密度に相当する画分が貯蔵される。
精製した抗原は1mg/ml の濃度に調節され、等容量の２％トウィーン80洗浄剤で
希釈される。この洗浄剤処理はデーン粒子から外側被膜
を除去し、従ってこれら粒子を非伝染性とする。それが
また若干の脂質の除去の結果、残留粒子の水性密度を平
均1.200g/mlから1.224g/mlに変換する。室温で１時間放
置後、上記溶液は0.22ミクロンミリポア（Millipore）
フィルターを通して濾過される。その後精製した抗原は
950mmHg圧力の下で102℃の温度に保持されている油浴中
に懸架されている直径2mmのステンレススチール製コイ
ルに通過され、この場合原料が102℃で２分間保持され
るような速度で送り込まれる。このためには２分40秒の
全滞留時間が必要である。希釈に続いて、得られた組成
物は無菌燐酸アルミニウムでアジュバント処理される。
最終ミョウバン吸着ワクチンは追加的ウィルス不活性化
段階として65℃で10時間さらに処理される。
希釈される。この洗浄剤処理はデーン粒子から外側被膜
を除去し、従ってこれら粒子を非伝染性とする。それが
また若干の脂質の除去の結果、残留粒子の水性密度を平
均1.200g/mlから1.224g/mlに変換する。室温で１時間放
置後、上記溶液は0.22ミクロンミリポア（Millipore）
フィルターを通して濾過される。その後精製した抗原は
950mmHg圧力の下で102℃の温度に保持されている油浴中
に懸架されている直径2mmのステンレススチール製コイ
ルに通過され、この場合原料が102℃で２分間保持され
るような速度で送り込まれる。このためには２分40秒の
全滞留時間が必要である。希釈に続いて、得られた組成
物は無菌燐酸アルミニウムでアジュバント処理される。
最終ミョウバン吸着ワクチンは追加的ウィルス不活性化
段階として65℃で10時間さらに処理される。
比較例２ 102℃で行われる加熱不活性化段階およびその後の段
階を除いて、実施例１の方法がほぼ同様に繰返えされ
る。これにより実施例１に述べられているような1.18mg
/mlの蛋白質濃度を有するHBsAg含有塊が得られる。HBsA
gの純度は、多価および１価抗ヒト血清蛋白抗血清につ
いてのゲル拡散研究によると、95％以上である。従って
組成物は検出できるほどヒト血清蛋白を含んでいない。
試料の一部は、２％燐タングステン酸による陰性染色後
に、195,000倍の電子顕微鏡写真に撮られる。この試料
の電子顕微鏡写真は第３図に示されている。
階を除いて、実施例１の方法がほぼ同様に繰返えされ
る。これにより実施例１に述べられているような1.18mg
/mlの蛋白質濃度を有するHBsAg含有塊が得られる。HBsA
gの純度は、多価および１価抗ヒト血清蛋白抗血清につ
いてのゲル拡散研究によると、95％以上である。従って
組成物は検出できるほどヒト血清蛋白を含んでいない。
試料の一部は、２％燐タングステン酸による陰性染色後
に、195,000倍の電子顕微鏡写真に撮られる。この試料
の電子顕微鏡写真は第３図に示されている。
実施例３ 実施例２に述べた試料の一部は、その後２分40秒間の
全滞留時間の間102℃の油浴中に浸漬されている直径2mm
のステンレススチール管を通過させることにより120℃
に加熱される。102℃の温度に到達するまで40秒かか
る。従って蛋白質組成物は約２分間102℃で加熱される
わけである。試料はわずかに乳白光を放ち、凝集性を示
す。試料の一部は陰性染色され、電子顕微鏡写真に撮ら
れる。第４図に示されているように、直線状、枝分れ状
および一般に円形のフィラメント形状を有する表面抗原
粒子は加熱後に現れる。これらの粒子は最初の製剤中に
は存在していない。これらの粒子は単純な凝集というよ
りもむしろ実際の膜融合から生ずる。なぜならばこれら
粒子が30分間も超音波にさらされても、これら粒子の形
態は何ら影響されないからである。
全滞留時間の間102℃の油浴中に浸漬されている直径2mm
のステンレススチール管を通過させることにより120℃
に加熱される。102℃の温度に到達するまで40秒かか
る。従って蛋白質組成物は約２分間102℃で加熱される
わけである。試料はわずかに乳白光を放ち、凝集性を示
す。試料の一部は陰性染色され、電子顕微鏡写真に撮ら
れる。第４図に示されているように、直線状、枝分れ状
および一般に円形のフィラメント形状を有する表面抗原
粒子は加熱後に現れる。これらの粒子は最初の製剤中に
は存在していない。これらの粒子は単純な凝集というよ
りもむしろ実際の膜融合から生ずる。なぜならばこれら
粒子が30分間も超音波にさらされても、これら粒子の形
態は何ら影響されないからである。
フィラメント状および球形状粒子の相対的免疫原性を
測定するために、これら粒子の一部は遠心分離により相
互に分離される。
測定するために、これら粒子の一部は遠心分離により相
互に分離される。
実施例４ 実施例３の加熱製剤は8000gの量で20分間遠心分離さ
れ、上澄み画分に分離され、この画分は、濾過による損
失を減少させるために50μl/mlのトウィン20を添加した
後に0.22ミクロンのミリポア膜を通してさらに濾過され
る。この上澄み留分の一部は陰性染色され、電子顕微鏡
写真に撮られ、得られた電子顕微鏡写真は第５図に示さ
れている。
れ、上澄み画分に分離され、この画分は、濾過による損
失を減少させるために50μl/mlのトウィン20を添加した
後に0.22ミクロンのミリポア膜を通してさらに濾過され
る。この上澄み留分の一部は陰性染色され、電子顕微鏡
写真に撮られ、得られた電子顕微鏡写真は第５図に示さ
れている。
実施例５ 実施例４において濾過により得られた沈降物は等張塩
水に再懸濁され、最初の容量とし、陰性染色されて電子
顕微鏡写真に撮られる。その顕微鏡写真は第６図に示さ
れている。
水に再懸濁され、最初の容量とし、陰性染色されて電子
顕微鏡写真に撮られる。その顕微鏡写真は第６図に示さ
れている。
実施例６ アルブミンの存在の下におけるフラッシュ加熱不活性化 製剤はカプリル酸ナトリウムによって安定化された3m
g/mlのヒト血清アルブミンの存在の下で実施例３におい
て述べたようにフラッシュ加熱された。多形態フィラメ
ントが再び生成された（第７図）。
g/mlのヒト血清アルブミンの存在の下で実施例３におい
て述べたようにフラッシュ加熱された。多形態フィラメ
ントが再び生成された（第７図）。
実施例７ アジュバント処理した蛋白質組成物の製造 実施例２および３の組成物の30ミクロリットル、実施
例４の組成物の40ミクロリットルおよび実施例５の組成
物の90ミクロリットルはそれぞれ10mlの無菌標準塩水に
加えられ、OD280に対して指定４ミクログラム/mlを生じ
る。これは加熱工程から得られる乳白光により蛋白濃度
のおよその推定値であると認められる。これら試料の最
も正確な蛋白質含有量はビオラド（BIORAD）蛋白質検定
によって得られる。各溶液はthe Rijks Inst.Bilthoven
のvoor de Volksgesundheid,Hollandによって調整され
た燐酸アルミニウムゲル（1.2mg/ml）の等容量で調節さ
れ、0.3mgの燐酸アルミニウム（ミョウバンホスフェー
ト）ゲルに吸着された0.5ml用量に対して推定１ミクロ
グラムを生成する。
例４の組成物の40ミクロリットルおよび実施例５の組成
物の90ミクロリットルはそれぞれ10mlの無菌標準塩水に
加えられ、OD280に対して指定４ミクログラム/mlを生じ
る。これは加熱工程から得られる乳白光により蛋白濃度
のおよその推定値であると認められる。これら試料の最
も正確な蛋白質含有量はビオラド（BIORAD）蛋白質検定
によって得られる。各溶液はthe Rijks Inst.Bilthoven
のvoor de Volksgesundheid,Hollandによって調整され
た燐酸アルミニウムゲル（1.2mg/ml）の等容量で調節さ
れ、0.3mgの燐酸アルミニウム（ミョウバンホスフェー
ト）ゲルに吸着された0.5ml用量に対して推定１ミクロ
グラムを生成する。
各抗原の1/4および1/16の量を含む塩水中における希
釈物質は、同様に上記のようなミョウバンアジュバント
に吸着され、0.25および0.6ミクログラムの推定用量を
得る。また対照は抗原溶液の変わりに塩水を用いて調整
される。
釈物質は、同様に上記のようなミョウバンアジュバント
に吸着され、0.25および0.6ミクログラムの推定用量を
得る。また対照は抗原溶液の変わりに塩水を用いて調整
される。
マウスの接種 体重20〜22gの20匹のメスのICRスイスマウスの各グル
ープは種々の製剤の0.5ccで腹膜組織内に接種される。
すなわち各試料は60匹のマウスに接種され、20匹には３
つの希釈物質のそれぞれが注入される。10匹のマウスは
対照アジュバントが接種される。
ープは種々の製剤の0.5ccで腹膜組織内に接種される。
すなわち各試料は60匹のマウスに接種され、20匹には３
つの希釈物質のそれぞれが注入される。10匹のマウスは
対照アジュバントが接種される。
すべてのマウスは心臓放血により出血させる。血液が
各管に集められ、室温で凝塊され、かつ遠心分離した
（3000rpm、15分）凝塊から血清を回収する前に４℃で
一晩保持される。
各管に集められ、室温で凝塊され、かつ遠心分離した
（3000rpm、15分）凝塊から血清を回収する前に４℃で
一晩保持される。
各血清はオーサブ（AUSAB）（商品名）試験セット（A
bbott Laboratories,Chicago,Illinois）を用いて定量
平衡ラインラジオイムノアッセイによって試験され、こ
の試験は100国際単位（IU）/mlを含むWHO国際HBIG標準
と比較される。希釈および負の対照の平均カウント／分
（CPM）を差し引いたCPMに関する一次曲線内における値
よりも大きな放射活性を与える試料は1:10および1:100
の希釈割合で再びテストされる。試料のHBsAg抗原性は
アウスリア（AUSRIA）（商品名）試験セット（Abbott L
aboratories,North Chicago,Illinois）を用いて平衡ラ
インイムノアッセイにより評価され、この評価はU.S.F.
D.A.により提供された暫定HBsAg/ad標準と比較される。
この標準によって得られた結果はジャーマンナショナル
HBsAg/ad標準を用いて独自に得られたものと同様であ
る。
bbott Laboratories,Chicago,Illinois）を用いて定量
平衡ラインラジオイムノアッセイによって試験され、こ
の試験は100国際単位（IU）/mlを含むWHO国際HBIG標準
と比較される。希釈および負の対照の平均カウント／分
（CPM）を差し引いたCPMに関する一次曲線内における値
よりも大きな放射活性を与える試料は1:10および1:100
の希釈割合で再びテストされる。試料のHBsAg抗原性は
アウスリア（AUSRIA）（商品名）試験セット（Abbott L
aboratories,North Chicago,Illinois）を用いて平衡ラ
インイムノアッセイにより評価され、この評価はU.S.F.
D.A.により提供された暫定HBsAg/ad標準と比較される。
この標準によって得られた結果はジャーマンナショナル
HBsAg/ad標準を用いて独自に得られたものと同様であ
る。
下記の第１表は実施例２から実施例５の異なる試料の
蛋白含有量および抗原性ならびにこれら値の割合、即ち
「比抗原性」を表している。理解されるように、比抗原
性は加熱により約50％減少している。このことは第６図
に見られるようなフィラメント形態の割合が高い実施例
５において特に著しい。
蛋白含有量および抗原性ならびにこれら値の割合、即ち
「比抗原性」を表している。理解されるように、比抗原
性は加熱により約50％減少している。このことは第６図
に見られるようなフィラメント形態の割合が高い実施例
５において特に著しい。
第８図は４つの製剤の希釈物を１回注射し28〜30日後
における抗HBsの少なくとも1mIU/mlで発育しているマウ
スの割合を示している。この判断基準によれば、加熱処
理した製剤は著しく高い免疫性を有していることがわか
る。下記第２表のデータが示しているように、マウスの
50％を血清変換させるのに必要な推定投与量から見て加
熱処理は免疫性を7.四倍増強していることがわかる。実
施例５のフィラメント画分は最も免疫性が高く、29.5倍
に増強されている。
における抗HBsの少なくとも1mIU/mlで発育しているマウ
スの割合を示している。この判断基準によれば、加熱処
理した製剤は著しく高い免疫性を有していることがわか
る。下記第２表のデータが示しているように、マウスの
50％を血清変換させるのに必要な推定投与量から見て加
熱処理は免疫性を7.四倍増強していることがわかる。実
施例５のフィラメント画分は最も免疫性が高く、29.5倍
に増強されている。
上記データから次のことが結論づけられる。即ち上記
分離方法によって得られた本質的な純粋なHBsAg粒子の
加熱はHBsAgの免疫原性を実際に高め、これにより抗体
水準を増加させる。定量パラメーターは1.5log10mIU/ml
（32mIU）の幾何平均抗HBsレベルを供給するのに必要な
投与量を推定することにより誘導される。このパラメー
ターを用いて102℃で２分間加熱することは、免疫原性
を６倍増加させると推定される。従って本発明の蛋白塊
は、直径18〜24nmの球形HBsAg粒子から本質的になる蛋
白塊の免疫原性より４〜６倍、好ましくは６〜８倍大き
な免疫原性を有することを特徴としている。もちろん直
径18〜24nmの円形粒子から本発明のフィラメント構造を
分離すると、実施例５の組成物に関する上記データから
明らかなように、得られた組成物は20〜30倍の更に大き
な免疫原性を有することができる。
分離方法によって得られた本質的な純粋なHBsAg粒子の
加熱はHBsAgの免疫原性を実際に高め、これにより抗体
水準を増加させる。定量パラメーターは1.5log10mIU/ml
（32mIU）の幾何平均抗HBsレベルを供給するのに必要な
投与量を推定することにより誘導される。このパラメー
ターを用いて102℃で２分間加熱することは、免疫原性
を６倍増加させると推定される。従って本発明の蛋白塊
は、直径18〜24nmの球形HBsAg粒子から本質的になる蛋
白塊の免疫原性より４〜６倍、好ましくは６〜８倍大き
な免疫原性を有することを特徴としている。もちろん直
径18〜24nmの円形粒子から本発明のフィラメント構造を
分離すると、実施例５の組成物に関する上記データから
明らかなように、得られた組成物は20〜30倍の更に大き
な免疫原性を有することができる。
従って、本発明の方法によって精製されたHBsAgを上
記のように102℃で２分間不活性化すると、意図したよ
うに残留する感染性が低下するのみならず、予想外のこ
ととして免疫原性が劇的に増加することが以外にもわか
った。この高い免疫原性のために、低蛋白含有量のワク
チンを製造することができ、従って全体的なワクチンの
製造コストを現在市販のワクチンよりもずっと低く抑え
ることができる。
記のように102℃で２分間不活性化すると、意図したよ
うに残留する感染性が低下するのみならず、予想外のこ
ととして免疫原性が劇的に増加することが以外にもわか
った。この高い免疫原性のために、低蛋白含有量のワク
チンを製造することができ、従って全体的なワクチンの
製造コストを現在市販のワクチンよりもずっと低く抑え
ることができる。
実施例８ 他の精製技術によって得られた熱不活性化ワクチンおよ
び本発明の方法によって得られた精製抗原の不活性化に
関する異なる熱不活性化技術の比較評価 上記に述べた方法に従って、ポリエチレングリコール
でHBsAgが２回沈澱させ、水酸燐灰石に対する負吸着お
よび等密度遠心法によって精製された。この部分的に精
製した原料はここで試料Ａとする。
び本発明の方法によって得られた精製抗原の不活性化に
関する異なる熱不活性化技術の比較評価 上記に述べた方法に従って、ポリエチレングリコール
でHBsAgが２回沈澱させ、水酸燐灰石に対する負吸着お
よび等密度遠心法によって精製された。この部分的に精
製した原料はここで試料Ａとする。
他の部分的に精製したHBsAg組成物（試料Ｂ）はブル
メルヒュース（Brummelhuis）等〔肝炎Ｂ型ワクチンに
おける熱不活性化による肝炎Ｂ型ワクチンの製造（Prep
aration of Hepatitis B Vaccine by Heat Inactivatio
n in Hepatitis B Vaccine)、第18回セラム・シンポジ
ウム（Serum Symposium）、ピー・モーパス（P Maupa
s）およびピー・グースリー（P Guesry）共著、エルセ
ビア／ノース−オランダ・バイオメジカル・プレス（El
sevier/North-Holland Biomedical Press 1981）〕によ
って提案された方法に従って製造された。
メルヒュース（Brummelhuis）等〔肝炎Ｂ型ワクチンに
おける熱不活性化による肝炎Ｂ型ワクチンの製造（Prep
aration of Hepatitis B Vaccine by Heat Inactivatio
n in Hepatitis B Vaccine)、第18回セラム・シンポジ
ウム（Serum Symposium）、ピー・モーパス（P Maupa
s）およびピー・グースリー（P Guesry）共著、エルセ
ビア／ノース−オランダ・バイオメジカル・プレス（El
sevier/North-Holland Biomedical Press 1981）〕によ
って提案された方法に従って製造された。
試料Ａは燐酸緩衝塩水で1mg/ml、2mg/ml、4mg/mlおよ
び6mg/mlまで希釈され、下記において述べるように熱処
理された。ブルメルヒュースの方法に従って、20μg HB
sAg/mlの濃度に調節したHBsAgの懸濁最終ピレットを用
いて、試料Ｂが熱処理された。試料ＡおよびＢが金属管
に入れられた。なおこの金属管は2mmの内径を有し、短
いシリコンゴム管で延長され、かつ金属ねじクランプで
密閉されていた。102℃に加熱された熱安定油浴に蒸気
管を浸漬ことにより熱不活性化が行われた。102℃の温
度における試料ＡおよびＢの滞留時間は２分であった。
その後これら試料は冷却用氷水浴に移された。
び6mg/mlまで希釈され、下記において述べるように熱処
理された。ブルメルヒュースの方法に従って、20μg HB
sAg/mlの濃度に調節したHBsAgの懸濁最終ピレットを用
いて、試料Ｂが熱処理された。試料ＡおよびＢが金属管
に入れられた。なおこの金属管は2mmの内径を有し、短
いシリコンゴム管で延長され、かつ金属ねじクランプで
密閉されていた。102℃に加熱された熱安定油浴に蒸気
管を浸漬ことにより熱不活性化が行われた。102℃の温
度における試料ＡおよびＢの滞留時間は２分であった。
その後これら試料は冷却用氷水浴に移された。
実施例３から６と同じ陰性染色方法により、即ち燐タ
ングステン酸陰性染色の後、得られた精製物の試料は電
子顕微鏡で撮影された。試料Ａ（１〜6mg/ml）の電子顕
微鏡写真は、第４図から６図に示されているのと同じ多
形態フィラメントを生じた。ネザーランド・レッド・ク
ロース（Netherlands Red Cross）の方法に従って製造
した不活性化試料、即ち試料ＢはHBsAgの他に少なくと
も約3mg/mlの他の血清蛋白を含んでいた。その電子顕微
鏡写真はHBsAgのフィラメント粒子をほとんど表示しな
かった。実施例６におけるような１〜3mg/mlのカプリル
酸ナトリウムで安定化したアルブミンを添加すること
は、多形態（第７図）への変質または免疫性の増加を変
更させるものではないことがわかった。HBsAgを精製す
る方法ならびに加熱時における濃度はその後のフラッシ
ュ加熱処理を決定するものであり、HBsAg粒子は第４図
から第６図に示されている新規で特別な形態に変質され
る、ということが結論づけられた。従って、熱不活性化
それ自体は形態の結果を決定するものではなくて、むし
ろ免疫原性を増加させる新規な形態は使用する精製技術
および実際の熱不活性化の組み合せによって生ずる。
ングステン酸陰性染色の後、得られた精製物の試料は電
子顕微鏡で撮影された。試料Ａ（１〜6mg/ml）の電子顕
微鏡写真は、第４図から６図に示されているのと同じ多
形態フィラメントを生じた。ネザーランド・レッド・ク
ロース（Netherlands Red Cross）の方法に従って製造
した不活性化試料、即ち試料ＢはHBsAgの他に少なくと
も約3mg/mlの他の血清蛋白を含んでいた。その電子顕微
鏡写真はHBsAgのフィラメント粒子をほとんど表示しな
かった。実施例６におけるような１〜3mg/mlのカプリル
酸ナトリウムで安定化したアルブミンを添加すること
は、多形態（第７図）への変質または免疫性の増加を変
更させるものではないことがわかった。HBsAgを精製す
る方法ならびに加熱時における濃度はその後のフラッシ
ュ加熱処理を決定するものであり、HBsAg粒子は第４図
から第６図に示されている新規で特別な形態に変質され
る、ということが結論づけられた。従って、熱不活性化
それ自体は形態の結果を決定するものではなくて、むし
ろ免疫原性を増加させる新規な形態は使用する精製技術
および実際の熱不活性化の組み合せによって生ずる。
上記事項は本発明を行うために現在考えられる最も好
ましい方法について述べている。HBsAgの特別な形態形
成に関する初期の研究において、適合可能蛋白、例えば
血清アルブミンで精製HBsAgを希釈して、加熱不活性に
よる有害作用からHBsAgを保護し、即ちHBsAgを変性から
保護した。その後、不活性化はこのように希釈をしなく
ても行うことができ、かつ本発明を行う好ましい方法は
精製され希釈されていないHBsAgに対して不活性化を行
うことであるということが見い出された。この好ましい
方法はHBsAgの上記改良形態も提供する。
ましい方法について述べている。HBsAgの特別な形態形
成に関する初期の研究において、適合可能蛋白、例えば
血清アルブミンで精製HBsAgを希釈して、加熱不活性に
よる有害作用からHBsAgを保護し、即ちHBsAgを変性から
保護した。その後、不活性化はこのように希釈をしなく
ても行うことができ、かつ本発明を行う好ましい方法は
精製され希釈されていないHBsAgに対して不活性化を行
うことであるということが見い出された。この好ましい
方法はHBsAgの上記改良形態も提供する。
本発明の特徴、即ち高濃度精製膜製剤のフラッシュ加
熱不活性化による脂質膜免疫原の免疫原性増加は、真核
細胞中において精製された組みかえ型DNA誘導ワクチン
のような他のワクチン、例えば酵母または細胞培養から
の組みかえ型DNAを基材とする肝炎Ｂおよび他のワクチ
ン、ならびにインフルエンザ、狂犬病、麻疹、ヘルペス
群ウィルス、HTLV I,IIおよびIIIのようなレトロウィル
ス用の現在の不活性ワクチン、寄生虫用ワクチンおよび
現在入手可能な、または現在開発中のワクチンの有効性
を高めるために、および／またはそれらの必要な投与量
を減少させるために容易に適合できるものである。
熱不活性化による脂質膜免疫原の免疫原性増加は、真核
細胞中において精製された組みかえ型DNA誘導ワクチン
のような他のワクチン、例えば酵母または細胞培養から
の組みかえ型DNAを基材とする肝炎Ｂおよび他のワクチ
ン、ならびにインフルエンザ、狂犬病、麻疹、ヘルペス
群ウィルス、HTLV I,IIおよびIIIのようなレトロウィル
ス用の現在の不活性ワクチン、寄生虫用ワクチンおよび
現在入手可能な、または現在開発中のワクチンの有効性
を高めるために、および／またはそれらの必要な投与量
を減少させるために容易に適合できるものである。
第１図はフラッシュ加熱によって小さな球形粒子から調
製されたフィラメント形態を示す説明図であり、ａは直
線状フィラメント;bは閉鎖円形または環状フィラメン
ト;cは枝分れフィラメント;dは開放円形フィラメント;e
は枝分れ環状フィラメント；およびｆは多数枝分れフィ
ラメントである。 第２図は本発明のワクチンを製造する方法を示す流れ図
である。 第３図は上記段階Ａ〜Ｃに従って得られ、燐タングステ
ン酸で陰性染色したHBsAgを含む粒子（これら粒子は本
発明のフラッシュ加熱処理を受けておらず、主に18〜24
nmの大きさを有する球形HBsAg粒子から成っている）の
電子顕微鏡写真である。 第４図は、第１図のものと同様に熱処理を受け、直線
状、枝分れ状および円形状フィラメント形態に変形され
たHBsAg含有粒子の形状を示す電子顕微鏡写真である。 第５図は、第４図に示されている溶液を8,000gで20分間
遠心分離し、更に得られた上澄み液を濾過した後に得ら
れた上澄み液画分の、第３図および第４図と同様の電子
顕微鏡写真である。 第６図は、8,000gで20分間遠心分離することにより得ら
れかつ最初の容量まで等張塩水中に再懸濁された沈降物
の第３図から第５図と同様な電子顕微鏡写真である。 第７図は、カプリル酸ナトリウムで処理した血清アルブ
ミン3mg/mlの存在の下でフラッシュ加熱処理し、同じ形
態構造のものが得られた本発明のHBsAg含有粒子の第３
図から第６図と同様の電子顕微鏡である。 第８図は第３〜６図に示されている形態を有する製剤
の、マウスにおける精製HBsAgの免疫原性に及ぼす加熱
不活性化の効果を示すグラフである。
製されたフィラメント形態を示す説明図であり、ａは直
線状フィラメント;bは閉鎖円形または環状フィラメン
ト;cは枝分れフィラメント;dは開放円形フィラメント;e
は枝分れ環状フィラメント；およびｆは多数枝分れフィ
ラメントである。 第２図は本発明のワクチンを製造する方法を示す流れ図
である。 第３図は上記段階Ａ〜Ｃに従って得られ、燐タングステ
ン酸で陰性染色したHBsAgを含む粒子（これら粒子は本
発明のフラッシュ加熱処理を受けておらず、主に18〜24
nmの大きさを有する球形HBsAg粒子から成っている）の
電子顕微鏡写真である。 第４図は、第１図のものと同様に熱処理を受け、直線
状、枝分れ状および円形状フィラメント形態に変形され
たHBsAg含有粒子の形状を示す電子顕微鏡写真である。 第５図は、第４図に示されている溶液を8,000gで20分間
遠心分離し、更に得られた上澄み液を濾過した後に得ら
れた上澄み液画分の、第３図および第４図と同様の電子
顕微鏡写真である。 第６図は、8,000gで20分間遠心分離することにより得ら
れかつ最初の容量まで等張塩水中に再懸濁された沈降物
の第３図から第５図と同様な電子顕微鏡写真である。 第７図は、カプリル酸ナトリウムで処理した血清アルブ
ミン3mg/mlの存在の下でフラッシュ加熱処理し、同じ形
態構造のものが得られた本発明のHBsAg含有粒子の第３
図から第６図と同様の電子顕微鏡である。 第８図は第３〜６図に示されている形態を有する製剤
の、マウスにおける精製HBsAgの免疫原性に及ぼす加熱
不活性化の効果を示すグラフである。
Claims (45)
- 【請求項１】フラッシュ加熱の条件の下で脂質膜系HBsA
gを十分な膜濃度でフラッシュ加熱して、膜を融解し、
そして融解した膜を枝分れフィラメント、閉鎖円形フィ
ラメント、開放円形フィラメントまたは枝分れ閉鎖フィ
ラメントに融合することを含んで成る、HBsAg粒子から
成る蛋白性塊の製造方法。 - 【請求項２】上記脂質膜系HBsAgが、フラッシュ加熱さ
れる組成物中に0.1〜10mg/mlの濃度で存在し、そしてそ
のHBsAgを800〜1000mmHgの圧力の下で101〜104℃で１〜
15分間加熱する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】上記HBsAgを蛋白性物質によってその希釈
を行うことなくフラッシュ加熱にかける、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】HBsAgの粒子から成る蛋白性塊であって、
上記粒子が枝分れフィラメント、閉鎖円形フィラメン
ト、開放円形フィラメントまたは枝分れ閉鎖フィラメン
トである粒子を含むことを特徴とする前記の蛋白性塊。 - 【請求項５】上記枝分れフィラメント、閉鎖円形フィラ
メント、開放円形フィラメントまたは枝分れ閉鎖フィラ
メントが15〜20nmの直径を有する特許請求の範囲第４項
記載の蛋白性塊。 - 【請求項６】カプリル酸ナトリウムで安定化したヒト血
清アルブミン以外の血清蛋白５重量パーセント未満を含
む特許請求の範囲第４項記載の蛋白性塊。 - 【請求項７】蛋白の総重量に基づき血清蛋白１重量パー
セント未満を含む特許請求の範囲第６項記載の蛋白性
塊。 - 【請求項８】上記蛋白性塊が、上記閉鎖円形フィラメン
トから外側に突出しているフィラメントをさらに含む閉
鎖円形フィラメント状HBsAgを有する粒子をもつ特許請
求の範囲第４項記載の蛋白性塊。 - 【請求項９】上記フィラメント状粒子が少なくとも50nm
の長さを有する特許請求の範囲第８項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１０】上記フィラメント状粒子が100〜1000nm
の長さを有する特許請求の範囲第９記載の蛋白性塊。 - 【請求項１１】18〜24nmの大きさの球形粒子の形のHBsA
gから本質的に成る組成物よりも少なくとも４倍大きな
免疫原性を有する特許請求の範囲第４項記載の蛋白性
塊。 - 【請求項１２】上記蛋白性塊が、18〜24nmの大きさの球
形HBsAg粒子から本質的に成る蛋白性塊の免疫原性の６
〜30倍の免疫原性を有する特許請求の範囲第11項記載の
蛋白性塊。 - 【請求項１３】カプリル酸ナトリウムで安定化したヒト
血清アルブミンと異なる他の血清蛋白５重量パーセント
未満を含む特許請求の範囲第11項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１４】カプリル酸ナトリウムで安定化したヒト
血清アルブミン以外の血清蛋白１重量パーセント未満を
含む特許請求の範囲第13項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１５】上記蛋白性塊を A.血漿をポリエチレングリコールと接触させることによ
って血漿からHBsAgを沈殿させて、血漿内に含まれてい
る他の血清蛋白からHBsAgを分離し、 B.分離したHBsAgの負吸着を水酸燐灰石上で行い、 C.そのように吸着したHBsAgを等密度遠心法で処理し、
そして D.上記遠心法によって分離した粒子を、少なくとも0.1m
g/mlの濃度で101〜104℃の温度で１〜15分間加熱するこ
とにより上記粒子に対して熱不活性化を行い、その後上
記粒子を冷却し、そして上記の加熱が連続流フラッシュ
加熱である場合には、その加熱を高圧下で実施すること
によって調製する、 特許請求の範囲第４項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１６】加熱前に上記粒子が洗浄剤で処理され、
これにより1.200〜1.224gm/ccのスクロース勾配におい
て上記粒子の平均水性密度を高める特許請求の範囲第15
項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１７】上記粒子が、加熱媒体中に浸漬され、0.
1〜10mmの直径を有する管を通過している間に101〜104
℃で加熱される特許請求の範囲第15項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１８】上記粒子が上記管を通過している間に、
800〜1000mmHgの圧力が加えられ、上記管内における上
記粒子の滞留時間を１〜15分間にする、特許請求の範囲
第17項記載の蛋白性塊。 - 【請求項１９】上記HBsAg粒子が、上記熱処理に先立っ
て、カプリル酸ナトリウムで安定化したヒト血清アルブ
ミンで希釈される特許請求の範囲第15項記載の蛋白性
塊。 - 【請求項２０】熱処理にかける溶液中における上記HBsA
g粒子の濃度が少なくとも0.1mg/mlである、特許請求の
範囲第15項記載の蛋白性塊。 - 【請求項２１】熱処理にかける血清中におけるHBsAg粒
子の濃度が少なくとも0.1〜10mg/mlである、特許請求の
範囲第20項記載の蛋白性塊。 - 【請求項２２】上記フィラメント状構造が少なくとも50
nmの長さを有する特許請求の範囲第４項記載の蛋白性
塊。 - 【請求項２３】上記構造が15〜20nmの直径および少なく
とも50nmの長さを有する特許請求の範囲第４項記載の蛋
白性塊。 - 【請求項２４】上記フィラメント状構造が100〜1000nm
の長さを有する特許請求の範囲第４項記載の蛋白性塊。 - 【請求項２５】上記フィラメント状構造が、少なくとも
50nmの長さを有する構造の枝部の少なくとも１つを保有
する枝分れ構造である特許請求の範囲第22項記載の蛋白
性塊。 - 【請求項２６】上記フィラメント状構造に少なくとも３
つの枝部が存在する特許請求の範囲第25項記載の蛋白性
塊。 - 【請求項２７】HBsAgの粒子から成る蛋白性塊であっ
て、上記粒子が枝分れフィラメント、閉鎖円形フィラメ
ント、開放円形フィラメントまたは枝分れ閉鎖フィラメ
ントである粒子を含むことを特徴とする前記の蛋白性
塊、および生理学的に受け入れることのできる希釈剤か
ら成ることを特徴とするワクチン。 - 【請求項２８】上記蛋白性塊の枝分れフィラメント、閉
鎖円形フィラメント、開放円形フィラメントまたは枝分
れ閉鎖フィラメントが15〜20nmの直径を有する特許請求
の範囲第27項記載のワクチン。 - 【請求項２９】上記蛋白性塊が、カプリル酸ナトリウム
で安定化したヒト血清アルブミン以外の血清蛋白５重量
パーセント未満を含む特許請求の範囲第27項記載のワク
チン。 - 【請求項３０】上記蛋白性塊が、上記閉鎖円形フィラメ
ントから外側に突出しているフィラメントをさらに含む
閉鎖円形フィラメント状HBsAgを有する粒子をもつ特許
請求の範囲第27項記載のワクチン。 - 【請求項３１】上記フィラメント状粒子が少なくとも50
nmの長さを有する特許請求の範囲第30項記載のワクチ
ン。 - 【請求項３２】上記蛋白性塊が、 A.血漿をポリエチレングリコールと接触させることによ
って血漿からHBsAgを沈殿させて、血漿内に含まれてい
る他の血清蛋白からHBsAgを分離し、 B.分離したHBsAgの負吸着を水酸燐灰石上で行い、 C.そのように吸着したHBsAgを等密度遠心法で処理し、
そして D.上記遠心法によって分離した粒子を、少なくとも0.1m
g/mlの濃度で101〜104℃の温度で１〜15分間加熱するこ
とにより上記粒子に対して熱不活性化を行い、その後上
記粒子を冷却し、そして上記の加熱が連続流フラッシュ
加熱である場合には、その加熱を高圧下で実施すること
によって調製され、 加熱前に上記粒子が洗浄剤で処理され、これにより1.20
0〜1.224gm/ccのスクロース勾配において上記粒子の平
均水性密度が高められたものである、特許請求の範囲第
27項記載のワクチン。 - 【請求項３３】上記蛋白性塊が、 18〜24nmの大きさの球形HBsAg粒子から本質的に成る蛋
白性塊の少なくとも４倍大きな免疫原性を有し カプリル酸ナトリウムで安定化したヒト血清アルブミン
以外の血清蛋白１重量パーセント未満を含む特許請求の
範囲第27項記載のワクチン。 - 【請求項３４】上記蛋白性塊のフィラメント状構造が少
なくとも50nmの長さを有する特許請求の範囲第27項記載
のワクチン。 - 【請求項３５】上記蛋白性塊のフィラメント状構造が10
0〜1000nmの長さを有する特許請求の範囲第27項記載の
ワクチン。 - 【請求項３６】上記フィラメント状構造が、少なくとも
50nmの長さを有する構造の枝部の少なくとも１つを保有
する枝分れ構造である特許請求の範囲第35項記載のワク
チン。 - 【請求項３７】上記フィラメント状構造に少なくとも３
つの枝部が存在する特許請求の範囲第36項記載のワクチ
ン。 - 【請求項３８】上記蛋白性塊が蛋白の総重量に基づき血
清蛋白を１重量パーセント未満の量で含み、検出可能な
量のHBV DNAを含まず、かつHBsAg、HBeAgよびpre-S抗原
性決定子を含む、特許請求の範囲第27項記載のワクチ
ン。 - 【請求項３９】HBsAgの粒子から成る蛋白性塊であっ
て、上記粒子が枝分れフィラメント、閉鎖円形フィラメ
ント、開放円形フィラメントまたは枝分れ閉鎖フィラメ
ントである粒子を含むことを特徴とする前記の蛋白性塊
を人間を除く動物に導入することから成る、前記動物に
抗体を誘発する方法。 - 【請求項４０】上記蛋白性塊の枝分れフィラメント、閉
鎖円形フィラメント、開放円形フィラメントまたは枝分
れ閉鎖フィラメントが15〜20nmの直径を有する特許請求
の範囲第39項記載の方法。 - 【請求項４１】上記蛋白性塊が、カプリル酸ナトリウム
で安定化したヒト血清アルブミン以外の血清蛋白５重量
パーセント未満を含む特許請求の範囲第39項記載の方
法。 - 【請求項４２】上記蛋白性塊が、蛋白の総重量に基づき
血清蛋白１重量パーセント未満を含む特許請求の範囲第
41項記載の方法。 - 【請求項４３】上記蛋白性塊が、 A.血漿をポリエチレングリコールと接触させることによ
って血漿からHBsAgを沈殿させて、血漿内に含まれてい
る他の血清蛋白からHBsAgを分離し、 B.分離したHBsAgの負吸着を水酸燐灰石上で行い、 C.そのように吸着したHBsAgを等密度遠心法で処理し、
そして D.上記遠心法によって分離した粒子を、少なくとも0.1m
g/mlの濃度で101〜104℃の温度で１〜15分間加熱するこ
とにより上記粒子に対して熱不活性化を行い、その後上
記粒子を冷却し、そして上記の加熱が連続流フラッシュ
加熱である場合には、その加熱を高圧下で実施すること
によって調製され、 加熱前に上記粒子が洗浄剤で処理され、これにより1.20
0〜1.224gm/ccのスクロース勾配において上記粒子の平
均水性密度が高められたものである、特許請求の範囲第
39項記載の方法。 - 【請求項４４】上記蛋白性塊のフィラメント状構造が少
なくとも50nmの長さを有する特許請求の範囲第39項記載
の方法。 - 【請求項４５】上記蛋白性塊のフィラメント状構造が10
0〜1000nmの長さを有する特許請求の範囲第39項記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US656833 | 1984-10-02 | ||
| US06/656,833 US4639371A (en) | 1984-10-02 | 1984-10-02 | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61191621A JPS61191621A (ja) | 1986-08-26 |
| JPH0832636B2 true JPH0832636B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=24634769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60218148A Expired - Lifetime JPH0832636B2 (ja) | 1984-10-02 | 1985-10-02 | 肝炎ｂ型抗原組成物およびそれから誘導した肝炎ｂ型に対するワクチン |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4639371A (ja) |
| EP (1) | EP0177015B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0832636B2 (ja) |
| KR (1) | KR900006887B1 (ja) |
| CN (1) | CN1016315B (ja) |
| AT (1) | ATE77055T1 (ja) |
| AU (1) | AU599007B2 (ja) |
| CA (1) | CA1265447A (ja) |
| DE (1) | DE3586193T2 (ja) |
| ZA (1) | ZA857610B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4935235A (en) * | 1979-05-24 | 1990-06-19 | The Regents Of The University Of California | Non-passageable viruses |
| DE3176404D1 (en) * | 1980-04-22 | 1987-10-08 | Pasteur Institut | Vaccine against viral hepatitis b, method and transformed eucaryotic cells for the preparation of this vaccine |
| US4695454A (en) * | 1985-04-01 | 1987-09-22 | New York Blood Center, Inc. | Process for preparing hepatitis B surface antigen containing particles in novel forms which are highly immunogenic |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
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