JPH08313526A - 有機溶媒中における免疫学的測定法、及び増感剤 - Google Patents
有機溶媒中における免疫学的測定法、及び増感剤Info
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- JPH08313526A JPH08313526A JP14408295A JP14408295A JPH08313526A JP H08313526 A JPH08313526 A JP H08313526A JP 14408295 A JP14408295 A JP 14408295A JP 14408295 A JP14408295 A JP 14408295A JP H08313526 A JPH08313526 A JP H08313526A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 有機溶媒中における免疫学的測定法、及び増
感剤を提供する。 【構成】 有機溶媒中又は水と有機溶媒との混合液中で
抗原抗体反応を行い、次いで抗原又は抗体に標識として
付した酵素由来の信号を検出する測定系に、カチオン界
面活性剤を存在させる。 【効果】 有機溶媒中での抗原抗体反応を増感でき、有
機溶媒中での酵素免疫学的測定方法において被検物質の
より明瞭な定量ができる。酵素標識抗原の使用量を節約
し、測定コストを節約することも可能である。
感剤を提供する。 【構成】 有機溶媒中又は水と有機溶媒との混合液中で
抗原抗体反応を行い、次いで抗原又は抗体に標識として
付した酵素由来の信号を検出する測定系に、カチオン界
面活性剤を存在させる。 【効果】 有機溶媒中での抗原抗体反応を増感でき、有
機溶媒中での酵素免疫学的測定方法において被検物質の
より明瞭な定量ができる。酵素標識抗原の使用量を節約
し、測定コストを節約することも可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有機溶媒中で抗原抗体
反応を行う免疫学的測定方法、及びその免疫学的測定方
法に用いる増感剤に関する。
反応を行う免疫学的測定方法、及びその免疫学的測定方
法に用いる増感剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】毒素や農薬等の有機化合物、あるいはホ
ルモン等の生理活性物質の中には、水に難溶性のものが
少なくない。従来、これらの難水溶性化合物を測定する
には、測定に先立ち、難溶性の程度に応じて適切な有機
溶媒によって対象化合物を抽出し、更に精製し、また、
更に精製物を適当な化合物に誘導して、高速液体クロマ
トグラフィー、ガスクロマトグラフィー等各種の機器分
析を行ってきた。これら抽出、精製の操作は、定量的測
定を直接行うことのできる水溶性化合物の場合と比較し
て煩雑で時間を要し、また、複雑で数段階の抽出精製操
作を行うことによる目的物の回収率の低下で、測定が困
難であった。従って、このような難水溶性化合物を短時
間に簡便に測定するために、有機溶媒による簡単な抽出
操作後、対象化合物を機器分析によらない免疫学測定
法、例えば酵素免疫学測定法を用いた測定法の開発が進
められており、既に、いくつかの方法が報告されている
〔例えば、Toxicon 27, 1323 (1989) 〕。
ルモン等の生理活性物質の中には、水に難溶性のものが
少なくない。従来、これらの難水溶性化合物を測定する
には、測定に先立ち、難溶性の程度に応じて適切な有機
溶媒によって対象化合物を抽出し、更に精製し、また、
更に精製物を適当な化合物に誘導して、高速液体クロマ
トグラフィー、ガスクロマトグラフィー等各種の機器分
析を行ってきた。これら抽出、精製の操作は、定量的測
定を直接行うことのできる水溶性化合物の場合と比較し
て煩雑で時間を要し、また、複雑で数段階の抽出精製操
作を行うことによる目的物の回収率の低下で、測定が困
難であった。従って、このような難水溶性化合物を短時
間に簡便に測定するために、有機溶媒による簡単な抽出
操作後、対象化合物を機器分析によらない免疫学測定
法、例えば酵素免疫学測定法を用いた測定法の開発が進
められており、既に、いくつかの方法が報告されている
〔例えば、Toxicon 27, 1323 (1989) 〕。
【０００３】このような、有機溶媒中で酵素免疫学測定
法、特に難水溶性化合物抽出液と酵素標識抗原を同時に
加え抗原抗体反応を行う競合的阻害法を用いる場合に
は、抗体のみならず酵素標識抗原も有機溶媒に曝され
る。そのため、抗体及び酵素の活性がそれぞれ低下し、
酵素の基質を加えて行う発色反応から得られる吸光度が
低下し、定量が困難になることがある。
法、特に難水溶性化合物抽出液と酵素標識抗原を同時に
加え抗原抗体反応を行う競合的阻害法を用いる場合に
は、抗体のみならず酵素標識抗原も有機溶媒に曝され
る。そのため、抗体及び酵素の活性がそれぞれ低下し、
酵素の基質を加えて行う発色反応から得られる吸光度が
低下し、定量が困難になることがある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、有機溶
媒中で酵素免疫学測定法、特に競合的阻害法を実施する
場合、発色反応を行う際に得られる吸光度の低下を防ぐ
方法は、従来全く確立されていなかった。従って、様々
な物質を有機溶媒中で競合的阻害法を用いて定量する際
に、この問題点に対する対応策が望まれていた。本発明
者は、有機溶媒中で酵素免疫学測定法を行う場合、カチ
オン界面活性剤、好適には炭素数１４〜１８のアルキル
基を有する第４級アンモニウム塩の界面活性剤を存在さ
せると、抗原抗体反応の後に実施する酵素発色反応によ
って得られる吸光度が増感される現象を見い出した。本
発明はこうした知見に基づくものである。
媒中で酵素免疫学測定法、特に競合的阻害法を実施する
場合、発色反応を行う際に得られる吸光度の低下を防ぐ
方法は、従来全く確立されていなかった。従って、様々
な物質を有機溶媒中で競合的阻害法を用いて定量する際
に、この問題点に対する対応策が望まれていた。本発明
者は、有機溶媒中で酵素免疫学測定法を行う場合、カチ
オン界面活性剤、好適には炭素数１４〜１８のアルキル
基を有する第４級アンモニウム塩の界面活性剤を存在さ
せると、抗原抗体反応の後に実施する酵素発色反応によ
って得られる吸光度が増感される現象を見い出した。本
発明はこうした知見に基づくものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、有機
溶媒中又は水と有機溶媒との混合液中で抗原抗体反応を
行い、次いで抗原又は抗体に標識として付した酵素由来
の信号を検出する測定系に、カチオン界面活性剤を存在
させることを特徴とする免疫学的測定方法に関する。更
に、本発明は、有機溶媒中又は水と有機溶媒との混合液
中で抗原抗体反応を行い、次いで抗原又は抗体に標識と
して付した酵素由来の信号を検出する免疫学的測定方法
用の、カチオン界面活性剤を含有することを特徴とする
増感剤にも関する。
溶媒中又は水と有機溶媒との混合液中で抗原抗体反応を
行い、次いで抗原又は抗体に標識として付した酵素由来
の信号を検出する測定系に、カチオン界面活性剤を存在
させることを特徴とする免疫学的測定方法に関する。更
に、本発明は、有機溶媒中又は水と有機溶媒との混合液
中で抗原抗体反応を行い、次いで抗原又は抗体に標識と
して付した酵素由来の信号を検出する免疫学的測定方法
用の、カチオン界面活性剤を含有することを特徴とする
増感剤にも関する。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
使用することのできる界面活性剤は、カチオン界面活性
剤であり、具体的には、第１級アミン塩、第２級アミン
塩及び第３級アミン塩のアミン塩型カチオン界面活性
剤、あるいは第４級アンモニウム塩の第４級アンモニウ
ム塩型カチオン界面活性剤のいずれか１種又はそれらの
任意の組合せを用いることができる。水溶性や安定性の
面から第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤が好
適に使用される。第４級アンモニウム塩は、特に限定さ
れるものではないが、モノ長鎖アルキルトリ低級アルキ
ルアンモニウム塩、モノ長鎖アルキルジ低級アルキルベ
ンジルアンモニウム塩、サパミン型第４級アンモニウム
塩、長鎖アルキル置換第４級窒素複素環式化合物塩等を
挙げることができる。
使用することのできる界面活性剤は、カチオン界面活性
剤であり、具体的には、第１級アミン塩、第２級アミン
塩及び第３級アミン塩のアミン塩型カチオン界面活性
剤、あるいは第４級アンモニウム塩の第４級アンモニウ
ム塩型カチオン界面活性剤のいずれか１種又はそれらの
任意の組合せを用いることができる。水溶性や安定性の
面から第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤が好
適に使用される。第４級アンモニウム塩は、特に限定さ
れるものではないが、モノ長鎖アルキルトリ低級アルキ
ルアンモニウム塩、モノ長鎖アルキルジ低級アルキルベ
ンジルアンモニウム塩、サパミン型第４級アンモニウム
塩、長鎖アルキル置換第４級窒素複素環式化合物塩等を
挙げることができる。
【０００７】前記の長鎖アルキル基は、好ましくは直鎖
あるいは分枝鎖の炭素数１４〜２０、より好ましくは炭
素数１４〜１８のアルキル基であることができ、前記の
低級アルキル基は、好ましくは直鎖あるいは分枝鎖の炭
素数１〜４のアルキル基、特にはメチル基又はエチル基
である。サパミン型第４級アンモニウム塩としては、例
えば、オクタデセノイルアミノエチルトリエチルアンモ
ニウム塩、オクタデセノイルアミノエチルジエチルベン
ジルアンモニウム塩、又はオクタデセノイルアミノエチ
ルジエチルメチルアンモニウム塩を挙げることができ
る。第４級窒素複素環式化合物は、窒素原子を少なくと
も１個含む、５員又は６員の飽和又は好ましくは不飽和
の第４級複素環式化合物が好ましく、例えば、ピリジニ
ウム塩、ピロール塩又はイミダゾール塩を挙げることが
できる。
あるいは分枝鎖の炭素数１４〜２０、より好ましくは炭
素数１４〜１８のアルキル基であることができ、前記の
低級アルキル基は、好ましくは直鎖あるいは分枝鎖の炭
素数１〜４のアルキル基、特にはメチル基又はエチル基
である。サパミン型第４級アンモニウム塩としては、例
えば、オクタデセノイルアミノエチルトリエチルアンモ
ニウム塩、オクタデセノイルアミノエチルジエチルベン
ジルアンモニウム塩、又はオクタデセノイルアミノエチ
ルジエチルメチルアンモニウム塩を挙げることができ
る。第４級窒素複素環式化合物は、窒素原子を少なくと
も１個含む、５員又は６員の飽和又は好ましくは不飽和
の第４級複素環式化合物が好ましく、例えば、ピリジニ
ウム塩、ピロール塩又はイミダゾール塩を挙げることが
できる。
【０００８】本発明で使用することのできるカチオン界
面活性剤を形成する陰イオンは、特に限定されるもので
はないが、例えば、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、
臭素原子、ヨウ素原子又はフッ素原子）を挙げることが
できる。好ましい第４級アンモニウム塩は、例えば、塩
化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニ
ウム、臭化セチルピリジニウム、臭化テトラデシルトリ
メチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアン
モニウム、塩化テトラデシルピリジニウム、塩化ステア
リルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ペンタデシル
トリメチルアンモニウム等である。
面活性剤を形成する陰イオンは、特に限定されるもので
はないが、例えば、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、
臭素原子、ヨウ素原子又はフッ素原子）を挙げることが
できる。好ましい第４級アンモニウム塩は、例えば、塩
化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニ
ウム、臭化セチルピリジニウム、臭化テトラデシルトリ
メチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアン
モニウム、塩化テトラデシルピリジニウム、塩化ステア
リルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ペンタデシル
トリメチルアンモニウム等である。
【０００９】本発明において、界面活性剤の濃度は、抗
原抗体反応及びそれに続く酵素反応を実施する反応系中
において、０．００１〜５．０重量％、好ましくは０．
０１〜１．０重量％、より好ましくは０．０２５〜０．
５重量％である。５．０重量％を超える高濃度、もしく
は０．００１重量％以下の低濃度の使用では、例えば、
酵素免疫学測定法を行う場合、抗原抗体反応後の、酵素
発色反応で得られる吸光度の増感効果が見られないので
不都合である。
原抗体反応及びそれに続く酵素反応を実施する反応系中
において、０．００１〜５．０重量％、好ましくは０．
０１〜１．０重量％、より好ましくは０．０２５〜０．
５重量％である。５．０重量％を超える高濃度、もしく
は０．００１重量％以下の低濃度の使用では、例えば、
酵素免疫学測定法を行う場合、抗原抗体反応後の、酵素
発色反応で得られる吸光度の増感効果が見られないので
不都合である。
【００１０】本発明による免疫学的測定方法は、抗原抗
体反応を実施し、標識として酵素を用いる方法、すなわ
ちＥＩＡ又はＥＬＩＳＡである限り、特に限定されるも
のではなく、例えば、競合結合法、サンドイッチ法又は
抗体測定法のいずれに利用することもできる。被検物質
は抗原又は抗体のいずれでもよく、従って、その被検物
質に応じて、酵素標識は抗原又は抗体のいずれに付して
もよい。
体反応を実施し、標識として酵素を用いる方法、すなわ
ちＥＩＡ又はＥＬＩＳＡである限り、特に限定されるも
のではなく、例えば、競合結合法、サンドイッチ法又は
抗体測定法のいずれに利用することもできる。被検物質
は抗原又は抗体のいずれでもよく、従って、その被検物
質に応じて、酵素標識は抗原又は抗体のいずれに付して
もよい。
【００１１】本発明の免疫学的測定方法では、有機溶媒
中又は水と有機溶媒との混合液中で抗原抗体反応を行
い、次いで、その同一の有機溶媒中又は水と有機溶媒と
の混合液中で抗原又は抗体に標識として付した酵素由来
の信号を検出する。有機溶媒は、特に限定されるもので
はないが、好ましくは、極性溶媒、例えば、アルコール
類、特にはメチルアルコール；ケトン類、特にはアセト
ン；更には、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと称
する）、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦと称する）、
ジオキサン、アセトニトリル等を挙げることができる。
水と有機溶媒との混合溶液は、水と水溶性有機溶媒（例
えば、アルコール類、特にはメチルアルコール）との混
合液であり、水は好ましくは０重量％〜９９重量％、よ
り好ましくは５０重量％〜９５重量％の量で含まれてい
ることができる。
中又は水と有機溶媒との混合液中で抗原抗体反応を行
い、次いで、その同一の有機溶媒中又は水と有機溶媒と
の混合液中で抗原又は抗体に標識として付した酵素由来
の信号を検出する。有機溶媒は、特に限定されるもので
はないが、好ましくは、極性溶媒、例えば、アルコール
類、特にはメチルアルコール；ケトン類、特にはアセト
ン；更には、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと称
する）、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦと称する）、
ジオキサン、アセトニトリル等を挙げることができる。
水と有機溶媒との混合溶液は、水と水溶性有機溶媒（例
えば、アルコール類、特にはメチルアルコール）との混
合液であり、水は好ましくは０重量％〜９９重量％、よ
り好ましくは５０重量％〜９５重量％の量で含まれてい
ることができる。
【００１２】前記の有機溶媒中又は水と有機溶媒との混
合液中で抗原抗体反応を行うことのできる抗体は、抗血
清又はモノクローナル抗体であることができ、これらの
抗体は、例えば、ウサギ抗血清、ヤギ抗血清、マウス抗
血清、あるいはマウス脾臓細胞と癌細胞とを融合したマ
ウスハイブリドーマ由来の培養上清、及びそれらを公知
の方法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、硫
安分画等で精製した精製抗体を使用することができる。
あるいは、酵素標識抗体を用いる場合は、公知の標識
法、例えば過ヨウ素酸、グルタルアルデヒドなどの架橋
試薬によって調製することができる。
合液中で抗原抗体反応を行うことのできる抗体は、抗血
清又はモノクローナル抗体であることができ、これらの
抗体は、例えば、ウサギ抗血清、ヤギ抗血清、マウス抗
血清、あるいはマウス脾臓細胞と癌細胞とを融合したマ
ウスハイブリドーマ由来の培養上清、及びそれらを公知
の方法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、硫
安分画等で精製した精製抗体を使用することができる。
あるいは、酵素標識抗体を用いる場合は、公知の標識
法、例えば過ヨウ素酸、グルタルアルデヒドなどの架橋
試薬によって調製することができる。
【００１３】酵素免疫学的測定方法で用いる固相化坦体
としては、例えばポリスチレンプレート等のプラスチッ
クプレート、ニトロセルロース膜、プラスチックビー
ズ、ラテックスビーズ等を挙げることができる。固相化
坦体には、抗体又は抗原を固相化して測定に供すること
ができる。固相化方法としては、公知の感作法、例えば
物理吸着による固定化法や、化学結合法を用いることが
できる。化学結合法の場合には、化学架橋試薬として、
例えば従来公知のカルボジイミドやグルタルアルデヒド
等を利用することができる。
としては、例えばポリスチレンプレート等のプラスチッ
クプレート、ニトロセルロース膜、プラスチックビー
ズ、ラテックスビーズ等を挙げることができる。固相化
坦体には、抗体又は抗原を固相化して測定に供すること
ができる。固相化方法としては、公知の感作法、例えば
物理吸着による固定化法や、化学結合法を用いることが
できる。化学結合法の場合には、化学架橋試薬として、
例えば従来公知のカルボジイミドやグルタルアルデヒド
等を利用することができる。
【００１４】酵素免疫学的測定方法では、標識酵素とし
て、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、又はガラクトシダーゼを用いることができる。ペ
ルオキシダーゼの基質としては、例えばテトラメチルベ
ンチゾン（以下ＴＭＢＺと称する）、アルカリフォスフ
ァターゼの基質としては、例えばｐ−ニトロフェニルリ
ン酸、そしてガラクトシダーゼの基質としては、例えば
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いるこ
とができる。
て、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、又はガラクトシダーゼを用いることができる。ペ
ルオキシダーゼの基質としては、例えばテトラメチルベ
ンチゾン（以下ＴＭＢＺと称する）、アルカリフォスフ
ァターゼの基質としては、例えばｐ−ニトロフェニルリ
ン酸、そしてガラクトシダーゼの基質としては、例えば
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いるこ
とができる。
【００１５】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例では、特に断らない限り、％は重量％
である。また、以下の実施例では、難水溶性下痢性貝毒
の１種であるオカダ酸（以下ＯＡと称する）に対するモ
ノクローナル抗体を固相化して調製されている、市販の
マイクロプレート（ＭＳ３６０８；住友ベークライト
製）を使用した。実施例１：アセトン中での界面活性剤による増感作用 （１）オカダ酸（ＯＡ）に対する抗体を固相化した市販
のマイクロプレート（ＭＳ３６０８）に、ペルオキシダ
ーゼで標識したオカダ酸（以下ＯＡ−ＰＯＤと称する；
Ｇｒａｄｅ Ｉ−ｃ；東洋紡社）１００ｎｇ／ｍｌと
０．０５％塩化セチルピリジニウムとを含む２０％アセ
トン／ホウ酸緩衝生理食塩水１００μｌずつを各ウェル
に添加し、抗原抗体反応を行わせた。コントロール試験
として、ＯＡ−ＰＯＤ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む２０
％アセトン／ホウ酸緩衝生理食塩水１００μｌずつを各
ウェルに添加し、抗原抗体反応を行わせた。なお、抗原
抗体反応の時間は６０分間とした（一次反応）。 （２）一次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。ペルオキシダーゼに対す
る基質溶液として、最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌのＴＭ
ＢＺと０．００６％の過酸化水素水とを含む０．１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００μｌずつを各
ウェルに添加し、室温で酵素発色反応を行わせた。１５
分後、１規定の硫酸水溶液１００μｌずつを各ウェルに
添加して酵素発色反応を停止させ、続いて、吸光光度計
により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測定した（二次反
応）。結果を表１に示す。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例では、特に断らない限り、％は重量％
である。また、以下の実施例では、難水溶性下痢性貝毒
の１種であるオカダ酸（以下ＯＡと称する）に対するモ
ノクローナル抗体を固相化して調製されている、市販の
マイクロプレート（ＭＳ３６０８；住友ベークライト
製）を使用した。実施例１：アセトン中での界面活性剤による増感作用 （１）オカダ酸（ＯＡ）に対する抗体を固相化した市販
のマイクロプレート（ＭＳ３６０８）に、ペルオキシダ
ーゼで標識したオカダ酸（以下ＯＡ−ＰＯＤと称する；
Ｇｒａｄｅ Ｉ−ｃ；東洋紡社）１００ｎｇ／ｍｌと
０．０５％塩化セチルピリジニウムとを含む２０％アセ
トン／ホウ酸緩衝生理食塩水１００μｌずつを各ウェル
に添加し、抗原抗体反応を行わせた。コントロール試験
として、ＯＡ−ＰＯＤ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む２０
％アセトン／ホウ酸緩衝生理食塩水１００μｌずつを各
ウェルに添加し、抗原抗体反応を行わせた。なお、抗原
抗体反応の時間は６０分間とした（一次反応）。 （２）一次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。ペルオキシダーゼに対す
る基質溶液として、最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌのＴＭ
ＢＺと０．００６％の過酸化水素水とを含む０．１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００μｌずつを各
ウェルに添加し、室温で酵素発色反応を行わせた。１５
分後、１規定の硫酸水溶液１００μｌずつを各ウェルに
添加して酵素発色反応を停止させ、続いて、吸光光度計
により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測定した（二次反
応）。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】 吸光度（４５０ｎｍ） 塩化セチルピリジニウム添加 １．６３７ 塩化セチルピリジニウム未添加 １．０１４
【００１７】参考例：ペルオキシダーゼ活性の有機溶媒
耐性に対する界面活性剤の影響 （１）ＯＡに対する抗体を固相化した市販のマイクロプ
レート（ＭＳ３６０８）に、ＯＡ−ＰＯＤ（１００ｎｇ
／ｍｌ）を含むホウ酸緩衝生理食塩水１００μｌずつを
各ウェルに添加し、抗原抗体反応を行わせた（一次反
応）。 （２）一次反応の終了後に、ホウ酸緩衝生理食塩水によ
りマイクロプレートを洗浄した。次に、０．０５％塩化
セチルピリジニウムを含む２０％アセトン／ホウ酸緩衝
生理食塩水１００μｌずつを各ウェルに添加した。コン
トロール試験として、２０％アセトン／ホウ酸緩衝生理
食塩水１００μｌずつを各ウェルに添加した。それぞれ
６０分間放置し、一次反応により抗体に結合したＯＡ−
ＰＯＤのペルオキシダーゼを有機溶媒に曝した（二次反
応）。 （３）二次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。続いて、ペルオキシダー
ゼに対する基質溶液として、最終濃度が１００ｎｇ／ｍ
ｌのＴＭＢＺと０．００６％の過酸化水素水とを含む
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００μ
ｌずつを各ウェルに添加し、室温で酵素発色反応を行っ
た。１５分後に１規定の硫酸水溶液１００μｌずつを各
ウェルに添加し酵素発色反応を停止させ、続いて、吸光
光度計により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測定した
（三次反応）。結果を表２に示す。
耐性に対する界面活性剤の影響 （１）ＯＡに対する抗体を固相化した市販のマイクロプ
レート（ＭＳ３６０８）に、ＯＡ−ＰＯＤ（１００ｎｇ
／ｍｌ）を含むホウ酸緩衝生理食塩水１００μｌずつを
各ウェルに添加し、抗原抗体反応を行わせた（一次反
応）。 （２）一次反応の終了後に、ホウ酸緩衝生理食塩水によ
りマイクロプレートを洗浄した。次に、０．０５％塩化
セチルピリジニウムを含む２０％アセトン／ホウ酸緩衝
生理食塩水１００μｌずつを各ウェルに添加した。コン
トロール試験として、２０％アセトン／ホウ酸緩衝生理
食塩水１００μｌずつを各ウェルに添加した。それぞれ
６０分間放置し、一次反応により抗体に結合したＯＡ−
ＰＯＤのペルオキシダーゼを有機溶媒に曝した（二次反
応）。 （３）二次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。続いて、ペルオキシダー
ゼに対する基質溶液として、最終濃度が１００ｎｇ／ｍ
ｌのＴＭＢＺと０．００６％の過酸化水素水とを含む
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００μ
ｌずつを各ウェルに添加し、室温で酵素発色反応を行っ
た。１５分後に１規定の硫酸水溶液１００μｌずつを各
ウェルに添加し酵素発色反応を停止させ、続いて、吸光
光度計により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測定した
（三次反応）。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】 吸光度（４５０ｎｍ） 塩化セチルピリジニウム添加 １．４０５ 塩化セチルピリジニウム未添加 １．６０７
【００１９】実施例１の結果によると、アセトン中で抗
原抗体反応を行う際に、反応系に塩化セチルピリジニウ
ム（カチオン界面活性剤）を添加することにより、非添
加の場合と比較して、酵素発色反応の際に得られる吸光
度が増幅されている。この原因としては、少なくとも、
以下の二通りの可能性が推測される。 （ａ）塩化セチルピリジニウムを添加することにより、
アセトン中での抗原抗体反応が増感される。 （ｂ）塩化セチルピリジニウムを添加することにより、
抗原抗体反応により抗体に結合したＯＡ−ＰＯＤのペル
オキシダーゼのアセトン耐性が向上される。 次に、参考例の結果によると、抗原抗体反応により抗体
に結合したＯＡ−ＰＯＤのペルオキシダーゼのアセトン
耐性は、塩化セチルピリジニウムを添加することによ
り、むしろ低下していることが示されており、耐性が向
上される可能性は否定された。従って、前記実施例１で
得られた結果は、反応系に塩化セチルピリジニウムを添
加することにより、非添加の場合と比較して、アセトン
中での抗原抗体反応が増感されたことによるものと考え
られる。
原抗体反応を行う際に、反応系に塩化セチルピリジニウ
ム（カチオン界面活性剤）を添加することにより、非添
加の場合と比較して、酵素発色反応の際に得られる吸光
度が増幅されている。この原因としては、少なくとも、
以下の二通りの可能性が推測される。 （ａ）塩化セチルピリジニウムを添加することにより、
アセトン中での抗原抗体反応が増感される。 （ｂ）塩化セチルピリジニウムを添加することにより、
抗原抗体反応により抗体に結合したＯＡ−ＰＯＤのペル
オキシダーゼのアセトン耐性が向上される。 次に、参考例の結果によると、抗原抗体反応により抗体
に結合したＯＡ−ＰＯＤのペルオキシダーゼのアセトン
耐性は、塩化セチルピリジニウムを添加することによ
り、むしろ低下していることが示されており、耐性が向
上される可能性は否定された。従って、前記実施例１で
得られた結果は、反応系に塩化セチルピリジニウムを添
加することにより、非添加の場合と比較して、アセトン
中での抗原抗体反応が増感されたことによるものと考え
られる。
【００２０】実施例２：種々の有機溶媒中における抗原
抗体反応の増感効果 （１）ＯＡに対する抗体を固相化した市販のマイクロプ
レート（ＭＳ３６０８）に、（ａ）ＯＡ−ＰＯＤ（５０
ｎｇ／ｍｌ）と０．０５％塩化セチルピリジニウムとを
含む１０％ＤＭＳＯ／ホウ酸緩衝生理食塩水、（ｂ）前
記（ａ）のホウ酸緩衝生理食塩水における１０％ＤＭＳ
Ｏの代わりに１０％ＴＨＦを含むホウ酸緩衝生理食塩
水、（ｃ）前記（ａ）のホウ酸緩衝生理食塩水における
１０％ＤＭＳＯの代わりに１０％ジオキサンを含むホウ
酸緩衝生理食塩水、（ｄ）前記（ａ）のホウ酸緩衝生理
食塩水における１０％ＤＭＳＯの代わりに１０％アセト
ニトリルを含むホウ酸緩衝生理食塩水、又は（ｅ）前記
（ａ）のホウ酸緩衝生理食塩水における１０％ＤＭＳＯ
の代わりに２０％メチルアルコールを含むホウ酸緩衝生
理食塩水を各ウェル毎に１００μｌずつ添加し、抗原抗
体反応を行わせた。なお、２０％メチルアルコール／ホ
ウ酸緩衝生理食塩水における実験においては、ＯＡ−Ｐ
ＯＤの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌとした。コントロール試
験として、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含み、
ＯＡ−ＰＯＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むホウ酸緩衝生理
食塩水を用いて同様な実験を行った。なお、抗原抗体反
応時間は６０分間とした（一次反応）。 （２）一次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。続いて、ペルオキシダー
ゼに対する基質溶液として、最終濃度が１００ｎｇ／ｍ
ｌのＴＭＢＺと０．００６％の過酸化水素水とを含む
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００μ
ｌずつを各ウェルに添加し、室温で酵素発色反応を行
い、１５分間後に１規定の硫酸水溶液１００μｌずつを
各ウェルに添加して酵素発色反応を停止させ、続いて、
吸光光度計により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測定し
た（二次反応）。 結果を表３に示す。なお、塩化セチルピリジニウム添加
区分と塩化セチルピリジニウム非添加区分の４５０ｎｍ
における可視光の吸光度の比（添加区分吸光度／未添加
区分吸光度）を求め、表３を作成した。
抗体反応の増感効果 （１）ＯＡに対する抗体を固相化した市販のマイクロプ
レート（ＭＳ３６０８）に、（ａ）ＯＡ−ＰＯＤ（５０
ｎｇ／ｍｌ）と０．０５％塩化セチルピリジニウムとを
含む１０％ＤＭＳＯ／ホウ酸緩衝生理食塩水、（ｂ）前
記（ａ）のホウ酸緩衝生理食塩水における１０％ＤＭＳ
Ｏの代わりに１０％ＴＨＦを含むホウ酸緩衝生理食塩
水、（ｃ）前記（ａ）のホウ酸緩衝生理食塩水における
１０％ＤＭＳＯの代わりに１０％ジオキサンを含むホウ
酸緩衝生理食塩水、（ｄ）前記（ａ）のホウ酸緩衝生理
食塩水における１０％ＤＭＳＯの代わりに１０％アセト
ニトリルを含むホウ酸緩衝生理食塩水、又は（ｅ）前記
（ａ）のホウ酸緩衝生理食塩水における１０％ＤＭＳＯ
の代わりに２０％メチルアルコールを含むホウ酸緩衝生
理食塩水を各ウェル毎に１００μｌずつ添加し、抗原抗
体反応を行わせた。なお、２０％メチルアルコール／ホ
ウ酸緩衝生理食塩水における実験においては、ＯＡ−Ｐ
ＯＤの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌとした。コントロール試
験として、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含み、
ＯＡ−ＰＯＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むホウ酸緩衝生理
食塩水を用いて同様な実験を行った。なお、抗原抗体反
応時間は６０分間とした（一次反応）。 （２）一次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。続いて、ペルオキシダー
ゼに対する基質溶液として、最終濃度が１００ｎｇ／ｍ
ｌのＴＭＢＺと０．００６％の過酸化水素水とを含む
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００μ
ｌずつを各ウェルに添加し、室温で酵素発色反応を行
い、１５分間後に１規定の硫酸水溶液１００μｌずつを
各ウェルに添加して酵素発色反応を停止させ、続いて、
吸光光度計により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測定し
た（二次反応）。 結果を表３に示す。なお、塩化セチルピリジニウム添加
区分と塩化セチルピリジニウム非添加区分の４５０ｎｍ
における可視光の吸光度の比（添加区分吸光度／未添加
区分吸光度）を求め、表３を作成した。
【００２１】
【表３】 比（添加区分／未添加区分） ホウ酸緩衝生理食塩水 ０．８９６ （ａ）１０％ＤＭＳＯ １．１７４ （ｂ）１０％ＴＨＦ １．２３６ （ｃ）１０％ジオキサン １．０９４ （ｄ）１０％アセトニトリル １．１６３ （ｅ）２０％メチルアルコール １．３４１
【００２２】また、塩化セチルピリウジニウムに換え
て、他のカチオン界面活性剤（塩化セチルトリメチルア
ンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウ
ム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ス
テアリルジメチルベンジルアンモニウム、及び塩化ペン
タデシルトリメチルアンモニウム）についても、同様の
試験を実施したところ、同様の増感効果が得られた。
て、他のカチオン界面活性剤（塩化セチルトリメチルア
ンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウ
ム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ス
テアリルジメチルベンジルアンモニウム、及び塩化ペン
タデシルトリメチルアンモニウム）についても、同様の
試験を実施したところ、同様の増感効果が得られた。
【００２３】実施例３：アセトン中でのＯＡ検量線の作
成 （１）ＯＡに対する抗体を固相化した市販のマイクロプ
レート（ＭＳ３６０８）に、０．１％塩化セチルピリジ
ニウムを含む４０％アセトン／ホウ酸緩衝生理食塩水で
調製したＯＡ標準溶液（５５．６ｎｇ／ｍｌ、１８．５
ｎｇ／ｍｌ、６．１５ｎｇ／ｍｌ、２．０７ｎｇ／ｍ
ｌ、０．６９ｎｇ／ｍｌ、０．２３ｎｇ／ｍｌ）（競合
的阻害法を行う反応系中の終濃度）５０μｌずつを各ウ
ェルに添加し、その後素早く、ＯＡ−ＰＯＤ（２００ｎ
ｇ／ｍｌ）を含むホウ酸緩衝生理食塩水５０μｌずつを
各ウェルに添加し、軽く揺倒し撹拌し、抗原抗体反応を
行わせた。抗原抗体反応は、室温で１時間行った。な
お、競合的阻害法を行う反応系中の終濃度で、ＯＡ−Ｐ
ＯＤ１００ｎｇ／ｍｌと０．０５％塩化セチルピリジニ
ウムとを含む２０％アセトン／ホウ酸緩衝生理食塩水溶
液となる。また、コントロール試験として、塩化セチル
ピリジニウムを含まない同様な系で抗原抗体反応を行っ
た（一次反応）。 （２）一次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。続いて、ペルオキシダー
ゼに対する基質溶液として、最終濃度がそれぞれ１００
ｎｇ／ｍｌのＴＭＢＺと０．００６％の過酸化水素水と
を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１
００μｌずつを各ウェルに添加し、室温で酵素発色反応
を行い、１５分後に１規定の硫酸水溶液１００μｌずつ
を各ウェルに添加して酵素発色反応を停止させ、続い
て、吸光光度計により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測
定した（二次反応）。結果を図１に示す。図１におい
て、□は塩化セチルピリジニウム未添加の場合であり、
◇は塩化セチルピリジニウム添加の場合である。
成 （１）ＯＡに対する抗体を固相化した市販のマイクロプ
レート（ＭＳ３６０８）に、０．１％塩化セチルピリジ
ニウムを含む４０％アセトン／ホウ酸緩衝生理食塩水で
調製したＯＡ標準溶液（５５．６ｎｇ／ｍｌ、１８．５
ｎｇ／ｍｌ、６．１５ｎｇ／ｍｌ、２．０７ｎｇ／ｍ
ｌ、０．６９ｎｇ／ｍｌ、０．２３ｎｇ／ｍｌ）（競合
的阻害法を行う反応系中の終濃度）５０μｌずつを各ウ
ェルに添加し、その後素早く、ＯＡ−ＰＯＤ（２００ｎ
ｇ／ｍｌ）を含むホウ酸緩衝生理食塩水５０μｌずつを
各ウェルに添加し、軽く揺倒し撹拌し、抗原抗体反応を
行わせた。抗原抗体反応は、室温で１時間行った。な
お、競合的阻害法を行う反応系中の終濃度で、ＯＡ−Ｐ
ＯＤ１００ｎｇ／ｍｌと０．０５％塩化セチルピリジニ
ウムとを含む２０％アセトン／ホウ酸緩衝生理食塩水溶
液となる。また、コントロール試験として、塩化セチル
ピリジニウムを含まない同様な系で抗原抗体反応を行っ
た（一次反応）。 （２）一次反応の終了後、ホウ酸緩衝生理食塩水により
マイクロプレートを洗浄した。続いて、ペルオキシダー
ゼに対する基質溶液として、最終濃度がそれぞれ１００
ｎｇ／ｍｌのＴＭＢＺと０．００６％の過酸化水素水と
を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１
００μｌずつを各ウェルに添加し、室温で酵素発色反応
を行い、１５分後に１規定の硫酸水溶液１００μｌずつ
を各ウェルに添加して酵素発色反応を停止させ、続い
て、吸光光度計により４５０ｎｍの可視光で吸光度を測
定した（二次反応）。結果を図１に示す。図１におい
て、□は塩化セチルピリジニウム未添加の場合であり、
◇は塩化セチルピリジニウム添加の場合である。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、有機溶媒中での抗原抗体
反応を増感することができる。また、有機溶媒中で行う
酵素免疫学的測定方法に応用することにより、被検物質
のより明瞭な定量を行うことができる。更に、酵素標識
抗原の使用量を節約することも可能であり、測定に要す
るコストの節約を計ることも可能である。
反応を増感することができる。また、有機溶媒中で行う
酵素免疫学的測定方法に応用することにより、被検物質
のより明瞭な定量を行うことができる。更に、酵素標識
抗原の使用量を節約することも可能であり、測定に要す
るコストの節約を計ることも可能である。
【図１】本発明方法によって作成したオカダ酸の検量線
である。
である。
Claims (3)
- 【請求項１】 有機溶媒中又は水と有機溶媒との混合液
中で抗原抗体反応を行い、次いで抗原又は抗体に標識と
して付した酵素由来の信号を検出する測定系に、カチオ
ン界面活性剤を存在させることを特徴とする免疫学的測
定方法。 - 【請求項２】 カチオン界面活性剤が炭素数１４〜１８
のアルキル基を有する第４級アンモニウム塩である請求
項１に記載の免疫学的測定方法。 - 【請求項３】 有機溶媒中又は水と有機溶媒との混合液
中で抗原抗体反応を行い、次いで抗原又は抗体に標識と
して付した酵素由来の信号を検出する免疫学的測定方法
用の、カチオン界面活性剤を含有することを特徴とする
増感剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14408295A JPH08313526A (ja) | 1995-05-18 | 1995-05-18 | 有機溶媒中における免疫学的測定法、及び増感剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14408295A JPH08313526A (ja) | 1995-05-18 | 1995-05-18 | 有機溶媒中における免疫学的測定法、及び増感剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08313526A true JPH08313526A (ja) | 1996-11-29 |
Family
ID=15353838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14408295A Pending JPH08313526A (ja) | 1995-05-18 | 1995-05-18 | 有機溶媒中における免疫学的測定法、及び増感剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08313526A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018155629A (ja) * | 2017-03-17 | 2018-10-04 | 東ソー株式会社 | ペプチドの吸着抑制剤 |
-
1995
- 1995-05-18 JP JP14408295A patent/JPH08313526A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018155629A (ja) * | 2017-03-17 | 2018-10-04 | 東ソー株式会社 | ペプチドの吸着抑制剤 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040106 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20040305 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040330 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20040531 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040713 |